KR20140004707A - 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포와 그의 제조 방법 및 약제 대사 독성 시험 방법 - Google Patents

다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포와 그의 제조 방법 및 약제 대사 독성 시험 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은, 약제의 대사 및 독성 시험에 사용 가능한 기능적 간세포를 다능성 줄기 세포로부터 제작하는 것에 관한 것이다. 다능성 줄기 세포를 이용하여 고기능 간세포를 제조하는 방법으로서, 공정 (A), (B)를 포함하는 방법에 의해, 다능성 줄기 세포로부터 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽을 얻고, 공정 (C)를 포함하는 방법에 의해, 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽으로부터 간 전구 세포를 얻고, 공정 (D)를 포함하는 방법에 의해, 간 전구 세포로부터 고기능 간세포를 얻는 것을 특징으로 하는 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포의 제조 방법.
(A) 무혈청이면서 또한 무피더 환경하에서 배양하는 공정
(B) 알부민과 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하는 공정
(C) SHH 또는 SHH 아고니스트와, 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하는 공정
(D) 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하여 성숙시키는 공정

Description

다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포와 그의 제조 방법 및 약제 대사 독성 시험 방법{HIGHLY FUNCTIONAL LIVER CELLS DERIVED FROM PLURIPOTENT STEM CELLS, METHOD FOR PRODUCING SAME, AND METHOD FOR TESTING METABOLISM/TOXICITY OF DRUG}
본 발명은 다능성 줄기 세포를 이용하여 고기능 간세포를 제조하는 방법과, 그 중간 산물인 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽 및 간 전구 세포를 제조하는 방법, 및 그 방법에 의해서 제조되는 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽, 간 전구 세포, 고기능 간세포, 또한, 고기능 간세포를 이용한 약제의 대사 및 독성의 시험 방법에 관한 것이다.
간장은, 생체에서의 주된 해독 장기이며, 다양한 약제의 대사를 담당하고 있다. 모든 약제가, 인간 생체로 투여되었을 때에, 많든 적든 간장에 부담을 주는 것으로 알려져 있다. 그 정도는, 경도의 간 기능 변화에서부터, 고도의 간 기능 부전까지 광범위에 걸치지만, 사전에 그것을 적절히 예측하기 위한 수단은 없다.
신규로 개발된 약제의 안전성의 검증은, 현재, 약사법상의 승인을 얻기 위해서 행해지는 임상 시험(치험)에 의해 행해지고 있다. 그러나 임상 시험의 실시에는 막대한 예산 및 세월이 필요하다. 또한 최근에는, 연구 개발중인 약제가, 그 간독성에 의해 개발 중지되는 경우의 비율이 늘어나고 있는 것이 문제가 되고 있다. 또한, 임상 시험을 끝내고 출시된 약제 중에도, 위독한 간 장해의 발증예가 보고되어 발매 중지되는 경우도 있어, 배상금 지불이라는 부담도 제약 기업에 압력으로 작용한다. 예를 들면, 세계적인 거대 제약 기업인 화이자(Pfizer)사가 개발한 항 당뇨병약 레줄린(Rezulin)은, 간 독성 때문에 발매 중지되었는데, 이에 의해 화이자사가 입은 손실은 수억 달러에 달하는 것으로 보고되었다(비특허문헌 1).
또한, 약제의 간 독성은 개인차도 커서, 임상 시험에서 독성이 충분히 파악되지 않는 경우도 있다. 이 때문에, 출시된 약제가 불행한 사고를 초래하여 판매 중지되는 예도 드물지 않다.
그 때문에, 임상 시험 실시 전에, 미리 시험관 내(in vivo)의 시험에 의해, 약제의 대사 및 독성을 평가할 수 있는 시스템을 구축하는 것은, 창약 사업에 있어서의 급선무로 되어 있다. 이러한 시스템의 제공은, 세계적 수준에서의 창약 연구의 향상과, 창약 사업의 촉진에 크게 공헌한다.
현재, 시험관 내에서의 약제 대사·독성 시험을 위한 기술로서, 1) 인간 간 세그먼트를 사용한 것, 2) 인간 초대 배양 간세포를 이용한 것, 3) 인간 간세포주를 이용한 것, 4) 인간 간세포 마이크로솜을 이용한 것이 적용되고 있다.
이 중, 인간 간 세그먼트 및 인간 초대 배양 간세포는, 로트간이나 개인간의 활성 편차가 크고, 또한 시험관 내의 실험에서의 활성이 매우 불안정하기도 한 점에서, 사용시에 있어서의 문제가 크다.
인간 간세포주에 관해서는, 그 대부분이 약제 대사·독성 시험에 대한 사용이 부적당한 것으로 알려져 있다. 유일하게, HapaRG(비특허문헌 2)가 약제 대사·독성 시험에 대한 사용이 가능한 것으로 되어 있지만, 이것은 특정한 일 개인에게서 유래하는 세포주인 점에서, 약제 대사·독성에서의 개인차를 평가하는 것은 불가능하다.
인간 간세포 마이크로솜은, 약제 대사에 관한 평가는 가능하지만, 이것은 간세포 그 자체가 아니라, 어디까지나 마이크로솜 분획을 정제한 것에 지나지 않아, 간세포 그 자체에 대한 독성 평가는 불가능하다. 또한 인간 간세포 마이크로솜의 제조에는 막대한 비용이 필요한 것도 문제로 되어 있다.
이러한 관점에서는, 무한 증식능과 다능성 분화능을 더불어 갖는 인간 다능성 줄기 세포로부터 기능적 간세포를 제작하는 기술을 개발하는 것은, 상기한 문제점을 모두 해결하는 것이 된다. 즉, 이 기술에 의해, 약제 대사·독성에 관한 평가의 질과 효율이 비약적으로 향상된다.
인간 다능성 줄기 세포인 인간 배성 줄기(ES) 세포 및 인간 인공 다능성 줄기(iPS) 세포로부터 기능적 간세포를 제작하는 기술로서, 지금까지 몇 가지인가가 보고되었으며, 관련 기술도 보고되었다(특허문헌 1 내지 3).
간장에서의 약제 대사에 주로 관여하는 시토크롬 P450 효소의 활성을 검출할 수 있는 기술도 보고되어 있다. 그러나, 종래 기술은 모두, 제작된 간세포에 있어서, 약제 비첨가시부터 시토크롬 P450 효소 활성이 충분히 현재화하고 있어, 약제 첨가에 따른 시토크롬 P450 효소 활성 상승은 전혀 검출되지 않았다는 치명적인 문제점이 있다(비특허문헌 3 내지 8).
또한 종래의 기술에서는, 1) 배양계에 소 태아 혈청이 첨가되어 있고, 2) 배양계에 마우스에서 유래하는 피더 세포가 공존하고, 3) 인간 다능성 줄기 세포로부터의 분화 지향성에 관해서는 주간에서의 편차가 매우 크다(비특허문헌 9)는 중요한 과제가 해결되지 않았다.
소 태아 혈청이 존재하면, 평가계에 첨가된 약제가 혈청 성분에 흡착되기 때문에, 약제 본래의 대사·독성을 정확하게 평가하는 것이 불가능해진다. 마찬가지로, 마우스 유래 세포가 공존하는 경우도, 약제 대사·독성 측정계가 교란될 위험성이 있다. 또한 간세포 제작 효율에 관한 주간 차가 큰 것은, 약제 대사·독성의 측정계를 불안정하게 하기 때문에, 주가 유래하는 곳의 개인차를 검증하는 것은 불가능해진다.
따라서, 약제 대사·독성 시험을 적절하면서도 또한 유효하게 실시하기 위해서는, 주간 차가 없는 안정된 배양 기술에 의해, 인간 다능성 줄기 세포로부터, 무혈청·무피더 환경하에서, 약제 첨가에 의존한 시토크롬 P450 효소 활성 변화의 검출을 가능하게 하는 기능적 간세포의 개발이 급선무이다.
일본 특허 공개 제2010-75199호 "인간 배줄기 세포를 신속히 확대하기 위한 배양계" 일본 특허 공개 제2008-212150호 "인간 배줄기 세포 유래의 췌도 세포" 일본 특허 공표 제2010-529851호 "다중 분화능성/다능성 세포 및 방법"
Nicholls H, Drug Discovery Today지, 제8권, 제1055페이지 Gripon P 등, 미국 과학 아카데미 기요, 제99권, 제15655 내지 15660페이지 Inamura M 등, Molecular Therapy지(제1판) 2010년 Liu H 등, Hepatology지, 제51권, 제1810 내지 1819페이지 Sullivan GJ 등, Hepatology지, 제51권, 제329 내지 335페이지 Touboul T 등, Hepatology지, 제51권, 제1754 내지 1765페이지 Duan Y 등, Stem Cells지, 제28권, 제674 내지 686페이지 Hay DC 등, 미국 과학 아카데미 기요, 제105권, 제12301 내지 12306페이지 Osafune K 등, 네이처·바이오 테크놀러지지, 제26권, 제313 내지 315페이지 실험 의학 Vol.26, No.5 (증간), 제35 내지 40페이지, 2008년 Mitaka T 등, Biochemicaland Biophysical Research Communications지, 제214권, 제310 내지 317페이지, 1995년 Chen Q 등, NatureProtcol지, 제2권, 제1197 내지 1205페이지, 2007년 Zhao D 등, PLoSOne지, 제4권, e6468, 2009년
본 발명은 다능성 줄기 세포로부터 고품질의 기능적 간세포를 안정적으로 제작하는 기술을 제공하는 것을 주된 과제로 한다. 특히, 인간 다능성 줄기 세포로부터, 약제의 대사 및 독성 시험에 사용되는 고품질의 기능적 간세포를 제작하는 것을 과제로 한다.
본 발명은 또한, 인간 다능성 줄기 세포로부터, 약제 첨가에 의존한 시토크롬 P450 효소 활성 변화를 검출 가능하게 하는 기능적 간세포를, 무혈청이면서 또한 무피더(feeder-free)의 환경하에서, 인간 다능성 줄기 세포의 주간 차 없이 안정적으로 제작하는 기술을 제공하는 것을 과제로 한다.
본 발명은 또한, 맞춤 의료(tailor-made medicine)도 감안하여, 임의의 개인의 체세포로부터, 센다이 바이러스 벡터에 의해 외래 유전자의 게놈 삽입을 초래하지 않고 수립된 인간 iPS 세포로부터, 약제 첨가에 의존한 시토크롬 P450 효소 활성 변화를 검출 가능하게 하는 기능 간세포를, 무혈청이면서 또한 무피더의 환경하에서 주간 차 없이 안정적으로 제작하기 위한 기술의 제공을 통해, 약제의 간독성에 관한 개인차를 시험관 내에서 평가하기 위한 시스템을 제공하는 것도 과제로 한다.
본 발명자들은, 인간 다능성 줄기 세포로부터의 간세포 분화 유도 배양에 있어서, 미리 적절한 밀도로 파종된 인간 다능성 줄기 세포를 제조해 두는 것이 열쇠가 됨을 발견하였다.
구체적으로는, 인간 다능성 줄기 세포의 각 집괴(集塊)가 서로 정확히 접하는 밀도가 최적인 것을 발견하였다. 이에 의해, 종래에는 제작이 매우 곤란했고, 주간에 따라 편차도 컸던 인간 다능성 줄기 세포로부터의 간세포 분화가, 고효율이면서도 또한 주간 차 없이 안정적으로 실시 가능해졌다.
본 발명자들은, 또한, 인간 다능성 줄기 세포로부터의 간세포 분화 유도 배양에 있어서, 종래 행해져 왔던 혈청 또는 혈청 대체물의 첨가가, 분화 유도 효율을 현저히 저해하는 것을 발견하였다.
