KR20130039726A - 대사 증후군의 치료를 위한 글루코만난, 잔탄 검 및 알긴산염을 포함하는 식품 - Google Patents

대사 증후군의 치료를 위한 글루코만난, 잔탄 검 및 알긴산염을 포함하는 식품 Download PDF

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마이클 리온
시몬 우드
크리스토퍼 존 로슨
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Abstract

글루코만난, 잔탄 검 및 알긴산염의 혼합물을 포함하는 식단 보충 및 식품. 식품 및 보충은 대사 증후군, 타입 I 당뇨병, 타입 II 당뇨병, 췌장 질환 또는 과지질혈증의 발병을 지연시키고, 진행을 늦추고, 및/또는 적어도 하나의 증상을 개선하는데 사용된다. 글루코만난, 잔탄 검 및 알긴산염의 혼합물은 다당류의 산성 가수분해 후 크로마토그래피성 분리를 수반하는 탄수화물 분석의 표준 방법을 사용하여 분석된다.

Description

대사 증후군의 치료를 위한 글루코만난, 잔탄 검 및 알긴산염을 포함하는 식품{FOOD COMPRISING GLUCOMANNAN, XANTHAN GUM AND ALGINATE FOR THE TREATMENT OF METABOLIC DISORDERS}
관련된 출원에 대한 교차-참고문헌
본 출원은 2010년 3월 10일에 출원된 출원 번호 61/312,630, 및 2010년 6월 23일에 출원된 출원 번호 61/357,658의 이익을 주장하며, 이것의 개시는 전문이 본원에 참고로 포함된다.
기술 분야
본 발명은 식이 섬유 조성물, 식이 섬유를 조성물을 포함하는 의료 식품, 및 대사 증후군 및 타입 II 당뇨병의 발병을 지연시키고 심각성을 완화하기 위한 그들의 사용법과 관련된다.
타입 II 당뇨병에 걸릴 수도 있는 질환인, 비만 및 대사 증후군은 점점 더 흔해지고 있다. 고혈압 (hypertension) 및 과지질혈증 (dyslipidemia)에 따른 내장 비만, 혈당, 및 인슐린 레벨의 증가는 총칭 대사 증후군으로 알려진 임상적 질환의 그룹임상적인 질환의 그룹이다 (E.J.　Gallagher et　al., Endocrinol. Metab . Clin . North Am .　37:559-79 (2008)). 이 질환들은 세포의 증가한 인슐린 저항 때문이고, 이 증상들은 타입 II 당뇨병으로 진행하는 과정에 대한 전구체라는 것이 발견되었다. 현재 대사 증후군을 확인하는 정확한 진단적 기준에 대한 논란이 있고, 연관된 과지질혈증 및 고혈압이 특이적 약물 사용을 해야하지만, 어느 약도 그것의 치료에 대해 입증되지 않았다. 타입 II 당뇨병은 전형적으로 혈당을 조절하기 위해 다양한 약 및, 더 심각한 경우에, 인슐린 주사로 관리된다. 하지만, 식단 및 체중 감소는 대사 증후군 및 타입 II 당뇨병과 연관된 많은 대사 이상을 바로잡는데 큰 역할을 한다 (Yip　et　al., Obesity Res.　9:341S-347S (2001)). 연구는 대사 증후군에 걸린 사람들이 주요 관상 동맥 질환을 경험할 50% 더 큰 위험을 갖는다는 것을 나타내었다 (D.E. Moller et　al., Annu . Rev . Med .　56:45-62 (2005)). 따라서, 체중, 공복의 인슐린, 및 글루코스의 감소는 고통받는 개개에 큰 건강 이익을 제공한다.
높은 혈당 지수 (glycemic index)를 갖는 음식의 섭취는 과식 및 비만으로 이끄는 것으로 알려져 있다 (Ludwig　et　al., Pediatrics　103(3):E26 (1999)). 그러므로, 당뇨성 또는 전-당뇨성 질환뿐만 아니라 체중 감소에 사용되는 약제로 혈당 지수를 낮추는 것이 바람직하다. 이러한 약제가 음식의 혈당 지수를 감소시킬 수 있으면 가장 바람직하다.
탄수화물 섭취의 감소는 또한 당뇨성 질환의 성공적인 관리에 필요하다. 식단 상담은 유용하지만, 그들이 저혈당을 더 자주 경험하는 만큼 당뇨병 환자는 더 많은 식탐을 경험한다 (Strachan　et　al., Physiol . Behav .　80(5):675-82 (2004)). 추가로, 당뇨병 환자의 혈당치를 낮추는 치료는 종종 체중증가량의 원하지 않는 부작용과 연관된다 (Schultes　et　al., J.　 Clin . Endocrinol . Metabol.　88(3):1133-41 (2003)). 가용성 식이 섬유가 높은 식단은 증가한 인슐린 민감도를 통해 당뇨병의 위험을 감소시킬 수도 있다 (Ylonen　et　al., Diabetes Care　26:1979-85 (2003)). 이것은 혈당 조절에서 가능한 식이 섬유의 역할로부터 일어날 수도 있다. 고 점성 식단은 저 점성 식단과 비교하여 더 큰 포만감을 생산한다는 것이 또한 보고되었다 (Marciani　et　al., Am .　J. Physiol . Gastrointest . Liver Physiol.　280:G1227-33 (2001)).
따라서, 혈당치를 낮추고 포만을 촉진함으로써 당뇨성 질환을 포함하는 대사 증후군의 관리를 돕는 식이 섬유 조성물이 필요하다. 본 발명은 이 필요 등을 말한다.
한 양태에서, 본 발명은 대사 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상의 예방, 치료, 또는 개선을 위해 합성된 의료 식품을 제공한다. 본 발명의 본 양태에 따라 의료 식품은 약 48 중량% 내지 약 90 중량% 글루코만난, 약 5 중량% 내지 약 20 중량% 잔탄 검, 및 약 5 중량% 내지 약 30 중량% 알긴산염, 및 단백질, 탄수화물, 및 지방으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 다량영양소를 포함하는, 점성 섬유질 블렌드 (blend) ("VFB") 또는 이들의 복합체 ("VFC")를 포함하는 고점성의 다당류 식이 섬유 조성물을 포함한다.
다른 양태에서, 본 발명은 의료 식품 생성물에 글루코만난, 잔탄 검, 및 알긴산염을 포함하는, 점성 섬유질 블렌드 (VFB) 또는 이들의 복합체 ("VFC")를 포함하는 식이 섬유 조성물의 유효량을 추가하는 단계를 포함하는 의료 식품 생성물을 제조하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 의료 식품 생성물은 대사 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 장애를 예방, 치료 또는 개선을 위해 합성된다. 일부 구체예에서, 의료 식품 생성물에 추가된 식이 섬유 조성물은 약 48 중량% 내지 약 90 중량% 글루코만난, 약 5 중량% 내지 약 20 중량% 잔탄 검, 및 약 5 중량% 내지 약 30 중량% 알긴산염을 포함한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 대사 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 또는 개선하는 방법을 제공한다. 본 발명의 본 양태의 방법은 대상체의 대사 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 또는 개선에 효과적인 시간 동안 효과적인, 약 48 중량% 내지 약 90 중량% 글루코만난, 약 5 중량% 내지 약 20 중량% 잔탄 검, 및 약 5 중량% 내지 약 30 중량% 알긴산염을 포함하는, 점성 섬유질 블렌드 (VFB) 또는 이들의 복합체 (VFC)를 포함하는, 고점성 다당류 식이 섬유 조성물 약 25 mg/kg/일 내지 약 1000 mg/kg/일을 이들을 필요로 하는 사람 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 타입 II 당뇨병에 걸려서 고통받거나, 또는 이에 걸릴 위험이 있는 포유 동물 대상체의 인슐린 저항성의 진행과 연관된 적어도 하나의 증상을 개선하는 방법을 제공한다. 본 발명의 본 양태의 방법은 약 48 중량% 내지 약 90 중량% 글루코만난, 약 5 중량% 내지 약 20 중량% 잔탄 검, 및 약 5 중량% 내지 약 30 중량% 알긴산염을 포함하는, 점성 섬유질 블렌드 (VFB) 또는 이들의 복합체 (VFC)를 포함하는, 고점성 다당류 식이 섬유 조성물 약 25 mg/kg/일 내지 약 1000 mg/kg/일을 이들을 필요로 하는 포유 동물 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
또 다른 양태에서, 본 발명은 적어도 하나의 다당류를 포함하는 샘플에서 구성당을 결정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 본 양태의 방법은: (a) 가수분해물을 생산하기 위해 산과 함께 적어도 하나의 다당류를 포함하는 샘플을 가수분해하는 단계; (b) 크로마토그래피 방법으로 가수분해시 가수분해 생성물을 분리하는 단계; (c) 단계 (b)에서 분리된 가수분해 생성물을 검출하는 단계; 및 (d) 샘플의 구성당을 결정하기 위해 단계 (c)에서 검출된 가수분해 생성물을 하나 이상의 표준 대조군과 비교하는 단계를 포함한다.
상기 양태 및 본 발명의 많은 부수적 이점은 첨부된 도식과 함께 연결할 때, 같은 것이 다음의 상세한 설명에 대한 참고문헌에 의해 더 잘 이해되는 만큼 더 쉽게 인정될 것이고,
도 1a은 실시예 1에 설명된 바와 같이, Zucker 당뇨병 래트의 8주 동안 시간이 지남에 따라 체중 (g)에 대한 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 식단의 효과를 도시한다;
도 1b는 실시예 1에 설명된 바와 같이, Zucker 당뇨병 래트의 8주 동안 시간이 지남에 따라 음식 소비 (g/일)에 대한 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 식단의 효과를 도시한다;
도 2a는 실시예 1에 설명된 바와 같이, Zucker 당뇨병 래트의 8주 동안 시간이 지남에 따라 공복 혈당치 (mg/dL)에 대한 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린을 함유하는 식단의 효과를 도시한다;
도 2a는 실시예 1에 설명된 바와 같이, Zucker 당뇨병 래트의 8주 동안 시간이 지남에 따라 공복 혈청 인슐린 레벨 (mg/dL)에 대한 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린을 함유하는 식단의 효과를 도시한다;
도 2c는 실시예 1에 설명된 바와 같이, Zucker 당뇨병 래트의 8주 동안 시간이 지남에 따라 비-공복 혈당치 (mg/dL)에 대한 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린을 함유하는 식단의 효과를 도시한다;
도 2d는 실시예 1에 설명된 바와 같이, Zucker 당뇨병 래트의 8주 동안 시간이 지남에 따라 공복 항상성 모델 평가 (Homeostasis Model Assessment; HOMA) 점수 (mg*U/ml2)에 대한 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린을 함유하는 식단의 효과를 도시한다;
도 3a는 실시예 1에 설명된 바와 같이, 8주 연구 동안 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 식단을 먹인 공복 Zucker 당뇨병 래트에 대한 합성 인슐린 민감도 지수 (composite insulin sensitivity index; CISI)를 도시한다;
도 3b는 실시예 1에 설명된 바와 같이, 8주 연구 동안 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 식단을 먹인 비-공복 Zucker 당뇨병 래트에 대한 합성 인슐린 민감도 지수를 도시한다;
도 3c는 실시예 1에 설명된 바와 같이, 8주 연구 동안 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 식단을 먹인 비-공복 Zucker 당뇨병 래트에 대한 HOMA 점수를 도시한다;
도 4는 실시예 1에 설명된 바와 같이, 8주 연구 동안 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 식단을 먹인 공복 Zucker 당뇨병 래트에서 측정된 혈청 트리글리세리드의 레벨을 도시한다;
도 5a는 실시예 1에 설명된 바와 같이, 0-5의 조직학적인 점수에 기초하여, 가장 심각한 5로, 세뇨관의 팽창 8주 후 Zucker 당뇨병 래트에 대한 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 함유하는 식단의 효과를 도시한다;
도 5b는 실시예 1에 설명된 바와 같이, 0-5의 조직학적인 점수에 기초하여, 가장 심각한 5로, 세뇨관의 퇴화/재생 8주 후 Zucker 당뇨병 래트에 대한 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 함유하는 식단의 효과를 도시한다;
도 5c는 실시예 1에 설명된 바와 같이, 0-5의 조직학적인 점수에 기초하여, 가장 심각한 5로, 신장 혈관 사이 확장 8주 후 Zucker 당뇨병 래트에 대한 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 함유하는 식단의 효과를 도시한다;
도 6은 실시예 1에 설명된 바와 같이, 항-래트 인슐린 항체로 염색에 의해 결정된 바와 같이, 8주 연구의 끝에 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 식단을 먹인 Zucker 당뇨병 래트에 존재하는 췌장도 인슐린 면역반응성 영역의 퍼센트를 도시한다;
도 7a는 실시예 1에 설명된 바와 같이, 0-5의 조직학적인 점수에 기초하여, 가장 심각한 5로, 8주 연구의 끝에 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 식단을 먹인 Zucker 당뇨병 래트에 존재하는 췌장도 단핵 염증 세포 침윤에 대한 조직학적 점수를 도시한다;
도 7b는 실시예 1에 설명된 바와 같이, 0-5의 조직학적인 점수에 기초하여, 가장 심각한 5로, 8주 연구의 끝에 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 식단을 먹인 Zucker 당뇨병 래트에 존재하는 췌장도 세포 분해에 대한 조직학적 점수를 도시한다;
도 7c는 실시예 1에 설명된 바와 같이, 0-5의 조직학적인 점수에 기초하여, 가장 심각한 5로, 8주 연구의 끝에 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 식단을 먹인 Zucker 당뇨병 래트에 존재하는 췌장도 섬유증의 양에 대한 조직학적 점수를 도시한다;
도 8a는 실시예 1에 설명된 바와 같이, 0-5의 조직학적인 점수에 기초하여, 가장 심각한 5로, 감소된 수단 블랙 염색 (Sudan black staning)에 의해 측정된 바와 같이, 지방간 (hepatic steatisos) 8주 후, Zucker 당뇨병 래트에 대한 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 식단의 효과를 도시한다;
도 8b는 실시예 1에 설명된 바와 같이, 0-5의 조직학적인 점수에 기초하여, 가장 심각한 5로, 간 미세혈관 공포현상 (hepatic microvesicular vacuolation) 8주 후, Zucker 당뇨병 래트에 대한 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 식단의 효과를 도시한다;
도 8c는 실시예 1에 설명된 바와 같이, 0-5의 조직학적인 점수에 기초하여, 가장 심각한 5로, 간 미세혈관 공포현상 (hepatic microvesicular vacuolation) 8주 후, Zucker 당뇨병 래트에 대한 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 식단의 효과를 도시한다;
도 9는 실시예 2에 설명된 바와 같이, 43주 이상 연구한 Sprague-Dawly 수크로스 먹인 래트에서 체중 증가량 및 혈청 트리아실글리세롤 (TAG)에 대한 VFC 또는 셀룰로스의 효과를 도시한다;
도 10a는 실시예 4에 설명된 바와 같이, 3주의 연구 기간 (V1=연구 개시일 0; V2=14일; V3 21일) 이상 모든 건강한 성인 연구 참가자의 혈장 PYY 레벨에 대한 VFC 또는 대조군 (탈지 우유 비과립화)의 효과를 도시한다;
도 10b는 실시예 4에 설명된 바와 같이, 3주의 연구 기간 (V1=연구 개시일 0; V2=14일; V3 21일) 이상 BMI 23 미만인 모든 건강한 성인 연구 참가자의 혈장 PYY 레벨에 대한 VFC 또는 대조군 (탈지 우유 비과립화)의 효과를 도시한다;
도 10c는 실시예 4에 설명된 바와 같이, 3주의 연구 기간 (V1=연구 개시일 0; V2=14일; V3 21일) 이상 모든 건강한 성인 연구 참가자의 공복 그렐린 (ghrelin) 레벨에 대한 VFC 또는 대조군 (탈지 우유 비과립화)의 효과를 도시한다;
도 11a는 실시예 6에 설명된 바와 같이, 0.5%의 VFB 비과립화 (삼성분 혼합물1 ("TM1")으로 나타남) 및 가공한 (예를 들어, 과립화) VFC (PGX?)의 유동 곡선 비교를 도시한다;
도 11b는 실시예 6에 설명된 바와 같이, 0.2%의 VFB 비과립화 (삼성분 혼합물1 ("TM1")으로 나타남) 및 가공한 (예를 들어, 과립화) VFC (PGX?)의 유동 곡선 비교를 도시한다;
도 11c는 실시예 6에 설명된 바와 같이, 0.1%의 VFB 비과립화 (삼성분 혼합물1 ("TM1")으로 나타남) 및 가공한 (예를 들어, 과립화) VFC (PGX?)의 유동 곡선 비교를 도시한다;
도 12a는 실시예 6에 설명된 바와 같이, VFB 비과립화 (TM1) 및 가공한 (예를 들어, 과립화) VFC (PGX?) 및 잔탄 검의 거듭 제곱 법칙 K 비교를 도시한다;
도 12b는 실시예 6에 설명된 바와 같이, VFB 비과립화 (TM1) 및 가공한 (예를 들어, 과립화) VFC (PGX?) 및 잔탄 검의 거듭 제곱 법칙 η 비교를 도시한다;
도 13a는 실시예 6에 설명된 바와 같이, 25℃에서 측정된 0.1 중량%, 0.2 중량%, 및 0.5 중량%의 곤약 글루코만난의 유동 곡선을 도시한다;
도 13b는 실시예 6에 설명된 바와 같이, 25℃에서 측정된 0.1 중량%, 0.2 중량%, 및 0.5 중량%의 잔탄 검의 유동 곡선을 도시한다;
도 13c는 실시예 6에 설명된 바와 같이, 25℃에서 측정된 0.1 중량%, 0.2 중량%, 및 0.5 중량%의 알긴산 나트륨의 유동 곡선을 도시한다;
도 14a는 실시예 6에 설명된 바와 같이, 25℃에서 측정된, 일정 비율 (KM:XG　=　4.12:1)의 곤약 글루코만난 (KM) 및 잔탄 검 (XG) 및 알긴산 나트륨의 가변량 (0%, 2%, 5%, 8%, 11%, 13%, 17%, 21%, 24%, 27%, 30%, 및　33%)을 함유하는, 곤약 글루코만난, 잔탄 검, 및 알긴산염을 포함하는 삼성분 혼합물의 비가열된 수성 용액 (0.5% 농도)의 유동 곡선을 도시한다;
도 14b는 실시예 6에 설명된 바와 같이, 25℃에서 측정된, 일정 비율 (KM:XG　=　4.12:1)의 곤약 글루코만난 (KM) 및 잔탄 검 (XG) 및 알긴산 나트륨의 가변량 (0%, 2%, 5%, 8%, 11%, 13%, 17%, 21%, 24%, 27%, 30%, 및　33%)을 함유하는, 1시간 동안 가열된, 곤약 글루코만난, 잔탄 검, 및 알긴산염을 포함하는 삼성분 혼합물의 수성 용액 (0.5% 농도)의 유동 곡선을 도시한다;
도 14c는 실시예 6에 설명된 바와 같이, 25℃에서 측정된, 일정 비율 ((KM:XG　=　4.12:1)의 곤약 글루코만난 (KM) 및 잔탄 검 (XG) 및 알긴산 나트륨의 가변량 (0%, 2%, 5%, 8%, 11%, 13%, 17%, 21%, 24%, 27%, 30%, 및　33%)을 함유하는, 4시간 동안 가열된, 곤약 글루코만난, 잔탄 검, 및 알긴산염을 포함하는 삼성분 혼합물의 수성 용액 (0.5% 농도)의 유동 곡선을 도시한다;
도 15a는 실시예 6에 설명된 바와 같이, 일정한 KM:XG 비율 (4.12:1)의 곤약 글루코만난, 잔탄 검, 알긴산 나트륨 및 알긴산염의 가변량 (0 내지 33%)의 혼합물의 비가열된 또는 가열된 (1시간) 0.5% 수성 용액에서 알긴산 나트륨의 비율에 대한 K의 의존성을 도시한다;
도 15b는 실시예 6에 설명된 바와 같이, 일정한 KM:XG 비율 (4.12:1)의 곤약 글루코만난, 잔탄 검, 알긴산 나트륨 및 알긴산염의 가변량 (0 내지 33%)의 혼합물의 비가열된 또는 가열된 (1시간) 0.5% 수성 용액에서 알긴산 나트륨의 비율에 대한 n의 의존성을 도시한다;
도 16a는 2 mg/ml의 로딩 농도로 및 I=0.0에서, 45,000 rpm의 로터 속도로, 온도=20.0℃에서, 글루코만난에 대한 뚜렷한 침전 농도 분포 g*(s) 대 s를 도시한다; 실시예 6에 나타난 바와 같이, 세로 좌표는 스베드베리 (S) 당 프린지 (fringe) 단위로 표현되고 가로 좌표는 스베드베리 단위이다;
도 16b는 2 mg/ml의 로딩 농도로 및 I=0.0에서, 45,000 rpm의 로터 속도로, 온도=20.0℃에서, 알긴산 나트륨에 대한 뚜렷한 침전 농도 분포 g*(s) 대 s를 도시한다; 실시예 6에 나타난 바와 같이, 세로 좌표는 스베드베리 (S) 당 프린지 (fringe) 단위로 표현되고 가로 좌표는 스베드베리 단위이다;
도 16c는 2 mg/ml의 로딩 농도로 및 I=0.0에서, 45,000 rpm의 로터 속도로, 온도=20.0℃에서, 잔탄에 대한 뚜렷한 침전 농도 분포 g*(s) 대 s를 도시한다; 실시예 6에 나타난 바와 같이, 세로 좌표는 스베드베리 (S) 당 프린지 (fringe) 단위로 표현되고 가로 좌표는 스베드베리 단위이다;
도 17a는 실시예 6에 설명된 바와 같이, 이온 강도 0-0.02 M에서 비가공된/비과립화 VFB ("TM1"으로 나타남)에 대한 뚜렷한 침전 농도 분포를 도시한다;
도 17b는 실시예 6에 설명된 바와 같이, 이온 강도 0-0.01 M에서 비가공된/비과립화 VFB ("TM1"으로 나타남)에 대한 뚜렷한 침전 농도 분포를 도시한다;
도 17c는 실시예 6에 설명된 바와 같이, 이온 강도 0-0.01 M에서 가공된/과립화 VFB (PGX?)에 대한 뚜렷한 침전 농도 분포를 도시한다;
도 17d는 실시예 6에 설명된 바와 같이, 이온 강도 0-0.02 M에서 가공된/과립화 VFB (PGX?)에 대한 뚜렷한 침전 농도 분포를 도시한다;
도 18a는 실시예 6에 설명된 바와 같이, 비가공된/비과립화 VFB (TM1)에 대해 3.5S 초과의 침강 계수 (sedimentation coefficient)를 가진 물질의 양에 대한 이온 강도 (분자 농도 단위 M로 표현됨)의 효과를 도시한다;
도 18b는 실시예 6에 설명된 바와 같이, 가공된/과립화 VFB (PGX?)에 대해 3.5S 초과의 침강 계수 (sedimentation coefficient)를 가진 물질의 양에 대한 이온 강도 (분자 농도 단위 M로 표현됨)의 효과를 도시한다;
도 19a는 실시예 6에서 설명된 바와 같이, 고정된 글루코만난:잔탄 비율 (KM:XG=4.12:1) 및 변화하는 알긴산염 농도 (0% 내지 33%)를 함유하는 비가열된 혼합물에 대한 침강 계수 분포를 도시한다; 및
도 19b는 실시예 6에서 설명된 바와 같이, 고정된 글루코만난:잔탄 비율 (KM:XG=4.12:1) 및 변화하는 알긴산염 농도 (0% 내지 33%)를 함유하는 가열된 (1 또는 4시간) 혼합물에 대한 침강 계수 분포를 도시한다.
본 발명은 발병을 지연시키고, 진행을 늦추고, 및/또는 대사 증후군, 타입 I 당뇨병, 타입 II 당뇨병, 췌장 질환, 및/또는 과지질혈증과 같은, 대사 질환 또는 장애의 증상 중 적어도 하나를 개선하는데 효과적인 식단 보충제, 의료식품, 및 방법을 제공한다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "대사 증후군"은 다음 증상 중 하나 이상을 나타낸다: 고혈압 및 과지질혈증에 덧붙여 내장 비만, 혈당, 및 인슐린 레벨의 증가 (E.J. Gallagher et　al., Endocrinol . Metab . Clin . North Am .　37:559-79 (2008)). 대사 증후군은 함께 발생하고 관상 동맥 질환, 뇌졸중, 및 타입 II 당뇨병에 걸릴 증가된 위험과 연관된 증상의 그룹의 이름이다. 대사 증후군의 증상은 허리 주변에 추가적인 무게 (중앙 또는 복부 비만), 높은 혈압, 높은 트리글리세리드, 인슐린 저항, 낮은 HDL 콜레스테롤, 및 높은 당에 의해 일어난 조직 손상을 포함한다. 인슐린 저항은 대사 증후군의 주요 원인이라고 생각된다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "대사 질환 또는 장애의 증상 중 적어도 하나를 개선하다"는 질환 또는 장애의 증상을 감소시키거나 완화하거나, 또는 가리기 위한 증상의 치료뿐만 아니라, 치료된 상태 또는 증상의 심각성의 진행을 예방하거나, 낮추거나, 멈추거나, 또는 전환하기 위한 치료를 포함한다. 이와 같이, 용어 "치료"는 입증된 상태 또는 증상의 의학적 치료적 처치 및/또는 적절하게, 예방적 투여 둘 다를 포함한다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "치료하는"은 또한 이들을 필요로 하는 대상체의 상태에 의존적으로, 대사 질환 또는 장애를 예방하는 단계, 또는 대사 질환 또는 장애를 예방하는 단계, 또는 대사 질환 또는 장애 또는 이들과 연관된 어느 증상의 발병을 포함하는, 대사 질환 또는 장애의 병리학과 연관된 하나 이상의 증상을 예방하는 단계, 뿐만 아니라 대사 질환 또는 장애의 심각성을 완화하는 단계 또는 대사 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상의 재발을 예방하는 단계를 포함한다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "의료 식품"은 내과의사의 감독하에 장으로 섭취되거나 투여되기 위해 제제되거나, 인식된 과학적 원칙에 기초하여, 독특한 영양적 필요가 의학적 평가에 의해 입증되는, 질환 또는 상태의 특이적 식단 관리하려고 하는 음식을 나타낸다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "글루코만난"은 약 3:1 비율로 β(1,4)-결합된-D-만노스 및 β(1,4)-결합된-D-글루코스 잔기 및 다양한 α-결합된 갈락토스 말단기를 가진 수용성 식이 섬유를 나타낸다. 가장 흔히 곤약 뿌리 (Amorphophallus konjac)로부터 분리되지만, 또한 다른 식물 공급원으로부터 분리될 수 있다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "잔탄 검"은 글루코스, 만노스, 글루쿠로난염 칼륨 또는 나트륨, 아세트산염, 및 피루브산염을 함유하는 헤테로 다당류를 나타낸다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "알긴산염"은 만누론산 및 글루론산의 혼합된 폴리머를 나타낸다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "섬유질 블렌드"은 섬유질의 혼합물을 나타낸다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "점성 섬유질 블렌드" ("VFB")은 글루코만난, 잔탄 검, 및 알긴산염의 혼합물을 나타낸다.
여기에 사용된 바와 같이, 용어 "점성 섬유질 복합체" ("VFC")는 각각의 순수한 상태를 나타내는 성질의 표현으로부터 개개의 성분를 예방하는 가공되지 않은 성분 사이의 2차 및 3차 상호작용의 형성에 의한 3개의 분리된 성분의 혼합물 대신 새로운 성분를 형성하도록 상호작용을 허용하는 방식으로 성분가 가공되는, 3개의 성분 글루코만난, 잔탄 검, 및 알긴산염의 연동 매트릭스를 나타낸다.
의료 식품
한 양태에서, 본 발명은 만성 췌장염, 및/또는 고지혈증로부터 고통받는 환자를 포함하여, 대사 증후군, 타입 I 또는 타입 II 당뇨병, 췌장액 분비 결핍과 같은, 대사 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상의 예방, 치료, 또는 개선을 위해 결합된 의료 식품을 제공한다. 본 발명의 본 양태의 의료 식품은 약 48 중량% 내지 약 90 중량% 글루코만난, 약 5 중량% 내지 약 20 중량% 잔탄 검, 및 약 5 중량% 내지 약 30 중량% 알긴산염을 포함하는, 점성 섬유질 블렌드 (VFB) 또는 이들의 복합체 (VFC), 및 단백질, 탄수화물, 및 지방으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 다량 영양소를 포함하는, 고점성 다당류 식이 섬유 조성물을 포함한다.
2006년 4월 7일 출원된 미결정 미국 특허 출원 번호　11/400,768, 2007년 7월 출원된 미결정 미국 특허 출원 번호 11/830,615에 설명된 바와 같이, 이것들 각각은 본원에 참고로 포함되고, 약 48 중량% 내지 약 90 중량% 글루코만난, 약 5 중량% 내지 약 20 중량% 잔탄 검, 및 약 5 중량% 내지 약 30 중량% 알긴산염으로부터 결합에 의해 생산된, 섬유질 블렌드 (VFB), 또는 이들의 복합체 (VFC)를 포함하는 고점성 다당류 식이 섬유 조성물이 개발되었고, 매우 높은 보수성 (water hold capacity) 및 겔 형성 성질을 소유하는, 상업적으로 "PolyGlycopleX?" 또는 "PGX?"로 나타내었다.
이 섬유 조성물의 구성하는 다당류 성분는 서로 상호보완적이고 현재 알려진 어느 다른 다당류보다도 3 내지 5배 더 높은 레벨의 점성으로 이끄는 강한 상호작용을 형성하도록 상승작용한다. 여기에 실시에 5 및 6에 설명된 바와 같이, 가공될 때 (예를 들어, 과립화), 3개의 성분 글루코만난, 잔탄 검, 및 알긴산염은 각각의 순수한 상태를 나타내는 성질의 표현으로부터 개개의 성분를 예방하는 가공되지 않은 성분 사이의 2차 및 3차 상호작용 (연결 지역 및 네트워크)의 형성에 의한 3개의 분리된 성분의 혼합물 대신 새로운 성분 (복합체 ("VFC"))를 형성하도록 상호작용한다.
다른 가용성 섬유질이 필요로 하는 것보다 낮은 중량 측정량에서 이 고점성 식이 섬유 조성물은 위장 내용물의 점성의 큰 증가를 전해준다. 이 고농축된 성질은 이 섬유 조성물이 다른 가용성 섬유보다 크게 낮은 투여량으로 상당한 생리학적인 효과를 전해주는 것을 허용하고, 따라서 이 물질의 유의한 양을 식품에 포함하는 것을 더 쉽게 만든다.
