JP6950887B2 - 体外型の人工肝臓、及び体外型の人工肝臓用又は肝細胞培養用の器具 - Google Patents
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Description
[1]以下を含む、少なくとも一個のモジュールを備える、体外型の人工肝臓:
・血漿成分入口ポート及び血漿成分出口ポート;
・血漿成分入口ポート及び血漿成分出口ポートを備える、血漿成分循環室;及び
・血漿成分循環室に隣接して配置され、血漿成分循環室とはアンモニアは透過するが肝細胞は透過しない分離膜で隔てられており、アンモニア代謝能を有する肝細胞が培養されている肝細胞培養室。
[2]肝細胞培養室の上に血漿成分循環室が配置されている、1に記載の人工肝臓。
[3]肝細胞が、100μg/dl/24h以上のアンモニア代謝機能を有し、かつ網状構造体を構成可能な、人工肝細胞である、1又は2に記載の人工肝臓。
[4]肝細胞が、無血清かつ無フィーダー環境下で培養されている、1〜3のいずれかに記載の人工肝臓。
[5]モジュール1個あたり少なくとも1.0×106個の肝細胞が培養されている、1〜4のいずれかに記載の人工肝臓。
[6]複数個のモジュールを備え、5.0×109〜5.0×1011個 の肝細胞が培養されている、1〜5のいずれかに記載の人工肝臓。
[7]1×104〜1×106cm2 の有効培養面積を有する、1〜6のいずれかに記載の人工肝臓。
[8]少なくとも以下を備える、体外型の人工肝臓用又は肝細胞培養用の器具:
・血漿成分入口ポート及び血漿成分出口ポート;
・血漿成分入口ポート及び血漿成分出口ポートを備える、血漿成分循環室;及び
・血漿成分循環室に隣接して配置され、血漿成分循環室とはアンモニアは透過するが肝細胞は透過しない分離膜で隔てられた、肝細胞を培養するための肝細胞培養室。
[9]肝細胞培養室が、肝細胞を導入するための細胞導入ポートを備える、8に記載の器具。
[10]肝細胞培養室が、空気を排出するためのエア抜きポートを備える、9に記載の器具。
[11]肝細胞培養室内に、分離膜の変形を抑制する手段を備える、8〜10のいずれかに記載の器具。
[1]100μg/dl/24h以上のアンモニア代謝機能を有し、かつ網状構造体を構成可能な、人工肝細胞。
[2]無血清かつ無フィーダー環境下で培養できる、1に記載の人工肝細胞。
[3]人工多能性幹(iPS)細胞から誘導されたものである、1又は2に記載の人工肝細胞。
[4]iPS細胞が、センダイウイルスベクターを用いて製造されたものである、3に記載の人工肝細胞。
[5]以下の工程を含む、人工肝細胞の製造方法:
iPS細胞を、Activin Aを含む分化誘導メディウムIで培養する、分化誘導工程1;
分化誘導工程1から得た細胞を、骨形成タンパク質4(BMP4)及び線維芽細胞増殖因子2(FGF2)を含む分化誘導メディウムIIで培養する、分化誘導工程2;及び
分化誘導工程2から得た細胞を、肝細胞成長因子(HGF)、Oncostatin M、Dexamethasone、並びにN,N'-(methylenebis(4,1-phenylene))diacetamide(FH1)及び/又は2-(N-(5-chloro-2-methylphenyl)(methylsulfonamido)-N-(2,6-difluorophenyl)-acetamide(FPH1)を含む分化誘導メディウムIIIで培養して人工肝細胞を得る、分化誘導工程3。
[6]iPS細胞が、センダイウイルスベクターを用いて製造されたものである、5に記載の製造方法。
[7]分化誘導メディウムIII が、FH1及びFPH1を含む、5又は6に記載の製造方法。
[8]分化誘導工程1〜3が、無血清かつ無フィーダー環境下で実施される、5〜7のいずれかに記載の人工肝細胞。
[9]分化誘導工程1及び分化誘導工程2が合計2〜14日間行われ、
分化誘導工程3が2〜14日間行われる、5〜8のいずれかに記載の製造方法。
