KR20130031351A - 크로마토그래피 매질 및 방법 - Google Patents

크로마토그래피 매질 및 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR20130031351A
KR20130031351A KR1020137001640A KR20137001640A KR20130031351A KR 20130031351 A KR20130031351 A KR 20130031351A KR 1020137001640 A KR1020137001640 A KR 1020137001640A KR 20137001640 A KR20137001640 A KR 20137001640A KR 20130031351 A KR20130031351 A KR 20130031351A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
fiber
chromatography
functionality
fibers
medium
Prior art date
Application number
KR1020137001640A
Other languages
English (en)
Inventor
데이비드 야보르스키
존 아마라
요아퀸 우마나
윌리엄 카탈도
미카일 코즈로프
매튜 스톤
Original Assignee
이엠디 밀리포어 코포레이션
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 이엠디 밀리포어 코포레이션 filed Critical 이엠디 밀리포어 코포레이션
Publication of KR20130031351A publication Critical patent/KR20130031351A/ko

Links

Images

Classifications

    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J39/00—Cation exchange; Use of material as cation exchangers; Treatment of material for improving the cation exchange properties
    • B01J39/26—Cation exchangers for chromatographic processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/32—Bonded phase chromatography
    • B01D15/325—Reversed phase
    • B01D15/327—Reversed phase with hydrophobic interaction
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/362—Cation-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/36—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving ionic interaction
    • B01D15/361—Ion-exchange
    • B01D15/363—Anion-exchange
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01D—SEPARATION
    • B01D15/00—Separating processes involving the treatment of liquids with solid sorbents; Apparatus therefor
    • B01D15/08—Selective adsorption, e.g. chromatography
    • B01D15/26—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism
    • B01D15/38—Selective adsorption, e.g. chromatography characterised by the separation mechanism involving specific interaction not covered by one or more of groups B01D15/265 - B01D15/36
    • B01D15/3804—Affinity chromatography
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28014—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their form
    • B01J20/28023—Fibres or filaments
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/28—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties
    • B01J20/28054—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof characterised by their form or physical properties characterised by their surface properties or porosity
    • B01J20/28057—Surface area, e.g. B.E.T specific surface area
    • B01J20/28059—Surface area, e.g. B.E.T specific surface area being less than 100 m2/g
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/282—Porous sorbents
    • B01J20/285—Porous sorbents based on polymers
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/281—Sorbents specially adapted for preparative, analytical or investigative chromatography
    • B01J20/286—Phases chemically bonded to a substrate, e.g. to silica or to polymers
    • B01J20/287—Non-polar phases; Reversed phases
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J20/00—Solid sorbent compositions or filter aid compositions; Sorbents for chromatography; Processes for preparing, regenerating or reactivating thereof
    • B01J20/30—Processes for preparing, regenerating, or reactivating
    • B01J20/32—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating
    • B01J20/3231—Impregnating or coating ; Solid sorbent compositions obtained from processes involving impregnating or coating characterised by the coating or impregnating layer
    • B01J20/3242—Layers with a functional group, e.g. an affinity material, a ligand, a reactant or a complexing group
    • B01J20/3244—Non-macromolecular compounds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J41/00—Anion exchange; Use of material as anion exchangers; Treatment of material for improving the anion exchange properties
    • B01J41/20—Anion exchangers for chromatographic processes
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J47/00—Ion-exchange processes in general; Apparatus therefor
    • B01J47/014—Ion-exchange processes in general; Apparatus therefor in which the adsorbent properties of the ion-exchanger are involved, e.g. recovery of proteins or other high-molecular compounds
    • B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
    • B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
    • B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
    • B01J47/00—Ion-exchange processes in general; Apparatus therefor
    • B01J47/12—Ion-exchange processes in general; Apparatus therefor characterised by the use of ion-exchange material in the form of ribbons, filaments, fibres or sheets, e.g. membranes
    • B01J47/127—Ion-exchange processes in general; Apparatus therefor characterised by the use of ion-exchange material in the form of ribbons, filaments, fibres or sheets, e.g. membranes in the form of filaments or fibres
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K1/00—General methods for the preparation of peptides, i.e. processes for the organic chemical preparation of peptides or proteins of any length
    • C07K1/14—Extraction; Separation; Purification
    • C07K1/16—Extraction; Separation; Purification by chromatography
    • C07K1/18—Ion-exchange chromatography
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/02—Recovery or purification
    • D—TEXTILES; PAPER
    • D04—BRAIDING; LACE-MAKING; KNITTING; TRIMMINGS; NON-WOVEN FABRICS
    • D04H—MAKING TEXTILE FABRICS, e.g. FROM FIBRES OR FILAMENTARY MATERIAL; FABRICS MADE BY SUCH PROCESSES OR APPARATUS, e.g. FELTS, NON-WOVEN FABRICS; COTTON-WOOL; WADDING ; NON-WOVEN FABRICS FROM STAPLE FIBRES, FILAMENTS OR YARNS, BONDED WITH AT LEAST ONE WEB-LIKE MATERIAL DURING THEIR CONSOLIDATION
    • D04H1/00—Non-woven fabrics formed wholly or mainly of staple fibres or like relatively short fibres
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N30/00—Investigating or analysing materials by separation into components using adsorption, absorption or similar phenomena or using ion-exchange, e.g. chromatography or field flow fractionation
    • G01N30/02—Column chromatography
    • G01N30/50—Conditioning of the sorbent material or stationary liquid
    • G01N30/52—Physical parameters
    • G01N2030/521—Physical parameters form
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10S—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10S502/00—Catalyst, solid sorbent, or support therefor: product or process of making
    • Y10S502/52724—Peculiar structure or physical form, e.g. foam, sponge, foil, sack, bag, fiber in a matrix, monolith, microstructure, microcracking, or microaggregates
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
    • Y10T428/29—Coated or structually defined flake, particle, cell, strand, strand portion, rod, filament, macroscopic fiber or mass thereof
    • Y10T428/2913—Rod, strand, filament or fiber
    • Y10T428/2933—Coated or with bond, impregnation or core
    • Y10T428/2938—Coating on discrete and individual rods, strands or filaments
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y10—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC
    • Y10T—TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER US CLASSIFICATION
    • Y10T428/00—Stock material or miscellaneous articles
    • Y10T428/29—Coated or structually defined flake, particle, cell, strand, strand portion, rod, filament, macroscopic fiber or mass thereof
    • Y10T428/2913—Rod, strand, filament or fiber
    • Y10T428/2973—Particular cross section

Abstract

성형된 섬유로부터 유래된, 크로마토그래피용, 특히 이온 교환 크로마토그래피용 흡착성 매질. 특정 실시양태에서, 작용화된 성형 섬유는 통상의 섬유와 비교하여 섬유의 표면적을 현저히 증가시키는 피브릴화된 또는 릿지형 구조를 제공한다. 상기 고 표면적 섬유에 대하여 양이온 교환 또는 음이온 교환 작용성을 부여하는 현수 작용기를 표면에 제공하는 방법도 또한 개시되어 있다. 상기 현수 작용성은 모노클로날 항체(mAb)와 같은 생체분자의 이온 교환 크로마토그래피 정제용으로 유용하다.