한 구체예에서, 점성 섬유질 블렌드 (VFB)의 생산에 사용된 다당류는 3개의 성분 (즉, 복합체 (VFC))의 연동 매트릭스를 생산하기 위해 과립화를 통해 가공된다. 여기에 사용된 바와 같이, "과립화"는 작은 입자가 더 큰, 영구적인 응집체로 함께 모이는 크기 확대의 어느 과정을 나타낸다. 과립화는 혼합 장비로 교반에 의해, 압축, 압출, 구체화에 의해 성취될 수도 있다. 식이 섬유 조성물은 다양한 메쉬 사이즈 (mesh size)를 사용하여 과립화될 수도 있다. 용어 "메쉬"는 정의된 크기의 구멍을 갖는 체를 통과하는 능력에 의해 결정되는 바와 같이 입자의 크기를 나타낸다. 여기에 사용된 메쉬 크기는, Chemical Engineers Handbook (5th　ed., Perry & Chilton, eds.)의 표 21-12에 설명된 바와 같은, Tyler 등가물이다. 식이 섬유 조성물/복합체의 과립화가 커질수록 (즉, 메쉬 사이즈가 작아질 수록), 원하는 점성을 얻는 동안 더 오래 걸린다. 일부 구체예에서, 식이 섬유 조성물/복합체는 그들의 입자 크기에 의해 과립화된 물질을 분리함으로써 결합된 메쉬 크기를 사용하여 과립화되고, 그때 원하는 점성 프로파일을 제공하도록 입자-크기로 분리된 과립을 재조합할 수 있다. 예를 들어, 30 내지 60의 결합된 메쉬 크기는 30 메쉬의 과립 (약 600 미크론), 약 40 메쉬의 과립 (약 400 미크론), 및 약 60 메쉬의 과립 (약 250 미크로)의 결합에 의해 얻어진다.
의료 식품에 함유된 점성 식이 섬유질 블렌드/복합체 (VFB/C)에서 글루코만난, 잔탄 검, 및 알긴산염의 비율은 약 48% 내지 약 90% (약 60% 내지 약 80%, 또는 약 60% 내지 약 90%, 또는 약 65% 내지 약 75%, 또는 약 50% 내지 약 80%, 또는 약 50% 내지 약 70%, 또는 약 70%와 같은)의 글루코만난, 약 5% 내지 약 20% (약 10% 내지 약 20% 또는 약 11% 내지 약 13%, 또는 약 13% 내지 약 17%, 약 13%, 또는 약 17%와 같은)의 잔탄 검, 및 약 5% 내지 약 30% (약 10% 내지 약 20% 또는 약 13% 내지 약 17%, 또는 약 13%, 또는 약 17%와 같은)의 알긴산염일 수도 있다. 일부 구체예에서, 의료 식품에 함유된 식단 조성물에서 글루코만난, 잔탄검, 및 알긴산염의 비율은 약 70% 글루코만난, 약 13% 내지 약 17% 잔탄, 및 약 13% 내지 약 17% 알긴산염이다.
일부 구체예에서, 의료 식품은 1.0 g 내지 100 g의 점성 섬유질 블렌드, 또는 이들의 복합체 (VFB/C)의 사람 대상체에 총 일일 소비량을 제공하도록 제제되고, 하루에 약 5 g 내지 약 50 g의 VFB/C, 하루에 약 10 g 내지 약 35 g의 VFB/C, 하루에 약 12 g 내지 약 35 g의 VFB/C, 또는 하루에 약 15 g 내지 약 35 g의 VFB/C, 하루에 약 20 g 내지 약 35 g의 VFB/C, 하루에 약 12 g 내지 약 25 g의 VFB/C, 하루에 약 15 g 내지 약 25 g의 VFB/C와 같은, 약 48% 내지 약 90%의 글루코만난, 약 5% 내지 약 20%의 잔탄 검, 및 약 5% 내지 약 30%의 알긴산염 (VFB/C)을 포함한다.
일부 구체예에서, 의료 식품은 약 50 mg/kg/일 내지 약 600 mg/kg/일과 같은, 약 100 mg/kg/일 내지 약 500 mg/kg/일과 같은, 약 200 mg/kg/일 내지 약 400 mg/kg/일과 같이, 약 25 mg/kg/일 내지 약 1000 mg/kg/일의 사람 대상체에 VFB/C의 일일 투여량을 제공하도록 제제된다.
본 발명의 의료 식품 생성물은 단백질 또는 아미노산, 탄수화물, 지질, 비타민, 미네랄, 및 보조인자, 자연적 또는 인공적 향, 염료 또는 다른 착색 첨가제, 및 방부제와 같은 추가적인 성분을 더 함유할 수도 있다. 용어 "비타민"은 티아민, 리보플라빈, 니코틴산, 판토텐산, 피리독신, 비오틴, 엽산, 비타민 B12, 리포산, 아스코르브산, 비타민 A, 비타민 D, 비타민 E, 및 비타민 K를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 또한 용어 "비타민" 내에 포함되는 것은 티아민 피로인산염 (TPP), 플라빈 모노뉴클레오티드 (FMM), 플라빈 아데닌 디뉴클레오티드 (FAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 (NAD), 니코틴아미드 아데닌 디뉴클레오티드 인산염 (NADP), 보조 효소 A (CoA), 인산 피리독살, 비오시틴, 테트라히드로폴산, 보조 효소 B12, 리포일리신, 11-씨스-레티날, 및 1,25-디히드록시콜레칼시페롤을 포함하는 보조 효소와 같은 보조 인자 및 보조 효소이다. 용어 "비타민"은 또한 콜린, 카르니틴, 및 알파, 베타, 및 감마 카로틴을 포함한다. 용어 "미네랄"은 무기물, 및 칼슘, 철, 아연, 셀레늄, 구리, 요오드, 마그네슘, 인, 크롬, 망간, 칼륨, 등, 및 이들의 혼합물을 포함하지만, 이에 제한되지 않는, 금속 등을 나타내고, 사람 식단에서 필요로 한다. 미네랄은 염, 산화물, 또는 킬레이트 염의 형태일 수도 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 의료 식품은 하나 이상의 지질을 더 포함한다. 본 발명의 본 구체예에서 사용된 바와 같이, 지질은 지방, 오일, 또는 왁스와 같은 알콜에 녹지만 물에 녹지 않는 물질로서 정의된다. 여기에 사용된 바와 같이, 용어 "지방" 및 "오일"은 교체해서 사용될 수 있고 지방산을 포함한다. 일부 구체예에서, 본 조성물에 사용하는 지질은 유제품의 지방 (예를 들어, 우유 지방, 버터 지방), 동물성 지방 (예를 들어, 라드) 또는 식물성 지방 (예를 들어, 코코넛 오일, 코코아 버터, 야자유, 또는 마가린)으로 구성된 그룹으로부터 선택된 지방을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 의료 식품에 사용하는 지질은 식용유 또는 오일의 혼합물을 포함한다. 이러한 오일은 식물성 오일 (예를 들어, 카놀라유, 대두유, 팜핵유, 올리브유, 홍화유, 해바라기씨 오일, 아마인 (아마인) 오일, 옥수수 오일, 면실유, 땅콩 오일, 월넛 오일, 아몬드 오일, 포도씨 오일, 월견초유 (evening primrose oil), 코코넛 오일, 보라지 오일, 블랙커런트씨 오일); 수산유 (예를 들어, 물고기 오일 및 물고기 간 오일), 또는 이들의 혼합물을 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 의료 식품에 사용하는 지질은 코코넛 오일, 팜핵유, 및 버터와 같은, 중쇄 트리글리세리드를 함유하는 오일 또는 정제된 형태의 중쇄 트리글리세리드를 포함한다.
일부 구체예에서, 본 발명의 의료 식품은 환자에 대한 칼로리 및 영양소의 유일한 공급원을 제공한다. 일부 구체예에서, 본 발명의 의료 식품은 사람 대상체의 식단에서 섬유질의 1차 공급원을 제공하도록 조작된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 의료 식품은 사람 대상체의 식단에서 섬유질의 유일한 공급원을 제공하도록 조작되고 표지되고 및/또는 이에 따라 내과의사에 의해 투여된다.
완벽한, 균형잡힌 식단의 일부로서 섭취하는 의료 식품은 전형적으로 하루에 하나 이상의 식사를 대체하기 위해 제제되고, 그로 인해 고전적인 음식으로부터 섭취하는 섬유질의 양이 감소된다. 의료 식품은 내과의사의 감독하에 투여되기 때문에, 환자는 섬유질을 함유하는 추가적인 식이 섬유 보충제를 섭취하지 않을 것이다.
본 발명의 의료 식품은 관리 및 내과의사의 감독하에 환자의 선택 집단에 의해 사용된다. 여기에 더 설명된 바와 같이, 본 발명의 의료 식품은 대사 증후군, (또한 증후군 X 및 인슐린 저항 증후군으로 알려짐), 타입 I 당뇨병, 타입 II 당뇨병, 비만, 비-알콜성 지방간 (지방간 질환), 췌장 질환, 및 고지혈증과 같은, 대사 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 또는 개선하기 위해 대사 질환으로 고통받거나, 걸릴 위험이 있는 사람과 같은, 포유 동물 대상체에 투여될 수도 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 의료 식품은 적어도 하루에 1번 필요로 하는 대상체에 투여된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 의료 식품은 하루에 2번, 바람직하게는 아침에 1번 및 오후/저녁에 1번 투여된다. 의료 식품의 전형적인 치료 식단은 적어도 2주 내지 8주 이상 계속된다. 치료되는 의학적 상태 및 환자의 반응과 같은 인자에 의존적으로, 치료 식단은 환자가 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상의 개선을 경험할 때까지 연장될 수도 있다. 본 발명의 의료 식품은 전형적으로 식사 대용 또는 식사 사이에 간식으로서 하루에 2인분이 소비될 것이다. 일부 구체예에서, 본 발명의 의료 식품은 의학적으로 감독되는 아주 낮은 칼로리의 식단의 일부로서 하루에 3번 내지 4번 음식의 유일한 공급원으로 대상체에 투여된다. 아주 낮은 칼로리의 식단의 전형적인 사용은 빠른 체중 감소 및 심대사 위험 인자의 감소를 일으키기 위한 비만의 치료에 있다.
의료 식품을 만드는 방법
또 다른 양태에서, 본 발명은 글루코만난, 잔탄 검, 및 알긴산염을 포함하는 점성 섬유질 블렌드 (VFB), 또는 이들의 복합체 (VFC)를 포함하는, 의료 식품 생성물에 식이 섬유 조성물의 유효량을 추가하는 단계를 포함하는 의료 식품 생성물을 제조하는 방법을 제공한다. 일부 구체예에서, 의료 식품 생성물을 제조하는 방법은 의료 식품 생성물에 글루코만난, 잔탄 검, 및 알긴산염을 포함하는, 점성 섬유질 블렌드 (VFB)으로부터 형성된 섬유질 복합체 (VFC)를 포함하는 식이 섬유 조성물의 유효량을 추가하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 의료 식품 생성물은 대사 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상의 예방, 치료, 또는 개선을 위해 합성된다. 일부 구체예에서, 의료 식품 생성물에 추가된 식이 섬유 조성물은 약 48 중량% 내지 약 90 중량% (약 60 중량% 내지 약 80 중량%, 또는 약 60 중량% 내지 약 90 중량%, 또는 약 65 중량% 내지 약 75 중량%, 또는 약 50 중량% 내지 약 80 중량%, 또는 약 50 중량% 내지 약 70 중량%, 또는 약 70%와 같은)의 글루코만난, 약 5 중량% 내지 약 20 중량% (약 10 중량% 내지 약 20 중량%, 또는 약 11 중량% 내지 약 13 중량%, 또는 약 13 중량% 내지 약 17 중량%, 또는 약 13 중량%, 또는 약 17 중량%)의 잔탄 검, 및 약 5 중량% 내지 약 30 중량% (약 10 중량% 내지 약 20 중량%, 또는 약 13 중량% 내지 약 17 중량%, 또는 약 13 중량%, 또는 약 17 중량%)의 알긴산염을 포함하는, 섬유질 블렌드 (VFB), 또는 섬유질 블렌드으로부터 형성된 섬유질 복합체 (VFC) (예를 들어, 과립화된 VFB)를 포함한다. 일부 구체예에서, 의료 식품에 추가되는 식이 섬유 조성물에 함유된, 섬유질 블렌드으로부터 형성된 섬유질 블렌드, 또는 섬유질 복합체에서 글루코만난, 잔탄 검, 및 알긴산염의 비율은 약 70% 글루코만난, 약 13% 내지 약 17% 잔탄, 및 약 13% 내지 약 17% 알긴산염이다.
일부 구체예에서, 대사 질환 또는 장애의 치료 또는 예방를 위해 제제된 의료 식품 생성물에 추가되는, 점성 섬유질 블렌드 (VFB), 또는 이들의 복합체 (VFC)를 포함하는 식이 섬유 조성물의 양은 의료 식품 생성물 무게의 5% 내지 20%이다. 일부 구체예에서, 하루에 2인분의 섭취에 기초하여, 의료 식품 생성물에 추가되는 식이 섬유 조성물 또는 이들의 복합체 (VFB/C)는 하루에 약 5 g 내지 50 g, 하루에 약 10g 내지 35 g, 하루에 약 12 g 내지 35 g과 같은, 하루에 약 15 g 내지 35 g, 하루에 약 20 g 내지 35 g과 같은, 하루에 약 12 g 내지 25 g, 하루에 약 15 g 내지 25 g과 같은, 하루에 약 1g 내지 100 g을 포함한다. 본 발명의 의료 식품 생성물은 전형적으로 하루에 1번, 바람직하게는 하루에 2번 또는 3번 섭취된다. 본 발명의 의료 식품은 구강투여에 대한 것이다.
섬유질 블렌드, 또는 이들의 복합체를 포함하는 식이 섬유 조성물은 고체, 액체, 또는 반-고체 의료 식품 생성물을 포함하는, 어느 타입의 의료 식품과도 결합될 수 있다. 모범적인 고체 의료 식품 생성물은 곡물 (예를 들어, 쌀, 시리얼 (뜨겁거나 차거나)), 그래놀라, 오트밀, 구운 제품 (빵, 쿠키, 머핀, 케이크, 등), 파스타 (쌀 또는 다른 곡물로 만든 면을 포함), 고기 (예를 들어, 가금류, 소고기, 양고기, 돼지고기, 해생성물), 및 유제품 (예를 들어, 우유, 요거트, 치즈, 아이스크림, 및 버터)을 포함하지만, 이에 제한되지 않는다. 모범적인 액체 또는 반-액체 의료 식품 생성물은 식사 대용 음료,과일 쥬스, 수프 (건조 수프 믹스를 포함), 식이 보조제, 및 스무디를 포함하지만, 이에 제한되지 않는다.
섬유질 블렌드 또는 이들의 복합체를 포함하는 식이 섬유 조성물은 어느 적합한 방법을 사용하여 섭취 전 의료 식품 생성물에 추가될 수도 있다. 예를 들어, 식이 섬유 조성물은 의료 식품 생성물로 구워질 수도 있고, 의료 식품과 혼합될 수도 있고, 또는 의료 식품 생성물에 뿌려질 수도 있다.
본 발명의 의료 식품은, 내과의사의 감독하에, 생성물이 특이적 대사 질환 또는 장애의 관리에 사용되려고 한 것이 아니라는 명백하게 진술된 표지와 함께 단위 투여량으로 포장된다.
대사 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 또는 개선하는 방법
또 다른 양태에서, 본 발명은 대사 증후군, 타입 I 당뇨병, 타입 II 당뇨병, 비만, 비-알콜성 지방간 (지방간 질환), 췌장 질환, 및 과지질혈증과 같은, 대사 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 또는 개선하는 방법을 제공한다. 본 발명의 본 양태의 방법은 약 48 중량% 내지 약 90 중량% (약 60 중량% 내지 약 80 중량%, 또는 약 60 중량% 내지 약 90 중량%, 또는 약 65 중량% 내지 약 75 중량%, 또는 약 50 중량% 내지 약 80 중량%, 또는 약 50 중량% 내지 약 70 중량%, 또는 약 70%와 같은)의 글루코만난, 약 5 중량% 내지 약 20 중량% (약 10 중량% 내지 약 20 중량%, 또는 약 11 중량% 내지 약 13 중량%, 또는 약 13 중량% 내지 약 17 중량%, 또는 약 13 중량%, 또는 약 17 중량%)의 잔탄 검, 및 약 5 중량% 내지 약 30 중량% (약 10 중량% 내지 약 20 중량%, 또는 약 13 중량% 내지 약 17 중량%, 또는 약 13 중량%, 또는 약 17 중량%)의 알긴산염을 포함하는, 점성 섬유질 블렌드 (VFB) 또는 이들의 복합체 (VFC)를 포함하는, 고점성 다당류 식이 섬유 조성물의 유효량을 이것을 필요로 하는 사람 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 섬유질 블렌드 또는 이들의 복합체에서 글루코만난, 잔탄 검, 및 알긴산염의 비율은 약 70%의 글루코만난, 약 13% 내지 약 17%의 잔탄, 및 약 13% 내지 약 17%의 알긴산염이다.
일부 구체예에서, 방법은 약 48 중량% 내지 약 90 중량%의 글루코만난, 약 5 중량% 내지 약 20 중량%의 잔탄 검, 및 약 5 중량% 내지 약 30 중량%의 알긴산염을 포함하는, 점성 섬유질 블렌드 (VFB) 또는 이들의 복합체 (VFC, 예를 들어, 과립화된 VFB와 같은)를 포함하는 식이 섬유 조성물을 이것을 필요로 하는 사람 대상체에 하루에 약 5 g 내지 약 50 g VFB/C와 같은, 하루에 약 10 g 내지 약 35 g VFB/C와 같은, 하루에 약 12 g 내지 약 35 g VFB/C와 같은, 하루에 약 15 g 내지 약 35 g VFB/C와 같은, 하루에 약 20 g 내지 약 35 g VFB/C와 같은, 하루에 약 12 g 내지 약 25 g VFB/C와 같은, 하루에 약 15 g 내지 약 25 g VFB/C와 같은, 하루에 1.0　g 내지　100　g VFB/C의 투여량으로 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 방법은 대상체의 대사 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상을 예방, 치료 또는 개선하는데 유효한 기간 동안, 식이 섬유질 블렌드 (VFB) 또는 이들의 복합체 (VFC)를 이것을 필요로 하는 사람 대상체와 같은, 포유 동물 대상체에 약 50 mg/kg/일 내지 약 600 mg/kg/일과 같은, 약 100 mg/kg/일 내지 약 500 mg/kg/일과 같은, 약 200 mg/kg/일 내지 약 400 mg/kg/일과 같은, 약 25 mg/kg/일 내지 약 1000 mg/kg/일의 투여량으로 투여하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 섬유질 블렌드 (VFB) 또는 이들의 복합체 (VFC)를 포함하는 식이 섬유 조성물은 여기에 설명된 바와 같이, 의료 식품 생성물의 형태로 대상체에 투여된다. 일부 구체예에서, 식이 섬유 조성물은 필요로 하는 대상체에 하루에 적어도 1번 투여된다. 일부 구체예에서, 본 발명의 식이 섬유 조성물은 하루에 2번, 바람직하게는 아침에 1번 및 오후/저녁에 1번 투여된다. 본 발명의 본 양태의 전형적인 치료 식단은 적어도 2주 내지 16주 이상 계속될 것이다. 치료되는 의학적 상태 및 환자의 반응과 같은 이러한 인자에 의존적으로, 치료 식단은 환자가 대사 질환 또는 장애의 적어도 하나의 증상의 개선을 경험할 때까지 연장될 수도 있다.
한 구체예에서, 본 발명은 타입 II 당뇨병으로 고통받거나, 걸릴 위험이 있는 사람 대상체에서 인슐린 저항의 진행과 연관된 적어도 하나의 증상을 개선하는 방법을 제공한다. 본 발명의 본 양태의 방법은 혈당치의 감소와 같은, 인슐린 저항의 과정의 적어도 하나의 증상을 개선하는데 유효한 기간 동안 약 48 중량% 내지 약 90 중량%의 글루코만난, 약 5 중량% 내지 약 20 중량%의 잔탄 검, 및 약 5 중량% 내지 약 30 중량%의 알긴산염을 포함하는, 섬유질 블렌드 또는 이들의 복합체를 포함하는 고점성 다당류 식이 섬유 조성물 (VFB/C)의 약 25 mg/kg/일 내지 약 1000 mg/kg/일 (예를 들어, 100 mg/kg/일 내지 500 mg/kg/일, 또는 350 mg/kg/일 내지 약 450 mg/kg/일)을 이것을 필요로 하는 사람 대상체에 투여하는 단계를 포함한다. 일부 구체예에서, 방법은 적어도 2주 내지 최대 16주 이상의 기간 동안 식이 섬유 조성물을 투여하는 단계를 포함한다.
미국 심장 협회 (American Heart Association) 및 심장, 폐, 혈액 국립 연구소 (National Heart, Lung, and Blood Institute)에 따르면, 대사 증후군은 대상체가 다음 중 3개 이상을 가지고 있으면 존재하는 것으로 진단된다: 130/85　mmHg 이상의 혈압; 100　mg/dL 이상의 혈당 (글루코스); 큰 허리 둘레 (남자: 40인치 이상; 여자: 35인치 이상); 낮은 HDL 콜레스테롤 (남자: 40　mg/dL 미만; 여자: 50　mg/dL 미만); 또는 150　mg/dL 이상의 트리글리세리드. 그러므로, 일부 구체예에서, 타입 II 당뇨병으로 고통받거나, 걸릴 위험이 있는 사람 대상체에서 인슐린 저항의 진행과 연관된 적어도 하나의 증상을 개선하는 방법은 (1) 100　mg/dL 이하의 레벨로 대상체의 혈당 (글루코스)을 감소시키고; (2) 남자 대상체에 대해 40인치 이하로, 또는 여자 대상체에 대해 35인치 이하로 허리 둘레를 줄이고; (3) 150 mg/dL 이하의 레벨로 트리글리세리드 레벨을 낮추는데 유효한 기간 동안 VFB/C의 유효량을 대상체에 투여하는 단계를 포함한다.
실시예 1-4에 설명된 바와 같이, 대조군에 비해, 글루코스-유발 기관 손상의 진행을 느리게 하고, 간에 지질의 누적을 감소시키는 능력, 췌장 베타 세포의 보존, 및 향상된 인슐린 민감도를 포함하는, VFC (예를 들어, 과립화된 VFB)의 효능은 포유 동물 대상체에서 대사 증후군의 초기 단계의 발달 및 진행의 개선에 대해 입증된다.
적어도 하나의 다당류를 포함하는 샘플을 분석하는 방법
또 다른 양태에서, 본 발명은 섬유질 블렌드, 또는 이들의 복합체를 포함하는 식이 섬유 조성물과 같은, 적어도 하나의 다당류를 포함하는 샘플의 구성당을 결정하는 방법을 제공한다. 본 발명의 본 양태의 방법은 (a) 가수분해물을 생산하기 위해 산으로 적어도 하나의 다당류를 포함하는 샘플을 가수분해하는 단계; (b) 크로마토그래피 방법으로 가수분해물에서 가수분해 생성물을 분리하는 단계; (c) 단계 (b)에서 분리된 가수분해 생성물을 검출하는 단계; 및 (d) 샘플의 구성당을 결정하기 위해 단계 (c)에서 검출된 가수분해 생성물과 하나 이상의 표준 대조군을 비교하는 단계를 포함한다.
일부 구체예에서, 샘플은 적어도 하나의 식이 섬유를 포함한다. 일부 구체예에서, 샘플은 알긴산 나트륨을 포함한다. 일부 구체예에서, 샘플은 알긴산염, 글루코만난 및 잔탄 검을 포함하는 섬유질 블렌드 또는 이들의 복합체를 포함한다.
가수분해
본 발명의 본 양태의 방법에 따라, 적어도 하나의 다당류를 포함하는 샘플은 가수분해물을 생산하기 위해 산으로 가수분해된다. 일부 구체예에서, 샘플을 가수분해하기 위해 사용된 산은 트리플루오로아세트산 (TFA)이다.
일부 구체예에서, 샘플은 만누론산 및 글루론산의 혼합된 폴리머인, 알긴산염을 포함한다. 이러한 구체예에서, 알긴산염을 포함하는 샘플의 가수분해 단계는 L-글루론산뿐만 아니라 D-만누론산의 방출 및 보존을 제공하는데 적합한 조건하에 수행된다. 예를 들어, 한 구체예에서, 알긴산의 초기 가수분해는 Fischer 및 Dorfel에 의해 설명된 바와 같이, 3℃에서 14시간 동안 95% 황산으로, 또는 상온에서 14시간 동안 80% 황산으로 영향을 받을 수 있다. 이러한 구체예에 따라, 알긴산에 교반하기 전, 무기산은 -10℃ 내지 -5℃ 사이로 냉각된다. 점성 덩어리는 럼프 (lump)의 형성을 피하기 위해 완전히 교반된다. 혼합물은 황산 용액이 약 0.5 N일 때까지 파쇄된 얼음 및 물로 희석된다. 용액은 끓는 중탕 냄비에서 6시간 동안 가열되고, 탄산칼슘으로 중성화된다. 황산칼슘 침전물의 여과 및 세척 후, 밝은 노랑 여과 세척수는 농축되고, 양이온-교환 컬럼을 통과하고 얇은 시럽에 대한 감소된 압력 하에 농축된다. 건조기에서 더 느린 농축 및 녹는점 191℃의 D-만노푸라누로노-락톤의 접종 후, 락톤의 일부는 시럽으로부터 결정화되지만, 가수분해된 알긴산이 L-글루론산보다 더 많은 D-만누론산을 함유해야지만 가능하다. 결정질 D-만누로노락톤의 제거 후, 남은 D-만누로노락톤 및 L-글루론산은 여기에 설명된 바와 같이 크로마토그래피 방법에 의해 분리된다.
또 다른 구체예에서, 알긴산염을 포함하는 샘플의 가수분해 단계는 트리플루오로아세트산 (TFA)의 사용을 포함한다. TFA는 가수분해물의 동결건조에 의해 간단히 제거를 허용하는 충분히 휘발성인 무기산에 대한 이점을 갖는다. 예를 들어, 약 8시간 내지 약 18시간의 기간 동안 질소하에 100 ℃에서 2 M TFA의 가수분해는 같은 조건하에 1 M H2SO4의 가수분해에 대한 적합한 대안인 것을 나타낸다 (Hough et al.).
6-8시간의 가수분해 시간은 전형적으로 중성당으로 구성된 다당류의 분해에 충분하지만, 상당한 비율의 우론산 잔기의 존재는, 일반적으로, 글리코시드우론산 결합이 다른 글리코시드 결합보다 산 가수분해에 대해 더 많이 저항하는 어려움을 소개한다. 약 16 내지 30 %몰의 정도로 우론산을 함유한, 박테리아의 협막 다당류 (capsular polysaccharide)와 같은 다당류에 대해, 일부 경우에서 질소하에 100℃에서 18시간 동안 2 M TFA의 가수분해는 만족스러운 것으로 나타났다 (Hough et al.). 하지만, 특히 산 (D-리보스, D-자일로스, 또는 L-람노스와 같은)에 의한 분해에 대해 민감한 당 잔기가 존재하는 경우, 가수분해의 시간은 바람직하게는 8시간으로 제한되고 나중에 단단히 교차-결합된 겔의 겔 크로마토그래피에 의해 발견된 가수분해물에서 알도비우론산의 일부인, 우론산과 결합된 남은 당에 대한 분석 결과는 수정된다.
일부 구체예에서, 알긴산염을 포함하는 샘플의 가수분해 단계는 약 95℃ 내지 약 110℃ 범위의 온도에서 약 48 내지 약 72시간의 기간 동안 TFA와 함께 샘플을 배양함으로써 수행된다. 실시예 6에 설명된 바와 같이, TFA로 72시간 동안 가수분해는 VFB/C 함유 샘플과 같은, 알긴산염을 포함하는 샘플로부터의 당의 가수분해성 방출에 효과적이었다는 것이 본 발명자에 의해 결정되었다.
가수분해물의 크로마토그래피 분리
본 발명의 본 양태의 방법에 따라, 가수분해물의 가수분해 생성물은 예를 들어, 박층 크로마토그래피, 가스 크로마토그래피 (GLC), 또는 액체 크로마토그래피 (LC)와 같은, C18 역상 물질의 사용을 포함하는 크로마토그래피 방법으로 분리된다. 일부 구체예에서, Dionex 크로마토그래피와 같은, 크로마토그래피 방법은 우론산으로부터 중성당을 분리할 수 있다.
크로마토그래피 방법에 의해 분리된 가수분해 생성물은 검출되고 샘플에서 구성당을 결정하기 위해 하나 이상의 표준 대조군과 비교된다. 당의 검출에 적합한 대표적인 검출기는 Dionex의 Pulsed Amperometric Detector, 또는 증기화 광산란 검출기 (Evaporative Light Scattering Detector; ELSD) 또는 HPLC 시스템에 부탁된 질량 분석기를 포함한다. 알려진 성분를 가진 샘플과 같은, 표준 대조군은 대조군 샘플로서 테스트 샘플과 병행하여 실행될 수 있다. 대안으로, 참고 문헌 표준은 실시예 5에 설명된 바와 같이, 특정 크로마토그래피 방법에 의해 분석된 참고 샘플에서 하나 이상의 특정 구성당의 알려진 특징일 수도 있다.
일부 구체예에서, 본 발명의 본 양태의 방법은 알긴산염과 같은, 적어도 하나의 다당류를 포함하는 샘플을 TFA로 가수분해하는 단계; C18 컬럼이 있는 HPLC 시스템과 같은, 크로마토그래피 방법으로 가수분해물에서 가수분해 생성물을 분리하는 단계; ELSD 또는 질량 분석기와 같은, 검출기로 가수분해 생성물을 검출하는 단계; 및 샘플에서 구성당을 결정하기 위해 검출된 생성물과 하나 이상의 참고 문헌 표준을 비교하는 단계를 포함한다.
다음 실시예는 단지 현재 본 발명을 수행하기 위해 고려된 최상의 방식을 도시하지만, 본 발명을 제한하는 것으로 이해되서는 안된다.
실시예 1
이 실시예는 인슐린 저항성, 체중, 췌장 β-세포 생존력, Zucker 당뇨병 래트의 지질 프로파일에 대한, 과립화된 점성 섬유질 블렌드 (상업적으로 PolyGlycopleX (PGX?)로 알려진 점성 섬유질 복합체 (VFC)로 또한 나타남)을 포함하는 식이 섬유 조성물의 효과를 설명한다.
