KR20130016679A - 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 신경세포 손상의 예방 또는 치료용 조성물 - Google Patents
꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 신경세포 손상의 예방 또는 치료용 조성물 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 또는 에탄올 추출물을 포함하는 신경세포 손상의 예방, 개선 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 또한, 본 발명의 조성물은 척수손상, 말초신경 손상, 퇴행성 뇌질환, 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 픽(Pick)병 또는 크로이츠펠트 야콥병 등의 예방, 개선 또는 치료를 위하여 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 신경세포 손상에 대한 예방 또는 치료 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 및 에탄올 추출물의 신경세포 손상에 대한 예방, 개선 또는 치료용도에 관한 것이다.
현대사회에 접어들면서 우리나라의 65세 이상 인구의 노년층이 전체 인구수의 11%에 이르고 있으며 2050년에는 38.2%로 증가할 것으로 예측되고 있다. 이와 관련하여 각종 퇴행성 신경질환과 심혈관계 질환 등에 관심이 커지고 있다.
퇴행성 신경질환은 정상적인 노화의 과정과는 달리 비정상적인 신경세포의 죽음에 의하여 뇌나 척수의 기능이 마비되어 인지능력, 보행능력 그리고 운동능력 등이 감소하게 되는 질환이다. 대표적인 퇴행성 신경질환으로는 뇌졸중 및 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 픽(Pick)병, 및 크로이츠펠트 야콥병 등이 있다.
퇴행성 신경질환은 허혈에 기인한 신경손상 및 활성산소에 의한 신경손상과 관련된 질환을 포함한다. 지금까지 보편적으로 받아들여지는 뇌허혈에 대한 신경세포사 기전으로는 2가지가 있다. 하나는 뇌 허혈에 의해서 세포 바깥에 과도한 글루타메이트(glutamate)가 축적되게 되면, 이러한 글루타메이트가 세포내로 유입되어 결국 과도한 세포내 칼슘의 축적으로 신경세포사가 유발된다는 신경세포사 기전(J. Neurocytology, 30, pp945-955, 2001)과 허혈-재관류시에 갑작스런 산소 공급으로 인해 생체 내 라디칼의 증가로 인해 DNA 및 세포질에 손상을 입어 유발된다는 산화성 신경 세포사이다(J. Biomed. Sci., 5, pp 401-414, 1998).
또한, 허혈에 의하지 않고, 혈중 활성산소의 증가에 의해서도 신경세포의 손상이 일어난다. 뇌는 활성산소에 의한 손상이 신체의 다른 어느 기관보다 크게 나타나는데 그 이유는 순환하는 O2의 20%가 뇌에 집중되어 있고, 세포막에는 불포화 지방산 측쇄(polyunsaturated fatty acid side chain)가 풍부하며, 반응성 산소 유리기(free radical) 반응의 촉매인 철이 풍부하나, 뇌에는 이러한 활성산소를 제거해 주는 항산화제가 상대적으로 적기 때문에 다른 장기들 보다 쉽게 활성산소로 인한 산화적 스트레스 상태에 놓이게 되기 때문이다.
현재, 이러한 퇴행성 신경질환을 치료하기 위해서 세포 이식, 외과적 수술 등 다양한 치료법이 제시되고 있지만 대부분이 위험요소와 부작용을 나타내고 있으며 손상 기전의 복잡성 등으로 실질적으로 신경세포의 손상을 보호하는 치료제는 개발되지 못하고 있는 실정이다.
국내의 경우, 다수의 천연 물질이 뇌졸증의 예방에 효과가 있는 건강식품으로서 시판되고 있으나, 이들 대부분은 과학적인 검증을 거치지 않은 것이 많으며, 오히려 건강식품 남용의 원인이 되기도 하여 사회적인 문제가 되고 있다. 따라서, 오랫동안 사용되어 그 안정성이 입증된 천연 생약을 객관적으로 검증하여 신경세포의 손상에 대한 보호 약물을 개발하는 것이 요구된다.
꾸지뽕나무(Cudrania tricuspidata) 는 뽕나무과에 속하는 낙엽교목으로 우리나라와 중국, 일본과 같은 동아시아에 주로 분포하며, 10여종이 알려져 있으나 우리나라에는 1종 만이 자생하고 있다. 가지에는 가시가 많으며 잎의 모양은 난형인 것과 3개로 갈라지는 형태가 있고 잎의 뒷면에는 털이 남아 있다. 꾸지뽕나무는 한방에서 유행성 이하선염, 폐결핵, 타박상, 급성관절염 등을 치료하는 민간요법으로 사용되어 오고 있다. 그 외에 과산화지질 생성억제 활성, 항균 활성, 항암 활성, 면역조절 활성, 항산화 활성, 항돌연변이 활성, 노화방지 등의 생리활성 연구가 진행되고 있다.