혈청 및 혈청 대체물의 결여는, 한편으로, 인간 다능성 줄기 세포의 생존성을 현저히 저하시킨다. 그 때문에, 인간 다능성 줄기 세포로부터의 간세포 분화 유도 배양에 있어서는, 혈청 또는 혈청 대체물이 존재하거나 결손되어도, 분화 유도 효율은 현저히 낮으면서 또한 불안정해진다는 딜레머가 있음을 발견하였다.
이 문제를 해결하기 위해서, 본 발명자들은, 인간 다능성 줄기 세포로부터의 간세포 분화 유도 효율을 저하시키지 않고, 또한 생존성을 높이기 위해서는, 분화 유도 초기 스텝에서, 배양계에 인간 리콤비넌트·알부민을 첨가하는 것이 매우 유효함을 발견하였다.
본 발명자들은, 또한, 마우스 발생에 있어서, 간장과 췌장의 공통 선조로부터의 간장 분화의 촉진 인자로서 알려져 있던 소닉 헤지호그(sonic hedgehog; SHH) 단백을, 인간 다능성 줄기 세포로부터의 간세포화 유도 배양계에 첨가하는 것이, 분화 유도의 효율화와 안정화에 유효한 것을 발견하였다.
본 발명자들은, 또한, 분화 유도 개시 전에, 미리 미분화 상태에 있는 인간 다능성 줄기 세포로부터, 효율적이면서도 또한 세포에 손상을 주지 않고 피더 세포(마우스 태아 섬유아세포)를 제거하는 방법으로서, 침강 속도차를 이용한 분리가 유효한 것을 발견하였다. 이에 따라, 인간 다능성 줄기 세포로부터, 빠르게 무피더 환경하에서 효율적으로 간세포 분화 유도를 실시하는 것이 가능해졌다.
이들 지견을 기초로, 본 발명은 다음 구성을 구비한다.
즉, 본 발명의 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포의 제조 방법은, 다능성 줄기 세포를 이용하여 고기능 간세포를 제조하는 방법으로서, 공정 (A), (B)를 포함하는 방법에 의해, 다능성 줄기 세포로부터 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽을 얻고, 공정 (C)를 포함하는 방법에 의해, 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽으로부터 간 전구 세포를 얻고, 공정 (D)를 포함하는 방법에 의해, 간 전구 세포로부터 고기능 간세포를 얻는 것을 특징으로 한다.
(A) 무혈청이면서 또한 무피더 환경하에서 배양하는 공정
(B) 알부민과 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하는 공정
(C) SHH 또는 SHH 아고니스트와, 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하는 공정
(D) 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하여 성숙시키는 공정
또한, 본 발명의 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽의 제조 방법은, 다능성 줄기 세포를 이용하여 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽을 제조하는 방법으로서, 공정 (A), (B)를 포함하는 방법에 의해, 다능성 줄기 세포로부터 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽을 얻는 것을 특징으로 한다.
(A) 무혈청이면서 또한 무피더 환경하에서 배양하는 공정
(B) 알부민과 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하는 공정
여기서, 공정 (A)에서, 다능성 줄기 세포를 그 각 집괴가 서로 접하는 밀도로 파종할 수도 있다.
공정 (A)에서, 침강 속도차에 의한 분리에 의해 피더 세포를 제거할 수도 있다.
공정 (B)에서, 알부민으로 인간 리콤비넌트·알부민을 이용할 수도 있다.
또한, 본 발명의 간 전구 세포의 제조 방법은, 원시 내배엽을 이용하여 간 전구 세포를 제조하는 방법으로서, 공정 (C)를 포함하는 방법에 의해, 원시 내배엽으로부터 간 전구 세포를 얻는 것을 특징으로 한다.
(C) SHH 또는 SHH 아고니스트와, 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하는 공정
여기서, 공정 (C)에서, 원시 내배엽으로 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽을 이용할 수도 있다.
또한, 본 발명의 고기능 간세포의 제조 방법은, 간 전구 세포를 이용하여 고기능 간세포를 제조하는 방법으로서, 공정 (D)를 포함하는 방법에 의해, 간 전구 세포로부터 고기능 간세포를 얻는 것을 특징으로 한다.
(D) 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하여 성숙시키는 공정
이상에서, iPS 세포로 센다이 바이러스 벡터에 의해 수립된 iPS 세포를 이용할 수도 있다.
다능성 줄기 세포로 인간 다능성 줄기 세포를 이용할 수도 있다.
또한, 본 발명의 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포는, 다능성 줄기 세포를 이용하여 제조되는 고기능 간세포로서, 공정 (A), (B)를 포함하는 방법에 의해, 다능성 줄기 세포로부터 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽을 얻고, 공정 (C)를 포함하는 방법에 의해, 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽으로부터 간 전구 세포를 얻고, 공정 (D)를 포함하는 방법에 의해, 간 전구 세포로부터 얻어지는 것을 특징으로 한다.
(A) 무혈청이면서 또한 무피더 환경하에서 배양하는 공정
(B) 알부민과 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하는 공정
(C) SHH 또는 SHH 아고니스트와, 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하는 공정
(D) 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하여 성숙시키는 공정
또한, 본 발명의 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포는, 다능성 줄기 세포를 이용하여 제조되는 고기능 간세포로서, 덱사메타손(Dexamethasone) 첨가시의 시토크롬 P450 효소 활성치가 HepaRG 세포의 2배 이상이고, ICG 취득 및 방출 활성을 가지며, PAS 염색 양성이고, A1AT를 발현하며, 담관 상피 세포로도 분화 가능한 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽은, 다능성 줄기 세포를 이용하여 제조되는 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽으로서, 공정 (A), (B)를 포함하는 방법에 의해, 다능성 줄기 세포로부터 얻어지는 것을 특징으로 한다.
(A) 무혈청이면서 또한 무피더 환경하에서 배양하는 공정
(B) 알부민과 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하는 공정
또한, 본 발명의 간 전구 세포는, 원시 내배엽을 이용하여 제조되는 간 전구 세포로서, 공정 (C)를 포함하는 방법에 의해, 원시 내배엽으로부터 얻어지는 것을 특징으로 한다.
(C) SHH 또는 SHH 아고니스트와, 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하는 공정
또한, 본 발명의 고기능 간세포는, 간 전구 세포를 이용하여 제조되는 고기능 간세포로서, 공정 (D)를 포함하는 방법에 의해, 간 전구 세포로부터 얻어지는 것을 특징으로 한다.
(D) 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하여 성숙시키는 공정
이상에서, 다능성 줄기 세포가 ES 세포 또는 iPS 세포일 수도 있다.
다능성 줄기 세포가 인간 다능성 줄기 세포일 수도 있다.
또한, 본 발명의 약제 대사의 시험 방법은, 상술한 것 중 어느 한 항에 기재된 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포를 이용하여 약제의 대사를 정량하는 것을 특징으로 한다.
또한, 본 발명의 약제 독성의 시험 방법은, 상술한 것 중 어느 한 항에 기재된 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포를 이용하여 약제에 의한 세포사를 정량하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 의해, 다능성 줄기 세포로부터 고품질의 기능적 간세포를 안정적으로 제작하는 기술을 제공할 수 있었다.
또한 본 발명에 의해, 인간 다능성 줄기 세포로부터, 약제 첨가에 의존한 시토크롬 P450 효소 활성 변화를 검출 가능하게 하는 기능적 간세포를, 무혈청이면서 또한 무피더의 환경하에서, 인간 다능성 줄기 세포의 주간 차 없이 안정적으로 제작할 수 있었다.
도 1은 SeV-iPS 세포에서의 형태 변화를 나타내는 현미경 사진이다.
도 2는 SeV-iPS 세포에서의 SSEA4, OCT4의 각 미분화 마커의 발현을 나타내는 FACS 스캔 결과의 그래프이다.
도 3은 SeV-iPS 세포에서의 SSEA4, OCT3/4, 나노그(Nanog)의 각 미분화 마커의 발현을 나타내는 면역 염색 사진이다.
도 4의 A는 SeV-iPS 세포에서의 SeV 벡터 유래 외래 유전자 제거를 나타내는 전기 영동 사진이다.
도 4의 B는 SeV-iPS 세포에서의 SeV 벡터 유래 외래 유전자 제거를 나타내는 현미경 사진이다.
도 5는 인간 iPS 세포(#40주) 유래 간세포의 위상차 현미경 사진이다.
도 6은 간세포 마커 검출용의 RT-PCR용 프라이머의 표이다.
도 7은 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 간세포의 RT-PCR의 전기 영동 사진이다.
도 8은 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 간세포의 정량 RT-PCR의 그래프이다.
도 9는 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 간세포의 면역 염색에 의한 사진이다.
도 10은 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 간세포의 웨스턴 블로팅(Western Blotting)에 의한 사진이다.
도 11은 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 간세포의 PAS 염색에 의한 현미경 사진이다.
도 12는 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 간세포의 ICG 취득과 방출을 나타내는 현미경 사진이다.
도 13은 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 간세포의 시토크롬 P450 활성을 나타내는 그래프이다.
도 14의 A는 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 간세포의 현미경 사진이다.
도 14의 B는 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 간세포의 현미경 사진이다.
도 14의 C는 다능성 줄기 세포로부터 분화 유도된 간세포의 현미경 사진이다.
도 15의 (A), (B)는 인간 배성 줄기 세포 유래 간세포, 미분화 인간 배성 줄기 세포를 이용한 약제 독성 시험을 나타내는 그래프, (C), (D)는 인간 iPS 세포 유래 간세포, 미분화 인간 iPS 세포를 이용한 약제 독성 시험을 나타내는 그래프, (E), (F)는 인간 SeV-iPS 세포 유래 간세포, 미분화 인간 SeV-iPS 세포를 이용한 약제 독성 시험을 나타내는 그래프, (G), (H)는 HepaRG 세포, HepG2 세포를 이용한 약제 독성 시험을 나타내는 그래프이다.
도 16은 D-GalN의 간세포 독성에 관한 특이성을 나타내는 그래프이다.
도 17의 (A)는 인간 iPS 세포 유래 간세포(#40)의 형태를 나타내는 현미경 사진, (B)는 인간 배성 줄기 세포 유래 간세포(KhES-1)의 형태를 나타내는 현미경 사진이다.
도 18의 (A)는 인간 인공 다능성 줄기 세포 유래 간세포에서의 EpCAM 및 α-FP의 면역 염색에 의한 사진, (B)는 인간 인공 다능성 줄기 세포 유래 간세포에서의 BrdU 및 Ki67의 면역 염색에 의한 사진, (C)는 인간 인공 다능성 줄기 세포 유래 간세포에서의 Alb의 면역 염색에 의한 사진, (D)는 인간 인공 다능성 줄기 세포 유래 간세포에서의 AAT의 면역 염색에 의한 사진, (E)는 인간 인공 다능성 줄기 세포에서의 EpCAM 및 α-FP의 면역 염색에 의한 사진, (F) 인간 인공 다능성 줄기 세포에서의 BrdU 및 Ki67의 면역 염색에 의한 사진이다.
도 19의 (A), (B), (C), (D)는 인간 배성 줄기 세포 및 인간 인공 다능성 줄기 세포로부터 유도된 간세포 중의 간 줄기/전구 세포 집단의 계대 배양 후의 현미경 사진, (E)는 α-FP, TDO2, AAT의 발현을 나타내는 RT-PCR의 전기 영동 사진이다.
이하에, 본 발명의 실시 형태를, 도면에 나타내는 실시예를 기초로 설명한다. 또한, 실시 형태는 하기의 예시에 한하지 않고, 본 발명의 취지로부터 일탈하지 않은 범위에서, 상기 문헌 등 종래 공지된 기술을 이용하여 적절하게 설계 변경 가능하다.