근거: 수컷 Zucker 당뇨병 래트 (ZDF) (ZDF/Cr1-Leprfa / fa)를 이 동물 모델이 타입 II 당뇨병 및/또는 더 어린 나이에 감소된 인슐린 민감도에 걸린 성인-발병 비만의 훌륭한 모델인 것으로 생각되기 때문에 본 연구에 사용할 동물 모델로 선택하였다 (C.　Daubioul et　al., J.　 Nutr .　132:967-973 (2002); J.M.　Lenhard et　al., Biochem. & Biophys . Res . Comm .　324:92-97 (2004); J.N.　Wilson, Atheriosclerosis 4:147-153 (1984)). ZDF들은 뇌 렙틴 수용체가 결핍된 것으로 발견된 돌연변이이다. 렙틴은 식욕 억제 시그날를 전달하는 지방 조직에 의해 분비되는 단백질이다. 그러므로, 이 돌연변이 래트에서, 식욕을 감소시키거나 포만감을 유발하는 피드백 시그날전달은 없다. ZDF 래트는 아주 빠른 속도로 음식을 섭취하고 아주 빠르게 비만이 될 것이다. 그러므로 이 모델은 과실을 통해 비만인 사람을 모방한다. ZDF 래트가 비만이 된 것처럼, 사람에서 보이는 바와 같이, 그들은 빠르게 인슈린에 대해 둔감해진다 (대사 증후군으로 나타남). ZDF 래트는 또한 과지질혈증이고 이 쥐 모델이 사람의 대사 증후군에 대한 좋은 모델이라는 것을 나타낸다. 시간이 지남에 따라, 사람에서 진행과 유사하게, ZDF 모델에서 당뇨가 진행되고, 췌장 β 세포 (인슐린 분비 세포)의 수의 감소로 얼굴이 불그스름해진다. 단백질은 과도한 글루코스에 의해 당화 (glycated)되고, ZDF 및 사람 둘 다에서 장기 기능, 특히 신장에서 문제를 일으킨다. 높은 글루코스 레벨은 단백질의 당화를 일으키고, 당뇨성 신증 및 관 손상을 일으킨다. 점성 섬유질 복합체 (VFC) 과립의 투여가 당뇨병의 발병을 지연시키고 및/또는 당뇨병의 심각성을 감소시킬 수 있는지 결정하기 위해 고지방 먹이를 먹지 않은 어린 나이의 ZDF (5주령)를 본 연구에 사용하였다. 단백질에 대한 글루코스 손상의 정도의 표준 마커는 당화된 헤모글로빈 (HbA1c)인데, 이것은 ZDF에서 증가되고, 현재 사람에서 약 인증을 위한 가장 중요한 마커 중 하나이다. 오줌에서 알부민의 측정값은 또한 신장에 대한 당뇨성 손상의 표준 마커이다. 당뇨병의 치료에 대한 FDA 가이드라인은 혈당의 조절 및 높은 글루코스에 의해 일어나는 조직 손상의 감소를 필요로 한다.
방법
섬유질 향상된 래트 먹이
점성 섬유질 복합체 (VFC) (곤약/잔탄/알긴산염 (70:13:17) 과립 (즉, 섬유질 블렌드는 상업적으로 PGX?로 알려진, 복합체를 형성하기 위한 과립화에 의해 가공된다)은 기본 래트 먹이에 포함된다 (D11725: Research Diets, New Brunswick, New Jersey). 표 1에서 하기 나타난 바와 같이, 본 연구에 사용된 대안의 식단은 다른 섬유질 형태를 포함한다. 각각의 섬유 공급원의 다른 에너지가 주어지는 모든 식단을 가능한 등에너지가 되도록 제제하였다 (VFC 및 이눌린 식단은 3.98　kcal/g을 제공하였고 셀룰로스는 3.90　kcal/g을 제공하였다).
셀룰로스를 불용성이고 비-발효성이고 비활성 참고 화합물로 생각되는 기본적인 참고 섬유질로서 선택하였다 (J.W.　Anderson et　al., J.　 Nutr .　124:78-83 (1994). 이눌린은 수용성이고 소화가 잘되지 않고 일부 연구에서 지질 감소 및 혈당 조절에 관해 일부 연구에서 효능을 나타낸 식물-유래한 프럭토스 폴리머이다; 하지만, 결과는 가변적이다 (P.　Rozan et　al., Br . J. Nutr .　99:1-8 (2008). 이눌린의 프럭토스 또는 글루코스 단위의 수 (폴리머화의 정도 "DP")는 99.9%　≥　5이고, 평균 DP 존재 ≥　23이다.
표 1: 각각 VFB, 셀룰로스, 또는 이눌린을 함유하는 3개의 식단의 조성물 (무게에 의한 성분의 퍼센트 기여도)
Figure pct00001
*각각, 상업적으로 PolyGlycopleX? (PGX?)로 알려진 VFC 섬유질 과립 (InnovoBiologic Inc., Calgary, Alberta, Canada), 셀룰로스 (Research Diets, New Brunswick, New Jersey), 및 이눌린 (Raftiline?HP, Orafti, Tienen, Belgium).
연구 디자인
5주령의 갈증난 (30) 수컷 ZDF/Crl-Leprfa / fa 래트를 Charles River (Kingston, New York)로부터 얻었다. 동물을 가장 최근의 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, DHEW (NIH)에서 추천된 크기에 맞는 매달린 철망 메쉬 케이지에서 단독으로 사육하였다. 모든 연구는 Eurofins Institutional Animal Use and Care Committee에 의해 입증되었다. 동물실은 온도 및 습도 조절되었고, 12시간 명/암 주기를 가졌고, 깨끗하고 해충이 없게 유지되었다. 동물을 도착 후 일주일 동안 길들였고, 동물은 자유식으로 음식과 물에 접근하였다.
길들인 후, 래트를 임의적으로 초기 혈당 및 체중에 기초하여 3 그룹 중 하나로 할당하였다. 표 1에 상기 나타난 바와 같이, 8주의 기간 동안 각 그룹의 래트 모두에게 5 중량%로 VFC (상업적으로 PGX?로 알려진), 셀룰로스, 또는 이눌린 (Raftiline?HP, 치커리-유래한 이눌린)을 함유하는 음식 중 한 가지 타입을 제공하였다. 8주 연구를 통해 매주 3번 음식 무게 측정, 매주 체중 측정, 및 글루코스 및 인슐린에 대한 혈액 샘플 수거를 포함하는, 기본적인 관찰 과정을 수행하였다.
공복 분석을 1주에 시작하였지만, 글루코스의 비-공복 분석을 3주에 시작하였다. 비-공복 동물에서, 인슐린은 마지막 시점에서만 측정하였다. 섬유질이 위장관에 물리적으로 존재하는 동안 안정화된 글루코스 레벨에 대한 VFC의 더 큰 효과가 관찰되었다는 관찰 때문에, Zucker 래트가 낮 및 밤 둘 다에 계속 먹는다는 사실 때문에, 비-공복 상태의 분석을 연구에 추가하였다. 비-공복 동물에서, 마지막 측정값만을 얻었지만, 공복의 동물에서, 본 연구를 통해 혈청 트리글리세리드를 측정하였다 (IDEXX, North　Grafton, Massachusetts).
모든 연구를 위해, 글루코스 및 인슐린을 위해 사용된 혈액 샘플을 낮의 대략 같은 시간 (오전 나절)에 채취하였다. 연구는 2번의 구강 당부하검사로 결론지어졌고, 일주일 단위로 분리하였고, 검시하였다.
측정값
8주 연구를 통해 다음 측정값을 얻었다:
음식 섭취: 실험 음식의 도입 전 및 후, 일주일에 3번 음식 무게를 측정하였다.
체중 을 일주일에 1번 측정하였다.
혈당 및 인슐린: 실험 음식의 도입 전 및 후 일주일 간격으로, 하룻밤 동안 공복 후 후안와 출혈을 통해 혈액을 수거하였다. 글루코스 및 인슐린을 위해 혈액 샘플을 낮의 대략 같은 시간 (오전 나절)에 일주일에 1번 채취하였다. 소량을 핸드헬드 글루코미터 (handheld glucometer)로 분석하였다. 인슐린 분석을 위해 샘플을 제거한 후, 1 mL을 응고시켰다; 0.5 mL 혈청을 제거하였고 트리글리세리드 함량에 대해 분석하였다. 동물들이 음식에 접근할 때 꼬리 닉을 통해 추가적인 샘플을 수거하였다. Bayer Ascensia Elite glucometer (Bayer Health Care, Tarrytown, New　York)를 사용하여 혈당을 측정하였다. ELISA (Ani Lytics, Gaithersburg, Maryland)를 사용하여 인슐린을 측정하였다.
구강 당부하검사 ( OGTTs )
9주 및 10주에, 연구는 마지막으로 완료된 비-공복 OGTT와 함께, 공복 및 비-공복 래트에서 2번의 구강 당부하검사 (OGTTs)로 결론지어졌다. 공복 및 비-공복 OGTTs 둘 다에 대해, 인슐린 분석 및 글루코스 측정에 대한 베이스라인 혈액 샘플을 채취하였다. 최종 비-공복 OGTT에 대한 초기 혈액 샘플을 하기 설명된 바와 같이 임상 화학 패널을 위해 사용하였다.
공복 및 비-공복 동물 둘 다에 대한 OGTT를 구강 글루코스 처리에 의해 유발하였다 (2　g/kg 글루코스, 위관영양법에 의해). 혈액 샘플을 글루코스 로드 후 30분, 60분, 90분, 및 120분에 채취하였고 글루코스 및 인슐린 함량에 대해 분석하였다. 두 번째 당부하검사의 결론에서, 래트를 이소플루오레인으로 희생시켰고, 조직병리학적인 분석을 위해 적절한 기관들을 채취하였다.
항상성 모델 평가 ( HOMA ) 점수를 연구를 통해 mg 글루코스　x 인슐린 (U/mL2)로 계산하였다. 이것은 일반적으로 말초 인슐린 저항의 더 큰 감소를 나타내는 더 낮은 HOMA 점수로, 인슐린 저항의 변화를 나타내는 믿을 수 있는 방법으로 받아들여진다. 구강 당부하검사 (OGTT) 연구에 대한 합성 인슐린 민감도 지수 (CISI) 점수는 또한 다음 공식을 사용하여 계산되었다:
Figure pct00002
이 CISI 점수는 향상된 인슐린 민감도를 나타내는 더 높은 점수와 함께 혈당 변동 폭 및 정규 곡선하의 영역을 고려한다.
공복 및 비-공복 OGTTs 둘 다에 대해, 인슐린 분석 및 글루코스 측정에 대한 베이스라인 혈액 샘플을 채취하였다. 최종 (비-공복) OGTT에 대한 초기 혈액 샘플을 또한 다음을 포함하는 임상 화학 패널을 위해 사용하였다: 전해질, 혈액 요소 질소 (BUN), 크레아티닌, 알칼린 포스파타제, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (ALT), 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (AST), 및 빌리루빈 (직접 + 간접) 및 전체 혈장 콜레스테롤 (IDEXX에 의해 수행된 분석, North Grafton, Massachusetts).
혈청 트리글리세리드 : 비-공복 동물에서 최종 측정값만을 채취하지만, 공복의 동물에서, 혈청 트리글리세리드를 연구를 통해 측정하였다 (IDEXX에 의해 수행된 분석, North Grafton, Massachusetts).
임상 화학 패널: 최종 비-공복 OGTT에 대한 초기 혈액 샘플을 전해질, 혈액 요소 질소 (BUN), 크레아티닌, 알칼린 포스파타제, 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (ALT), 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (AST), 및 빌리루빈 (직접 + 간접) 및 전체 혈장 콜레스테롤 (IDEXX에 의해 수행된 분석, North Grafton, Massachusetts)을 포함하는 임상 화학 패널을 위해 사용하였다.
조직 분석: 간의 한 엽, 한 신장, 및 췌장을 10% 중성 완충된 포르말린 (NBF)에서 고정하였다. 췌장은 24시간 후에 70% 에탄올로 옮겼다. 조직을 가공하였고 파라핀에 집어넣었다. 간 및 신장을 약 5 미크론으로 섹션하였고 헤마톡실린 및 에오신 (H&E)로 염색하였다. 췌장을 약 5 미크론으로 연속적으로 2번 섹션하였고, 섹션을 H&E로 염색하거나 면역조직화학적으로 래트 인슐린에 대한 마우스 항체 (1:300 토끼 항-래트 인슐린, Cell Signaling Technology, Danvers, Massachusetts)로 염색하였다.
면역조직화학법 :
면역조직화학법을 다음과 같이 수행하였다. 이소타입 대조군 항체 (정상 토끼 IgG, R&D Systems, Minneapolis, Minnesota)를 비-특이적 및 배경 염색의 전체적인 레벨을 평가하기 위해 사용하였다. 다음 탈파라핀화에서, Declere? (Cell Marque™ Corporation, Rocklin, California) 용액 을 사용하여 항원 회수를 120℃에서 15분 후 뜨거운 Declere? 용액에서 상온에서 5분 동안 수행하였다. 탈염수에 3% 과산화수소에서 10분 동안 배양에 의해 내인성 퍼옥시다제 활성을 억제하였다. 슬라이드를 5% 정상 염소 혈청에서 20분 동안 배양하였다. 그때 슬라이드를 60분 동안 1차 항체와 함께 배양 후, 비오티닐화된 염소 항-토끼 항체에서 30분 동안 배양하였다. 슬라이드를 ABD Elite Reagent? (Vector, Burlingame, California)에서 30분 동안 배양하였다. 최종적으로, 표본을 디아미노벤지딘에서 5분 동안 배양 후, 헤마톡실린 대비염색한다.
검시 후, 추가적인 간 엽을 OCT에 집어넣었고 5μM로 섹션하였고 지질 성분 (자유 지방산 및 트리글리세리드)의 분석을 위해 수단 블랙으로 염색하였다.
H&E로 염색된 모든 슬라이드를 세뇨관 확장의 증가 및 신장의 세뇨관 변성, 췌장 도세포 퇴화, 및 지방간의 증가와 같은, ZDF에서 일반적으로 관찰되는 것들과 관련된 형태상의 변화에 대해 평가하였다. 이 변화들을 그 발견의 심각성에 기초하여, 가장 심각한 것을 5로 하는, 0 내지 5의 스케일로 반-양적으로 등급을 나누었다.
수단 블랙으로 염색된 간 슬라이드를 평가하였고 가장 심각한 것을 5로 하는, 0 내지 5의 스케일로 수단 블랙 양성 액포의 존재에 대해 반-양적으로 등급을 나누었다.
면역조직화학적으로 항-인슐린 항체로 염색된 췌장 슬라이드에서 인슐린 양성 세포와 도 영역의 퍼센트를 측정하였다. 이 측정은 형태적으로 수행되었다. 췌장 당 10개의 도는 수의 병리학자에 의해 수동으로 설명되었다. 이 도 내에 인슐린 염색에 대해 양성인 영역을 유사하게 설명하였고, 인슐린에 대해 양성인 도 영역의 퍼센트를 ImagePro?Plus 이미지화 소프트웨어를 사용하여 계산하였다.
통계적인 방법:
다양한 시점에 수거된 구간 데이터를 분산의 양방향 반복 측정 분석 (ANOVA)에 의해 분석하였다. Motulsky H., Intuitive Biostatistics, NY, University Press (1995)에 설명된 바와 같이, 큰 효과는 Bonferroni의 다양한 비교 테스트를 사용하는, 비교의 원인이 되었다.
비-공복 래트에서 연구의 끝에만 측정된 인슐린, 콜레스테롤, 및 혈액 화학을 한 방향 ANOVA에 의해 분석하였다. Motulsky H., Intuitive Biostatistics, NY, University Press (1995)에 설명된 바와 같이, 큰 효과는 Dunnetts의 다양한 비교 테스트 (MCT)를 사용하는, 비교의 원인이 되었다.
Motulsky H., Intuitive Biostatistics, NY, University Press (1995)에 설명된 바와 같이 비-구간 또는 별개의 데이터 (예를 들어, 조직학적 점수)를 Kruskal Wallis 테스트에 의해 분석하였다. 큰 효과는 Dunnett's MST를 사용하는, 비교의 원인이 되었다.
결과
체중 및 음식 소비
도 1a는 Zucker 당뇨병 래트에서 8-주 연구 동안 시간이 지남에 따라 체중 (g)에 대한 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 식단의 효과를 도시한다. 도 1a에 나타난 바와 같이, 1주로부터 시간과 관련된 체중의 증가는 VFC 처리된 래트 대 셀룰로스 먹은 동물 또는 이눌린 먹은 동물에서 상당히 둔화되었다. 연구의 시작에서, 모든 Zucker 당뇨병 래트는 유사한 체중을 갖고 있었다 (약 160 g). 다음 3주 후, VFC 함유 음식을 먹은 래트보다 셀룰로스 또는 이눌린 함유한 음식을 먹은 래트가 평균 40 g 더 증가하였다. 1주 내지 8주에서 VFC 대 셀룰로스 또는 이눌린 함유 식단을 먹은 래트 사이에서 큰 차이가 관찰되었다 (부호 "***"는 p　<0.001를 나타낸다, Bonferroni's MCT). 이눌린 및 셀룰로스 함유 식단을 먹은 래트 사이에서 큰 차이가 관찰되지 않았다.
도 1b는 Zucker 당뇨병 래트에서 8-주 연구 동안 시간이 지남에 따라 음식 소비 (g/일)에 대한 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 식단의 효과를 도시한다. 도 1b에 나타난 바와 같이, 음식 소비는 VFC 처리된 래트에서 처음 3주 동안 크게 감소하였다 (부호 "*"는 1주에서 p　<0.05를 나타낸다; 부호　"***"는 2주에서 p　<0.001를 나타낸다; 부호　"**"는 3주에서 p　<0.01를 나타낸다). 4주 연구 후, 레벨은 더 이상 통계적으로 다른 두 그룹과 다르지 않지만, VFC 그룹의 음식 섭취는 남은 프로토콜을 통해 더 낮게 유지되었다. 이눌린 및 셀룰로스 함유 식단을 먹은 래트 사이에서 큰 차이가 관찰되지 않았다.
VFC 함유 음식을 먹은 래트는 전형적으로 20-23 g/일 (흘린 양에 대해 교정됨; 약 70-85 kcal/일과 동등함)을 먹었다. 셀룰로스 또는 이눌린 함유 음식을 먹은 래트는 전형적으로 21-27 g/일(흘린 양에 대해 교정됨; 약 75-100 kcal/일과 동등함)을 먹었다.
요약하면, 이 결과들은 전형적으로 ZDF 래트 모델에서 관찰되는, 시간과 관련된 체중의 증가는 VFC 처리 동물에서 크게 둔화되었다는 것을 입증한다.
당화 조절: 혈당 및 대사
도 2a-d는 8주 연구 동안 시간이 지남에 따라 ZDF 래트에서 공복 혈당 (도 2a), 공복 혈청 인슐린 (도 2b), 비-공복 혈당 (도 2c), 및 공복 항상성 모델 평가 (HOMA) 점수 (도 2d)에 대한 VFC , 셀룰로스 , 또는 이눌린 함유 식단의 효과를 도시한다.
도 2a에 나타난 바와 같이, VFC 처리된 래트에 대한 혈당치에서 관찰된 약간의 증가로 공복 래트의 혈당치는 래트 중 어느 것에서도 크게 평가되지 않았다 (3주 및 6주에서 부호"*"는 p　<0.05를 나타낸다).
도 2b에 나타난 바와 같이, 공복 래트의 혈청 인슐린 레벨은 연구 기간을 통해 VFC 처리된 래트에서 감소하였고, 혈청 인슐린 레벨은 5주에 시작하는 통계적으로 상당한 레벨에서 감소되었다 (4주 후 부호　"***"는 p　<0.001를 나타낸다).
도 2c에 나타난 바와 같이, 비-공복 래트의 혈당치는 셀룰로스 및 이눌린 먹은 래트와 비교하여 약 5주에 시작하는 VFC 처리된 래트에서 크게 감소되었다 (5주 후 부호 "***"는 p　<0.0001를 나타낸다).
도 2d에 나타난 바와 같이, VFC 처리된 래트는 연구 5주 (부호　"*"는 p　<0.05를 나타낸다), 5-7주와 함께 (p　<0.05), 및 8주 (부호　"**"는 p　<0.01를 나타낸다)에 시작하는 크게 감소된 HOMA 점수를 갖게 되었다.
일반적으로, 공복 조건 하에서 (즉, 음식 접근 없이 약 16시간 후 아침에 테스트된 동물), ZDF 래트는 음식이 충분한 (비-공복) 조건 하에서 보이는 것들보다 훨씬 더 낮은 혈당 농도를 유지한다 (도 2a와 도 2c 비교). 도 1a에 나타난 바와 같이, 모든 공복 그룹에 대해, 혈당치는 전형적으로 VFC , 셀룰로스, 또는 이눌린 먹은 그룹 사이에서 관찰된 아주 작은 차이로, 95　mg/dL 및 145　mg/dL 사이의 범위에서 관찰되었고, 이것은 미미하게 당뇨병으로 생각된다.
도 2b에 나타난 바와 같이, 공복 조건 하에서, VFC 함유 식단을 먹은 래트는 셀룰로스 또는 이눌린 함유 음식을 먹은 래트보다 훨씬 더 많이 안정한 혈청 인슐린 농도를 유지하였다. 도 2b에 나타난 바와 같이, 공복 혈청 인슐린 레벨은 VFC 처리된 ZDF 래트에서 5주에 시작하는 것으로 관찰된 큰 감소로 연구의 시간 과정에 걸쳐 감소되었고 8주를 통해 상당히 남아있다 (4주 후 p　<0.001, 부호　"***"에 의해 나타난 바와 같이). 이눌린 및 셀룰로스 함유 식단을 먹은 래트 사이에서 큰 차이는 관찰되지 않았다.
공복 래트에서 본 연구의 과정 중 인슐린 저항을 항상성 모델 평가 (HOMA)를 계산함으로써 평가하였다. 도 2d에 나타난 바와 같이, HOMA 점수는 모든 그룹에 대해 연구의 과정을 통해 상승하였지만, 셀룰로스 또는 이눌린을 먹은 래트보다 VFC 함유 식단을 먹은 래트에서 훨씬 적게 상승하였다. VFC 대 셀룰로스 또는 이눌린 사이의 큰 차이는 5, 6, 및 7주에서 (p　<0.05, 부호　"*"에 의해 나타난 바와 같이) 및 8주에서 (p　<0.01, 부호　"**"에 의해 나타난 바와 같이). 셀룰로스 또는 이눌린 함유 식단 사이에서 큰 차이는 관찰되지 않았다.
도 3a는 연구 8주 동안 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 식단을 먹은 공복 Zucker 당뇨병 래트에 대한 합성 인슐린 민감도 지수 (CISI) 점수를 도시한다. 도 3a에 나타난 바와 같이, 공복 동물의 OGTT 테스트에 대해 계산된 CISI 점수는 VFC 처리된 동물에 대해 훨씬 더 높았고 (p　<0.01, 부호　"**"에 의해 나타남), 셀룰로스 및 이눌린 먹은 그룹과 비교하여 이 VFC 그룹에 대한 향상된 인슐린 민감도를 더 입증하였다.
도 3b는 연구 8주 동안 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 식단을 먹은 비-공복 Zucker 당뇨병 래트에 대한 합성 인슐린 민감도 지수 (CISI) 점수를 도시한다. 도 3b에 나타난 바와 같이, VFC 처리된, 비-공복 동물은 훨씬 더 높은 CISI 점수를 나타내었고 (p　<0.001, 부호　"***"에 의해 나타남), 그러므로 셀룰로스 및 이눌린 처리된 그룹과 비교하여 더 높은 인슐린 민감도를 나타낸다. 최대 글루코스 레벨은 글루코스 처리 후 30분에 보였고, VFC 그룹은 다른 두 그룹과 비교하여 훨씬 낮은 피크 값을 갖게 되었다.
도 2c에 나타난 바와 같이, 비-공복 (먹은) 조건 하에서 (즉, 전 24시간 동안 계속되는 음식 접근으로 아침에 테스트된 동물), VFC 함유 식단을 먹은 래트는 테스트된 모든 주 동안 셀룰로스 또는 이눌린 함유 식단을 먹은 래트보다 더 낮은 혈당치를 유지한다. 혈당 테스트는 연구의 3주 중에 시작하였고 8주까지 계속되었다. 먹은 상태에서 동물의 글루코스 테스트를 공복 글루코스 값이 정상 범위와 아주 근접하다는 관찰이 제공되는 연구 프로토콜에 추가하였고, 어느 특정 이론에 결부되는 것을 바라지 않지만, VFC의 많은 기계적인 작용이 음식과의 직접적인 접촉을 수반한다고 생각된다.
먹은 조건 하에서 인슐린은 마지막 시점에서만 측정되지만, 최종 시점에서 측정될 때 공복 동물에서 보이는 것과 유사하게 향상된 인슐린 민감도가 관찰되었다. 도 2c에 나타난 바와 같이, 먹은 상태 혈당 반응은, 이눌린 또는 셀룰로스 처리된 동물과 비교하여, VFC 처리된 동물에서 훨씬 낮아졌다. 이눌린 또는 셀룰로스 함유 식단을 먹은 래트 사이에서 큰 차이는 관찰되지 않았다.
도 3c는 8주 연구의 최종 혈액 도식을 위해 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 식단을 먹은 비-공복 Zucker 당뇨병 래트에 대해 계산된 HOMA 점수를 도시한다. 도 3c에 나타난 바와 같이, HOMA 점수는 셀룰로스 및 이눌린 그룹과 비교하여 VFC 처리된 그룹 (p　<0.001)에서 크게 낮아진다는 것이 발견되었다. 상기 언급된 바와 같이, 더 낮은 HOMA 점수는 말초 인슐린 저항의 더 큰 감소를 나타낸다.
지질 프로파일
혈청 트리글리세리드를 공복 (연구에 걸쳐 측정) 및 비-공복 (8주 연구의 끝에서만 측정) 동물에서 측정하였다. 도 4는 8주 연구 동안 시간이 지남에 따라 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 식단을 먹은 공복 Zucker 당뇨병 래트에서 측정된 혈청 트리글리세리드의 레벨을 도시한다. 도 4에 나타난 바와 같이, 공복 동물에 대해, VFC 처리된 동물은 이눌린 및 셀룰로스 처리된 그룹과 비교하여 트리글리세리드에 대한 이르고 크게 낮아지는 효과를 나타내었다. 2-3주 후, 혈청 트리글리세리드는 이눌린 및 VFC 처리된 동물과 비교하여 더 낮은 트리글리세리드를 갖는 셀룰로스 처리된 동물에 대한 성향으로, 모든 그룹에서 낮아졌다. 하기 표 2에 나타난 바와 같이, 비-공복 동물에서, 연구의 끝에 측정된 바와 같이, 혈청 트리글리세리드는 다른 두 그룹보다 훨씬 더 낮은 트리글리세리드를 갖는 것으로 밝혀진 이눌린 처리된 동물과 함께, VFC 처리된 및 셀룰로스 처리된 동물에 대해 유사하였다.
8주 연구 끝에, 혈장 콜레스테롤을 마지막 OGTT 전 음식을 먹은 동물로부터 얻은 베이스라인 샘플에서 측정하였다. 하기 표 2에 나타난 바와 같이, 동물은 과콜레스테롤혈증이었고, VFC는 셀룰로스 및 이눌린 먹은 그룹과 비교하여 절반 이상으로 콜레스테롤 레벨을 감소시킨다.
표적 기관 효과: 간, 췌장 및 신장의 조직학적 평가
상기 글루코스 및 인슐린에 대해 설명된 데이터가 VFC 처리로 향상된 인슐린 민감도 및 당화 조절을 나타내지만, 신장과 같은 기관에 대한 손상의 정도의 개선에 대한 VFC의 효과를 평가하기 위해 조직 분석을 수행하였다. 특히 신장은 당뇨성 신증에 민감한 것으로 알려져 있는데, 이것은 고혈당 및 지나친 당화와 관련될 가능성이 있다. 측정된 모든 조직에 대해, 당뇨병의 진행을 지연시키고 및/또는 당요병과 연관된 증상을 개선하는 VFC 처리의 능력의 지표로서 손상의 정도를 평가하였다.
신장
H&E로 염색된 당뇨성 신장 조직의 모든 슬라이드를 세뇨관 확장의 증가 및 신장의 세뇨관 변성/재생을 포함하는, ZDF에서 일반적으로 관찰되는 것들과 관련된 형태상의 변화에 대해 평가하였다. 여러 신장 병리학 파라미터는 VFC 함유 식단을 먹은 Zucker 당뇨병 래트 및 이눌린 또는 셀룰로스 함유 음식을 먹은 ZDF 래트 사이에서 차이를 나타내었다.
도 5A는 가장 심각한 것을 5로 하는, 0-5의 조직학적 점수에 기초하여, 세뇨관 확장 8주 후 Zucker 당뇨병 래트에 대한 VFC , 셀룰로스 , 또는 이눌린 함유 식단의 효과를 도시한다. 도 5A에 나타난 바와 같이, 세뇨관을 VFC 처리된 ZDF 래트에서 부재하는 것으로 평가하였다. 반대로, 세뇨관 확장은 셀룰로스 및 이눌린을 먹인 ZDF 래트에 존재하는 것이 발견되었다. 도 5a에 나타난 점수는 VFC 및 셀룰로스 또는 이눌린을 먹은 그룹 사이에서 상당한 치료 효과 (p　<0.001, indicated by the 부호　"*")를 나타내었다. 이눌린 및 셀룰로스를 먹은 동물들 사이에서 세뇨관 확장의 양에서 큰 차이는 관찰되지 않았다.
도 5b는 가장 심각한 것을 5로 하는, 0-5의 조직학적 점수에 기초하여, 세뇨관 변성/재생 8주 후 Zucker 당뇨병 래트에 대한 VFC , 셀룰로스 , 또는 이눌린 함유 식단의 효과를 도시한다. 도 5b에 나타난 바와 같이, VFC 함유 식단을 먹은 래트는 0.1의 세뇨관 변성/재생 점수를 나타내었는데, 이 점수는 한 래트에서 1 (최소 심각성)의 점수, 및 그룹에서 다른 9마리의 래트에 대한 0 (정상 한계 내)의 점수로 구성된다. 반대로, 도 5b에 더 나타난 바와 같이, 셀룰로스 또는 이눌린 함유 식단으로 먹은 래트에 대한 평균 점수는 1.0이었다. 세뇨관 변성/재생의 심각성의 감소에 대한 VFC의 처리 효과는 VFC 대 셀룰로스 또는 이눌린을 먹은 그룹 사이에서 관찰된 큰 차이로, 유의했다 (p　<0.01, 부호　"**"에 의해 나타남). 셀룰로스 또는 이눌린 사이에서 관찰된 큰 차이는 없다.
도 5c는 신장 혈관 사이 확장 8주 후 Zucker 당뇨성 래트에 대한 VFC , 세룰로스-, 또는 이눌린 함유 식단에 대한 효과를 도시한다. 도 5c에 나타난 바와 같이, 사구체 혈관 사이 확장 점수는 셀룰로스 또는 이눌린 함유 식단과 비교하여 VFC 함유 식단을 받은 그룹에 대해 더 낮은 점수를 나타냈다. 혈관 사이 확장에 대한 점수는 전체적인 통계적인 유의함에 도달했지만, 인과 관계 테스트에서 상당히 다른 치료 그룹의 유일한 쌍은, 셀룰로스 식단과 비교하여 감소된 강한 성향을 갖는, VFC 및 이눌린 함유 식단을 먹은 그룹이었다 (p　<0.05, 부호　"*"에 의해 나타남).
