CN108697632A - 包含海参提取物作为有效成分的皮肤改善组合物 - Google Patents

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Abstract

公开包含海参提取物作为有效成分的皮肤改善组合物。通过重复2次冷冻干燥来制备的海参提取物对皮肤再生活性和美白皮肤具有效果。

Description

包含海参提取物作为有效成分的皮肤改善组合物
技术领域
本发明涉及包含海参提取物作为有效成分的皮肤改善组合物，尤其为涉及包含通过重复2次冷冻干燥来制备的海参提取物作为有效成分的皮肤改善组合物的发明。
背景技术
海参为一种属于棘皮动物门海参纲(holothuroidea)的海洋无脊椎动物，在韩国有刺参、黑海参、红海参等4科14种。自古以来，海参与人参一同为具有代表性的滋补食品，至今也为食品营养学的研究对象。兹山鱼谱、本草纲目、东医宝鉴等中记载有对于恢复元气、安神等效果，可知远在古代也广为利用，并且在最近的研究中发现皂苷成分，因此揭开在食品营养学上具有优秀的效果。
近年来，不仅在食品营养学上开展研究，海参作为天然物质新型药物的方面上的研究也正在积极开展着，尤其，在最近的研究结果中验证了海参的对于皮肤再生或美白皮肤的功效。但是，大部分对于皮肤再生及美白皮肤的研究同时使用了海参和由其他原料提取的提取物。因此，难以确定仅具有海参的情况下的对于皮肤再生及美白皮肤的功效。并且，在仅仅研究海参的情况下，未报道有关于海参的种类、部位、提取方法等对皮肤活性具有何种差异的详细研究，并且大部分提出根据动物实验的效果，而未准确地提出有实际人类皮肤模型当中对皮肤再生及美白皮肤的效果。
因此，需要研究海参是否具有对皮肤再生及美白皮肤的效果，还有必要确认实际人类皮肤对海参的皮肤再生及美白具有效果。
发明内容
技术问题
本发明为了解决如上所述的问题而提出，本发明的目的在于，提供通过重复2次冷冻干燥来制备的包含海参提取物作为有效成分的皮肤改善组合物。
解决问题的手段
作为用于实现如上所述的技术问题的技术手段，根据本发明一方案的皮肤改善组合物包含通过重复2次冷冻干燥来制备的海参提取物来作为有效成分。
在这里，上述海参提取物可以通过包括如下步骤的制备方法来制备：对海参进行第一次冷冻干燥的步骤；粉碎经冷冻干燥的海参来制备粉末的步骤；对经粉碎的粉末进行孵育的步骤；对经孵育的海参进行蒸发浓缩的步骤；对经蒸发浓缩的海参进行过滤及冷凝的步骤以及对经冷凝的海参进行第二次冷冻干燥的步骤。
上述皮肤改善组合物还可通过包括如下步骤的制备方法来制备：在上述第一次冷冻干燥的步骤之前，对海参以-70℃至-100℃的温度进行超低温冷冻(deep-freezing)。
上述第一次冷冻干燥的步骤可包括：将海参冷却至-20℃至-100℃温度的步骤；以及将经冷却的海参干燥36小时至84小时的步骤。
在上述孵育的步骤中，可通过向海参粉末中放入55％至95％的乙醇来孵育1小时至3小时。
在上述蒸发浓缩的步骤中，可在55℃至100℃温度下蒸发浓缩1.5小时至5小时。
上述海参可以为刺参和/或黑海参。
上述海参提取物可以是仅使用海参内脏提取的。
上述海参提取物可通过还包括如下步骤的制备方法来制备：通过将经第二次冷冻干燥的海参溶解于溶剂中来制备溶液。
上述溶剂可以为选自由丁二醇(butylene glycol)、水、乙基己二醇(ethylhexanediol)及1，2-己二醇(1，2-hexanediol)组成的组中的一种以上。
上述皮肤改善可以为皮肤再生活性。
上述皮肤再生活性可以为Ⅳ型胶原蛋白的表达量增加，细胞活性因子(ki-67)的增加和/或基质金属蛋白酶的分泌量减少。
上述皮肤改善可以为美白皮肤。
上述美白皮肤可以为抑制黑色素生成。
发明的效果
本发明的包含海参提取物作为有效成分的皮肤改善组合物具有使皮肤再生的效果，例如Ⅳ型胶原蛋白的表达量增加、基质金属蛋白酶的分泌量减少等，并且具有防止皮肤黑化的效果，例如抑制黑色素生成等。
附图说明
图1为示出用于提取海参提取物的制备工序。