Description

크로마토그래피 매질 및 방법{Chromatogrphy media and method}
본 출원은, 그 내용이 참조에 의해 본 명세서에 포함되는, 2010년 7월 30일 출원된 미국 가출원 번호 61/369,331호를 우선권 주장한다.
분야
본 명세서에 개시된 실시양태들은 이온 교환 크로마토그래피에 의해서와 같은 생체분자의 정제에 적합한 크로마토그래피 매질에 관한 것이다.
모노클로날 항체(monoclonal antibodies)와 같은 다양한 치료성 생체분자의 상업적 등급의 정제는 현재 비드 기제(bead based) 크로마토그래피 수지를 이용하여 달성된다. 모노클로날 항체(mAB)는 치료제 및 진단제로서 계속 그 중요성을 얻고 있다. 후보 mAB에 대한 하이브리도마 라이브러리를 스크리닝하는 방법은 시간 소모적이고 또 노동 집약적이다. 적합한 mAB를 발현하는 하이브리도마 세포주가 확립되면, 더욱 특징화하기 위한 충분한 mAB를 생성하기 위하여 정제 방법도 개발되어야 한다. 전통적인 정제 방법은 단백질 A 또는 단백질 G 친화성 크로마토그래피뿐만 아니라 이온 교환 크로마토그래피를 사용하는 것을 포함한다. 정제된 항체는 투석을 이용하여 탈염되고 생물학적 완충액으로 교환된다. 전체 과정은 전형적으로 완성하기까지 수일 소요되며 또 복수의 mAB가 병행하여 평가될 때 특히 부담된다.
크로마토그래피 수지는 비드가 친화성, 양이온 교환, 또는 음이온 교환 모드로 작용할 수 있도록 다양한 리간드 구조를 갖도록 현재 제조되고 있다. 이들 수지는 높은 기공율 및 큰 표면적을 나타내어, 제조규모(예를 들어, 10,000 리터)에서 생체분자의 뱃치 가공(batch processing)을 위한 충분한 흡착성능을 수지에 제공한다. 크로마토그래피 수지는 최소의 유동 불균일성으로 효율적인 컬럼 팩킹(packing)이 가능한 구형 구조를 전형적으로 나타낸다. 비드 사이의 간극(interstitial space)은 크로마토그래피 컬럼을 통하여 대류 수송을 위한 플로우 채널(flow channels: 유로)을 제공한다. 이것은 크로마토그래피 컬럼이 최소의 압력 강하에 의해 높은 선속도(linear velocity)에서 큰 층 깊이(bed depth)로 실행될 수 있게 한다. 이들 인자의 조합은 크로마토그래피 수지가 생체분자의 대규모 정제를 위해 요구되는 소망하는 효율, 높은 투과성 및 충분한 결합능을 나타낼 수 있게 한다. 비드 기제 크로마토그래피에서, 흡착에 유용한 대부분의 표면적은 비드의 내부이다. 따라서, 상기 분리 공정은 본질적으로 느린데, 이는 질량 수송 속도가 전형적으로 기공 확산에 의해 제어되기 때문이다. 이러한 확산 저항을 최소화하고 또 부수적으로 동적(dynamic) 결합능을 최대화하기 위하여, 작은 직경의 비드가 적용될 수 있다. 그러나, 작은 직경의 비드의 사용은 컬럼 압력 강하 증가를 희생한 것이다. 따라서, 분취(preparative) 크로마토그래피 분리의 최적화는 흔히 효율/동적 능력(작은 비드 선호됨)과 컬럼 압력 강하(대형 비드 선호됨) 사이의 절충을 포함한다.
크로마토그래피 매질은 전형적으로 가격이 아주 비싸고(>$1000/L) 또 대규모 제조 컬럼의 경우 상당량이 필요하다. 그 결과, 생물약제 제조자는 크로마토그래피 수지를 수백회 재활용한다. 이들 재생 주기 각각은 상당량의 매질을 소모하고, 또 각 단계는 각 세정, 멸균, 및 컬럼 팩킹 작업을 실시하는 것과 관련한 추가적 비용을 발생시킨다.
특허 문헌에는 작용화된 섬유성 매질 및/또는 복합물을 기본으로 하여 생물약제를 분리하기 위한 몇 가지 방법이 기재되어 있고 또 시판되고 있다. 다공성 겔을 섬유 매트릭스에 혼입하는 것을 흔히 기초로 하여, 필요한 표면적을 제공하는 상기 겔은 타당한 결합능을 획득할 것이다. 그러나, 이러한 구조에서, 겔 위치 및 중량에서 불량한 균일성이 일반적으로 불량한 효율(얕은 파과(breakthrough) 및 용출 프런트)을 초래한다. 또한, 유동에 대한 내성은 짧은 층 깊이의 경우에서도 높을 수 있어, 적당한 압력 하중하에서 겔 압축에 의해 문제가 흔히 악화된다. 실시된 다른 시도 방법은 섬유 매트릭스 내에 미립자를 혼입하는 것으로, 상기 미립자는 흔히 다공성이어서 천연의 흡착 작용성을 보유하며, 그 예는 활성탄 및 실리카겔이다.
층 투과성 및 도달가능한 유속을 희생시키지 않고도 생체분자 크로마토그래피 적용을 위해 고 표면적 섬유와 현수(pendant) 흡착 작용성의 조합을 제공한다면 바람직할 것이다. .
요약
종래 기술의 단점은, 크로마토그래피용, 특히 이온 교환 크로마토그래피용 흡착성 매질에 관련된 본 명세서에 기재된 실시양태에 의해 해결되었다. 개시된 크로마토그래피 매질은 성형 섬유(shaped fiber)로부터 유래한다. 특정 실시양태에서, 상기 성형 섬유는 피브릴화된(fibrillated) 또는 릿지형(ridged) 구조를 나타낸다. 이들 릿지는 통상의 섬유와 비교할 때 섬유의 표면적을 크게 증가시킬 수 있다. 따라서, 섬유 직경을 감소시키지 않고도 고표면적을 얻으며, 이는 전형적으로 층 투과성에서 현저한 감소 및 유속에서 상응하는 감소를 초래한다. 특정 실시양태에 따른 고 표면적 섬유의 예는 알라쏘 인더스트리스 인코포레이션(미국 노쓰캐롤라이나 랄리 소재)으로부터 구입할 수 있는 날개형(winged) 섬유이다. 알라쏘의 날개형 섬유의 횡단면의 SEM 영상이 도 1d에 제공되어 있다. 이들 섬유는 약 14 m2/g의 표면적을 제공한다. 예컨대 양이온 교환 또는 음이온 교환 작용성을 상기 고 표면적 섬유에 제공하는 표면 현수 작용기를 부가하는 방법도 또한 본 명세서에 개시되어 있다. 상기 현수 작용성(functionality)은 모노클로날 항체(mAb)와 같은 생체분자의 이온 교환 크로마토그래피 정제용으로 유용하다.
본 명세서에 개시된 실시양태는 또한 고 표면적 작용화된 섬유를 포함하는 매질을 이용하여 생체분자를 단리, 정제 또는 분리하는 방법에 관한 것이다. 이들 방법은 유통 모드(flow through mode) 또는 결합/용출 모드로 실시될 수 있다. 예컨대, mAb 정제에서, 양이온 교환 크로마토그래피가 전형적으로 실시되며, 항체 단백질의 등전점 미만의 pH 및 적당하게 억제된 용액 도전성에서 실시하면, 상기 항체 단백질은 이온 교환 리간드를 통하여 지지체에 이온적으로 결합하는 반면에 결합되지 않은 오염물(숙주 세포 단백질, 핵산, 등)은 크로마토그래피 층(bed)을 통하여 자유로이 통과할 것이다. 이들 오염물은 비드 수지와 단백질 사이의 이온성 상호작용을 차단하기에 충분히 높은 도전성의 완충액을 사용하여 결합 mAb 생성물을 방출하기 전에, 팩킹된 비드 층을 적절한 완충액 용액을 사용하여 씻어내는 것에 의해서도 또한 제거된다. 대조적으로, 음이온 교환 크로마토그래피는 모노클로날 항체 생산에서 흔히 하류에 사용되어 잔류 세포 배양액 오염물을 제거하며, 이때 상기 작업은 mAb 단백질이 비드 수지의 양이온성 표면에 결합하지 않지만 대신에 크로마토그래피 컬럼을 자유로이 통과하게 하는 pH 및 도전성의 용액 조건에서 실시된다. 반면에 네트 음전하(net negative charge)를 갖는 단백질 및 핵산은 음이온 교환 수지에 효과적으로 결합하므로 생성물로부터 제거된다.
특정 실시양태에 따르면, 본 명세서에 개시된 매질은 높은 층 투과성(예를 들어, 500-900 mDarcy), 비드 기제 크로마토그래피 매질에 비하여 낮은 원료 비용, 20-60 mg/mL IgG 동적 결합, 높은 분리 효율(예를 들어, HETP < 0.1 cm), 50-160 mg/g IgG 정적 결합능, 및 리간드 결합 부위에 대한 흡착질(adsorbate)의 신속한 대류 우세 수송을 갖는다.
특정 실시양태에 따르면, 독특한 고 표면적, 압출 섬유(예를 들어, 열가소성 섬유)의 사용은, 임의적으로 배향된 2 내지 6 mm 길이의 절단 섬유의 팩킹 층(packed bed)으로 구성될 때, 높은 유동 투과성(액체) 및 균일한 유동 분포를 허용한다. 그러한 섬유 표면을 작용화하는 화학 처리 방법은 흡착성 상호작용(들)을 기본으로 한 생체분자적 및 생물학적 분리가 가능하도록 제공된다. 화학 처리 방법은 이온성, 친화성, 소수성 등의 상호작용 또는 상호작용의 조합을 기본으로 하는 섬유에 다양한 표면 화학 작용성을 부여할 수 있다. 섬유 제조 및 간단한 표면 화학 처리 공정의 조합된 경제에 의해 생물약제 뿐만 아니라 백신 제조에서 정제 작업을 위한 경제적이고 용이하게 측량가능한 기술을 얻는다.
특정 실시양태에 따르면, 신속한 가공 속도를 허용하는 흡착성 분리 물질이 제공되는데, 이는 확산성 수송이 더 긴 접촉시간을 요하므로 더 느린 가공 속도로 만드는 것과 대조적으로, 섬유 표면으로 및 섬유 표면으로부터 용질의 대량 수송은 매질을 통한 유체 대류에 의해 크게 제어되기 때문이다. 비드 기공의 입체적(steric) 제한으로 인하여 통상의 비드 기제 매질을 이용하여서는 효과적으로 분리될 수 없는 바이러스와 같은 대형 생물학적 종을 포획하거나 제거하는 능력이 제공된다.
도 1a는 종래 기술에 따른 섬유의 개략도이다;
도 1b는 특정 실시양태에 따라 사용될 수 있는 릿지형 섬유의 개략도이다;
도 1c는 특정 실시양태에 따라 부착된 현수 기를 갖는 도 1b의 섬유의 개략도이다;
도 1d는 특정 실시양태에 따라 사용될 수 있는 릿지형 섬유의 SEM 영상이다;
도 1e는 특정 실시양태에 따른 섬유의 작용화(fucntionalization)의 개략도이다;
도 1f는 특정 실시양태에 따른 섬유의 작용화의 다른 개략도이다;
도 2는 특정 실시양태에 따른 SP-작용화된 매질에 대한 IgG 파과 곡선(breakthrough) 및 용출 피크이다;
도 3은 특정 실시양태에 따른 다양한 속도에서 SP-작용화된 매질에 대한 IgG 파과 곡선의 플럿이다;
도 4는 특정 실시양태에 따른 다양한 선속도에서 IgG 동적 결합능의 플럿이다;
도 5는 특정 실시양태에 따른 mAb 부하 시험(challenge test)의 크로마토그램이다;
도 6은 특정 실시양태에 따라 작용화된 매질에 대한 mAb 용출 피크이다;
도 7a, 도 7b 및 도 7c는 특정 실시양태에 따라 단백질 A HPLC에 의한 IgG 정량화를 도시한다;
도 8a, 도 8b 및 도 8c는 특정 실시양태에 따른 CHO-HCP에 대한 ELISA 데이터를 도시한다;
도 9는 특정 실시양태에 따른 모노클로날 항체 공급물(feed)의 유통 응집물 정리제거(clearance)를 나타내는 그래프이다;
도 10은 특정 실시양태에 따라 SP-촉수(tenacle) 작용화된 매질에 대한 IgG 파과 곡선의 플럿이다;
도 11은 특정 실시양태에 따른 다양한 속도에서 SP-촉수 작용화된 양이온 교환 매질에 대한 IgG 파과 곡선의 플럿이다; 그리고
도 12는 특정 실시양태에 따른 다양한 속도에서 SP-촉수 작용화된 양이온 교환 매질에 대한 IgG 동적 결합능의 플럿이다.
상세한 설명
본 명세서에 기재된 실시양태에 따른 성형된 섬유(shaped fiber) 매질은 섬유 자체의 표면에 의존한다. 성형된 섬유는 고 표면적 뿐만 아니라 높은 유동 투과성을 갖기 때문에, 히드로겔 또는 다공성 미립자의 부가와 같은 장식처리는 성능(capacity) 및 효율에 대한 실시 목적을 반드시 만족해야 하는 것은 아니다. 또한, 히드로겔 또는 다공성 미립자의 부가에 의한 표면적 향상을 필요로 하지 않아, 본 명세서에 기재된 매질의 제조 비용은 최소로 유지된다.
섬유는 임의 길이 및 직경일 수 있고 또 바람직하게는 절단 섬유 또는 스테이플 섬유 또는 부직포(non-woven fabric)이다. 이들은 일체 구조로 함께 결합될 필요는 없지만 개별의 독자적인 성분으로서 효과적으로 작용할 수 있다. 이들은 규정할 수 없는 길이의 실 또는 모노필라멘트과 같은 연속 길이 형태일 수 있거나 또는 이들은 부직포 또는 직조물과 같은 섬유성 물질(예를 들어, 스테이플 섬유)을 자르는 것에 의해, 결정 성장 방법 등에 의해 형성된 연속적 길이의 섬유를 개별 조작으로 절단하는 것에 의해 더 짧은 개별 섬유로 형성될 수 있다. 바람직하게는 상기 섬유는 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리에틸렌, 폴리아미드, 열가소성 우레탄, 코폴리에스테르, 또는 액체 결정성 중합체와 같은 열가소성 중합체로 제조된다. 약 1-3 데니어를 갖는 섬유가 바람직하다. 특정 실시양태에서, 상기 섬유는 약 1 ㎛ 내지 약 100 ㎛의 단면 길이 및 약 1 ㎛ 내지 약 100 ㎛의 단면 폭을 갖는다. 1개의 적합한 섬유는 약 20 ㎛의 단면 길이와 약 10 ㎛의 단면 폭을 가지므로, 약 1.5 데니어를 초래한다. 약 100,000 cm2/g 내지 약 1,000,000 cm2/g 범위의 표면적을 갖는 섬유가 적합하다. 바람직하게는 상기 섬유는 약 10-20 ㎛의 단면 길이를 갖는다.
특정 실시양태에서, 상기 섬유는 기재된 용도에 적합한 포트(port)와 치수를 갖는 장치 또는 용기에 압축하에 용이하게 팩킹될 수 있다. 상기 섬유는 또한 부직포 산업에서 일반적인 스펀본드(spunbond)(연속성 필라멘트) 또는 웨트-레이드(wet-laid)(절단 섬유) 공정에 의해 생성된 부직 시트스톡(sheestock) 물질과 같은 예비성형된 층 포맷(preformed bed)으로 사용될 수 있다. 적합한 예비성형된 섬유 포맷은 시트, 매트, 웹, 모노리쓰(monoliths) 등을 포함한다.
특정 실시양태에서, 상기 섬유 단면은 일반적으로 날개형상이고, 실질적으로 종축을 규정하는 주 본체 영역(main body region), 및 상기 주 본체 영역으로부터 외부로 향하여 방사상(radially)으로 연장되어 있는 복수의 돌출부(projections)를 갖는다. 상기 돌출부는 섬유의 길이를 따라 연장되는 동일직선상(co-linear)의 다수의 채널을 형성하며, 전형적으로 섬유당 20-30 채널이다. 특정 실시양태에서, 상기 돌출부의 길이는 주 본체 영역의 길이보다 더 짧다. 특정 실시양태에서, 상기 섬유 단면은 일반적으로 날개형상이며, 섬유의 중심 아래로 지나는 종방향 축을 포함하는 중앙 영역(middle region) 및 상기 중앙 영역으로부터 연장되는 복수의 돌출부를 갖는다(도 1d). 특정 실시양태에서, 복수의 돌출부는 일반적으로 중앙 영역으로부터 방사상으로 연장된다. 이 구조의 결과, 복수의 채널이 상기 돌출부에 의해 규정된다. 돌출부 사이에서 적합한 채널 폭은 약 200 내지 약 1000 나노미터 범위이다. 적합한 섬유는 미국 특허 공개번호 2008/0105612호에 기재되어 있고, 그 내용은 참조에 의해 본 명세서에 포함된다.
고 표면적 섬유의 표면 작용화는 2단계 공정에 의해 달성될 수 있다. 적합한 작용화 공정은 그라프팅 중합반응이며, 또 도 1e에 도시된 도식 1에 설명되어 있다. 작용화는 수성 수산화 나트륨 존재하, 50℃에서 12시간 동안 상기 섬유를 알릴 글리시딜 에테르로 처리하는 것에 의해 나일론 6 섬유 표면에 현수 알릴기를 부착시키는 것으로 개시된다. 상기 현수 알릴 기는 현수 아크릴아미드 중합체 작용성을 위한 부착지점으로서 섬유 표면 상에서 고정 부위로서 작용한다. 아크릴아미드 단량체의 용액 중합반응을 위한 조건이 제공되며, 상기 섬유 표면 상의 현수 알릴 기는 용액 중에서 성장하는 중합체 사슬에 부착된다. 따라서, 상기 알릴-작용화된 섬유는 2-아크릴이미도-2-메틸-1-프로판설폰산의 수성 용액, N,N-디메틸아크릴이미드 및 과황산 암모늄으로 80℃에서 4시간 동안 처리하였다. 80℃로 가열되면, 과황산염 분해가 아크릴 단량체의 자유 라디칼 중합반응을 개시한다. 이들 조건하에서, 상기 섬유 표면 상의 현수 알릴 기는 현수 아크릴 중합체 작용성에 대한 부착점으로서 작용한다. 이렇게 하여, 상기 아크릴 중합체는 섬유 표면에 공유적으로 부착된다.
특정 실시양태에서, 상기 아크릴아미드 중합체는 개별적으로 제조되고, 나중에 표면 코팅으로 나일론 섬유에 도포될 수 있다. 생성한 표면-코팅된 섬유는 알릴 그라프팅된 물질에 대하여 상응하는 IgG 결합능을 나타내었다.
특정 실시양태에 따르면, 작용화는, 도 1f에 도시된 바와 같이, 고 표면적 섬유의 표면 상으로 히드록시프로필아크릴레이트(HPA) 및 N,N'-메틸렌비스(아크릴아미드)(MBAm)의 교차결합 코팅을 침적(deposition)시키는 것에 의해 개시된다. 이 단계는 아크릴아미드 단량체의 후속되는 세륨 이온 개시된 레독스(redox) 중합반응에 대한 반응성 히드록실알킬 작용성을 제공한다.
HPS/MBAm 처리된 섬유는 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산 나트륨염의 수용액, 암모늄 세륨(IV) 니트레이트, 및 HNO3에 의해 질소 분위기하의 35℃에서 반응된다. 이들 조건하에서, 상기 섬유 표면 상의 가교결합된 히드록실알킬(히드록시프로필아크릴레이트) 작용성의 세륨 산화는 섬유 표면 상에 자유 라디칼을 생성하고 또 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산 단량체의 표면 그라프팅 중합반응을 개시한다. 이러한 조건하에서, 표면 개시된 중합반응 공정은 중합체화된 (2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산) 단량체의 중합체성 "촉수(tenacle)"를 생성한다. 이렇게 하여, 상기 아크릴아미드 중합체는 상기 섬유 표면에 공유결합적으로 부착된다. 이러한 공정은 그라프팅 중합반응으로 공지되어 있다.
1-5 cm의 층 높이에서 약 0.1-0.4 g/ml, 바람직하게는 약 0.32 g/ml 사이의 적합한 컬럼 팩킹 밀도는 크로마토그래피 평가에서 허용할만한 성능을 위한 충분한 유동 균일성을 제공할 것이다.
특정 실시양태에서, 상기 매질(작용화된 팩킹된 섬유)은, 비드 기제 매질과는 달리, 건조, 예비팩킹된 포맷으로 사용자에게 전달될 수 있다. 상기 섬유는 열적 또는 화학적 수단에 의해 융합되어 압력 용기에 내장될 수 있는 반강성(semirigid) 구조를 형성할 수 있다. 이러한 구성에 의해, 상기 매질 및 수반하는 장치는 사용할 준비가 된 상태로 제조될 수 있다. 크로마토그래피 비드 기제 매질은 일반적으로 느슨한(loose) 물질(습윤)로서 전달되며, 이때 사용자는 압력 용기(컬럼)에 로딩할 필요가 있고 또 다양한 수단에 의해 공극(void) 또는 채널 없이 잘 팩킹된 층을 생성한다. 후속 시험은 일반적으로 팩킹의 균일성을 보장할 필요가 있다. 대조적으로, 특정 실시양태에 따르면, 생성물이 사용할 준비가 되어 있어 사용자에 의한 팩킹은 필요치 않다.
성형된 섬유 매질은 그의 형태 성질상 다공성 크로마토그래피 비드 상에 비하여 특정의 이점을 제공한다. 전형적으로 비드 기제 크로마토그래피에서, 분리 공정에서 속도 제한 단계는 확산에 의해 제어되는 바와 같이 다공성 비드의 깊이로 흡착질(용질)이 침투하는 것이다; 단백질과 같은 거대분자의 경우, 상기 확산 수송은 비교적 느릴 수 있다. 본 명세서에 개시된 고 표면적 섬유의 경우, 상기 결합부위는 섬유의 외부에 노출되어 있으므로 유동 스트림 중의 흡착질 분자에 의해 용이하게 접근될 수 있다. 이 방법에 의해 제공된 신속한 수송은 짧은 체류 시간(높은 유속)을 허용하므로, 모의된 이동성 층 시스템과 같은 수단에 의해 매질의 신속한 순환을 가능하게 한다. 생물물질의 생산에서 가공 속도는 중요한 변수이기 때문에, 본 명세서에 개시된 바와 같은 섬유 기제 크로마토그래피 매질은 통상의 비드 기제 매질에 비하여 특정의 공정 이점을 갖는다.
통상의 크로마토그래피 수지는 전형적으로 아가로오스, 합성 중합체 및 실리카 또는 유리로 된 다공성 비드로 시작된다. 이들 물질은 일반적으로 고가이고; 비작용화된 아가로오스 비드는 리터당 $300-$350 사이의 비용이 들 수 있고 제어된 기공 유리는 리터당 $600-$1000의 비용이 들 수 있다. 대조적으로, 양호한 크로마토그래피 특성을 달성하기 위하여 적합한 밀도와 두께의 본 명세서에 기재된 바와 같은 고 표면적 섬유의 부직포 층은 리터당 $20-$50 사이의 비용으로 추산된다. 이 비용 이점은 이 신규 크로마토그래피 매질이 사용하기에 적합한 가격의 "일회용" 기술로서 시판될 수 있고 또 단일 사용 후에 또는 가장 가능하게는 하나의 제조 캠페인 내의 다수 주기 후에 버릴 수 있다.
본 명세서에 개시된 실시양태의 표면 작용화된 섬유 매질(예를 들어, SP 작용화된 알라쏘(Alasso) 섬유, SPF1)은 팩킹된 층 포맷으로 고 투과성을 나타낸다. 팩킹 밀도에 따라서, 상기 층 투과성은 >14000 mDarcy 내지 1000 mDarcy 미만 범위일 수 있다. 0.1 g/mL(1 g 매질/9.3 mL 컬럼 부피)의 낮은 팩킹 밀도에서, 900 cm/hr의 선속도(linear velocity)에서 14200 mDarcy의 층 투과성이 측정되었다. 이 값은 넓은 속도 범위(400-1300 cm/hr)에 걸쳐 변화되지 않는다. 이러한 거동은 팩킹된 섬유 층이 높은 선속도를 억제하지 않음을 나타낸다. 이어, 표면 작용화된 섬유 매질(SP 작용화된 알라쏘 섬유, SPF1)을 0.33 g/mL(1 g 매질/ 2.85 mL 컬럼 부피)의 더 높은 팩킹 밀도로 압축하여 900 cm/hr의 선속도에서 1000 mDarcy의 층 투과성을 얻었다. 유사하게, 이러한 1000 mDarcy 값은 400-1300 cm/hr의 선속도 범위에 걸쳐 변하지 않았다. 적합한 팩킹 밀도는 약 0.1 내지 약 0.5 g/ml를 포함한다.
ProRes-S(밀리포어 코포레이션 제조, 매사추세츠 빌레리카 소재)와 같은 생체분리에 적용된 통상의 팩킹된 층, 이온 교환 크로마토그래피 매질의 경우, 상기 경우((3 cm 층 깊이, 11 mm ID Vantage 컬럼, 2.85 mL 컬럼 부피)에 대하여 유사한 치수의 팩킹된 층에 대해 1900 mDarcy의 투과성 값이 측정되었다. 막 흡착제(adsorber)의 경우, 전형적인 투과성 값은 1-10 mDarcy 범위이다. ProRes-S의 경우, 400-1300 cm/hr의 속도 범위에 걸쳐 층 투과성에서 유의한 변화가 관찰되지 않았다. 이러한 거동은 ProRes-S와 같은 반강성 비드에 대해서도 예상되었으나; 더욱 압축성 매질(예컨대 아가로오스 비드)이 팩킹된 층의 현저한 압축으로 인하여 높은 선속도(> 200 cm/hr)에서 층 투과성에서 현저한 감소를 나타낼 것으로 기대된다.