본 발명에 의한 고기능 간세포는, 다능성 줄기 세포를 이용하여 제조되는 고기능 간세포로서, 공정 (A), (B)를 포함하는 방법에 의해, 다능성 줄기 세포로부터 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽을 얻고, 공정 (C)를 포함하는 방법에 의해, 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽으로부터 간 전구 세포를 얻고, 공정 (D)를 포함하는 방법에 의해 간 전구 세포로부터 얻어진다.
(A) 무혈청이면서 또한 무피더 환경하에서 배양하는 공정
(B) 알부민과 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하는 공정
(C) SHH 또는 SHH 아고니스트와, 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하는 공정
(D) 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하여 성숙시키는 공정
다능성 줄기 세포로부터 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포를 얻기 위해서는, 전형적으로는, 다능성 줄기 세포를 마우스 태아 섬유아세포 등의 피더 세포로부터 분리한 후, 매트리겔(Matrigel)(등록상표)(BD사 제조) 등으로 코팅한 배양 접시 위에, 다능성 줄기 세포의 각 세포 집괴가 서로 정확히 접하는 밀도로 파종한 뒤에, 미분화 유지용 배지에서 3일 정도 배양하고 나서, 중내배엽 분화 배지, 배체내배엽 분화 배지, 간 전구 세포 분화 유도 배지, 간세포 성숙 촉진 배지를 이용하여 순차 배양함으로써 행한다.
다능성 줄기 세포로부터의 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포의 제작 기간은, 20 내지 30일 정도다.
각 분화 배지 및 성숙 촉진 배지는, 범용의 기초 배지나 무혈청 배양용 배지에, 적어도 1종의 사이토카인을 10ng/ml 내지 200ng/ml 정도, 또는 적어도 1종의 호르몬을 0.1μM 정도 첨가한 배지이다. 배지는, 희망에 따라, 세포의 유지 및 분화에 악영향을 끼치지 않는 한, 적절한 다른 첨가물을 함유하고 있어도 좋다. 범용의 기초 배지로는 DMEM, DMEM/F12, RPMI, IMDM 등을 들 수 있다. 무혈청 배양용 배지로는 에스클론 SF-B(산코준야쿠사 제조), 에스클론 SF-03(산코준야쿠사 제조), ASF-104(아지노모또사 제조), ASF-104N(아지노모또사 제조), X-VIVO 10(론자(Lonza)사 제조), X-VIVO 15(론자사 제조) 등을 들 수 있다.
분화 배지 및 성숙 촉진 배지의 기본 배양 성분으로는, 인간 다능성 줄기 세포에서 간세포로의 분화를 유도하는 데 적합한 배지이면 좋고, 예를 들면, 로스웰 파크 메모리얼 인스티튜트(Roswell Park Memorial Institute; RPMI) 1640 등을 들 수 있다.
분화 유도에서의 배양 조건은, 이용되는 인간 다능성 줄기 세포의 종류에 따라 적절하게 설정할 수 있는데, 예를 들면, 37℃, 5% 부피 탄산 가스 배양 장치(5% CO2 인큐베이터)의 조건 등을 들 수 있다.
이하, 상세히 본 발명을 설명한다.
본 발명에서 이용하는 다능성 줄기 세포 유래 배체내배엽이란, 다능성 줄기 세포 유래의 배체내배엽이다. 배체내배엽이란, 초기 발생에 있어서 원장 관입 후에 형성되는 중내배엽에서 유래되는 내배엽 성분이며, 태아의 소화관 조직의 형성에 기여하여, SOX17나 FOXA2 등의 전사 인자를 발현한다. 배체내배엽은, 공정 (A), (B)를 포함하는 방법으로 얻을 수 있다.
(A) 무혈청이면서 또한 무피더 환경하에서 배양하는 공정
(B) 알부민과 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하는 공정
이하, 각 공정에 대해서 설명한다.
(A) 무혈청이면서 또한 무피더 환경하에서 배양하는 공정:
다능성 줄기 세포란, 다능성을 갖는 줄기 세포를 가리키며, 예를 들면 ES 세포, iPS 세포, 정소 줄기 세포, 성체 줄기 세포, 뮤즈(Muse) 세포 등을 들 수 있다.
또한, 출발 원료의 다능성 줄기 세포는, 인간 다능성 줄기 세포이어도 좋다. 이 경우, 다능성 줄기 세포는, 인간에게서 유래되며, 다능성 분화능을 유지하는 세포군이다. 이것에는, 인간 ES 세포, 인간 iPS 세포, 인간 정소 줄기 세포, 인간 성체 줄기 세포, 인간 뮤즈 세포 등이 포함된다.
출발 원료인 다능성 줄기 세포의 입수 방법 및 수립 방법은 공지되어 있다. 예를 들면, 인간 ES 세포의 경우, 문부 과학성에서 허가를 얻은 뒤에, 일본 수립 기관(쿄오토 대학, 국립 육성 의료 연구 센터)으로부터의 분여나, 국외 시설(개인 기업, 대학 등)로부터의 분여 또는 구입이 가능하다. 또한 인간 iPS 세포에 대해서는, 센다이 바이러스(SeV) 벡터를 이용하는 방법이 바람직하며, 예를 들면 시판되고 있는 인간 섬유아세포 등을, 리프로그램 인자 발현 유닛을 탑재한 센다이 바이러스 벡터가 첨가된 배지에서 배양함으로써 수립된다. 리프로그램 인자 발현 유닛을 탑재한 센다이 바이러스 벡터로는, 예를 들면 사이토튠-iPS(CytoTune-iPS)(디나벡 가부시끼가이샤 제조) 등을 들 수 있다. 레트로바이러스 벡터를 이용하여 제작한 인간 iPS 세포는, 이화학 연구소 바이오리소스 센터에서의 구입이나, 쿄오토 대학이나 국립 육성 의료 연구센터로부터의 분여가 가능하다.
공정 (A)에서 사용하는 미분화 유지 배지는, 범용의 미분화 유지 배지를 이용할 수도 있지만, 보다 바람직하게는 섬유아세포 증식 인자 2(FGF2) 등의 사이토카인이 첨가되지 않은 미분화 유지 배지이다.
무혈청이면서 또한 무피더 환경하에서 배양한다는 것은, 동물 혈청 및 인간 혈청을 포함하지 않는 배지를 이용하여, 해당 다능성 줄기 세포 이외의 세포종(예를 들면 마우스 태아 섬유아세포)이 공존하지 않는 환경하에서 배양하는 것이다. 이때, 다능성 줄기 세포의 배양 밀도는, 다능성 줄기 세포의 각 세포 집괴가 서로 정확히 접하는 밀도인 것이 가장 바람직하다.
이것보다 저밀도인 경우에는, 분화 유도 초기에 현저한 세포사가 야기되거나, 생존 세포가 남는 경우에도, 그 대부분은 나무상 돌기가 많은 비내배엽계 세포로 분화하게 된다. 또한 이것보다 고밀도인 경우에는, 분화 후기에 형성되는 내배엽 유래 조직에 특징적인 삼차원적 구축을 나타내는 영역으로부터 현저한 세포사가 유도되게 된다.
(B) 알부민과 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하는 공정:
알부민은 인간의 리콤비넌트 알부민이 바람직하고, 알부민의 양은 0.1 내지 1% 정도, 바람직하게는 0.3% 정도다.
공정 (B)에서 이용하는 사이토카인의 예는, Wnt3A나 액티빈(Activin) A 등이다. 사이토카인의 양은, 예를 들면, Wnt3A는 10 내지 50ng/mL 정도, 바람직하게는 25ng/ml 정도, 액티빈 A는 10 내지 100ng/ml 정도, 바람직하게는 100ng/ml 정도다.
공정 (A)에 의해 제조된 미분화 다능성 줄기 세포를, 인간 리콤비넌트 알부민, Wnt3A, 액티빈 A를 포함하는 배지를 이용하여, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 1일 정도 배양함으로써 다능성 줄기 세포 유래 중내배엽을 얻을 수 있다. 이것을 또한 액티빈 A와 혈청 대체품을 포함하는 배지를 이용하여, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 1일 정도 배양함으로써 다능성 줄기 세포 유래 배체내배엽을 얻을 수 있다. 또한 혈청 대체품으로는, 녹아웃(KnockOut)(등록상표) 혈청 대체품(라이프 테크놀로지스(Life Technologies)사 제조) 등을 들 수 있다.
다능성 줄기 세포 유래 배체내배엽이 생긴 것은, SOX17이나 FOXA2 등의 배체내배엽 형성의 열쇠가 되는 전사 인자의 발현 유도를 RT-PCR 등에 의해서 확인할 수 있다.
본 발명에서 이용하는 간 전구 세포란, 원시 장관에서 간세포로의 코미트먼트가 일어난 세포이며, 공정 (C)를 포함하는 방법으로 얻을 수 있다.
(C) SHH 또는 SHH 아고니스트와, 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하는 공정:
SHH 또는 SHH 아고니스트란, 각각, 소닉 헤지호그·패스웨이를 활성화하는 리콤비넌트 펩티드 또는 약제이다. SHH로는, 인간의 소닉 헤지호그 단백의 N말단 펩티드 단편(Cys24-Gly197), SHH 아고니스트로는 클로로벤조티오펜 함유 헤지호그 아고니스트(SAG)를 들 수 있다. 소닉 헤지호그 N말단 펩티드 단편의 농도는, 예를 들면, 100 내지 400ng/ml, SAG의 농도는, 예를 들면, 1 nM 내지 500nM이고, 바람직하게는, 소닉 헤지호그 N말단 펩티드 단편의 농도는 200ng/ml 정도, SAG의 농도는 100nM 정도다.
공정 (C)에서 이용하는 사이토카인의 예는, 섬유아세포 증식 인자 2(FGF2), 뼈 형성 인자 4(BMP4), 간세포 증식 인자(HGF) 등이다. 사이토카인의 양은, 예를 들면, FGF2는 5 내지 50ng/ml, BMP4는 5 내지 50ng/ml, HGF는 5 내지 50ng/ml이고, 바람직하게는 FGF2는 10ng/ml 정도, BMP4는 20ng/ml 정도, HGF는 20ng/ml 정도다. 구체적으로는, 공정 (B)에서 얻어진 다능성 줄기 세포 유래 배체내배엽을, 예를 들면, 2%의 혈청 대체품을 포함하는 RPMI1640 등의 기초 배지에 FGF2, BMP4, SHH를 첨가한 배양액으로 5일 정도 배양한 후, 예를 들면, 2%의 혈청 대체품을 포함하는 RPMI1640 등의 기초 배지에 FGF2, BMP4, HGF를 첨가한 배양액으로 4일 정도 배양함으로써 다능성 줄기 세포 유래 간 전구 세포를 얻을 수 있다. 여기서, 전반에서는 SHH를 첨가한 배양액을 이용하고, 후반에서는 SHH를 첨가하지 않은 배양액을 이용하고 있지만, 후반에서도 SHH를 첨가한 배양액을 이용할 수도 있다. 또한, 각 배양 기간에서, 적어도 1회의 배지 교환을 행하는 것이 바람직하다.
다능성 줄기 세포 유래 간 전구 세포가 제작된 것은, HNF4a 등의 간원기 형성의 열쇠가 되는 전사 인자나, α 페토프로테인 등의 간원기 마커 유전자의 발현 유도를 RT-PCR이나 웨스턴 블로팅 등에 의해서 확인할 수 있다.
본 발명의 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포는, 공정 (D)를 포함하는 방법으로 얻을 수 있다.