图2为示出将海参提取物制备成溶液的工序。
图3为示出比较例1、2及4的Ⅳ型胶原蛋白及ki-67的表达量。
图4为示出实施例3及4的Ⅳ型胶原蛋白及ki-67的表达量。
图5为示出ki-67的表达率比较图形。
图6为示出MMP-9的标准曲线图形。
图7为示出MMP-9的分泌量比较图形。
图8为示出黑色素标准曲线。
图9为示出比较例2及比较例3、实施例1至实施例6的黑色素量比较图形。
具体实施方式
以下，进一步详细地说明本发明。但是，这仅作为示例来提出，本发明并不限定于此，本发明仅由下文中的发明要求保护范围来进行定义。
提供对皮肤再生活性和美白皮肤均具有功效的皮肤美容组合物。
根据本发明一方案的皮肤改善组合物包含通过重复2次冷冻干燥来制备的海参提取物作为有效成分。
上述海参为属于楯手目(aspiodchirotida)，刺参科(stichopodidae)，刺参属(stichopus)的海洋生物，全球栖息有1500种。在韩国存活的海参的学名为刺参(stichopusjaponicus)，并栖息有4科14种。
优选地，上述海参可以为刺参、黑海参。刺参为生存在外海水域的岩石、碎石、沙质区域的海参，黑海参为栖息在富营养水域、陆地的影响较强的地方的海参。
上述海参可以为选自由整个海参、内脏及除了内脏之外的部位组成的组中的一种以上的部位。
作为海鲜的干燥方法，具有自然干燥、加压干燥、常压干燥及真空干燥，上述冷冻干燥为属于真空干燥的干燥方法。上述冷冻干燥为通过冻结及减压含有大量水分的材料来使冰升华的同时去除水分并取得干燥物的干燥方法。冷冻干燥具有如下的优点，即，通过使热敏感的物质的损坏最小化来进行干燥，并且经干燥的物质形成易于水分渗透的结构，从而可实现冻结物质的快速的再水化(rehydration)。
上述海参因热而易于引起组织变形，由于水分含量较多，因此比较适合由冷冻干燥来干燥海参。经冷冻干燥的海参可保持着固有的组织来进行干燥，并且对水的再水化优秀。
上述有效成分是指皮肤改善组合物的主成分为海参提取物。即，海参提取物直接或间接地表现出组合物的皮肤美容功能。
上述组合物为皮肤改善组合物。所谓皮肤改善是指美白皮肤、改善皮肤周围、帮助自紫外线保护皮肤的功能等。
根据所需的皮肤改善功能及剂型，包含上述海参提取物的皮肤改善组合物可仅包含海参提取物来作为有效成分，还可同时包含海参提取物和其他必要成分来作为有效成分。并且，上述皮肤美容组合物可用作皮肤外用剂，还可用作如健康食品等的食品或如注射剂型等的药物等。
上述海参提取物可通过包括如下步骤的制备方法来制备：对海参进行第一次冷冻干燥(步骤S110)；粉碎经冷冻干燥的海参来制备粉末(步骤S120)；对经粉碎的粉末进行孵育(步骤S130)；对经孵育的海参进行蒸发浓缩(步骤S140)；对经蒸发浓缩的海参进行过滤(步骤S150)及冷凝(condensation)(步骤S160)；以及对经冷凝的海参进行第二次冷冻干燥(步骤S170)。
上述皮肤改善组合物可通过包括如下步骤的制备方法来制备：在上述第一次冷冻干燥的步骤之前，对海参以-70℃至-100℃的温度进行超低温冷冻(deep-freezing)。通过超低温冷冻，可完全去除海参的水分，并且以极低温快速冷冻，因此海参的细胞不受损并可保持完整。上述超低温冷冻可通过迅速通过作为最大冰晶生成带的-1℃至-5℃的温度区间快速冷冻(quick freezing)方法进行。
经第一次冷冻干燥(步骤S110)的上述海参的营养成分被浓缩。即，通过冷冻干燥，水分从重量的90％以上由水形成的生海参除去，与生海参相比，在以相同重量条件下，经干燥的海参包含高度浓缩营养成分。因此，能够以少量也可呈现优秀的皮肤改善效果。
上述第一次冷冻干燥(步骤S110)可包括如下的制备方法：将海参冻结为-10℃至-110℃；以及将经冻结的上述海参感召36小时至84小时。
