KR101061541B1 - 역분화 유도 인자를 포함하는 헤르페스 심플렉스 앰플리콘바이러스를 이용한 역분화 전분화성 줄기 세포의 제조방법 - Google Patents

역분화 유도 인자를 포함하는 헤르페스 심플렉스 앰플리콘바이러스를 이용한 역분화 전분화성 줄기 세포의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 (a) 역분화 유도인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스(Herpes simplex amplicon viruses) 존재 하에서 인간에서 유래된 체세포 또는 불사화된(immortalized) 세포 주를 배양하는 단계; 및 (b) 단계(a)로부터 얻어진 배양물로부터 배아줄기세포-유사 콜로니(embryonic stem cell-like colonies)를 분리하는 단계를 포함하는, 역분화 만능 줄기세포(iPS cells)의 제조방법을 제공한다.
헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스, 역분화 만능 줄기세포

Description

역분화 유도 인자를 포함하는 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스를 이용한 역분화 전분화성 줄기 세포의 제조방법{Method for preparing induced pluripotent stem cells using herpes simplex amplicon viruses containing reprogramming-inducing genes}
본 발명은 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스 (herpes simplex simplex amplicon viruse)를 역분화 유도 인자를 코딩하는 유전자의 수송체(gene delivery vehicle)로 사용하여, 역분화 만능 줄기세포(iPS cells)를 제조하는 방법에 관한 것이다.
역분화 만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cell, iPS 세포)는 분화된 세포(예를 들어, 체세포)로부터 역분화되어 얻어진 만능분화능(pluripotency)을 갖는 세포를 지칭하며, 각종 장기 세포로 분화 가능하다. iPS 세포는 역분화 유도인자들에 의해 분화된 세포를 재프로그램화(reprogramming)하여 얻어질 수 있으므로, 체세포 핵치환(somatic cell transfer) 없이 환자 면역 적합성 만능 세포주의 생성이 가능하다. 따라서 iPS 세포는 환자의 세포에서 유래될 수 있어 임상에 적용 시 면역 거부반응을 피할 수 있다. 또한, iPS 세포는 난자나 배아를 사용하지 않기 때 문에 생명윤리적 논란이나 종교적 비난이 없는 장점이 있다.
2006년 8월에 Takahashi, K., 및 Yamanaka, S. 등이 생쥐 세포를 이용한 역분화에 의한 iPS 세포의 형성을 최초로 발표(Takahashi, K., and Yamanaka, S. (2006). Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors. Cell 126, 663-676)한 이래, Takahashi, K. 등 및 Yu, J. 등은 인간세포를 대상으로 역분화에 의한 iPS 세포의 형성을 보고한 바 있다(Takahashi, K., Tanabe, K., Ohnuki, M., Narita, M., Ichisaka, T., Tomoda, K., and Yamanaka, S. (2007). Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors. Cell 131, 861-872; 및 Yu, J., Vodyanik, M.A., Smuga-Otto, K., Antosiewicz-Bourget, J., Frane, J.L., Tian, S., Nie, J., Jonsdottir, G.A., Ruotti, V., Stewart, R., et al . (2007). Induced Pluripotent Stem Cell Lines Derived from Human Somatic Cells. Science New York, NY). Takahashi, K. 등은 iPS 세포를 얻기 위해서는 Sox2, Oct3/4, 및 Klf4의 역분화 유도인자가 필수적으로 필요하고 또한, 추가적으로 c-Myc이 iPS 세포의 형성을 촉진하는 역할을 하는 것을 밝혀냈다. 또한, Yu, J. 등은 Sox2, Oct3/4, 및 Nanog의 역분화 유도인자가 iPS 세포를 얻기 위해 필수적으로 필요하며, Lin28이 존재하는 경우 iPS 세포의 형성이 증가하는 것을 밝혀냈다.
한편, 재프로그램화 (reprogramming)에 의한 iPS 세포 형성을 위해서는, 역분화 유도인자를 체세포 내에 전달하는 단계를 필수적으로 거치게 되며, 구체적으로는 Sox2, Oct3/4, Klf4, 및 c-Myc의 역분화 유도인자를 코딩하는 유전자들을 각 각 레트로바이러스들을 수송체로 사용하여 체세포에 전달하거나(Takahashi, K. et al (2007) Cell 131, 861-872), 또는 Sox2, Oct3/4, Nanog, Lin28의 역분화 유도인자를 코딩하는 유전자를 각각 렌티바이러스들을 수송체로 사용하여 체세포에 전달하여야한다 (Yu, J., et al . (2007), Science, New York, NY).
그러나, 상기 레트로바이러스나 렌티바이러스는 세포의 핵 내의 염색체에 무작위로 끼어 들어가는 성질을 가지고 있기 때문에, 끼어들어가는 위치에 따라 얻어지는 iPS 세포를 임상에 적용할 경우 암 발생을 포함하여 안전성에 심각한 영향을 미칠 수 있다. 2000년도 초반 대에 프랑스에서 레트로바이러스를 이용하여 유전자치료법으로 Bubble boy 병 (X-SCID 병)을 치료받던 11명의 아이들 중에 3명의 아이가 백혈병에 걸렸던 사례가 보고된 바 있다.
본 발명자들은 안전성 확보될 수 있는 우수한 iPS 세포의 제조방법을 개발하고자 다양한 연구를 수행하였다. 그 결과, 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스 앰플리콘 플라스미드(Herpes simplex virus amplicon plasmid)를 사용하여 얻어진 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스를 통하여 역분화 유도인자들을 전달할 경우, 염색체에 끼어 들어가지 않고 염색체 바깥에서 에피솜(extrachromosomal episome) 형태로 존재하여 역분화 유도 유전자를 발현시키기 때문에 레트로바이러스 혹은 렌티바이러스 등을 사용함으로써 야기될 수 있는 안전성 문제를 피할 수 있다는 것을 발견하였다. 또한 재조합 앰플리콘 플라스미드는 크기가 10 kb 정도이기 때문에 헤르페스 바이러스 안에 150 kb의 DNA까지 집어넣을 수 있어, 각 유전자들이 10 카피이상 한 개의 헤르페스 심플렉스 바이러스 내로 들어가 세포 내로 동시에 많은 양이 전달될 수 있다는 것을 발견하였다.