본 발명에서 해결하고자 하는 과제는 천연자원으로부터 신경세포의 손상의 예방 또는 치료 효과 즉, 신경세포의 보호 효과를 갖는 물질을 찾아 제공하는 것이다.
상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 신경세포 손상의 예방, 개선 또는 치료용도에 사용하기 위한 물질로서 꾸지뽕나무(Cudrania tricuspidata) 잎의 메탄올 추출물 또는 에탄올 추출물을 제공한다.
본 발명에 따른 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 또는 에탄올 추출물을 활성성분으로서 포함하는 조성물은 신경세포 보호 효과가 탁월하여 신경세포 손상의 예방, 개선, 치료를 위하여 사용될 수 있으며, 신경세포 손상으로 인한 각종 질환의 예방, 개선 또는 치료에 이용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 퇴행성 뇌질환, 뇌졸중 및 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 픽(Pick)병, 크로이츠펠트 야콥병, 척수손상 또는 말초신경손상의 예방, 개선 또는 치료를 위하여 사용될 수 있다.
본 발명의 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 또는 에탄올 추출물을 포함하는 조성물은 의약조성물로써 의약품을 제조하는데 사용될 수 있으며, 식품조성물로써 기능성 식품을 제조하는데 사용될 수 있다.
도 1은 N18-RE-105 신경세포주에서 글루타메이트(glutamate)에 의해 유도된 세포독성에 대한 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 (CTM) 및 에탄올 추출물(CTE)의 세포보호 효과를 MTT reduction assay로 관찰한 결과이다. MTT 환원율(세 번 실시한 실험결과의 means ± S.D.)은 대조군(CTM 처리군 및 CTE 처리군에 대한 대조군은 각각 글루타메이트 및 CTM을 처리하지 않은 군 및 글루타메이트 및 CTE을 처리하지 않은 군임)을 100%로 하였을 때에 대한 상대적인 값으로 나타내었다.
도 2는 PC12 신경세포주의 H2O2에 의해 유도된 세포독성에 대한 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 (CTM) 및 에탄올 추출물(CTE)의 세포보호 효과를 MTT reduction assay로 관찰한 결과이다. MTT 환원율(세 번 실시한 실험결과의 means ± S.D.)은 대조군(CTM 처리군 및 CTE 처리군에 대한 대조군은 각각 H2O2 및 CTM을 처리하지 않은 군 및 H2O2 및 CTE을 처리하지 않은 군임)을 100%로 하였을 때에 대한 상대적인 값으로 나타내었다.
도 3 은 N18-RE-105 신경세포주에서 글루타메이트(glutamate)에 의해 유도된 세포독성에 대한 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 (CTM) 및 에탄올 추출물(CTE)의 세포보호 효과를 LDH leakage assay로 관찰한 결과이다. 데이터는 비히클 투여군으로부터 방출된 LDH 의 활성을 100%로 하여 normalize되었으며, 별도의 플레이팅에 의하여 얻어진 대조군에 대한 %로 나타내었다.
도 4는 PC12 신경세포주에서 H2O2에 의해 유도된 세포독성에 대한 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 (CTM) 및 에탄올 추출물(CTE)의 세포보호 효과를 LDH leakage assay로 관찰한 결과이다. 데이터는 비히클 투여군으로부터 방출된LDH 의 활성을 100%로 하여 normalize되었으며, 별도의 플레이팅에 의하여 얻어진 대조군에 대한 %로 나타내었다.
도 5는 PC12 cells 에서 H2O2에 의해 유도된 활성산소종(ROS)의 생산에 대한 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 (CTM) 및 에탄올 추출물(CTE) 의 저해효과를 관찰한 결과이다. DCF fluorescence의 증가를 대조군에 의한 값에 대한 배수(fold)로 계산하였다.
도 2는 PC12 신경세포주의 H2O2에 의해 유도된 세포독성에 대한 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 (CTM) 및 에탄올 추출물(CTE)의 세포보호 효과를 MTT reduction assay로 관찰한 결과이다. MTT 환원율(세 번 실시한 실험결과의 means ± S.D.)은 대조군(CTM 처리군 및 CTE 처리군에 대한 대조군은 각각 H2O2 및 CTM을 처리하지 않은 군 및 H2O2 및 CTE을 처리하지 않은 군임)을 100%로 하였을 때에 대한 상대적인 값으로 나타내었다.