优选地，上述第一次冷冻干燥(步骤S110)的冻结温度可以为-10℃至-110℃，更优选地，可以为-20℃至-100℃。根据冻结温度，冷冻干燥的冻结时间变化。冻结温度越低，冻结时间则越短，并且空隙的大小小且具有致密的组织。这是因为当这进行快速冻结时，快速越过冰晶生成带，因此形成更小的冰粒子。当上述冻结温度低于-110℃时，冷冻干燥时间虽变短，但冰晶生成速度变快且冰晶变小，因此水向经第一次冷冻干燥的海参的内部渗入，向经干燥的海参吸收的速度变缓，从而水化恢复能力呈现较低。并且，当上述冻结温度高于-10℃时，海参的内部的空隙变大，因此水化恢复能力变好，但冷冻干燥时间变长，从而制备提取物的过程有可能加长。
优选地，经第一次冻结的上述海参可干燥36小时至84小时，更优选地，可干燥48小时至72小时。上述干燥是指升华干燥和/或第二次干燥。升华干燥是指冻结之后将压力降低到水的三相点以下并将其直接从固体变化为气体来干燥水分，如细胞的内部的水等，第二次干燥是指对升华干燥之后还残留的水分进行干燥的脱湿。当上述干燥时间短于36小时时，海参内的水分有可能无法充分干燥，当长于72小时时，水分过度干燥，因此存在水化恢复能力变差的顾虑。
粉碎经第一次冷冻干燥的上述海参来制备粉末(步骤S120)。优选地，根据使用目的，粉末的大小可以为0.01nm至1mm。当将经冷冻干燥的海参制备成粉末时，尺寸变小，因此可易于向体内吸收，并且表面积增加，从而可容易地与包含在皮肤改善组合物中的其他物质进行反应。
对经粉碎的上述粉末进行孵育(步骤S130)可包括如下的制备方法：向海参粉末放入55％至95％的乙醇并孵育1小时至3小时。
优选地，上述乙醇可以为55％至95％的纯度，更优选地，可以为65％至85％的纯度。并且，优选地，孵育可进行1小时至3小时，更优选地，可进行1.5小时至2.5小时。上述孵育(步骤S130)使海参的基质蛋白质得以分解，经分解的基质蛋白质可使海参提取物的皮肤美容功能活性化。当上述乙醇的纯度小于55％时，因包含污染物质，因此可进行孵育，当大于95％时，因高纯度的乙醇，海参蛋白质可被凝固。当上述孵育时间小于1小时时，有可能无法充分分解成海参的基质蛋白质能够制备提取物的程度，当大于3小时时，因海参的基质蛋白质的分解而能够使海参的皮肤美容功能丧失。
上述蒸发浓缩(步骤S140)可包括如下步骤的制备方法：将经孵育的海参在55℃至100℃温度下蒸发浓缩1.5小时至5小时。
优选地，上述蒸发浓缩可在55℃至100℃温度下进行1.5小时至5小时，更优选地，可在65℃至90℃温度下进行2小时至4.5小时。通过上述蒸发浓缩的步骤，可去除乙醇、油成分、重金属等污染成分并仅取得纯的海参。当蒸发浓缩温度小于55℃时，因低温而使污染成分无法挥发，从而可在海参提取物中残留杂质，当超过100℃时，因高温而可使海参的皮肤改善成分受损。并且，当蒸发浓缩时间小于1.5小时时，因时间短而可使乙醇、污染成分等无法充分蒸发，当超过5小时时，因长时间加热而有可能导致在低温下也产生海参成分的蛋白质变形。
对经孵育的上述海参进行过滤(步骤S150)及冷凝(condensation)的步骤(步骤S160)为用于从经蒸发浓缩的海参剔除杂质并浓缩而取得高纯度的海参提取物的步骤。
对经冷凝的上述海参进行第二次冷冻干燥的步骤(步骤S170)为用于对经冷凝的海参进行第二次冷冻干燥来取得高纯度的海参提取物的步骤。由于第二次冷冻干燥步骤为再次重复第一次冷冻干燥步骤，因此在下文中省略详细说明。
优选地，上述海参可以为刺参和/或黑海参，更优选地，可以为栖息于西海岸的百灵岛附近海岸的刺参和/或黑海参。刺参及黑海参属于内湾性海参，红海参属于外海性海参。作为内湾性海参的刺参及黑海参的波里氏囊(polian vesicle)又厚又短，前端呈钝圆形，收缩性小，触手骨片(ossicle)的形态简单。与此相反，作为外海性海参的红海参的波里氏囊细长，前端呈尖尖的形状，收缩性强，触手骨片的形态复杂。与仅吃红藻类的红海参相比，上述刺参及黑海参摄取多种食饵，因此存在比红海参具有更多种营养成分。