따라서, 본 발명은 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스 (Herpes simplex amplicon virus)를 이용한 iPS 세포의 제조방법을 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명의 일 태양에 따라, (a) 역분화 유도인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스(Herpes simplex amplicon viruses) 존재하에서 인간에서 유래된 체세포 또는 불사화된(immortalized) 세포 주를 배양하는 단계; 및 (b) 단계(a)로부터 얻어진 배양물로부터 배아줄기세포-유사 콜로 니(embryonic stem cell-like colonies)를 분리하는 단계를 포함하는, 역분화 만능 줄기세포(iPS cells)의 제조방법이 제공된다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 단계(a)의 상기 배양은 Sox2를 코딩하는 유전자를 포함하는 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스; Oct3/4를 코딩하는 유전자를 포함하는 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스; 및 Nanog을 코딩하는 유전자를 포함(선택적으로 Lin28을 코딩하는 유전자를 추가로 포함)하는 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스 존재 하에서 수행될 수 있다. 또한, 단계(a)의 상기 배양은 Sox2를 코딩하는 유전자를 포함하는 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스; Oct3/4를 코딩하는 유전자를 포함하는 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스; 및 Klf4를 코딩하는 유전자를 포함(선택적으로 c-Myc를 코딩하는 유전자를 추가로 포함)하는 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스 존재 하에서 수행될 수 있다. 상기 헤르페스 심플렉스 바이러스는 각각의 상응하는 역분화 유도인자를 코딩하는 유전자를 헤르페스 심플렉스 바이러스 앰플리콘 플라스미드(Herpes simplex virus amplicon plasmid), 바람직하게는 서열번호 17의 염기서열을 갖는 헤르페스 심플렉스 바이러스 앰플리콘 플라스미드에 재조합시켜 얻어진 발현 플라스미드를 수용 세포(permissive cell line)에 패키징(packaging)시켜 얻어질 수 있다. 또한, 상기 패키징은 상기 발현 플라스미드, BAC DNA(fHSV△pac△27 0+), 및 헬퍼-플라스미드(pEBHICP27)를 상기 수용 세포에 공동-형질도입(co-transfection)시킴으로써 수행될 수 있다.
또한, 단계(a)의 상기 배양은 Sox2를 코딩하는 유전자; Oct3/4를 코딩하는 유전자; 및 Nanog을 코딩하는 유전자를 동시에 포함(선택적으로 Lin28을 코딩하는 유전자를 추가로 포함)하는 1 종의 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스 존재하에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 배양은 Sox2를 코딩하는 유전자; Oct3/4를 코딩하는 유전자; 및 Klf4를 코딩하는 유전자를 동시에 포함(선택적으로, c-Myc를 코딩하는 유전자를 추가로 포함)하는 1 종의 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스 존재하에서 수행될 수 있다.
단계 (a)가 1 종의 헤르페스 심플렉스 바이러스를 사용하여 수행되는 경우, 상기 헤르페스 심플렉스 바이러스는 (i) Sox2를 코딩하는 유전자, Oct3/4를 코딩하는 유전자, Nanog를 코딩하는 유전자, 및 선택적으로 Lin28을 코딩하는 유전자; 또는 Sox2를 코딩하는 유전자, Oct3/4를 코딩하는 유전자, Klf4를 코딩하는 유전자, 및 선택적으로 c-Myc를 코딩하는 유전자를 포함하는 유전자 구조체로서, 상기 유전자들이 서열번호 1의 펩타이드를 코딩하는 유전자를 매개로 연결된 유도 유전자 구조체를 헤르페스 심플렉스 바이러스 앰플리콘 플라스미드(Herpes simplex virus amplicon plasmid)에 재조합시켜 발현 플라스미드를 제작하는 단계, 및 (ii) 단계(i)에서 얻어진 발현 플라스미드를 수용 세포(permissive cell line)에 패키징(packaging)시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어질 수 있다. 상기 서열번호 1의 펩타이드를 코딩하는 유전자는 서열번호 2의 염기서열을 가질 수 있으며, 상기 유전자 구조체가 서열번호 15 또는 16의 염기 서열로 구성될 수 있다. 상기 헤르페스 심플렉스 바이러스 앰플리콘 플라스미드는 서열번호 17의 염기서열을 가질 수 있다. 또한, 상기 패키징은 상기 발현 플라스미드, BAC DNA(fHSV△pac△27 0+), 및 헬퍼-플라스미드(pEBHICP27)를 상기 수용 세포에 공동-형질도입(co-transfection)시킴으로써 수행될 수 있다.
본 발명에 따라, 헤르페스 심플렉스 바이러스 앰플리콘 플라스미드를 사용하여 얻어진 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스를 통하여 역분화 유도인자를 전달할 경우, 염색체에 끼어 들어가지 않고 핵 내에 에피솜(episome) 형태로 존재함으로써 레트로바이러스 혹은 렌티바이러스 등의 바이러스를 수송체로 사용함으로써 생길 수 있는 안전성 문제를 피할 수 있다. 또한, 역분화 유도인자들을 각각 코딩하는 유전자들을 서열번호 1의 펩타이드를 코딩하는 DNA 단편을 매개로 연결시켜 얻어진 다중 역분화 유도 유전자 구조체를 상기 바이러스 앰플리콘 플라스미드에 재조합시켜 얻어진 발현 플라스미드로 헤르페스 심플렉스 바이러스 입자를 형성시켜, 상기 입자를 분화된 체세포에 도입할 경우 하나의 폴리시스트론(polycistronic) mRNA로부터 여러 개의 역분화 유도 인자들을 동시에 발현시킬 수 있다. 상기와 같이 제작된 다중 역분화 유전자 발현 플라스미드를 헤르페스 심플렉스 바이러스를 만드는데 필요한 유전자가 들어있는 BAC DNA(fHSV△pac△27 0+) 와 pEBHICP27 플라스미드와 함께 베로 세포(vero cells) 등의 수용 세포에 동시-형질 도입 (co-transfection)시킨 후, 상기 세포를 배양하여 상기 유전자 구조체를 포함하는 바이러스 입자를 분리하여 분화된 체세포에 도입할 경우, 높은 효율로 역분화된 세포(즉, iPS 세포)를 얻을 수 있다.