표 2에서, 본 명세서에 개시된 실시양태의 표면 작용화된 섬유 매질(SPF1)에 대한 IgG 동적 결합능 데이터가 제공되어 있다. 200 cm/hr 내지 1500 cm/hr의 선속도 범위에 걸친 1, 5, 10, 50% 파과 현상에서 IgG DBC 값에서 어떠한 유의한 변화도 측정되지 않았고 또 도 3에 제공된 IgG 파과 곡선의 형상에서 유의한 변화가 없었다.
하기 표 A에서, IgG 동적 결합능 데이터는 다양한 범위의 선속도에 걸쳐서 측정된 ProRes-S에 대해 제공되었다. 이러한 전통적인 팩킹된 층, 비드 기제, 이온 교환 크로마토그래피 매질(ProRes-S)의 경우, 포획 크로마토그래피 적용에 결합하고 용출하기 위한 DBC를 최대화하기 위해 60 cm/hr의 선속도가 추천된다. 더 높은 속도(> 60 cm/hr)에서, IgG 동적 결합능에서 현저한 감소가 있다. 측정된 최고 높은 선속도(1200 cm/hr)에서, 상기 IgG DBC는 60 cm/hr 케이스에 대해 측정된 분획이다. ProRes-S가 60 cm/hr 보다 큰 선속도에서 동작될 때 IgG 파과 곡선의 현저한 확대가 관찰되었다.
60 cm/hr 보다 큰, 특히 200 cm/hr 보다 큰 선속도에서 매우 짧은 체류 시간 또는 컬럼 동작을 요하는 적용의 경우, 상기 SP-작용화된 섬유 매질(SPF1)은 ProRes-S와 같은 전통적인 비드 기제 크로마토그래피 수지에 비하여 이들 적용에 더욱 더 적합하다.
Figure pct00001
표 A. 다양한 선속도에서 1, 5, 10 및 50% 파과에서 ProRes-S 매질에 대한 IgG DBC 값.
고 표면적 섬유 표면 작용화 및 자유 라디칼 중합반응 그라프팅 과정의 예를 이하에 제공한다.
실시예 1 : 현수 알릴 기에 의한 고 표면적 섬유의 표면 변형
알릴 글리시딜 에테르에 의한 나일론 섬유 표면 변형
유리 병에 알릴 글리시딜 에테르(28.9 g, 250 mmol), 황산 나트륨(6.0 g, 42 mmol) 및 4N 수산화 나트륨 용액(60 mL)을 부가하였다. 4 g의 느슨한 나일론 섬유(공급자, lot ID)를 상기 혼합물에 부가하였다. 습윤 고체를 12시간 동안 50℃로 가열하였다.
실온으로 냉각한 후, 상기 고체를 부크너 깔때기로 전달하고 또 증류수(400 mL)로 세척하였다. 상기 물질을 진공하에서 30분간 건조시켰다.
9.4 g을 축축한 고체로 수득하였다.
상기 물질은 다음 단계에 즉시 사용되었다.
실시예 2 . 현수 설포프로필 양이온 교환 작용성을 사용한 알릴-변형된, 고 표면적 섬유의 자유 라디칼 그라프트 중합반응.
알릴-변형된 나일론( AMPS / DMAM 55/45)의 그라프트 중합반응. 유리 병에 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산(AMPS, 5.02 g, 24 mmol), N,N-디메틸아크릴아미드(DMAM, 1.96 g, 20 mmol), 과황산 암모늄(0.49 g, 2 mmol) 및 물(72.8 mL)을 부가하였다. 9.4 g의 느슨한 나일론 섬유(실시예 1)를 상기 혼합물에 부가하였다. 습윤 고체를 4 시간 동안 80℃로 가열하였다.
실온으로 냉각한 후, 상기 고체를 부크너 깔때기로 전달하고 또 증류수(450 mL) 및 메탄올(250 mL)에 의해 세척하였다. 상기 물질을 오븐에 놓고 70℃에서 12시간 동안 건조시켰다.
4.0 g을 백색의 섬유성 고체로 수득하였다.
실시예 3 . 생성한 매질의 작용 성능
실시예 2로부터의 설포프로필-작용화된 고 표면적 섬유는 폴리클로날 인간 감마 면역글로불린(IgG)의 정제에 대한 양이온 교환 크로마토그래피로 평가하였다. IgG에 대한 정적 결합능 측정 결과는 하기 표 1에 제공된다. 이 연구에서, 알라쏘 인더스트리스(lot ID 090602PA6C)로부터 얻은 비작용화된 "날개형 섬유" 샘플의 정적 결합능은 상기 실시예 1 및 2에 기재된 UV-개시된 중합반응 공정 및 열적으로 개시된 중합체 그라프팅 공정에 의해 제조된 설포프로필-작용화된 섬유 샘플과 비교하였다. 열적으로 개시된 자유 라디칼 그라프팅 과정은 UV-개시된 공정(10-30 mg IgG/g 섬유 샘플) 및 비작용화된 섬유 단독(20 mg IgG/g 섬유 샘플)에 비하여 현저하게 더 높은 정적 결합능(50-80 mg IgG/ g 섬유 샘플)을 갖는 SP-작용화된 섬유 매질을 제공하였다. 1M NaCl 용액을 사용한 IgG 용출 연구는 이들 샘플 상에서 실시하였다. SP-작용화된 물질로부터 이들 용출 조건하에서 결합 IgG의 50-70% 회수율이 측정되었다. 이들 결과를 기초로, 상기 SP-작용화된 섬유 매질은 생체분자 크로마토그래피 적용에서 작용 성능 시험에 대해 충분한 정적 결합능 및 염 용출 특성을 나타낸다.
Figure pct00002
표 1. 정적 결합능 측정. 부하(challenge) 시험: 50 mM 아세트산 나트륨(pH 5) 중의 2 g/L 폴리클로날 인간 IgG(SeraCare LifeSciences 제조, 매사추세츠 밀포드 소재). 완충액 50 mM 아세트산 나트륨(pH 5)을 사용하여 세척. 50 mM 아세트산 나트륨(pH 5) 중의 완충액 1M 염화나트륨으로 용출.
실시예 4 .
약 0.3 g의 느슨한 SP-작용화된 알라쏘 날개형 섬유를 6.6 mm ID Omnifit 크로마토그래피 컬럼에 로딩하였다. 층 부피를 상부 용매 분포 헤더(top solvent distribution header)의 압축에 의해 2 cm로 조정하여 0.68 mL의 컬럼 부피를 얻었다. IgG 동적 결합능 측정은 하기 과정에 따라서 실시하였다:
10 CV 50 mM NaOAc 완충액(pH 5)(평형화)
50 mM NaOAc 완충액(pH 5) 중의 60 CV 2 mg/mL IgG(SeraCare)
(IgG 부하시험)
80 CV 50 mM NaOAc 완충액(pH 5)(세척)
50 mM NaOAc 완충액(pH 5) 중의 50 CV 1M NaCl (용출)
20 CV 0.5 M NaOH (세정)
60 CV 50 mM NaOAc 완충액(pH 5)(세척)
도 2는 특정 실시양태에 따른 실시예 2에 기재된 SPFl 섬유에 대한 전형적인 IgG 파과 곡선의 예를 제공한다. 예리한 파과 곡선이 있으며 또 IgG 동적 결합능은 20 내지 30 mg/mL 범위에서 측정하였다(표 2). 50 mM NaOAc 완충액(pH 5) 중의 1M 염화 나트륨을 사용한 용출시 결합 IgG의 정량 회수를 달성하였다.
Figure pct00003
도 3은 200 cm/hr 내지 1500 cm/hr 범위의 다양한 선속도에서 SPFl 섬유 매질 컬럼에 대한 중첩된 IgG 파과 곡선을 제공한다. 선형 유속이 증가함에 따른 파과 곡선의 형상에서 변화는 없었다.
도 4는 아주 높은 속도(1500 cm/hr)에서 측정된 IgG 동적 결합능에서 최소한의 변화를 도시한다. 이 거동은 이온성 리간드 결합 부위로의 IgG 분자의 대류 수송에 의해 지배되는 계를 나타내는 것이다.
대조적으로, 전통적인 비드 기제 이온 교환 크로마토그래피 수지는 동적 결합능에서 현저한 감소를 나타내고 또 속도가 증가함에 따라서 더욱 파과 곡선을 확산시킬 것이다. 아주 높은 속도에서, 층 압축은 비드의 통합성을 절충시켜, 불량한 유동 균일성 및 감소된 크로마토그래피 성능을 초래한다.
실시예 5 . 아크릴아미드 공중합체 코팅에 의한 나일론 표면 변형.
AMPS / DMAM 55/45의 용액 중합반응. 250 mL 3구 원형바닥 플라스크에 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산(AMPS, 10.04 g, 48 mmol), N,N-디메틸아크릴아미드(DMAM, 3.92 g, 40 mmol), 과황산 암모늄(0.98 g, 4 mmol) 및 물(146 mL)을 부가하였다. 상기 용액을 4시간 동안 80℃로 가열하였다. 실온으로 냉각한 후, 상기 중합체 용액을 이하의 단계에 즉시 사용하였다.
AMPS / DMAM 중합체 코팅에 의한 나일론 섬유 표면 변형. 유리 병에 상기 제조한 19 g의 AMPS/DMAM 55/45 공중합체 용액 및 1 g의 느슨한 나일론 섬유(알라쏘 인더스트리스, #090602PA6C)를 부가하였다. 습윤 고체를 80℃에서 24시간 동안 가열하였다. 실온으로 냉각한 후, 상기 고체를 부크너 깔때기로 전달하고 또 증류수(3 x 50 mL) 및 메탄올(1 x 50 mL)에 의해 세척하였다. 이 물질을 진공하에서 10분간 건조시켰다. 이 물질을 오븐에 넣어 40℃에서 24시간 동안 건조시켰다.
백색 섬유성 고체로서 0.9 g을 수득하였다.
정적 결합능 측정. IgG에 대한 정적 결합능 측정 결과는 하기 표 3에 제공한다. 이 연구에서, 알라쏘(로트 번호 090602PA6C)로부터 구입한 비작용화된 "날개형 섬유" 샘플의 정적 결합능을 본 실시예(실시예 5)의 용액 중합체 코팅에 의해 제조된 설포프로필-작용화된 섬유 샘플의 정적 결합능과 비교하였다. 이 연구에서, 상기 용액 중합체 코팅 과정은 비작용화된 섬유 단독(1 mg IgG/g 섬유 샘플)에 비하여 더 높은 정적 결합능(30-40 mg IgG/g 섬유 샘플)을 갖는 SP-작용화된 섬유 매질을 제공하였다. 이들 결과를 토대로, SP-작용성 중합체 섬유 코팅은 AMPS/DMAM 공중합체 용액의 간단한 코팅 및 열적 어닐링에 의해 제공될 수 있다.
Figure pct00004
실시예 6. 현수 알릴 기에 의한 고 표면적 섬유의 표면 변형
알릴 글리시딜 에테르에 의한 나일론 섬유 표면 변형
0.5 L 플라스크에 알릴 글리시딜 에테르(70.7 g, 620 mmol), 황산 나트륨(14.9 g, 105 mmol) 및 4N 수산화 나트륨 용액(350 mL)을 부가하였다. 10 g의 느슨한 나일론 섬유(알라쏘 인더스트리스, #090602PA6C)를 상기 혼합물에 부가하였다. 습윤 고체를 12시간 동안 50℃로 가열하였다. 실온으로 냉각한 후, 상기 고체를 부크너 깔때기로 전달하고 또 증류수(1.5 L) 및 메탄올(0.5 L)로 세척하였다. 이 물질을 진공하에서 30분간 건조시켰다. 이 물질을 오븐에 넣고 50℃에서 18시간 동안 건조시켰다.
백색 섬유성 고체로 8.8 g을 수득하였다.
실시예 7. 현수 설포프로필 양이온 교환 작용성에 의한 알릴-변형된, 고 표면적 섬유의 자유 라디칼 그라프트 중합반응
알릴-변형된 나일론( AMPS / DMAM 55/45)의 그라프트 중합반응. 유리 바이얼에 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산(AMPS), N,N-디메틸아크릴아미드(DMAM), 과황산 암모늄 및 물을 하기 표 4에 제공된 비율로 부가하였다. 느슨한 알릴 글리시딜 에테르 변형된 나일론 섬유(실시예 6)를 각 혼합물에 부가하였다. 습윤 고체를 80℃에서 4 시간 동안 가열하였다.
실온으로 냉각한 후, 습윤 고체를 각 부크너 깔때기로 전달하고 또 증류수(3 x 50 mL) 및 메탄올(1 x 50 mL)에 의해 세척하였다. 이 물질을 오븐에 넣고 40℃에서 12 시간 동안 건조시켰다.
건조된, 표면-변형된 섬유 샘플은 IgG 시험 용액을 사용한 정적 결합능 측정에 준비가 되어 있다.
정적 결합능 측정. IgG에 대한 정적 결합능 측정 결과는 하기 표 4에 제공된다. 이 연구에서 알라쏘(로트 번호 090602PA6C)로부터 입수한 비작용화된 "날개형 섬유" 샘플의 정적 결합능을 열적으로 개시된 중합체 그라프팅 공정(샘플 A-G)에 의해 제조된 설포프로필-작용화된 섬유 샘플과 비교하였다. 이 연구에서, SP-작용화된 섬유 매질의 IgG 정적 결합능은 AMPS/DMAM 중합체 조성 및 반응 용액의 농도에 의해 영향을 받을 수 있다. 예컨대, 샘플 E 및 G는 비작용화된 나일론 섬유 단독(6 mg IgG/g 섬유 샘플) 뿐만 아니라 더 높은 AMPS 함량을 갖도록 제조된 A 및 C 샘플의 IgG 정적 결합능에 비하여 실질적으로 더 높은 IgG 정적 결합능을 나타낸다.
Figure pct00005
매질의 작용 성능. 실시예 2로부터의 설포프로필-작용화된 고 표면적 섬유의 작용 성능은 양이온 교환 크로마토그래피에 의해 모노클로날 항체(mAb)을 결합시키고 용출 정제하는 이하의 실시예로 평가하였다. mAb는 6.7 mg/mL 농도로 단백질 A 컬럼으로부터 용출된 것으로 제공되었다.
실시예 8. 모노클로날 항체의 결합 및 용출 정제
컬럼 팩킹. 실시예 2로부터 얻은 0.9 g의 설포프로필-작용화된 고 표면적 섬유를 100 g 이소프로판올에서 30분간 슬러리화시켰다. 400 mL의 탈이온수를 부가하고 또 상기 슬러리를 철야로 교반하였다. 상기 섬유 슬러리를 11 mm ID vantage 컬럼으로 전달하고, 진공을 이용하여 컬럼을 통하여 과량의 액체를 빼내고 스테이플 섬유의 압축을 용이하게 하였다. 상기 슬러리를 컬럼으로 전달한 후, 컬럼의 상부 헤더를 설치하고 또 상기 헤더를 압축하여 최종 컬럼 부피 2.76 mL(표적 성능을 위한 층 압축)를 얻었다. 2중량% 아세톤 용액을 사용하여 HETP 및 피크 비대칭 측정을 실시하였다. HETP는 0.1 cm 미만으로 측정되었고 또 피크 비대칭은 2.0 미만으로 측정되었다.
양이온 교환 크로마토그래피에 의한 mAb 정제. 도 5 및 6에서, 실시예 2의 양이온 교환 매질을 사용한 mAb의 결합/용출 정제로부터 얻은 크로마토그램의 예가 제공된다. 이 실시예에서, 6.7 mg/mL mAb(14.7 mg mAb)를 함유하는 단백질 A 용출물 0.79 CV(2.18 mL)를 상기 컬럼에 적용하고 또 100 mM MES 완충액(pH 6) 중의 250 mM NaCl에 의해 용출시켰다. mAb 용출 피크는 20 0.5 CV 분획(각 분획 = 1.38 mL)으로 수집하였다. 280 nm에서 각 분획의 UV 흡수의 측정에 의한 mAb 용출 분획의 정량은 13.8 mg (94% 수율)의 회수율을 나타내었다. IgG 용출 분획은 도 7에서 단백질 A HPLC에 의해 분석되었다. 이 분석은 또한 각 용출 분획의 IgG 농도를 제공한다. 이 분석에 의하여, mAb 용출은 주로 분획 #5-9에 존재하였고, 또 mAb 회수율은 90%이다
도 8에서, ELISA 데이터는 각 mAb 용출 분획의 중국 햄스터 난소 숙주 세포 단백질 농도(CHO-HCP)에 대해 제공되었다. 상기 HCP는 주로 479 ng/mL의 평균 농도로 분획 #5-9에서 용출되었다. 상기 mAb 시험 용액은 6944 ng/mL의 HCP 농도를 가졌기 때문에, 1.1의 HCP 정리제거(clearance) 로그 감소 값(LRV)이 산출되었다.
실시예 9. 현수 알릴 기에 의한 고 표면적 섬유의 표면 변형
알릴 글리시딜 에테르에 의한 나일론 섬유 표면 변형.
유리 바이얼에 알릴 글리시딜 에테르(28.8 g, 252 mmol), 황산 나트륨(6.0 g, 43 mmol) 및 4N 수산화 나트륨 용액(60 mL)을 부가하였다. 4 g의 느슨한 나일론 섬유(알라쏘 인더스트리스, #090602PA6C)를 상기 혼합물에 부가하였다. 습윤 고체를 12시간 동안 50℃로 가열하였다.
실온으로 냉각한 후, 상기 고체를 부크너 깔때기로 전달하고 또 증류수(0.5 L)에 의해 세척하였다. 이 물질을 진공하에서 30분 동안 건조시켰다. 습윤 물질은 다음 단계에 즉시 사용되었다.
실시예 10. 현수 트리메틸암모늄 음이온 교환 작용성을 갖는 알릴-변형된, 고 표면적 섬유의 자유 라디칼 그라프트 중합반응.
알릴-변형된 나일론( APTAC 100)의 그라프트 중합반응.
유리 바이얼에 (3-아크릴아미도프로필) 트리메틸암모늄 클로라이드(APTAC, 9.1 g, 44 mmol), 과황산 암모늄(0.64 g, 3 mmol), 물(27 mL) 및 상기 실시예 9로부터 얻은 10 g의 습윤 알릴 글리시딜 에테르 변형 섬유를 부가하였다. 이 용액을 4시간 동안 80℃로 가열하였다.
실온으로 냉각한 후, 습윤 고체를 부크너 깔때기로 각각 전달하고 또 증류수(100 mL) 및 메탄올(30 mL)에 의해 세척하였다. 이 물질을 진공하에서 120분간 건조시켰다. 이 물질을 오븐에 넣고 50℃에서 12시간 동안 건조시켰다.
연황색 섬유성 고체로서 6.1 g을 수득하였다.
상기 건조된 표면-변형된 섬유 샘플은 소 혈청 알부민(BSA) 시험 용액에 의한 정적 결합능 측정에 준비되어 있다.
실시예 11.
정적 결합능 측정. 음이온 교환 적용에서 트리메틸암모늄-작용화된 섬유의 성능 시험을 위하여, BSA 정적 결합능 측정을 실시하였다. BSA에 대한 정적 결합능 측정의 결과는 하기 표 5에 제공된다. 이 연구에서, 실시예 10의 열적으로 개시된 중합체 그라프팅 공정에 의해 제조된 트리메틸암모늄-작용화된 섬유 샘플의 정적 결합능을 기록하였다. 실시예 10으로부터의 트리메틸암모늄-작용화된 섬유 매질의 BSA 정적 결합능은 1 내지 19 mg/g 사이이다.
Figure pct00006
실시예 12.
비변형 나일론 섬유의 그라프트 중합반응. 6 x 200 mL 병에 3-설포프로필메타크릴레이트 칼륨염(3-SPMA), 물, 나일론 섬유(알라쏘 인더스트리스) 및 1M HNO3 용액(이하의 표 중에 기재된 양)을 부가하였다. 1M HNO3 중의 암모늄 세륨(IV) 니트레이트(CAN) 0.4M 용액을 각 병에 부가하였다. 반응 병에 마개를 하고 또 그 혼합물을 18시간 동안 35℃로 가열하였다.
실온으로 냉각한 후, 각 병으로부터 얻은 섬유 고체를 0.5M 황산(3 x 50 mL) 중의 0.2M 아스코르브산의 용액, 탈이온수(3 x 50 mL), 1M 수산화 나트륨 용액(3 x 50 mL), 탈이온수(3 x 50 mL) 및 아세톤(1 x 50 mL)으로 세척하였다. 이 물질을 오븐에 넣고 40℃에서 12시간 동안 건조시켰다.
백색 섬유성 고체 샘플을 얻었다(회수율 및 중량 부가에 대한 데이터는 표 6 참조).
Figure pct00007
정적 결합능 측정. IgG에 대한 정적 결합능 측정 결과는 하기 표 7에 제공된다. SP-작용화된 촉수 섬유 매질은 시판되는 생체분자 크로마토그래피 용도에서 이용된 비드 기제 양이온 교환 매질에 필적하는 IgG 정적 결합능을 나타낸다.
Figure pct00008
동적 결합능 측정. 실시예 12-6의 SP-작용화된 섬유 매질의 IgG 동적 결합능 측정의 결과는 하기 표 8에 제공된다. 1.0 g의 매질을 11 mm 내부 직경 Vantage 컬럼에 팩킹하고 또 2.9 cm의 층 깊이로 압축하였다(2.75 mL 컬럼 부피, 0.36 g/mL 섬유 팩킹 밀도). 동적 결합능 측정은 60 cm/hr 내지 1200 cm/hr의 선속도 범위에 걸쳐 실시하였다. 이들 속도는 9초 내지 180초의 체류 시간에 상응하였다. 실시예 12-6의 섬유 매질은 30-40 mg/mL 범위의 IgG 동적 결합능을 나타내었다.
Figure pct00009
표 8. 다양한 선속도(RT = 체류 시간)에서 1, 5, 10 및 50% 파과에서 SP-촉수 작용화된 알라쏘 날개형 섬유 양이온 교환 매질에 대한 IgG DBC 값. 부하시험: 50 mM 아세테이트, pH 5.2 중의 2.0 g/L 폴리클로날 인간 IgG(SeraCare Life Sciences 제조, 매사추세츠 밀포드 소재).
실시예 13.
비변형 나일론 섬유의 그라프트 중합반응. 6 x 200 mL 병에 글리시딜 메타크릴레이트(GMA), 물, 나일론 섬유(알라쏘 인더스트리스) 및 1M HNO3 용액(하기 표에 기재된 양으로)을 부가하였다. 1M HNO3 중의 암모늄 세륨(IV) 니트레이트(CAN) 0.4M 용액을 각 병에 부가하였다. 반응 병에 마개를 하고 그 혼합물을 18시간 동안 35℃로 가열하였다.
실온으로 냉각한 후, 각 병으로부터 얻은 섬유 고체를 0.5M 황산(3 x 50 mL) 중의 0.2M 아스코르브산의 용액, 탈이온수(3 x 50 mL), 1M 수산화 나트륨 용액(3 x 50 mL), 탈이온수(3 x 50 mL) 및 아세톤(1 x 50 mL)에 의해 세척하였다. 이 물질을 오븐에 넣고 40℃에서 12시간 동안 가열하였다.
백색 섬유성 고체 샘플을 수득하였다(회수율 및 중량 추가 데이터에 대한 표 9 참조).
Figure pct00010
에폭시 작용화된 섬유의 디에틸아민- 작용화 . 6 x 250 mL 병에 상기 실시예로부터 얻은 축축한 GMA-작용화된 섬유 부분, 및 25 중량% 디에틸아민(수성)(하기 표에 기재된 양으로)의 용액을 부가하였다. 이 혼합물을 실온에서 3시간 동안 교반하였다.
섬유 고체를 탈이온수(3 x 50 mL) 및 에탄올(1 x 50 mL)에 의해 순차적으로세척하였다. 이 물질을 오븐에 넣고 40℃에서 12시간 동안 건조시켰다.
백색의 섬유성 고체 샘플을 수득하였다(회수율 및 중량 추가 데이터에 대한 표 10 참조).
Figure pct00011
정적 결합능 측정. BSA에 대한 정적 결합능 측정의 결과는 하기 표 11에 제공된다. GMA-촉수 그라프팅 밀도에 따라서, 디에틸아민-작용화된 촉수 섬유 매질은 다양한 범위의 값으로 BSA 정적 결합능을 나타낼 수 있다. 이 연속시험에서, 본 발명자들은 실시예 13-2B 및 실시예 13-3B 조성은 시판되는 생체분자 크로마토그래피 용도에 이용되는 비드 기제 음이온 교환 매질에 필적하는 BSA SBC 값을 나타내는 것을 밝혀내었다.
Figure pct00012
동적 결합능 측정. 실시예 13-3B의 디에틸아민-작용화된 섬유 매질에 대한 BSA 동적 결합능 측정 결과는 하기 표 12에 제공되어 있다. 0.5 g의 매질을 11 mm 내부 직경 Vantage 컬럼에 팩킹하고 1.5 cm 층 깊이로 압축하였다(1.42 mL 컬럼 부피, 0.35 g/mL 섬유 팩킹 밀도). 동적 결합능 측정은 200 cm/hr의 선속도에서 실시하였다. 이 속도는 27초의 체류 시간에 상응한다. 실시예 13-3B의 섬유 매질은 10% 파과에서 30 mg/mL의 BSA 동적 결합능을 나타낸다.
Figure pct00013
표 12. 200 cm/hr (RT = 체류 시간)에서 1, 5, 10 및 50% 파과에서 디에틸아미-촉수 작용화된 알라쏘 날개형 섬유 음이온-교환 매질에 대한 BSA DBC 값. 부하시험: 25 mM 트리스 완충액(pH 8) 중의 2 g/L 소 혈청 알부민(BSA).
실시예 14.
비변형 나일론 섬유의 그라프트 중합반응. 500 mL 병에 글리시딜 메타크릴레이트(GMA, 1.70 g, 12 mmol), 및 물(232.8 mL)을 부가하였다. 5 g의 알라쏘 나일론 섬유를 상기 용액에 부가하였다. 1M HNO3 용액(7.22 mL, 7.2 mmol)을 반응 혼합물에 부가한 다음 1M HNO3(0.602 mL, 0.240 mmol) 중의 암모늄 세륨(IV) 니트레이트의 0.4M 용액을 부가하였다.
이 반응 혼합물을 1시간 동안 35℃로 가열하였다.