도 3 은 N18-RE-105 신경세포주에서 글루타메이트(glutamate)에 의해 유도된 세포독성에 대한 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 (CTM) 및 에탄올 추출물(CTE)의 세포보호 효과를 LDH leakage assay로 관찰한 결과이다. 데이터는 비히클 투여군으로부터 방출된 LDH 의 활성을 100%로 하여 normalize되었으며, 별도의 플레이팅에 의하여 얻어진 대조군에 대한 %로 나타내었다.
도 4는 PC12 신경세포주에서 H2O2에 의해 유도된 세포독성에 대한 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 (CTM) 및 에탄올 추출물(CTE)의 세포보호 효과를 LDH leakage assay로 관찰한 결과이다. 데이터는 비히클 투여군으로부터 방출된LDH 의 활성을 100%로 하여 normalize되었으며, 별도의 플레이팅에 의하여 얻어진 대조군에 대한 %로 나타내었다.
도 5는 PC12 cells 에서 H2O2에 의해 유도된 활성산소종(ROS)의 생산에 대한 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 (CTM) 및 에탄올 추출물(CTE) 의 저해효과를 관찰한 결과이다. DCF fluorescence의 증가를 대조군에 의한 값에 대한 배수(fold)로 계산하였다.
본 발명의 발명자들은 신경세포 손상의 예방, 개선 또는 치료에 사용될 수 있는 물질을 찾아내기 위하여 국내외에서 자생하고 있는 약용식물을 대상으로 광범위한 탐색을 한 결과, 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 및 에탄올 추출물이 신경세포주인 세포독성이 유도된 N18-RE-105 세포주와 PC12 세포주에 대해 강력한 세포보호 효과를 가진다는 것을 발견하였다.
즉, 본 발명의 발명자들은 MTT reduction assay를 통하여 정량적으로 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 및 에탄올 추출물의 신경세포 보호효과를 관찰하였는데, 글루타메이트를 N18-RE-105 신경 세포주에 처리하거나 H2O2를 PC12 세포주에 처리하면 세포생존율이 감소하지만, 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 또는 에탄올 추출물을 함께 처리하면 세포생존율이 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 및 에탄올 추출물의 농도에 의존적으로 회복된다는 것을 확인하였다 (실시예 2 및 실시예3, 도 1 및 도 2).
또한 동일한 조건 하에서 세포의 손상 정도를 확인하기 위하여 배양액 중에 들어 있는 LDH (lactate dehydrogenase)의 방출 양을 측정한 결과, 글루타메이트를 N18-RE-105 신경 세포주에 처리하거나 H2O2를 PC12 세포주에 처리하면 LDH 방출량이 증가하지만, 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 또는 에탄올 추출물을 함께 처리하면 LDH 방출량이 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 및 에탄올 추출물의 농도에 의존적으로 감소하여 정상으로 회복된다는 것을 확인하였다 (실시예 4 및 실시예 5, 도 3 및 도 4).
이러한 결과들은 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 및 에탄올 추출물이 강력한 신경세포 보호 효과가 있다는 것을 말해 준다.
또한, 본 발명의 발명자들은 DCF-DA assay 를 통해, 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 또는 에탄올 추출물의 신경세포보호 효과는 활성산소종(ROS Reactive Oxygen Species) 소거능이 일부 기여한다는 것을 밝혔다 (실시예 6 및 도 5).
이와 같은 결과를 기초로 본 발명은 일 측면에서, 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 또는 에탄올 추출물을 활성성분으로서 포함하는 신경세포 손상의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다. 또한, 본 발명은 일 측면에서, 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 또는 에탄올 추출물을 포함하는 신경세포 손상의 예방 또는 치료용 의약품을 제공한다. 상기 신경세포 손상은 퇴행성 뇌질환, 척수손상, 또는 말초신경 손상에 의해 유발될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 퇴행성 뇌질환은 신경세포사에 의해 유발되는 뇌졸중 및 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 픽(Pick)병, 및 크로이츠펠트 야콥병 등을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다.
꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 또는 에탄올 추출물을 포함하는 신경세포 손상의 예방 또는 치료용 의약품은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 약제학적 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 의약품은 경구투여제제, 주사제, 좌제, 경피투여제제, 및 경비투여제제를 포함하며, 이에 한정되지 않는 임의의 제형으로 제제화되어 투여될 수도 있다. 예를 들어 환제, 액제, 현탁제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 환제, 또는 엑기스제와 같은 경구 투여용 제형으로 제제화될 수 있다.