本発明により、シート状の組織として肝細胞を維持することができ、また循環流が直接肝細胞に伝わらない、ハイブリッド型人工肝臓用の器具、及び肝細胞培養用の器具が提供される。
・血漿成分入口ポート及び血漿成分出口ポート ;
・血漿成分入口ポート及び血漿成分出口ポートを備える、血漿成分循環室;及び
・血漿成分循環室に隣接して配置され、血漿成分循環室とはアンモニアは透過するが肝細胞は透過しない分離膜で隔てられており、アンモニア代謝能を有する肝細胞が培養されている肝細胞培養室。
図1は、人工肝臓を構成するモジュールの実施態様の一例の断面図である。モジュールの内部は、分離膜5により、血漿成分循環室3と肝細胞培養室4とに分割されている。モジュールは、モジュール蓋7とモジュール本体8とを、分離膜5を挟むように付設して形成することができる。血漿成分循環室3と肝細胞培養室4とは、どのように配置してもよいが、図1に示したように、肝細胞培養室4の上に血漿成分循環室3を配置することが好ましい。血漿成分循環室3は、血漿成分入口ポート1及び血漿成分出口ポート2を備える。肝細胞培養室4では、肝細胞9が培養されている。肝細胞は、無血清かつ無フィーダー環境下で培養されていてもよい。用いることのできる肝細胞の例については、後に詳述する。モジュールには、分離膜5が変形しないように、分離膜5の変形を抑制する手段、例えば分離膜サポート6を設けてもよい。また、肝細胞培養室4は、肝細胞を導入するための細胞導入ポートや、肝細胞を導入する際に空気を排出するためのエア抜きポートを備えていてもよい。
図2は、人工肝臓を用いたシステムの実施態様の一例の模式図である。人工肝臓を用いた体外循環システムは、血漿分離器11を用いる場合は、患者10側の第一の循環回路20(患者側回路)と、人工肝臓12が配された第二の循環回路21(人工肝臓側回路)とにより構成することができる。必要に応じ送液ポンプ等を利用して、循環回路20に患者10から採取した血液を循環させる。血液が血漿分離器11に導入されると、患者の血液から血漿が分離され、分離された血漿は、循環回路21に流れる。循環回路21に血漿を流すために、送液ポンプを利用してもよい。血漿が人工肝臓12に導入されると、人工肝臓を構成するモジュール内部に培養されている肝細胞により、アンモニア等の有害物質の代謝が行われる。人工肝臓12に導入される血漿はまた、人工肝臓内部の肝細胞に、酸素等の必要物質を供給する役割も有している。肝細胞により有害物質が減じられ、人工肝臓12から導出された血漿は循環回路20に入って循環回路20を流れる血液と一緒になり、患者10へ返血される。
次に、本発明の人工肝臓に用いられる肝細胞について説明する。本発明には、従来のハイブリッド型人工肝臓への適用が検討されてきた種々の肝細胞を用いることができる。
[網状構造体]
細胞の特徴に関し、「網状構造体を構成可能である」とは、対象となる細胞を適切な条件で培養した場合に、所定の網状構造体が構成されることをいう。網状構造体は、細胞を適切な密度で、必要に応じ細胞外マトリクス(ECM)、例えばmatrigel(登録商標)、ヒアルロン酸、ヘパリン、フィブロネクチン、ラミニン、ビトロネクチン、又は他のECMでコートした培養器に播種し、適切な培地を用いて数日間培養することにより、構成される。網状構造体は、少なくとも細胞1個分の幅〜1000μm(より特定すると数個分の幅〜500μm、さらに特定すると20〜250μm)の紐状の部分と、円形、楕円形等の空隙の部分とを含む。空隙の直径は典型的には、100〜2000μmであり、より特定すると200〜1000μmであり、さらに特定すると300〜1000μmである。網状構造体はまた、細胞1〜3個分の、厚み10〜60μmを有しうる。
本発明でアンモニア代謝機能をいうときは、特に記載した場合を除き、対象となる細胞を適切な条件で培養した場合のアンモニア代謝機能をいう。アンモニア代謝機能の測定方法は、当業者にはよく知られているが、フィーダー細胞(HUVECs、MSCs等)を用いず、後述する化合物(FH1)を用いて、必要に応じEMCでコート下培養器を用い、付着培養することが好ましい。より詳細な条件は、本書の実施例の項に記載の方法を参照することができる。