실온으로 냉각한 후, 상기 고체를 탈이온수(3 x 100 mL)로 세척하고 또 축축한 물질(12.21 g)을 다음 단계에 즉시 사용하였다.
에폭시- 작용화된 섬유의 Q- 작용화. 4 x 250 mL 병에 상기 실시예로부터 얻은 축축한 GMA-작용화된 섬유 일부, 및 메탄올 중의 50 wt% 트리메틸아민(수성) 용액(하기 표 13에 기재된 양으로)을 부가하였다. 이 혼합물을 실온에서 18시간 동안 교반하였다.
섬유 고체를 0.5M 황산(3 x 50 mL) 중의 0.2M 아스코르브산의 용액, 탈이온수(3 x 50 mL), 1M 수산화 나트륨 용액(3 x 50 mL), 탈이온수(3 x 50 mL) 및 에탄올(1 x 50 mL)에 의해 순차적으로 세척하였다.
이 물질을 오븐에 넣고 40℃에서 12시간 동안 건조시켰다.
백색의 섬유성 고체 샘플을 수득하였다(회수율 및 중량 추가 데이터에 대한 표 13 참조).
Figure pct00014
정적 결합능 측정. BSA에 대한 정적 결합능 측정의 결과는 하기 표 14에 제공된다. Q-작용화된 촉수 섬유 매질은 30 mg/mL 범위의 BSA 정적 결합능을 제공한다. 이 연구에서, 본 발명자들은 실시예 14C 및 실시예 14D 조성이 시판되는 생체분자 크로마토그래피 적용에 이용된 비드 기제 음이온 교환 매질에 필적하는 가장 높은 BSA SBC 값을 가짐을 밝혀내었다.
Figure pct00015
동적 결합능 측정. 실시예 14C에 따라 제조된 Q-작용화된 섬유 매질에 대한 BSA 동적 결합능 측정 결과는 하기 표 15에 제공된다. 1.0 g의 매질을 11 mm 내부 직경 Vantage 컬럼에 팩킹하고 또 3.0 cm의 층 깊이로 압축하였다(2.85 mL 컬럼 부피, 0.35 g/mL 섬유 팩킹 밀도). 동적 결합능 측정은 60 cm/hr 내지 1200 cm/hr의 선속도 범위에 걸쳐 실시되었다. 이들 속도는 9초 내지 180초의 체류 시간에 상응한다. 실시예 14C의 섬유 매질은 30-40 mg/mL 범위의 BSA 동적 결합능을 나타낸다.
Figure pct00016
표 15. 다양한 선속도(RT = 체류 시간)에서 1, 5, 10 및 50% 파과에서 Q-촉수 작용화된 알라쏘 날개형 섬유 음이온 교환 매질의 BSA DBC 값. 부하시험: 25 mM 트리스 완충액(pH 8) 중의 2 g/L 소 혈청 알부민(BSA)).
실시예 15.
비변형 나일론 섬유의 그라프트 중합반응. 500 mL 병에 히드록시에틸메타크릴레이트(HEMA, 1.69 g, 13 mmol), 및 물(232.5 mL)을 부가하였다. 5.00 g의 알라쏘 나일론 섬유를 상기 용액에 부가하였다. 1M HNO3 용액(7.21 mL, 7.2 mmol)을 상기 반응 혼합물에 부가하고, 이어 1M HN03(0.601 mL, 0.240 mmol) 중의 암모늄 세륨(IV) 니트레이트의 0.4M 용액을 부가하였다.
이 반응 혼합물을 1시간 동안 35℃로 가열하였다.
실온으로 냉각한 후, 고체를 0.5M 황산 중의 0.2M 아스코르브산 용액(3 x 100 mL), 탈이온수(3 x 100 mL), 1M 수산화 나트륨 용액(3 x 100 mL), 탈이온수(3 x 100 mL) 및 에탄올(1 x 100 mL)에 의해 세척하였다. 이 물질을 오븐에 넣고 40℃에서 12시간 동안 건조시켰다.
백색의 섬유성 고체 5.58 g을 수득하였다.
실시예 16.
폴리 ( HEMA )- 작용화된 섬유의 황산화 . 자성 교반막대를 구비한 아르곤 하의 500 mL 3-가지 플라스크에 3N NaOH 수산화 나트륨 기포를 아세트산에 부가하고 0℃로 냉각시켰다. 클로로설폰산(5.0 g, 43 mmol)을 부가하였다. 상기 실시예로부터 얻은 2.5 g의 폴리(HEMA)-작용화된 섬유를 상기 반응 혼합물에 부가하였다. 이 반응은 승온시켜 실온으로 만들고 또 1시간 동안 교반하였다.
상기 섬유 고체를 5 mL 물 및 300 mL 1M 탄산 나트륨 용액 부가에 의해 중화시켰다. pH > 7으로 될때까지 반응 혼합물에 고체 탄산 나트륨을 부가하였다. 상기 섬유 고체는 1M 탄산 나트륨(3 x 100 mL) 용액, 탈이온수(3 x 100 mL) 및 에탄올(1 x 100 mL)에 의해 순차적으로 세척하였다. 이 물질을 오븐에 넣고 40℃에서 12 시간 동안 건조시켰다.
백색 고무상 고체 3.64 g을 수득하였다.
비교예 1
비변형 EVOH 섬유의 그라프트 중합반응. 4 x 30 mL 병에 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산 나트륨염 용액(AmPS-Na, 50% 수성), 물, 및 EVOH 섬유(Engineered 섬유 Technologies, S030-0.5dx5mm)를 부가하였다. 이 반응 혼합물을 진공하에서 붓고 질소에 의해 3회 다시 충전시켰다. 1M HNO3 용액 및 암모늄 세륨(IV) 니트레이트의 0.4M 용액(CAN)을 각 병에 부가하였다(하기 표 16에 기재된 양으로). 상기 반응 병에 마개를 하고 또 그 혼합물을 12시간 동안 40℃로 가열하였다.
실온으로 냉각한 후, 각 병으로부터 얻은 섬유 고체를 탈이온수(3 x 30 mL), 0.5M 황산 중의 0.2M 아스코르브산의 용액 (3 x 30 mL), 탈이온수(3 x 30 mL), 1 M 수산화 나트륨 용액(2 x 30 mL), 탈이온수(3 x 30 mL) 및 메탄올(2 x 30 mL)에 의해 세척하였다. 이 물질을 오븐에 넣고 40℃에서 8시간 동안 건조시켰다.
백색의 섬유성 고체 샘플을 수득하였다(회수율 및 % 수율 데이터에 대한 표 16 참조).
Figure pct00017
표 16. 세륨 레독스 그라프트 중합반응 조성 및 회수율 데이터.
비교예 2.
비변형 PVA 섬유의 그라프트 중합반응. 4 x 30 mL 병에 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산 나트륨염 용액(AmPS-Na, 50% 수성), 물, 및 PVA 섬유(Engineered Fiber Technologies, VPB 052x3mm)를 부가하였다. 이 반응 혼합물을 진공하에서 붓고 질소에 의해 3회 다시 채워졌다. 1M HNO3 용액 및 1M HNO3 중의 암모늄 세륨(IV) 니트레이트(CAN)의 0.4 M 용액을 각 병에 부가하였다(하기 표 17에 기재된 양으로). 각 반응 병에 마개를 하고 그 혼합물을 12시간 동안 40℃로 가열하였다.
실온으로 냉각한 후, 각 병으로부터 얻은 섬유 고체를 탈이온수(3 x 30 mL), 0.5 M 황산 중의 0.2 M 아스코르브산 용액(3 x 30 mL), 탈이온수(3 x 30 mL), 1 M 수산화 나트륨 용액(2 x 30 mL), 탈이온수(3 x 30 mL) 및 메탄올(2 x 30 mL)에 의해 세척하였다. 이 물질을 오븐에 넣고 40℃에서 8시간 동안 건조시켰다.
백색의 섬유성 고체 샘플을 수득하였다(회수율 및 % 수율 데이터에 대한 하기 표 17 참조).
Figure pct00018
표 17. 세륨 레독스 그라프트 중합반응 조성물 및 회수율 데이터.
정적 결합능 측정. IgG에 대한 정적 결합능 측정 결과는 하기 표 18에 제공된다. EVOH 섬유 기제 매트릭스(비교예 1)에 대한 SP-작용화된 촉수 매질 기제는 낮은 IgG 정적 결합능을 나타낸다. PVA 섬유 기제 매트릭스를 기본한 SP-작용화된 촉수 매질((비교예 2)은 특정 조성에 대한 IgG 정적 결합능(비교예 2-1)에 비하여 약간 더 높게 나타난다. 모든 경우에서, IgG SBC 값은 시판되는 생체분자 크로마토그래피 적용에 이용된 비드 기제 양이온 교환 매질에 비하여 훨씬 더 낮았다. 이들 예는 알라쏘 인더스크리스로부터 입수한 날개형 섬유 매질에 의해 나타낸 표면적 향상 이점을 설명하기 위해 제공된다. PVA 또는 EVOH 유형 기제 매트릭스 상에서 유사한 표면적 향상이 실시되면, 본 명세서에 기재된 세륨 이온 레독스 그라프팅 과정으 이용하여 직접 표면 작용화 후에 높은 IgG 결합능을 얻을 수 있다.
Figure pct00019
표 18. 정적 결합능 측정. 부하시험: 50 mM 아세트산 나트륨(pH 5) 중의 2 g/L 폴리클로날 인간 IgG(SeraCare Life Sciences 제조, 매사추세츠 밀포드 소재).
실시예 16.
HPA / MBAm 95/5에 의한 나일론 섬유 표면 변형. 기계적 교반기, 환류 응축기 및 온도제어기를 구비한 2000 mL 3구 원형바닥 플라스크에 히드록시프로필아크릴레이트(HPA, 13.7 g, 95 mmol), N,N'-메틸렌비스(아크릴아미드)(MBAm, 0.77 g, 5 mmol) 및 물(710 mL)을 부가하였다. 16.8 g의 느슨한 나일론 섬유(알라쏘 인더스트리스, #090602PA6C)를 상기 혼합물에 부가하였다. 과황산 암모늄(1.60 g, 7 mmol)을 부가하였다. 습윤 고체를 80℃에서 4 시간 동안 가열하였다.
실온으로 냉각한 후, 상기 고체를 부크너 깔때기로 전달하고 또 뜨거운 물(3 x 500 mL) 및 메탄올(1 x 500 mL)에 의해 세척하였다. 이 물질을 진공하에서 20분 동안 건조시켰다. 이 물질을 오븐에 넣고 40℃에서 18시간 동안 건조시켰다.
백색 섬유 17.6 g을 수득하였다.
실시예 17.
HPA / MBAm 변형된 나일론 섬유의 그라프트 중합반응.
4 x 200 mL 병에 글리시딜 메타크릴레이트(GMA), 물, HPA/MBAm 변형 나일론 섬유(실시예 16) 및 1M HNO3 용액을 부가하였다(하기 표 19에 기재된 양으로). 1M HNO3 중의 암모늄 세륨(IV) 니트레이트(CAN) 0.4M 용액을 각 병에 부가하였다. 이 반응 병에 마개를 하고 또 그 혼합물을 12시간 동안 35℃로 가열하였다.
실온으로 냉각한 후, 각 병으로부터 얻은 섬유 고체를 탈이온수(3 x 150 mL) 및 메탄올(1 x 150 mL)에 의해 세척하였다. 이 물질을 오븐에 넣고 40℃에서 12 시간 동안 가열하였다.
백색의 섬유성 고체 샘플을 수득하였다(회수율 및 중량 추가 데이터에 대하 표 19 참조).
Figure pct00020
표 19. 세륨 레독스 그라프트 중합반응 조성 및 회수율 데이터.
실시예 18.
재조합 단백질 A 친화성 리간드 , rSPA 에 의한 나일론 섬유 표면 변형. 250 mL 병에 1M 중탄산 나트륨(100 mL), 재조합 단백질 A(rSPA #RN091139, 150 mg, 물 중의 47.5 mg/mL 용액으로서) 및 물(90 mL)을 부가하였다. 실시예 17-4로부터 얻은 GMA-그라프트된 섬유(350 mg)를 반응 혼합물에 부가하였다. 이 혼합물을 37℃에서 2.5 시간 동안 가열하였다.
실온으로 냉각한 후, 상기 고체를 부크너 깔때기로 전달하고 또 0.1M 중탄산 나트륨(3 x 100 mL)에 의해 세척하였다. 습윤 섬유 고체는 0.2 M 중탄산 나트륨 중의 10 중량% 티오글리세롤 용액/0.5M 염화 나트륨 용액 100 mL에 현탁시켰다. 이 혼합물을 실온에서 철야로 교반하였다.
상기 고체를 부크너 깔때기로 전달하고 또 0.15 M 염화 나트륨을 갖는 0.1 M TRIZMA 염기의 용액(1 x 75 mL), 0.05 M 아세트산 용액(1 x 75 mL)에 의해 세척하였다. TRIZMA 염기 및 아세트산 세척 주기는 2회 부가적으로 반복하였다. 섬유 고체는 마지막으로 탈이온수(1 x 75 mL) 및 20 wt% 에탄올(1 x 75 mL)에 의해 세척하였다. 섬유 고체는 20 wt% 에탄올 용액에 저장하였다.
정적 결합능 측정. 실시예 18에 따라 제조된 단백질 A-작용화된 섬유 매질에 대한 IgG 정적 결합능 측정 결과는 하기 표 20에 제공된다. 상기 단백질 A-작용화된 촉수 섬유 매질은 4 mg/mL 범위의 IgG 정적 결합능을 나타내었다. 단백질 A 리간드 커플링 과정의 추가의 최적화는 저 비용의 생체분자 친화성 크로마토그래피 적용에 대해 증가된 IgG 정적 결합능을 제공할 것이다.
Figure pct00021
표 20. 정적 결합능 측정. 부하시험: 포스페이트 완충 염수(pH 7.4) 중의 2 g/L 폴리클로날 인간 IgG(SeraCare Life Sciences 제조, 매사추세츠 밀포드 소재)
동적 결합능 측정. 실시예 18의 단백질 A-작용화된 섬유 매질에 대한 IgG 동적 결합능 측정 결과는 하기 표 21에 제공된다. 0.35 g의 매질을 11 mm 내부 직경 Vantage 컬럼에 팩킹하고 또 1.1 cm 층 깊이로 압축하였다(1.04 mL 컬럼 부피, 0.34 g/mL 섬유 팩킹 밀도). 동적 결합능 측정은 60 cm/hr 내지 800 cm/hr 선속도 범위에 대하여 실시하였다. 이들 속도는 체류 시간 5 초 내지 60 초에 상응한다. 실시예 18의 섬유 매질은 5 mg/mL 범위의 IgG 동적 결합능을 나타낸다. 단백질 A 리간드 커플링 과정의 추가의 최적화는 저 비용의 생체분자 친화성 크로마토그래피 적용에 대하여 증가된 IgG 동적 결합능을 제공할 것이다.
Figure pct00022
표 21. 다양한 선속도(RT = 체류 시간)에서 1, 5, 10, 및 50% 파과에서 단백질 A-작용화된 알라쏘 날개형 섬유 친화성 크로마토그래피 매질에 대한 IgG DBC 값. 부하시험: 포스페이트 완충 염수(pH 7.4) 중의 2 g/L 폴리클로날 인간 IgG(SeraCare Life Sciences 제조, 매사추세츠 밀포드 소재).
실시예 19.
HPA / MBAm 변형 나일론 섬유의 유통( flow through ) 그라프트 중합반응. 22 mm 내부 직경 Vantage 크로마토그래피 컬럼에 상기 실시예 16으로부터 얻은 HPA/MBAm 변형 나일론 섬유의 슬러리를 부가하였다(100 mL 탈이온수 중의 1.52 g 섬유). 컬럼을 통하여 과량의 액체를 뽑아내고 또 스테이플 섬유의 압축을 용이하게 하기 위하여 진공을 사용하였다. 슬러리를 컬럼에 전달한 후, 컬럼의 상부 헤더를 설치하고, 또 헤더를 압축하여 최종 부피 4.54 mL(1.2 cm 층 깊이)를 얻었다. 자기 교반 바, 환류 응축기, 온도제어기, 및 가열 맨틀을 구비한 250 mL 3구 플라스크에 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산 나트륨염 용액(AmPS-Na, 50% 수성, 23.0 g, 100 mmol) 및 물(53.5 mL)을 부가하였다. 이 단량체 용액은 아르곤 가스에 의해 10분 동안 살포되었다. 1M HN03 중의 암모늄 세륨(IV) 니트레이트(CAN)의 0.4 M 용액(0.62 mL, 0.250 mmol) 및 1M HNO3 용액(2.5 mL, 2.5 mmol)을 상기 반응 혼합물에 부가하고 또 이 반응 혼합물을 35℃로 가열하였다. 이 단량체 용액은 3.5 mL/min의 속도로 12시간 동안 Vantage 컬럼을 통하여 펌핑되었다. 단량체 용액의 점도는 반응 과정 동안 증가되는 것으로 밝혀졌다; 이는 3시간 후 때때로 컬럼을 통하여 단량체 용액의 유속의 실질적 감소를 초래하였다.
실온으로 냉각한 후, vantage 컬럼으로부터 얻은 섬유 고체를 제거하고 또 0.5 M 황산 중의 0.2M 아스코르브산 용액(3 x 150 mL), 탈이온수(3 x 150 mL), 1 M 수산화 나트륨 용액(3 x 150 mL), 탈이온수(3 x 150 mL) 및 메탄올(1 x 150 mL)에 의해 세척하였다. 이 물질을 오븐에 넣고 40℃에서 12시간 동안 건조시켰다.
백색 섬유성 고체 1.52 g을 수득하였다.
정적 결합능 측정. IgG에 대한 정적 결합능 측정 결과는 하기 표 22에 제공된다. 유통 그라프트 중합반응 공정을 통하여 제조된 SP-작용화된 촉수 섬유 매질은 시판되는 생체분자 크로마토그래피 적용에 이용된 비드 기제 양이온 교환 매질에 필적하는 IgG 정적 결합능을 나타낸다. HPA/MBAm 변형 섬유 전구체(실시예 16)는 최소의 IgG SBC 만을 나타낸다.
Figure pct00023
표 22. 정적 결합능 측정. 부하시험: 50 mM 아세테이트(pH 5) 중의 2 g/L 폴리클로날 인간 IgG(SeraCare Life Sciences 제조, 매사추세츠 밀포드 소재).
동적 결합능 측정. 실시예 19의 SP-작용화된 섬유 매질에 대한 IgG 동적 결합능 측정 결과는 하기 표 23에 제공된다. 0.64 g의 매질을 11 mm 내부 직경 Vantage 컬럼에 팩킹하고 또 2.0 cm 층 깊이로 압축하였다(1.90 mL 컬럼 부피, 0.32 g/mL 섬유 팩킹 밀도). 동적 결합능 측정은 200 cm/hr의 선속도에서 실시하였다. 이 속도는 36초의 체류 시간에 상응한다. 실시예 19의 섬유 매질은 40 mg/mL의 IgG 동적 결합능을 나타낸다.
Figure pct00024
표 23. 다양한 선속도(RT = 체류 시간, nd = 데이터 없음)에서의 1, 5, 10 및 50% 파과에서 SP-촉수 작용화된 알라쏘 날개형 섬유 양이온 교환 매질에 대한 IgG DBC 값. 부하시험: 50 mM 아세테이트, pH 5 중의 2.0 g/L 폴리클로날 인간 IgG(SeraCare Life Sciences 제조, 매사추세츠 밀포드 소재).
실시예 20.
비변형 나일론 섬유의 그라프트 공중합반응. 4 x 250 mL 병에 글리시딜 메타크릴레이트(GMA),(3-아크릴아미도프로필) 트리메틸암모늄 클로라이드 용액(APTAC, 물 중의 75 wt% 용액), 물, 날개형 나일론 섬유(알라쏘 인더스트리스) 및 1M HNO3 용액을 부가하였다(하기 표에 기재된 양으로). 1M HNO3 중의 암모늄 세륨(IV) 니트레이트(CAN)의 0.4 M 용액을 각 병에 부가하였다. 이 반응 병에 마개를 하고 또 반응을 3시간 동안 35℃로 가열하였다.
실온으로 냉각한 후, 각 병으로 얻은 섬유 고체를 아세톤(3 x 100 mL)으로 세척하였다. 축축한 물질을 오븐에 넣어 40℃에서 12시간 동안 건조시켰다.
백색의 섬유성 고체 샘플을 수득하였다(회수율 및 중량 추가 데이터에 대한 표 24 참조).
Figure pct00025
표 24. 세륨 레독스 그라프트 중합반응 조성 및 회수율 데이터.
실시예 21.
에폭시- 작용화된 섬유의 폴리 ( 알릴아민 ) 변형. 30 mL 병에 상기 실시예 20-2로부터 얻은 MA/APTAC 그라프트된 섬유(0.5 g), 물(10 mL), 40 wt% 폴리(알릴아민) 히드로클로라이드 용액(1.25 g의 40 wt% 용액) 및 1.0 M 수산화 나트륨(10 mL)을 부가하였다. 이 반응 혼합물을 18시간 동안 35℃로 가열하였다.
실온으로 냉각한 후, 고체를 탈이온수(3 x 50 mL) 및 아세톤(1 x 50 mL)에 의해 세척하였다.
축축한 물질을 오븐에 넣고 40℃에서 12시간 동안 건조시켰다.
담황색 섬유성 고체로서 0.48 g을 수득하였다.
실시예 22.
설포프로필 - 작용화된 섬유의 폴리 ( 알릴아민 ) 변형. 자기 교반 막대를 구비한 500 mL 비이커에 상기 실시예 2의 1.0 g의 설포프로필-작용화된 섬유 및 물 중의 폴리알릴아민 용액(PAA MW = 15 kDa, 20%(w/w), 75 mL)을 부가하였다. 폴리(에틸렌글리콜) 디글리시딜 에테르(750 μL, Aldrich #475696)를 부가하고 또 이 혼합물을 실온에서 5분간 급격하게 교반한 다음 250 mL 물에 의해 급랭시켰다. 이 혼합물을 중간 글래스 프릿 필터(medium glass frit filter)를 통하여 여과하고 또 물(3 x 250 mL)에 의해 세척하였다. 섬유를 40℃에서 철야로 건조시켰다. (실시예 22)
실시예 23.
설포프로필 - 작용화된 섬유의 폴리 ( 알릴아민 ) 변형. 자기 교반 막대를 구비한 500 mL 비이커에 상기 실시예 2의 1.0 g의 설포프로필-작용화된 섬유 및 물 중의 폴리알릴아민 용액(PAA MW = 15 kDa, 20%(w/w), 75 mL)을 부가하였다. 폴리(에틸렌글리콜) 디글리시딜 에테르(750 μL, Aldrich #475696)를 부가하고 또 그 혼합물을 실온에서 10분간 급속하게 교반한 다음 250 mL 물에 의해 급랭시켰다. 이 혼합물을 중간 글래스 프릿 필터를 통하여 여과하고 또 물(3 x 250 mL)에 의해 세척하였다. 섬유를 40℃에서 철야로 건조시켰다.(실시예 23)
실시예 24.
설포프로필 - 작용화된 섬유의 폴리 ( 알릴아민 ) 변형. 자기 교반 막대를 구비한 500 mL 비이커에 상기 실시예 23의 1.0 g의 설포프로필-작용화된 섬유 및 물 중의 폴리알릴아민 용액(PAA MW = 15 kDa, 20%(w/w), 75 mL)을 부가하였다. 폴리(에틸렌글리콜) 디글리시딜 에테르(750 μL, Aldrich #475696)를 부가하고 또 그 혼합물을 실온에서 10분간 급속하게 교반한 다음 250 mL 물에 의해 급랭시켰다. 이 혼합물을 중간 글래스 프릿 필터를 통하여 여과하고 또 물(3 x 250 mL)에 의해 세척하였다. 섬유를 40℃에서 철야로 건조시켰다.(실시예 24)
정적 결합능 측정. BSA에 대한 정적 결합능 측정 결과는 하기 표 25에 제공된다. 폴리(알릴아민)-작용화된 섬유 매질은 20-60 mg/mL 범위의 BSA 정적 결합능을 제공한다. 이 시리즈에서, 본 발명자들은 실시예 24의 조성이 시판중인 생체분자 크로마토그래피 적용에 이용된 비드 기제 음이온 교환 매질에 필적하는 가장 높은 BSA SBC 값을 나타냄을 밝혀내었다.
Figure pct00026
표 25. 정적 결합능 측정. 부하시험: 50 mM 트리스 완충액(pH 8) 중의 2 g/L 소 혈청 알부민(BSA).
동적 결합능 측정. 실시예 24의 폴리(알릴아민)-작용화된 섬유 매질에 대한 BSA 동적 결합능 측정 결과는 하기 표 26에 제공된다. 1.0 g의 매질을 11 mm 내부 직경 Vantage 컬럼에 팩킹하고 또 3.0 cm 층 깊이로 압축하였다(2.85 mL 컬럼 부피, 0.35 g/mL 섬유 팩킹 밀도). 동적 결합능 측정은 200 cm/hr의 선속도에서 실시하였다. 이 속도는 54초의 체류 시간에 상응한다. 실시예 24의 섬유 매질은 10% 파과에서 50 mg/mL의 BSA 동적 결합능을 나타낸다.
Figure pct00027
표 26. 200 cm/hr(RT = 체류 시간)에서 1, 5, 10, 및 50% 파과에서 폴리(알릴아민)-작용화된 알라쏘 날개형 섬유 음이온 교환 매질에 대한 BSA DBC 값. 부하시험: 25 mM 트리스, pH 8 중의 0.5 g/L BSA.
실시예 25.