췌장
도 6은, 항-래트 인슐린 항체로 염색에 의해 결정된 바와 같이, 8주 연구 끝에 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 식단을 먹은 Zucker 당뇨병 래트에 존재하는 췌장 도 인슐린 면역반응성 영역의 퍼센트를 도시한다. 도 6에 나타난 바와 같이, VFC 함유 식단을 먹은 래트는 셀룰로스 또는 이눌린 함유 식단을 먹은 래트와 비교하여, 인슐린 면역조직화학법에 의해 측정된 바와 같이, 전체 도 영역의 퍼센트 (즉, 큰 췌장 베타 세포 덩어리)로 더 높은 영역을 유지하였다. 인과 관계 테스트가 VFC 및 셀룰로스 함유 식단을 먹은 래트 사이에서 차이를 나타내지만 (p　<0.001), ANOVA 분석은 큰 치료 효과 (p　<0.0001, 부호　"***"에 의해 나타남)를 나타내었다. 이눌린 및 셀룰로스 함유 식단을 먹은 동물들 사이에는 차이가 없는 것으로 나타났다. 중요하게, 이 데이터들은 더 낮은 공복 혈청 인슐린 농도 (도 2b) 및 더 큰 인슐린 민감도 (도 3b)와 결합되는 이 데이터들은, VFC 함유 식단을 먹은 Zucker 당뇨병 래트가 셀룰로스 또는 이눌린 함유 식단을 먹은 래트와 비교에서 인슐린 분비에 대한 훨씬 더 큰 예비 용량을 유지한다는 것을 나타낸다.
도 7a는 가장 심각한 것을 5로 하는, 0-5의 조직학적 점수에 기초하여, 8주 연구 끝에 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 식단을 먹은 Zucker 당뇨병 래트에 존재하는 췌장 도 단핵 염증 세포 침투에 대한 조직학적 점수를 도시한다.도 7a에 나타난 바와 같이, 도 단핵 침투의 존재의 점수에 대한 관찰된 치료 효과에서 차이는 없었다.
도 7b는 가장 심각한 것을 5로 하는, 0-5의 조직학적 점수에 기초하여, 8주 연구 끝에 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 식단을 먹은 Zucker 당뇨병 래트에 존재하는 췌장 도 세포 변성에 대한 조직학적 점수를 도시한다. 도 7b에 나타난 바와 같이, 도 세포의 변성에 대한 점수는 VFC 함유 식단을 먹은 래트에서 없었고, 셀루로스- 또는 이눌린 함유 식단을 먹은 래트에서 더 높아지려는 성향이 있었다; 하지만, 이 차이들은 통계적인 유의함에 도달하지 못했다.
도 7c는 가장 심각한 것을 5로 하는, 0-5의 조직학적 점수에 기초하여, 8주 연구 끝에 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 식단을 먹은 Zucker 당뇨병 래트에 존재하는 췌장 도 섬유증의 양에 대한 조직학적 점수를 도시한다. 도 7c에 나타난 바와 같이, 도 섬유증의 양에 대한 점수는 셀룰로스 또는 이눌린 함유 식단을 먹은 래트와 비교하여 VFC 함유 식단을 먹은 래트에서 더 낮아지려는 성향이 있다; 하지만, 이 차이들은 통계적인 유의함에 도달하지 못했다. 출혈 또는 헤모시데린의 존재에 대한 점수는 VFC 함유 식단을 먹은 래트에서 더 낮은 점수에 대한 추세를 나타내었다 (데이터 미도시).
간
도 8a는 가장 심각한 것을 5로 하는, 0-5의 조직학적 점수에 기초하여, 감소된 수단 블랙 염색에 의해 측정된 바와 같이, 지방간 8주 후 Zucker 당뇨병 래트에 대한 VFC , 셀룰로스 , 또는 이눌린 함유 식단의 효과를 도시한다. 도 8a에 나타난 바와 같이, VFC 함유 식단을 먹은 래트는 셀룰로스 또는 이눌린 함유 식단을 먹은 래트보다 더 작은 지방간 (수단 블랙 염색에 의해 측정)을 나타내었다. 0 (정상 한계 내) 내지 5 (심각)의 스케일에서, VFC 함유 식단을 먹은 래트의 평균은 3.4이다. 이것을 셀룰로스 함유 식단을 먹은 래트에 대한 4.6 및 이눌린 함유 식단을 먹은 래트에 대한 4.1의 점수와 비교한다. 그룹은 VFC 대 셀룰로스 및 이눌린 함유 식단을 먹은 래트 사이에서 크게 달랐다 (p　<0.01, 부호　"**"에 의해 나타남). 이눌린 및 셀룰로스 함유 식단을 먹은 래트 사이에서 큰 차이는 관찰되지 않았다.
VFC 함유 식단을 먹는 래트는 또한 셀룰로스 또는 이눌린 함유 식단을 먹은 래트보다 더 작은 간세포 미세수포성 공포를 나타내었다. 도 8b는 가장 심각한 것을 5로 하는, 0-5의 조직학적 점수에 기초하여, 간세포 미세수포성 공포 8주 후 Zucker 당뇨병 래트에 대한 VFC, 셀룰로스, 또는 이눌린 함유 식단의 효과를 도시한다. 도 8b에 나타난 바와 같이, 셀룰로스 또는 이눌린 함유 식단을 먹은 모든 래트에서 심각한 것으로 미세수포성 공포를 평가하였다 (4.6의 평균 점수, 높음). 반대로, VFC 함유 식단을 먹은 래트는 3.2의 점수로 평균을 내었다 (가벼움). Dunnett's MCT는 VFC 함유 및 셀룰로스 함유 식단을 먹은 그룹 사이에서 큰 차이를 나타내었지만 (p　<0.001, 부호 "**"에 의해 나타남), 이눌린 및 셀룰로스 함유 식단을 먹은 그룹 사이에서는 아니다.
도 8c는 가장 심각한 것을 5로 하는, 0-5의 조직학적 점수에 기초하여, 간세포 미세수포성 공포 8주 후 Zucker 당뇨병 래트에 대한 VFC, 셀룰로스, 도는 이눌린 함유 식단의 효과를 도시한다. 도 8c에 나타난 바와 같이, 모든 처리 그룹에서, 거대수포성 간세포 공포는, 더 낮은 심각성 점수에 반영된 바와 같이 (도 8b 내지 도 8c), 미세수포성 간세포 공포보다 일반적으로 덜 중요하다. 이눌린 함유 식단을 먹은 래트가 셀룰로스 함유 식단을 먹은 래트와 비교하여 감소된 공포를 갖는 성향을 나타내었지만, 이 차이는 통계적으로 유의하지 않았다. VFC 대 셀롤로스 함유 및 이눌린 함유 식단을 먹은 그룹 사이에서 큰 차이가 있었다 (p　<0.001, 부호 "***"에 의해 나타남). 이눌린 및 셀룰로스 함유 식단을 먹은 그룹 사이에서 큰 차이는 보이지 않았다. 낭포성 간세포 변성 및 섬유증은 또한 VFC 함유 식단을 먹은 래트에서 덜 심각한 점수를 받는 경향을 나타냈지만, 이것은 통계적인 유의성에 도달하지 못했다 (데이터 미도시).
하기 표 2에 나타난 바와 같이, 간 손상에 대한 여러 임상 화학 지표는 실질적인 VFC로 치료 효과를 나타내었다. 간 효소 알라닌 아미노트랜스퍼라제 (ALT) 및 아스파르테이트 아미노트랜스퍼라제 (AST)는 온전한 세포막과 함께, 간세포의 손상에 의해 혈액으로 방출된다. 명백한 간 질환 범위가 없는 Sprague-Dawley 래트는 22-48 IU/L의 ALT 레벨을 갖는다 (IDEXX 참고 데이터). 표 2에 나타난 데이터는 ALT 및 AST 레벨에 관한 전체적인 치료 효과를 나타내었다. 인과 관계 테스트는 셀룰로스 또는 이눌린 함유 식단을 먹은 래트와 비교하여 VFC 함유 식단을 먹은 래트에서 더 낮은 혈액 ALT 레벨을 나타내었고 (p　<0.05), 셀룰로스 함유 식단을 먹는 래트와 비교하여 이눌린 함유 식단을 먹는 래트에서 훨씬 더 높은 혈액 ALT 레벨을 나타내었다 (p　<0.05).
혈액 AST는 표 2에 더 나타난 바와 같은 결과와 유사한 패턴을 나타낸다. 명백한 간 질환 범위가 없는 Sprague-Dawley 래트는 33-53 IU/L의 AST 레벨을 갖는다 (IDEXX 참고 데이터). 이눌린 함유 식단을 먹는 래트는 1010 IU/L를 평균으로 하는 반면, VFC 함유 식단을 먹는 래트는 약 170 IU/L를 평균으로 하였고, 셀룰로스 함유 식단을 먹는 래트는 870 IU/L를 평균으로 하였다. 전체적인 치료 효과는 통계적으로 유효했고 (p　<0.0001), 이눌린 및 셀룰로스 함유 식단을 먹는 그룹 사이의 차이가 크지 않았지만, VFC 및 셀룰로스 함유 식단을 먹은 그룹 사이의 차이는 유의했다 (p　<0.001, Dunnett's MCT).
표 2에 나타난 바와 같이, VFC 함유 식단을 먹은 래트는 셀룰로스 또는 이눌린 함유 식단을 먹은 래트보다 더 낮은 혈청 알칼린 포스파타제 레벨을 갖고 있었다. 알려진 간 질환 또는 뼈 질환이 없는 Sparague-Dawley 래트에서 이 파라미터의 정상 범위는 0-267　IU/L (IDEXX 참고 데이터). 표 2에 나타난 바와 같이, VFC 함유 식단을 먹은 래트에 대한 평균 혈청 알칼린 포스파타제 레벨은 정상 범위 내에 있었지만, 셀룰로스 또는 이눌린 함유 식단을 먹은 래트에 대한 평균은 둘 다 정상 범위 밖에 있었다. VFC 대 셀룰로스 또는 이눌린 함유 식단을 먹은 그룹 사이에서 알칼린 포스파타제의 감소는 유의했다 (p　<0.001). ALT 및 AST의 증가는 간세포의 손상을 나타내지만, VFC로 더 낮은 혈청 알칼린 포스파타제 레벨은 담즙 울체 (cholestasis)에 대한 보호 효과를 제안한다 (D.S.　Pratt et　al., Harrison's Principles of Internal Medicine 15 th Edition, pp.　1711-1715 (2001). 반대로, 글로불린 및 빌리루빈은 간에 의해 제거되고, 향상은 면역 반응이 작용하지 않는 간 기능을 반영한다.
Sparague-Dawley 래트의 글로불린에 대한 정상 범위는 2.8-4.5　g/dL이다 (IDEXX 참고 데이터). 표 2에 나타난 바와 같이, VFC 함유 식단을 먹는 래트에 대한 글로불린 농도는 3.4　g/dL, 및 셀룰로스 및 이눌린 함유 식단을 받은 래트는 각각, 4.0 및 3.9 　g/dL을 평균으로 한다. VFC 및 셀룰로스 함유 음식물을 먹은 그룹 사이의 유의한 차이 (p<0.001, Dunnett's MCT)로, 섬유질 타입의 효과는 유의했지만 (p<0.001), 이눌린 및 셀룰로스 함유 식단을 먹은 그룹 사이에서는 아니다. 유사하게, 표 2에서 나타난 바와 같이, VFC 함유 식단을 먹은 래트는 0.13　mg/dL 전체 (직접 및 간접) 빌리루빈을 평균으로 하지만, 셀룰로스 및 이눌린 함유 식단을 먹은 래트는 각각, 0.19 및 0.18　mg/dL을 평균으로 한다. Sprague-Dawley 래트에 대한 참고 범위는 0-0.4　mg/dL이다 (IDEXX 참고 데이터). 이눌린 및 셀룰로스 함유 식단을 먹은 그룹 사이는 아니지만 VFC 함유 식단을 먹은 그룹 사이의 유의한 차이 (p<0.05, Dunnett's MCT)로, 치료 효과는 통계적으로 유의하다 (1W ANOVA, F(2,28)=4.93, p<0.05). 글로불린 및 빌리루빈 레벨은 모든 그룹에 대해 정상 한계 내에 있었지만, VFC 함유 식단을 먹은 래트는 분석물 대 다른 그룹의 유의하게 낮아진 농도를 나타내었고 (p<0.001), 향상된 간 기능을 제안한다.
Sprague-Dawley 래트의 빌리루빈에 대한 정상 범위는 0-0.4 mg/dL이다 (IDEXX 참고 데이터). 처리 그룹 사이의 빌리루빈에서 큰 차이가 관찰되지 않았다. 간에서 합성되는, 알부민은 모든 치료 그룹에서 유사하였다.
표 2: 비-공복 Zucker 당뇨병 래트에서 연구의 종료시 채취한 주요 분석물의 혈장 화학 (최종 비-공복 OGTT의 베이스라인 측정)
Figure pct00003
* 셀룰로스 그룹으로부터 유의하게 다름 (p < 0.05)
** 셀룰로스 그룹으로부터 유의하게 다름 (p < 0.01)
*** 셀룰로스 그룹으로부터 유의하게 다름 (p < 0.001)
결과의 논의:
Zucker 당뇨병 래트 모델에서 이 연구는 VFC 함유 식단은 유의하게 당화 조절을 향상시키고, 신장 손상을 감소시키고, 췌장 베타 세포를 보존하고, 인슐린 민감도를 향상시키고, 그러므로 몸에서 전체 글루코스 부하를 감소시킨다. 게다가, 다른 섬유질 풍부한 식단과 비교하여 VFC 함유 식단을 먹은 래트에서 연구의 과정을 통해 약 10%까지 체중증가 속도의 감소를 관찰하였다. 이것은 부분적으로 연구 중에 보이는 감소된 음식 섭취 때문일 수도 있지만, 감소된 음식 섭취는 연구의 처음 3주 동안만 유의했다. 실시예 4에 더 나타난 바와 같이, VFC는 또한 GLP-1의 분비 및 포만감 유발 PYY를 증가시킨다.
본 연구에 사용된 VFC 과립의 양은 래트 음식에 추가된 5% VFC였다. 도 1a 및 1b에 나타난 바와 같이, VFC 먹는 래트에 대한 하루에 음식 소모량은 약 22 g/일, 즉 22 그램, 1.1 g VFC로 평균 내었다. Zucker 래트의 평균 무게가 약 300 g이라고 가정하면 (도 1a 참조), 그때 본 연구의 kg 당 투여량은 약 3.66　g/d/kg였다. 사람이 약 60 kg이라고 가정하면, 그때 이 투여량은 사람에 대해 약 219.6　g/일과 동등한 양일 것이다. Reagan-Shaw et　al., FASEB Journal 22:659-661 (2007)에 설명된 바와 같이, 쥐 투여량 0.1 내지 0.15의 부피에 대한 체표면적에 기초한 투여량의 사람에 대한 전환을 사용하여, 이것은 투여량 하루에 약 22 그램 내지 약 33 그램의 60 사람kg 또는 약 366 mg/kg/일 내지 약 550 mg/kg/일의 투여 범위로 전환될 것이다.
본 연구에서, 공복 Zucker 당뇨병 래트 (즉, 음식 접근 없이 약 16시간 후 아침에 테스트된 동물)는 크게 향상된 글루코스 레벨을 갖지 않았는데, 질환이 명백해지기 시작했을 때 관찰된 인슐린과잉혈증에 의해 제공된 충분한 보상 때문일 것이다. 테스트 전 16시간 동안 공복인 동물에서, 식단 그룹 전체에서, 인슐린 레벨은 VFC 처리된 그룹과 비교하여 셀룰로스 및 이눌린 처리된 그룹에서 더 높았는데, HOMA 및 CISI 점수와 함께 이것은 VFC 처리된 동물과 비교하여 이눌린 및 셀룰로스 처리된 그룹에서 더 큰 말초 인슐린 저항을 나타낸다. 그러므로, VFC는 인슐린 민감도를 향상시키기 위해 내장에 존재할 필요가 없다는 것이 나타난다. 어느 특정 이론과 결부되기를 바라지 않지만, 테스트 전 16시간 동안 공복인 VFC 처리된 동물에서 관찰된 향상된 인슐린 민감도는 증가된 프로글루카곤 발현 때문일 수도 있다 (S.P. Massimino et　al., J. Nutr .　128:1786-1793 (1998); R.A. Reimer et　al., Endocrinology 137:3948-3956 (1996)); 또는 근육 GLUT-4의 상향 조절 때문일 수도 있다 (Y.J. Song et　al., Clin . Exp . Pharm . Physiol .　27:41-45 (2000)).
테스트 전 16시간 동안 공복인 동물이 연구의 3주에 시작하는, 단지 약간만 고혈당인 이후에, 비-공복 상태 (즉, 테스트 전 음식에 계속된 접근)하에 래트에서 혈장 글루코스를 또한 측정하였다. 비-공복 상태에서 테스트된 동물에서, 셀룰로스 및 이눌린 처리된 그룹의 동물은 고혈당이지만, VFC 처리된 그룹의 동물은 거의 비-당뇨성 레벨로 감소하였다. 비-공복 상태에서 연구 종료시만 인슐린 레벨을 측정하였고, VFC 처리된 동물에서 인슐린이 유의하게 감소되었다는 것을 발견하였고, HOMA 및 CISI 점수는 또한 다른 그룹과 비교하여 VFC 처리된 동물에서 향상된 인슐린 민감도를 나타내었다.
그러므로, 혈청 인슐린이 VFC 처리된 동물의 공복 및 비-공복 상태 둘 다에서 유의하게 감소되었고, 혈당이 비-공복 상태에서 테스트된 VFC 처리된 동물에서 유의하게 감소되었다는 점에서, Zucker 당뇨병 래트의 VFC 처리는 당뇨병의 초기 진행을 지연시키는데 유효하였다는 것을 나타낸다.
당화 조절의 향상에 더하여, VFC 처리된 동물은 또한 셀룰로스 및 이눌린 처리된 동물과 비교하여 감소된 기관 손상을 가진다는 것을 결정하였다. 당뇨성 신증은 당뇨병, 특히사구체 기저막의 농화 (thickening) 혈관 사이 및 세뇨관의 확장 및 세뇨관 변성의 임상적으로 중요한 후유증이고, 대사 장해 및 혈류 역학 변화로부터 일어난다 (H.R. Brady and B.M. Brenner: Pathogenesis of Glomerular Injury, in Harrison's Principles of Internal Medicine 15th ed., E. Braunwald et　al., pp.　1572-1580 (2001)). 흥미롭게도, 본 연구에서 유의한 기관 손상은 상대적으로 가벼운 당뇨병에도 불고하고, 당뇨병 발생 초기인 젊은 Zucker 당뇨병 래트에서 아주 빠르게 발생한다는 것이 결정되었다. 중요하게도, VFC 처리된 동물은 이눌린 또는 셀룰로스 처리된 그룹과 비교하여 8주 연구의 끝에 존재하는, 유의하게 더 큰 밀도의 췌장 β 세포를 가지고있다는 것을 관찰하였다. 이 데이터는 8주 동안 VFC 함유 식단을 먹은 Zucker 당뇨병 래트가 인슐린 분비에 대한, 유의하게 더 큰 예비 용량을 유지한다는 것을 나타낸다. 췌장 β 세포의 보존은 인슐린 분비촉진제 GLP-1의 레벨을 증가시키는 DPP IV에 대해 참조한다는 것이 언급되었고, DPP IV 억제제를 사용하는 일부 연구에서, 인슐린은 타입 II 당뇨병의 모델, 특히 식후 인슐린 레벨에서 대조군보다 더 많다 (A. Viljanen et　al., J. Clin . Endocrinol . Metab . 94:50-55 (2009)).
본 연구에 사용된 Zucker 당뇨병 래트 모델에서, 비-공복 글루코스 레벨은 신장 손상을 일으키는데 충분한 것으로 나타났다. VFC 처리된, 특히 혈관 사이 확장에 관련된 그룹에서 신장 손상이 덜 있는 것이 결정되었다. 정상 먹이 급여 중 향상된 당화 조절 및 그 후 조직 당화의 감소는 감소된 신장 손상의 주요 인자로서 제공될 가능성이 있었다. 흥미롭게도, 및 예상 외로, 조직학은 VFC가 전체 글루코스 부하의 감소를 나타내는, 당화 손상으로부터 신장을 유의하게 보호하고, 그러므로 당화를 감소시킨다는 것을 나타내었다. 혈당의 감소가 더 이상 약 인증에 충분하지 않다고 생각되기 때문에, FDA는 항-당뇨성 효과에 대한 1차 마커로서 감소된 당화를 고려한다.
혈청 및 간 지질 프로파일에 대한 VFC 처리의 효과에 관하여, 혈장 콜레스테롤은 VFC 처리된 그룹에서 유의하게 감소되었다. 혈청 트리글리세리드 레벨의 효과는 더 사용 가능하였다. 그럼에도 불구하고, 간 지질 레벨 (지방간) 및 혈청 빌리루빈, ALT, 및 AST와 같은 간 측정값은 VFC 처리된 그룹에서 융의하게 감소되었고, 이것은 VFC 처리된 그룹에서 감소된 간 손상을 나타낸다. 게다가, 조직학적 분석에 기초하여, VFC 처리된 동물은 간세포 손상의 감소된 지수 및 알칼린 포스파타제의 감소된 혈청 레벨을 가지는데, 이것은 VFC 처리된 동물이 감소된 콜레스테롤뿐만 아니라 대사 증후군의 일반적인 동반물인, 지방간의 감소를 가지고 있다는 것을 나타낼 수도 있다 (A. Viljanen et　al., J. Clin . Endocrinol . Metab . 94:50-55 (2009)).
그러므로, VFC의 사용에 대한 효능은 당화 조절, 신장 손상의 감소 및 췌장 베타 세포의 보존에 관하여 ZDF에서 입증된다. 이 실시예에서 설명된 바와 같이, VFC 처리된 래트는 신장 손상, 특히 혈관 사이 확장을 덜 가지고 있었다. 향상된 당화 조절 및 그후 조직 당화의 감소는 감소된 신장 손상의 주요 인자로서 제공될 것이다. 그러므로, VFC는 글루코스 유발된 기관 손상의 진행, 간에서 지질 누적을 느리게 하고 췌장 베타 세포의 손상을 억제하는 능력을 포함하는, 대사 증후군의 초기 단계의 발달 및 진행의 개선을 돕기 위한 추가적인 식단으로서 사용될 수도 있다.
실시예 2
이 실시예는 췌장 조절 장애, 이상지질혈증, 및 비만에 대한 과립화된 점성 섬유질 블렌드 (VFC 과립) (섬유질 복합체 PolyGlycopleX? (PGX?)로 또한 나타남)을 포함하는, 식이 섬유 조성물의 효과를 결정하기 위해 비만 래트 모델을 유발하는 높은-수크로스 식단에서 수행된 연구를 설명한다.
근거: 실시예 1에 설명된 바와 같이, 새로운, 수용성 섬유질 복합체, VFC 과립은 또한 PolyGlycopleX? (PGX?)로 나타나고 (높은 보수성 및 겔 형성 성질을 가진 고점성 다당류 복합체를 형성하기 위해 곤약 만난, 잔탄 검, 및 알긴산염로부터 제조됨), Zucker 당뇨병 래트의 체중을 감소시키고 인슐린 민감도를 증가시킨다. 하지만, Zucker 당뇨병 래트에서 관찰되는, 혈청 트리아실글리세롤 (TAG)와 관련된 VFC 과립의 효과는 가변적이었다. 혈청 TAG 레벨을 감소시키기 위한 다양한 섬유질의 가변성은 다른 연구에서 관찰되었고, 섬유질 타입 및 특정 동물 모델과 관련될 수도 있다 (W.U. Jie et　al., Biomed . Environ . Sci . 10:27-37 (1997); A. Sandberg et　al., Am . J. Clin . Nutr . 60:751-756 (1994); R. Wood et　al., Metab . Clin . Exp . 56:58-67 (2007); and N.M. Delzenne et　al., J.　 Nutr . 129:1467S-1470S (1999)). 예를 들어, Mao-Yu et　al.에 의한 연구는 비-분해 가능한 섬유질에 의한 TAG의 감소는 TAG 증가의 심각성 및 시간이 지남에 따른 안정성에 의존적이다.
이 실시예에서 설명된 연구를 과립화된 VFC의 체중 증가량, 혈청 트리아실글리세롤 (TAG), 및 사람 타입 II 당뇨병을 철저히 모방한, 특히 만성으로 제공될 때 체중 증가 및 간 및 혈청 TAG 레벨의 일정한 증가를 일으키는 것으로 알려진 식단 유발된 비만 (높은 수크로스 65 중량%)의 모델인, 수크로스 먹은 수컷 Sprague-Dawley 래트의 지방간에 대한 효과를 결정하기 위해 수행하였다 (A.M. Gadja et　al., An . Lab News 13:1-7 (2007); M. Hafidi et　al., Clin . Exp . Hyperten . 28:669-681 (2006); 및 P. Rozan et　al., Br . J. Nutr . 98:1-8 (2008)). 이 실시예에서 설명된 연구를 래트의 생활 주기의 합리적인 부분을 캡쳐하고 이 모델의 특징인 혈청 TAG 레벨의 일정한 증가를 최대화하기 위해서 43주 동안 수행하였다.
방법:
섬유질 향상된 래트 음식:
점성 섬유질 복합체 (VFC) (곤약/잔탄/알긴산염 (70:13:17)) 과립 (즉, 섬유 블렌드는 복합체를 형성하기 위해서 과립하에 의해 가공되었고, 상업적으로 PGX?로서 알려짐)은 기본의 래트 음식 (D11725: Research Diets, New Brunswick, New Jersey)에 포함되었다. 본 연구에 사용된 대안의 식단은 하기 표 3에 나타난 바와 같이 다른 섬유질 형태를 포함하였다. 가용성 및 비-발효성 및 비활성 참고 화합물이라고 생각되는 기본 참고 섬유질로서 셀룰로스를 선택하였다 (J.W. Anderson et　al., J. Nutr . 124:78-83 (1994)).
표 3: VFC 또는 셀룰로스를 함유하는 3가지 식단의 조성 (체중에 대한 성분의 퍼센트 기여)
Figure pct00004
* PolyGlycopleX? (PGX?) (InnovoBiologic Inc. Calgary, AB, Canada)로서 상업적으로 알려진 VFC 섬유질 과립
동물 모델: 수크로스 먹은 래트는 정상 유전적 배경의 존재시 과트리글리세리드혈증 (hypertriglyceridemia)의 훌륭한 모델로 생각되기 때문에 수컷 Sprague-Dawley (SD) 래트를 선택하였다 (A.M. Gadja et　al., An Lab News 13:1-7 (2007)).
연구 디자인 : Charles River (Kingston NY)로부터 6주령에 30마리의 SD 래트를 얻었다. 동물을 가장 최근의 Guide for the Care and Use of Laboratory Animals, DHEW (NIH)에서 추천된 크기에 맞는, 매달린 철망 메쉬 케이지에서 단독으로 사육하였다. 동물실은 온도 및 습도 조절되었고, 12시간 명/암 주기를 가졌고, 깨끗하고 해충이 없게 유지되었다. 동물을 테스트 전 4일 동안 적응시켰다.
물: 여과된 수도물을 자동 물 분배 시스템에 의해 무제한 공급하였다.
음식: 길들인 후, 래트를 임의적으로 두 그룹, 5 중량% 셀룰로스 또는 5 중량% VFB의 식단에 추가된 65 중량% 수크로스와 함께, 두 그룹 중 하나에 그룹당 n=10으로 할당하였다. 식단은 약 3902 음식물 kcal 전체에 대해, 3.90 kcal/g인 셀룰로스 식단 및 3.98 kcal/g인 VFC 식단으로 거의 등에너지성이다. 전체 43주 동안 셀룰로스 (시작 체중 214.7 ± 2.6　g) 또는 VFB (시작 체중 220.8 ± 3.5　g)와 함께 높은 수크로스 식단을 무제한으로 래트에 급여하였다.
연구 측정: 음식 소비 (매일), 체중 (매주), 및 혈청 트리아실글리세롤 (TAG) (IDEXX에 의해 분석됨, North Grafton, MA), 혈당 (Acensia Elite 글루코meterer를 통해) 및 혈청 인슐린 (Ani Lytics, Gaithersburg, MD)의 측정을 위한 혈액 샘플의 매주 수거는 연구를 통해 이루어졌다. 헤모글로빈 당화 및 혈액 요소 질소를 측정하기 위한 최종 혈액 분석으로 연구를 결론 내렸다. 제한된 검시를 다음과 같이 수행하였다. 수단 블랙 조직화학법을 사용하여 지질 함량의 분석을 위해 간의 한 엽을 급속냉동 (snap-frozen)하였다. 간의 한 엽을 헤마톡실린 및 에오신 염색 후 고정하였다.
통계학적 방법: 체중 증가량을 연구를 통해 체중 증가량의 차이에 대해 반복 측정 ANOVA 및 한 방향 ANOVA를 사용하여 통계학적 차이에 대해 분석하였다. 다양한 비교에 대한 알파 오차율을 Bonferroni 교정을 사용하여 조절하였다. 비-파라미터성 데이터에 대한 Kruskall-Wallis 테스트로 조직학 점수를 측정하였다.
결과:
도 9는 43주 동안 Sprague-Dawley 수크로스 먹인 래트의 체중 증가량 및 혈청 트리아실글리세롤 (TAG)에 대한 과립화된 VFC (PGX?) 또는 셀룰로스 다이어트의 효과를 도시한다 ("*" 부호는 p<0.05를 나타낸다; "**" 부호는 p<0.01를 나타낸다; "***" 부호는 p<0.001). 초기 체중은 VFC 먹은 그룹 (215　± 3 그램)과 셀룰로스 먹인 그룹 (221　± 3　g) 사이에 다르지 않다.도 9에 나타난 바와 같이, 수크로스 풍부한 식단 때문에 두 그룹에서 시간이 지남에 따라 체중이 증가하였지만, 체중 증가량은 셀룰로스 먹은 그룹 과 비교하여 VFC 먹은 그룹에서 연구± 시작부터 22주까지 유의적으로 감소되었다 (p<0.05). 반복 측정은 감소된 체중 증가량을 나타내는 VFC 먹은 래트의 체중 증가량에 대한 유의한 치료 효과를 나타내었다 (p=0.04). 최종 체중이 그룹들 (p=0.20; 각각, VFC 및 셀룰로스 먹은 그룹에 대해 660 ±22 대 645 ± 26　g)사이에서 유의적으로 다르지 않지만, VFC 래트는 연구 종료시에 7% 낮은 체중을 유지하였다. VFC 먹은 래트에 대한 음식 소모는 셀룰로스 먹은 래트와 유사하였다 (데이터 미도시).
도 9에 더 나타난 바와 같이, 혈청 TAG 레벨은 연구의 초기 부분에 대해 안정하지만, 43주에 연구 종료까지 시간이 지남에 따라 셀룰로스 먹은 그룹에서 증가하였다. 반대로 VFC 먹은 래트는 셀룰로스 먹은 그룹보다 유의하게 더 낮은 혈청 TAG 레벨을 나타내었다 (p<0.01). VFC 먹은 그룹은 셀룰로스 먹은 그룹의 베이스라인 TAG 레벨과 유의하게 다르지 않은 베이스라인 TAG 레벨을 갖고 있었다.