無血清及び/又は無フィーダー環境下での培養:
人工肝細胞の培養に際しては、各種の既存の培養器を利用できる。培養器素材は、当業者であれば適宜選択できるが、増殖が良好であり、かつ高い機能を維持するとの観点からは、EMCをコートした培養器を用いることが好ましい。好ましいECMの例は、matrigel(登録商標)、ヒアルロン酸、ヘパリン、フィブロネクチン、ラミニン、及びビトロネクチン、プロテオグリカン(コンドロイチン硫酸プロテオグリカン、ヘパラン硫酸プロテオグリカン、ケラタン硫酸プロテオグリカン、デルマタン硫酸プロテオグリカン)、各種コラーゲン、ゼラチン、テネイシン、エンタクチン、エラスチン、及びフィブリリン等である。
人工肝細胞は、後述する分化誘導メディウムIIIを用い、10日程度の継続培養が可能であることが確認されている。適切な密度で播種することにより、継代し、増殖させることができると考えられる。適切な密度とは、例えば人工肝細胞が互いに丁度接する密度である。これよりも低密度の場合は、増殖が悪く、またこれよりも高密度の場合は、三次元的構築を示す領域から顕著な細胞死が誘導されうる。
好ましい態様において用いられる人工肝細胞は、以下の工程を含む方法により製造することができる:
iPS細胞を、Activin Aを含む分化誘導メディウムIで培養する、分化誘導工程1;
分化誘導工程1から得た細胞を、骨形成タンパク質4(BMP4)及び線維芽細胞増殖因子2(FGF2)を含む分化誘導メディウムIIで培養する、分化誘導工程2;及び
分化誘導工程2から得た細胞を、肝細胞成長因子(HGF)、Oncostatin M、Dexamethasone及びN-phenyl-2-(N-phenylmethylsulfonamido) acetamide骨格を有する化合物を含む分化誘導メディウムIIIで培養して人工肝細胞を得る、分化誘導工程3。
分化誘導工程1では、iPS細胞を、少なくともActivin Aを含む分化誘導メディウムIで培養する。
好ましい態様において用いられる肝細胞を得るためには、出発細胞として、ヒト又は非ヒト動物由来のiPS細胞を用いる。iPS細胞の入手方法及び樹立方法は当業者にはよく知られている。ヒトiPS細胞は、理化学研究所バイオリソースセンターからの購入や、京都大学や国立成育医療研究センターからの分与が可能である。入手可能であり、かつ好ましいiPS細胞の例は、例えば、臍帯由来線維芽細胞(RCB0436 HUC-F2)にレトロウイルスベクターにより4因子(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc)を導入することにより樹立された、ヒト人工多能性幹(iPS)細胞株HiPS-RIKEN-1A(理化学研究所、HPS0003)、臍帯由来線維芽細胞(RCB0197 HUC-Fm)にレトロウイルスベクターにより4因子(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc)を導入することにより樹立されたヒトiPS細胞株HiPS-RIKEN-2A(理化学研究所、HPS0009)、臍帯由来線維芽細胞にレトロウイルスベクターにより3因子(Oct3/4, Sox2, Klf4)を導入することにより得られるヒトiPS細胞株HiPS-RIKEN-12A(理化学研究所、HPS0029)、センダイウイルスベクターを用いて4因子(Oct3/4, Sox2, Klf4, c-Myc)を導入することにより樹立されたヒトiPS細胞株Nips-B2(理化学研究所、HPS0223)等である。
iPS細胞を樹立する際、因子を導入するためのベクターとして、センダイウイルスベクターを用いることが好ましい。レトロウイルスベクターは細胞の核に入り込んでDNAとして遺伝子発現を行うものであるため、得られたiPS細胞を患者に用いた際に、極めて稀ではあるが、ベクターが患者の染色体に積極的に入り込んだり、あるいは染色体DNAと遺伝的組換えを起こす恐れが懸念されている。一方、センダイウイルスベクターは、細胞核の中に入らず、細胞質内で自らのゲノムを複製して大量のタンパク質を作り出すものである。このゲノムはRNAからできており、患者の染色体のDNAとは物質的に異なるため、センダイウイルスベクターが核内の患者の染色体を改変するリスクは原理上ないと考えられている。
