CN1807465A

CN1807465A - 一种海藻糖的分离纯化方法

Info

Publication number: CN1807465A
Application number: CN 200610016527
Authority: CN
Inventors: 胡耀辉; 朴春红; 于寒松; 彭帅; 刘俊梅; 刘仁杰; 王欢
Original assignee: 胡耀辉
Priority date: 2006-01-11
Filing date: 2006-01-11
Publication date: 2006-07-26

Abstract

本发明公开了一种海藻糖的分离纯化方法，包括向酶转化法生产海藻糖所获得的酶反应液中加入糖化酶进行酶解反应和向糖化酶酶解反应液中接种3～10％重量的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，在25～30℃，pH5.5～7.5条件下发酵培养，然后再经离心、超滤、离子交换、浓缩、结晶干燥得海藻糖纯品。与以往的活性炭柱层析法和离子交换树脂法相比，本发明采用两步法去除酶解液中的杂糖，所得海藻糖纯品经HPLC检测，纯度达到98.0％。同时，本发明还具有分离纯化效率高，海藻糖损失少，成本低廉，工艺简单等优点，必将对简化酶法生产海藻糖生产工艺、提高产量、降低生产成本产生积极的推动作用。

Description

一种海藻糖的分离纯化方法

技术领域

本发明涉及一种海藻糖的分离纯化方法，特别是指利用酶转化法生产海藻糖过程中对海藻糖的分离纯化方法。

背景技术

海藻糖是由两个葡萄糖分子通过α，α-1，1键结合而成的非还原性双糖。由于海藻糖存在非还原末端，使其具有保护生物细胞和生物活性物质在脱水、干旱、高温、冷冻、高渗透压及有毒试剂等不良环境条件下活性免遭破坏的功能，因此，近年来受到人们日益广泛的关注。

目前，海藻糖的生产方法主要有微生物抽提法、发酵法、酶转化法和基因工程法。其中，酶转化法因其成本低廉、工艺简单、转化率高等优点而具有广阔的应用前景。特别是利用麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)及海藻糖合酶(Trehalose synthase)以淀粉、淀粉水解物、麦芽低聚糖、麦芽糖等为底物酶法转化生产海藻糖现已成为海藻糖工业化生产的主要方法。以淀粉、淀粉水解物、麦芽低聚糖、麦芽糖等为原料酶法制备海藻糖过程中，酶解后的水解液中除了含有海藻糖外，还含有麦芽糖、葡萄糖等糖类。

目前，从酶解液中分离海藻糖的方法主要有活性炭柱层析法和离子交换层析法。活性炭为非极性吸附剂，在水溶液中吸附力最强，在有机溶剂中吸附力较弱。活性炭对各种糖的吸附力不同，糖的聚合度越大，活性炭对其吸附越强。研究表明，葡萄糖、果糖、木糖等单糖能够被水以大致相同的速度从活性炭柱上洗脱下来；蔗糖、麦芽糖、海藻糖、乳糖等二糖能被5％乙醇洗脱，因此，可以通过该法将酶解液中的二糖、单糖进行分离，但是该方法不能将酶解液中的大量麦芽糖有效的去除。此外，利用活性炭柱分离杂糖过程中海藻糖损失较大(15％以上)，且需要大量的有机溶剂，因此使海藻糖生产成本增加，不适合于工业化生产的需要。另一种方法则是离子交换树脂法。因为葡萄糖具有C₁位的醛基，其在碱性条件下发生解离，释放出一个H+离子从而使葡萄糖带负电荷而被阴离子交换树脂吸附。然而海藻糖分子的羟基发生解离比葡萄糖的C₁位的H⁺离子解离要困难，根据这一特性将酶解液中的麦芽糖三糖、麦芽糖等杂糖转化为葡萄糖，然后在碱性条件下将葡萄糖和海藻糖分离。但是该方法海藻糖回收率只有49.8％左右，不适于工业化生产的要求。