上述海参提取物可以是仅使用海参内脏提取的。因存在于内脏内的海藻类的影响，与除了内脏之外部位相比，海参内脏具有高抗氧化性。抗氧化是指防止氧化的作用。海参内脏的抗氧化性可通过去除人体内的活性氧来防止因细胞的氧化而引起的细胞的老化，因此可有助于皮肤美容。因此，包含仅从海参的内脏所提取的提取物作为有效成分的皮肤改善组合物可对皮肤再生活性及美白皮肤发挥出优秀的功能。
上述海参提取物可以为通过还包括如下步骤的制备方法来制备：将经第二次冷冻干燥的上述海参溶解于溶剂中来制备溶液的步骤(步骤S180)。包含海参提取物作为有效成分的皮肤改善组合物可通过多种剂型来使用。因此，根据使用目的及方法，皮肤改善组合物还可包含溶液的海参提取物。上述溶剂可以为选自由极性、非极性、有机及无机溶剂组成的组中的一种以上的溶剂。
优选地，上述溶剂可以为选自由丁二醇(butylene glycol)、水、乙基己二醇(ethyl hexanediol)及1，2-己二醇(1，2-hexanediol)组成的组中的一种以上。
丁二醇、乙基己二醇及1，2-己二醇为醇类化合物，可溶解海参的多种成分，因此可制备能够包含海参提取物的皮肤改善组合物有效发挥皮肤改善功能的溶液。
上述皮肤改善可以为皮肤再生活性。优选地，上述皮肤再生活性可以为Ⅳ型胶原蛋白(collagen type IV)的表达量增加、细胞活性因子(ki-67)的增加和/或基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases)分泌量减少。
上述皮肤再生活性可以为Ⅳ型胶原蛋白的表达量增加。优选地，与由二甲基亚砜制备的阴性对照组相比，上述Ⅳ型胶原蛋白的表达量可以为200％至500％，与抗坏血酸相比，可以为103％至110％。
胶原蛋白(collagen)为构成哺乳动物的皮肉层和***的主要蛋白质，并在构成身体的蛋白质中占25％至35％。至今，已发现29种类型的胶原蛋白，Ⅳ型胶原蛋白为基底膜和肾小球癫痫基质的主要构成成分。Ⅳ型胶原蛋白由7S胶原蛋白区域、非胶原1(NC1，noncollagenous 1)区域、非胶原2(NC2，non collagenous 2)区域及三螺旋(TH，triplehelix)区域等4个区域构成。Ⅳ型胶原蛋白的4个分子以NH2末端部位相连接，其中二硫键(S-S)较多的区域为7S胶原蛋白区域，该区域不被细菌性胶原蛋白分解酶等的多种蛋白质分解酶分解。基底膜是指存在于表皮和真皮之间的薄膜，担当着皮肤再生作用。当基底膜受损时，用于分解胶原蛋白的酶从表皮层向真皮侵入，因此破坏胶原蛋白纤维，从而皮肤上产生皱纹。通过使作为基底膜的主要构成成分的Ⅳ型胶原蛋白的表达量增加来强化基底膜的机制，上述皮肤改善组合物可具有对皮肤再生活性的功能。
上述皮肤再生活性可以为细胞活性因子(ki-67)的增加。优选地，与作为阴性对照组的0.1％的二甲亚砜(dimethyl sulfoxide)相比，上述细胞活性因子(ki-67)的表达量可以为200％至500％。细胞活性因子(ki-67)为用作细胞增殖的标志物的蛋白质，在细胞周期中的G1期、G2期、S期、M期中表达。包含海参提取物作为有效成分的皮肤改善组合物通过影响皮肤细胞来使再生活性增加。因此，使用皮肤改善组合物的皮肤的角质层等的细胞再生变得活跃，并且细胞活性因子(ki-67)的表达量增加。
上述皮肤再生活性可以为基质金属蛋白酶的分泌量减少。优选地，上述基质金属蛋白酶的分泌量减少可以为用二甲基亚砜制备的阴性对照组的基质金属蛋白酶表达量的50％至90％，抗坏血酸的基质金属蛋白酶表达量的60％至90％。
基质金属蛋白酶是指用于分解Ⅳ型胶原蛋白的Ⅳ型胶原酶(type IVcollagenase)及基质分解素(stromelysin，MMP-3)。Ⅳ型胶原酶由明胶酶A(gelatinase A，MMP-2)及明胶酶B(gelatinase B，MMP-9)构成。明胶酶A从成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞等制备而成，明胶酶B均从正常细胞和癌细胞制备，基质分解素(MMP-3)从癌细胞制备。上述海参提取物可通过使上述基质金属蛋白酶的分泌量减少且抑制Ⅳ型胶原蛋白的分解的机制，具有对皮肤再生活性的功能。