この工程で用いられる分化誘導メディウムIは、Wnt3AやActivinA等のサイトカインを含む。少なくともActivinAを含むことが好ましい。サイトカインの量は、例えば、Wnt3Aは10〜50ng/mL程度、好ましくは25ng/ml程度、ActivinAは10〜100ng/ml程度、好ましくは100ng/ml程度である。
分化誘導工程2では、分化誘導工程1から得た細胞を、分化誘導メディウムIIで培養する。
この工程で用いられる分化誘導メディウムIIは、種々のサイトカイン、例えば、線維芽細胞増殖因子2(FGF2)、骨形成因子4(BMP4)、肝細胞増殖因子(HGF)を含む。サイトカインの量は、例えば、FGF2は5〜50ng/ml、BMP4は5〜50ng/ml、HGFは5〜50ng/mlであり、好ましくはFGF2は10ng/ml程度、BMP4は20ng/ml程度、HGFは20ng/ml程度である。分化誘導メディウムIIは、少なくとも骨形成タンパク質4(BMP4)及び線維芽細胞増殖因子2(FGF2)を含む。分化誘導メディウムIIも無血清とすることができ、例えばRPMI1640等の基本的な組成に、上述のサイトカインと血清代替品を添加して用いることができる。分化誘導メディウムIIの具体的な構成例は、本願明細書の実施例の項に記載された組成のものである。
本工程は、分化誘導工程2から得た細胞を、分化誘導メディウムIIIで培養して人工肝細胞を得る工程である。
ここで用いるサイトカイン及びホルモンの例は、オンコスタチンM(OSM)やDexamethasone等である。用いる量は、例えば、OSMは10〜50ng/ml、Dexamethasoneは0.05〜0.5μMであり、好ましくはOSMは25ng/ml程度、Dexamethasoneは0.1μM程度である。分化誘導メディウムIIIは、少なくとも、肝細胞成長因子(HGF)、Oncostatin M、Dexamethasone、並びにN,N'-(methylenebis(4,1-phenylene))diacetamide(FH1)及び/又は2-(N-(5-chloro-2-methylphenyl)(methylsulfonamido)-N-(2,6-difluorophenyl)-acetamide(FPH1)を含む。分化誘導メディウムIIIの具体的な構成例は、本願明細書の実施例の項に記載された組成のものである。
分化誘導メディウムIIIは、下式で表される、N,N'-(methylenebis(4,1-phenylene))diacetamide(FH1)及び/又は2-(N-(5-chloro-2-methylphenyl)(methylsulfonamido)-N-(2,6-difluorophenyl)-acetamide(FPH1)を含む。
分化誘導工程1〜3はいずれも、血清及び/又は無フィーダー環境下で、好ましくは無血清かつ無フィーダー環境下で実施することができる。また必要に応じ、ECMをコートした培養器を用いて実施することができる。
肝実質細胞は、発生学的に、胚様体における心筋細胞の出現に続いて出現することが知られている。実験的に肝実質細胞は、胚様体から分化した心筋細胞近傍に発現が観察されることが知られている。
好ましくは、上記の人工肝細胞の項で述べたように、網状構造体を構成可能であること、高いアンモニア代謝能を有することを指標とする。
[iPS細胞の作製]
下記の方法でiPS細胞を作製した。
1. POIETICS(登録商標) CORD BLOOD CD34+ Cells (Cat. No. 2C-101A)、POIETICS(登録商標) Mobilized CD34+ Cells (Cat. No. 2G-101B) を解凍する.