HPA / MBAm 95/5에 의한 나일론 섬유 표면 변형. 기계적 교반기, 환류 응축기, 및 온도제어기를 구비한 1000 mL 3구 원형바닥 플라스크에 히드록시프로필아크릴레이트(HPA, 13.7 g, 95 mmol), N,N'-메틸렌비스(아크릴아미드)(MBAm, 0.77g, 5 mmol) 및 물(710 mL)을 부가하였다. 16.8 g의 느슨한 나일론 섬유(Allaso Industries, #090602PA6C)를 상기 혼합물에 부가하였다. 과황산 암모늄(1.60 g, 7 mmol)을 부가하였다. 습윤 고체를 80℃에서 4 시간 동안 가열하였다.
실온으로 냉각한 후, 상기 고체를 부크너 깔때기로 전달하고 또 뜨거운 물(3 x 500 mL) 및 메탄올(1 X 500 mL)에 의해 세척하였다. 이 물질을 진공하에서 30분간 건조시켰다. 이 물질을 오븐으로 전달하고 또 40℃에서 12 시간 동안 건조시켰다.
백색 섬유로서 17.3 g을 수득하였다.
실시예 26. 현수 설포프로필 양이온 교환 작용성에 의한 HPA / MBAm 변형, 고 표면적 섬유의 세륨 이온 레독스 그라프트 중합반응.
HPA / MBAm 변형 나일론 섬유의 그라프트 중합반응.
기계적 교반기, 환류 응축기, 및 온도제어기를 구비한 200 mL 3구 원형바닥 플라스크에 2-아크릴아미도-2-메틸-1-프로판설폰산 나트륨염(AMPS-Na, 23.1 g, 100 mmol), 및 물(76.3 mL)을 부가하였다. 2.50 g의 HPA/MBAm 변형 나일론 섬유(실시예 25)를 상기 용액에 부가하였다. 이 반응 혼합물을 진공하에서 질소 가스에 의해 3주기 동안 정화시켰다.
1M HN03 중의 암모늄 세륨(IV) 니트레이트의 0.4 M 용액(0.620 mL, 0.250 mmol) 및 1M HN03 용액(2.46 mL, 2.46 mmol)을 상기 반응 혼합물에 부가하였다.
이 반응 혼합물을 18시간 동안 35℃로 가열하였다.
실온으로 냉각한 후, 고체를 0.5 M 황산 중의 0.2M 아스코르브산 용액(3 X 150 mL), 탈이온수(3 X 150 mL), 1M 수산화 나트륨 용액(3 X 150 mL), 탈이온수(3 X 150 mL) 및 아세톤(3 X 150 mL)에 의해 세척하였다. 이 물질을 오븐에 넣어 40℃에서 12시간 동안 건조시켰다.
백색의 섬유성 고체로서 2.52 g을 수득하였다.
매질의 작용 성능 . 실시예 26으로부터 얻은 설포프로필-작용화된 고 표면적 섬유는 폴리클로날 인간 감마 면역글로불린(IgG) 정제에 대한 양이온 교환 크로마토그래피 매질에 대해 평가하였다.
IgG에 대한 정적 결합능 측정 결과는 하기 표 27에 제공된다. 이 연구에서, 알라쏘로부터 얻은 비작용화된 "날개형 섬유"(로트 ID "3kg 뱃치 - 제조 로트 ID 없음)의 정적 결합능은 실시예 26의 세륨 이온 레독스 중합반응 공정 및 실시예 2에 기재된 열적으로 개시된 중합체 그라프팅 공정에 의해 제조된 설포프로필-촉수 작용화된 섬유 샘플과 비교하였다.
세륨 이온 레독스 그라프팅 과정은 열적으로 개시된 공정(50 mg IgG/g 섬유 샘플) 및 비작용화된 섬유 단독(10 mg IgG/g 섬유 샘플)에 비하여 현저하게 더 높은 정적 결합능(150 mg IgG/g 섬유 샘플)을 갖는 SP-작용화된 촉수 섬유 매질을 제공함이 밝혀졌다. 상기 SP-작용화된 촉수 섬유 매질은 시판되는 생체분자 크로마토그래피 적용에 이용된 비드 기제 수지 매질에 필적하는 IgG 정적 결합능을 나타낸다.
Figure pct00028
표 27. 정적 결합능 측정. 부하시험: 50 mM 아세트산 나트륨(pH 5) 중의 2 g/L 폴리클로날 인간 IgG(SeraCare LifeSciences 제조, 매사추세츠 밀포드 소재)
HETP 값은 실시예 26으로부터 얻은 1.00 g의 SP-촉수 변형 나일론 섬유에 의해 팩킹된 11 mm ID Vantage 컬럼 상에 아세톤 주사와 3.0 cm의 층 부피로 압축된 섬유 층(컬럼 부피 2.85 ml)을 이용하여 측정하였다. HETP(0.08 cm) 및 피크 비대칭(1.8-2.0)에 대한 용인가능한 값이 발견되었다. 이들 결과를 기초로 하여, 0.35 g/mL의 SP-촉수 변형 섬유 팩킹 밀도는 크로마토그래피 평가에서 용인가능한 성능에 대해 충분한 균일성을 제공할 것이라 믿어진다.
IgG 동적 결합능 측정은 이하의 과정에 따라서 상기와 동일한 컬럼을 이용하여 실시하였다:
5 CV(컬럼 부피) 50 mM NaOAc 완충액(pH 5)(평형화)
50 mM NaOAc 완충액(pH 5) 중의 60 CV 1.7 mg/mL IgG(SeraCare) (IgG 시험)
30 CV 50 mM NaOAc 완충액(pH 5)(세척)
50 mM NaOAc 완충액(pH 5) 중의 15 CV 1M NaCl (용출)
10 CV 0.5 M NaOH(세정)
10 CV 50 mM NaOAc 완충액(pH 5)(세척)
도 10은 특정 실시양태에 따른 SP-촉수 변형 섬유에 대한 전형적인 IgG 파과 곡선의 예를 제공한다. 예리한 파과 곡선과 10% IgG 파과에서 40 mg/ mL의 IgG 동적 결합능이 존재한다(표 28).
DBC (mg/mL)
% 파과 200 cm/hr
(RT 54 sec)		 200 cm/hr
(RT 54 sec)		 200 cm/hr
(RT 54 sec)		 400 cm/hr
(RT 27 sec)		 800 cm/hr
(RT 14 sec)		 1200 cm/hr
(RT 9 sec)
1 39 42 43 39 35 24
5 41 46 46 42 37 26
10 42 46 47 44 39 27
50 49 53 54 52 48 32
표 28. 다양한 선속도(RT = 체류 시간)에서 1, 5, 10 및 50% 파과에서 SP-촉수 작용화된 알라쏘 날개형 섬유 양이온 교환 매질에 대한 IgG 동적 결합능.
도 11은 200 cm/hr 내지 1200 cm/hr 범위의 다양한 선속도에서 SP-촉수 섬유 컬럼에 대한 겹쳐진 IgG 파과 곡선을 제공한다. 선형 유동 속도가 증가함에 따라서, IgG 파과 곡선의 기울기는 약간 감소된다. 본 명세서에 개시된 실시양태에 따른 섬유 매질에 대한 동적 IgG 결합능에 대한 속도 영향은 비드 기제 계에서 전형적으로 관측되는 것에 비하여 훨씬 덜 현저하다. 도 12에서, 측정된 가장 높은 속도(1200 cm/hr, 9초 체류 시간)에서 측정된 IgG 동적 결합능에서 보통의 감소가 보인다. 이러한 특징은 이온성 리간드 결합 부위에 대한 IgG 분자의 대류성 수송에 의해 크게 영향을 받는 시스템임을 나타낸다.
대조적으로, 전통적 비드 기제 이온 교환 크로마토그래피 수지는 속도가 증가함에 따라서 동적 결합능에서 현저한 감소를 나타내고 또 파과 곡선을 더욱 확산시킬 것이다. 아주 높은 속도에서, 층 압축은 비드의 일체성을 절충할 수 있어, 더 불량한 유동 균일성과 감소된 크로마토그래피 성능을 초래할 수 있다.
실시예 27.
유통 숙주 세포 단백질 정리제거. 실시예 26에 따라 제조된 설포프로필-작용화된 섬유 매질은 유통 연마 방식으로 HCP 제거 활성에 대하여 평가되었다. 0.3 g의 설포프로필-작용화된 섬유 매질을 14.5 mm 내부 직경 컬럼에 팩킹하고 또 0.6 cm의 층 깊이로 압축하였다(1.00 mL 컬럼 부피, 0.30 g/mL 섬유 팩킹 밀도). 상기 컬럼은 독립적으로 또 시판되는 막 흡착제(ChromaSorb™, 밀리포어 코포레이션 제조, 막 부피 0.2 mL)와 조합하여 시험하였다.
모노클로날 항체를 함유하는 세포 배양액을 청정화시킨 다음 단백질 A 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 단리하고 또 상기 용액의 pH를 pH 5로 조정하였다. 이어 상기 단백질 A 용출의 pH는 트리스를 이용하여 pH 7로 조정한 다음 0.2 미크론 막을 통하여 여과하였다.
상기 컬럼 및 Chromasorb™ 막 장치는 완충액 용액(25 mM Tris, pH 7)으로 평형화시켰다.
상기 설포프로필-작용화된 섬유 매질 및 Chromasorb™ 막 흡착제는 표 29에 기재된 바와 같이 개별적으로 또 시리즈로 평가하였다. 72 mL의 7.3 g/L 모노클로날 항체 단백질 A 용출액(pH 7)은 0.25 mL/min의 유속으로 장치를 통과하였다. 12 mL 분획 6개를 수집하였다. 8개의 유통 분획뿐만 아니라 모아진 샘플을 HCP-ELISA 및 단백질 A HPLC에 의해 분석하여 HCP 정리제거 수준 및 모노클로날 항체 회수율을 각각 측정하였다.
SP-섬유(0.38 LRV)는 ChromaSorb™ 막 흡착제(1.42 LRV)만큼 HCP를 제거하지 않는 한편, 본 발명자들은 상기 2개 유통 흡착제를 pH 7에서 연속 배열하면 이들 흡착제 개별에 비하여 HCP 정리제거(2.13 LRV)에서 더 효과적이라는 것을 밝혀내었다. 이들 흡착제 매질은 용량 제한되지 않으므로, 이들 결과는 상기 2개 흡착제가 HCP의 별개의 분명한 집단을 제거함을 제시한다. 본 발명자들은 SP-섬유는 HCP가 더 효과적인 양전하를 가질 더 낮은 pH에서 더 많은 HCP를 제거할 것이라 예상한다. SP-섬유에 대한 모노클로날 항체의 친화성이 또한 증가되어 생성물 회수율을 감소시킬 것이다.
Figure pct00029
표 29. 모노클로날 항체 공급물의 유통 정제. 3개 유통 연마 트레인의 평가. SP-섬유(실시예 26)[상부], ChromaSorb™[중간], SP-섬유(실시예 26)/ChromaSorb™ [하부]에 배열. 5개 유통 분획 및 1 풀링된 분획에 대한 모노클로날 항체 회수율(단백질 A HPLC) 및 HCP 정리제거(HCP-ELISA). 부하시험: 0.25 mL/min의 유속으로 7.3 g/L의 모노클로날 항체 단백질 A 용출(pH 7).
실시예 28.
유통 숙주 세포 단백질 정리제거. 실시예 14(실시예 14C)에 따라 제조된 Q-작용화된 섬유 매질은 유통 연마 모드로 HCP 제거 활성에 대해 평가되었다. 0.34 g의 Q-작용화된 섬유 매질을 14.5 mm 내부 직경 컬럼에 팩킹하고 또 0.6 cm의 층 깊이로 압축하였다(1.00 mL 컬럼 부피, 0.34 g/mL 섬유 팩킹 밀도).
모노클로날 항체를 함유하는 세포 배양액을 청정화시킨 다음 단백질 A 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 단리하며 또 상기 용액의 pH는 pH 5로 조정하였다. 단백질 A 용출의 pH는 이어 TRIZMA 염기에 의해 pH 8로 조정한 다음 0.2 미크론 막을 통하여 여과시켰다.
Q-작용화된 섬유 매질 컬럼은 완충액 용액(25 mM Tris, pH 8)에 의해 평형화되었다.
Q-작용화된 섬유 매질 평가로부터 얻은 데이터는 표 30에 제공된다. 100 mL의 8.2 g/L 모노클로날 항체 단백질 A 용출액(pH 8)은 1.0 mL/min의 유속으로 장치를 통과하였다. 10개의 10 mL 분획을 수집하였다. 결합된 HCP는 25 mM Tris pH 8 중의 1M 염화 나트륨 용액을 용출 완충액으로 사용하여 용출시켰다.
2개의 10 mL 용출 분획을 또한 수집하였다. 10개의 유통 분획 및 2개의 용출 분획은 HCP-ELISA 및 단백질 A HPLC에 의해 분석하여 HCP 정리제거 수준 및 모노클로날 항체 회수율을 각각 측정하였다.
상기 Q-작용화된 섬유는 유통 모드의 HCP 정리제거에 효과적이다. 높은 mAb 회수율(94%)과 더불어 0.3의 HCP LRV를 달성하였다. 본 명세서에 개시된 실시양태의 Q-작용화된 섬유 매질은 모노클로날 항체 생산에서 유통 연마 적용을 위한 비드 기제 수지 매질 및 막 흡착제에 비하여 편리하고 저비용으로 실시될 수 있다. 상기 Q-작용화된 섬유 매질의 높은 투과성(실시예 14C에 따라 제조된 Q-작용화된 섬유 매질에 대하여 700 mDa)은 막 흡착제를 사용하여서는 달성할 수 없는 유동 속도로 mAb 공급 스트림을 고속 가공할 수 있게 할 수 있다.
Figure pct00030
표 30. 모노클로날 항체 공급물의 유통 정제. 팩킹된 층 포맷으로 Q-작용화된 섬유 매질을 포함하는(1.0 mL 컬럼 부피, 0.34 g/mL 팩킹 밀도) 유통 연마 공정의 평가. 5개 유통 분획 및 2개 용출 분획에 대한 모노클로날 항체 회수율(단백질 A HPLC) 및 HCP 정리제거(HCP-ELISA). 풀링된 분획 데이터가 산출값이다. 부하시험: 1.0 mL/min(체류 시간 = 60 초)의 유속으로 8.2 g/L의 모노클로날 항체 단백질 A 용출(pH 8).
실시예 29.
유통 모노클로날 항체 응집물 정리제거. 실시예 26에 따라 제조된 설포프로필-작용화된 섬유 매질을 유통 연마 모드로 모노클로날 항체 응집물 제거 활성에 대해 평가하였다. 1.0 g의 설포프로필-작용화된 섬유 매질을 11 mm 내부 직경 Vantage 컬럼에 팩킹하고 또 3.0 cm의 층 깊이로 압축하였다(2.85 mL 컬럼 부피, 0.35 g/mL 섬유 팩킹 밀도).
20 g/L 모노클로날 항체를 함유하는 단백질 A 용출 풀을 50 mM 아세테이트 완충액(pH 5) 및 50 mM 아세테이트 완충액(pH 5) 중의 0.5 M 염화 나트륨 용액으로 희석시켜 pH 5에서 6.9 g/L 용액 및 19 mS/cm 도전성을 제공하였다. 단량체성 모노클로날 항체의 결합을 약화시키고 또 단백질 A 공급물 용액 중의 응집된 모노클로날 항체의 결합을 선호하기 위하여 19 mS/cm의 도전성 값이 선택되었다.
설포프로필-작용화된 섬유 매질 컬럼은 완충액 용액(50 mM 아세테이트, pH 5)으로 평형화시켰다.
설포프로필-작용화된 섬유 매질의 평가로부터 얻은 데이터는 표 31 및 도 9에 제공된다. 9.285 mL의 6.9 g/L 모노클로날 항체 단백질 A 용출액(pH 5, 19 mS/cm)은 3.2 mL/min(200 cm/hr)의 유속으로 컬럼을 통과하였다. 33개의 8.6 mL(3 컬럼 부피) 분획을 수집하였다. 결합된 단량체성 및 응집된 모노클로날 항체는 용출 완충액으로서, 50 mM 아세테이트 pH 5 중의 0.5 M 염화 나트륨 용액을 사용하여 용출시켰다. 5개의 8.6 mL(3 컬럼 부피) 용출 분획을 또한 수집하였다. 33개의 유통 분획 및 5개의 용출 분획을 크기 배제 크로마토그래피(SEC) 및 단백질 A HPLC에 의해 분석하여 응집물 정리제거 수준 및 모노클로날 항체 회수율을 각각 측정하였다.
상기 설포프로필 작용화된-섬유는 유통 모드 작업하에 단량체성 모노클로날 항체의 존재하에서, 응집된 모노클로날 항체를 결합시키는 능력을 나타내었다. 단백질 A HPLC 데이터로부터 본 발명자들은 92%의 높은 mAb 회수율을 발견하였다. SEC 데이터 분석은 유통 분획 #2에서 단량체성 mAb 종의 완전한 파과를 나타내는 한편, 응집된 mAb는 유통 분획 #5까지는 0.6%(100% 파과)의 초기 공급물 농도와 일치하지 않음을 나타낸다. 용출 분획 #35, 36, 및 37의 SEC 분석은 응집된 고분자량(HMW) 종에서 mAb 집단이 농축되며 또 단량체성 mAb에서 소모됨을 나타낸다. 본 명세서에 개시된 실시양태에 따른 설포프로필-작용화된 섬유 매질은 본 실시예에 기재된 방법에 따른 응집물 정리제거를 위한 수단으로 작용할 수 있다. 설포프로필-작용화된 섬유 매질의 높은 투과성(실시예 26에 따라 제조된 설포프로필-작용화된 섬유 매질에 대해 520 mDa)은 모의된 이동층 작업에 대해 적합한 고 유속에서 높은 속도, 신속한 주기의 mAb 공급 스트림을 허용한다.
Figure pct00031
표 31. 모노클로날 항체 공급물의 유통 응집물 정리제거. 팩킹된 층 포맷으로 설포프로필-작용화된 섬유 매질(2.85 mL 컬럼 부피, 0.35 g/mL 팩킹 밀도)을 포함하는 유통 응집물 정리제거 공정의 평가. 31개 유통 분획 및 3개 용출 분획에 대한 모노클로날 항체 회수율(단백질 A HPLC) 및 % 단량체, % HMW 응집물(SEC). 풀링된 분획 데이터가 산출값이다. 부하시험: 3.2 mL/min(체류 시간 = 54 초) 유속으로 6.9 g/L의 모노클로날 항체 단백질 A 용출(pH 5, 19 mS).
실시예 32.
압축 층 상에서 직접적 포획. 실시예 19의 설포프로필-작용화된 섬유 매질을 청정화되지 않은 세포 배양 유체로부터 유통 모드 작업으로 직접적인 모노클로날 항체 포획에 대해 평가하였다. 0.49 g의 설포프로필-작용화된 섬유 매질을 14.5 mm 내부 직경 컬럼에 팩킹하고 또 3.0 cm의 층 깊이로 압축하였다(5.0 mL 컬럼 부피, 0.10 g/mL 섬유 팩킹 밀도). 설포프로필-작용화된 섬유 매질 컬럼은 완충액 용액(50 mM 아세테이트, pH 5)에 의해 평형화되었다. 0.8 g/L 모노클로날 항체를 함유하는 청정화되지 않은 중국 햄스터 난소 세포 배양 유체가 제공되었다(pH 6.5, 5.7 mS/cm).
0.8 g/L 모노클로날 항체를 함유하는 100 mL의 비청정화 세포배양 유체는 12.5 mL/min(460 cm/hr) 유속으로 컬럼을 통과하였다. 9개의 10 mL(2 컬럼 부피) 유통 분획을 수집하였다. 저 밀도 섬유 층은 반복된 섬유 층의 압축과 팽창에 의해 50 mM 아세테이트 완충액(pH 5)으로 세척하였다. 상기 압축과 팽창은 컬럼 유동 분포 헤더의 조정에 의해 달성하였다. 13개 10 mL(2 컬럼 부피) 50 mM 아세테이트 완충액(pH 5) 세척 분획을 수집하였다. 결합된 모노클로날 항체는 용출 완충액으로 50 mM 아세테이트 pH 5 중의 1.0 M 염화 나트륨 용액을 사용하여 용출하였다. 모노클로날 항체 용출물을 더 농축시키기 위하여 압축층 포맷(층 깊이 1.0 cm, 1.65 mL 컬럼 부피, 0.30 g/ mL 섬유 팩킹 밀도)의 용출 단계를 실시하는 것이 바람직하다. 3개의 10 mL(2 컬럼 부피) 용출 분획을 수집하였다. 9개의 유통 분획, 13개의 세척분획 및 3개의 용출 분획을 단백질 A HPLC에 의해 분석하여 모노클로날 항체 회수율을 측정하였다. 설포프로필-작용화된 섬유 매질의 평가로부터 얻은 데이터는 표 32에 제공된다.
상기 설포프로필-작용화된 섬유는 비청정화된 중국 햄스터 난소 세포 배양 매질 존재하에서 모노클로날 항체(mAb)를 결합하는 능력을 나타내었다. 단백질 A HPLC 데이터로부터, 본 발명자들은 분획 #7에 의한 mAb 포획 작업 동안 완전한 mAb 파과를 발견하였다. 50 mM 아세테이트(pH 5) 세척 단계는 세척 분획 #6에 의한 컬럼 및 계로부터 미결합 mAb를 제거한다. 50 mM 아세테이트(pH 5) 중의 1.0 M 염화 나트륨을 사용한 용출은 설포프로필-작용화된 섬유 매질 컬럼으로부터 결합 mAb를 용출시킨다. 당업자들은 모노클로날 IgG 결합능에서의 현저한 이득은 임의의 공정 변형에 의해 실현될 수 있음을 인식할 것이다. 이들은 세포 배양 공급물 도전성의 감소, 비청정화된 세포 배양 공급물의 희석, 또는 본 실시예의 설포프로필-기제 양이온 교환 리간드 작용성 대신 단백질 A 친화성 리간드 구조의 사용을 포함할 수 있다. 당업자는 실시예 18의 단백질 A 작용화된 섬유 매질이 직접적인 포획 적용에 바람직할 수 있음을 인식할 것이다. 저 팩킹 밀도 포맷에서, 상기 표면 작용화된 섬유 매질은 비청정화된 공급물 스트림으로부터 직접 IgG를 포획할 수 있다. 후속 층 압축은 압축된 상 포맷에서 mAb 용출물의 농축을 허용한다. 이 공정은 모노클로날 항체와 같은 치료성 생물약제의 하류 가공에서 기본적인(원심분리) 및 부차적인 청정화(심층 여과) 공정 사용을 제거한다.
Figure pct00032
표 32. 비청정화된 세포 배양액으로부터 모노클로날 항체의 직접적 포획. 설포프로필-작용화된 섬유 매질을 팩킹된 층 포맷(5.00 mL 컬럼 부피, 0.10 g/mL 팩킹 밀도)으로 포함하는 직접적 mAb 포획 공정의 평가. 4개의 유통 분획, 4개의 세척 분획 및 3개의 염화 나트륨 용출 분획에 대한 모노클로날 항체 농도 및 회수율(단백질 A HPLC). 부하시험: 0.87 g/L의 모노클로날 항체(pH 6.5, 5.7 mS)를 함유하는 12.5 mL/ min(체류 시간 = 24 초) 유속의 100 mL의 비청정화된 중국 햄스터 난소 세포 배양 유체.
실시예 33.
바이러스의 결합/용출 정제를 위한 섬유 매질 능력. 박테리오파지 φ 6에 대한 정적 결합능 및 용출 회수율의 결과는 하기 표 31에 제공된다. 5개의 플라스틱 원심분리관에 실시예 14C의 Q-작용화된 촉수 섬유 매질 및 작용화되지 않은 알라쏘 섬유 샘플을 하기 표 33에 기재된 양으로 부가하였다. 각 섬유 샘플 및 대조 튜브를 5 mL의 25 mM 트리스 완충액(pH 8, 0.18 mg/mL HSA)에 의해 10분간 교반하여 평형화시켰다. 이 튜브를 4000 rpm에서 테이블 상부 원심분리로 10분간 실온에서 방사시켜 섬유 매질을 펠릿화하였다. 2.5 mL의 상청액을 제거하고 또 25 mM 트리스 완충액(pH 8, 0.18 mg/mL HSA) 중의 2.5 mL의 1.7 x 107 pfu/mL φ6 용액을 각 튜브에 부가하였다. 상기 샘플을 실온에서 1시간 동안 교반시켰다. 그 후, 튜브를 실온에서 테이블 상부 원심분리에 의해 4000 rpm에서 15분간 방사시켜 섬유 매질을 방사시켰다. 2.5 mL의 상청액을 제거하고 또 이들 샘플을 플라크-형성 에세이에 의해 미결합 φ6에 대해 분석하였다. 이 튜브를 25 mM 트리스 완충액(pH 8, 0.18 mg/mL HSA)의 2.5 mL 세척으로 3회 세척하고 원심분리하여 각 세척과 2.5 mL 상청액 제거 사이에 섬유 매질을 펠릿화하였다. 세척 후, 25 mM 트리스 완충액(pH 8, 0.18 mg/mL HSA) 중의 1.0 M NaCl 용액 2.5 mL를 각 튜브에 부가하였다(5 mL 전체 부피, 최종 NaCl 농도는 0.5 M임). 상기 샘플을 실온에서 10분 동안 교반하였다. 그 후, 튜브를 실온에서 테이블 상부 원심분리에 의해 4000 rpm에서 10분간 방사하여 섬유 매질을 펠릿화하였다. 2.5 mL의 상청액을 제거하고 또 이들 용출 샘플은 용출된 φ 6에 대해 플라크 형성 에세이에 의해 분석하였다. 실시예 14C의 Q-작용화된 촉수 섬유 매질은 3.1의 현저한 박테리오파지 φ 6 로그 감소 값(LRV)과 40%의 용출 회수율을 나타낸다. 이러한 성능은 시판되는 바이러스 크로마토그래피 적용에서 이용된 막 기제 음이온 교환 매질에 필적한다. 본 발명의 Q-작용화된 섬유 매질은 바이러스 정리제거를 유통하기 위한 또는 바이러스 정제 적용을 결합/용출하기 위한 팩킹된 장치 포맷 또는 크로마토그래피 컬럼에 통합될 수 있다.
Figure pct00033
표 33. 정적 결합능 측정. 시험: 0.18 mg/mL HSA를 갖는 25 mM Tris(pH 8)에 의한 2.5 mL의 1.7 x l07 pfu/mL 박테리오파지 φ6. 용출 완충액: 0.18 mg/mL HSA를 갖는 25 mM Tris(pH 8) 중의 0.5 M NaCl.