본 명세서에서, "역분화 만능 줄기세포 (induced pluripotent stem cells, iPS 세포)"라 함은 "reprogrammed pluripotent stem cells"로도 지칭되며, 분화된 세포 를 재프로그램하여(즉, 역분화시켜) 만능분화능(pluripotency)을 갖도록 유도된 세포를 말한다. 상기 역분화 만능 줄기세포는 뇌, 심장 등의 장기 세포로 다양하게 분화될 수 있다.
본 발명은 (a) 역분화 유도인자를 코딩하는 유전자를 포함하는 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스(Herpes simplex amplicon viruses) 존재하에서 인간에서 유래된 체세포 또는 불사화된(immortalized) 세포 주를 배양하는 단계; 및 (b) 단계(a)로부터 얻어진 배양물로부터 배아줄기세포-유사 콜로니(embryonic stem cell-like colonies)를 분리하는 단계를 포함하는, 역분화 만능 줄기세포(iPS cells)의 제조방법을 제공한다.
헤르페스 심플렉스 바이러스 (Herpes simplex virus)는, 레트로바이러스나 렌티바이러스와 달리, 숙주세포(host cell)의 염색체에 끼어 들어가지 않고 염색체 밖에서 에피솜(episome) 상태로 존재하므로, 레트로바이러스 혹은 렌티바이러스를 사용함으로써 야기될 수 있는 안전성 문제를 피할 수 있다. 특히, 헤르페스 심플렉스 바이러스 형성에 사용되는 헤르페스 심플렉스 바이러스 앰플리콘 플라스미드(Herpes simplex virus amplicon plasmid)는 "gutted" DNA 플라스미드로서 DNA 복제 (replication) origin (oriS) 과 packaging signal (pac) 만을 가지고 있기 때문에 상대적으로 크기가 큰 외부유전자(transgene)도 삽입할 수 있다.
본 발명에 의해, 헤르페스 심플렉스 바이러스 앰플리콘 플라스미드(Herpes simplex virus amplicon plasmid)에 역분화 유도 인자를 코딩하는 유전자가 재조합된 발현 플라스미드로부터 얻어진 헤르페스 심플렉스 바이러스를 분화된 체세포에 도입할 경우, 안전성 문제를 피하면서 역분화 만능 줄기세포를 제조할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
상기 역분화 유도인자는 재프로그램화를 유도할 수 있는 기능을 갖는 모든 인자들을 포함하며, 바람직하게는 재프로그램화에 관여하는 것으로 알려져 있는 역분화 유도인자의 조합을 포함한다. 예를 들어, 상기 역분화 유도인자는 재프로그램화를 유도하는 것으로 알려져 있는 Sox2, Oct3/4, Nanog, Klf4, Lin28, 및 Myc로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다. 상기 Sox2, Oct3/4, Nanog, Klf4, Lin28, 및 c-Myc의 아미노산 서열 및 염기 서열은 GenBank 등에 공지되어 있으며, 각각 서열번호 3 내지 14 와 같다 (표 1 참조).
역분화 유도인자 종류 서열번호
Sox2 아미노산 서열 3
염기서열 4
Oct3/4 아미노산 서열 5
염기서열 6
Nanog 아미노산 서열 7
염기서열 8
Klf4 아미노산 서열 9
염기서열 10
Lin28 아미노산 서열 11
염기서열 12
c-Myc 아미노산 서열 13
염기서열 14
바람직하게는, 상기 역분화 유도인자는 Oct3/4를 코딩하는 유전자, Nanog를 코딩하는 유전자, 및 Sox2를 코딩하는 유전자의 조합(및, 선택적으로 Lin28을 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 조합)이거나, Oct3/4를 코딩하는 유전자, Klf4를 코딩하는 유전자, 및 Sox2를 코딩하는 유전자의 조합(및, 선택적으로 c-Myc을 코딩하는 유전자를 추가로 포함하는 조합)일 수 있다. 당업자는 상기한 Sox2, Oct3/4, Nanog, Klf4, Lin28, c-Myc 뿐만 아니라, 역분화 유도에 관여하는 것으로 알려지거나 알려질 다양한 인자들이 본 발명에 따른 제조방법에 제한 없이 적용될 수 있음을 인식할 것이다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 단계(a)의 상기 배양은 Sox2를 코딩하는 유전자를 포함하는 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스; Oct3/4를 코딩하는 유전자를 포함하는 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스; 및 Nanog을 코딩하는 유전자를 포함(선택적으로 Lin28을 코딩하는 유전자를 추가로 포함)하는 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스 존재하에서 수행될 수 있다. 또한, 단계(a)의 상기 배양은 Sox2를 코딩하는 유전자를 포함하는 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스; Oct3/4를 코딩하는 유전자를 포함하는 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스; 및 Klf4를 코딩하는 유전자를 포함(선택적으로 c-Myc를 코딩하는 유전자를 추가로 포함)하는 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스 존재하에서 수행될 수 있다.