2. CytoTune(登録商標)-iPS 2.0 Sendai Reprogramming Kitを用い、キットに付属のプロトコールに従い、iPS細胞を作製する.
下記を行い、iPS細胞が得られたことを確認した。
1. 253G1(理研より入手)及びCiPSをCytoSpin(登録商標)でスライドガラスに貼り付ける(800rpm, 5min)
2. 4%パラフォルムアルデヒド(ナカライテスク)で固定(15min, 室温)
3. PBSで3回洗浄
4. ブロッキング(0.3% TritonX-100, 1% BSA, 10% AB serum 又はBlockingOne-Histo(ナカライテスク))10〜20min, 室温
5. 0.1% Tween PBS処理 5min, 室温
6. R&D, Human Pluripotent stem cell 3 color Immunocytochemistry kit 各10倍希釈、3hr, 室温又はo/n, 4℃
7. PBSで洗浄
8. VECTA SHIELD(登録商標) Hard Set with DAPIで封入
9. オールインワン蛍光顕微鏡BZ-9000(KEYENCE)で観察
1. 253G1(理研より)及びCiPSをAccutase処理37℃, 5minで剥離させ、回収
2. SSEA-4 FITC, SSEA-3 PE, TRA-1-81 PE(各終濃度1μg/ml)抗体で染色(4℃, 30min)
3. FACSCaliburで測定
4. CellQuest或いはFlowJoで解析
後述の培養法において、定期的にオールインワン蛍光顕微鏡BZ-9000(KEYENCE)で観察
1. 12-well plateでiPS細胞を培養
2. PBSで洗浄
3. 10% 中性ホルマリン 1ml/wellで固定(5min, 室温)
4. PBSで洗浄
5. Anti-Sev抗体(0.1% TritonX-100/PBSで1/500希釈)500μl添加
6. 37℃, 1h反応
7. PBSで洗浄
8. Dyelight550標識anti-rabbit IgG抗体(0.1% TritonX-100/PBSで1/500希釈)500μl添加
9. 37℃, 1h反応
10. PBSで洗浄
11. オールインワン蛍光顕微鏡BZ-9000(KEYENCE)で観察
免疫染色及びフローサイトメトリーの結果を図3に、定期的に細胞の形態を観察した結果を図4に、CiPS細胞からのrSeVベクターの脱落を確認した結果を図5に示した。CiPS細胞は、作製から拡大培養の全工程において、フィーダーレスであった。また、感染からおよそ3か月の継代で、sReVが脱落したCiPSを取得できた。
下記の方法で、iPS由来高機能肝細胞(CiPS-Hep)を誘導するためのiPS細胞を準備した。なお、iPS細胞コロニー観察等、上記の作製されたiPS細胞の確認においては、本項に示した方法を実施した。
1. Laminin-51) (-80℃)を4℃で融解しておく.手で温めないように注意.
2. 6ウェルプレート2)にPBS3)を1ml/well入れ,全体に行き渡らせる.
3. PBSの入った6ウェルプレートと200μlチップを4℃で冷やしておく.
4. 融解したLaminin-5をPBSの入ったウェルに回し入れ,素早く10回程度ゆらし,全体に行き渡らせる.Laminin-5は吸着性が非常に強いため,ピペッティングは絶対にしない.
5. 4℃で一晩,又は37℃で2時間以上インキュベートしてコーティングする.37℃で放置しないこと.
6. すぐに使用しない場合はパラフィルムで2重にシールし,4℃で保存できる.(1週間)
1. P2の遠心分離機を20℃に設定する.
2. 各種阻害剤(以下の工程9で使用の4種)を-30℃のフリーザーから出しておく.
3. 培養メディウムを調製する(以下ReproFF2と記載).
5. ラミニンコートディッシュをPBS(-)で2回すすぎ,1mlのPBS(-)をウェルに入れておく.
6. 凍結細胞を液体窒素から取り出し,37℃のウォーターバスに2min漬けて溶解する.凍結細胞の容量が少ない場合は,温めた培地を適量加え,優しくピペッティングすることにより素早く解凍させる.
7. 解凍した細胞を回収し培養メディウム9mlを入れた15mlチューブに移し,優しく転倒混和し混ぜる.
8. 遠心分離 条件:160g, 5min, R.T. アクセル有,ブレーキ有
9. 遠心中に培養メディウム+各種阻害剤を4ml調製する.
11. 阻害剤培養メディウムを1ml加え細胞ペレットをピペッティングにより優しくほぐす.
12. ラミニンコートディッシュのPBS(-)を除去し,細胞懸濁培養液をウェルに移す.残りの阻害剤培養メディウムで15mlチューブを洗い,ウェルへ移す.
13. ディッシュを揺らし,細胞を均一に広げ,37℃,5%CO2でインキュベートする.
14. 翌日,優しくウェル中の培地を混ぜた後,上清を除去する.
15. 再び培養メディウム+各種阻害剤4mlを加え37℃,5%CO2で培養する.
1. 培養上清を除去する
2. 新鮮な培養メディウムReproFF2を4ml/wellで加える.
3. 上記の操作を2〜3日おき(月,水,金)に行う.
1. ラミニンコートディッシュを作製する.
2. 培養上清を除去する.
3. PBS(-) 1mlを加え細胞表面を洗浄する.
4. PBS(-)を除去し,ESGRO Complete Accutase12)を1ml/wellで加え,37℃,5%CO2,5minインキュベートする.
5. ウェル中の剥がれきれていない細胞をピペッティングによりはがし,細胞溶液を15mlチューブへ回収する.