发明内容

本发明的目的是针对现有技术的不足，而提供一种廉价、简单的方法将海藻糖生产过程中的海藻糖和杂糖进行快速有效的分离，简化酶转化法生产海藻糖过程中海藻糖分离纯化步骤，从而更适应于工业化生产的要求。

酶转化法生产海藻糖所获得的酶反应液中除了海藻糖外，还含有麦芽糖、葡萄糖、糊精等糖类，此外还有蛋白、色素、氨基酸和金属离子等杂质。因此需要经过系列纯化过程才能得到纯度较高的海藻糖。

本发明根据海藻糖不带可游离的醛基，不具还原性，对酸和热都非常稳定，不被一般酶水解这一特性，利用糖化酶将酶解反应液中的麦芽糖、麦芽低聚糖等杂糖水解成葡萄糖，然后利用酿酒酵母将葡萄糖、氨基酸等杂质转化成醇、CO₂等小分子物质，进而达到将海藻糖和杂糖分离的目的。

因此，本发明所提出的一种海藻糖的分离纯化方法，包括向酶转化法生产海藻糖所获得的酶反应液中加入糖化酶进行酶解反应和向糖化酶酶解反应液中接种3～10％重量的酿酒酵母(Saccharomycescerevisiae)，在pH5.5～7.5条件下发酵培养。

葡萄糖苷酶，国际统一分类编号为EC.3.2.1.3，也称为α-1，4-葡聚糖葡萄糖水解酶，俗称糖化酶。其能够从非还原末端的α-1，4键开始，水解淀粉、麦芽糖等生成葡萄糖，而对海藻糖则无水解作用。

酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)可将葡萄糖等糖类物质迅速转化成醇、CO₂等小分子物质，而对海藻糖则无特异作用。

本发明的酿酒酵母属于：真菌门(Eumycophta)→子囊菌门(Ascomycophta)→半子囊菌纲(Hemiascomycetes)或原子囊菌纲(Protoascomycetes)→内孢霉目(Endomycetales)或酵母目→酵母科(Saccharomycetaceae)→酵母亚科(Saccharomycoideae)→酵母属(Saccharomycopsis)→酿酒酵母种(Saccharomyces Cerevisiae)。

本发明具体地涉及一种海藻糖的分离纯化方法，包括以下步骤：

a提供利用酶转化法生产海藻糖所获得的酶反应液，并将酶反应液钝化，使反应液中的酶类和热不敏感性蛋白变性；

其中所述的酶反应液可以是以淀粉、淀粉水解物、麦芽低聚糖、麦芽糖等为原料经酶(麦芽寡糖基海藻糖合成酶(MTSase)和麦芽寡糖基海藻糖水解酶(MTHase)及海藻糖合酶(Trehalose synthase等)作用所得的酶反应液；所述的酶反应液可以采取高温100℃钝化；

b、向a步骤中的酶反应液中加入糖化酶，每克底物中加入0.14～0.28个糖化酶单位，在50～60℃、pH3.5-5.5条件下水解反应6～12h；

c、向糖化酶酶解反应液中接种3～10％重量的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，在25～30℃，pH5.5～7.5条件下培养。

所述的向糖化酶酶解反应液中接种酿酒酵母，可在pH5.5～7.5条件下培养6～16h，然后在100℃钝化10min终止反应。

所涉及海藻糖的分离纯化方法还包括下述步骤：将经接种酿酒酵母并培养、钝化所得的发酵液离心、超滤、离子交换、浓缩、结晶干燥。

本发明所使用的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)均由市场上购得，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC 1001，CICC1012，CICC1202购自于中国工业微生物菌种保藏中心(简称CICC)；保藏单位的地址为：(100027)北京市朝阳区霄云路32号；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC1001用于酿造酒精；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC1012用于酿造葡萄酒；酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC1202用于酿造啤酒。