VFC 함유 식단을 먹은 래트는 셀룰로스 식단을 먹은 래트보다 더 작은 지방간을 나타내었다 (수단 블랙 염색에 의해 측정됨). 지질 함량을 수단 블랙으로 간 조직 섹션을 염색함으로써 결정하였고, 가장 심각한 것을 5로 하는, 0 내지 5의 스케일로 슬라이드를 수단 블랙 양성 액포의 존재에 대해 반-양적으로 등급을 나누었다. 심각도 점수는 셀룰로스 처리된 그룹에 대해 3.9 ± 0.3 및 VFC 처리된 그룹에 대해 2.7 ± 0.4였고, 이것은 유의적으로 달랐다. 차이가 통계적으로 유의하지 않았지만 (거대수포성 공포에 대해 p<0.07 및 미세수포성 공포에 대해 p<0.11, 데이터 미도시), VFC 먹은 래트에서 간세포 손상의 감소에 대한 강한 성향은 또한 셀룰로스 먹은 그룹에서 관찰되었다. 혈당 및 인슐린 레벨을 연구를 통해 매주 관찰하였고 바뀌지 않았는데, 이것은 이 동물 모델에 대해 기대된다 (A.M. Gadja et　al., An . Lab News 13:1-7 (2007)).
논의:
비만의 식단-유발 모델에서 예상된 바와 같이, Sprague-Dawley (SD) 수크로스 먹은 래트는 약 18-25주까지 빠르게 체중이 증가하였고, 이 시간에 체중은 성장의 더 느린 속도로 안정화되었다. 도 9에 나타난 바와 같이, 빠른 체중 성장 기간 중에, VFC 과립은 셀룰로스와 비교하여 연구의 후반부 (즉, 더 많은 나이의 래트)에서 더 느린 성장 단계 중에 관찰된 더 작은 감소로 체중 변화량을 유의하게 감소시켰다. 도 9에 더 나타난 바와 같이, 혈장 TAG는 더 나이 많은 래트의 상기 베이스라인을 증가시켰고, VFC는 TAG의 이 증가가 유의적으로 둔화되었다. 이 데이터와 일치하게, 조직형태학법에 의해 측정된 바와 같이 지방간은 VFC 먹은 동물에서 셀룰로스 먹은 동물과 비교하여 유의하게 감소되었다.
비-분해 가능한 섬유질을 소모하는 대상체에서 체중 감소는 다음 중 하나 이상과 관련된 것으로 생각된다: 감소된 음식 섭취, 변화된 포만감 호르몬 반응, 위 둔화에 이은 감소된 영양소 흡수 및/또는 섬유질에 의한 영양소 흡수 (N.C. Howarth et　al., Nutr . Rev . 59:163-169 (2001); A. Sandberg et　al., Am . J. Clin . Nutr . 60:751-756 (1994); G. Grunberger et　al., Diabet . Metab . Res . Rev . 23:56-62 (2006); 및 J.R. Paxman et　al., Nutr . Res . 51:501-505 (2008)). 본 연구에서, 음식 소모의 약간의 감소가 관찰되었고, 그러므로 이 사실은 VFC 먹은 동물의 관찰된 체중 감소에 기여하지 않을 것이다. 어느 특정 이론과 결부되기를 바라지 않지만, 둔화된 위 비우기 및 먹은 음식의 감소된 영양소 흡수는 체중 감소의 원인일 수도 있는데, 이것은 증가된 글루카곤-유사 단백질 (GLP-1)의 분비 때문일 수도 있다 (N.N. Kok et　al., J. Nutr . 128:1099-1103 (1998)).
간 또는 혈장 TAG의 감소는 많은 식이 섬유 연구의 주제였고, 결과는 다양하다 (W.U. Jie et　al., Biomed . Environ Sci . 10:27-37 (1997); A. Sandberg et　al., Am . J. Clin . Nutr . 60:751-756 (1994); R. Wood et　al., Metab . Clin . Exp. 56:58-67 (2007); 및 N.M. Delzenne et　al., J. Nutr . 129:1467S-1470S (1999); P. Rozan et　al., Br . J. Nutr . 98:1-8 (2008)). 모든 연구가 섬유질 타입 사이에 관찰되는 일부 차이로, 현저히 감소되는 TAG 흡수를 나타내지 않는다. 예를 들어, Delzenne 및 Kok에 의한 연구는 올리고프럭토스가 프럭토스 먹은 래트에서 지질 생성을 감소시킴으로써 지방간을 감소시킨다는 것을 나타내었다 (N.M. Delzenne et　al., J. Nutr . 129:1467S-1470S (1999)). 유사하게, Kok et　al.은 올리고프럭토스 섬유질에 의해 유발된 GLP-1 분비는 또한 감소된 지질 생성 및 지방 동원에 대한 원인일 수도 있다 (N.N. Kok et　al., J. Nutr . 128:1099-1103 (1998)). 어느 특정 이론과 결부되기를 바라지 않지만, 감소된 지질 생성 및 감소된 지방 흡수 둘 다는 본 연구의 VFC 먹은 동물에서 관찰된 TAG 감소에 역할을 한다. 감소된 영양소 흡수는 음식 소모의 감소 없이 관찰된 체중 증가량의 감소를 설명할 것이다.
결론으로서, 이 연구는 VFC 과립은 현재의 약학이 낮추는데 아주 효과적이지 않은, Sprague-Dawley (SD) 수크로스 먹은 래트 모델에서 혈청 TAG를 유의하게 낮춘다는 것을 입증한다. 감소된 지방간은 감소된 혈청 TAG와 유사하고, 이러한 성질은 VFC 과립을 과지질혈증뿐만 아니라 체중 감소를 포함하는 대사 증후군의 다른 양태에 걸린 환자를 치료하는데 추가되는 유용한 음식으로 만든다.
실시예 3
이 실시예는 과립화된 점성 섬유질 복합체 (VFC 과립) (섬유질 복합체 PolyGlycopleX? (PGX?)로 또한 나타남)를 포함하는, 단기간 체중 감소 및 연관된 위험 인자들에 대한 식이 섬유 조성물의 효과를 입증하는, 과체중 및 비만 성인 사람 대상체의 연구를 설명한다.
근거: 세계 건강 기구에 발표된 최근 데이터에 따르면, 비만은 만성 질환에 영향을 받는 10억 이상의 과체중 성인으로 세계적인 유행병의 부분에 도달하였다 (www.who.int, accessed 3/15/08). 관상 동맥 질환 및 뇌졸중, 인슐린 저항, (대사 증후군), 타입 II 당뇨병, 고혈압, 및 암은 모두 잘 알려진 지나친 체중의 의학적 합병증이다 (K.　Fukioka Obesity Res 10(Supp　12):116S-123S (2002)). 게다가, 최근의 유행병적 연구는 성인 비만이 기대 수명의 감소와 연관된다는 것이 확인되었다. 본 연구는 40살의 남자 및 여자 비-흡연자는 비만 때문에 그들의 삶에서 각각, 평균 7.1 및 5.8년을 손해 본다는 것을 나타내었다 (A. Peeters et　al., Ann . Intern . Med . 138:24-32 (2003)). 후자의 위험 인자를 감안할 때, 다수의 치료적 방해는 수술, 약 치료, 및 다이어트 및 운동과 같은 생활 스타일 변화를 포함할 수 있는 과체중/비만에 대해 사용가능하다.
어느 무게 조절 프로그램의 중요한 식단 계획은 높은 섬유질 음식 , 특히 점성 가용성 섬유질을 함유하는 음식들 또는 음식의 유의한 양을 섭취하는 것을 수반한다 (K.M. Queenan et　al., Nutr . J. (2007)). 평균 미국 시민들은 하루에 약 2.4 그램-매일 섭취할 것을 권장하는, 5 내지 10 그람의 식이 점성 가용성 섬유질의 반의 점성 가용성 섬유질을 소모한다 (T.A. Shamliyan et　al., J. Family Practice 55:761-69 (2006)).
식단만으로 가용성 섬유질의 이상적인 양을 얻기는 어렵기 때문에, 음식 물질로 사용되거나 가용성 섬유질의 일정하게 높은 섭취가 허용되는 보충제로서 섭취될 수 있는 가용성 섬유 농축물의 명확한 필요가 있다. PGX? (PolyGlycopleX?) 로 또한 나타나는, 과립화된 VFC는 EnviroSimplex?로 나타나는 과정을 사용하여 글루코만난, 잔탄 검, 및 알긴산염을 반응시킴으로써 제조되는, 새롭고, 고점성인 다당류 복합체이다. 결과로 얻은 다당류 복합체 (α-D-글루쿠로노-α-D-만노-β-D-만노-β-D-글루칸), (α-L-글루쿠로노-β-D-만누로난), β-D-글루코-β-D-만난, α-D-글루쿠로노-α-D-만노-β-D-만노-β-D-글루코), (α-L-글루쿠로노-β-D-만누로노), β-D-글루코-β-D-만난은 실시예 5 및 6에 설명된 구조적 분석에서 입증된 바와 같이, 새로운 독립체이고, 현재 알려진 어느 섬유질 중 가장 높은 점성 및 보수력을 가진다.
이 실시예는 체중 감소, 신체 용적 지수 (BMI), 뿐만 아니라 과체중 및 비만 성인의 콜레스테롤, 저밀도 지질단백질 (LDL) 콜레스테롤, 고밀도 지질단백질 (HDL), 트리글리세리드, 공복 인슐린, 공복 글루코스, 및 14주 기간 동안 2시간 당부하검사를 포함하는 심대사 위험 인자에 대한 VFC 과립화 및 보통의 라이프스타일 변화의 효능을 검사하기 위해 수행된 연구를 설명한다.
방법:
참가자:
약 25　kg/m2 to 36　kg/m2의 범위의 신체 용적 지수 (BMI)를 가진, 20 내지 65살의, 29명의 활발하지 않은 성인 전체 (23명 여자; 6명 남자)를 지역 신문에 게재된 일련의 광고를 통해 참가시키기 위해 초대하였다. 대상체는 이 프로그램에 참가하기 전 정보 제공을 동의하였다. 1975년 헬싱키 선언 (Helsinki Declaration)에 발표된 윤리적 표준에 따라 관찰 분석을 수행하였다.
인체측정학 및 다른 측정: 참가자들을 표준 의학용 줄자를 사용하여 키 (cm), 체중 (킬로그램), 및 허리-엉덩이 측정값 (cm)에 대해 격주마다 평가하였다. 허리-엉덩이 측정값을 일회용 종이 가운을 입은 대상체의 약 배꼽 위 2.2 cm 및 큰 전절 (trochanter)의 엉덩이 주변의 일정한 해부학적 위치에서 얻었다. 퍼센트 신체 지방을 베이스라인에서 (연구 시작 전) 및 그 후 매 2주마다 생체 전위 임피던스 테스트 (bioelectrical impedance test) (RJL Systems, Michigan, USA)를 사용하여 결정하였다. 임피던스 데이터의 컴퓨터화된 분석을 신체 용적 지수 (BMI) 및 퍼센트 신체 지방을 결정하기 위해 활용하였다.
식단 및 보충물 : 각각의 지원자는 내과의사로부터 건강한 식사, 체중 감소 및 운동에 대한 일반적인 지시를 받았다. 게다가, 식단 및 운동 상담 시간을 14주 동안 2주 마다 그룹에 제시하였다. 이 설명에서 강조점은 칼로리 계산에 있지 않지만, 주로 부분 조절 및 저지방, 저당화 지수 식단을 따라하고 유지하는 방법에 초점을 맞추었다. 일반적인 추천은 또한 전체 체중 감소를 증가시키는 운동의 다양성, 타입, 및 시기 (예를 들어, 힘 및 심혈관 유산소 운동)에 초점을 맞춘 이 프로그램에 포함되었다. 게다가, 대상체는 음료 또는 음식 (예를 들면, 지방이 없는 요거트)에 추가될 수 있는 섬유질 복합체 PolyGlycopleX? (PGX?)로 또한 나타나는, 과립화된 접성 섬유질 복합체 (VFC) (곤약/잔탄/알긴산염 (70:13:17) 과립과 함께 제공된다.
5 그램의 VFC 과립은 각 식사 전 5 내지 10분에 500 ml의 물과 함께 섭취되는 양이다. 10 내지 15 그램의 과립화된 VFC/일의 하루 총 섭취량을 위해, 14주 동안 하루에 2 내지 3번 섭취되는 것이었다.
혈액 수거 및 실험실 생화학 분석: 모든 실험실 측정은 캐나다 브리티쉬 콜럼비아의 독립적인 실험실에 의해 수행되었다. 베이스라인에서 (연구 시작 전), 대상체에 다음 테스트에 포함되는 피를 뽑는 과정 전 10시간 동안 공복일 것을 요구하였다: 전체 콜레스테롤, 트리글리세리드, HDL, LDL, 글루코스, 인슐린, 및 2-시간 인슐린. 75 그램 구강 당부하검사를 또한 실험실에 의해 결정된 바와 같이 기준 및 과정에 따라 수행되었다. 비정상적인 위험 인자를 가진 것들만 14주에 마지막의 검사 파라미터를 사용하여 재-검사되었다.
통계학적 분석: 키, 체중, BMI, % 신체 지방, 및 처리 전 및 후 다양한 검사치를 포함하는 여러 타입의 변수를 평가하기 위해 컴퓨터화된 통계학적 분석을 대응 t-테스트를 사용하여 수행하였다. 0.05 미만 p-값을 갖는 변수들에서 유의한 결과를 얻었다.
결과:
체중 감소 및 다른 인체 측정 파라미터: VFC를 사용하는 14주 동안, 그룹 체중 (-5.79 ± 3.55 kg), 허리 측정 (-12.07 ±5.56 cm), % 신체 지방 (-2.43 ±2.39 %), 및 BMI (-2.26 ±1.24 kg/m2)에서 유의한 감소가 있었다. 하기 표 4 및 5에 전체 결과를 나타낸다.
표 4: 그룹 1: 조합된 남자 및 여자
Figure pct00005
*0주로부터 p < 0.05
a=체중은 킬로그램이다 (kg)
b=허리 및 엉덩이는 센티미터이다 (cm)
표 5: 조합된 그룹 모두에 대한 BMI
Figure pct00006
*0주로부터 p < 0.05
c=kg/m2의 BMI
유사하게, 두 성별은 개별적으로 하기 표 6 및 표 7에 나타난 바와 같은 테스트된 체중 감소에서 유의한 감소를 입증하였다. 하기 표 7에 나타난 바와 같은, 남자는 14주 연구를 통해 평균 8.30 ±2.79 kg이 감소되었다 (평균 7.43% 체중 감소). 도 6에 나타난 바와 같이, 여자는 14주 연구를 통해 평균 5.14 ±3.49 kg이 감소되었다 (평균 6% 체중 감소).
표 6: 그룹 1: 여자 (n=23)
Figure pct00007
* 0주로부터 p < 0.05
a=체중은 킬로그램이다 (kg)
b=허리 및 엉덩이는 센티미터이다 (cm)
표 7: 그룹 2: 남자 (n=6)
Figure pct00008
* 0주로부터 p < 0.05
a=체중은 킬로그램이다 (kg)
b=허리 및 엉덩이는 센티미터이다 (cm)
지질 레벨: 연구 시작 전 얻은 베이스라인 값과 비교하여, VFC 사용 14주 후, 대상체는 전체 콜레스테롤 값의 19.26%의 평균 감소 (n　=　17; 0주로부터 p　<　0.05) 및 LDL 콜레스테롤 값의 25.51%의 평균 감소를 갖는다 (n　=　16; 0주로부터 p　<　0.05). 도 8에 나타난 바와 같이, 이 연구에서 관찰된 트리글리세리드의 감소 및 HDL 콜레스테롤 값의 증가에 대한 성향을 관찰하였지만, 관찰된 차이는 통계적으로 유의하지 않다.
공복 인슐린 및 글루코스: VFC 사용 14주 후, 연구 시작 전 얻은 베이스라인 측정값과 비교하여, 본 연구의 대상체는 공복 글루코스의 평균 6.96% 감소 (n　=　20; 0주로부터 p　<　0.05), 2시간 당부하의 평균 12.05% 감소 (n　=　21; 0주로부터 p　<　0.05), 및 공복 인슐린 레벨의 평균 27.26% 감소 (n　=　17; 0주로부터 p　<　0.05)를 경험하였다.
표 8: VFC (PGX?)로 14주 실험 동안 얻은 전체 실험 데이터의 개요
* 0주로부터 p < 0.05; ** 베이스라인으로부터 NS (비유의적인)
자가 보고 저울을 사용하는 효능의 분석: 연구의 끝에 참가자에 의해 완료되는 자가 보고 저울에서, VFC 사용자의 97.7%는 식탐의 제한 및 굶주림의 생성물에 대한 양성 반응을 갖는다는 것을 언급하였다.
테스트 제조의 부작용: 모든 보고된 불만의 대부분을 포함하는 경미한 위장관 (GI) 증상을 갖는, VFC의 사용은 일반적으로 참가자에 의해 잘 참아졌다. 68 퍼센트는 가벼운 GI 증상 (예를 들어, 가스, 복부팽창, 변비, 붉은 변)은 VFC의 시작 후 약 3주 내에 해결된다는 것을 언급하였다. 32 퍼센트의 참가자는 프로그램을 통해 가벼운 GI 부작용에 걸린 것을 발견하였지만, 이것들은 사용을 중단할 정도로 충분하지 않았다. 또한 이 후자의 발견을 확인하는 VFC (PGX?)의 내성에 대한 최근 조절된 연구를 프랑스에서 수행하였다 (I.G. Carabin et　al., Nutrition J. 8:9 (2008)).
논의: 이 실시예에서 설명된 의학적으로 감독된 체중 감소 연구는 14주 기간을 통한 식단 및 육체적인 활성의 일반적인 변화와 함께 VFC 과립의 사용은 과체중 및 비만 대상체에서 심대사 위험 인자의 변형에 이롭다. 전체적으로, 베이스라인으로부터 그룹 체중 (-5.79 ±3.55　kg), 허리 측정 (-12.07 ±5.56　cm), 및 퍼센트 신체 지방 (-2.43 ±2.39%)에서 유의하게 감소하였다. 게다가, 이 후자의 육체적인 변화는 14주의 상대적으로 짧은 기간을 통한 공복 LDL (-25.51%), 공복 글루코스 (-6.96%), 및 공복 인슐린 (-27.26%) 레벨의 유의한 감소에 의해 비교되었다.
14주 기간 동안 평균적으로 남자 (-8.30 ±2.79　kg)가 여자 (-5.14 ±3.49　kg)보다 더 많은 체중이 감소된다는 언급은 흥미롭다. 이 변화는 남은 에너지 소비에 나타나는 기본적인 성 차이에 의한 것으로 돌릴 수 있다. Dr. Robert Ferraro et　al.은 나이, 활동, 및 신체 조성에 대한 통계적 조정 후 활발하지 못한 24시간 에너지 소비는 남자에 비해 여자에서 약 5 내지 10% 낮다는 것을 나타내었다.
감소된 체중 (-5.79 kg)에서 VFC에 의해 얻은 결과는 항-비만 약제 올리스타트 (Xenical?, Alli?)를 섭취한 사람과 비교될 수 있다. 올리스타트는 지방의 억제를 감소시키는 리파제 억제제이다 (J.B. Dixon et　al., Aust . Fam . Physician 35:576-79 (2006)). 조절된 연구에서, 약 올리스타트를 60 mg의 농도로, 16주 기간을 통해 매일 활용한 적당히 과체중인 개개에 대해 가벼운 증상의 391명은 플라세보 그룹의 1.9 kg과 비교하여 3.05 kg이 감소되었다 (J.W. Anderson et　al., Ann . Pharmacother. 40:1717-23 (2006).
VFC 사용은 또한 적당한 비만에 대한 가벼운 증상에 연관된 다른 위험 인자의 감소를 일으켰다. 전체적으로, VFC 치료 14주 후 베이스라인 값으로부터 전체 콜레스테롤 레벨 (-19.26%; -1.09 mmol/L) 및 LDL 콜레스테롤 레벨 (-25.51%; -0.87 mmol/L)의 유의적인 감소 (p　<　0.05)가 관찰되었다. VFC로 얻은 지질 값의 감소는 로바스타틴 (Mevacor™)과 같은 이러한 초기 발생 스타틴제의 사용과 비교될 수 있다. 예를 들어, 로바스타틴 치료 한 달 내에 언급된 한 연구에서, 전체 및 LDL 콜레스테롤은 증가된 콜레스테롤 레벨에서 각각 19% 및 27% 감소되었다 (W.B. Kannel et　al., Am . J. Cardiol .　66:1B-10B (1990)).
게다가, 실시예 1 및 2에 설명된 바와 같이, VFC의 사용은 혈액 지질 레벨을 감소시킬 뿐만 아니라, 대사 증후군의 초기 단계의 발달 및 진행을 개선하는데 사용될 수도 있다. 고혈압 및 이상지질혈증에 따른 내장 비만, 혈청 글루코스, 및 인슐린 레벨의 증가는 총괄적으로 대사 증후군으로 알려진 임상적 상태의 그룹이다 (E.J. Gallagher et　al., Endocrinol . Metab . Clin . North Am . 37:559-79 (2008)). 연구는 대사 증후군에 걸린 사람은 주요 관상 동맥 질환을 경험할 50% 더 큰 위험을 갖는다는 것을 나타내었다 (D.E. Moller et　al., Annu . Rev . Med . 56:45-62 (2005)). 따라서, 체중, 공복의 인슐린, 및 글루코스의 감소는 고통받는 개개에 큰 건강 이익을 제공한다.
이 14주 연구에서, VFC 사용은 89.41　± 44.84 pmol/L 내지 65.04 ± 33.21 pmol/L의 공복의 인슐린 레벨의 감소를 일으킨다 (p < 0.05). 공복의 인슐린의 감소는 향상된 인슐린 민감도를 반영하고 부분적으로 체중 감소에 동반되는 인슐린 민감도의 향상에 따른 증가된 GLP-1 활성 및 감소된 식후 과혈당 때문일 수도 있다 (see G. Reaven et　al., Recent Prog . Horm . Res . 59:207-23 (2004)).
이 발견은 실시예 1에 설명된 Zucker 비만 래트 연구에서 얻은 결과와 일치하고, 라이프스타일 변형과 관련된 VFC의 치료적 사용은 비만 및 특정 심대사 위험 인자로 고통받는 사람들에게 실질적인 이점이라는 것을 제안한다. 비만 및 향상된 콜레스테롤 레벨의 치료에 사용 가능한 다른 타입의 표준 의학적 간섭과 달리, VFC 사용은 최소의 부작용과 연관된다. 그것의 치료적 효능에 따른, 이 이로운 안전성 프로파일은 VFC가 과체중/비만이고, 증가된 콜레스테롤 레벨을 갖고 및/또는 인슐린 저항성인 사람에 대한 제 1선의 치료로서 생각되어야 한다는 것을 제안한다.
실시예 4
이 실시예는 탈지유 과립화을 먹은 대조군 대상체와 비교하여 점성 섬유질 복합체를 공급한 후 증가된 혈장 PYY 레벨 및 증가된 배설물 단쇄 지방산 (SCFA)를 타나내는 정상 체중인 건강한 사람의 연구를 설명한다.
근거:
많은 식이 섬유는 소화관 포만 호르몬 분비의 증가 및 장기능의 향상을 포함하는, 많은 건강상 이점을 갖는다는 것이 나타났다 (R.A. Reimer et　al., Endocrinology 137:3948-3956 (1996); Reimer and Russell, Obesity 　16:40-46 (2008); P.D. Cani et　al., Br . J. Nutr . 92:521-526 (2004); T.C. Adam and R.S. Westererp-Plantenga, Br . J. Nutr . 93:845-851 (2005)). 유일하게 알려진 식욕 증진 펩티드인, 그렐린은 굶주림과 연관되지만, 글루카곤-유사 펩티드-1 (GLP-1) 및 펩티드 YY (PYY)는 음식 섭취의 감소를 수반하는 식욕 억제 펩티드이다 (Wren and Bloom, Gastroenterology 132:2116-2130 (2007)).
식이 섬유의 이점을 조절하는 메카니즘이 완전히 이해되지 않지만, 단쇄 지방산 (SCFA)의 생산은 효과의 일부를 매개한다고 생각된다. SCFA, 및 주로 아세테이트, 부티레이트, 및 프로피오네이트는 발효 가능한 식이 섬유의 혐기성 발효에 의해 대장에서 생산되고, 포만 호르몬의 자극 및 혈청 콜레스테롤의 조절과 관련되었다.
본 연구의 목적은 VFC (PGX?) 또는 대조군 (탈지유 과립화)을 21일 동안 소비한 후 건강한 대상체에서 내장 포만 호르몬 GLP-1, PYY 및 그렐린의 레벨뿐만 아니라 배설물의 DCFA 농도를 검사하기 위한 것이었다.
방법:
대상체 : 참가자는 18.5 및 28.4 kg/m2 사이의 BMI (즉, 정상 체중)를 갖는 18 및 55살 사이의 건강하고, 비흡연가 남성 및 여성이었다.
연구 디자인: 임의적인, 이중 맹검법의, 플라세코 조절된 시험을 다음과 같이 수행하였다:
참가자는 임의적으로 두 그룹으로 분할하였다:
그룹 1 (n=27)은 테스트 생성물인 점성 섬유질 복합체 (VFC) (곤약/잔탄/알긴산염 (70:13:17)) 과립 (즉, Inovobiologic Inc., Calgary, CA에 의해 공급되는 PGX?로 상업적으로 알려진, 섬유질 블렌드를 복합체를 형성하기 위해 가공하였다)을 소비하였다.
그룹 2 (n=27)는 대조군 생성물 (테스트 생성물과 유사한 색깔 및 질감의, 탈지유 과립화)을 소비하였다.
대조군 및 테스트 생성물을 CRID Pharma, France의 상업적인 아침 씨리얼 10 g과 사전 혼합하였고, 상업적으로 사용 가능한 플레인 요거트 135 ml과 함께 포장하였다. 참가자는 섭취 전 요거트 및 사전 혼합된 생성물을 혼합하였다.
연구의 처음 7일 동안, 참가자는 2번의 주요 식사중 일부로서 하루에 2번 2.5 g의 생성물 (테스트 또는 대조군)을 소비하였다. 연구의 마지막 14일 동안, 참가자는 하루에 2번 5 g의 생성물 (테스트 또는 대조군)을 소비하였다. 연구의 기간 동안, 참가자는 섬유질 풍부한 음식을 삼가하고 하루에 약 10 g으로 식이 섬유의 섭취를 제한하도록 지시되었다. 사전 혼합된 생성물 및 요거트를 제외하고, 모든 다른 음식을 구입하였고 보통 식단으로서 참가자들에 의해 준비되었다.
평가: 참가자는 4번의 별도의 방문시 수행된 평가를 갖게 되었다. 선별 (방문 0, 선별 방문, "VO")은 육체적인 시험을 수반하였다.
혈액 샘플: 공복의 혈액 샘플을 방문 1, 연구의 0일 (베이스라인)에 수거하였다. 방문 2=생성물 5 g 섭취 일 주일 후인, 연구의 7일. 방문 3=생성물 10 g 섭취 후 2주 후인, 연구의 21일. 각각의 방문 중, 디프로틴 A (0.034　mg/ml 혈액; MP Biomedicals, Illkirch, France)가 추가된 EDTA 처리된 튜브에 혈액을 수거하였고 3000 rpm으로 4℃에서 12분 동안 원심분리하였다. 혈장을 분석 전까지 - 80℃에 보관하였다.
대변 수거: 베이스라인에서 (V1, 0일), 5 g/d의 생성물 섭취 1주 후 (V2, 8 ± 1일), 및 10 g/d의 생성물 섭취 2주 후 (V3, 22 ± 2일), 대상체로부터 배설물 샘플을 얻었다. 대상체는 각각의 계획된 방문 전 48시간 내에 하나의 배설물 샘플을 수거하였다. 분석을 위해 약 5 g의 샘플을 드라이아이스에 옮겨두었다.
혈장 분석:
GLP -1: LINCO research (Millipore, St. Charles, MO)의 ELISA 키트를 사용하여 활성 GLP-1을 정량하였다. 제조사에 따라, 검정 민감도는 100　μl 샘플 크기에 대해 2 pM이다. 4 pM에서 내부 검사 CV는 8%이고 사이 검사 CV는 13%이다 (Millipore, St. Charles, MO).
PYY 및 그렐린 : Phoenix Pharmaceuticals, Inc. (Burlingame, CA)의 ELISA 키트를 사용하여 PYY 및 그렐린을 정량화하였다. PYY에 대한 검정 민감도는 0.06　ng/ml이었고 그렐린에 대한 민감도는 0.13　ng/ml이었다. 내부 검정 CV은 두 검정에 대해 5% 미만이었고 사이 검정 CV는 PYY 및 그렐린에 대해 각각, 14% 미만 및 9% 미만이었다.
인슐린: Milliport (St. Charles, MO)의 ELISA 키트를 사용하여 인슐린을 측정하였다. 7% 미만 내부 검정 CV 검정 및 11.4% 미만 사이 검정의 민감도는 2 μU/ml이다.
통계학적 분석: 결과는 평균 ± 표준평균오차로 나타낸다. 3번의 방문시 펩티드 레벨을 Bonferroni 조정으로 반복되는 ANOVA에 의해 분석 (파라미터로서 시간 (V1, V2, V3) 및 식단의 이중 분석)하였다. Pearson 상관 계수를 사용하여 2개의 파라미터 사이의 연관성을 계산하였다. 공식 [HOMA-IR=공복의 인슐린 (μU/ml) X 공복의 글루코스 (mmol/l)/22.5]을 사용하여 인슐린 저항에 대한 항상성 모델 평가를 계산하였다. SPSS v 16.0 소프트웨어 (SPSS Inc. Chicago IL)를 사용하여 데이터를 분석하였다.
배설물 분석: Van Nuenen et al., Microbial Ecology in Health and Disease 15:137-144 (2003)에 따라 SCFA 측정을 수행하였다. 간단히 말하면, 배설물 샘플을 원심분리하였고 포름산 (20%), 메탄올 및 2-에틸 부티르산의 혼합물 (내부 표준, 메탄올에 2 mg/ml)을 맑은 상층액에 추가하였다. 0.5 ml 샘플을 자동화된 샘플러를 사용하는 Chrompack CP9001 가스 크로마토그래프의 GC-컬럼 (Stabilwax-DA, length 15 m, ID 0.53 mm, 필름 두께 0.1 mm; Varian Chrompack, Bergen op Zoom, The Netherlands)에 주입하였다. 맑은 상층액에서 Cobas Mira 플러스 자동분석기 (Roche, Almere, The Netherlands)로 L- 및 D-락테이트 둘 다를 효소학적으로 결정하였다. 미소전극을 사용하여 pH를 측정하였다. 최소 2일 동안 110℃에서 서브 샘플을 건조함으로써 건조물을 측정하였다.
통계학적 분석: 결과는 평균 ± 표준평균오차로 나타낸다. 3번의 방문시 내부-그룹 인자로서 방문 및 사이 그룹 인자로서 치료를 사용한 반복 측정 ANOVA에 의해 SCFA를 분석하였다. Pearson의 상관계수 분석을 사용하여 SCFA 및 다른 측정된 결과 (포만 호르몬, 글루코스, 인슐린 및 HOMA-IR) 사이의 상관계수를 결정하였다. 유의성은 P=0.05로 맞추었다.