상기 헤르페스 심플렉스 바이러스는 각각의 상응하는 역분화 유도인자를 코딩하는 유전자를 헤르페스 심플렉스 바이러스 앰플리콘 플라스미드(Herpes simplex virus amplicon plasmid), 바람직하게는 서열번호 17의 염기서열을 갖는 헤르페스 심플렉스 바이러스 앰플리콘 플라스미드에 재조합시켜 얻어진 발현 플라스미드를 수용 세포(permissive cell line)에 패키징(packaging)시켜 얻어질 수 있다. 또한, 상기 패키징은 상기 발현 플라스미드, BAC DNA(fHSV△pac△27 0+), 및 헬퍼-플라스미드(pEBHICP27)를 상기 수용 세포에 공동-형질도입(co-transfection)시킴으로써 수행될 수 있다.
본 발명에 따라, 역분화 유도 인자들을 서열번호 1의 펩타이드를 코딩하는 DNA 단편을 매개로 연결시킬 경우, 하나의 폴리시스트론(polycistronic) mRNA로부터 여러 개의 역분화 유도 인자들을 동시에 얻을 수 있다. 즉, 역분화 유도 인자들을 코딩하는 유전자들 사이에 서열번호 1의 펩타이드를 코딩하는 DNA 단편을 동일한 프레임으로 삽입하게 되면, 라이보좀이 상기 2A 단편의 총 27 아미노산 중에서 아미노산 26번째와 27번째 사이를 건너뛰게 되어 펩타이드 사슬을 끊어 줌으로써 결국 26개의 서열번호 1의 펩타이드에서 유래한 여분의 아미노산이 C-말단에 붙은 역분화 유도 인자(단백질 1)와 N-말단에 1개의 서열번호 1의 펩타이드에서 유래한 아미노산이 붙은 채로 역분화 유도 인자(단백질 2)가 분리된다. 상기 메커니즘을 모식도로 나타내면 도 1과 같다. 상기 서열번호 1의 펩타이드는 Hasegawa, K., Cowan, A.B., Nakatsuji, N., and Suemori, H. (2007). Efficient multicistronic expression of a transgene in human embryonic stem cells. Stem cells (Dayton, Ohio) 25, 1707-1712 에서 개시된 바 있으며, Hasegawa, K. 등은 인간 배아 줄기 세포에서 FMDV (foot-and-mouth disease virus)에서 유래한 2A 단편에 의해 매개된 도입 유전자들의 다중시스트론 발현(multicistronic expression)을 보고하고 있다. 그러나, Hasegawa, K. 등은 인간 배아 줄기세포를 대상으로 도입유전자의 효율적인 발현을 개시하고 있을 뿐이다.
본 발명에 의해, 2종 이상의 역분화 유도 인자들을 코딩하는 각각의 유전자들을 서열번호 1의 펩타이드를 코딩하는 DNA 단편, 예를 들어 서열번호 2의 염기서열을 갖는 DNA 단편을 매개로 연결시켜 다중 유전자 (multi-gene) 구조체로 제작할 경우, 다중 역분화 유전자 발현 (multi-gene expression) 플라스미드가 제작될 수 있으며, 상기 유전자 재조합 앰플리콘 플라스미드가 도입된 헤르페스 심플렉스 바이러스 입자를 분화된 체세포에 도입할 경우, 높은 효율로 iPS 세포를 얻을 수 있다는 것이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명의 제조방법에 있어서, 단계(a)의 상기 배양은 Sox2를 코딩하는 유전자; Oct3/4를 코딩하는 유전자; 및 Nanog을 코딩하는 유전자를 동시에 포함(선택적으로 Lin28을 코딩하는 유전자를 추가로 포함)하는 1 종의 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스 존재하에서 수행될 수 있다. 또한, 상기 배양은 Sox2를 코딩하는 유전자; Oct3/4를 코딩하는 유전자; 및 Klf4를 코딩하는 유전자를 동시에 포함(선택적으로, c-Myc를 코딩하는 유전자를 추가로 포함)하는 1 종의 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스 존재하에서 수행될 수 있다.
상기한 바와 같이, 단계 (a)가 1 종의 헤르페스 심플렉스 바이러스를 사용하여 수행되는 경우, 상기 헤르페스 심플렉스 바이러스는 (i) Sox2를 코딩하는 유전자, Oct3/4를 코딩하는 유전자, Nanog를 코딩하는 유전자, 및 선택적으로 Lin28을 코딩하는 유전자; 또는 Sox2를 코딩하는 유전자, Oct3/4를 코딩하는 유전자, Klf4를 코딩하는 유전자, 및 선택적으로 c-Myc를 코딩하는 유전자를 포함하는 유전자 구조체로서, 상기 유전자들이 서열번호 1의 펩타이드를 코딩하는 염기서열을 매개로 연결된 유도 유전자 구조체를 헤르페스 심플렉스 바이러스 앰플리콘 플라스미드(Herpes simplex virus amplicon plasmid)에 재조합시켜 발현 플라스미드를 제작하는 단계, 및 (ii) 단계(i)에서 얻어진 발현 플라스미드를 수용 세포(permissive cell line)에 패키징(packaging)시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어질 수 있다.
단계(i)에서 상기 서열번호 1의 펩타이드를 코딩하는 염기서열은 서열번호 2의 염기서열일 수 있다. 또한, 상기 유전자 구조체는 서열번호 15 또는 16의 염기 서열로 구성될 수 있다. 그러나, 당업자는 상기한 Sox2, Oct3/4, Nanog, Klf4, Lin28, c-Myc 뿐만 아니라, 역분화 유도에 관여하는 것으로 알려지거나 알려질 다양한 인자들이 본 발명에 따른 유전자 구조체에 제한 없이 적용될 수 있음을 인식할 것이다. 또한, 당업자는 본 발명에 따른 유전자 구조체에 있어서, 상기 역분화 유전자들의 연결 순서가 임의로 선택될 수 있음을 인식할 것이다. 상기 유전자 구조체는 아래에서 언급한 바와 같이, 상기 역분화 유전자 구조체로 형질전환된 바이러스 벡터 플라스미드를 사용하여 적절한 패키징 방법으로 얻어진 바이러스[즉, 바이러스 입자]로부터 통상의 방법으로 분리할 수 있다. 상기 역분화 유전자 구조체로 형질전환된 바이러스 벡터 플라스미드 즉, 상기 유전자 구조체를 포함하는 다중 역분화 유도 유전자 (multiple reprogramming-inducing gene) 발현 플라스미드는 결국 숙주세포 내로 전달이 가능한 수송체 역할을 하는 바이러스 (즉, 바이러스 입자) 내에 패키지(package)되어 숙주세포 내로 전달된다.