本发明的关键处在于糖化酶水解反应和酿酒酵母的发酵：

1、糖化酶水解反应

酶转化法生产海藻糖所获得的酶反应液中除了含有海藻糖外，还含有麦芽糖、麦芽三糖及葡萄糖等杂糖。因为麦芽糖与海藻糖为同分异构体，一般的方法不能够有效、快速的将其分离，并且海藻糖损失较大。为此本发明利用糖化酶将麦芽糖、麦芽低聚糖等杂糖水解成葡萄糖，然后再将其和海藻糖分离。酶解反应结束后经TLC法检测，结果如图1，图1中：1.葡萄糖标品，2.麦芽糖标品，3.海藻糖标品，4.加入糖化酶后样品，5.海藻糖中加入糖化酶，6.麦芽糖中加入糖化酶。由图1可以看出样品中只含有葡萄糖和海藻糖两种糖类，说明麦芽糖、麦芽三糖和麦芽低聚糖等杂糖已全部转化为葡萄糖。由图1还可以看出，糖化酶不作用于海藻糖，即不会造成海藻糖的损失。

2、酿酒酵母发酵

向糖化酶酶解反应液中接种酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC1001、CICC1012或CICC1202，其可将酶解反应液中的葡萄糖、氨基酸等转化为醇、CO₂等小分子物质，而对海藻糖则无作用。本发明利用这一方法将葡萄糖和海藻糖快速有效的分离。反应结果见图2，图2中：1.葡萄糖标品，2.麦芽糖标品，3.海藻糖标品，4.酿酒酵CICC1012发酵后样品。由图2可知，经酿酒酵母CICC1012发酵后，酶解反应液中只含有海藻糖一种糖类物质，而麦芽糖、葡萄糖等杂糖全部被去除。

由于海藻糖所具有的独特功能，使得海藻糖在稳定生物大分子和生物膜以及食品保鲜等方面有着广阔的应用前景。例如将海藻糖用于食品的保存，可以防腐并保持食物原有的色泽；将海藻糖用于酶抗体、生物膜等的干燥过程，可以将其在常温下运输和保存。实际上，海藻糖仍未被广泛大量使主要原因在于其市场价格较高。由此可见，本发明所提出新的海藻糖分离纯化方法，降低了生产成本，对海藻糖推广应用具有重大意义。

与以往的活性炭柱层析法和离子交换树脂法相比，本发明采用两步法去除酶解液中的杂糖，所得海藻糖纯品经HPLC检测，纯度达到98.0％，如图3所示。本发明还具有分离纯化效率高，海藻糖损失少，成本低廉，工艺简单等优点，必将对简化酶法生产海藻糖生产工艺、提高产量、降低生产成本产生积极的推动作用。

附图说明

图1.本发明糖化酶酶解后反应液检测结果图；

图2.本发明酿酒酵母CICC1012发酵结果图；

图3.本发明所得海藻糖经HPLC检测结果图。

具体实施方式

一种海藻糖的分离纯化方法，包括以下步骤：

a、提供酶转化法生产海藻糖所获得的酶反应液并将钝化：

酶反应液可以是以淀粉、淀粉水解物(玉米淀粉水解物)、麦芽低聚糖、麦芽糖等为原料经酶(麦芽寡糖基海藻糖合成酶MTSasc和麦芽寡糖基海藻糖水解酶MTHase及海藻糖合酶Trehalose synthase等)作用所得的酶反应液，经测定，酶反应液的海藻糖含量占总糖量60％左右，将酶反应液于100℃钝化10min，使反应液中的酶类和热不敏感性蛋白变性；

b、糖化酶水解反应：

根据酶反应液中糖含量和海藻糖生成酶的转化率推算酶转化法生产海藻糖所获得的酶反应液中杂糖的含量，向a步骤中的酶反应液中加入糖化酶，每克底物中加入0.14～0.28个糖化酶单位，在50～60℃、pH3.5-5.5条件下水解反应6～12h；