Claims (15)

  1. 실질적으로 종축을 규정하는 주 본체 영역을 포함하는 영역 및 상기 주 본체 영역으로부터 외부로 방사상으로 연장되는 복수의 돌출부를 포함하는 단면을 갖는 고 표면적 섬유를 포함하는 크로마토그래피 매질로서, 상기 섬유는 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 친화성 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택된 크로마토그래피를 가능하게 하는 부여된 작용성을 갖는, 크로마토그래피 매질.
  2. 제1항에 있어서, 상기 작용성이 양이온 교환 작용성인 크로마토그래피 매질.
  3. 제1항에 있어서, 상기 작용성이 음이온 교환 작용성인 인 크로마토그래피 매질.
  4. 제1항에 있어서, 상기 작용성이 아크릴 중합체 작용성을 포함하는 크로마토그래피 매질.
  5. 제1항에 있어서, 상기 섬유의 표면이 현수 설포프로필 기에 의해 변형되는 크로마토그래피 매질.
  6. 제1항에 있어서, 상기 섬유의 표면이 현수 트리메틸암모늄 기에 의해 변형되는 크로마토그래피 매질.
  7. 제1항에 있어서, 상기 작용성이 상기 섬유에 그라프트되는 크로마토그래피 매질.
  8. 제1항에 있어서, 상기 섬유가 그램 당 15 m2의 표면적을 갖는 크로마토그래피 매질.
  9. 실질적으로 종축을 규정하는 주 본체 영역을 포함하고, 또 상기 주 본체 영역으로부터 외부로 방사상으로 연장되는 복수의 돌출부를 갖는 단면을 갖는 고 표면적 섬유의 부직포 층으로서, 상기 섬유는 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 친화성 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택된 크로마토그래피를 가능하게 하는 부여된 작용성을 갖는, 부직포 층.
  10. 실질적으로 종축을 규정하는 주 본체 영역을 포함하고, 또 상기 주 본체 영역으로부터 외부로 방사상으로 연장되는 복수의 돌출부를 갖는 단면을 갖는 느슨한 또는 융합된 절단 섬유의 팩킹된 층을 포함하는 하우징으로서, 상기 섬유는 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 친화성 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택된 크로마토그래피를 가능하게 하는 부여된 작용성을 갖는, 하우징.
  11. 생체분자를 포함하는 샘플을 섬유 매질의 층과 접촉시키는 것을 포함하는 생체 분자를 포함하는 샘플의 정제 방법으로서,
    상기 섬유는 실질적으로 종축을 규정하는 주 본체 영역을 포함하고, 또 상기 주 본체 영역으로부터 외부로 방사상으로 연장되는 복수의 돌출부를 갖는 단면을 가지며, 또
    상기 섬유는 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 친화성 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택된 크로마토그래피를 가능하게 하는 부여된 작용성을 갖는, 샘플의 정제 방법.
  12. 제11항에 있어서, 상기 작용성이 유통 모드의 정제를 가능하게 하는 샘플의 정제 방법.
  13. 제11항에 있어서, 상기 작용성이 결합/용출 모드의 정제를 가능하게 하는 샘플의 정제 방법.
  14. 제11항에 있어서, 상기 이온 교환 작용성이 양이온 교환 작용성이고, 또 상기 정제는 5 내지 8 범위의 pH에서 실시되는 샘플의 정제 방법.
  15. 단백질 혼합물을 제공하는 단계;
    상기 단백질 혼합물을, 실질적으로 종축을 규정하는 주 본체 영역을 포함하고, 또 상기 주 본체 영역으로부터 외부로 방사상으로 연장되는 복수의 돌출부를 갖는 단면을 갖는 섬유 매질의 저 밀도 층(bed)과 접촉시키는 단계, 이때 섬유는 이온 교환 크로마토그래피, 소수성 상호작용 크로마토그래피, 및 친화성 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택된 크로마토그래피를 가능하게 하는 부여된 작용성을 가짐;
    상기 섬유 매질을 세척하여 미결합 종을 제거하는 단계;
    상기 섬유 매질을 압축하는 단계; 및
    상기 압축된 섬유 매질을 세척하여 결합 단백질을 추출하는 단계를 포함하는, 단백질의 정제 방법.
KR1020137001640A 2010-07-30 2011-07-27 크로마토그래피 매질 및 방법 KR20130031351A (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36933110P 2010-07-30 2010-07-30
US61/369,331 2010-07-30
PCT/US2011/045519 WO2012015908A2 (en) 2010-07-30 2011-07-27 Chromatography media and method