上述皮肤改善可以为美白皮肤。美白皮肤是指通过黑色素来防止皮肤被黑素生成(melanogenesis)并使皮肤美白且美丽。
上述皮肤美容组合物可在黑色素合成前、合成中或合成后起到美白皮肤功能。在黑色素合成前通过酪氨酸酶(tyrosinase)转录调节和糖化调节，在黑色素合成当中通过酪氨酸酶阻碍、过氧化酶阻碍、还原剂及活性氧消除，在黑色素合成之后通过酪氨酸酶分解、黑素体移动阻碍、剥离促进来起到美白皮肤功能。
上述美白皮肤可以为抑制黑色素生成。优选地，与用1×PBS制备的阴性对照组的黑色素分泌量相比，包含海参提取物作为有效成分的皮肤改善组合物的黑色素分泌量的减少可以为减少12％至15％，与用二甲基亚砜制备的阴性对照组的黑色素分泌量相比，可减少2％至6％。
上述抑制黑色素生成是在作为细胞内物质的酪氨酸由酪氨酸酶转换为多巴(dopa)、多巴醌(dopaquinone)之后，黑色素通过作为酪氨酸酶相关蛋白质的多巴色素互变异构酶(TRP-2，dopachrome tautomerase)和酪氨酸酶相关蛋白1(TRP-1，5，6-二羟基吲哚-2-羧酸氧化酶(5，6-dihydroxyindole-2-carboxylic acid oxidase))作用和自动化工序来生成。上述皮肤改善组合物可通过酪氨酸酶抑制活性增加和/或酪氨酸酶表达减少来阻碍酪氨酸形成为黑色素的机制来抑制黑色素的产生。
以下，对本发明进行详细说明，使得本发明所属技术领域的普通技术人员可容易实施。但是，本发明可由多种不同的形态来实现，并且不限定于在此说明的实施例。
比较例1至比较例3：阴性对照组
比较例1至比较例3分别利用由韩国迪高(TEGO)科技公司(株)提供的维持培养基(maintenance medium)、由韩国迪高(TEGO)科技公司(株)提供的0.1％的二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide)、由韩国迪高(TEGO)科技公司(株)提供的1×PBS(phosphatebuffer saline)来制备了阴性对照组。
比较例4及比较例5：阳性对照组
比较例4中利用抗坏血酸(L-Ascorbin acid)制备，比较例5中利用熊果酚甙(arbutin)制备了阳性对照组。
实施例1：低浓度海参提取物
通过清洗在百灵岛附近海域采集的刺参及黑海参并在-30℃温度下冷却、干燥48小时的第一次冷冻干燥步骤之后，粉碎经冻结的海参来制备成了粉末。将海参粉末放入75％的乙醇中孵育2小时之后，在70℃温度下蒸发浓缩3小时之后，使之通过棉状物(cotton)来进行了过滤。利用真空蒸发器(vacuum evaporator，EYELA N-12，EYEKA CA-1112，东京理化器械株式会社(EYELA)出品，东京，日本)浓缩5小时至50mg/ml的低浓度。以-30℃、48小时的条件将经浓缩的上述海参进行了第二次冷冻干燥。
实施例2：高浓度海参提取物
通过清洗在百灵岛附近海域采集的刺参及黑海参并在-30℃温度下冷却、干燥48小时的第一次冷冻干燥步骤之后，粉碎经冻结的海参来制备成了粉末。将海参粉末放入75％的乙醇中孵育2小时之后，在70℃温度下蒸发浓缩3小时之后，使之通过棉状物来进行了过滤。利用真空蒸发器(vacuum evaporator，EYELA N-12，EYEKA CA-1112，东京理化器械株式会社(EYELA)出品，东京，日本)浓缩5小时至50mg/ml的低浓度。以-30℃、48小时的条件将经浓缩的上述海参进行了第二次冷冻干燥。
实施例3：低浓度海参内脏提取物
通过清洗在百灵岛附近海域采集的刺参及黑海参的内脏并在-80℃温度下利用超低温冷柜进行超低温冷冻。经超低温冷冻的海参内脏在-30℃温度下冷却并干燥48小时的第一次冷冻干燥步骤之后，粉碎经冻结的海参内脏来制备成了粉末。将海参内脏粉末放入75％的乙醇孵育2小时之后，在70℃温度下蒸馏浓缩3小时之后，使之通过棉状物来进行了过滤。利用真空蒸发器(vacuum evaporator，EYELA N-12，EYEKA CA-1112，东京理化器械株式会社(EYELA)出品，东京，日本)浓缩5小时至50mg/ml的低浓度。以-30℃、48小时的条件将经浓缩的上述海参内脏进行了第二次冷冻干燥。