6. ウェルにReproFF2を1ml加え,ウェル内を洗浄し15mlチューブへ溶液を回収し,さらに15mlチューブへReproFF2をもう1ml加え,Total volumeを3mlにする.
7. 調整した細胞懸濁液をよく混和後,トリパンブルー染色液13)で2倍希釈しセルカウントを行う.
8. 継代するウェル数に応じて5x105cells/wellになるように細胞懸濁液を新たな15mlチューブへ分注する.必要に応じて残りの細胞は凍結保存する.
9. 遠心分離する.条件:160g, 5min, R.T. アクセル有,ブレーキ有
10. 遠心中に培養メディウム+阻害剤を4ml/wellになるように調整する.
12. 培養プレートに日付,iPS細胞の名前,継代数を記載し37℃,5%CO2で培養する.
月→金→水→月の間隔で継代を続ける.
1. 細胞継代時と同様に細胞をはがし,カウントする.
2. 細胞懸濁液を遠心分離する.条件:160g, 5min, R.T. アクセル有,ブレーキ有
3. 凍結に用いるセラムチューブ14)に日付,細胞名,継代数をラベルする.
4. 遠心後,上清をしっかり除き,1x106 cells/500μlになるようにSTEM-CELLBANKER15)に細胞を懸濁させる.
5. 細胞懸濁液をラベリングしたセラムチューブに500μl/本ずつ分注していく.
6. 分注後,セラムチューブを-80℃のディープフリーザーに入れる.
7. 1〜3日後以内に凍結した細胞を-80℃から液体窒素細胞保存システムへ移動させ保管する.
下記の方法で、CiPS細胞から高機能肝細胞(CiPS-Hep)を分化誘導した。
1. メディウムIを必要量(4ml/well)調製する.
3. メディウムIを4ml/wellになるように加える.
4. Day6まで毎日上清を除去し,新鮮なメディウムIを加える作業を行う.
1. メディウムIIを必要量(4ml/well)調製する.
3. Day9まで毎日上清を除去し,新鮮なメディウムIIを加える作業を行う.
1. 培養プレートのマトリゲルコーティング
1.1. BD matrigel growth factor reduced20) 300μlを4℃で解凍する.
1.2. 24 well-plate dish21),KnockOut-DMEM22)を4℃で冷やしておく.
1.3. マトリゲルが融解されたら,KnockOut-DMEMを等量加え,ピペッティングによりよく混和する.
1.4. マトリゲル希釈液を24 well-plate dishへ1wellあたり200μlずつ入れwell全体に行き渡らせる.
1.5. 24 well-plate dishを常温で3時間以上静置しコーティングする.
2.1. iPS由来高機能肝細胞分化誘導メディウムIII(以下メディウムIII)を1ml/wellになるように調製する.
2.3. ESGRO Complete Accutaseを1ml加え,37℃で5minインキュベートする.
2.4. 念入りにピペッティングして細胞をはがし,細胞溶液を15mlチューブへ回収する.
2.5. HCM 1mlでウェル内を洗浄し15mlチューブへ溶液を回収し,さらに15mlチューブへHCMをもう1ml加え,Total volumeを3mlにする.
2.6. 細胞懸濁液をよく混和し,トリパンブルー2倍希釈でセルカウントする.
2.7. 継代するウェル数に応じて1.0x106cells/wellになるように新たな15mlチューブへ必要量を分注する.
2.8. 160g, 5min, R.T.で遠心分離する.
2.9. 遠心中にマトリゲルコーティングウェルにPBS(-)を1ml加え,洗浄し上清を除去する.この洗浄作業を2回繰り返し,ウェルにPBS(-)を1ml加える.
2.10.遠心後上清を除去し,Adhesion cultivationを行う場合にはマトリゲルコーティングウェルの上清も除去後,メディウムIIIを用いて細胞ペレットをピペッティングによりほぐし,マトリゲルコーティングウェルに播種する.
Floating cultivateonを行う場合には、メディウムIIIを用いて細胞ペレットをピペッティングによりほぐし,MPC treatment plate(MD6 with Lid Low-Cell Binding; Nalge Nunc International, Japan)に播種する.