Related Child Applications (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157000534A Division KR101619865B1 (ko) 2010-07-30 2011-07-27 크로마토그래피 매질
KR1020147025710A Division KR101627597B1 (ko) 2010-07-30 2011-07-27 부직포 층

Publications (1)

Publication Number Publication Date
KR20130031351A true KR20130031351A (ko) 2013-03-28

Family

ID=45527371

Family Applications (7)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157025293A KR101871683B1 (ko) 2010-07-30 2011-07-27 크로마토그래피 매질 및 방법
KR1020177012999A KR101847405B1 (ko) 2010-07-30 2011-07-27 크로마토그래피 매질 및 방법
KR1020137001640A KR20130031351A (ko) 2010-07-30 2011-07-27 크로마토그래피 매질 및 방법
KR1020157002666A KR20150023923A (ko) 2010-07-30 2011-07-27 크로마토그래피 매질 및 방법
KR1020157000534A KR101619865B1 (ko) 2010-07-30 2011-07-27 크로마토그래피 매질
KR1020147025710A KR101627597B1 (ko) 2010-07-30 2011-07-27 부직포 층
KR1020187017537A KR101997543B1 (ko) 2010-07-30 2011-07-27 크로마토그래피 매질 및 방법

Family Applications Before (2)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157025293A KR101871683B1 (ko) 2010-07-30 2011-07-27 크로마토그래피 매질 및 방법
KR1020177012999A KR101847405B1 (ko) 2010-07-30 2011-07-27 크로마토그래피 매질 및 방법

Family Applications After (4)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020157002666A KR20150023923A (ko) 2010-07-30 2011-07-27 크로마토그래피 매질 및 방법
KR1020157000534A KR101619865B1 (ko) 2010-07-30 2011-07-27 크로마토그래피 매질
KR1020147025710A KR101627597B1 (ko) 2010-07-30 2011-07-27 부직포 층
KR1020187017537A KR101997543B1 (ko) 2010-07-30 2011-07-27 크로마토그래피 매질 및 방법

Country Status (7)

Country Link
US (3) US9029517B2 (ko)
EP (1) EP2598223B1 (ko)
JP (3) JP2013535683A (ko)
KR (7) KR101871683B1 (ko)
CN (3) CN104722101A (ko)
SG (2) SG186915A1 (ko)
WO (1) WO2012015908A2 (ko)

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20170015997A (ko) * 2014-09-02 2017-02-10 이엠디 밀리포어 코포레이션 나노-피브릴화된 표면 특징을 갖는 고표면적 섬유 매질
KR20180095133A (ko) * 2013-12-12 2018-08-24 이엠디 밀리포어 코포레이션 아크릴아미드 함유 필터를 사용한 단백질 분리
US11236125B2 (en) 2014-12-08 2022-02-01 Emd Millipore Corporation Mixed bed ion exchange adsorber
US11305271B2 (en) 2010-07-30 2022-04-19 Emd Millipore Corporation Chromatography media and method

Families Citing this family (31)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
SG10201701224UA (en) * 2012-03-12 2017-04-27 Merck Patent Gmbh Removal of protein aggregates from biopharmaceutical preparations in a flowthrough mode
US10704021B2 (en) 2012-03-15 2020-07-07 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic perfusion devices
US10967298B2 (en) 2012-03-15 2021-04-06 Flodesign Sonics, Inc. Driver and control for variable impedence load
US9950282B2 (en) 2012-03-15 2018-04-24 Flodesign Sonics, Inc. Electronic configuration and control for acoustic standing wave generation
US9458450B2 (en) 2012-03-15 2016-10-04 Flodesign Sonics, Inc. Acoustophoretic separation technology using multi-dimensional standing waves
MY178616A (en) 2012-09-17 2020-10-19 Grace W R & Co Chromatography media and devices
JP6340317B2 (ja) * 2012-10-18 2018-06-06 Jnc株式会社 抗体精製用陽イオン交換クロマトグラフィー担体および抗体医薬の製造過程で生産される抗体単量体とその重合体の分離方法
EP2950903A4 (en) * 2013-01-31 2016-09-07 Emd Millipore Corp CHROMATOGRAPHIC SUPPORT FOR THE PURIFICATION OF VACCINES AND VIRUSES
US9816901B2 (en) * 2013-01-31 2017-11-14 Emd Millipore Corporation Disposable direct capture device
CN103551129B (zh) * 2013-11-15 2016-01-13 天津工业大学 一种具有宽pH使用范围的重金属离子吸附纤维的制备及应用
EP3092049A1 (en) 2014-01-08 2016-11-16 Flodesign Sonics Inc. Acoustophoresis device with dual acoustophoretic chamber
US11021699B2 (en) 2015-04-29 2021-06-01 FioDesign Sonics, Inc. Separation using angled acoustic waves
US11420136B2 (en) 2016-10-19 2022-08-23 Flodesign Sonics, Inc. Affinity cell extraction by acoustics
US11377651B2 (en) 2016-10-19 2022-07-05 Flodesign Sonics, Inc. Cell therapy processes utilizing acoustophoresis
US11708572B2 (en) 2015-04-29 2023-07-25 Flodesign Sonics, Inc. Acoustic cell separation techniques and processes
US11474085B2 (en) 2015-07-28 2022-10-18 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
US11459540B2 (en) 2015-07-28 2022-10-04 Flodesign Sonics, Inc. Expanded bed affinity selection
US11214789B2 (en) 2016-05-03 2022-01-04 Flodesign Sonics, Inc. Concentration and washing of particles with acoustics
US11085035B2 (en) 2016-05-03 2021-08-10 Flodesign Sonics, Inc. Therapeutic cell washing, concentration, and separation utilizing acoustophoresis
US20190201812A1 (en) * 2016-06-20 2019-07-04 Clemson University Functionalized Polyamide Stationary Phase for Chromatography and Microwave Assisted Formation Thereof
US11097252B2 (en) 2016-07-14 2021-08-24 Puridify Ltd. Functionalised chromatography medium comprising polymer nanofibres and process of preparation thereof
GB201612248D0 (en) 2016-07-14 2016-08-31 Puridify Ltd New process
US20190284321A1 (en) * 2016-07-18 2019-09-19 North Carolina State University Heat-Induced Grafting Of Nonwovens For High Capacity Ion Exchange Separation
EP3504544A1 (en) 2016-08-26 2019-07-03 Puridify Ltd. Chromatography system
US11325104B2 (en) 2017-12-07 2022-05-10 Emp Biotech Gmbh System and method of applied radial technology chromatography
BR112020009889A2 (pt) 2017-12-14 2020-11-03 Flodesign Sonics, Inc. acionador e controlador de transdutor acústico
GB201800448D0 (en) * 2018-01-11 2018-02-28 Puridify Ltd Chromatography media and methods for producing them
CN111818980B (zh) * 2018-03-08 2022-10-11 生物辐射实验室股份有限公司 阴离子交换-疏水混合模式色谱树脂
WO2019192877A1 (en) * 2018-04-03 2019-10-10 Merck Patent Gmbh Cex chromatography media and low salt elution of target proteins from biopharmaceutical feeds
EP4025336A4 (en) 2019-09-05 2024-01-17 Bio Rad Laboratories Inc ANION EXCHANGE/HYDROPHOBIC RESINS FOR MIXED MODE CHROMATOGRAPHY
CN111389052A (zh) * 2020-03-13 2020-07-10 中谱科技(福州)有限公司 一种聚酰胺高效液相色谱柱的制备及其应用