상기 유전자 구조체는 그 크기가 약 4-5 kb 정도로 작기 때문에 다양한 바이러스 벡터 플라스미드들(viral vector plasmids), 예를 들어, 레트로바이러스 플라스미드(retroviral plasmid), 렌티바이러스 플라스미드(lentiviral plasmid), 아데노바이러스 플라스미드(adenovirus plasmid), 헤르페스 심플렉스 바이러스 앰플리콘 바이러스 플라스미드(herpes simplex amplicon viral plasmid) 등에 재조합시켜 얻어질 수 있다. 이 중, 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스를 사용할 경우, 얻어지는 바이러스가 염색체에 끼어 들어가지 않고 에피솜(episome) 형태로 존재함으로써 레트로바이러스 혹은 렌티바이러스 등의 바이러스 벡터를 사용함으로써 야기될 수 있는 안전성 문제를 피할 수 있고 또한 세포 독성이 낮으므로, 바람직하게 사용될 수 있다. 즉, 상기 다중 역분화 유도 유전자 발현 플라스미드는 상기 유전자 구조체를 바이러스 벡터 플라스미드(viral vector plasmid)에 재조합시켜 얻어질 수 있으며, 상기 바이러스 벡터 플라스미드는 헤르페스 심플렉스 바이러스 앰플리콘 플라스미드(Herpes simplex virus amplicon plasmid), 더욱 바람직하게는 서열번호 17의 염기서열을 갖는 헤르페스 심플렉스 바이러스 앰플리콘 플라스미드일 수 있다.
상기 다중 역분화 유도 유전자 발현 플라스미드는 예를 들어, Oct3/4, Nanog, 및 Sox2 유전자 등의 역분화 유도 인자를 코딩하는 유전자들을 PCR 등으로 증폭시키고, pHGCX(Saeki, Y., Fraefel, C., Ichikawa, T., Breakefield, X.O., and Chiocca, E.A. (2001). Improved helper virus-free packaging system for HSV amplicon vectors using an ICP27-deleted, oversized HSV-1 DNA in a bacterial artificial chromosome. Mol Ther 3, 591-601)와 PCR-T/A 플라스미드인 yT&A (RBC T&A Cloning Kit, Cat. No. RC001)등의 벡터에 NheI, NotI, BamHI, BglII, XbaI 및 EcoRI 등의 적절한 제한효소를 사용하여 상기 증폭시킨 유전자 및 2A 단편(예를 들어, 서열번호 2의 단편)을 클로닝하여 얻어질 수 있다 (도 2 참조). 바람직하게는 상기 유전자 구조체가 재조합된 재조합 플라스미드를 헤르페스 심플렉스 바이러스 앰플리콘 플라스미드(예를 들어, 서열번호 17의 염기서열을 갖는 앰플리콘 플라스미드)에 재조합시켜, 프로모터(예를 들어, elongation factor 1 프로모터, 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 등) 및 폴리 A 서열(예를 들어, SV40 바이러스 폴리 A 서열, 소성장호르몬(bovine growth factor, BGH) 폴리 A 서열) 사이에 상기한 유전자 구조체가 삽입된 다중 역분화 유도 유전자 발현 플라스미드를 제작할 수 있다 (도 3 참조).
상기와 같이 얻어진 발현 플라스미드를 수용 세포(permissive cell line)에 패키징(packaging)시키는 단계[즉, 단계(i)]는 베로 2-2 세포 (vero 2-2 cell: African green monkey kidney cell; from Dr. Rozanne Sandri-Goldin,. University of California, Irvine, CA, USA) 등의 통상의 수용 세포주를 사용하여 수행할 수 있다. 상기 패키징(packaging)은 상기한 수용 세포주를 사용하여, 무-헬퍼 바이러스 시스템[예를 들어, 헬퍼-BAC DNA 및 pEBHICP27 플라스미드(ICP27 유전자를 따로 분리하여 제작된 플라스미드)를 이용한 시스템]을 이용한 방법 혹은 자기복제 능력이 없는 헬퍼-바이러스(예를 들어, 헬퍼-아데노바이러스 혹은 헬퍼-헤르페스 심플렉스 바이러스)를 이용한 방법을 통하여 수행할 수 있다. 예를 들어 헬퍼-헤르페스 심플렉스 바이러스를 사용할 경우 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스의 분리과정에서 상기 헬퍼-바이러스가 조금씩 섞여 들어가 세포 독성을 유발할 가능성이 있다. 따라서, 상기 패키징은 헬퍼-바이러스의 오염 가능성을 없앤 무-헬퍼 바이러스 시스템(Saeki, Y., Fraefel, C., Ichikawa, T., Breakefield, X.O., and Chiocca, E.A. (2001). Improved helper virus-free packaging system for HSV amplicon vectors using an ICP27-deleted, oversized HSV-1 DNA in a bacterial artificial chromosome. Mol Ther 3, 591-601)을 사용하여 수행하는 것이 바람직하다. 상기 무-헬퍼 바이러스 시스템에서는 pac (packaging) 시그날을 제외한 전 헤르페스 심플렉스 바이러스 게놈이 BAC (bacterial artificial chromosome; fHSV△pac△27 0+) 에 넣어져 있고 안전성을 더 높이기 위해 ICP27 유전자를 BAC DNA 에서 제거하여 또 다른 플라스미드(pEBHICP27)로서 제공해 준다. 따라서 이 두 가지의 플라스미드들과 상기한 다중 역분화 유도 유전자 발현 앰플리콘 플라스미드를 vero 2-2 세포 등의 수용세포(permissive cell line)에 동시-형질전환(co-transfection)시킬 경우, BAC DNA 와 pEBHICP27 플라스미드로부터 생산되는 헤르페스 심플렉스 바이러스 생성에 필요한 유전자 산물로 인하여 헤르페스 심플렉스 바이러스의 구조가 만들어지고 그 내부로 다중 역분화 유도 유전자 발현 앰플리콘 플라스미드가 rolling circle mechanism 을 통해 헤르페스 심플렉스 바이러스의 캡시드(capsid) 내부를 채움으로써, 바이러스[즉, 바이러스 입자(viral particles)]를 얻을 수 있다 (도 4 참조).