결과: 54명의 대상체 (25명의 남성 및 29명의 여성)가 연구에 참가하였고 모두 4번의 방문 (V0-V3)에 참석하였다. 아무 대상체도 연구를 중단하지 않았고, 생성물을 잘 참아졌다. 대조군 생성물을 받은 대조군 (11명의 남성, 16명의 여성)은 30.9 ± 10.8의 평균 나이를 가졌고 22.8 ± 2.4의 초기 BMI를 가졌다. 테스트 생성물 (VFC)을 받은 그룹은 32.3　±10.3의 평균 나이를 가졌고 22.7　± 2.1의 초기 BMI를 가졌다. 그룹들 사이에 베이스라인 임상적 및 생화학적 특징의 차이는 없었다.
V1, V2 및 V3의 체중, 글루코스, 인슐린 및 HOMA-IR 점수는 하기 표 9에 제공된다.
표 9: 대조군 또는 VFC를 소비하는 참가자의 체중, 및 생화학적 파라미터
Figure pct00010
값은 평균 ± 표준평균오차 (n=27/그룹)로 나타낸다. N/M=미결정. 성별이 반복 측정 ANOVA의 공변으로 포함될 때, 방문 사이의 차이는 테스트 그룹에 대한 HOMA-IR에 대해 유의적이었다 (p=0.024).
하기 표 9에 나타난 바와 같이, 대조군 및 테스트 그룹에서 V1 및 V3 사이에서 유의한 체중 변화는 없었다. 공복의 혈장 글루코스는 시간이 지남에 따라 또는 그룹 사이에서 변하지 않는다. 테스트 그룹 (즉, PGX?)에서 V1 및 V3 사이에서 공복의 인슐린의 14% 감소가 있었지만, 이 차이는 대조군과 통계적으로 다르지 않았다. HOMA-IR 점수에 대한 평균 원점수 및 퍼센트 변화는 대조군에 대해 -0.04 또는 -3.6 및 테스트 그룹에서 -0.21 또는 -18.3%이었다. HOMA-IR에서 퍼센트 감소는 대조군보다 테스트 그룹에서 유의적으로 더 컸다 (P=0.03). 반복 측정 ANOVA는 방문의 효과에 대해 P=0.067를 나타내었다. 성별이 반복 측정 ANOVA의 공변으로 포함될 때, 방문 효과는 통계적으로 유의적이었다 (p=0.024).
독립적으로 분석될 때, V1 및 V3 사이에서 남성은 여성 (P=0.042)보다 HOMA-IR 점수의 더 큰 감소를 나타내었다. 남성 참가자의 대조군 및 테스트에 대한 HOMA-IR의 감소는 유사하다 (-0.36 ± 0.20 및 -0.31 ± 0.18, 각각). 하지만, 여성 HOMA-IR 점수는 대조군에서 증가되었고 (+0.18 ± 0.17) 테스트 그룹에서 감소되었다 (-0.08 ± 0.19).
방문을 통한 공복의 GLP-1 레벨 및 그룹 사이의 유의적인 차이는 없었다 (데이터 미도시).
도 10a는 V1 (0일), V2 (14일) 및 V3 (21일)에서 모든 참가자 (n=54)에 대하여 건강한 성인의 공복의 PYY에 대한 대조군 및 VFC의 효과를 도시한다. 값은 평균 ± 표준평균오차로 나타낸다. 도 10a에 나타난 바와 같이, 반복 측정 분석은 공복의 PYY에 대한 방문의 통계적으로 유의한 효과 (P=0.004)를 나타내었다. 도 10b에 나타난 바와 같이, 도 10a에 나타난 결과가 BMI에 의해 계층화될 때, BMI<23인 참가자들은 방문 (P=0.03) 및 치료 (P=0.037)로 인한 PYY 레벨의 유의적인 차이를 나타내었다. 분산분석은 연구의 끝에 테스트 그룹 대 대조군에서 유의적으로 더 높은 레벨의 PYY를 나타내었다 (P=0.043). 증가된 PYY 레벨은, 그것이 감소된 음식 섭취와 연관된 식욕 억제 호르몬이기 때문에, 유리하다는 것을 언급한다.
도 10c에 나타난 바와 같이, 반복 측정 ANOVA는 공복의 전체 그렐린 레벨에 대한 방문 (P<0.001) 및 치료 (p=0.037)의 유의적인 효과를 나타내었다. 도 10c에 나타난 바와 같이, 89.7　± 20.0 및 97.7　± 26.6 pmol/I의 감소는 대조군 및 VFC 처리된 테스트 그룹에서 각각, 관찰되었다.
PYY는 V2에서 글루코스와 음성 상관관계가 있다 (r=-0.27, P=0.046). 또한 V1 및 V2에서 그렐린 및 인슐린 사이 (r　=　-0.28, P=0.038 및 r=-0.31, P=0.022, 각각) 및 V1 및 V2에서 그렐린 및 HOMA 사이 (r=-0.27, P=0.052 및 r==0.28, P=0.041, 각각)에서 유의적인 음성 상관관계가 있다.
배설물의 SCFA 및 락테이트 :
하기 표 10에 나타난 바와 같이, 아세테이트의 농도는 VFC (PGX?) 대 대조군 (P=0.01)과 함께 유의적으로 더 높았다. V1 (베이스라인; p=0.286) 또는 V2 (p=0.096)에서 그룹 사이에서 아세테이트 농도의 차이가 없지만, 농도는 V3에서 대조군보다 VFC (PGX?)에서 유의적으로 더 높았다 (p=0.018). 그룹 사이에서 프로피오네이트, 부티레이트, 발러레이트, 카프로에이트, 또는 락테이트 농도에서 유의적인 처리 차이는 없었다. 반복 측정 분석은 VFC (PGX?) 대 대조군 (P=0.06)을 소비하는 대상체에서 V3에 더 높은 전체 SCFA로 확인되는 전체 SCFA에 대해 유의적인 치료 효과 (P=0.03)를 나타내었다. V1 및 V3 사이에서 감소하는 두 그룹의 배설물의 pH (0.02)에 대한 방문의 유의적인 효과가 있었다.
포만 호르몬, 인슐린 및 글루코스의 상관관계
혈장 그렐린, PYY, GLP-1, 인슐린, 글루코스, 및 HOMA-IR의 레벨의 분석 결과는 상기 표 9에 나타난다. 하기 표 10에 나타난 바와 같이, V3에서 공복의 그렐린 및 프로피오네이트 사이에 유의한 음성 상관관계가 있었다 (r=-0.29; P=0.03). 베이스라인 및 최종 방문 사이에서 프로피오네이트의 변화를 V3-V1로 계산하였고 델타 프로피오네이트로 나타내었다. 델타 프로피오네이트는 델타 인슐린 (r=-0.26; P=0.05) 및 델타 HOMA-IR (r=-0.25; P=0.07)와 음성 연관되었다.
표 10: VFC (PGX?) 또는 대조군 생성물 보충 후 대상체에서 단쇄 지방산 (SCFA) 및 락테이트의 배설물 농도
Figure pct00011
값은 평균 ± 표준평균오차 (n=27/그룹)로 나타낸다 (n=27/그룹). 방문 3 (V3)에서 부호 *는 대조군 및 VFC (PGX?) 사이의 유의한 차이를 나타낸다. 부호 † 는 방문 3 (V3)에서 대조군 및 VFC (PGX?) 사이의 차이에 대한 추세 (p=0.06)를 나타낸다.
논의
혈장 PYY 레벨의 분석
이 실시예에 설명된 연구의 결과는 VFC 사용이 대조군 생성물과 비교하여 공복의 PYY의 레벨을 증가시키고 이것은 BMI < 23인 참가자에서 통계적으로 유의하다. PYY의 혈장 농도는 전형적으로 과체중 및 비만인 사람에서 감소되고 (R.L. Batterham et　al., Nature 418:650-654 (2002)), PYY의 손상된 분비는 비만의 발달을 촉진하고 및/또는 체중 감소를 저해할 수도 있다.
본 연구의 대조군의 참가자들이 3주 연구의 과정을 통한 공복의 PYY의 적당한 감소를 보이는 동안, VFC를 소비하는 참가자들은 PYY 레벨을 유지하였고, BMI < 23인 사람의 경우, 실제로 PYY 레벨이 증가하였다. 프리바이오틱스의 미생물 발효가 건강한 성인에서 GLP-1 및 PYY 생산의 증가와 연관된다는 것이 최근 나타났다 (P.D. Cani et　al., Am . J. Clin . Nutr . (2009)). 설치류에서, 식이 섬유의 미생물 발효의 부산물인, 단쇄 지방산 (SCFA)은 직접적으로 PYY 분비를 자극한다는 것이 나타났다 (V. Dumoulin et　al., Endocrinology 139:3780-3786 (1998)). VFC의 시작 물질 중 하나인, 곤약 글루코만난은 사람의 아세테이트, 프로프리오네이트, 및 부티레이트의 배설물 농도를 증가시키는 것으로 나타났다 (H.L. Chen et　al., J. Am . Coll. Nutr . 27:102-108 (2008)). 섬유질의 점성은 또한 음식 섭취에 독립적으로 영향을 미친다는 것이 나타났고, 이 효과는 포만 호르몬 분비의 변화에 의해 매개될 수도 있다.
VFC를 함유하는 테스트 생성물을 소비하는 그룹 및 대조군 생성물을 소비하는 그룹 둘 다에서 공복의 그렐린의 레벨은 방문 1 (0일) 및 방문 3 (21일) 사이에서 억제되었다. 그렐린은 음식 섭취를 자극하고 지방 과다를 촉진하기 때문에 (A.M. Wren et　al., J. Clin . Endocrinol . Metab . 86:5992-5995 (2001); M. Tschop et　al., Nature 407:908-913 (2000)), 식사 전 그렐린의 꾸준한 증가를 감소시키는 화합물은 매력적이다. 대조군에 비해 VFC 그룹에서 관찰된 8 pmol/I 더 큰 그렐린의 감소가 본 연구에서 유의적으로 다르지 않을 때, 다른 것은 식이 섬유와 함께 공복 및 식사-관련된 그렐린의 감소를 나타낸다 (예를 들어, Parnell and Reimer, 2009 참조). 식단 화합물이 그렐린을 억제하는 메카니즘은 잘 알려져 있지 않지만, 영양소의 흡수율 및 창자 루멘의 삼투압이 역할을 할 수 있다고 가정되었다 (Overduin et　al., Endocrinology 146:845-850 (2005)). 게다가 이 점에서, VFC는 현재 알려진 개개의 어느 다당류보다 3 내지 5배 더 큰 점성을 갖고, 그러므로 창자를 따라 영양소 흡수가 변할 가능성이 있다는 것이 언급된다.
본 연구에서, 3주의 과정을 통해 두 그룹 사이의 GLP-1의 공복의 레벨에서 검출된 차이는 없었다. 이 GLP-1의 변화의 결핍은 다른 식이 섬유에서 관찰되었다 (T.C. Adam and R.S. Westererp-Plantenga, Br . J. Nutr . 93:845-851 (2005); K.S. Juntunen et　al., Am . J. Clin . Nutr . 78:957-964 (2003)).
본 연구에 참가한 건강한 대상체의 글루코스 및 인슐린의 농도가 정상 범위 내에 있었지만, 테스트 그룹에서 연구의 과정을 통한 인슐린의 14% 감소 및 대조군 그룹에 비해 테스트 그룹에서 HOMA-IR 점수의 5.3배 더 큰 감소는 인슐린 민감도의 근본적인 향상을 나타낼 수도 있는데, 이것은 실시예 1 및 3에서 얻은 결과와 일치한다. 요약하면, 본 연구는 건강한 참가자에서 VFC (PGX?)가 감소된 음식 섭취에 수반되는 소화관 펩티드인, PYY의 공복의 레벨을 증가시킨다는 것을 입증한다.
배설물의 SCFA 레벨의 분석
상기 설명된 바와 같이, 발효 가능한 식이 섬유는 에너지 섭취를 감소시키고 식욕 억제 소화관 호르몬의 분비를 증가시킨다는 것을 나타냈다. 원위 내장의 식이 섬유의 미생물의 발효로부터 SCFA의 발생은 이 조절에서 역할을 하는 것으로 생각된다. 최근, Cani et al., Am J. Clin Nutr 90:1236-1243 (2009)는 호기내 수소 농도 (소화관 미생물 발효의 측정) 및 음식 섭취를 또한 감소시키는 잠재적인 인슐린 분비 촉진 호르몬인, 혈장 GLP-1 사이의 유의적인 상관관계를 입증하였다. 본 연구는 최대 10 g/d의 새로운 기능적 섬유질 복합체 PGX?를 소비하는 대상체에서 전체 SCFA, 특이적으로 아세테이트의 배설물의 농도의 유의적인 증가의 입증에 의한 이 데이터들을 기반으로 한다. 아세테이트, 프로피오네이트, 및 부티레이트는 원위의 소화관에서 생산된 주된 SCFA이다. 창자의 SCFA를 감지하는 자유 지방산 수용체 (FFAR)는 최근 FFAR2 (또한 GPR43으로 알려짐) 및 FFAR3 (또한 GPR41로 알려짐)으로 확인되었다. Ichimura A. et al., Prostaglandins & Other Lipid Mediators 89:82-88 (2009) 참조. FFAR2는 PYY를 발현하는 장내 분비 세포에서 발현되는데, 이것은 SCFA가 PYY 분비를 자극한다는 데이터와 일치한다 (Ichimura et al., 2009). 시험관 내에서, 아세테이트 및 프로피오네이트는 FFAR2 활성화를 통해 3T3-L1 지방세포에서 지방분해를 억제하고 마우스의 생체 내에서 혈장 자유 지방산 (FFA)을 억제하는 것으로 나타났다. Ge H et al., Endocrinology 149:4519-4526 (2008) 참조. 증가된 FFA는 인슐린 저항성 및 이상지질혈증과 연관되었다. 또한 구강으로 투여된 프로피오네이트는 FFAR3을 통해 마우스에서 렙틴을 증가시킨다고 제안하는 증거가 있다 (Ichimura et al., 2009). 음식 섭취를 감소시키기 n이해 중앙으로 작용하는 렙틴에 관하여, 식이 섬유의 미생물 발효에 의해 생산되는 SCFA는 FFAR2 및 FFAR3를 통해 부분적으로 숙주의 대사를 조절하는 것이 가능하다.
본 연구의 결과는 VFC (PGX?) 보충의 3주의 끝에 아세테이트 및 전체 SCFA의 유의한 증가를 입증한다. 보충의 3주를 통해 우리의 대상체에서 체중의 변화는 없지만, 3달의 기간을 통해 올리고프럭토스와 같은 다른 가용성 섬유질에서 나타난 바와 같이 테스트된 최종 투여량 (10 g/d)에서 PGX? 섬유의 소비는 체지방 덩어리를 감소시킬 수 있다 (Parnell J.A. et al., Am J Clin Nutr 89:1751-1759 (2009). 프로피오네이트 및 그렐린 사이의 음성 상관관계는 식이 섬유, 특히 VFC (PGX?)와 같은 고점성인 것들과 연관된 음식 섭취의 전체적인 감소와 맞출 수 있다. 인슐린 및 HOMA-IR의 음성 상관관계는 전체적인 대사의 건강을 향상시키고 인슐린 저항성을 r마소시키기 위한 이 기능적 섬유의 능력과 일치한다.
결론적으로, 이 실시예의 결과는 3주 기간을 통해 고점성이고 가용성 섬유질, VFC (PGX?)의 적당한 투여량을 소비하는 대상체에서 배설물 아세테이트의 증가를 나타낸다. SCFA, 프로피오네이트는 공복의 글레린, 인슐린 및 HOMA-IR과 음성 상관관계가 있었다. 이것은 결장에서 발효를 제안하는 VFC (PGX?)로 배설물의 SCFA 농도의 증가는 잠재적으로 FFAR2 및 FFAR3을 통해 매개되는, 생리학적인 효과의 캐스케이드를 일으킬 수도 있다는 것을 나타내는 우리의 지식에 대한 최초의 보고서이다.
실시예 5
이 실시예는 과립화된 점성 섬유질 복합체 (VFC) (곤약/잔탄/알긴산염 (70:13:17)의 1차 구조의 분석을 설명한다 (즉, PGX?로 상업적으로 알려진, 섬유질 블렌드를 복합체를 형성하기 위해 가공하였다).
근거: 다당류는 글리코시드 히드록실기를 통해 결합된 당 (단당류)으로 구성된 자연적으로 발생한 폴리머이다. 그것들은 분지형 또는 선형일 수도 있고 수천 Dalton 내지 2백만 이상의 범위의 아주 높은 분자량을 가질 수도 있다. 메틸화 분석, 가수분해 및 크로마토그래피 및 가수분해 및 NMR 분광학을 사용하여 과립화된 VFC (70% 곤약-만난, 17% 잔탄 검, 13% 알긴산염 나트륨)의 1차 구조를 결정하였다.
곤약 글루코만난은 곤약 (Amorphophallus 곤약)의 덩이줄기 또는 곤냑 (Konnyaku) 뿌리로부터 얻은 부분적으로 아세틸화된 (1, 4)-β-D-글루코만난이다 (Bewley et al., 1985, Biochemistry of Storage Carbohydrates in Green Plants, Academic Press, New York, pp.　289-304).
잔탄 검은 잔토모나스속 털보하늘소종 (Xanthomonas campestris)에 의해 생산된 미생물의 다당류이다. 그것은 독특한 유동학적이고 겔을 형성하는 성질을 가진다. 잔탄의 구조는 β-(1, 4)-결합된 글루코스 단위의 셀룰로식 백본에 기초하는데, 이것은 주요 사슬에서 모든 2차 글루코스 단위과 결합된 만노스-글루쿠론산-만노스의 삼당류 측쇄를 가진다. 일부 말단 만노스 단위은 피루빌화되고, 내부 만노스 단위의 일부는 아세틸화된다 (Andrew T. R., ACS Symposium Series No . 45 (1977)).
알긴산염 나트륨은 돌미역 (brown seaweed) (예를 들어, 갈색 해초 (Laminaria hyperborea), 푸쿠스 베시쿨로수스 (Fucus vesiculosus), 아스코필룸 노도숨 (Ascophyllum nodosum))으로부터 얻은 다당류의 나트륨염이다. 화학적 구조는 (1, 4) 결합된-β-D-폴리만누론산 (폴리 M), (1,4) 결합된-β-L-폴리글루론산 (폴리 G)의 블록 및 2개의 우론산 대체 블록 (poly MG)으로 구성된다. Grasdalen, H., et al., Carbohydr Res 89:179-191 (1981). 알긴산염은 이가 금속 양이온으로 강한 겔을 형성하고 '에그 박스' 모델은 겔화의 형태를 설명하기 위해 사용되었다. Grant, G.T., et al., FEBS Lett 32:195-198 (1973) 참조.
방법:
이 실시예에 사용된 모든 다당류는 InovoBiologic Inc (Calgary, Alberta, Canada)에 의해 공급되었다. 단일 다당류는 곤약 글루코만난 (제품 번호.　2538 및 2681); 잔탄 검 (제품 번호. 2504 및 2505); 및 알긴산염 나트륨 (제품 번호.　2455, 2638, 및 2639). 과립화된 VFC (PGX?), 제품 번호. 900495 및 2029070523)는 70% 곤약-만난, 17% 잔탄 검, 및 13% 알긴산염 나트륨을 섞고 30 중량% 내지 60 중량% 물을 VFB에 추가하고 그때 열을 가해 추가된 물을 말림으로써 생산되었다. 같은 삼성분 혼합물 (비가공된 VFB)의 샘플을 가공 전에 채취하였는데, 이것은 삼성분 혼합물 #1 (TM1, 제품 번호. 900285, 900416, 및 1112050809)로 나타난다.
1. 메틸화 분석
근거: 부분적으로 메틸화된 알디톨 아세테이트의 GCMS 분석은 다당류의 단당류 성분 및 그들의 결합 위치를 나타내기 위해 사용되었다 (H.　Bjorndal et　al., Carbohydrate Research 5:433-40 (1967)). 그러므로 메틸화 분석은 3개의 다당류 (곤약-만난, 잔탄 검, 및 알긴산염)을 함께 추가하고 열 처리 및 과립화 과정을 통해 그들을 가공하는 과정에 의해 생성된 새롭고 예상하지 못한 당 및 결합 위치를 나타낼 수 있다. 하지만, 메틸화 분석은 어떻게 당이 함께 결합되는지 (α 또는 β) 나타내지 않는다. 메틸화 분석은 메틸화되지 않고 가수분해에 대해 저항성이 있는, 우론산 (예를 들어, 알긴산염 나트륨)의 분석에 대해 만족스럽지 못한 것으로 알려져 있다 (Percival et　al., Chemistry and Enzymology of Marine Algal Polysaccharides, Academic Press 101 (1967)). 알긴산염 나트륨은 전체적으로 우론산 (만누론산 및 글루론산)으로 구성되기 때문에, VFC를 분석하기 위해서 추가적인 방법이 필요하였는데, 이것은 하기 설명된 바와 같이, 펄스 전류 검출 (pulsed amperometric detection; HPAEC-PAD) 및 1H NMR 분광법과 함께 가수분해 및 고성능 음이온 교환 크로마토그래피에 의해 결과로 얻은 중성당 및 우론산의 분석을 수반하였다.
방법:
하기 표 11에 나타난 샘플을 분석하였는데, 이것은 VFC (곤약 만난, 알긴산염 나트륨, 잔탄 검), 비과립화된 VFB ("삼성분 혼합물 #1" 또는 "TM1"로 나타남) 및 과립화된 VFC (PGX?)로 나타남)의 각각의 성분을 포함한다. 측정된 양의 단일 다당류 및 삼성분 혼합물을 채취하였고, 각 샘플 450 μg에 디메틸 설폭시드 몇 방울을 추가하였다. 수산화나트륨 (NaOH/요오드화 메틸 (MeI))을 사용하여 샘플을 페르메틸화하였고, 샘플을 흔든 다음 2시간 동안 총 네 번 분쇄하였다. 클로로포름 추출물로 샘플을 정제하였고 2 M 트리플루오로아세트산 (TFA)으로 120℃에서 2시간 동안 가수분해하였고 2 M NH4OH에 중수소화 나트륨 (NaBD4)으로 상온에서 2시간 동안 감소되었다. 빙초산에 메탄올 (90:10)의 혼합물의 3번의 추가에 의해 중수소의 분해로 생산되는 붕산염을 제거한 후 동결 건조하였다. 무수 아세트산을 사용하여 샘플을 아세트화하였다 (100℃에서 1시간).아세트화된 샘플을 클로로포름으로 추출에 의해 정제하였다.
메틸화 분석의 결과:
표 11: 당에 해당하는 PMAA의 보유 시간 (분) 및 GCM에 의해 확인된 많은 다양한 샘플의 결합 (tr=극소량, nd=미결정)
Figure pct00012
"TM1": 삼성분 혼합물 #1
표 11은 7개의 샘플로부터 유래한 부분적으로 메틸화된 알디톨 아세테이트 (PMAA)에서 수행된 결합 분석의 재구성된 이온 크로마토그램 (미도시)에서 관찰된 결과의 요약을 제공한다. 표 11에 나타난 바와 같이, 알긴산염 나트륨의 샘플은 4-결합된 글루코스에 대한 약한 결합을 제공하기만 한다. 각각의 다당류 샘플에서 관찰된 시그날의 비교는 곤약 만난 과립화에서 발견된 성분이 보고된 구조, 즉, 짧은 말단 측쇄를 가진 위치 4를 통해 결합된 글루코스 및 만노스와 일치한다. 잔탄 검 샘플은 말단 만노스 및/또는 말단 글루코스 및 4-결합된 글루코스에 대한 강한 시그날에 더하여 2-결합된 만노스에 대한 약한 시그날을 제공하였다. 14.65분에 용출하는 시그날은 3, 4-결합된 분지형 6탄당과 일치하는 분열 패턴을 제공하였다. 모든 잔탄 검 시그날은 보고된 구조와 일치한다. 잔탄 검에서 시그날은 약 14.65분에 존재하고 모든 VFB 및 VFC 샘플은 잔탄 검 샘플에서 관찰된 3, 4-결합된 6탄당 분기점과 일치한다.
요약하면, 샘플에서 할당 가능한 시그날의 전체 프로파일은 곤약 만난과 일치하는 성분을 함유하고, 그들은 또한 잔탄 검 (분기점)으로 할당될 수 있는 성분을 함유한다. 이 메틸화 결과는 다음 결론과 일치한다. 첫 번째, 비과립화된 VFB (TM1) 및 과립화된 VFC (PGX?) 둘 다는 곤약 만난 (4-결합된 만노스) 및 잔탄 검 (3, 4-결합된 분지형 글루코스) 둘 다를 함유한다. 스펙트럼에서 다른 메틸화된 당은 이 생체 고분자 물질 중 하나로부터 발산시킬 수 있다. 두 번째, 다른 일반적인 생체 고분자 물질 (예를 들어, 갈락토만난, 카라기난, 등), 6-결합된 글루코스 (전분), 등은 없다. 세 번째, 새로운 당-유사 구조가 형성되었다는 이 결과로부터 증거가 없다 (즉, 다른 당과 질량이 일치하지 않고, 과립화된 VFC 및 비과립화된 VHB는 유사한 질량 스펙트럼을 갖는다). 네 번째, 이 분석은 원래의 우론산이 메틸화되지 않는다는 사실 때문에 알긴산염 나트륨 성분을 확인할 수 없다 (Percival et　al., Chemistry and Enzymology of Marine Algal Polysaccharides, Academic Press 101 (1967)). 알긴산염 나트륨의 분석은 가수분해 및 크로마토그래피 및 가수분해 및 NMR 분광법을 사용하여 이루어진다.
2. 가수분해 및 GCMS 분석
근거:
잔탄 검 및 알긴산염 나트륨 둘 다는 우론산, 즉, 글루론산 (잔탄 검) 및 만누론산 및 글루론산 (알긴산염 나트륨)을 함유한다. 이 구조적 특징은 카르복실 전자받계에 의해 일어난 다당류에서 우론산의 지나친 가수분해 저항성 때문에 확인하기 어려운데, 이것은 산-촉매작용된 가수분해의 첫 번째 단계, 즉, 글리코시드 산소 원자의 양성자화를 이루기 아주 어렵게 만든다 (Percival et　al., Chemistry and Enzymology of Marine Algal Polysaccharides, Academic Press 104 (1967)). 이것은 다당류를 공격에 대해 아주 안정하게 만드는 효과를 갖는다. 오래된 문서에서 알긴산염 나트륨 가수분해의 방법은 몇 시간 동안 90% H2SO4를 처리한 다음 희석 후 24시간 동안 끓이는 것을 설명한다 (Fischer et　al., Hoppe - Seyler's Z Physiol Chem 302:186 (1955)). 하지만, 더 최근에 더 강한 휘발성 산인, 트리플루오로아세트산 (TFA)이 사용되었고 제거의 용이성을 위해 휘발성의 추가된 이점을 갖는 폴리우로니드에서 아주 저항성이 강한 결합을 가수분해하는 것이 발견되었다 (L. Hough et　al., Carbohydrate Research 21:9 (1972)).
이 실시예는 크로마토 그래피의 사용 및 NMR의 선택적인 사용을 통한 VFB 및 VFC (또한 "VFB/C"로 나타남)의 가수분해를 위해 발달된 새로운 분석 방법 및 모든 가수분해 생성물 (글루코스, 만노스, 글루코론산, 만누론산, 및 글루론산)의 특징을 설명한다.
방법:
GCMS 분석: 부분적으로 메틸화된 알디톨 아세테이트 (PMAA)를 분리하였고 가스 크로마토그래피-질량 분석기 (GCMS)에 의해 확인하였다. DB5 컬럼, 45℃에서 온-컬럼 주입 및 40℃에서 1분, 100℃까지 25℃/분, 290℃까지 8℃/분, 및 최종적으로 290℃에서 5분 동안 유지의 온도 프로그램으로 GC 분리를 수행하였다. 단위 해상도로 50-620 달톤의 질량 범위를 통해 스캐닝 방식에서 70 eV의 이온화 전압으로 MS 확인을 수행하였다.
부분적인 가수분해 조건: 가수분해: 조건은 결과가 원하지 않는 저해 생성물에 의해 가려지는 이러한 정도에서 당을 공격하지 않고 가능한 완벽하게 다당류를 가수분해하는 VFB/C의 트리플루오로아세트산 (TFA)을 위해 고안되었다.
2 M TFA가 들어있는 밀봉된 튜브에 위치하고 100℃로 1시간, 2시간, 4시간, 8시간, 24시간, 및 72시간 동안 가열된, 표 11에 나타난 30 mg 샘플에 대해 TFA 가수분해를 수행하였다. 샘플들을 지정된 시간에 열로부터 제거하였고, TFA는 냉동 건조기에서 증발되었고 샘플을 실리카 겔 플레이트에서 박층 크로마토그래피 (TLC) (용매:부탄올:에탄올:물, 5:3:2) 로 검사하였다. 점들을 메탄올에 황산 (5%)를 사용하여 시각화하였다. 결과가 원하지 않는 저해 생성물에 의해 가려지는 이러한 정도에서 당을 공격하지 않고 가능한 완벽하게 다당류를 가수분해하는 최고의 조건은 100℃에서 72시간 동안 2 M TFA 배양, 여과, 동결 건조 x2인 것이 결정되었다. 결과는 표 12에 요약된다.
가수분해 분석의 결과:
표 12: TFA 가수분해의 결과
Figure pct00013
크로마토그래피:
3개의 다당류의 구성당을 분비하는 확립된 가수분해 조건을 갖기 위해, 우론산 (글루쿠론산, 만누론산, 및 글루론산)으로부터 중성당 (글루코스, 만노스) 둘 다를 분리할 수 있는 크로마토그래피 방법이 발달되었다.
Dionex 산성 크로마토그래피는 당 및 관련된 화합물에 널리 사용되는 크로마토그래피 방법이다. 이 검출 방법은 굴절률과 같은 과거에 활용된 많은 방법들과 비교하여 훨씬 더 민감하다.
방법:
장비: Dionex ICS-3000 이중 펌프 IC 시스템, 전기화학적 검출기, Chromeleon 데이터 시스템.
물질: 물 (탈-이온화 및 증류), 수산화나트륨 (50% 용액, HPLC 전기화학 등급), 나트륨 아세테이트, 무수 (=99.5%).
표 13: 크로마토그래피 조건:
Figure pct00014
샘플의 제조:(농도 ~0.02 mg/ml)
30 mg/ml (NMR 샘플)의 D2O의 초기 농도로부터 샘플 용액을 약 0.02 mg/ml의 농도로 제조하였다. 가수분해물 및 표준 용액의 앨리쿼트 (15 μl)를 탈이온수에 녹였고 (30mg/ml) 분석을 위해 탈이온수로 0.0225 mg/ml로 희석하였다. 3개의 다당류: 글루코스 및 만노스 (곤약 글루코만난 및 잔탄 검으로부터), 글루쿠론산 (잔탄 검으로부터) 및 만누론산 및 글루론산 (알긴산염 나트륨으로부터)의 각각의 예측된 가수분해물 성분의 표준 용액을 유사하게 제조하였다.