HUVEC及びMSCをフィーダー細胞として用いる場合には、Adhesion cultivationとして適宜共培養を行う(後掲非特許文献1参照).
2.11.培養プレートに日付,細胞の名前等記載し,37℃,5%CO2インキュベータ内で培養する.
2.12.Day17まで隔日で上清を除去し,新鮮なメディウムIIIを加える作業を行う.
1. HBM(カクテル−)+ アンモニア水(以下アンモニア培地)を1ml/well×2になるように調製する.
3. 上清を除去し,アンモニア培地を1ml/wellで加える.
4. 空きのウェルにアンモニア培地及びHBMを1mlずつ入れ,ポジコン及びネガコンとする.
5. 37℃,5%CO2で24hr培養する.
1. 上清をエッペンチューブに回収し,500g,5min遠心分離する.
2. 上清を新しいエッペンチューブ3本に300μlずつ回収し,-80℃で凍結する.
3. ウェルをPBSで洗浄し,トリプシンEDTA30) 1mlを加え,37℃で5minインキュベートする.
4. 念入りにピペッティングして細胞をはがし,細胞溶液をFACSチューブ31)に通す.
5. HBM 1mlで洗浄し,Total volumeを2mlにする.
6. トリパンブルーでカウントする.
下記を行い、iPS細胞が得られたことを確認した。
1. 上清を溶解させる.
2. 遠心 8000rpm 5min 4℃
3. アンモニア希釈液を作製する.キット内の標準液及び標準希釈液は使用しない.HBM(無添加)960μlにアンモニウムイオン標準液 (1000mg/L) 40μlを添加し,ボルテックスし,標準液とする.
5. 800μlの除タンパク液を加え,ボルテックスする.
6. 遠心 8000rpm 5min 4℃
7. 遠心中にマイクロプレートリーダー及びパソコンの電源を入れ,Tecan i-controlを選択しておく.
8. 上清を60μlずつ96well 平底プレートへ分注していく.Duplicate
9. 発色試液Aを60μlずつ各ウェルに加えていく.
10. 蓋を外してマイクロプレートリーダーにセットし,プレートを撹拌する.(Shakingをダブルクリック,10sec,Normalにセットし,Statをクリック)
11. 発色試液Bを30μlずつ各ウェルに加えていく.
12. マイクロプレートリーダーにセットし,プレートを撹拌する.
13. 発色試液Cを60μlずつ各ウェルに加えていく.なるべく速く.
14. マイクロプレートリーダーにセットし,プレートを撹拌する.
15. 37℃,CO2 5%インキュベータで20minインキュベートする.
16. 4℃で10min以上冷やし反応を止める.
17. プレートの底面をきれいに拭き,左上を合わせて,マイクロプレートリーダーにセットする.
18. 吸光度(620 or 630nm)を測定する.(MeasureのAbsorbanceをダブルクリック.620nm.Detailsで測定するwellを選択.Startをクリック)
1. ISOGEN II(ニッポンジーン)を用い、付属のプロトコールに従い、RNA抽出
2. ナノドロップ(登録商標)でRNA濃度測定
3. PrimeScript High Fidelity RT-PCR kitでcDNAを合成
4. Veriti 96-well Thermal Cycler(Applied Biosystems)でPCR実施
5. プライマーセットは以下の通り
8. Gel Redで染色し、観察
得られたiPS-HEP細胞の写真を、図6に示した。得られた細胞は、特徴的な網状構造体を構成するものであった。空隙の直径は約300〜1000μmであり、網部分の幅は約20〜200μmであった。細胞1〜3個分の厚み約10〜60μmを有していた。
非特許文献1:T. Takebe et al. Vascularized and functional human liver from an iPSC-derived organ bud transplant. Nature 499, 481-484 (2013), doi:10.1038/nature12271, Published online 03 July 2013
2 血漿成分出口ポート
3 血漿成分循環室
4 肝細胞培養室
5 分離膜
6 分離膜サポート(分離膜の変形を抑制する手段)
7 モジュール蓋
8 モジュール本体
9 肝細胞
10 患者
11 血漿分離器
12 人工肝臓
20 循環回路1(患者側回路)
21 循環回路2(人工肝臓側回路)