实施例4：高浓度海参内脏提取物
通过清洗在百灵岛附近海域采集的刺参及黑海参的内脏并在-80℃温度下利用超低温冷柜进行了超低温冷冻。将经超低温冷冻的海参内脏在-30℃温度下冷却并干燥48小时的第一次冷冻干燥步骤之后，粉碎经冻结的海参内脏来制备成了粉末。将海参内脏粉末放入75％的乙醇孵育2小时之后，在70℃温度下蒸发浓缩3小时之后，使之通过棉状物来进行了过滤。利用真空蒸发器(vacuum evaporator，EYELA N-12，EYEKA CA-1112，东京理化器械株式会社(EYELA)出品，东京，日本)浓缩5小时至50mg/ml的低浓度。以-30℃、48小时的条件将经浓缩的上述海参内脏进行了第二次冷冻干燥。
实施例5：低浓度海参提取物液体
在通过清洗在百灵岛附近海域采集的刺参及黑海参并在-30℃温度下冷却、干燥48小时的第一次冷冻干燥步骤之后，粉碎经冻结的海参来制备成了粉末。将海参粉末放入75％的乙醇中孵育2小时之后，在70℃温度下蒸发浓缩3小时之后，使之通过棉状物来进行了过滤。利用真空蒸发器(vacuum evaporator，EYELA N-12，EYEKA CA-1112，东京理化器械株式会社(EYELA)出品，东京，日本)浓缩5小时至50mg/ml的低浓度。以-30℃、48小时的条件将经浓缩的上述海参进行了第二次冷冻干燥。通过将经第二次经冷冻干燥的海参提取物与丁二醇(butylene glycol)、水、乙基己二醇(ethyl hexanediol)及1，2-己二醇(1，2-hexanediol)溶剂混合来制备了5％浓度的海参提取物溶液。
实施例6：高浓度海参提取物液体
在通过清洗在百灵岛附近海域采集的刺参及黑海参并在-30℃温度下冷却、干燥48小时的第一次冷冻干燥步骤之后，粉碎经冻结的海参来制备成了粉末。将海参粉末放入75％的乙醇中孵育2小时之后，在70℃温度下蒸发浓缩3小时之后，使之通过棉状物来进行了过滤。利用真空蒸发器(vacuum evaporator，EYELA N-12，EYEKA CA-1112，东京理化器械株式会社(EYELA)出品，东京，日本)浓缩5小时至50mg/ml的低浓度。以-30℃、48小时的条件将经浓缩的上述海参进行了第二次冷冻干燥。通过将第二次经冷冻干燥的海参提取物与丁二醇(butylene glycol)、水、乙基己二醇(ethyl hexanediol)及1，2-己二醇(1，2-hexanediol)溶剂混合来制备了20％浓度的海参提取物溶液。
实验例1：皱纹改善试验
在-20℃温度下保管的试验物质在处理之前解冻并在维持培养基中稀释来进行了准备(参照下列表1)。将对照组与试验组每3D皮肤培养模型(韩国迪高(TEGO)科技公司(株))孔(well)向培养基层各处理3.5ml，并向细胞层表面上各处理30μl之后，在CO2培养箱(10％，CO2，37℃)中培养了24小时。培养24小时之后，更换培养基，并将对照组和试验组每3D皮肤培养模型(韩国迪高(TEGO)科技公司(株))孔向培养基层各反复处理3.5ml，向细胞层表面上各反复处理30μl之后，CO2培养箱(10％，CO2，37℃)中追加培养24小时，总共培养了48小时。培养48小时之后，收集所有组的培养液，并在-70℃温度下保管，组织制备了冻结块(frozen block)。
表1
在Ⅳ型胶原蛋白的情况下，除了省略了利用上述0.5％的曲拉通100(triton X-100)进行透性化(permeabilization)的过程之外，与Ⅳ型胶原蛋白相同地进行了试验，相对于位于表皮层内基底层的总细胞数，以百分比分析ki-67阳性细胞数并在下列表2及图5中示出。
表2