본 발명의 제조방법의 단계(a)에 있어서, 상기 배지는 통상의 세포 배양용 배지, 예를 들어, 태아소혈청 (Fetal bovine serum), 페니실린/스트렙토마이신 등의 항생제, 비-필수 아미노산(non-essential amino acid) 등이 보충된 DMEM 배지를 사용하여, 통상의 세포 배양 조건하에서 배양할 수 있다. 배지 중의 상기 바이러스 입자의 농도는 약 1 M.O.I. (multiplicity of infection) 정도일 수 있으나, 이에 제한되는 것이 아니다.
상기 인간으로부터 유래된 체세포는 예를 들어 인간의 피부, 모발, 성체줄기세포 등을 제한없이 포함한다. 또한, 불사화된 세포 주는, 예를 들어 293 세포 주(human embryonic kidney cell line) 등의 인간에서 유래된 불사화된 세포 주를 사용할 수 있다. 또한, 줄기세포에서 특이적으로 발현하는 것으로 알려진 Oct3/4 프로모터; 및 항생제 내성 유전자(하이그로마이신 내성 유전자) 및/또는 eGFP 형광 유전자 등이 도입된 불사화된 세포 주(즉, 불사화된 리포터 세포주)를 사용할 경우, 하이그로마이신(Hygromycin) 내성 유전자와 eGFP 유전자가 배아줄기세포에만 특이적으로 작동하는 Oct4 프로모터에 의해 발현되므로, 이어지는 줄기세포 주 분리 과정을 손쉽게 수행할 수도 있다. Oct3/4 프로모터, 항생제 내성 유전자(하이그로마이신 내성 유전자), eGFP 형광 유전자 등이 도입된 불사화된 리포터 세포주 다음과 같이 제작할 수 있다:
인간 Oct3/4 locus 전체를 포함하는 BAC (bacterial artificial chromosome) DNA를 얻고(Children's Hospital Oakland Research Institute, Cat# RP11-100L8), 독립적으로 pHygrEGFP (Clontech cat# PT3203-5) 등의 공지의 플라스미드에 "하이그로마이신 내성 유전자와 eGFP 형광 유전자를 코돈 프레임이 맞도록 이어붙인 융합 유전자" 와 "인간 elogation factor 1 alpha (EF1a) 프로모터-블라스토시딘 (blastocidin) 내성 단백질 코딩 유전자(pEF/Bsd plasmid (Invitrogen, K511-01)" 발현 유닛을 통상의 유전공학적 방법으로 클로닝한다. 상기 "하이그로마이신 내성 유전자:eGFP 형광 유전자 융합 유전자와 인간 elogation factor 1 alpha (EF1a) 프로모터-블라스토시딘 (blastocidin) 내성 단백질 코딩 유전자 발현 유닛"을 BAC DNA 상의 Oct3/4 프로모터 뒤에 삽입하기 위해선 다음과 같은 방법을 사용할 있다. 먼저 "하이그로마이신 내성 유전자:eGFP 융합 유전자와 인간 EF1a 프로모터-블라스토시딘 (blastocidin) 내성 유전자" 발현 유닛을 집어넣을 곳인 BAC DNA 상의 Oct3/4 프로모터 뒤의 삽입을 원하는 위치의 위, 아래쪽의 (upstream & downstream) BAC DNA sequences의 150-50 bp정도를 따로 제조한 "하이그로마이신 내성 유전자:eGFP 형광 융합 유전자-인간 EF1a 프로모터 -블라스토시딘 내성 (blastocidin) 유전자 발현 유닛"의 위쪽 (5' 단말) 부분과 아래쪽 (3' 단말) 부분에 각각 150 bp 와 50 bp의 Oct3/4 내의 삽입하고자 하는 프로모터 바로 아랫부분의 염기서열을 센스 및 안티센스 올리고뉴클레오티드를 만들어 어닐링하여 이중 가닥을 만든 후 리가아제(ligase)를 이용하여 붙인다. 이 재조합된 플라스미드를 박테리아 내에서 BAC DNA (Oct3/4 locus 포함)와 동시에 집어넣어 homologous recombination에 의해 발현 유닛을 BAC DNA의 원하는 부위인 Oct3/4 프로모터 뒤에 정확하게 삽입되게 한다. 그리고 sequence 분석을 통해 삽입코자하는 발현 유닛들이 원하는 BAC DNA의 부위에 들어갔는지를 확인한다. 즉 BAC DNA의 Oct3/4 프로모터 뒤에 "하이그로마이신 내성 유전자:eGFP 형광 융합 유전자" 와 "인간 EF1a 프로모터-블라스토시딘 내성 유전자 발현 유닛" 이 정확한 위치에 들어간 재조합 BAC DNA를 얻게 되면 293 세포 등의 불사화된 세포주에 이 BAC DNA를 형질도입 (transfection) 시킨 후 블라스토시딘을 이용하여 BAC DNA가 안정하게 염색체에 끼어들어간 stable cell line 만을 선발한다.