SEQ ID NO.:2 hALB Rev
SEQ ID NO.:3 hHNF4a For
SEQ ID NO.:4 hHNF4a Rev
SEQ ID NO.:5 hOCT4 For
SEQ ID NO.:6 hOCT4 Rev
SEQ ID NO.:7 hCYP3A4 For
SEQ ID NO.:8 hCYP3A4 Rev
SEQ ID NO.:9 hβ-actin For
SEQ ID NO.:10 hβ-actin Rev
Claims (11)
- 以下を含む、少なくとも一個のモジュールを備える、体外型の人工肝臓:
・血漿成分入口ポート及び血漿成分出口ポート;
・血漿成分入口ポート及び血漿成分出口ポートを備える、血漿成分循環室;及び
・血漿成分循環室に隣接して配置され、血漿成分循環室とはアンモニアは透過するが肝細胞は透過しない分離膜で隔てられており、アンモニア代謝能を有する肝細胞が培養されている肝細胞培養室であって、
肝細胞培養室で培養されている肝細胞が、以下の工程を含む製造方法により得られる、100μg/dl/24h以上のアンモニア代謝機能を有し、かつ網状構造体を構成可能な、人工肝細胞である、人工肝臓:
iPS細胞を、Activin Aを含む分化誘導メディウムIで培養する、分化誘導工程1;
分化誘導工程1から得た細胞を、骨形成タンパク質4(BMP4)及び線維芽細胞増殖因子2(FGF2)を含む分化誘導メディウムIIで培養する、分化誘導工程2;及び
分化誘導工程2から得た細胞を、肝細胞成長因子(HGF)、Oncostatin M、Dexamethasone、並びにN,N'-(Methylenebis(4,1-phenylene))diacetamide(FH1)及び2-(N-(5-Chloro-2-methylphenyl)methylsulfonamido)-N-(2,6-difluorophenyl)-acetamide(FPH1)を含む分化誘導メティウムIIIで付着培養して人工肝細胞を得る、分化誘導工程3。 - 肝細胞培養室の上に血漿成分循環室が配置されている、請求項1に記載の人工肝臓。
- iPS細胞が、センダイウイルスベクターを用いて製造されたものである、請求項1又は2に記載の人工肝臓。
- 肝細胞が、無血清かつ無フィーダー環境下で培養されている、請求項1〜3のいずれか1項に記載の人工肝臓。
- モジュール1個あたり少なくとも1.0×106個の肝細胞が培養されている、請求項1〜4のいずれか1項に記載の人工肝臓。
- 複数個のモジュールを備え、5.0×109〜5.0×1011個の肝細胞が培養されている、請求項1〜5のいずれか1項に記載の人工肝臓。
- 1×104〜1×106cm2の有効培養面積を有する、請求項1〜6のいずれか1項に記載の人工肝臓。
- 少なくとも以下を備える、体外型の人工肝臓用又は肝細胞培養用の器具:
・血漿成分入口ポート及び血漿成分出口ポート;
・血漿成分入口ポート及び血漿成分出口ポートを備える、血漿成分循環室;及び
・血漿成分循環室に隣接して配置され、血漿成分循環室とはアンモニアは透過するが肝細胞は透過しない分離膜で隔てられた、肝細胞が培養の際に付着するための底面を有する肝細胞培養室であって、
以下の工程を含む製造方法により得られる人工肝細胞を培養するための、器具:
iPS細胞を、Activin Aを含む分化誘導メディウムIで培養する、分化誘導工程1;
分化誘導工程1から得た細胞を、骨形成タンパク質4(BMP4)及び線維芽細胞増殖因子2(FGF2)を含む分化誘導メディウムIIで培養する、分化誘導工程2;及び
分化誘導工程2から得た細胞を、肝細胞成長因子(HGF)、Oncostatin M、Dexamethasone、並びにN,N'-(Methylenebis(4,1-phenylene))diacetamide(FH1)及び2-(N-(5-Chloro-2-methylphenyl)methylsulfonamido)-N-(2,6-difluorophenyl)-acetamide(FPH1)を含む分化誘導メティウムIIIで付着培養して人工肝細胞を得る、分化誘導工程3。 - 肝細胞培養室が、肝細胞を導入するための細胞導入ポートを備える、請求項8に記載の器具。
- 肝細胞培養室が、空気を排出するためのエア抜きポートを備える、請求項9に記載の器具。
- 肝細胞培養室内に、分離膜の変形を抑制する手段を備える、請求項8〜10のいずれか1項に記載の器具。
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