Family Cites Families (130)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US3382305A (en) 1954-10-29 1968-05-07 Du Pont Process for preparing oriented microfibers
US3936394A (en) 1972-04-13 1976-02-03 Asahi Kasei Kogyo Kabushiki Kaisha Polymer adsorbents and method for manufacture thereof
US4169790A (en) 1975-05-02 1979-10-02 South African Inventions Development Corporation Solid surface texture suitable for a stationary phase for chromatography
US4384957A (en) 1980-09-08 1983-05-24 Amf Incorporated Molecular separation column and use thereof
US4512897A (en) 1981-07-28 1985-04-23 Amf Incorporated Molecular separation column and use thereof
US4496461A (en) 1983-06-17 1985-01-29 Amf Incorporated Chromatography column
US4657742A (en) 1985-07-01 1987-04-14 Ppg Industries, Inc. Packed fiber glass reaction vessel
US4721572A (en) 1985-07-12 1988-01-26 Miles Laboratories, Inc. Purfication of blood clotting factors and other blood proteins on non-carbohydrate sulfated matrices
AU598606B2 (en) 1986-11-27 1990-06-28 Unitika Ltd. Adsorptive fiber sheet
US5162074A (en) 1987-10-02 1992-11-10 Basf Corporation Method of making plural component fibers
JP2660261B2 (ja) 1988-05-25 1997-10-08 旭化成工業株式会社 多機能性モジュール
US5360540A (en) 1990-04-23 1994-11-01 Andelman Marc D Chromatography system
US5354472A (en) 1991-12-04 1994-10-11 Cobe Cardiovascular, Inc. Anion exchange materials comprised of derivatized cellulose-polyester composites
JPH05239709A (ja) 1992-02-24 1993-09-17 Toyobo Co Ltd 極細超異形繊維
US5468847A (en) 1994-03-10 1995-11-21 Minnesota Mining And Manufacturing Company Method of isolating and purifying a biomacromolecule
US5502022A (en) 1994-05-16 1996-03-26 Biosepra, Inc. Chromatography adsorbents utilizing mercapto heterocyclic ligands
JPH08108069A (ja) 1994-10-07 1996-04-30 Toyobo Co Ltd 幹細胞分離方法
TW288051B (ko) * 1994-11-22 1996-10-11 Ebara Corp
JPH08170958A (ja) 1994-12-19 1996-07-02 Makoto Kawabata 分離剤
FR2737730B1 (fr) * 1995-08-10 1997-09-05 Pasteur Merieux Serums Vacc Procede de purification de virus par chromatographie
AUPN520395A0 (en) 1995-09-04 1995-09-28 Steripak Pty Ltd Manufacturing process for polymers with fractal structure
US5906747A (en) 1995-11-13 1999-05-25 Biosepra Inc. Separation of molecules from dilute solutions using composite chromatography media having high dynamic sorptive capacity at high flow rates
US6254883B1 (en) 1996-01-30 2001-07-03 Novagent Oy Composition for transdermal delivery of drugs
US5800706A (en) 1996-03-06 1998-09-01 Hyperion Catalysis International, Inc. Nanofiber packed beds having enhanced fluid flow characteristics
AU714882B2 (en) 1996-04-09 2000-01-13 Therakos, Inc. Method for removal of psoralens from biological fluids
JP3983292B2 (ja) 1996-05-15 2007-09-26 ハイピリオン カタリシス インターナショナル インコーポレイテッド 高表面積ナノファイバー
JP4128628B2 (ja) 1996-05-15 2008-07-30 ハイピリオン カタリシス インターナショナル インコーポレイテッド 堅い多孔質炭素構造体及びその製造方法
KR100522108B1 (ko) 1996-05-15 2006-01-27 하이페리온 커탤리시스 인터내셔널 인코포레이티드 고표면적나노섬유
US5948528A (en) 1996-10-30 1999-09-07 Basf Corporation Process for modifying synthetic bicomponent fiber cross-sections and bicomponent fibers thereby produced
AT406373B (de) * 1997-02-27 2000-04-25 Immuno Ag Verfahren zur reinigung von faktor viii/vwf-komplex mittels kationenaustauscherchromatographie
US5886154A (en) 1997-06-20 1999-03-23 Lebing; Wytold R. Chromatographic method for high yield purification and viral inactivation of antibodies
CA2317495C (en) 1998-01-12 2004-11-09 F. William Collins A process for the isolation, recovery and purification of non-polar extractives
DK1058844T3 (da) * 1998-02-27 2006-03-06 Bia Separations Doo Chromatografisk indretning
JPH11279945A (ja) 1998-03-23 1999-10-12 Japan Atom Energy Res Inst 放射線グラフト重合されたポリエチレン材料
SE9803838D0 (sv) 1998-11-09 1998-11-09 Knut Irgum A chromatography method and a column material useful in said method
FR2787465A1 (fr) 1998-12-21 2000-06-23 Transgene Sa Procede d'inactivation des virus enveloppes dans une preparation virale de virus non enveloppes
AU779267B2 (en) 1998-12-31 2005-01-13 Centelion S.A.S. Method for separating viral particles
CA2366928C (en) * 1999-02-25 2009-07-14 Pall Corporation Positively charged membrane
US6780327B1 (en) * 1999-02-25 2004-08-24 Pall Corporation Positively charged membrane
US6270970B1 (en) 1999-05-14 2001-08-07 Promega Corporation Mixed-bed solid phase and its use in the isolation of nucleic acids
TW522042B (en) * 1999-10-20 2003-03-01 Honeywell Int Inc Devices and methods for chemical reactive filtration
CN2455356Y (zh) 1999-11-18 2001-10-24 李循 一种高填充度混合床离子交换器
DE19962577A1 (de) 1999-12-23 2001-07-12 Tittgen Biotechnologie Dr Chromatographiematerial und Verfahren unter Verwendung desselben
CA2410948C (en) 2000-05-31 2012-07-17 Chiron Corporation Method for the purification of alphavirus replicon particles
JP4520621B2 (ja) * 2000-11-01 2010-08-11 信和化工株式会社 クロマトグラフィー用分離カラム、固相抽出用媒体、及びクロマトグラフィーの試料注入システム
GB2377447B (en) 2001-04-18 2003-06-25 Amersham Biosciences Ab Isolation of dna molecules
ES2331466T3 (es) 2001-06-15 2010-01-05 Kuraray Co., Ltd. Fibra compuesta.
RU2304463C2 (ru) 2001-06-22 2007-08-20 Аргонид Корпорейшн Наноразмерный электроположительный волокнистый адсорбент
US7374673B2 (en) 2001-09-10 2008-05-20 Clemson University Channeled polymer fibers as stationary/support phases for chemical separation by liquid chromatography and for waste stream clean-up
DE60227390D1 (de) * 2001-09-28 2008-08-14 Invista Tech Sarl Dehnbarer vliesstoff und methode zu dessen herstellung
US7118675B2 (en) 2002-02-04 2006-10-10 Millipore Corporation Process for removing protein aggregates and virus from a protein solution
SE0200543D0 (sv) 2002-02-21 2002-02-21 Amersham Biosciences Ab Method of separation using aromatic thioether ligands
US20030180936A1 (en) 2002-03-15 2003-09-25 Memarzadeh Bahram Eric Method for the purification, production and formulation of oncolytic adenoviruses
WO2004013388A1 (ja) 2002-08-05 2004-02-12 Toray Industries, Inc. 多孔繊維
US7510848B2 (en) 2003-04-04 2009-03-31 North Carolina State University Prion protein binding materials and methods of use
WO2005011849A2 (en) 2003-08-05 2005-02-10 Millipore Corporation Electrodeionization module and apparatus comprising it
US7291263B2 (en) 2003-08-21 2007-11-06 Filtrona Richmond, Inc. Polymeric fiber rods for separation applications
SE0400501D0 (sv) 2004-02-27 2004-02-27 Amersham Biosciences Ab Antibody purification
MXPA06012232A (es) * 2004-04-20 2007-06-15 Univ Texas Uso del patron proteogenomico del plasma para diagnostico, clasificacion, prediccion de respuesta a la terapia y comportamiento clinico, estratificacion de la terapia y monitoreo de enfermedad, en malignidades hematologicas.
DK1748701T3 (da) * 2004-05-07 2010-09-20 Wisconsin Alumni Res Found Fremgangsmåder og sammensætninger involverende valleproteinisolater
US7261813B2 (en) * 2004-08-10 2007-08-28 Clemson University Monolithic structures comprising polymeric fibers for chemical separation by liquid chromatography
CN101039744B (zh) 2004-08-13 2010-05-05 麦克马斯特大学 包含非交联的胶凝聚合物的复合材料
US20060070950A1 (en) 2004-10-01 2006-04-06 3M Innovative Properties Company Composite filtration article
KR101243601B1 (ko) 2004-10-21 2013-03-20 지이 헬스케어 바이오-사이언시스 에이비 크로마토그래피 리간드
WO2006052302A2 (en) 2004-11-03 2006-05-18 Introgen Therapeutics Inc. Method of producing and purifying adenoviral vectors
MY144940A (en) 2005-01-25 2011-11-30 Avantor Performance Mat Inc Chromatographic media
US7311825B2 (en) 2005-05-02 2007-12-25 Varian, Inc. Polymer modified porous substrate for solid phase extraction
WO2007053235A1 (en) * 2005-11-04 2007-05-10 Sachem, Inc. Cation-exchange displacement chromatography process and cationic organic compounds for use as displacer compounds in cation-exchange displacement chromatography process
CA2633398C (en) 2005-12-28 2012-02-28 Vantrix Corporation Multi-users real-time transcoding system and method for multimedia sessions
CN1807465A (zh) 2006-01-11 2006-07-26 胡耀辉 一种海藻糖的分离纯化方法
SG170837A1 (en) 2006-04-05 2011-05-30 Abbott Biotech Ltd Antibody purification
WO2008001802A1 (fr) 2006-06-27 2008-01-03 Asahi Kasei Kabushiki Kaisha Substrat pour traitement de fluide biologique
EP1878791A1 (en) 2006-07-11 2008-01-16 Bia Separations D.O.O. Method for influenza virus purification
CN101484196B (zh) * 2006-08-31 2012-08-08 东丽株式会社 含有复合纤维的吸附载体
EP2066418A4 (en) 2006-09-29 2011-12-28 Ge Healthcare Bio Sciences Ab SEPARATION MATRIX FOR VIRAL PURIFICATION
US8129019B2 (en) * 2006-11-03 2012-03-06 Behnam Pourdeyhimi High surface area fiber and textiles made from the same
EP2091623A4 (en) * 2006-11-17 2011-10-12 Gareth Michael Forde MATERIALS, METHODS AND SYSTEMS FOR PURIFICATION AND / OR SEPARATION OF MOLECULES
CN101036876B (zh) 2007-01-25 2010-09-01 天津大学 超大孔纤维素微球蛋白质吸附介质的制备方法
FR2911883B1 (fr) * 2007-01-29 2009-05-01 Intissel Soc Par Actions Simpl Procede de greffage par rayonnement ionisant au moyen d'une molecule tensioactive reactive, substrat textile et separateur de batterie obtenus par greffage
US9433922B2 (en) 2007-08-14 2016-09-06 Emd Millipore Corporation Media for membrane ion exchange chromatography based on polymeric primary amines, sorption device containing that media, and chromatography scheme and purification method using the same
WO2009061759A1 (en) 2007-11-09 2009-05-14 3M Innovative Properties Company Porous polymeric resins
US20090130738A1 (en) 2007-11-19 2009-05-21 Mikhail Kozlov Media for membrane ion exchange chromatography
JP2011016036A (ja) 2007-11-26 2011-01-27 Asahi Kasei Chemicals Corp タンパク吸着材料およびその製造方法
CN102257134B (zh) 2008-02-12 2014-03-05 赛诺菲巴斯德有限公司 使用离子交换和凝胶过滤色谱进行痘病毒纯化的方法
EP2522692B1 (en) 2008-05-30 2014-06-18 3M Innovative Properties Company Ligand monomers and copolymers made therewith
JP2011523965A (ja) 2008-05-30 2011-08-25 スリーエム イノベイティブ プロパティズ カンパニー リガンド官能化基材
ES2567087T3 (es) 2008-06-10 2016-04-19 Pathogen Removal And Diagnostic Technologies Inc. Revestimiento acomodable de fibras poliméricas sobre substratos no tejidos
CN102215865B (zh) 2008-09-24 2013-10-30 米迪缪尼有限公司 病毒纯化方法
NZ592097A (en) 2008-10-20 2013-01-25 Abbott Lab Viral inactivation during purification of il-12 and il-18 antibodies
US9631008B2 (en) * 2008-12-22 2017-04-25 Hoffmann-La Roche Inc. Immunoglobulin purification
CN101768206B (zh) 2008-12-31 2013-05-15 华北制药集团新药研究开发有限责任公司 一种重组人血清白蛋白的纯化方法及其应用
EP2398577A2 (en) 2009-02-19 2011-12-28 Bonner, Alex Garfield Porous interpenetrating polymer network
US8053565B2 (en) 2009-05-28 2011-11-08 Bio-Rad Laboratories, Inc. Multi-media affinity column to prevent leaching of ligands
JP5716297B2 (ja) 2009-06-25 2015-05-13 Jnc株式会社 クロマトグラフィー用充填剤、その製造方法、およびそれを用いたウイルス用ワクチンの製造方法
US8536316B2 (en) 2009-08-07 2013-09-17 Emd Millipore Corporation Methods for purifying a target protein from one or more impurities in a sample
WO2011038053A1 (en) 2009-09-25 2011-03-31 Armark Authentication Technologies, Llc Tissue fiber scaffold and method for making
MX2012004711A (es) 2009-10-20 2012-05-23 Abbott Lab Aislamiento y purificacion de los anticuerpos anti-il-13 al usar cromatografia de afinidad con proteina a.
US20110142863A1 (en) 2009-12-16 2011-06-16 Millipore Corporation Flow through purification processes for large biomolecules
US20120077249A1 (en) 2010-04-20 2012-03-29 Millipore Corporation Separation Of Virus And/Or Protein From Nucleic Acids By Primary Amines
KR101871683B1 (ko) 2010-07-30 2018-06-27 이엠디 밀리포어 코포레이션 크로마토그래피 매질 및 방법
US20120077405A1 (en) 2010-09-29 2012-03-29 Hao Zhou Core/Shell Nanofiber Non-Woven
US20120074611A1 (en) 2010-09-29 2012-03-29 Hao Zhou Process of Forming Nano-Composites and Nano-Porous Non-Wovens
WO2012044382A1 (en) 2010-09-29 2012-04-05 Milliken & Company Process of forming nano-composites and nano-porous non-wovens
US8889572B2 (en) 2010-09-29 2014-11-18 Milliken & Company Gradient nanofiber non-woven
US20120077406A1 (en) 2010-09-29 2012-03-29 Scrivens Walter A Nanofiber Non-Wovens Containing Particles
US8795561B2 (en) 2010-09-29 2014-08-05 Milliken & Company Process of forming a nanofiber non-woven containing particles
JP6023715B2 (ja) 2010-10-11 2016-11-09 アッヴィ・バハマズ・リミテッド タンパク質の精製方法
KR101831300B1 (ko) 2010-10-29 2018-02-23 한미사이언스 주식회사 재조합 대장균으로부터 인간 과립구 콜로니 자극인자를 정제하는 방법
WO2012068442A1 (en) 2010-11-19 2012-05-24 Pathogen Removal And Diagnostic Technologies Inc. High-surface area fibers and nonwoven membranes for use in bioseparations
US20120213796A1 (en) 2011-02-22 2012-08-23 Fox Barbara S Polyclonal antibody compositions
BR112013032225A2 (pt) 2011-06-13 2016-08-16 Merck Sharp & Dohme método para purificar toxina de difteria, e, formulação
JP6151640B2 (ja) 2011-06-29 2017-06-21 協和発酵キリン株式会社 たん白質の精製方法
US8722757B2 (en) * 2011-07-22 2014-05-13 Ut-Battelle, Llc Fiber-based adsorbents having high adsorption capacities for recovering dissolved metals and methods thereof
JP5567539B2 (ja) 2011-10-28 2014-08-06 ローム アンド ハース カンパニー 前処理されたカチオン交換樹脂、その処理方法及びカチオン交換樹脂を含有する混床系
US20140301977A1 (en) 2011-11-02 2014-10-09 Genentech, Inc. Overload and elute chromatography
GB201119192D0 (en) 2011-11-07 2011-12-21 Ucl Business Plc Chromatography medium
US20130115837A1 (en) 2011-11-09 2013-05-09 Dale S. Kitchen Nanofiber nonwovens and nanofiber nonwoven composites containing roped fiber bundles
US20130112625A1 (en) 2011-11-09 2013-05-09 Pradipkumar Bahukudumbi Consolidated nanofiber nonwovens and consolidated nanofiber nonwoven composites containing roped fiber bundles
SG10201701224UA (en) 2012-03-12 2017-04-27 Merck Patent Gmbh Removal of protein aggregates from biopharmaceutical preparations in a flowthrough mode
HUP1200172A2 (en) 2012-03-19 2013-10-28 Richter Gedeon Nyrt Methods for refolding g-csf from inclusion bodies
US9650411B2 (en) 2012-08-07 2017-05-16 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. Method of purifying protein
CN102911250B (zh) 2012-09-29 2014-04-16 浙江海正药业股份有限公司 酸性重组蛋白药物的纯化方法
US9284663B2 (en) 2013-01-22 2016-03-15 Allasso Industries, Inc. Articles containing woven or non-woven ultra-high surface area macro polymeric fibers
EP2950903A4 (en) 2013-01-31 2016-09-07 Emd Millipore Corp CHROMATOGRAPHIC SUPPORT FOR THE PURIFICATION OF VACCINES AND VIRUSES
CN105103654B (zh) 2013-02-14 2017-06-23 纳米帕雷尔股份有限公司 纳米纤维混合毛毡
KR20150118155A (ko) 2013-02-22 2015-10-21 에이전시 포 사이언스, 테크놀로지 앤드 리서치 음성 하전된 입자들을 갖는 바이러스 제제들의 크로마토그래피 정제
WO2014179665A1 (en) 2013-05-03 2014-11-06 Biogen Idec Inc. Methods for increasing polypeptide recovery
CN104042714B (zh) 2014-07-02 2016-04-27 河南中医学院 一种桃仁蛋白、多糖及低聚糖的制备方法
CA2954425C (en) 2014-09-02 2019-05-07 Emd Millipore Corporation High surface area fiber media with nano-fibrillated surface features
WO2016093926A1 (en) 2014-12-08 2016-06-16 Emd Millipore Corporation Mixed bed ion exchange adsorber

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US11305271B2 (en) 2010-07-30 2022-04-19 Emd Millipore Corporation Chromatography media and method
KR20180095133A (ko) * 2013-12-12 2018-08-24 이엠디 밀리포어 코포레이션 아크릴아미드 함유 필터를 사용한 단백질 분리
KR20170015997A (ko) * 2014-09-02 2017-02-10 이엠디 밀리포어 코포레이션 나노-피브릴화된 표면 특징을 갖는 고표면적 섬유 매질
US10449517B2 (en) 2014-09-02 2019-10-22 Emd Millipore Corporation High surface area fiber media with nano-fibrillated surface features
US11236125B2 (en) 2014-12-08 2022-02-01 Emd Millipore Corporation Mixed bed ion exchange adsorber

Also Published As

Publication number Publication date
WO2012015908A2 (en) 2012-02-02
SG186915A1 (en) 2013-02-28
JP2018059952A (ja) 2018-04-12
US20180085743A1 (en) 2018-03-29
KR20140119199A (ko) 2014-10-08
WO2012015908A3 (en) 2012-05-31
CN103153423A (zh) 2013-06-12
KR101619865B1 (ko) 2016-05-11
KR20170058440A (ko) 2017-05-26
KR20150109499A (ko) 2015-10-01
JP2013535683A (ja) 2013-09-12
JP2015179099A (ja) 2015-10-08
EP2598223A2 (en) 2013-06-05
KR101997543B1 (ko) 2019-07-09
US20150258540A1 (en) 2015-09-17
EP2598223B1 (en) 2022-04-06
EP2598223A4 (en) 2017-07-19
CN108404453A (zh) 2018-08-17
KR101871683B1 (ko) 2018-06-27
CN108404453B (zh) 2021-01-05
KR101847405B1 (ko) 2018-04-10
US11305271B2 (en) 2022-04-19
US9815050B2 (en) 2017-11-14
KR20180072865A (ko) 2018-06-29
JP6278929B2 (ja) 2018-02-14
JP6580168B2 (ja) 2019-09-25
KR20150023923A (ko) 2015-03-05
CN104722101A (zh) 2015-06-24
US9029517B2 (en) 2015-05-12
KR101627597B1 (ko) 2016-06-08
US20120029176A1 (en) 2012-02-02
KR20150013940A (ko) 2015-02-05
SG10201803960SA (en) 2018-07-30

Similar Documents

Publication Publication Date Title
US11305271B2 (en) Chromatography media and method
KR101601812B1 (ko) 생물약제학적 제제로부터 플로우 쓰루 모드로 단백질 응집물의 제거
EP3187260B1 (en) Functionalised chromatography medium
JP6665184B2 (ja) 混床イオン交換吸着剤
KR20150099846A (ko) 백신 및 바이러스를 정제하기 위한 크로마토그래피 매질
Hajizadeh Application of composite cryogels in downstream processing-A review
Avramescu et al. Membrane chromatography
Sakata et al. Chromatographic Removal of DNA from Protein Solutions by Cationic Polymer Beads

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
AMND Amendment
E601 Decision to refuse application
A107 Divisional application of patent
AMND Amendment
A107 Divisional application of patent