(D) 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하여 성숙시키는 공정:
여기서 이용하는 사이토카인 및 호르몬의 예는, 온코스타틴 M(OSM)이나 덱사메타손 등이다. 이용하는 양은, 예를 들면, OSM은 10 내지 50ng/ml, 덱사메타손은 0.05 내지 0.5μM이고, 바람직하게는 OSM은 25ng/ml 정도, 덱사메타손은 0.1μM 정도다.
공정 (C)에서 얻어진 다능성 줄기 세포 유래 간 전구 세포를, 예를 들면, 2%의 혈청 대체품을 포함하는 RPMI1640 등의 기초 배지에 OSM과 덱사메타손을 첨가한 배양액으로 2주 정도 배양함으로써, 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포를 얻을 수 있다. 또한, 이 배양 기간에서, 3일에 1회 정도의 빈도로 배지 교환을 행하는 것이 바람직하다.
이와 같이 하여 얻어진 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포는, 고농도(10μM 정도)의 덱사메타손을 첨가했을 때의 시토크롬 P450 효소 활성치가 HepaRG 세포의 그것의 2배 이상이고, 인도시아닌그린(ICG) 취득 및 방출 활성을 가지며, 과요오드산 쉬프(Periodic Acid Schiff; PAS) 염색 양성이고, α1-안티트립신(α1-antitrypsin; A1AT)을 발현하여, 담관 상피 세포로도 분화 가능한 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포이다.
고농도 덱사메타손 첨가시의 시토크롬 P450 효소 활성치가 HepaRG 세포의 2배 이상이라는 것은, 범용의 시토크롬 P450 효소 활성 검출 키트 등을 이용한 시험에 의해 제시할 수 있다. 예를 들면, 프로메가사의 p450-GloTM CYP 어세이 키트(Assay kit)의 키트를 이용하면, 시토크롬 P450 효소 활성은 루미노미터에 의한 광량으로서 실측되기 때문에, 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포와 HepaRG 세포의 시토크롬 P450 효소 활성치의 비를 광량비로서 계산할 수 있다.
ICG 취득 활성을 갖는 것은, 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포에, 예를 들면, 1mg/ml의 ICG를 첨가하여, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 30분 배양한 후, PBS 등의 무색의 ICG 불포함 버퍼로 세정한 뒤에, 광학 현미경으로 관찰하면, 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포가 ICG 색소에 의해 녹색으로 염색되어 있음으로써 확인할 수 있다.
ICG 방출 활성을 갖는 것은, 상기한 ICG 염색 세포를, 간세포 성숙 촉진 배지를 이용하여, 예를 들면, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 6시간 배양한 후에 광학 현미경으로 관찰하면, 세포가 ICG 색소를 방출하여 무색으로 되어 있음으로써 확인할 수 있다.
PAS 염색 양성인 것은, 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포를 10% 정도의 포르말린으로 고정한 후에, 범용의 방법으로 PAS 염색을 실시하고, 광학 현미경에 의한 관찰로 세포질 내의 자홍색 과립을 검출함으로써, 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포 내의 글리코겐 과립의 존재를 확인할 수 있다.
A1AT를 발현하고 있는 것은, 세포로부터 RNA를 제조하여, A1AT 특이적 프라이머를 이용한 RT-PCR을 행하고, 세포 용해액을 제조하여 A1AT 특이적 항체를 이용하여 웨스턴 블로팅을 행하고, 세포를 고정하여 A1AT 특이적 항체를 이용하여 면역 염색을 행하는 3개의 시험 모두가 양성이 됨으로써 확인할 수 있다.
담관 상피 세포로도 분화 가능한 것은, 공정 (D)에서 제작된 세포 중에, 고기능 간세포와 함께 오발 세포 마커인 EpCAM이 양성인 세포 집단, 및 담관 상피 세포 마커(γ-GTP, ALP1, LAP 등)가 양성인 세포 집단이 존재함으로써 판단된다.
담관 상피 세포에 의한 담관 구조의 형성은, 전자 현미경에 의한 관찰에 있어서, 섬모 상피 세포로 이루어지는 관상 구조물이 헤링관에 연결되어 검출됨으로써 확인할 수 있다.
이렇게 해서 얻어진 간세포는 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포이고, 실질상, 이종 동물 세포의 혼입이나 이종 동물 유래 바이러스의 감염이 없다는 우수한 성질을 갖는다. 이와 같이 하여 얻어지는 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포는, 기능적 간세포이고, 고농도 덱사메타손 첨가시의 시토크롬 P450 효소 활성치가 HepaRG 세포의 그것의 2배 이상이고, 고농도 덱사메타손 첨가에 따른 시토크롬 P450 효소 활성치의 상승이 통계적 유의차를 갖고 검출되며, ICG 취득 및 방출 활성을 가지며, PAS 염색 양성이고, A1AT를 발현하여, 담관 상피 세포로도 분화 가능하다는 특징을 구비한다.
또한 본 발명에서 제작된 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포는, 다능성 줄기 세포의 주에 의존하지 않고, 항상 안정된 품질을 보증하는 것인 것이 큰 특징으로 되어 있다. 그 점에서, 도너로부터 채취된 간생검 재료 및 그 배양품(초대 배양 간세포)에서의 로트간 차의 문제는 완전히 극복된 것으로 되어 있다. 또한 간생검 재료 및 초대 배양 간세포는, 장기적인 배양에 의해 현저한 기능 저하를 초래하기 때문에, 수요에 맞춘 조달이 매우 곤란하지만, 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포는 수요에 맞춘 조달이 용이하다.
얻어진 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포는, 약제의 대사나 독성의 시험에 사용할 수 있다.
예를 들면, 대사의 시험에 이용하는 경우, 목적 약제를 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포에 첨가하여, 예를 들면, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 16시간 정도 배양한 후, 범용의 시토크롬 P450 효소 활성 검출 키트를 이용한 시험을 행함으로써 실시된다. 예를 들면, 프로메가사의 p450-GloTM CYP 어세이 키트의 키트를 이용하는 경우, 50μl의 배양 상청을 이용하면 어세이가 가능하기 때문에, 다능성 줄기 세포의 분화 유도 후에 시간 경과를 쫓아, 시토크롬 P450 효소 활성을 평가하는 것이 가능하다.
독성의 시험에 이용하는 경우, 목적 약제를 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포에 첨가하여, 예를 들면, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하여, 시간 경과를 쫓아 범용의 세포사 측정 기술에 의해 세포 독성을 평가할 수 있다. 범용의 세포사 측정 기술로는, 전기 영동에 의한 염색체 DNA 분단화의 검출, 유세포 분석기를 이용한 염색체 DNA 감소 세포의 검출, 아넥신(Annexin) V를 이용한 아포토시스 세포의 검출, 프로피디움 요오드화물(Propidium iodide; PI) 등의 사세포 염색제를 이용한 사세포의 검출 등을 들 수 있다.
또한, 간세포에 대한 독성과, 담관 상피 세포에 대한 독성을 구별하는 것은, 목적 약제를 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포에 첨가하여, 예를 들면, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하여, 시간 경과를 쫓아 배양 상청을 회수하고, 간세포에 특징적인 효소군(글루타믹 옥살로아세틱 트랜스아미나제(glutamic oxaloacetic transaminase; GOT), 글루타믹 피루빅 트랜스아미나제(glutamic pyruvic transaminase; GPT) 등), 및 담관 상피 세포에 특징적인 효소군(γ-글루타밀 트랜스펩티다제(γ-glutamyl transpeptidase; γ-GTP), 류신 아미노펩티다제(leucine aminopeptidase; LAP), 1형 알칼리 포스파타제(alkaline phosphatase type 1: ALP1) 등)을 범용의 방법으로 측정함으로써 실시된다.
다능성 줄기 세포 유래 간세포를 이용한 약물의 독성 시험을 행하는 경우에 대해서 보다 자세히 방법을 예시하면, 다음과 같은 방법으로 바람직하게 행할 수 있다.
우선, 다능성 줄기 세포 유래 간세포의 배양 상청에, 약물을 다양한 농도로 첨가한다(예: 아세토아미노펜 5 내지 10mM 등). 계속해서, 예를 들면, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하여, 시간 경과를 쫓아 세포 생존성 및 세포사의 상황을 측정함으로써 약물의 독성이 정량적으로 평가된다.
여기서 세포 생존성의 정량법으로는, 테트라졸륨염을 기질에 이용한 범용의 미토콘드리아 호흡능 측정법(MTT 어세이, WST 어세이 등) 등을 들 수 있다.
세포사의 정량법으로는, 1) 용의 아포토시스 검출 기술(아넥신 V를 프로브로 하는 유세포 분석기에 의한 아포토시스 세포의 검출법, PI에 의한 세포 DNA 함유량의 측정(=sub G1 분획의 측정), 아가로스 전기 영동에 의한 염색체 유래 저분자 DNA의 정량, 튜넬(TUNEL) 어세이 등), 2) 범용의 사세포 검출 기술(유세포 분석기에 의한 PI 양성 세포의 측정, 코멧 어세이에 의한 염색체 DNA 분해량의 측정), 3) 범용법에 의한 배양 상청 중의 일탈 효소(글루타믹 옥살로아세틱 트랜스아미나제; GOT, 글루타믹 피루빅 트랜스아미나제; GPT, γ-글루타밀 트랜스펩티다제; γ-GTP, 류신 아미노펩티다제; LAP, 알칼리 포스파타제(ALP) 등)의 측정을 들 수 있다.
이들 중, 배양 상청 중의 일탈 효소 측정은, 간세포 독성과 담관 세포 독성을 나눠 측정할 수 있는 점에서 특히 우수하다. 즉, 간세포에 특징적인 효소군(GOT, GPT)과, 담관 상피 세포에 특징적인 효소군(γ-GTP, LAP, 1형 ALP) 중 어느 쪽이 상승하고 있는지를 조사함으로써, 간세포 독성과 담관 세포 독성으로 구별해서 평가할 수 있다.
실시예
[실시예 1] 센다이 바이러스 벡터를 이용한 인간 인공 다능성 줄기 세포의 유도:
우선, 인간 신생아 포피 유래 선유아세포(BJ)(ATCC(http://www.atcc.org), CRL-2522) 5.0×105(개)를 10% FBS 함유 DMEM(라이프 테크놀로지스사, Grand Island, NY, USA), 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배양 후, MOI=3의 농도의 하기 (a) 내지 (d)의 벡터를 배양한 세포에 감염시켰다.
(a) SeV18+ OCT3/4/TSΔF 벡터
(b) SeV18+ SOX2/TSΔF 벡터
(c) SeV18+ KLF4/TSΔF 벡터
(d) SeVHNL c-MYC/TS15ΔF 벡터
벡터를 감염시킨 후, 다음날 10% FBS 함유 DMEM로 배지 교환을 행하였다. 그 후, 6일간, 37℃, 5% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 그 후, 젤라틴 코팅 10cm 배양 접시에 준비한 X선 조사 처리가 완료된 마우스 태아 섬유아세포(MEF)6.0×105(개)의 상에서, 아큐타제(Accutase)로 박리한 상기 도입 세포의 5.0×104(개)로부터 5.0×105(개)를 배양하였다. 다음날, 10% FBS 함유 DMEM에서 영장류 ES 세포용 배지(레프로셀사(ReproCELL Inc.), Toyko, Japan)(5ng/ml가 되도록 FGF2를 첨가함)로 배지 교환하여, 3% CO2 인큐베이터에서 배양하였다. 배지 교환은 매일 행하였다.
도 1은, BJ 세포 유래 인간 인공 다능성 줄기 세포(SeV-iPS 세포)에서의 형태 변화를 나타내는 현미경 사진이다.