如上述表2中所示，与作为阴性对照组的比较例2相比，实施例3及4中Ⅳ型胶原蛋白的表达明显增加了。与作为阴性对照组的比较例2相比，实施例3及4的N＝3中的ki-67表达增加，通过实施例3的ki-67表达率在作为阴性对照组的比较例2的12.5(±3.6)％中以49.1(±7.8)％增加了3.9倍，实施例4的ki-67表达率在作为阴性对照组的比较例2的12.5(±3.6)％中以48.3(±10.2)％增加了3.9倍。
实验例1-2：MMP-9ELISA
人体MMP-9ELISA kit(R&D systems/DMP900)的试剂盒进行。为了MMP-9的标准曲线，利用1×校准稀释剂(calibrator diluent)将20ng/ml的MMP-9标准储备液按照各个步骤稀释，并制备了标准溶液，在下列表3中示出。
表3
向人体MMP-9微板的各个孔中放入检测稀释液(assay diluent)100μl，各添加100μl的空白液(blank)、标准溶液(standard)及试验溶液并在常温下反映了2小时。去除反应液，每孔添加400μl的漂洗缓冲液(wash buffer)之后，总重复3次去除的过程。每孔放入200μl的MMP-9缀合物(conjugate)之后，在遮光状态常温下反映了1小时。去除反应液，每孔添加400μl漂洗缓冲液之后，总重复3次去除的过程。使用基质溶液(substrate solution)之前，包含在kit中的显色剂(color reagent)A和B以相同的量混合制备，并将其每孔添加200μl，在遮光状态常温下反映了30分钟。每孔添加50μl的停止液(stop solution)并在30分钟以内在450nm波长测定了吸光度，利用MMP-9标准曲线分析了试验溶液的MMP-9分泌量。
免疫萤光染色法(Immunofluorescence staining)为利用冻结块并根据本身试验方法对Ⅳ型胶原蛋白进行。MMP-9分泌量利用收集的培养液并利用ELISA kit进行了定量分析。将MMP-9标准溶液吸光度结果在下列表4及图6中示出，将MMP-9分泌量在下列表5及图7中示出。
表4
表5
如上述表4及表5中所示，MMP-9的平均分泌量测定结果为比较例1为14.4(±3.1)ng/ml，比较例2为17.9(±1.6)ng/ml，作为阳性对照组的比较例4测定为14.8(±2.5)ng/ml，与作为阴性对照组的比较例1及2相比，MMP-9的分泌量无变化。实施例3的平均MMP-9分泌量为12.0(±1.4)ng/ml，与作为阴性对照组的比较例2相比，减少了0.7倍。
因此，如实验例1-1及1-2中所示，包含海参提取物作为有效成分的皮肤美容组合物与抗坏血酸(L-Ascorbin acid)比较时，呈现出具有同等以上的功效。
实验例2：美白皮肤试验
以-20℃保管的试验物质在处理之前解冻，并利用1×PBS(Diluent)稀释，以如下列表6准备。
表6
将试验物质向3D皮肤培养模型(Neoderm，韩国迪高(TEGO)科技公司(株))表面上每孔各处理100μl。在CO2培养箱(10％，CO2，37℃)中培养48小时之后，将残留于3D皮肤培养模型表面上的残留试验物质利用移液器去除。
然后，将3D皮肤培养模型用200μl的磷酸缓冲盐溶液(PBS)清洗2次，利用刀片(blade)从3D皮肤培养模型的***边缘刮除分离。将经分离的3D皮肤培养模型组织盛入1.5ml的微量离心管(e-tube)中，完全去除磷酸缓冲盐溶液之后，3D皮肤培养模型中添加裂解液(lysis buffer，SolvableTM)各360μl。在裂解液中反应5分钟之后，3D皮肤培养组织模型从膜分离去除。在95℃，微量恒温仪(heat block)中孵育45分钟，以13000rpm离心分离10分钟之后，将上清液移入新的微量离心管(eppendorf tube)。利用20mg/ml的NH4OH制备了100μl/ml的黑色素溶液之后，将制备的100μl/ml黑色素溶液利用裂解液如表7所示进行的阶段性稀释并制备标准溶液，将其结果在表7中示出。将标准溶液向96孔板中各移入200μl的空白溶液、标准溶液及试验物质并将在450nm测定吸光度的结果在表8中示出，利用黑色素标准曲线进行定量化来分析黑色素量的结果在下列表9及图9中示出。