상기 각각의 제형으로 제제화 시, 각각의 제형의 제조에 필요한 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 부가하여 제조할 수 있다. 대표적으로 경구 투여용 제형으로 제제화 시 상기 담체로서 희석제, 활택제, 결합제, 붕해제, 감미제, 안정제, 및 방부제 중에서 1 종 이상을 선택하여 사용할 수 있으며, 첨가제로는 향료, 비타민류, 및 항산화제 중에서 1 종 이상을 선택하여 사용할 수 있다.
상기 담체 및 첨가제는 약제학적으로 허용 가능한 것은 모두 가능하며, 구체적으로 희석제로는 유당, 옥수수 전분, 대두유, 미정질 셀룰로오스, 또는 만니톨, 활택제로는 스테아린산 마그네슘 또는 탈크, 결합제로는 폴리비닐피롤리돈 또는 히드록시프로필셀룰로오스가 바람직하다. 또한, 붕해제로는 카르복시메틸셀룰로오스 칼슘, 전분글리콜산나트륨, 폴라크릴린칼륨, 또는 크로스포비돈, 감미제로는 백당, 과당, 솔비톨, 또는 아스파탐, 안정제로는 카르복시메틸셀룰로오스나트륨, 베타-사이클로덱스트린, 백납, 또는 잔탄검, 방부제로는 파라옥시안식향산메틸, 파라옥시안식향산프로필, 또는 솔빈산칼륨이 바람직하다.
또한, 상기 성분 이외에도 공지의 첨가제로서 미각을 돋구기 위하여, 매실향, 레몬향, 파인애플향, 허브향 등의 천연향료, 천연과즙, 클로로필린, 플라보노이드 등의 천연색소, 과당, 벌꿀, 당알코올, 설탕과 같은 감미성분, 또는 구연산, 구연산 나트륨과 같은 산미제를 혼합하여 사용할 수도 있다.
상기 의약품은 퇴행성 뇌질환, 척수 손상, 및 말초신경 손상 등에 의해 유발되는 신경세포 손상의 예방 또는 치료 효과를 얻기 위하여, 유효성분으로서 성인을 기준으로 1 일 총 투여량은 0.1 mg/kg체중 ~ 1 g/kg체중을 한번에 또는 임의로 수회 나누어서 투여할 수 있다. 상기 투여량은 신경세포 손상을 유발한 질병의 종류, 질병의 진행 정도, 투여 경로, 성별, 나이, 체중 등에 따라 적절히 증감될 수 있다.
또한, 본 발명은, 일 측면에서, 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 또는 에탄올 추출물을 포함하는 신경세포 손상의 예방 또는 개선용 식품 조성물을 제공한다. 상기 식품조성물을 사용하여 신경세포 손상의 예방 또는 개선용 건강보조식품을 제조할 수 있다.
이러한 건강보조식품은 당해 기술분야에 공지되어 있는 통상적인 건강보조식품의 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 건강보조식품은 예를 들어 환제, 산제, 과립제, 정제, 캅셀제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 엑기스제, 차, 젤리, 또는 음료 등으로 제조될 수 있다. 상기 식품학적 조성물 또는 건강보조식품에는 허용 가능한 담체 또는 첨가제로는 제조하고자 하는 제형의 제조에 당해 기술분야에서 사용 가능한 것으로 공지되어 있는 임의의 담체 또는 첨가제가 이용될 수 있다.
추가로 본 발명은, 일 측면에서, 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 또는 에탄올 추출물을 투여하는 것을 포함하는 신경세포 손상을 예방, 개선 또는 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명에서 사용되는 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 또는 에탄올 추출물은 그대로 사용될 수도 있으며, 농축한 엑기스 형태로 사용될 수도 있다. 농축액은 예를 들어 30~50℃ 에서 감압농축하여 제조할 수 있으며, 이로 제한되는 것은 아니다. 또는 상기 추출액이나 농축액을 동결 건조하여 동결건조물의 형태로서 이용될 수도 있다.
이하, 본 발명을 하기 실시예에 의해 더욱 구체적으로 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 어떤 의미로든 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되는 것은 아니다.
[실험 재료]
본 실험에서 사용된 꾸지뽕나무(Cudrania tricuspidata Bureau) 잎은 경남 산청군에서 자생하는 것을 추출하여 실험에 사용하였다. 꾸지뽕나무 잎 추출물의 신경세포 보호 효과를 확인하기 위한 실험에 사용된 시약으로 LDH (lactate dehydrogenase) release assay kit는 WaKo Pure Chemical Industries, Ltd. (Osaka, Japan)로부터 구입하였으며, 세포주 배양을 위해 필요한 fetal bovine serum (FBS), Dulbecco’ modified Eagle’ medium (DMEM), penicillin-streptomycin, horse serum (HS) 등은 Gibco-BRL (Grand Island, NT, USA)에서 구입하였고 3-[4,5-dimethylthiazol-2-yl]-2,5-dipheyl tetrazolium bromide (MTT), ascorbic acid, H2O2 (hydrogen peroxide solution), 2’7’-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA), dimethyl sulfoxide (DMSO)는 Sigma chemical CO. (St. Louis, MO, USA)제품을 구입하였다. 그 외의 연구에 사용된 여러 가지 용매 및 시약은 모두 일급 이상의 등급을 사용하였다.