콜로니는 수일 후부터 나타났고, 20일 정도 배양함으로써 인간 배성 줄기 세포 모양의 콜로니가 출현하였다. 도 1의 사진과 같이, 유도 전의 BJ 세포와 분명히 다른 인간 배성 줄기 세포에 나타나는 것과 마찬가지의 편평한 콜로니가 나타났다. 이 인간 배성 줄기 세포 모양의 콜로니는, 종래 보고되어 있는 외관의 것과 마찬가지였다(비특허문헌 10). 이들 콜로니는, 마이크로 피펫으로 단리한 후, 새로운 MEF 상에서 배양하였다. 그리고 인간 다능성 줄기 세포용 박리액(0.25% 트립신(라이프 테크놀로지스사 제조), 1mg/ml 콜라게나제 IV(와코 준야꾸 고교가부시끼가이샤 제조), 20% 녹아웃(등록상표) 혈청 대체품(라이프 테크놀로지스사 제조), 1mM CaCl2)를 이용한 박리 조작을 통해, 안정된 계대·증식 배양이 가능하였다.
상기 실험에 의해 얻어진 세포가, 다능성 줄기 세포에 특징적인 마커를 발현하고 있는지 여부를 밝히기 위해서, 하기 실험을 더 행하였다.
[실시예 2] 센다이 바이러스 벡터를 이용한 인간 인공 다능성 줄기 세포의 미분화 유지의 확인:
유세포 분석기(FACS칼리버(FACSCalibur)(등록상표))(BD 바이오사이언스(BD Biosciences))를 이용하여, 인간 다능성 줄기 세포의 미분화 마커인 SSEA4, OCT3/4의 발현을 조사하였다.
구체적으로는, SSEA4에 대해서는, 실시예 1에서 얻어진 SeV-iPS 세포를, 다능성 줄기 세포용 박리액(0.25% 트립신(라이프 테크놀로지스사), 1mg/ml 콜라게나제 IV(와코 준야꾸 고교가부시끼가이샤 제조), 20% 녹아웃(등록상표) 혈청 대체품(라이프 테크놀로지스사 제조), 1mM CaCl2)으로 회수한 후, 트립신/EDTA액(시그마케미칼사(SigmaChemicalCo.), St. Louis, MO, USA)을 이용하여 분산시킨 뒤에, FACS 버퍼(X1 PBS, 0.05% NaN3, 5% FBS)에 부유시켰다. 여기에 2% 마우스 BD Fc 블록(Mouse BD Fc Block)(BD 바이오사이언스)을 첨가한 후, 항인간 SSEA4 피코에리트린 컨쥬게이티드 마우스 IgG(SSEA4 phycoerythrin conjugated mouse IgG)(R&D, Minneapolis, MN, USA)를 X 1/10 첨가하여 빙상에서 60분 정치한 후, FACS 버퍼로 세정하여, 유세포 분석기로 SSEA4 발현을 해석하였다.
또한, OCT3/4 발현에 대해서는, SeV-iPS 세포를 회수한 후, 픽스 앤 펌셀 퍼미어빌리제이션 키트(FIX & PERM CELL PERMEABILIZATION KIT)(칼택 레보러토리즈(Caltag Laboratories), An-Der-Grub, Austria)을 이용하여 세포의 고정·세포막 투과 처리를 행한 뒤에, 2% 마우스 BD Fc 블록(BD 바이오사이언스)과 항인간 OCT3/4 피코에리트린 컨쥬게이티드 랫트 IgG(OCT3/4 phycoerythrin conjugated rat IgG)(R&D, Minneapolis, MN) X 1/10을 첨가하여, 빙상에서 60분 정치한 후, FACS 버퍼로 세정하여, 유세포 분석기로 OCT3/4 발현을 해석하였다.
그 결과, 도 2의 FACS 스캔 결과에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서 얻어진 SeV-iPS 세포는, SSEA4, OCT4의 각 미분화 마커를 모두 고발현하고 있는 것이 확인되었다. OCT3에 대해서도 마찬가지였다.
또한, 상단의 그래프는, SSEA4, OCT4 각각, 좌측이 컨트롤 항체, 우측이 목적 항체(항 SSEA4 항체, 항 OCT4 항체)에서의 염색 데이터이다. 컨트롤 항체에 비하여 목적 항체에서의 염색 데이터가 FL2 증가 방향으로 시프트하고 있기 때문에, 대다수의 세포에서 목적 단백의 발현이 인정되었다. 하단의 그래프는, 상단의 그래프를 막대 그래프 표시한 것이고, 컨트롤 항체에 비해 목적 항체에서의 분포 곡선이 FL2 증가 방향으로 시프트하고 있음이 명백하다.
또한, 인간 다능성 줄기 세포의 미분화 마커인 SSEA4, OCT3/4, 나노그의 발현을 면역 염색법으로도 확인하였다.
구체적으로는, 실시예 1에서 얻어진 SeV-iPS 세포를 아세톤/메탄올(1:3)로 고정하고, 0.1% 트리톤-X-100/PBS에 의해 세포막 투과 처리를 실시한 뒤, 항인간 SSEA4 항체(ES 셀 마커 샘플 키트(ES Cell Marker Sample Kit))(밀리포어사(MilliporeCo), Bedford, MA, USA), 항인간 OCT3/4 항체(ES 셀 마커 샘플 키트)(밀리포어사), 항인간 나노그 항체(레프로셀사, Tokyo, Japan) X 1/100을 이용하여 일차 항체 반응을 행하였다. 또한, 항인간 SSEA4 항체, 항인간 OCT3/4 항체에 대해서는, Kit의 프로토콜에 따라서 행했다. 그리고, 알렉사 플루어(Alexa Fluor) 488 표지 항토끼 IgG 항체(라이프 테크놀로지스사) X 1/2000을 이용하여 이차 항체 반응을 행한 후, 형광 현미경에 의한 관찰을 행하였다.
그 결과, 도 3의 면역 염색 결과에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서 얻어진 SeV-iPS 세포는, SSEA4, OCT4, 나노그의 각 미분화 마커를 모두 고발현하고 있는 것이 확인되었다. 또한, OCT3에 대해서도 마찬가지였다.
[실시예 3] SeV 벡터 유래 외래 유전자의 제거:
실시예 1에서 얻어진 SeV-iPS 세포로부터 SeV 벡터 유래 외래 유전자가 제거된 주를 얻기 위해서 클로닝을 행하였다.
SeV 벡터 유래 외래 유전자의 제거의 기준으로서, 항 SeV 항체(메디컬 앤 바이올로지컬 레보러토리즈 주식회사(Medical & Biological Laboratories Co., Ltd.), Nagoya, Japan)에 의한 면역 염색을 행하였다. SeV-iPS 세포를 10% 마일드포름(와코 퓨어 케미칼 인더스트리즈(WAKO Pure Chemical Industries), Osaka, Japan)으로 고정하고, 일차 항체로서 항 SeV 항체, 이차 항체로서 알렉사 플루어 488 표지 항토끼 IgG 항체(라이프 테크놀로지스사)를 이용한 염색을 행한 후, 형광 현미경에 의한 관찰을 행하였다.
또한, 이식유전자(transgenes) 및 SeV 게놈을 검출하기 위해서 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription-polymerase chain reaction; RT-PCR)을 행하였다. RT는 RT-PCR용 슈퍼스크립트 III 퍼스트-스트랜드 신테시스 시스템(Superscript III First-Strand Synthesis System for RT-PCR)(라이프 테크놀로지스사)을 이용하여 행하였다. PCR은 GeneAmpR PCR 시스템 9700(라이프 테크놀로지스사)을 이용하여, 변성(94℃에서 5분), 증폭(94℃에서 30초, 55℃에서 30초, 72℃에서 30초, 30 내지 35사이클), 후 신장(72℃에서 10분)의 각 스텝을 행하였다. 프라이머는, OCT3/4(Fw: CCCGAAAGAGAAAGCGAACCAG, Rv: AATGTATCGAAGGTGCTCAA), SOX2(Fw: ACAAGAGAAAAAACATGTATGG, Rv: ATGCGCTGGTTCACGCCCGCGCCCAGG), KLF4(Fw: ACAAGAGAAAAAACATGTATGG, Rv: CGCGCTGGCAGGGCCGCTGCTCGAC), cMYC(Fw: TAACTGACTAGCAGGCTTGTCG, Rv: TCCACATACAGTCCTGGATGATGATG), SeV(Fw: GGATCACTAGGTGATATCGAGC), Rv: ACCAGACAAGAGTTTAAGAGATATGTATC)를 이용하였다.
그 결과, 도 4의 (A)의 전기 영동 결과 및 도 4의 (B)의 현미경 사진에 나타낸 바와 같이, 실시예 1에서 얻어진 SeV-iPS 세포주는, SeV 항원 음성이고, SeV 벡터 유래 외래 유전자를 유지하지 않는 것이 확인되었다. 그 때문에, SeV-iPS 세포주는, 레트로바이러스 벡터로 제작된 iPS 세포에 비해, 임상적 사용, 약제 평가계, 병의 용태 모델계에 대한 사용에도 적합하다.
[실시예 4] 인간 배성 줄기 세포 및 인간 인공 다능성 줄기 세포의 유지 배양:
인간 배성 줄기 세포(KhES-1)는 쿄오토 대학·재생 의과학 연구소로부터 공여받았다. 레트로바이러스 벡터를 이용하여 제작한 인간 인공 다능성 줄기 세포는, 쿄오토 대학·iPS 세포 연구소(253G1) 및 국립 육성 의료 연구 센터(#40)로부터 공여받았다. KhES-1, 253G1, #40, SeV-iPS 세포주는, X선 조사 처리 완료된 MEF 상에서, 20% 녹아웃 혈청 대체품(KSR)(라이프 테크놀로지스사), 5ng/ml FGF2, 1% 비필수 아미노산 용액, 100㎛ 2-머캅토에탄올, 2mM L-글루타민 함유 DMEM/F12(라이프 테크놀로지스사) 배지를 이용하여 유지 배양을 행하였다.
[실시예 5] 인간 배성 줄기 세포 및 인간 인공 다능성 줄기 세포로부터의 간세포 유도:
간세포로의 분화 유도 전에, KhES-1, 253G1, #40, SeV-iPS 세포주로부터 MEF를 분리·제거하기 위해서, 박리액 처리에 의해 회수된 다능성 줄기 세포의 부유액을, 원침관 내에서 30초 정도 정치함으로써 다능성 줄기 세포만을 선택적으로 침강시킨 뒤에, 매트리겔(BD 바이오사이언스)로 코팅된 배양 접시 상에서 배양하였다. 이때, 매트리겔 코트 접시 상에 세포 비접착면이 노출되지 않을 정도의 고밀도로 다능성 줄기 세포를 파종하는 것이 중요하다.
간세포로의 분화 유도는 다음 5단계의 공정으로 행하였다.
(1) 100ng/ml 액티빈 A, 25ng/ml Wnt3A, 인간 리콤비넌트 알부민 함유 RPMI 배지(인비트로젠)에서 24시간 배양
(2) 100ng/ml 액티빈 A, 0.2% KSR 함유 RPMI 배지에서 24시간 배양
(3) 10ng/ml FGF2, 20ng/ml BMP4, 200ng/ml SHH, 2% KSR 함유 RPMI 배지에서 5일간 배양
(4) 10ng/ml FGF2, 20ng/ml BMP4, 20ng/ml HGF, 2% KSR 함유 RPMI 배지에서 5일간 배양
(5) 10ng/ml 온코스타틴 M, 0.1㎛ 덱사메타손, 2% KSR 함유 RPMI 배지에서 6 내지 16일간 배양
이 5단계의 공정에서 배양을 행함으로써, 도 5의 현미경 사진에 나타낸 바와 같이, KhES-1, 253G1, #40, SeV-iPS 세포로부터, 내배엽 유래 조직에 특징적인 삼차원적 구축, 및 간세포 배양에 특징적으로 되는 다각형 구조체를 포함하는 간세포 집단이 얻어졌다. 또한, 도 5에서는, 대표적인 예로서 #40의 위상차 현미경 상을 나타내었지만, KhES-1, 253G1, SeV-iPS 세포에 대해서도 마찬가지였다.