此外，不同来源的糖化酶，其最适宜水解温度和pH也不同。曲霉为55～60℃，pH3.5～5.0；根霉为50～55℃，pH4.5～5.5；拟内孢霉为50℃，pH4.8～5.0。一般在较高温度较低pH条件下水解，可以避免杂菌生长，减少有色物质的生成，易于脱色。因此一般优选温度55-60℃。

本实施例中采用无锡市科能技术有限公司生产的糖化酶，该糖化酶广泛用于酒精、味精、曲酒、啤酒、黄酒、有机酸抗生素等发酵工业，也可用于分解低聚糖。该糖化酶最适作用温度为58-60℃；最适Ph4.2-4.6，使用时需用35℃-45℃温水活化30min，搅拌均匀后使用。

c、酿酒酵母发酵

向糖化酶酶解反应液中接种3～10％重量的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC1001、CICC1012或CICC1202，在25～30℃、pH5.5～7.5条件下培养6～16h，然后在100℃钝化10min终止反应；

d、发酵液钝化离心

将c中所得发酵液5000g离心10min，去除菌体、蛋白等杂质；

e、超滤

采用节留分子量10000Da以上的超滤装置，将反应液中的大分子杂质去除；

f、离子交换

采用D201大孔强碱性阴离子交换树脂、D001CC大孔强酸性阳离子交换树脂组成的混合床，阴阳树脂用量体积比为2∶1，用2倍于样液体积的去离子水洗脱，对反应液进行脱盐、脱色处理；

g、浓缩

将反应液于60℃，0.09MPa条件下旋转蒸发，浓缩至海藻糖终浓度为40-50％；

h、结晶干燥

向海藻糖浓缩液中加入4倍体积的无水乙醇，并投入晶种，4℃静止12h，海藻糖即可结晶。将海藻糖结晶过滤，用少量乙醇冲洗，然后于40℃下真空干燥10h即为海藻糖纯品。

Claims

1、一种海藻糖的分离纯化方法，包括向酶转化法生产海藻糖所获得的酶反应液中加入糖化酶进行酶解反应和向糖化酶酶解反应液中接种3～10％重量的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)，在pH5.5～7.5条件下发酵培养。

2、根据权利要求1所述的一种海藻糖的分离纯化方法，包括以下步骤：

a、提供利用酶转化法生产海藻糖所获得的酶反应液，并将酶反应液钝化，使反应液中的酶类和热不敏感性蛋白变性；

3、根据权利求2所述的一种海藻糖的分离纯化方法，其特征在于所述的向糖化酶酶解反应液中接种酿酒酵母培养6～16h，然后在100℃钝化10min终止反应。

4、根据权利要求3所述的一种海藻糖的分离纯化方法，还包括下述步骤：将经过接种酿酒酵母并培养、钝化所得的发酵液离心、超滤、离子交换、浓缩、结晶干燥。

5、根据权利要求4所述的一种海藻糖的分离纯化方法，其特征在于所述的离子交换采用D201大孔强碱性阴离子交换树脂、D001-CC大孔强酸性阳离子交换树脂组成的混合床，阴阳树脂用量体积比为2∶1，用2倍于样液体积的去离子水洗脱，对反应液进行脱盐、脱色处理。

6、根据权利要求4所述的一种海藻糖的分离纯化方法，其特征在于所述的浓缩过程是将脱色脱盐后的反应液于60℃，0.09MPa条件下旋转蒸发，浓缩至海藻糖终浓度为40-50％。

7、根据权利要求1或2所述的一种海藻糖的分离纯化方法，其特征在于所述的酶反应液是以淀粉、淀粉水解物、麦芽低聚糖、麦芽糖等为原料经酶作用所得的酶反应液。

8、根据权利要求1至7中任何一项所述的一种海藻糖的分离纯化方法，其特征在于所述的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)CICC 1001、CICC 1012或CICC1202。