상기와 같이 제작된 리포터 세포주는 하이그로마이신(Hygromycin) 내성 유전자와 eGFP 유전자가 배아줄기세포에만 특이적으로 작동하는 Oct4 프로모터에 의해 발현되는 특성을 가지고 있다. 따라서, 상기 리포터 세포주가 iPS 세포로 역분화되는 경우, 하이그로마이신 내성 유전자와 eGFP 형광이 발현되므로 항생제에 의한 선발이나 검색을 용이하게 수행할 수 있다.
상기와 같이 역분화 시켜 얻어진 iPS 세포는 배지를 줄기 세포 배양용 배지, 예를 들어, 0.05mM 베타-머캅토에탄올, 1% 비필수아미노산, 20% 넉-아웃 혈청 대체물(knock out serum replacement), 100U/ml 페니실린, 100ug/ml 스프렙토마이신, 및 4ng/ml bFGF로 보충된 DMEM-12 배지로 교체하여 배양한 후, 배양물로부터 배아줄기세포-유사 콜로니(embryonic stem cell-like colonies)를 분리함으로써 얻을 수 있다. 상기 콜로니는 배양물 중에서 핵이 상대적으로 크면서 세포질은 적은 작고 둥근 세포들이 뭉쳐있는 형태의 형태학적으로 구분되는 모양을 가지고 있으므로 알콜램프로 끝을 구부린 파스퇴르 파이펫을 이용한 물리적인 방법으로 이들을 분리할 수 있다. 또한, 상기한 바와 같이 불사화된 리포터 세포주가 사용된 경우에는 항생제 내성 및 형광에 의해 iPS 세포를 분리할 수 있다.
본 발명의 제조방법에 있어서, 상기와 같이 제작된 다중 역분화 유도 유전자 구조체 (gene construct containing multiple reprogramming-inducing genes)를 바이러스를 수송체 (vector)로 이용하여 분화된 체세포에 도입할 경우, 높은 효율로 iPS 세포를 얻을 수 있으며, 상기한 본 발명의 역분화 만능 줄기세포의 제조방법의 일 예를 모식도로 나타내면 도 5와 같다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 다중 역분화 유도 인자 발현 플라스미드의 제작
서열번호 4, 6, 및 8의 염기서열을 갖는 Sox2, Oct3/4, 및 Nanog 유전자를 PCR을 사용하여 증폭하였으며, 사용한 프라이머들은 다음 표 2와 같다.
역분화 유도인자 종류 서열번호 서열
NheI-Oct3/4 정방향 18 GGGGGCTAGCCGCCATGGCGGGACACCTGGCTTC
NotI-Oct3/4 역방향 19 GGGGGCGGCCGCTCAGTTTGAATGCATGGGAG
XhoI-Sox2 정방향 20 GGGGCTCGAGCCGCCATGTACAACATGATGGAGAC
XbaI-Sox2 역방향 21 GGGGTCTAGATCACATGTGTGAGAGGGGCAGTGTG
BglII-Nanog 정방향 22 GGGGAGATCTGCCGCCATGAGTGTGGATCCAGCTTG
EcoRI-Nanog 역방향 23 GGGGGAATTCACACGTCTTCAGGTTGCATG
pHGCX 벡터를 제한효소 NheI 및 EcoRI으로 자른 후 CIP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase)를 처리하고, 제한효소 NheI 및 NotI으로 잘라 증폭시킨 Oct3/4 유전자(insert 1), 2A 단편 증폭용 정방향 프라이머(5'-GGGGGCGGCCGCAAAATTGTCGCTCCTGTCAAACAAACTCTTAACTTTGATTTACTCAAACTGGCTGGGGATGTAGAAAGCAATCCAGGTCCAGGATCCGGGG-3', 서열번호 24) 및 역방향 프라이머(5'-CCCCGATCCTGGACCTGGATTGCTTTCTACATCCCCAGCCAGTTTGAGTAAATCAAAGTTAAGAGTTTGGACAGGAGCGACAATTTTGCGGCCGCCCCC-3', 서열번호 25)를 95 ℃에서 2-3분 denature 시키고, 서서히 상온으로 떨어지게 하여 어닐링(annealing)시키고, 제한효소로 이중절단 (NotI/BamH1) 하여 양쪽에 제한효소 부위 NotI 과 BamHI을 갖도록 제작한 2A segment (insert 2), 및 BglII 및 EcoRI으로 자른 증폭시킨 Nanog 유전자(insert 3)를 접합(ligation)시켜 재조합 플라스미드(재조합 플라스미드-1)를 제작하였다. yT&A(RBC T&A Cloning Kit, Cat. No. RC001)) 벡터를 제한효소 EcoRI 및 XbaI으로 자른 후 CIP (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase)를 처리하고, 2A 단편 증폭용 정방향 프라이머(5'-GGGGGAATTCAAAATTGTCGCTCCTGTCAAACAAACTCTTAACTTTGATTTACTCAAACTGGCTGGGGATGTAGAAAGCAATCCAGGTCCACTCGAGGGGG-3', 서열번호 26) 및 역방향 프라이머(5'-CCCCCTCGAGTGGACCTGGATTGCTTTCTACATCCCCAGCCAGTTTGAGTAAATCAAAGTTAAGAGTTTGGACAGGAGCGACAATTTTGAATTCCCCC-3', 서열번호 27)를 95 ℃에서 2-3분 denature 시키고, 서서히 상온으로 떨어지게 하여 어닐링(annealing)시키고, 제한효소로 이중절단 (ECoRI/XhoI) 하여 양쪽에 제한효소 부위 EcoRI 과 XhoI을 갖도록 제작한 2A segment (insert 1) 및 XhoI 과 XbaI으로 잘라 증폭시킨 Sox2 유전자(insert 2')를 접합(ligation)시켜 재조합 플라스미드(재조합 플라스미드-2)를 제작하였다. 상기에서 얻어진 재조합 플라스미드-2에 제한효소 EcoRI 과 XbaI을 처리하여 2A-Sox 재조합 유전자 조각을 재조합 플라스미드-2의 EcoRI/XbaI 부위에 접합(ligation)시켰다. 상기한 바와 같이 Oct3/4, Nanog, 및 Sox2 유전자가 2A 단편을 매개로 연결된 유전자 구조체(즉, Oct3/4-2A-Nanog-2A-Sox2, 서열번호 15)를 포함하는 재조합 플라스미드의 제작과정은 도 2에 나타낸 바와 같다. 상기 서열번호 15의 유전자 구조체를 포함하는 재조합 플라스미드를 서열번호 17의 염기서열을 갖는 헤르페스 심플렉스 바이러스 앰플리콘 플라스미드(pHGCX)에 재조합시켜, 서열번호 15의 유전자 구조체가 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터 및 소 성장호르몬 (BGH) 유전자에서 유래한 폴리 A 서열 사이에 삽입된 다중 역분화 유도 유전자 발현 플라스미드를 제작하였다 (도 3 참조).