[실시예 6] 인간 인공 다능성 줄기 세포로부터 유도한 간세포의 RT-PCR에 의한 평가:
미분화 상태, 및 간세포 분화 유도된 인간 인공 다능성 줄기 세포(253G1)로부터, TRIzol(라이프 테크놀로지스사)을 이용하여 전체 RNA를 추출하였다. 얻어진 1μg의 전체 RNA를 이용하여 RT-PCR을 행하였다. PCR은, 변성(94℃에서 5분), 증폭(94℃에서 1분, 50 내지 60℃에서 1분, 72℃에서 30초, 35사이클), 후 신장(72℃에서 10분)의 각 스텝을 행하였다. 이용한 프라이머를 도 6의 표에 나타내었다.
그 결과, 도 7의 전기 영동 결과에 나타낸 바와 같이, 인간 인공 다능성 줄기 세포로부터 유도한 간세포에 있어서, α-FP, 알부민, A1AT, HNF4α, TAT, CYP3A4, TDO2의 유전자 발현이, 분화 유도 후의 시간 경과와 함께 유도되는 것으로 확인되었다.
[실시예 7] 인간 인공 다능성 줄기 세포로부터 유도한 간세포의 실시간 RT-PCR에 의한 평가:
실시간 RT-PCR용의 전체 RNA를 TRIzol(라이프 테크놀로지스사)을 이용하여, 간세포 분화 유도를 시행하고 있는 배양 접시 상의 모든 세포로부터 전체 RNA를 추출하였다. 얻어진 1μg의 전체 RNA를 이용하여 RT에 의해 cDNA를 합성하였다. 이 cDNA, 택맨(TaqMan) 표적 프로브/프라이머, GAPDH 프로브/프라이머, 퀀티텍트 멀티플렉스 PCR 마스터 믹스(QuantiTect Multiplex PCR Master Mix)(퀴아겐 사이언스(Qiagen Science), Maryland, USA)를 이용하여 ABI 프리즘 7900 HT 시퀀스 디텍션 시스템(ABI PRISM 7900 HT sequence Detection System)(라이프 테크놀로지스사)에 의해 이중(duplex) 실시간 RT-PCR을 행하였다. 증폭은, 50℃에서 2분, 95℃에서 10분의 반응 후에, 95℃에서 15초와 60℃에서 1분의 반응을 45사이클 반복하여 행하였다. 얻어진 결과는 GAPDH에 의한 표준화를 행하였다. 프로브/프라이머는 TDO2(어세이 ID: Hs00194611_ ml), Cyp3A4(어세이 ID: Hs01546612_ml), TAT(어세이 ID: Hs00356930_ml)를 이용하였다.
그 결과, 도 8의 그래프에 나타낸 바와 같이, 인간 인공 다능성 줄기 세포(253G1)로부터 유도한 간세포에 있어서 TDO2, CYP3A4, TAT의 유전자 발현이 간세포의 성숙에 따라 상승하는 것으로 관찰되었다. TDO2, TAT에 대해서는, 미분화 세포에 비해 분화 유도 후 16일에 있어서 약 2000배, 2.8배의 발현 상승을 나타냈다. 또한 Cyp3A4에 대해서는, HepG2에 비해 분화 유도 후 16일째에서 약 566배의 발현 상승을 나타냈다.
[실시예 8] 인간 배성 줄기 세포로부터 유도한 간세포의 면역 염색에 의한 평가:
세포를 아세톤/메탄올(1:3)로 고정하고, 0.1% 트리톤-X-100/PBS로 세포막 투과 처리를 행하여, 항인간 α-페토프로테인(α-fetoprotein;α-FP) 항체(에피토믹스사(Epitomics Inc.), Burlingame, CA, USA) X 1/500, 항알부민 항체(DAKO A/S, Denmark), 항인간 α1-안티트립신(A1AT) 항체(라이프스탄 바이오사이언스사(Lifespan Bioscience, Inc.), Seattle, WA) X 1/500, 항인간 시토크롬 P450(Cyp) 항체(아브캠사(Abcam Plc), Cambridge, UK) X 1/2000을 이용한 일차 항체 반응, 알렉사 플루어 488 표지 항토끼 IgG 항체(라이프 테크놀로지스사) X 1/2000을 이용한 이차 항체 반응을 행한 후에, 세포를 형광 현미경으로 관찰하였다.
그 결과, 도 9의 면역 염색 결과에 나타낸 바와 같이, 인간 배성 줄기 세포로부터 유도한 간세포에 있어서 α-FP, 알부민, A1AT의 시그널이 검출되었다.
또한, 도면 중, 녹색은 목적 단백에 대한 항체에서의 염색상, 청색은 DAPI에 의한 핵 염색상이다. 핵이 염색되어 있는 것은 어느 것이든 세포질이 녹색으로 염색되어 있기 때문에, 모든 세포가 염색되어 있음을 알 수 있어, 목적 단백의 세포내 국재와 한개 한개의 세포의 존재가 명확화되었다. 도면 중, K1 유래 간세포(K1-derived Hepatocyte)의 K1은, 쿄오토 대학에서 수립된 인간 ES 세포주 KhES-1을 나타낸다.
[실시예 9] 인간 배성 줄기 세포 및 인간 인공 다능성 줄기 세포로부터 유도한 간세포의 웨스턴 블로팅에 의한 평가:
분화 유도한 세포의 용해액을 등량의 SDS-PAGE용 샘플 buffer와 혼화하여, 98℃에서 5분간 열 변성하였다. 12%의 아크릴아미드겔로 SDS-PAGE를 행하고, 세미드라이블로팅법에 의해 PVDF막으로 전사를 행하였다. 5% 밀크/TBS-T로 블록킹을 행하고, 항α-FP 항체(에피토믹스사) X 1/500, 항알부민 항체(DAKO A/S) X 1/20000, 항 A1AT 항체(라이프스판 바이오사이언스) X 1/500, 항 Cyp 항체(아브캠사) X 1/2000을 이용한 일차 항체 반응, HRP 표지 항토끼 IgG(셀 시그날링 테크놀로지사(Cell Signaling Technology, Inc.), Beverly, MA, USA) X 1/2000을 이용한 이차 항체 반응 후에, ECL 웨스턴 블로팅 검출 시스템(GE 헬스케어(GE Healthcare), Fairfield, CT, USA)을 이용하여 X선 필름(후지필름(FUJIFILM), RX-U)(후지 포토 필름 주식회사(Fuji Photo Film Co., Ltd.), Tokyo, Japan)에 시그널을 감광시켰다.
그 결과, 인간 배성 줄기 세포 및 인간 인공 다능성 줄기 세포로부터 유도한 간세포에 있어서, 간세포에 특징적인 단백질의 발현을 검출하였다. 대표적인 예로서 KhES-1의 웨스턴 블로팅 결과를 도 10에 나타내었다. 간세포에 특징적인 α-FP, 알부민, A1AT, CYP3A4의 단백질 발현이 검출되었다. 또한, 초대 배양 간세포(HC)에 대해서는, 입수 후에 실험에 필요한 양의 세포를 얻기 위해서 최저 수의 계대 배양을 했지만, 기능 단백의 발현은 소실되었다. 도면 중, 253G1은 쿄오토 대학에서 수립된 인간 iPS 세포주, #40은 국립 육성 의료 연구 센터에서 수립된 인간 iPS 세포주를 나타낸다.
[실시예 10] 인간 배성 줄기 세포 및 인간 인공 다능성 줄기 세포로부터 유도한 간세포의 PAS 염색에 의한 평가:
간세포 내의 글리코겐을 과요오드산 쉬프(PAS) 염색 키트(뮤토 퓨어 케미칼즈 주식회사(Muto Pure Chemicals Co., Ltd), Tokyo)를 이용하여 검출하였다.
10.5% 포름알데히드를 이용하여, 인간 배성 줄기 세포 및 인간 인공 다능성 줄기 세포로부터 유도한 간세포의 실온에서 고정을 행하고, 1% 과요오드산으로 10분 처리한 후, 37℃에서 30분 쉬프 염색을 행하였다. 헤마톡실린으로 카운터 염색을 행하여, 현미경에 의한 관찰을 행하였다.
그 결과, 인간 배성 줄기 세포 및 인간 인공 다능성 줄기 세포로부터 유도한 간세포에 있어서, 고빈도로 PAS 염색 양성의 세포가 관찰되었다. 대표적인 예로서 KhES-1의 PAS 염색 결과를 도 11에 나타내었다. 도면 중, K1 유래 간세포의 K1, 미분화 hES K1의 hES K1, K1 유래 간세포의 K1은, 모두 쿄오토 대학에서 수립된 인간 ES 세포주 KhES-1을 나타낸다.
[실시예 11] 인간 배성 줄기 세포 및 인간 인공 다능성 줄기 세포로부터 유도한 간세포의 ICG 취득능과 방출능의 평가:
간세포의 해독 능력(이물을 처리하는 능력)을 ICG의 취득과 방출에 의해 측정하였다.
ICG 취득은, 간세포를 1mg/ml의 ICG와 37℃에서 30분간 인큐베이트하고, PBS로 세정한 후에 광학 현미경으로 관찰함으로써 평가하였다. ICG 방출은, ICG 불포함 배지에서 6시간 더 배양한 후에 광학 현미경으로 관찰함으로써 평가하였다.
그 결과, 인간 배성 줄기 세포 및 인간 인공 다능성 줄기 세포로부터 유도한 간세포에 있어서, ICG의 취득과 방출을 확인하였다. 대표적인 예로서 KhES-1의 현미경 관찰 결과를 도 12에 나타내었다. 도면 중, 녹색은 ICG를 나타낸다. 상단의 사진에서는, 세포 영역이 ICG를 받아들여 녹색을 나타내고 있지만, 6시간 배양 후의 하단의 사진에서는, ICG가 세포밖으로 배출되어 있다.
[실시예 12] 인간 배성 줄기 세포 및 인간 인공 다능성 줄기 세포로부터 유도한 간세포의 CYP3A4 활성의 평가:
간세포의 시토크롬 P450 3A4(CYP3A4) 활성을 p450-GloTM CYP3A4 측정 키트(프로메가사(Promega Co.), Madison, WI, USA)를 이용하여 측정하였다.
50㎛의 덱사메타손 또는 100㎛의 리팜피실린으로 16시간 자극을 행한 간세포의 배양 상청에 CYP3A4의 합성 기질을 가하고, 4시간 후에 배양 상청을 회수하여 미약 발광 측정 장치(루미노미터)에 의해 발광 강도를 측정하였다.
그 결과, 도 13의 그래프에 나타낸 바와 같이, 인간 배성 줄기 세포 및 인간 인공 다능성 줄기 세포로부터 유도한 간세포에서 CYP3A4 활성이 관찰되었다. 항상 미분화 세포에 비해 수배 이상의 활성치가 얻어졌다. 센다이 바이러스 벡터를 이용하여 유도한 인간 인공 다능성 줄기 세포 유래의 간세포에서는 HepaRG 세포(바이오프레딕 인터내셔널(BIOPREDIC International), Rennes, France)의 8배 이상의 활성이 관찰되었다.