[세포주 및 그의 배양]
실험에 사용된 세포주는 rat pheochromocytoma PC12와 hybridoma N18-RE-105로서 각각 한국세포주은행(KCLB)과 한국생명공학원구원에서 분양 받아 사용하였다. 세포배양을 위해 DMEM medium에 10% FBS, 5% HS을 첨가하였고, PC12 세포주에는 100 unit/ml의 penicillin, 100 mg/ml의 streptomycin을 첨가하고, N18-RE-105 세포주에는 1 × HAT supplement를 첨가하여 사용하였다. 95%의 습도가 유지되는 37℃, 5% CO2 incubator (MCO-18AIC, Sanyo, Osaka, Japan)에서 배양하였다.
[
실시예
1]
꾸지뽕나무
잎의 추출물의 제조
꾸지뽕나무의 잎 5 g에 메탄올을 200 ml 또는 에탄올을 200 ml 가하여 3일간 상온에서 추출한 후, 여과지(5C. 110 mm, Tokyo Roshi Daish, Ltd., Todyo, Japan)로 여과하였다. 여과된 추출액을 40℃에서 회전감압농축기(EYELA N-1000, Tokyo, Japan)를 이용하여 감압 농축하여 각 용매 추출물을 얻어, 메탄올 추출물을 CTM, 에탄올 추출물을 CTE로 명명하였다. 상기 각 추출물을 10 ㎍/ml로 DMSO (dimethyl sulfoxide)에 녹여 적당한 농도로 희석하였다. 세포주에 처리시 DMSO의 최종농도가 1%가 되도록 처리하였다.
[
실시예
2]
MTT
환원 분석을 통한 세포
생존률
관찰
CTM 및 CTE의 신경세포 보호 효과를 측정하기 위하여 MTT reduction assay를 실시하였다. N18-RE-105 세포주는 5 × 104 cells/ml로 맞추고 PC12 세포주는 1 ×105 cells/ml로 맞추어 96 well plate에 각각 100 ㎕씩 첨가하여 24시간 동안 37℃, 5% CO2 incubator에서 배양한 후, CTM과 CTE를 10, 50, 100 ㎍/ml의 농도로 제조하여 세포주에 처리하였다.
1)
N18
-
RE
-105 세포주에서
CTM
,
CTE
의 세포보호 효과
상기의 CTM과 CTE를 세포주에 처리한 다음, 30분 동안 배양시킨 후 N18-RE-105 세포주에 20 mM glutamate을 처리하여 2시간 동안 CO2 incubator에서 배양한 뒤 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT (5 mg/ml) 용액을 10 ㎕씩 첨가하여 1시간 동안 다시 CO2 incubator에서 배양하였다. 1시간 반응 후, formazan 형성을 확인하고 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 완전히 suction한 다음, 100 ㎕의 DMSO를 첨가하여 formazan을 녹인 후 ELISA reader (Model 680, BioRad, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 꾸지뽕잎 추출물을 처리하지 않고 배양시킨 대조군(정상군: 글루타메이트 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 모두 처리하지 않은 군) 세포의 세포생존율을 100%로 하였을 때의 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.
Glutamate는 중추신경계에서 주요한 흥분성 신경전달물질로서 신경계에 필수적인 요소로 작용하지만, 뇌 속의 과다한 축적은 뇌세포의 사멸과 변성을 초래하여 알츠하이머와 같은 퇴행성 뇌질환을 야기하는 것으로 알려져 있다.