表7
表8
表9
如上述表中所示，实施例5的N＝3的平均黑色素量测定为19.3(±009)μg/ml，与比较例3对比减少了13.6％，实施例6的N＝3的平均黑色素量测定为19.2(±0.4)μg/ml，与比较例3对比减少了13.8％。实施例1的N＝3的平均黑色素量测定为20.6(±1.0)μg/ml，与比较例2对比减少了2.2％，实施例2的N＝3的平均黑色素量测定为19.8(±0.7)μg/ml，与比较例2对比减少了6.3％。实施例3的N＝3的平均黑色素量测定为20.2(±1.4)μg/ml，与比较例2对比减少了4.5％，实施例4的N＝3的平均黑色素量测定为21.0(±0.6)μg/ml，与比较例2对比减少了0.4％。实施例1至4呈现出具有与熊果酚甙(arbutin)相似水平的美白功效。
如上所述的本发明的说明为用于例示的，本发明所属技术领域的普通技术人员应该理解的是，在不变更本发明的技术思想或必要特征的情况下也容易变形为其他具体形态。因此，应该理解的是，在以上描述的多个实施例在所有方面上为示例性的，而并不是限定性的。例如，以单一形式说明的各个结构要素可分散实施，同理，以分散形式说明的多个结构要素也能够以结合形态实施。本发明的范围由下文中的发明要求保护范围来呈现，而不是上述具体说明，并且应解释为由发明要求保护范围的意义及范围以及其等同替代物的概念导出的所有变更或变形形态包含在本发明的范围中。

Claims (14)

1.一种皮肤改善组合物，其特征在于，包含通过重复2次冷冻干燥来制备的海参提取物作为有效成分。
2.根据权利要求1所述的皮肤改善组合物，其特征在于，
上述海参提取物通过包括如下步骤的制备方法来制备：
对海参进行第一次冷冻干燥的步骤；
粉碎经冷冻干燥的上述海参来制备粉末的步骤；
对经粉碎的上述粉末进行孵育的步骤；
对经孵育的上述海参进行蒸发浓缩的步骤；
对经蒸发浓缩的上述海参进行过滤及冷凝的步骤；以及
对经冷凝的上述海参进行第二次冷冻干燥的步骤。
3.根据权利要求2所述的皮肤改善组合物，其特征在于，上述皮肤改善组合物通过包括如下步骤的制备方法来制备：在上述第一次冷冻干燥的步骤之前，对海参以-70℃至-100℃的温度进行超低温冷冻。
4.根据权利要求3所述的皮肤改善组合物，其特征在于，
上述第一次冷冻干燥的步骤包括：
将海参冷却至-20℃至-100℃温度的步骤；以及
将经冷却的上述海参干燥36小时至84小时的步骤。
5.根据权利要求2所述的皮肤改善组合物，其特征在于，在上述孵育的步骤中，通过向经粉碎的上述粉末中加入55％至95％的乙醇来孵育1小时至3小时。
6.根据权利要求2所述的皮肤改善组合物，其特征在于，在上述蒸发浓缩的步骤中，在55℃至100℃温度下蒸发浓缩1.5小时至5小时。
7.根据权利要求1所述的皮肤改善组合物，其特征在于，上述海参为刺参和/或黑海参。
8.根据权利要求1所述的皮肤改善组合物，其特征在于，上述海参提取物是仅使用海参内脏提取的。
9.根据权利要求2所述的皮肤改善组合物，其特征在于，上述海参提取物通过还包括如下步骤的制备方法来制备：通过将经第二次冷冻干燥的上述海参溶解于溶剂中来制备溶液。
10.根据权利要求9所述的皮肤改善组合物，其特征在于，上述溶剂为选自由丁二醇、水、乙基己二醇及1，2-己二醇组成的组中的一种以上。
11.根据权利要求1所述的皮肤改善组合物，其特征在于，上述皮肤改善为皮肤再生活性。
12.根据权利要求8所述的皮肤改善组合物，其特征在于，上述皮肤再生活性为Ⅳ型胶原蛋白的表达量的增加、作为细胞活性因子的ki-67的增加和/或基质金属蛋白酶的分泌量减少。
13.根据权利要求1所述的皮肤改善组合物，其特征在于，上述皮肤改善为美白皮肤。
14.根据权利要求10所述的皮肤改善组合物，其特征在于，上述美白皮肤为抑制黑色素生成。
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