또한, HepaRG 세포의 배양은 바이오프레딕 인터내셔널사의 프로토콜에 따라서 행하였다. HepG2 세포는 휴먼 사이언스 연구 자원 뱅크로부터, 인간 초대 배양성 인간 세포주는 DS 파마 바이오메디컬 주식회사(DS Pharma Biomedical Co., Ltd.)(Osaka, Japan)로부터 구입하고, 셀 시스템즈(Cell Systems)사(Kirkland, WA, USA)의 CS-C 배지 키트를 이용하여 배양하였다. 도면 중, 253G1은 쿄오토 대학에서 수립된 인간 iPS 세포주, #40은 국립 육성 의료 연구 센터에서 수립된 인간 iPS 세포주, SeV는 SeV 벡터를 이용하여 유도한 iPS 세포주, ES-K1은 쿄오토 대학에서 수립된 인간 ES 세포주, CTL은 대조군(Control)의 약칭을 나타낸다.
[실시예 13] 인간 배성 줄기 세포 및 인간 인공 다능성 줄기 세포로부터 유도한 간세포의 전자 현미경 사진에 의한 평가:
다능성 줄기 세포 유래 간세포를, 2.5% 글루타르알데히드액으로 고정한 후, BML사(BML Inc.)(Tokyo, Japan)의, 2% 사산화오스뮴액으로 후 고정, 에폰 수지로의 포매, 울트라마이크로톰으로 70nm 두께의 세그먼트 제작을 행한 후, 전자 현미경에 의해 관찰하였다.
그 결과, 도 14의 (A), (B)에 나타낸 바와 같이, 간세포에 특징적인 융모가 풍부한 세포가 검출되고, 또한 이들에 있어서 간세포에 특이적인 구조, 즉, 세포질의 글리코겐 α과립(로제트를 형성하고 있는 글리코겐 과립), 및 세포간 경계의 미세 담관과 그것에 이어지는 밀착 결합과 데스모솜이 검출되어, 성숙 간세포가 제작되어 있는 것이 확인되었다. 대표적인 예로서 KhES-1의 결과를 나타낸다.
또한, 도 14의 (C)에 나타낸 바와 같이, 담관 상피 세포에 특이적인 구조, 즉, 세포의 한쪽 면에는 키가 작은 융모(신요세관이나 소장·대장에 나타나는 쇄자연(brush border)보다 분명히 짧고, 담관 상피 세포에 특징적인 융모)와, 반대측의 면에는 기저막이 검출되어, 성숙 담관 상피 세포가 제작되어 있는 것이 확인되었다. 대표적인 예로서 #40의 결과를 나타낸다.
또한, 인간 배성 줄기 세포 유래의 담관 상피 세포에 대해서나, 인간 인공 다능성 세포 유래의 담관 상피 세포에 대해서도, 마찬가지의 결과였다.
[실시예 14] 인간 배성 줄기 세포 및 인간 인공 다능성 줄기 세포로부터 유도한 간세포를 이용한 약제의 독성 평가:
다능성 줄기 세포 유래 간세포에, 간세포 독성을 갖는 것으로 알려진 D-갈락토사민(D-GalN)을 최종 농도 25mM로 첨가하여 37℃에서 배양하였다. 24시간 후에 1.5ml의 배양 상청을 회수하여, 4℃에서 15000rpm 회전하여 세포 성분을 완전히 제거한 뒤, 상청 중에 포함되는 간장 유래 일탈 효소인 글루타믹 옥살로아세틱 트랜스아미나제(GOT), 글루타믹 피루빅 트랜스아미나제(GPT), γ-글루타밀 트랜스펩티다제(γ-GTP), 류신 아미노펩티다제(LAP), 락테이트 디히드로게나제(lactate dehydrogenase; LDH), 및 LDH 아이소자임(LDH 1 내지 5)의 농도를 측정(가부시끼가이샤 B·M·L(도쿄도 시부야구)에서 시행)하였다.
그 결과, 도 15의 (A)에 나타낸 바와 같이, 인간 ES 세포(KhES-1주) 유래 간세포(분화 유도 28일째)에서는, D-GalN 투여에 의존하여, 성숙 간세포 일탈 효소인 GOT의 상승이 인정되었다. 또한, 미세 담관(간세포) 및 담관 상피 세포에서 유래되는 일탈 효소인 γ-GTP, 및 담관 상피 세포에서 유래되는 일탈 효소인 LAP의 상승도 인정되었다. 또한, 성숙 간세포 일탈 효소인 LDH의 상승도 확인되었고, 또한 아이소자임 측정에서는 4형 5형 우위의 "간장 장애형"의 패턴이 나타났다. 한편, 미분화 ES 세포에 D-GalN을 투여했을 때는, 도 15의 (B)에 나타낸 바와 같이, 어떠한 일탈 효소도 상승이 나타나지 않았다.
또한, 인간 iPS 세포(#40) 유래 간세포에도 마찬가지의 결과가 얻어졌다. 즉, 도 15의 (C)에 나타낸 바와 같이, D-GalN 투여에 의존하여, 성숙 간세포 일탈 효소인 GOT 및 GPT, 미세 담관(간세포) 및 담관 상피 세포에서 유래되는 일탈 효소인 γ-GTP, 및 담관 상피 세포에서 유래되는 일탈 효소인 LAP의 상승이 나타났다. 또한 성숙 간세포 일탈 효소인 LDH의 상승도 확인되었고, 또한 아이소자임 측정에서는 4형 5형 우위의 "간장 장애형"의 패턴이 나타났다. 한편, 미분화 ES 세포에 D-GalN을 투여했을 때는, 도 15의 (D)에 나타낸 바와 같이, GOT, GPT, γ-GTP, LAP, LDH의 상승은 나타나지 않았다.
또한 SeV-iPS 유래 간세포에서도 거의 마찬가지의 결과가 얻어졌다. 즉, 도 15의 (E)에 나타낸 바와 같이, SeV-iPS 유래 간세포를 D-GalN 존재하에서 배양했을 때는, 배양 상청 중에 GOT의 상승이 나타났고, 한편, 도 15의 (F)에 나타낸 바와 같이, 미분화 SeV-iPS 세포를 D-GalN 존재하에서 배양했을 때는, 배양 상청 중에서 GOT의 상승은 나타나지 않았다.
시판되고 있는 간세포주인 HepaRG 세포를 D-GalN 존재하에서 배양했을 때는, 도 15의 (G)에 나타낸 바와 같이, 배양 상청 중에 GOT, GPT, LAP, 및 5형 LDH의 상승이 나타났지만, γ-GTP의 상승은 나타나지 않았다. 또한, 도 15의 (H)에 나타낸 바와 같이, HepG2 세포를 D-GalN 존재하에서 배양했을 때는, GOT, GPT 및 5형 LDH의 상승이 나타났지만, γ-GTP나 LAP의 상승은 나타나지 않았다.
또한, 도 15의 (A) 내지 (H)의 실험에서 검출된 배양 상청 중에서의 간장 유래 일탈 효소의 상승이, 확실히 D-GalN의 간세포/담관 상피 세포에 대한 독성에 의한 것인 것은, 프로스타글란딘 E1(PGE1)을 이용한 이하의 실험에 의해 확인되었다. 즉, #40주 유래 간세포에 미리 4mM의 PGE1을 첨가하여, 37℃에서 4시간 배양한 후, 상기와 같이 하여 D-GalN 투여 실험을 시행하였다. 그 결과는 도 16에 나타낸 바와 같이, 배양 상청 중에 검출되는 모든 간장 유래 일탈 효소의 상승은, PGE1의 전 처리에 의해 유의하게 억제되었다. 결과를 적지는 않지만, 다른 인간 iPS 세포주나 인간 ES 세포주에서 유래되는 간세포 분화 유도 샘플에서도 마찬가지의 경향이 나타났다.
또한, PGE1에 관해서는, 간장 장해 억제 효과나 간 재생 촉진 효과 등이 있는 것으로 알려져 있으며, 임상에서도 간 절제나 간 이식에서의 허혈 재관류 장해의 억제, 간 절제 후의 간 기능의 개선, ABO 혈액형 부적합 간이식에서의 단장기 파종성 혈관내 응고 증후군의 예방 등에 유효한 것으로 보고되어 있다.
이상과 같이, 다능성 줄기 세포 유래 간세포를 간독성 약제의 존재하에서 배양하면, 범용의 생화학 검사 기술로 검출할 수 있는 레벨의 간세포 효소가 배양 상청 중에 일탈하는 것이 실증되었다. 이 방법에 따르면, 종래법과 같은 세포 회수 등의 시간은 필요 없고, 단지 1.5ml 정도의 배양 상청을 채취하는 것만으로, 간편하게 간 독성을 정량적으로 폭넓게 평가하는 것이 가능하다. 또한, 본 발명에 의한 다능성 줄기 세포 유래 간세포를 이용한 평가 시스템의 최대 특징은, 미세 담관에서 유래되는 일탈 효소인 γ-GTP 및 담관 상피 세포에서 유래되는 일탈 효소인 LAP의 상승을 검지할 수 있는 점이다. 기존의 HepaRG 세포나 HepG2 세포를 이용하여 어세이해도, 이들 일탈 효소의 상승을 동시에 확인할 수는 없는 점에서, 간 독성[간세포의 세포질(GOT, LDH) 내지 간세포의 세포막(미세 담관)(γ-GTP) 내지 담관 상피 세포(LAP)]을 망라적으로 평가하기 위해서는 다능성 줄기 세포 유래 간세포의 사용이 필수적이다.
[실시예 15] 인간 배성 줄기 세포 및 인간 인공 다능성 줄기 세포로부터 유도한 간세포 중의 간 줄기/전구 세포 집단의 동정:
다능성 줄기 세포 유래 간세포는, 도 5에 도시한 바와 같이, 다각형의 세포 집단이 평면적으로 넓어지는 2차원 영역과, 세포끼리 중층화하여 부풀어있는 3차원 구축 영역을 포함하여 이루어진다(도 17). 형태학적으로는, 전자는 성숙 간세포의 특징이고, 후자는 간 줄기/전구 세포의 특징인 점에서, 다능성 줄기 세포 유래 간세포 중에는 간 줄기/전구 세포가 포함되고, 이들은 3차원 구축 영역에 존재하는 것으로 강하게 시사되었다.
이것을 확인함과 함께, 형태학적 관찰에 의해 간편하게 간 줄기/전구 세포를 동정·분리하기 위한 수법을 확립하기 위해서, 간 줄기/전구 세포의 마커인 상피세포 부착 분자(epithelial cell adhesion molecule; EpCAM) 및 α-FP의 발현에 대해서 면역 염색법으로 조사하였다. 도 18의 (A)는 인간 인공 다능성 줄기 세포(#40)로부터 제작된 간세포(분화 유도 28일째)에서의 EpCAM 및 α-FP의 면역 염색의 결과이다. 여기에 나타낸 바와 같이, 3차원 구축 영역에 일치하여 EpCAM과 α-FP의 발현이 나타났다. 또한, 3차원 구축 영역에 있는 세포가 증식 사이클에 있는 것은, 핵산 아날로그인 브로모데옥시우리딘(bromodeoxyuridine; BrdU)의 취득 시험(도 18의 (B) 좌측) 및 증식기 마커인 Ki67의 면역 염색(도 18의 (B) 우측)에 의해 확인되었다. 한편, 다각형의 세포 집단이 평면적으로 넓어지는 2차원 영역에서는, 성숙 간세포 마커인 Alb(도 18의 (C)) 및 AAT(도 18의 (D))의 발현이 면역 염색법에 의해 확인되었다. 일련의 결과는, 다른 인간 인공 다능성 줄기 세포주에서도 확인되었다(도 18의 (E), (F)).
이상으로부터, 다능성 줄기 세포로부터 제작된 간세포 분화 유도 산물에 있어서, 3차원 구축 영역에 있는 세포 집단은 간 줄기/전구 세포이고, 한편, 2차원 영역에 있는 세포 집단은 성숙 간세포인 것이 분명해졌다.