정상군의 세포생존율을 100%로 하였을 때 glutamate를 단독으로 처리하면 생존률이 35.1%로 약 64.9%가 더 사멸하였는데 CTM을 10, 50, 100 ㎍/ml 처리한 군은 각각 54.5, 76.2, 70.7%가 생존하였고 CTE를 10, 50, 100 ㎍/ml 처리한 군은 각각 64.6, 70.2, 61.6%가 생존하였다
2)
PC12
세포주에서
CTM
,
CTE
의 세포보호 효과
CTM과 CTE가 다른 세포주에서도 세포보호 효과가 있는지를 알아보기 위해서 PC12 세포주를 30분 동안 배양시킨 후 0.5 mM H2O2를 처리하여 2시간 동안 CO2 incubator에서 배양한 뒤 각 well에 PBS 완충액에 녹인 MTT (5 mg/ml) 용액을 10 ㎕씩 첨가하여 1시간 동안 다시 CO2 incubator에서 배양하였다. 1시간 반응 후, formazan 형성을 확인하고 formazan이 흩어지지 않게 상등액을 완전히 suction한 다음, 100 ㎕의 DMSO를 첨가하여 formazan을 녹인 후 ELISA reader (Model 680, BioRad, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 꾸지뽕잎 추출물을 처리하지 않고 배양시킨 대조군(정상군: H2O2 및 꾸지뽕나무 잎 추출물을 모두 처리하지 않은 군) 세포의 세포생존율을 100%로 하였을 때의 상대적인 세포성장 억제율을 구하였다.
정상군에서 세포 생존율을 100%로 하였을 때, H2O2 단독 처리군은 20.7%로 정상군에 비해 약 80%가 더 사멸하였으나 CTM을 10, 50, 100 ㎍/ml 처리한 군은 각각 29.6, 69.1, 74.4%가 생존하였고 CTE를 처리한 군에서는 각각 43.4, 71.7, 73.7%가 생존하여 농도 의존적으로 신경세포 보호 효과가 있었다 (도 2).
[
실시예
3]
LDH
release
assay
에 의한 세포독성 관찰
CTM과 CTE의 신경세포 보호 효과를 측정하기 위하여 LDH (lactate dehydrogenase) release assay를 실시하였다. N18-RE-105 세포주는 5 ×104 cells/ml로 맞추고 PC12 세포주는 1 ×105 cells/ml로 맞춘 후, 100 ㎕씩 96well plate에 분주하여 CO2 incubator에서 24시간 동안 배양한 뒤, CTM과 CTE를 10, 50, 100 ㎍/ml의 농도로 세포주에 처리하고, 30분간 CO2 incubator에서 배양시켰다.
1)
N18
-
RE
-105 세포주에서
CTM
,
CTE
의 세포보호 효과
상기 CO2 incubator에서 배양시킨 후, N18-RE-105 세포주에 20 mM glutamate을 처리하여 2시간 배양하였다. 배양액의 상등액을 새로운 96-well plate에 50 ㎕ 분주하고, 이 배양액에 LDH reagent를 50 ㎕씩 첨가하여 상온에서 정치시킨 후, 10분간 반응시켰다. 반응이 완료되면 stop solution인 1 N HCl을 100 ㎕씩 첨가하여 반응을 중지시키고, ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생존하는 세포의 LDH 측정을 위해 배양액을 suction 후, 0.5% triton X-100 용액을 50 ㎕ 첨가하여 40 rpm으로 10분간 shaking 시켜 세포벽을 깨트리고 LDH reagent 50 ㎕를 첨가하여 반응시켰다. 반응이 끝나면 반응정지용액(stop solution)인 1 N HCl을 100 ㎕씩 첨가하여 반응을 중지시키고, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
LDH 측정에 의한 세포독성의 백분율은 배양액과 살아있는 세포에서 총 LDH에 대한 배양액으로부터 유리된 LDH의 값으로 계산하여 글루타메이트 실험군과 비교한 값으로 나타내었다.
20 mM glutamate를 처리한 경우, 67.3%로 정상군에 비해 약 35.4%가 더 사멸함을 알 수 있었고 CTM을 10, 50, 100 ㎍/ml의 농도로 세포주에 처리하였을 때 각각 49.2, 31.3, 32.1%가 사멸하였고 CTE을 10, 50, 100 ㎍/ml의 농도로 세포주에 처리하였을 때 각각 43.0, 31.5, 35.7%로 LDH 방출량이 감소하여 정상군의 수준으로 회복되었다는 것을 확인할 수 있었다 (도 3).
2)
PC12
세포주에서
CTM
,
CTE
의 세포보호 효과
CTM과 CTE가 다른 세포주에서도 세포보호 효과가 있는지를 알아보기 위해서, 상기 CO2 incubator에서 배양시킨 후, 0.5 mM H2O2를 처리하여 2시간 배양하였다. 배양액의 상등액을 새로운 96-well plate에 50 ㎕ 분주하고, 이 배양액에 LDH reagent를 50 ㎕씩 첨가하여 상온에서 정치시킨 후, 10분간 반응시켰다. 반응이 완료되면 stop solution인 1 N HCl을 100 ㎕씩 첨가하여 반응을 중지시키고, ELISA reader를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생존하는 세포의 LDH 측정을 위해 배양액을 suction 후, 0.5% triton X-100 용액을 50 ㎕ 첨가하여 40 rpm으로 10분간 shaking 시켜 세포벽을 깨트리고 LDH reagent 50 ㎕를 첨가하여 반응시켰다. 반응이 끝나면 반응정지용액(stop solution)인 1 N HCl을 100 ㎕씩 첨가하여 반응을 중지시키고, 540 nm에서 흡광도를 측정하였다.