30℃에서 샘플을 가드 컬럼 (50 x 4 mm)으로 Dionex CarboPac PA1 (250 x 4mm) 컬럼에 주사하였다. 표 13에 나타난 바와 같이, 컬럼을 a: 탈이온수; b: 100　mM NaOH (HPLC 전기화학 등급)에 50 mM 나트륨 아세테이트 (무수=99.5%) 및 c: 100 mM NaOH로 형성된 용매 구배로 1 ml min-1의 유속으로 용출하였다.
크로마토그래피 분석의 결과:
표 14는 다양한 섬유질 샘플의 가수분해물의 Dionex 이온 크로마토그래피의 결과를 나타낸다.
표 14: 가수분해물의 Dionex 이온 크로마토그래피의 결과
Figure pct00015
Figure pct00016
*표준으로서 글루론산의 사용은 알긴산염 나트륨의 가수분해로부터 확인되었다 (두 번째 유의적인 피크는 글루론산이라는 가정).
표 15: 상업적인 생체 고분자 물질 및 그들의 단당류 성분
Figure pct00017
표 14에 나타난 바와 같이, GCMS 분석의 결과는 성분당 및 당산이 한 번의 35분 실행에서 잘 분리되었다는 것을 나타낸다. 표 14에 더 나타난 바와 같이, VFB/C의 TFA 가수분해는 4개의 가능한 단당류, 즉, 글루코스, 만노스, 글루코론산, 및 만누론산이 Dionex 극소량에서 명확하게 관찰되는 독특한 프로파일을 제공한다. 이 결과는 곤약 글루코만난 (만노스, 글루코스), 잔탄 검 (글루코스, 만노스, 글루쿠론산), 및 알긴산염 나트륨 (만누론산 및 글루론산)을 포함하는 VFB/C의 조성물과 일치한다.
표 15는 다양한 상업적 생체 고분자 물질의 단당류 성분을 나타내고, VFC (PGX?)가 단당류 성분의 독특한 프로파일을 제공한다. 그러므로, 이 결과는 TFA 가수분해 및 GCMS 분리는 단당류의 다른 조합으로부터 VFC를 구분하기 위해 사용될 수도 있다.
요약하면, 곤약 글루코만난 및 잔탄 검의 PMMA의 GCMS 분석은 그들의 알려진 1차 구조로부터 예상된 특징적인 당 및 결합의 존재를 입증하였다. 곤약 글루코만난은 4-결합된 글루코스, 4-결합된 만노스, 및 말단 글루코스 및/또는 만노스 (주로 측쇄로부터)에 해당하는 GC 피크를 제공하였다. 잔탄 검은 말단 만노스 및/또는 글루코스 (측쇄로부터) 및 4-결합된 글루코스 (주요 사슬에서), 플러스 3, 4-결합된 6탄당 (글루코스)에 해당하는 강한 피크 및 2-결합된 만노스 (둘 다 측쇄로부터)에 대한 약한 피크를 제공한다. 표 11에 나타난 바와 같이, 사실상 이 모든 피크는 또한 TM1 및 과립화된 VFC (PGX?)의 PMAA의 GCMS 분석에서 검출되었고, 그들 둘 다는 곤약 글루코만난 및 잔탄 검을 함유한다는 것을 나타낸다. 잔탄 검 성분의 2-결합된 만노스의 위치에서 용출하는 극소량 피크는 너무 약해서 질량 스펙트럼으로부터 명확히 할당할 수 없었지만, 약 12.47 및 14.65 분의 유지 시간의 시그날은 잔탄 검의 말단 만노스 및 3, 4-결합된 6탄당 (글루코스)과 각각 일치한다. 중요하게도, 이 분석은 TM1 또는 다른 성분 생체 고분자 물질에서, 또는 가공 중에 형성될 수 있는 어느 새로운 당 또는 당 결합에서 나올 수도 있는 과립화된 VFC (PGX?)의 어느 추가적인 예측하지 못한 당 또는 당 결합을 나타내지 않았다. 예측된 바와 같이, TM1 및 과립화된 VFC의 PMAA의 GCMS 분석은 알긴산염 나트륨 성분을 확인할 수 없다.
HPAEC-PAD 분석에 관하여, 표 14는 TM1 및 과립화된 VFC의 가수분해물에 대해 얻은 크로마토그램의 요약과 함께 TM1 및 과립화된 VFC의 예측된 가수분해물 성분을 포함하는 표준의 측정된 유지 시간을 나타낸다. 표 14에 나타난 바와 같이, TM1 및 과립화된 VFC의 가수분해물에서 4개의 가능한 성분 (글루코스, 만노스, 글루쿠론산 및 만누론산)을 검출하였다. 혼합물의 비교적 낮은 알긴산염 나트륨 함량 때문에, 5 번째 성분, 글루론산은 이 분석에서 검출되지 않았다. 예측하지 못한 가수분해물 성분을 검출하지 않았다. 이 결과는 PMAA의 GCMS 분석에서 얻은 결과와 일치하였고, TM1 및 과립화된 VFC가 화학적으로 변화되지 않은 곤약 글루코만난 및 잔탄 검을 함유한다는 결론을 지지한다. 게다가, 가수분해물의 만누론산의 검출은 화학적으로 변화되지 않은 알긴산염 나트륨의 추가적인 존재를 제안한다.
3. 온전한 및 부분적으로 가수분해된 폴리머 , 및 모노머 표준의 핵자기 공명법
근거:
핵자기 공명법 (NMR)은 스펙트럼이 분자에서 양성자 (수소 워자)의 위치를 통한 그들의 1차 구조에 대한 방대한 양의 정보를 함유하기 때문에, 유기체 분자의 분석을 위한 가치있는 기술이다. 따라서, 기본적인 레벨에서, 1H NMR 스펙트럼의 힘은 원하는 혼합물에서 표준 화합물 및 알려지지 않은 화합물의 화학적 이동 및 통합에 대한 잘 확립된 규칙을 사용하여 다양한 성질을 '핑거프린트'할 수 있는, 충분한 레벨의 1차 구조 정보를 제공하는 것이다. 탄수화물은 NMR에서 분석에 유용한 많은 특징적인 성질을 갖는다. 탄수화물 NMR 스펙트럼의 2개의 주요 특징적인 성질은 (i) "아노머" 공명으로 불리는데, 이것은 당 고리의 C1과 연관된 양성자이고, 이것은 전형적으로 다른 주요 성질보다 더 낮은 필드에서 발생한다; (ii) 이것은 당 고리의 나머지와 연관된 양성자의 "고리 엔벨로프 (envelope)"이다. 예를 들어, 글루코스에 대하여, 알파 및 베타 아노머 공명은 각각, 5.2 및 4.6 ppm이고, 고리 양성자 엔벨로프는 각각, 3.1 및 3.9 ppm 사이이다.
흥미롭게도, 우론산은 상기 설명된 전형적인 6탄당 스펙트럼과 약간 다른 NMR 스펙트럼을 갖고, 그들의 공명은 글루코스 및 만노스에 대한 것들보다 약간 더 높은 필드에서 함께 모였다 (3.9-5.6　ppm). Santi et　al., 12 th Int . Electronic Conf on Synthetic Organic Chemistry ( ECSOC -12):1-30 (2008). 그러므로, 원하는 다당류 (VFB/C)의 가수분해물의 NMR 스펙트럼은 폴리머에서 구조적 단위 (글루코스, 만노스, 우론산, 등)의 핑거프린트를 결정하기 위해 사용될 수도 있다.
이 실시예에서 설명된 연구에서, NMR 스펙트럼을 다양한 다당류 및 VFB의 가수분해물에서 얻은 복합체 혼합물을 핑거프린트하기 위해 사용하였다. 그것은 전체 다당류는 점성과 같은 물리적인 특징의 문제 때문에 폴리머의 레벨의 NMR을 검사할 수 없다는 것을 나타낸다.
방법:
단일 다당류 및 삼성분 혼합물의 샘플을 100℃에서 4시간 및 24시간 동안 2 M TFA로 부분적으로 가수분해하였다. 여과된 가수분해물 샘플 (30 mg)을 D2O (1 ml)에 녹였고 다시 D2O에 녹이고 NMR 튜브에 넣기 전에 동결 건조하였다. 예측된 2개의 단당류 및 3개의 우론산의 표준 용액을 유사하게 제조하였다.
자동 튠 광대역 다핵성 프로브 및 가변 온도 악세사리가 있는 Bruker 400　MHz Advance　III 분광계로 298.1 K에서 가수분해물 및 표준 용액에 대한 NMR 스펙트럼을 얻었다. 16개의 스캔은 특정 256개의 스캔인 글루론산 샘플을 제외한 주요 샘플에 대해 실행되었다.
NMR 분석의 결과:
단당류 및 우론산 표준에 대한 1H NMR 스펙트럼을 잘 해결하였고, 잔탄 검 및 알긴산염 나트륨에서, 및 VFC (PGX?)의 가수분해물에서 그들의 특징적인 화학 이동을 발견하였다 (데이터 미도시). 잔탄 검의 글루코스 및 만노스에 대해 관찰된 화학 이동은 아노머 공명 (4.6-5.2　ppm)으로 및 당 고리 공명 (3-4　ppm)으로 해결될 수 있다. 알긴산염 나트륨의 만누론산 및 글루론산에 대해 관찰된 화학 이동은 함께 더 가깝다 (3.6-5.2　ppm 사이). 과립화된 VFC (PGX?) 가수분해물에서 발견된 우론산 공명은 명백히 잔탄 검 및 알긴산염 나트륨의 가수분해물에서 발견된 것들의 조합이었고, 과립하던 VFC (PGX?)에서 화학적으로 변화되지 않는 알긴산염 나트륨의 존재를 지지한다.
요약하면, 순수한 표준, 성분 가수분해물 및 VFC 가수분해물의 NMR 스펙트럼은 VFC (PGX?)가 변화되지 않은 글리코시드 결합을 가진 단당류 성분의 1차 구조적 성질이 변화되지 않는 다당류로 구성된다는 것을 입증한다.
전체적인 결론:
이 실시예에 설명된 결과는 사전 제제된, 비가공된/비과립화된 VFB (TM1)와 비교하여 과립화된 VFC (PGX?)의 1차 화학적 구조가 본질적으로 변화되지 않았다는 것을 입증한다. 이 실시예에 설명된 바와 같이, 그것은 곤약 글루코만난 및 잔탄 검 성분이 예측된 단위 및 결합을 합유하고, VFB/C 성분을 함께 혼합하거나 가공함으로써 도입될 수도 있는, 설명되지 않은 추가적인 구조적 성분이 없는 고전적인 메틸화 방법에 의해 나타났다.
VFB/C의 성분 중 하나인, 알긴산염 나트륨은 메틸화에 대해 저항성이기 때문에, VFB/C의 1차 화학적 구조의 변하지 않는 성질에 대한 증거를 더 지원하는 것을 제공하기 위하여, 구조적인 분석을 완료하기 위해, 부분적인 가수분해, 크로마토그래피 및 NMR을 포함하는, 추가적인 방법이 활용되었다.
요약하면, 이 실시예에서 설명된 연구는 과립화된 VFC (PGX?)는 과립화 가공에 의해 그것의 1차적인 성질이 화학적으로 변형되지 않는다는 결론을 지지한다.
실시예 6
이 실시예는 과립화된 점성 섬유질 복합체 (VFC) (곤약/잔탄/알긴산염 (70:13:17)) 과립의 유동 및 고분자 성질의 분석을 설명한다 (즉, 복합체를 형성하기 위해 PGX?로 상업적으로 알려진, 섬유질 블렌드를 과립화에 의해 가공하였다). 이 실시예에 설명된 결과는 다음 명명법에 따라 새로운 다당류를 형성하는 네트워크 및 접합 영역을 확립하기 위해 폴리머 레벨에서 과립화된 VFC 사이에서 발생한다는 것을 입증한다: α-D-글루쿠로노-α-D-만노-β-D-만노-β-D-글루코),(α-L-글루로노-β-D-만누로노),β-D-글루코-β-D-만난.
근거:
이 실시예에 설명된 연구를 곤약 만난, 잔탄 검, 및 알긴산염 나트륨을 포함하는, 삼성분 과립화된 VFB/C 혼합물이 모든 3개의 성분을 수반하는 네트워크 및 접합 영역을 함유하는지 조사하기 위해 수행하였고, 비가공된/비과립화된 VFB, 또는 개개의 성분 곤약 만난, 잔탄 검, 또는 알긴산염 나트륨과 비교하여 가공된/과립화된 VFC에 대해 독특한 용액의 유동 특성을 일으켰다. 용액의 과립화된 VFC (PGX?)에서 3개의 다당류 사이의 비-공유결합 고분자 상호작용의 존재를 하기 설명된 기술로 조사하였다. 곤약 글루코만난 및 잔탄 검 사이에서 둘로 이루어진 상호작용은 실시예 5에 설명된 연구의 결과로부터 예측되었기 때문에, 가능한 삼성분 상호작용에서 3 번째 다당류, 알긴산염 나트륨의 참가를 특이적으로 탐지하기 위해 추가적인 분석을 수행하였다.
1. 유동학적 측정
첫 번째 연구에서, 비가공된/비과립화된 VFB (삼성분 혼합물 #1, "TM1"으로 나타남) 및 과립화된 VFC (PGX?)의 많은 농도에서 유동 곡선을 생산하였고, 삼성분 혼합물의 수용액의 유동에서 시너지 효과를 나타내기 위해 이것들을 같은 농도에서 VFB/C 단독의 각각 단일 성분의 용액에 대한 유동 곡선과 비교하였다.
표 16: 유동학적 연구에 사용된 샘플
Figure pct00018
샘플 제조:
탈이온 증류수의 용액에서 단일 다당류 및 삼성분 혼합물을 연구하였다. 정확하게 측정된 샘플은 25℃에서 물 100 g에 0.1 g, 0.2 g, 및 0.5 g의 농도 (각각, 0.1%, 0.2%, 및 0.5%)에서 분산되었고, 마그네틱 스터러 및 소수점 네 자리까지 측정된 샘플을 천천히 소용돌이의 중심으로 붓기 전 생성된 소용돌이에 배치된 물의 측정량을 2시간 동안 교반으로 수화하였다. 2시간 후, 용액을 모든 미립자들이 완벽히 혼합된 것을 확실하게 하기 위해서 1분 동안 고속 믹서 (IKA shear mixer (15K　rpm))로 전단하였다. 분석에 적합하다고 생각되기 전 1시간 동안 샘플을 더 교반하였다.
유동 곡선 측정:
용액 유동을 25.0 ± 0.1℃에서 C14 DIN 53019 콘센트릭 실린더 측정 시스템을 사용하는 Bohlin Gemini Rheometer로 측정하였다. 0.1 Pa로부터 10 Pa로 상승하는, 일련의 일정한 적용된 전단 응력에서 정상 단계 전단 속도를 측정하였다. 로그 전단 속도에 대한 로그 점성의 유동 곡선을 사용하여 유동은 초기에 특성화되었다.
결과:
도 13a, 13b 및 13c는 25℃에서 측정된 바와 같이, 각각 0.1 중량%, 0.2 중량%, 및 0.5 중량%에서 곤약 글루코만난, 잔탄 검, 및 알긴산염 나트륨의 유동 곡선을 도시한다. 도 13a-13c에 도시된 개개의 다당류의 용액에 대한 유동 곡선은 잔탄 검이 가장 강력한 증점제이고 (도 13b), 다음에 곤약 글루코만난 (도 13a) 및 마지막으로 알긴산염 나트륨 (13c)인 것을 나타낸다. 다른 많은 샘플 단일 다당류의 용액들 사이의 유동에서 작은 차이가 보였다. 잔탄 검 용액은 또한 로그 플롯이 선형인 경우 수 십년의 전단 속도에 걸쳐 가장 광범위한 전단 희석 영역을 가졌다.
도 11a-c는 0.5 중량% (도 11a), 0.2 중량% (도 11b) 및 0.1 중량% (도 11c)에서 비가공된/비과립화된 VFB (TM1) 및 과립화된 VFC (PGX?)의 유동 곡선 비교를 도시한다.
도 11a-c에 나타난 데이터는 다음과 같이 각각의 유동 곡선을 점성 η 및 전단 속도 D 사이의 거듭제곱 관계로 맞춤으로써 더 검사되었다.
η= KD n -1
각각 지수 법칙 유체에 대해 선형인 전단 속도에 대한 점성의 로그 플롯의 절편 및 기울기로부터 유래한 K는 일치 지수 (두께의 전체적인 값을 제공)이고 η는 유동 지수 (뉴턴 유동의 편차를 나타냄)인 경우이다. K 값은 전체적인 일치를 나타내고 η는 뉴턴 유동의 편차를 나타낸다 (η=1). 뉴턴 유체는 1의 η 값을 갖고, η이 1 이하로 감소하면, 유체는 점점 전단 희석해진다.
도 11a-c에 나타난 바와 같이, 모든 비가공된/비과립화된 VFB (TM1) 및 과립화된 VFC (PGX?) 샘플은 각각의 농도에서 아주 유사한 유동 곡선을 제공하였고, 가공에서 또는 사전 혼합의 사전 노화에서 낮은 수분 활성은 혼합물의 성질에 영향을 미친다는 것을 나타내었다. 그것은 가공은 열 처리의 희석 용액 조건보다 훨씬 낮은 수분 활성에서 일어난다는 것을 언급한다. VFB/C 혼합물의 유동 곡선은 잔탄 검의 그것에 가장 근접하였다: 그것들은 거듭 제곱에 대해 확인하였고 광범위한 전단 희석 유체를 나타내지만, 각각의 농도에서 점성의 규모 및 전단 희석의 정도는 잔탄 검 단독의 그것보다 실제로 더 높다. 이것은 도 12a에 나타난 바와 같이, VFB/C 혼합물 및 잔탄 검의 용액 사이의 거듭 제곱 K 및 η 값의 차이에 의해 명확히 나타난다.
도 12a는 거듭 제곱 K와 비가공된/비과립화된 VFB (TM1), 과립화된 VFC (PGX?) 및 잔탄 검의 비교를 도시한다. 도 12a에 나타난 바와 같이, 비가공된/비과립화된 VFB (TM1) 및 과립화된 VFB (PGX?) 샘플은 각각의 농도에서 가장 유사한 K 값을 제공한하고, K 값은 농도에 따라 증가하였다. 농도 범위에 걸쳐 더 높은 K 값은 더 큰 점성에 해당하고, 더 낮은 η 값은 더 큰 정도의 전단 희석에 해당한다는 것을 언급한다.
도 12b는 거듭 제곱 η와 비가공된/비과립화된 VFB (TM1), 과립화된 VFC (PGX?) 및 잔탄 검의 비교를 도시한다. 도 12b에 나타난 바와 같이, η 값은 또한 각각의 농도에서 모든 VFC 샘플들과 유사하였지만, 0.30 내지 0.35%의 범위에서, 전단 희박의 정도에서, 최소 η 값의 가능한 존재, 또는 최대를 제안하였다.
과립화된 VFC (70% 곤약 글루코만난, 17% 잔탄 검, 및 13% 알긴산염 나트륨)를 발생시키기 위해 사용된 비율에 기초하여, 혼합물의 유동은 100% 곤약 글루코만난의 그것과 대체로 유사한 것으로 예측될 것이고, 다당류 사이의 상호작용이 없는 것으로 가정한다. 하지만, 곤약 글루코만난은 삼성분 혼합물에서 우세한 다당류이고, 잔탄 검 및 알긴산염 나트륨은 둘 다 작은 성분인 것이 제공되어, 비가공된/비과립화된 VFB (TM1) 및 과립화된 VFC 1 (PGX?) 용액의 유동은 이 혼합물의 다당류 사이의 상호작용의 명확한 지시를 제공한다.
요약 :
도 11에 나타난 과립화된 VFC (PGX?) 유동 곡선과 도 13a-13c에 나타난 개개의 성분의 유동 곡선을 비교하여, 이 결과는 상호작용이 과립화된 VFC 사이에서 발생하고, 비가공된/비과립화된 VFB (TM1) 및 과립화된 VFC (PGX?)에 존재하는 특정 삼성분 조성물에 대해 예측된 것보다 더 큰 점성 및 전단 희석 유체의 정도로 증가를 제공한다. 과립화된 VFC (PGX?) 샘플의 전체적인 유동은 잔탄 검의 그것과 가장 근접하지만, 놀랍게도, 과립화된 VFC (PGX?)의 점성은 실제로 잔탄 검 단독의 그것보다 더 높다. 이것은 도 12a 및 12b에 나타나는데, 이것은 잔탄 검과 비교하여 과립화된 VFC (PGX?)에 대해 더 높은 K 값, 및 약 0.45% 이하 농도, 더 낮은 η 비교 값을 강조한다. 비가공된/비과립화된 VFB (TM1) 및 과립화된 VFC (PGX?)의 잔탄검 함량이 약 17%, 및 남은 83%는 덜 강력한 증점제 곤약 만난 및 알긴산염 나트륨을 포함하는데, 이 결과는 과립화된 VFC (PGX?) 샘플에서 다당류 사이에서 발생하는 상호작용의 명백한 증거를 제공한다.
2. 알긴산염 나트륨 농도의 효과 및/또는 열 처리 연구
다음과 같이 유동 및 고분자 성질의 VFB/C에 대한 다양한 농도의 알긴산염 나트륨의 효과 및 열 처리의 효과를 결정하기 위해 추가적인 실험을 수행하였다.
방법:
곤약 글루코만난, 잔탄 검 및 알긴산염 나트륨의 혼합물을 제조하였다. 혼합물은 일정한 비율 (KM:XG=4.12:1)의 곤약 글루코만난 (KM) 및 잔탄 검 (XG) 및 알긴산염 나트륨의 가변적인 양 (A0 내지 A33) (0%, 2%, 5%, 8%, 11%, 13%, 17%, 21%, 24%, 27%, 30%, 및 33%)을 함유한다. 모든 샘플을 처음 2-방향 (곤약 글루코만난 및 잔탄 검) 또는 3-방향 (곤약 글루코만난, 잔탄 검, 및 알긴산염) 섬유질 조합의 건조 혼합물로서 제조하였다. 손목 진탕기를 사용하여 완전히 혼합되고, 필요할 때까지 -19℃에 보관된, 각각의 샘플 (혼합물)을 소수점 넷 째 자리(건조) 측정되었다.
도 11에 나타난 과립화된 VFC (PGX?) 유동 곡선과 도 13a-13c에 나타난 개개의 성분의 유동 곡선을 비교하여, 이 결과는 상호작용이 과립화된 VFC 사이에서 발생하고, 비가공된/비과립화된 VFB (TM1) 및 과립화된 VFC (PGX?)에 존재하는 특정 삼성분 조성물에 대해 예측된 것보다 더 큰 점성 및 전단 희석 유체의 정도로 증가를 제공한다. 과립화된 VFC (PGX?) 샘플의 전체적인 유동은 잔탄 검의 그것과 가장 근접하지만, 놀랍게도, 과립화된 VFC (PGX?)의 점성은 실제로 잔탄 검 단독의 그것보다 더 높다. 이것은 도 12a 및 12b에 나타나는데, 이것은 잔탄 검과 비교하여 과립화된 VFC (PGX?)에 대해 더 높은 K 값, 및 약 0.45% 이하 농도, 더 낮은 η 비교 값을 강조한다. 비가공된/비과립화된 VFB (TM1) 및 과립화된 VFC (PGX?)의 잔탄검 함량이 약 17%, 및 남은 83%는 덜 강력한 증점제 곤약 만난 및 알긴산염 나트륨을 포함하는데, 이 결과는 과립화된 VFC (PGX?) 샘플에서 다당류 사이에서 발생하는 상호작용의 명백한 증거를 제공한다. 각각의 조성물의 수용액을 각각의 샘플 (혼합물) 5.0 g을 1 kg 탈이온수에 추가하여 마그네틱 스터러에 의해 교반함으로써 0.5%의 단일 농도로 제조하였고 4시간에 걸쳐 균질할 때까지 수화시켰다. 모든 샘플이 제조될 때까지 혼합물의 수용액을 5℃에 보관하였다.
열 처리
각각의 용액의 20 ml 앨리쿼트를 얻었고 다음과 같이 처리하였다: (i) 주위 온도 (22℃) (비가열)에서 배양하거나, 또는 (ii) 자동 온도 조절로 오븐에서 90℃로 가열하였다 (증발 때문에 일어나는 손실을 피하기 위해 포장된 용기에 넣었고 1시간 (A0H 내지 A33H) 또는 4시간 (A0H4 내지 A33H4) 동안 완전히 수화를 확실하게 하기 위해 주기적으로 흔들었다).
일정한 비율의 곤약 글루코만난 (KM) 및 잔탄 검 (XG) 및 가변적인 양의 알긴산염 나트륨 (0%, 2%, 5%, 8%, 11%, 13%, 17%, 21%, 24%, 27%, 30%, and 33%)을 함유하는, 곤약 글루코만난, 잔탄 검, 및 알긴산염 나트륨의 혼합물의 수용액의 25℃에서 유동 곡선을 0.5%의 단일 농도에서 측정하였다. 상기 설명된 바와 같이, 용액을 가열하지 않고, 1시간 동안 가열하거나, 4시간 동안 가열하였다.
결과:
비가열된 2-방향 (A=0), 및 삼성분 혼합물에 대한 유동 곡선 (25℃에서 측정됨)은 도 14a에 나타난다. 1시간 동안 가열된 2-방향 및 삼성분 혼합물에 대한 유동 곡선 (25℃에서 측정됨)을 도 14b에서 나타난다. 4시간 동안 가열된 2-방향 및 셋으로 구성된 혼합물에 대한 유동 곡선 (25℃에서 측정됨)은 도 14c에 나타난다.
도 14a에 나타난 바와 같이, 비가열된 혼합물에 대해, 두 개 이상의 강력한 증점제 (KM 및 XG)가 더 약한 증점제 알긴산염 나트륨에 의해 대체되는지 예측된 바와 같이, 점성은 알긴산염 나트륨 함량의 증가와 함께 감소되는 것으로 나타났다.
도 14b에 나타난 바와 같이, 1시간 동안 가열된 혼합물에 대해, 증가된 알긴산염 나트륨 함량을 갖는 셋으로 구성된 혼합물은 가열되지 않은, 같은 비율의 알긴산염을 가진 혼합물보다 더 높은 레벨의 점성을 유지하였다 (도 14a에 나타남). 도 14c에 나타난 바와 같이, 4시간 동안 가열된 혼합물의 점성은 1시간 동안 가열 후 관찰된 그것과 유사했다. 이 결과들은 알긴산염 나트륨을 포함하는 삼성분 혼합물을 가열하는 것이 다당류 사이에 삼성분 상호작용을 일으킨다는 것을 나타낸다.
도 15a 및 15b는 일정한 KM:XG 비율 (4.12:1) 및 가변적인 양의 알긴산 염 (0 내지 33%)의 곤약 글루코만난, 잔탄 검, 및 알긴산염 나트륨의 혼합물의 0.5% 수용액에 대한 혼합물에서 알긴산염 나트륨의 비율에 대한 K 및 η 둘 다의 의존성을 도시한다. 15a는 알긴산염 함량에 대한 비가열된 및 가열된 셋으로 구성된 혼합물의 거듭 제곱 K 값의 의존성을 도시한다. 열 처리 되지 않은 삼성분 혼합물의 용액에 대한 유동 곡선은 거듭 제곱에 맞췄고 원칙적으로 알긴산염 나트륨 함량의 증가와 함께 점성의 감소를 나타냈다. 도 15a에 나타난 바와 같이, 가열되지 않은 용액에 대해, 거듭 제곱 K 값은 알긴산염 나트륨 함량의 증가와 함께 작은 초기 증가를 나타냈지만, 이것은 큰 감소 다음에 일어났다. 약 3 내지 5% 알긴산염 나트륨 함량에서 최대 K 값이 나타났다. 도 15b에 나타난 바와 같이, 혼합물에서 알긴산염 나트륨의 함량의 증가와 함께, η 값은 증가하였다 (뉴턴 유동에 대해). 이것은 곤약 글루코만난 및 잔탄 검 (알긴산염 없음)의 고점성이고 전단 희석 이성분 혼합물에서 33% 알긴산염 나트륨으로 유의하게 덜 점성이고 덜 전단 희석 삼성분 혼합물로 진행을 나타냈다. 이 결과들은 알긴산염 나트륨이 더 약한 증점제로서 작용했다는 것을 나타낸다.
도 15a 및 도 15b에 나타난 바와 같이, 2개 이상의 강력한 증점제 (곤약 글루코만난 및 잔탄 검)가 더 약한, 덜 전단 희석 증점제 (알긴산염 나트륨)으로 희석될 때 약 5%의 알긴산염 나트륨에서 K의 감소 및 η 값의 증가가 예측된다. 도 15a에 나타난 바와 같이, 1시간 동안 가열된 용액에 대해 유사한 데이터를 얻었는데, 약 5% 이하의 알긴산염 나트륨에서 열 처리 때문에 일어난 K 값의 초기 감소, 11% 이상에서, K 값의 감소는 비가열된 용액에 대해 관찰된 것보다 훨씬 덜 급격했다. K 값의 최대는 삼성분 혼합체에서 8% 내지 11%의 약간 더 높은 알긴산염 나트륨 함량의 열 처리된 용액에서 나타났다. 도 15b에 나타난 바와 같이, 열 처리된 용액의 η 값은 알긴산염 나트륨 함량의 범위에서 낮게 유지되었고 변하지 않았다. 4시간 동안 가열된 용액의 제한된 수에 대해, K 및 η 값은 1시간만 가열된 같은 용액에 대해 얻은 것과 유사하였다 (데이터 미도시).
결과의 요약:
전체적으로, 이 결과들은 삼성분 용액의 열처리가 고분자 상호작용의 전체적인 레벨을 크게 증가세켰다는 것을 나타낸다. 가공 전 및 후의 유동이 유사한 경우 가공 중의 상황과 반대로, 이 샘플들은 희석 용액에서 열 처리되었고 새롭게 혼합된 성분으로 이루어졌다. 0% 및 약 5% 사이의 알긴산염 나트륨을 포함하는 과립화 혼합물의 용액에 대한 K 값이 열 처리 후에 실제로 감소하기 때문에, 이 더 높은 레벨의 상호작용은 곤약 글루코만난 및 잔탄 검 사이의 상호작용의 향상 때문이 아닐 가능성이 있었다. 오히려, 열 처리는 곤약 글루코만난 및 잔탄 검 사이 중 하나 또는 둘 다와 알긴산염 나트륨의 상호작용을 향상시킨다는 것을 나타낸다.
전체적으로, 이 결과들은 혼합물의 열 처리 후, 알긴산염 나트륨은 회복되었고 곤약 글루코만난 및 잔탄 검 사이의 상호작용을 강하게 하거나, 용액에 다른 2개의 다당류와의 상호작용에서 스스로를 수반한다는 것을 제안한다. 그러므로, 이 결과들은 알긴산염 나트륨이 이성분 혼합물의 유동학을 크게 훼손하지 않고 열 처리와 조합으로 약 8% 내지 20%의 레벨로 글루코만난 및 잔탄 검에 추가될 수도 있다는 것을 제안한다.