[실시예 16] 인간 배성 줄기 세포 및 인간 인공 다능성 줄기 세포로부터 유도한 간세포 중의 간 줄기/전구 세포 집단의 계대 배양:
전 실시예에서 동정한, 다능성 줄기 세포에서 유래되는 간 줄기/전구 세포 집단(간세포 분화 유도 산물 중에서 3차원적 구축을 형성하는 세포 집단)을 회수하여, 계대 배양하는 것을 시도하였다. 우선 세포를 회수하기 위한 세포 박리법에 대해서 검토하였다. 트립신이나 콜라게나제 등의 단백 분해 효소, 또는 2가 이온 등의 킬레이트제를 포함하는 용액을 이용하여, 3차원 구축 영역을 형성하는 세포 집단을 박리(분리)하면, 세포의 생존성은 현저히 저하되어, 계대 후에는 거의 모든 세포가 죽는 것으로 판명되었다. 따라서, 마이크로나이프를 이용하여 물리적으로 3차원 구축 영역을 잘라내어, 느슨한 피펫팅 조작에 의해 세포 집단을 분산시킨 후에, 매트리겔(BD사 제조)로 코팅한 프레시한 배양 접시에 옮겨 넣어, 5% 부피 탄산 가스 인큐베이터 안에서 37℃ 배양하였다.
그 결과, 도 19에 나타낸 바와 같이, 계대한 세포 집단은 생존성을 유지하고 증식을 개시하였다. 계대 배양 11일째에는 배양 접시 일면에 세포가 확산되고(도 19의 (A)), 이들 중에는 다시 3차원 구축 영역을 형성하는 부분도 확인되었다(도 19의 (B), 화살표 위치). 또한 별도의 3차원 구축 영역에는, 작은 간세포 콜로니(small hepatocyte colonies)(비특허문헌 11 내지 12)라고 불리는 간 전구 세포에 매우 유사한 형태를 나타내는 세포군도 나타났다(도 19의 (C), (D), 화살표 위치).
다음으로, 계대 배양에 의해 증폭된 세포 집단에 관해서, 간 전구 세포 마커인 α-FP, 성숙 간세포 마커인 TDO2 및 AAT의 발현을 RT-PCR로 조사하였다. 그 결과, 도 19의 (E)에 나타낸 바와 같이, α-FP 및 AAT의 발현은 계대 후에도 유지되고, 또한 TDO2의 발현은 계대 전보다 오히려 상승되었다. 이들 결과로부터, 3차원 구축 영역을 형성하는 세포 집단은, 계대 배양 후에도 간 전구 세포의 존재를 유지하면서도, 간세포 성숙도를 높이면서 증폭되는 것이 분명해졌다.
이상으로부터, 다능성 줄기 세포 유래 간세포 분화 유도 산물 중에서 3차원적 구축을 형성하는 세포 집단은 간 줄기/전구 세포 집단이고, 이들은 마이크로나이프 등에 의해 물리적으로 박리·분산되고 나서 매트리겔 코트 접시 상에서 배양함으로써, 용이하게 계대 증폭 배양을 행할 수 있는 것으로 나타났다.
인간 다능성 줄기 세포 유래 간세포 집단으로부터의 간 줄기/전구 세포의 순화 방법에 관해서는, 항 N-카데린 항체를 이용한 세포 분리(cell sorting) 기술이 보고되어 있다(비특허문헌 13). 그러나, 이 방법에서는, 특이적 항체를 이용한 염색 공정과, 세포 분리기(cell sorter) 등의 비싼 기기를 이용한 세포 분획의 공정이 필요해질 뿐 아니라, 순화된 간 줄기/전구 세포를 증폭하기 위해서는 마우스 유래 피더 세포(STO주) 상에서 모두 배양할 필요가 있다. 이에 반해 본 발명에 의한 방법에서는, 위상차 현미경하에서의 마이크로나이프 등에 의한 3차원 구축 영역의 회수라는, 간편한 조작만으로 간 줄기/전구 세포의 순화를 가능하게 할 뿐 아니라, 순화된 간 줄기/전구 세포의 증폭은 무피더 환경 배양(매트리겔 코트 접시 등)으로 달성된다는 이점이 있다.
이와 같이, 본 발명에 의한 다능성 줄기 세포 유래 간 줄기/전구 세포의 순화 및 계대 배양을 위한 기술은, 범용성이 높을 뿐 아니라, 이종 동물에게서 유래하는 세포를 일체 사용하지 않는 무피더 배양계인 점에서, 다능성 줄기 세포 유래 간 줄기/전구 세포의 제조를 위해 매우 타당성이 높은 방법이다.
본 발명에 의하면, 종래의 약제 대사·독성 평가계가 안고 있었던 수많은 문제점, 즉, 데이터의 불안정성, 로트차, 주간차, 비용, 개인차의 검출 불능 등의 문제점이 극복되기 때문에, 획기적인 창약 연구 툴을 제공할 수 있다. 또한, 현행의 의약 개발에서의 전임상 시험 단계에서의 간세포에 관한 안전성 시험 등에도 기여한다.
산업상 이용가능성
본 발명에 의한 약제 대사·독성 평가 시스템을 구성하는 간세포의 출발 재료의 하나인 인간 ES 세포나 인간 iPS 세포 등은 무한 증식능을 갖는 점에서, 공업적 스케일로 안정적으로 생산하는 것이 매우 용이하다. 또한, 간세포는, 인간 다능성 줄기 세포로부터 1개월 이내에 제작 가능하며, 수요에 따른 공급도 가능하다. 또한, 그 간세포의 제작 기술은, 범용의 세포 배양 설비만을 사용하는 점에서, 세계의 모든 나라와 지역에서 실시가 가능하기 때문에, 거대 플랜트 산업으로 전개할 수 있어, 실용적이며 산업상 이용 가치가 높다.

Claims (20)

  1. 다능성 줄기 세포를 이용하여 고기능 간세포를 제조하는 방법으로서,
    공정 (A), (B)를 포함하는 방법에 의해, 다능성 줄기 세포로부터 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽을 얻고, 공정 (C)를 포함하는 방법에 의해, 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽으로부터 간 전구 세포를 얻고, 공정 (D)를 포함하는 방법에 의해, 간 전구 세포로부터 고기능 간세포를 얻는
    것을 특징으로 하는 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포의 제조 방법.
    (A) 무혈청이면서 또한 무피더 환경하에서 배양하는 공정
    (B) 알부민과 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하는 공정
    (C) SHH 또는 SHH 아고니스트와, 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하는 공정
    (D) 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하여 성숙시키는 공정
  2. 다능성 줄기 세포를 이용하여 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽을 제조하는 방법으로서,
    공정 (A), (B)를 포함하는 방법에 의해, 다능성 줄기 세포로부터 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽을 얻는
    것을 특징으로 하는 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽의 제조 방법.
    (A) 무혈청이면서 또한 무피더 환경하에서 배양하는 공정
    (B) 알부민과 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하는 공정
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    공정 (A)에서,
    다능성 줄기 세포를 그 각 집괴(集塊)가 서로 접하는 밀도로 파종하는,
    다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽의 제조 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    공정 (A)에서,
    침강 속도차에 의한 분리에 의해 피더 세포를 제거하는,
    다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽의 제조 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    공정 (B)에서,
    알부민으로 인간 리콤비넌트·알부민을 이용하는,
    다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽의 제조 방법.
  6. 원시 내배엽을 이용하여 간 전구 세포를 제조하는 방법으로서,
    공정 (C)를 포함하는 방법에 의해, 원시 내배엽으로부터 간 전구 세포를 얻는
    것을 특징으로 하는 간 전구 세포의 제조 방법.
    (C) SHH 또는 SHH 아고니스트와, 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하는 공정
  7. 제6항에 있어서,
    공정 (C)에서,
    원시 내배엽으로 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽을 이용하는,
    간 전구 세포의 제조 방법.
  8. 간 전구 세포를 이용하여 고기능 간세포를 제조하는 방법으로서,
    공정 (D)를 포함하는 방법에 의해, 간 전구 세포로부터 고기능 간세포를 얻는
    것을 특징으로 하는 고기능 간세포의 제조 방법.
    (D) 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하여 성숙시키는 공정
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서,
    다능성 줄기 세포로 ES 세포 또는 iPS 세포를 이용하는,
    제조 방법.
  10. 제9항에 있어서,
    iPS 세포로 센다이 바이러스 벡터에 의해 수립된 iPS 세포를 이용하는,
    제조 방법.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    다능성 줄기 세포로 인간 다능성 줄기 세포를 이용하는,
    제조 방법.
  12. 다능성 줄기 세포를 이용하여 제조되는 고기능 간세포로서,
    공정 (A), (B)를 포함하는 방법에 의해, 다능성 줄기 세포로부터 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽을 얻고, 공정 (C)를 포함하는 방법에 의해, 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽으로부터 간 전구 세포를 얻고, 공정 (D)를 포함하는 방법에 의해 간 전구 세포로부터 얻어지는
    것을 특징으로 하는 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포.
    (A) 무혈청이면서 또한 무피더 환경하에서 배양하는 공정
    (B) 알부민과 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하는 공정
    (C) SHH 또는 SHH 아고니스트와, 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하는 공정
    (D) 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하여 성숙시키는 공정
  13. 다능성 줄기 세포를 이용하여 제조되는 고기능 간세포로서,
    덱사메타손(Dexamethasone) 첨가시의 시토크롬 P450 효소 활성치가 HepaRG 세포의 2배 이상이고, ICG 취득 및 방출 활성을 가지며, PAS 염색 양성이고, A1AT를 발현하며, 담관 상피 세포로도 분화 가능한
    것을 특징으로 하는 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포.
  14. 다능성 줄기 세포를 이용하여 제조되는 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽으로서,
    공정 (A), (B)를 포함하는 방법에 의해 다능성 줄기 세포로부터 얻어지는
    것을 특징으로 하는 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽.
    (A) 무혈청이면서 또한 무피더 환경하에서 배양하는 공정
    (B) 알부민과 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하는 공정
  15. 원시 내배엽을 이용하여 제조되는 간 전구 세포로서,
    공정 (C)를 포함하는 방법에 의해 원시 내배엽으로부터 얻어지는
    것을 특징으로 하는 간 전구 세포.
    (C) SHH 또는 SHH 아고니스트와, 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하는 공정
  16. 간 전구 세포를 이용하여 제조되는 고기능 간세포로서,
    공정 (D)를 포함하는 방법에 의해, 간 전구 세포로부터 얻어지는
    것을 특징으로 하는 고기능 간세포.
    (D) 적어도 1종의 사이토카인의 존재하에서 배양하여 성숙시키는 공정
  17. 제12항 내지 제14항 중 어느 한 항에 있어서,
    다능성 줄기 세포가 ES 세포 또는 iPS 세포인,
    다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포 또는 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽.
  18. 제12항 내지 제17항 중 어느 한 항에 있어서,
    다능성 줄기 세포가 인간 다능성 줄기 세포인,
    다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포 또는 다능성 줄기 세포 유래 원시 내배엽.
  19. 약제의 대사를 시험하는 방법으로서,
    제12항 내지 제18항 중 어느 한 항의 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포를 이용하여 약제의 대사를 정량하는,
    것을 특징으로 하는 약제 대사의 시험 방법.
  20. 약제의 독성을 시험하는 방법으로서,
    제12항 내지 제18항 중 어느 한 항의 다능성 줄기 세포 유래 고기능 간세포를 이용하여 약제에 의한 세포사를 정량하는
    것을 특징으로 하는 약제 독성의 시험 방법.
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