LDH 측정에 의한 세포독성의 백분율은 배양액과 살아있는 세포에서 총 LDH에 대한 배양액으로부터 유리된 LDH의 값으로 계산하여 H2O2 실험군과 비교한 값으로 나타내었다.
PC12 세포주에서 0.5 mM H2O2를 30분간 단독 처리하였을 때 84.4%로 정상군에 비해 약 61%가 더 사멸되었고, CTM을 농도별로(10, 50, 100 ㎍/ml) 처리하였을 때 각각 83.8, 52.3, 33.1%가 사멸하였고 CTE을 처리하였을 때는 각각 78.6, 32.6, 27.6%로 LDH 방출량이 감소하여 정상군의 수준으로 회복된다는 것을 확인할 수 있었다 (도 4).
[
실시예
4]
DCF
-
DA
assay
를 통한
ROS
소거 활성 측정
CTM과 CTE의 ROS 소거 활성을 측정하기 위하여 PC12 세포주에서 DCF-DA assay를 실시하였다. DCF-DA assay는 세포내 발생하는 ROS의 양을 ROS와 반응하여 형광을 나타내는 2’,7’-dichlorofluorescin diacetate (DCF-DA) 시약을 이용하여 측정하는 방법으로 DCF-DA는 세포 내로 자유롭게 들어갈 수 있는 형태이지만 세포내에 존재하는 esterase에 의해 DCF로 탈아세틸화되어 세포외로 나갈 수 없는 형태가 된다. 이때 생성된 DCF가 ROS와 만나게 되면 형광을 나타내게 된다.
PC12 세포주를 96 well plate에 1 ×105 cells/ml로 분주하여 37℃, 5% CO2 incubator에서 24시간 배양하였다. CTM과 CTE를 농도 별(10, 50, 100 ㎍/ml)로 처리하고 30분간 배양한 뒤 1 mM H2O2를 처리하여 30분간 배양하였다. ROS의 양을 측정하기 위하여 에탄올로 희석된 10 μM DCF-DA 시약을 처리한 뒤 30분간 배양하고 상등액 100 ㎕를 취해서 형광 plate로 옮긴 뒤 fluorescence microplate reader (GENios)를 사용하여 형광강도(excitation 485 nm, emission 535 nm)를 측정하였다. DCF 형광강도에 대한 증가율은 정상군과 비교하여 fold로 계산하였다.
정상군과 H2O2 처리군 그리고 H2O2와 CTM, H2O2와 CTE을 농도별로 처리한 실험군을 비교하였다. 그 결과, 도 5와 같이 정상군에 비해 H2O2를 30분간 처리하였을 때 ROS 발생량이 27.2배 증가하였지만, CTM과 CTE를 각각 10, 50, 100 ㎍/ml의 농도로 처리하였을 시 CTM을 처리한 군에서는 16.5, 9.9, 6.0배로 ROS 발생량이 억제되었고 CTE를 처리한 군에서도 역시 17.3, 10.8, 6.4배로 ROS 발생량이 농도의존적으로 억제되었다. 이러한 사실은 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 및 에탄올 추출물은 H2O2로부터 유도되는 ROS의 생성을 억제하여 세포를 보호한다는 것을 의미한다.
[
제제예
]
꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물(CTM) 또는 에탄올 추출물(CTE)을 유효성분으로 함유하는 다양한 형태의 제제를 하기와 같이 제조하였다.
제제예
1: 정제의 제조
CTE 50 ㎎
유당 50 ㎎
전분 10 ㎎
스테아린산 마그네슘 적량
상기의 성분들을 혼합하고 통상적인 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조하였다.
제제예
2:
산제의
제조
CTM 50 ㎎
유당 30 ㎎
전분 20 ㎎
스테아린산 마그네슘 적량
상기의 성분들을 긴밀히 혼합한 후 폴리에틸렌이 코팅된 포에 충진하고 밀봉하여 산제를 제조하였다.
제제예
3: 캅셀제의 제조
CTM 50 ㎎
유당 30 ㎎
전분 28 ㎎
탈크 2 ㎎
스테아린산 마그네슘 적량
상기의 성분들을 혼합하고 통상적인 캅셀제의 제조방법에 따라서 젤라틴 경캅셀에 충진하여 캅셀제를 제조하였다.