3. 분석적인 초원심분리의 침강
근거:
PolyGlycopleX? (α-D-글루쿠로노-α-D-만노-β-D-만노-β-D-글루코), (α-L-글루로노-β-D 만누로노), α-D-글루코-β-D-만난 (PGX?)로 또한 나타난, 예상외로 높은 점성의 VFC (곤약/잔탄/알긴산염 (70:13:17)) 과립 (즉, 상업적으로 PGX?로 알려진, 복합체를 형성하기 위해 과립화에 의해 섬유질 블렌드를 가공하였다)는 우리에게 거시적 관찰 뒤에 분자적 기초를 제공할 수도 있는 분자의 레벨에서 상호작용을 찾기 위해, 분석적인 초원심분리에서 침강 속도 유체에 의해 나타난 바와 같이, 곤약 글루코만난, 잔탄, 및 알긴산염의 혼합물의 유체 역학적 성질을 조사하게 하였다. 이 연구에서, 분석적인 초원심분리에서 침강 속도의 기술은 글루코만난이 우성 성분이고, 잔탄 및 알긴산염에 의해 보충되는 혼합물의 성질을 조사하기 위한 프로브로서 사용되었다.
방법:
다당류
본 연구에 사용된 모든 다당류, 즉: 곤약 글루코만난, 제품 번호　2538; 잔탄 검, 제품번호 2504; 및 알긴산염 나트륨, 제품번호 2455/2639는 InovoBiologic Inc, (Calgary, Alberta, Canada)에 의해 제공되었다. 다당류는 개별적으로 및 과립화된 VFC (이 연구에서 "PGX?"로 나타남), 및 비과립화된 VFB (이 연구에서 "TM1"으로 나타남)를 삼성분 혼합물로서 연구되었다. 샘플을 탈이온 증류수에 녹였고 pH ~6.8의 인산-염소 완충액에서 이온 강도 0.0001 M, 0.001 M, 0.01 M, 0.1 M, 및 0.2 M의 용액으로 투석하였다. 0.05 M 이상의 이온 강도는 NaCl의 추가에 의해 보충되었다.
분석적인 초원심분리
분석적인 초원심분리에서 침강 속도의 기술을 상호작용 연구에 대한 프로브로서 사용하였다. 이 유리-용액 방법은 다른 방법에 비해 달리 상호작용 현상을 방해하거나 간섭하는 컬럼, 막 물질, 다른 분리 매체 또는 고정화가 필요하지 않다는 이점을 갖는다 (S.E. Harding Analytical Ultracentrifugation Techniques and Methods, pp.　231-252, Cambridge: Royal Society of Chemistry (2005)). Rayleigh 간섭 광학을 갖춘 Beckman XL-I 초원심분리기를 사용하였다. 데이터를 CCD 카메라 시스템을 사용하여 캡쳐하였다. 45000 rpm의 로터 속도로 조정 전, 초기 스캔은 아주 높은 분자량의 입자 (검출되지 않았다)의 존재를 관찰하기 위해 3000 rpm의 낮은 로터 속도에서 이루어졌다. s20 ,w를 얻기 위해서 침강 계수 s를 20.0℃에서 물의 밀도 및 점성의 표준 조건으로 교정하였다. 12시간 이상의 실행 시간 동안 2분 간격으로 스캔을 수행하였다. s에 비해 침강 계수 분포 g(s)의 분포의 관점에서 Claverie et　al., Biopolymers 14:1685-1700 (1975)의 유한 요소 분석법에 기초한 "최소 자승 g(s)" SEDFIT 알고리즘 (Dam & Schuck, Methods in Enzymology 384:185 (2003))을 사용하여 데이터를 분석하였다 (예를 들어, S.E. Harding, Carbohydrate Research 34:811-826 (2005) 참조). 상호작용의 존재를 알아내기 위해 침강 계수 분포의 변화 분석을 사용하였다. 대조군 및 혼합물을 위해 2.0 mg/ml 또는 0.5% (100 g의 물에 0.5 g)의 총 로딩 농도를 활용하였다.
결과 및 토의
반응물의 무결성
곤약 글루코만난, 잔탄, 및 알긴산염을 분자의 무결성을 확립하기 위해 분석적인 초원심분리에 의해 개별적으로 처음 특성화하였다.
도 16은 2 mg/ml의 로딩 농도 및 I=0.0에서, 글루코만난 (도 16a), 알긴산염 나트륨 (도　16B) 및 잔탄 (도　16c)에 대한 침강 계수에 비해 명백한 침강 농도 분포 g* (s)를 도시한다. 로터 속도 45000 rpm, 온도=20.0℃. 세로 좌표는 스베드베리 (S) 당 프린지 단위로 표현되고, 가로 좌표는 스베드베리 단위로 표현된다.
도 17은 이온 강도 0-0.2 M에서 비가공된/비과립화된 VFB (TM1) (도 17a); 이온 강도 0-0.01 M에서 TM1 (도 17b); 및 이온 강도 0-0.1 M 과립화된 VFC (PGX?) (도 17c); 이온 강도 0-0.2 M 과립화된 VFC (PGX?) (도 17d)에 대한 명백한 침강 농도 분포를 도시한다; 로터 속도 45000　rpm, 온도=20.0℃.
도 18은 비가공된/비과립화된 VFB (TM1) (도　18a); 또는 과립화된 VFC (PGX?) (도　18b)에 대해 3.5s 이상의 침강 계수를 가진 물질의 양에 대한 이온 강도의 효과 (분자 농도 단위 M으로 표현됨)를 도시한다. 로그 눈금을 가능하게 하기 위해 I=0.00001 M에서 I=0.00 값으로 표시된다.
명백한 침강 계수 분포에 대한 모든 경우에 단봉형 플롯이 나타났다 (도 17a, b, c). 이 조건 하에, 1S=10-13 s인 경우, 곤약 글루코만난은 ~1.6S, 알긴산염은 ~1.3S 및 잔탄은 ~3.5S의 명백한 중량 평균 침강 계수 s 20 ,w를 갖는다.
복합체 형성 및 추가된 전해질의 효과
다음의 삼성분 혼합물에 대해 침강 계수 분포 플롯이 발생하였다: 최대 10S 까지, 대조군 (2 mg/ml)에 사용된 같은 총 로딩 농도에서 비가공된/비과립화된/비가열된 VFB (TM1) (도　17a, b) 및 과립화된/가열된 VFC (PGX?) (도　17c, d). 상호작용에 대한 우리의 기준에 따라, 우리는 대조군 - 잔탄에서 가장 높은 침강 종의 그것보다 더 큰 명백한 침강 계수를 갖는 물질의 양을 평가하였다: 3.5S 초과에서 물질 침강은 상호작용 생성물로서 간주된다.
표 17은 3.5S 초과인 침강 물질의 농도를 나타낸다. 각각의 경우에서 초원심분리 세포 로딩 농도는 2.0 mg/ml이었다.
표 17: 3:3.5S 초과의 침강 물질의 농도
Figure pct00019
표 17은 특히 낮은 침강 계수 (~2S)에서 큰 비율의 미반응 물질이 있지만, 개개의 성분과 비교하여, TM1 및 과립화된 VFC 혼합물에 대한 침강 물질의 농도의 뚜렷한 증가를 나타낸다. 도 18 및 표 18은 또한 더 큰 침강 물질의 출현에 대한 이온 강도 증가의 효과를 나타낸다.
표 18은 TM1 (비가공된/비과립화된 VFB)에 대한 이온 강도의 효과의 결과를 나타낸다. 각각의 경우에서 초원심분리 세포 로딩 농도는 2.0 mg/ml이었다.
표 18: TM1 (비과립화된 VFB)에 대한 이온 강도의 효과
Figure pct00020
표 19는 PGX? (과립화된 VFC)에 대한 이온 강도의 효과의 결과를 나타낸다. 각각의 경우에서 초원심분리 세포 로딩 농도는 2.0 mg/ml이었다.
표 19: PGX? (과립화된 VFB)에 대한 이온 강도의 효과
Figure pct00021
과립화된 및 비과립화된 혼합물 둘 다에 대해, 많은 양의 더 높은 침강 물질이 이러한 물질의 출현이 억제되는 상기 0.01 M의 최대 이온 강도로 관찰되는 것을 알 수 있다 (도 18a, b). 도 18a는 비가공된/비과립화된 VFB (TM1)에 대해 3.5S 초과의 침강 계수를 가진 물질의 양에 대한 이온 강도 (분자 농도 단위 M으로 표현됨)의 효과를 도시한다. 도 18b는 가공된 (예를 들어, 과립화된) VFC (PGX?)에 대한 3.5S 초과의 침강 계수를 가진 물질의 양에 대한 이온 강도의 효과를 도시한다.
삼성분 혼합물의 침강 계수의 분포
고정된 글루코만난:잔탄 검 비율 및 변하는 알긴산염 농도 (0% 내지 33%)를 함유하는 혼합물에 대한 침강 계수 분포. 혼합물은 비가열 (0)되거나 또는 1시간 (H1) 내지 4시간 (H4) 동안 열 처리되었다.
침강 계수 분포는 5 mg/ml (0.5%)의 총 로딩 농도에서 탈이온화된 증류수의 샘플로부터 결정되었다. 비가열된 샘플에 대한 결과는 도 19a에 나타난다. 열 처리된 샘플에 대한 결과는 도 19b에 나타난다. 도 19a에 나타난 바와 같이, 알긴산염의 부재시, 본질적으로 글루코만난 대조군의 침강 계수 분포를 가진, 비가열된 (A0) 또는 1시간 (A0H1) 또는 4시간 (A0H4) 동안 처리된 샘플에 대한 글루코만난:잔탄 혼합물에 지배된 이성분 글루코만난에 대한 큰 상호작용 생성물이 관찰되지 않았다 (Abdelhameed et al., Carbohydrate Polymers, 2010 참조). 하지만, 알긴산염의 존재시 상황은 다르다. 도 19a에 나타난 바와 같이, 비가열된 삼성분 혼합물은 더 큰 침강 계수 물질에 기초한 13%, 17%, 21%, 최대 24%의 알긴산염 함량의 일부 상호작용을 나타냈지만, 27%의 알긴산염 농도 이상에서 큰 효과가 관찰되지 않았다. 열-처리된 샘플에 대해, 도 19b에 나타난 바와 같이, 복합체는 로그 측정값과 일치하는, 약 8% 이상의 알긴산염 농도에서 관찰되었다. A21H1 (21% 알긴산염 혼합물, 1시간 동안 가열됨), A24H1, A27H1, A30H1과 같은 1시간 동안 열 처리 및 알긴산염을 함유하는 모든 4시간 동안 처리된 더 큰 알긴산염 함량 샘플의 일부는 열 처리 과정 후 겔을 형성하였고 침강 속도 방법에 의해 분석될 수 없다. 이것은 이것들을 겔 상태로 변경하기 위한 충분한 강도의 원래 용액에서 상호작용의 존재를 나타낸다. 반대로, 비가열된 샘플에서 분자 상호작용은 이러한 겔화 현상을 촉진하기에 불충분했다.
결론
글루코만난, 잔탄, 및 알긴산염의 혼합물은 전해질의 적당한 양의 추가에 따라 제거되는 상호작용 생성물의 존재를 나타낸다. 이 관찰들은 0.01 M의 이온 강도를 넘는 지원 전해질의 포함에 의해 저해될 수 있는 삼성분 혼합물 내에 상호작용과 일치한다. 더 낮은 침강 계수 (3.5S 미만, 우리가 연구한 조건 하에)에서 큰 비율의 물질 침강이 있는 것과 같이, 상호작용은 화학량적이 아니다.
4. VFC 및 알긴산염 나트륨과 염화 칼슘의 비교 처리
근거:
과립화된 VFC (PGX?)는 물에서 고점성 용액을 생산하지만 응집성 겔을 형성하지 않는다. 상기 설명된 결과는 폴리머 레벨에서 3개의 성분 (곤약 만난, 잔탄 검, 및 알긴산염)의 복합체 상호작용의 형성과 일치한다.
알긴산염이 VFC로부터 분리될 수 있는지 결정하기 위해서, 이온에 의해 용액에서 알긴산염이 VFC로부터 분리될 수 있는지 테스트하는 실험을 수행하였다. 알긴산염은 칼슘 매개된 침전 및 겔화 특성을 갖는 것으로 알려져 있다 (K. Clare, "Algin," in Whistler R.L. and BeMiller J.N. Eds., Industrial 검 s, Academic Press 116 (1993); A. Haug et　al., Acta Chem . Scand . 19:341-351 (1965)). 알긴산염 나트륨의 순수한 용액은 칼슘 추가의 방식에 의존적으로 침전 또는 겔을 형성하기 위한 칼슘 이온의 추가에 대해 강하게 및 순간적으로 반응한다 (Clare et al. (1993); Haug et al. (1965)). 따라서, 전형적인 겔화 반응에서, 무수 인산 이칼슘과 같은 불용성 칼슘염을 알긴산염 나트륨 용액에 추가한 다음 균질한 겔의 형성을 일으키기 위해 Ca++ 이온이 천천히 방출되도록 유발하는 글루코노 델타락톤과 같은 서방형 (slow-release) 산을 추가하였다. 하지만, 만약 Ca++ 이온이, 염화 칼슘의 경우와 같이, 신속하게 추가되면, 즉각적인 침전이 발생한다. 알긴산염 고분자의 폴리글루론산 세그먼트는 Ca++ 이온과 가장 강하게 결합하는 것으로 알려져 있지만 (Kohn et　al., Acta Chemica Scandinavica 22:3098-3102 (1968)), 만약 이 세그먼트들이 다른 2개의 다당류 중 하나 또는 둘 다와의 상호 작용 때문에 덜 접근 가능하게 된다면, 칼슘 알긴산염 침전은 제한될 수도 있다.
방법:
0.5% (100 g 물에 0.5 g)의 탈이온화 증류수에 비가공된 VFB (TM1) 및 가공된/과립화된 VFC (PGX?)의 용액의 앨리쿼트는 0.1, 0.05, 및 0.01 중량%로 희석되었다. 0.5%의 Ca2 + 이온 농도를 달성하기 위해 각각의 농도에, 10% CaCl2.2H20 용액 5ml을 추가하였고 충분히 혼합하였다.
Ca2 + 이온의 같은 추가는 또한 (1) 비가공된 VFB (TM1) 및 가공된/과립화된 VFC (PGX?) 용액의 그것과 같은 알긴산염 농도를 함유한 알긴산염 나트륨 단독의 유사한 시리즈의 대조군 용액; 및 (2) 비가공된 VFB (TM1) 및 가공된/과립화된 VFC (PGX?)의 0.5% 용액에서와 같이 같은 알긴산염 나트륨 농도 (100 g 물에서 g로 측정됨) 및 같은 상대적인 비율의 2개의 다당류를 함유한 알긴산염 나트륨을 가진 곤약 글루코만난 또는 잔탄 검의 이성분 혼합물의 용액으로 되어있다.
침전의 존재/부재에 대한 시각적 검사 전 30분 동안 용액을 대기시켰다.
결과:
결과는 하기 표 20에 나타난다.
표 20: 샘플 농도 및 결과
Figure pct00022
표 20에 요약된 결과에 나타난 바와 같이, 적어도 0.0075%의 레벨로 알긴산염 칼슘을 침전시키는, 0.5% Ca++ 이온의 존재시, 동등한 알긴산염 레벨로 과립화된 VFC (PGX?)의 용액에서 침전의 징후는 없다는 것이 명백하다. 이 발견은 개개의 성분이 순수한 상태에서 나타나는 성질을 나타내는 것을 예방하는 접합 영역 및 네트워크 (즉, 2차 및 3차 레벨의 다당류 구조)를 형성하기 위해 용액에서 상호 작용하는 VFB/C 성분과 일치한다. 칼슘 알긴산염 침전은 0.5% Ca++ 이온에 의해 침전되는 불충분한 알긴산염을 함유한 대부분의 희석 용액 외에 해당하는 알긴산염 나트륨에서 형성되었다.
결론:
과립화된 VFC (PGX?)의 알긴산염 유동의 이 연구에서, 칼슘 이온이 염화 칼슘의 추가에 의해 신속하게 도입되었을 때 침전 또는 겔 형성이 발생하지 않는다는 것을 입증하였다. 유사한 대조군 실험에서, 염화 칼슘을 감소된 농도의 알긴산염 나트륨의 순수한 용액에 추가하였는데, 이것은 아주 낮은 알긴산염 농도에서조차, 즉각적인 알긴산염 칼슘의 침전을 생산하였다. 이 결과들은 용액에서 정상적으로 Ca++ 이온과 강하게 결합하는 알긴산염 고분자의 폴리글루론산염 세그먼트는 곤약 글루코만난 및 잔탄 검의 존재시 알긴산염 나트륨이 있는 VFB/C 용액에서 이러한 상호작용에 대해 덜 사용 가능 (또는 사용 불가능) 했다는 것을 제안한다.
이것은 다른 2개의 폴리다당류 중 하나 또는 둘 다와의 대안의 상호작용 때문에 Ca++ 이온에 덜 접근 가능하거나 접근 불가능한 고분자의 이 세그먼트 때문일 수도 있다. Ca++ 이온이 알긴산염 나트륨과 함께 곤약 글루코만난 또는 잔탄 검의 이성분 용액에 추가될 때 알긴산염 칼슘 침전이 관찰되었는데, 이것은 알긴산염 나트륨이 상호작용하기 위해 다른 2개의 다당류의 존재를 필요로 한다는 것을 제안한다.
전체적인 결과의 논의
실시예 5에 설명된 VFB/C의 1차 구조의 분석의 결과는 과립화 후 과립화된 VFC에 존재하는 성분 다당류의 1차 구조는 변함이 없고, 열의 투입을 수반하는 가공 전 (TM1) 또는 후 (과립화된 VFC)에 공유 결합의 상호작용이 발생하지 않았다는 것을 나타낸다. 하지만, 이 실시예에 설명된 고분자 결합의 분석의 결과는 비-공유 결합의 상호작용이 발생하고, VFB/C의 고분자 레벨에서 생산되는 새로운 다당류 복합체를 결과로 낳는다는 것을 나타낸다. 유동학적 연구는 비가공된/비과립화된 VFB (TM1) 및 과립화된 VFC (PGX?) 둘 다의 용액 점성이 혼합물에서 개개의 다당류의 점성화 작용의 조합으로부터 예측된 것보다 상당히 더 높다는 것을 분명히 나타낸다. 용액에서 VFC의 전체적인 유량 특성은 잔탄 검 단독의 그것과 가장 근접하지만, VFC의 점성은 잔탄 검의 그것보다 더 높다. 이 실시예에서 테스트된 VFC (70% KM, 17% 잔탄, 13% 알긴산염 나트륨)의 구체예는 단지 17%의 가장 강한 증점제, 잔탄 검, 및 83%의 2개의 더 약한 증점제, 곤약 만난 (70%) 및 알긴산염 나트륨 (13%)를 함유하는 것으로 생각되는데, 물에서 그것의 유동이 곤약 만난의 것과 유사할 것이라고 예측될 것이다. 하지만, VFC의 용액 유동은 실제로 잔탄 검 단독의 그것과 더 근접하고, 그것의 점성은 잔탄 검보다 더 높다는 것이 결정되었다.
실험실에서 제조된 가변적인 알긴산염 함량을 함유한 삼성분 혼합물의 용액의 유동학적 및 침강 작용의 추가적인 연구는 삼성분 상호작용을 확인하였고, 이것은, 특히 혼합물의 알긴산염 나트륨 함량이 약 5%보다 더 클 때, 용액을 열 처리함으로써 향상되었다. 게다가, Ca++ 이온 추가 실험은 다른 2개의 다당류 둘 다의 존재가 알긴산염 칼슘 침전을 예방하기 위해 필요하다는 것을 나타냈다.
이 결과는, 용액에서, 알긴산염 나트륨이 다음 명명법으로 새로운 다당류 복합체를 형성하는 네트워크 및 접합 영역을 확립하기 위해 곤약 글루코만난 및 잔탄 검과 상호작용한다는 것을 입증한다: α-D-글루쿠로노-α-D-만노-β-D-만노-β-D-글루코), (α-L-글루쿠로노-β-D-만누로노), β-D-글루코-βD-만난.
실시예 1-4에 설명된 바와 같이, 과립화된 VFC (PGX?)의 투여는 이들을 필요로 하는 대상체에서 대사증후군, 타입 I 당뇨병, 타입 II 당뇨병, 췌장 질환, 또는 과지질혈증과 같은, 대사 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상의 예방, 치료, 또는 개선에 유용하다.
도식적인 구체예가 도시되고 설명되었지만, 본 발명의 사상 및 범위로부터 벗어나지 않고 그 안에서 다양한 변화가 이루어질 수 있다는 것이 인정될 것이다.

Claims (27)

  1. 점성 섬유질 블렌드 또는 이들의 복합체를 포함하고, 약 48 중량% 내지 약 90 중량% 글루코만난, 약 5 중량% 내지 약 20 중량% 잔탄 검, 및 약 5 중량% 내지 약 30 중량% 알긴산염, 및 단백질, 탄수화물, 및 지방으로 구성된 그룹으로부터 선택된 적어도 하나의 다량 영양소를 포함하는, 고점성 다당류 식이 섬유 조성물을 포함하는 대사 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 또는 개선하는 의료 식품으로서, 대사 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상의 예방, 치료, 또는 개선하기 위해 합성된 것을 특징으로 하는 의료 식품.
  2. 제 1항에 있어서, 의료 식품은 고점성 다당류 식이 섬유 조성물의 약 10 g 내지 약 100 g의 일일 투여량을 제공하기 위해 합성되는 것을 특징으로 하는 의료 식품.
  3. 제 1항에 있어서, 의료 식품은 고점성 다당류 식이 섬유 조성물의 약 15 g 내지 약 35 g의 일일 투여량을 제공하기 위해 합성되는 것을 특징으로 하는 의료 식품.
  4. 제 1항에 있어서, 식이 섬유 조성물은 약 60 중량% 내지 약 80 중량% 글루코만난, 약 10 중량% 내지 약 20 중량% 잔탄 검, 및 약 10 중량% 내지 약 20 중량% 알긴산염을 포함하는 것을 특징으로 하는 의료 식품.
  5. 제 1항에 있어서, 대사 질환 또는 장애는 대사 증후군, 타입 I 당뇨병, 타입 II 당뇨병, 췌장 질환, 및 과지질혈증으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 의료 식품.
  6. 글루코만난, 잔탄 검, 및 알긴산염을 포함하는 식이 섬유 조성물의 유효량을 의료 식품 생성물에 추가하는 단계를 포함하는, 의료 식품 생성물을 제조하는 방법.
  7. 제 6항에 있어서, 의료 식품은 대사 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 또는 개선하기 위해 합성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 식이 섬유 조성물은 약 60 중량% 내지 약 80 중량% 글루코만난, 약 10 중량% 내지 약 20 중량% 잔탄 검, 및 약 10 중량% 내지 약 20 중량% 알긴산염을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 제 6항에 있어서, 의료 식품은 고점성 다당류 식이 섬유 조성물의 약 10 g 내지 약 100 g의 일일 투여량을 제공하기 위해 합성되는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 대사 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상을 예방, 치료, 또는 개선하는 방법으로서, 섬유질 블렌드 또는 이들의 복합체를 포함하고, 대사 질환 또는 장애와 연관된 하나 이상의 증상을 예방, 치료 또는 개선하는데 효과적인 기간 동안, 유효한 약 48 중량% 내지 약 90 중량% 글루코만난, 약 5 중량% 내지 약 20 중량% 잔탄 검, 및 약 5 중량% 내지 약 30 중량% 알긴산염을 포함하는 고점성 다당류 식이 섬유 조성물의 약 25 mg/kg/일 내지 약 1000 mg/kg/일을 필요로 하는 사람 대상체에 투여하는 단계를 포함하는 방법.
  11. 제 7항 또는 제 10항에 있어서, 대사 질환 또는 장애는 대사증후군, 타입 I 당뇨병, 타입 II 당뇨병, 췌장 질환, 및 과지질혈증으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 10항에 있어서, 필요로 하는 대상체는 인슐린 저항성으로 고통받거나, 이에 걸릴 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제 10항에 있어서, 필요로 하는 대상체는 글루코스-유발 기관 손상으로 고통받거나, 이에 걸릴 위험이 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  14. 제 10항에 있어서, 방법은 적어도 2주의 기간 동안 적어도 하루에 한 번 식이 섬유 조성물을 투여하는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제 10항에 있어서, 식이 섬유 조성물은 의료 식품 생성물로서 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 적어도 2주의 기간 동안 약 48 중량% 내지 약 90 중량% 글루코만난, 약 5 중량% 내지 약 20 중량% 잔탄 검, 및 약 5 중량% 내지 약 30 중량% 알긴산염을 포함하는 고점성 다당류 식이 섬유 조성물의 약 25 mg/kg/일 내지 약 1000 mg/kg/일을 필요로 하는 포유 동물 대상체에 투여하는 단계를 포함하는, 타입 II 당뇨병으로 고생하는 중이거나, 이에 걸릴 위험이 있는 대상체의 인슐린 저항의 진행과 연관된 적어도 하나의 증상을 개선하는 방법.
  17. 제 16항에 있어서, 식이 섬유 조성물은 약 60 중량% 내지 약 80 중량% 글루코만난, 약 10 중량% 내지 약 20 중량% 잔탄 검, 및 약 10 중량% 내지 약 20 중량% 알긴산염을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제 16항에 있어서, 식이 섬유 조성물은 의료 식품 생성물로서 투여되는 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 적어도 하나의 다당류를 포함하는 샘플의 성분당을 결정하는 방법으로서,
    (a) 가수분해물을 생산하기 위해 산으로 적어도 하나의 다당류를 포함하는 샘플을 가수분해하는 단계;
    (b) 크로마토그래피 방법으로 가수분해물에서 가수분해 생성물을 분리하는 단계;
    (c) 단계 (b)에서 분리된 가수분해 생성물을 검출하는 단계;
    (d) 샘플의 구성당을 결정하기 위해 단계 (c)에서 검출된 가수분해 생성물과 하나 이상의 표준 대조군을 비교하는 단계;
    를 포함하는 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 단계 (a)에 사용된 산은 트리플루오로아세트산 (TFA)인 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제 19항에 있어서, 단계 (a)의 가수분해는 48 내지 72시간의 기간 동안 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제 19항에 있어서, 단계 (a)의 가수분해는 95℃ 내지 110℃의 온도에서 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제 19항에 있어서, 크로마토그래피 방법은 우론산으로부터 중성당을 분리할 수 있는 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 크로마토그래피 방법은 Dionex 산성 크로마토그래피를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제 19항에 있어서, 샘플은 적어도 하나의 식이 섬유를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제 19항에 있어서, 샘플은 알긴산염 나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 제 19항에 있어서, 샘플은 글루코만난, 잔탄 검, 및 알긴산염 나트륨을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160001935A (ko) 2014-06-30 2016-01-07 원광대학교산학협력단 블랙 커런트 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사증후군의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물

Families Citing this family (17)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE102010039734A1 (de) * 2010-08-25 2012-03-01 Bayer Materialscience Aktiengesellschaft Katalysator und Verfahren zur Herstellung von Chlor durch Gasphasenoxidation
GB201110672D0 (en) * 2011-06-23 2011-08-10 M I Drilling Fluids Uk Ltd Wellbore fluid
TWI469785B (zh) * 2012-04-25 2015-01-21 Inovobiologic Inc 用於治療代謝性疾病之膳食纖維組成物
RU2727960C2 (ru) 2013-07-01 2020-07-28 Юниверсити Оф Саутерн Калифорния Состояние воздержания от пищи в качестве диетического лечения диабета
CN104277130A (zh) * 2013-07-02 2015-01-14 中国科学院上海药物研究所 一种硫酸酯化聚古洛糖酸多糖或其可药用盐及其制备方法和用途
CN103604884B (zh) * 2013-11-21 2015-10-28 南京工业大学 一种检测海藻生物质内还原性糖类物质的方法
DK3082466T3 (da) * 2013-12-18 2019-10-07 Thylabisco Ab Anvendelse af thylakoider til formindskelse af trangen til velsmagende næringsmidler
CN104391049B (zh) * 2014-09-20 2017-03-22 鄂尔多斯市中轩生化股份有限公司 黄原胶微量溶剂残留量的检测方法
UA121122C2 (uk) * 2014-11-26 2020-04-10 Омега Фарма Інновейшн Енд Девелопмент Нв Композиція харчових волокон
CA2973617A1 (en) * 2015-01-26 2016-08-04 Kaleido Biosciences, Inc. Glycan therapeutics and related methods thereof
US20190029301A1 (en) * 2016-01-12 2019-01-31 University Of Southern California Use of long-term fasting mimicking as dietary treatment for multiple myeloma and other cancers
US10485253B2 (en) 2017-08-21 2019-11-26 Mustapha Benmoussa Method of microalgal biomass processing for high-value chemicals production, the resulting composition of butyrogenic algal slowly fermenting dietary fiber, and a way to improve colon health using a slowly fermenting butyrogenic algal dietary fiber
EP3827027A4 (en) 2018-07-23 2022-04-27 Nutragenom, LLC COMPOSITION AND PROCESSES FOR GENERATION AND CONSERVATION OF MOLECULAR HYDROGEN (H2) IN AQUEOUS SYSTEMS
CN110412157A (zh) * 2019-07-17 2019-11-05 广州金评检测研究院有限公司 一种烟酰胺原料中烟酸的测定方法
JP7412759B2 (ja) * 2020-04-16 2024-01-15 松谷化学工業株式会社 水溶性食物繊維のエネルギー量の簡便な測定方法
CN112933105A (zh) * 2021-02-10 2021-06-11 浙江工业大学 甘露葡萄糖醛酸多（寡）糖及硫酸化衍生物在制备治疗非酒精性脂肪肝药物中的应用
CN112782321A (zh) * 2021-03-09 2021-05-11 上海市质量监督检验技术研究院 一种快速检测纺织品中维生素e含量的测定方法

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0683118B2 (ja) * 1988-01-19 1994-10-19 日本電気株式会社 直流終端回路
JPH02245148A (ja) * 1989-03-17 1990-09-28 Unie Koroido Kk グルコマンナンの凝固方法及びこれに用いる組成物
US5460957A (en) * 1992-04-28 1995-10-24 Maruha Corporation Calcium alginate oligosaccharide and method for producing the same from potassium or sodium alginate
US20020044988A1 (en) * 2000-08-22 2002-04-18 Fuchs Eileen C. Nutritional composition and method for improving protein deposition
GB0406013D0 (en) * 2004-03-17 2004-04-21 Chiron Srl Analysis of saccharide vaccines without interference
US8597709B2 (en) * 2005-04-12 2013-12-03 Inovobiologic Inc. Dietary supplement and methods of use
US8062686B2 (en) * 2005-04-12 2011-11-22 InovoBiologics, Inc. Dietary supplement, and methods of use

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20160001935A (ko) 2014-06-30 2016-01-07 원광대학교산학협력단 블랙 커런트 추출물을 유효성분으로 함유하는 대사증후군의 예방, 개선 또는 치료를 위한 조성물

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NZ602249A (en) 2014-10-31
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WO2011109900A1 (en) 2011-09-15
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JP2017074072A (ja) 2017-04-20

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