제제예
4:
현탁제의
제조
CTE 50 ㎎
이성화당 10 g
설탕 30 ㎎
나트륨 카복시메틸셀룰로즈 100 ㎎
레몬향 적량
정제수 적량 가하여 전체 100 ㎖
상기의 성분들을 혼합하여 통상적인 현탁제의 제조방법에 따라 현탁제를 제조한 후 100 ㎖ 용량의 갈색병에 충진하고 멸균하여 현탁제를 제조하였다.
제제예
5. 건강 음료의 제조
CTM 100 ㎎
비타민 C 15 g
비타민 E(분말) 100 g
젖산철 19.75 g
산화아연 3.5 g
니코틴산아미드 3.5 g
비타민 A 0.2 g
비타민 B1 0.25 g
비타민 B2 0.3g
물 적량
통상의 건강음료 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합한 다음, 약 1시간동안 85℃에서 교반 가열한 후, 만들어진 용액을 여과하여 멸균된 2ℓ 용기에 취득하여 밀봉 멸균한 뒤 냉장 보관한 다음 본 발명의 건강음료 조성물 제조에 사용한다.
상기 조성비는 비교적 기호음료에 적합한 성분을 바람직한 실시예로 혼합 조성하였지만 수요계층이나, 수요국가, 사용용도 등 지역적, 민족적 기호도에 따라서 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하다.
본 발명에서 사용되는 모든 기술용어는, 달리 정의되지 않는 이상, 본 발명의 관련 분야에서 통상의 당업자가 일반적으로 이해하는 바와 같은 의미로 사용된다. 또한 본 명세서에는 바람직한 방법이나 시료가 기재되나, 이와 유사하거나 동등한 것들도 본 발명의 범주에 포함된다. 본 명세서에 참고문헌으로 기재되는 모든 간행물의 내용은 본 발명에 도입된다.
Claims (7)
- 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 및 에탄올 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는, 신경세포 손상의 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 및 에탄올 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는, 퇴행성 뇌질환, 척수손상, 또는 말초신경 손상, 뇌졸중 및 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 픽(Pick)병, 크로이츠펠트 및 야콥병으로 구성된 그룹에서 선택되는 질병의 예방 또는 치료용 약학조성물.
- 제 1 항 또는 제2 항에 따른 조성물, 및 약제학적으로 허용 가능한 담체 또는 첨가제를 포함하는 의약품.
- 제 3 항에 있어서, 환제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 에어로졸, 엑기스제, 주사제, 경피 투여제, 또는 좌제의 형태인 것을 특징으로 하는 의약품.
- 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 및 에탄올 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는, 신경세포 손상의 예방 또는 개선용 식품조성물.
- 꾸지뽕나무 잎의 메탄올 추출물 및 에탄올 추출물로 구성된 군으로부터 선택되는 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는, 척수손상, 말초신경 손상, 퇴행성 뇌질환, 뇌졸중, 치매, 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 픽(Pick)병, 및 크로이츠펠트 야콥병으로 구성된 군으로부터 선택되는 질병의 예방 또는 개선을 위한 식품 조성물.
- 제 5 항 또는 제6항의 조성물을 포함하는, 환제, 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽제, 액제, 에어로졸, 엑기스제, 차, 젤리, 또는 음료의 형태인 것을 특징으로 하는 건강보조식품.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110078754A KR20130016679A (ko) | 2011-08-08 | 2011-08-08 | 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 신경세포 손상의 예방 또는 치료용 조성물 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020110078754A KR20130016679A (ko) | 2011-08-08 | 2011-08-08 | 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 신경세포 손상의 예방 또는 치료용 조성물 |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20130016679A true KR20130016679A (ko) | 2013-02-18 |
Family
ID=47895984
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020110078754A KR20130016679A (ko) | 2011-08-08 | 2011-08-08 | 꾸지뽕나무 잎 추출물을 포함하는 신경세포 손상의 예방 또는 치료용 조성물 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR20130016679A (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107982308A (zh) * | 2016-03-04 | 2018-05-04 | 西南大学 | 黄芪提取液的医药用途 |
| KR20200127424A (ko) * | 2019-05-02 | 2020-11-11 | 가천대학교 산학협력단 | 꾸지뽕나무 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 최종당화산물관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
-
2011
- 2011-08-08 KR KR1020110078754A patent/KR20130016679A/ko not_active Application Discontinuation
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| KR20200127424A (ko) * | 2019-05-02 | 2020-11-11 | 가천대학교 산학협력단 | 꾸지뽕나무 추출물 또는 이로부터 분리한 화합물을 유효성분으로 포함하는 최종당화산물관련 질환의 예방 또는 치료용 조성물 |
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