실시예 2. 다중 역분화 유도 인자 발현 헤르페스 심플렉스 바이러스의 제조
실시예 1에서 얻어진 다중 역분화 유도 유전자 발현 플라스미드와 헤르페스 심플렉스 바이러스의 구조를 만드는데 필요한 헬퍼-플라스미드 (pEBHICP27) 및 BAC DNA (fHSVΔpacΔ27 0+)를 vero 세포에 동시-형질도입하여 다중 역분화 유도 유전자 구조체를 포함하는 헤르페스 심플렉스 바이러스를 얻었다 (도 4 참조).
상기 동시-형질도입은 6 cm 배양용기에서 95%이상 자란 vero 2-2 세포(Dr. Rozanne Sandri-Goldin,. University of California, Irvine, CA, USA)에 실시예 1 에서 얻어진 다중 역분화 유도 유전자 발현 플라스미드 즉, 재조합된 앰플리콘 플라스미드(1.2 ug)와 헬퍼-플라스미드(pEBHICP27, 0.4 ug) 및 BAC DNA (4 ug)을 혼합하여 FuGENEHD Transfection Reagent (8:2) (Roche, 독일)를 이용하여 수행하였다. 최종적으로 바이러스 입자는 60시간 후에 상기 세포를 배양액과 함께 모은 뒤, 세포를 얼림과 녹임을 3회 반복하면서 깨뜨려 세포 내의 바이러스를 방출시킨 후 1,350 x g로 원심분리하여 터진 세포 찌꺼기를 제거하고, 얻어진 배양액을 20,000 rpm으로 3 시간 동안 초원심분리하여 농축한 후 사용하였다.
상기 과정을 통하여, 헤르페스 앰플리콘 플라스미드가 캡시드 속으로 여러 개가 이어져서 150 kb 가 될 때까지 들어가게 되고, 앰플리콘 플라스미드로 채워진 캡시드가 숙주 세포의 세포막을 감싸고 나옴으로써 감염력이 있는 헤르페스 심플렉스 엠플리콘 바이러스를 제조하였다.
실시예 3. 웨스턴 블럿팅
실시예 2에서 얻어진 다중 역분화 유전자 구조체를 가진 헤르페스 심플렉스 바이러스가 인간세포에 감염 되었을 때 2A 시스템이 제대로 작용하여 각각의 역분화 단백질들이 세포 내에서 형성이 되는지 확인하기 위해서 웨스턴 블럿팅을 수행하였다. 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스를 G16-9 (인간 글리오블라스토마, glioblastoma; Gli36 derived cell line that express HSV-1 VP 16 constitutuvely; widely available from many labs)에 감염시킨 후 24시간 후 세포 추출액을 만들고(lane 3, 도 6), 양성 대조군으로서 Oct3/4 만 발현하는 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스를 감염시킨 G16-9 세포의 세포 추출액을 만들고(lane 2, 도 6), 음성 대조군으로서 Oct3/4를 발현하지 않는 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스를 감염시킨 G16-9 세포의 세포 추출액을 만들어(lane 1, 도 6), 상기 세포 추출액들을 이용하여 웨스턴 블럿팅을 실시한 결과는 도 6과 같다.
도 6의 왼쪽 위 그림은 Oct3/4를 발현하는 바이러스 (HSVamp-Oct3/4 promoter-Oct3/4)를 감염시킨 후 얻은 형광사진이며, 왼쪽 아래 그림은 Oct3/4가 2A로 연결된 유전자 구조체 안에 포함 되어 있는 바이러스 (HSVamp-hOct4promoter-Oct3/4-2A-Nanog-2A-Sox2)를 감염시킨 후 얻은 형광사진으로서 EGFP는 앰플리콘 플라스미드 내의 헤르페스 심플렉스 바이러스 immediate early (IE) 프로모터 뒤에 붙여져 있어 모든 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스들은 EGFP 형광을 나타낸다. 이 왼쪽의 형광 사진들은 vero 세포에서 만들어진 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스들을 G16-9 세포에 처리를 한 것으로서 바이러스들이 잘 만들어졌음을 보여주고 있다.
도 6의 오른쪽 그림은 위에서 설명한 세 가지 바이러스 감염결과 얻은 G16-9 세포 추출물들을 SDS-PAGE 전기영동을 한 후에 Oct3/4에 특이적인 항체로 웨스턴 블럿팅을 한 결과이다. 도 6의 결과로부터, 본 발명에 따라 얻어진 다중 역분화 유도 유전자로 이루어진 유전자 구조체를 포함하고 있는 재조합 헤르페스 심플렉스 바이러스로 형질전환 된 G16-9 세포는 Oct3/4를 발현하고 있음을 알 수 있으며 (lane 3, 도 6), 도 6의 세 번째 레인(lane)에서 Oct3/4 단백질이 조금 크기가 크게 나타난 것은 서열번호 1의 2A 펩타이드로부터 유래한 26 아미노산이 Oct3/4의 C-말단에 아직 붙어 있기 때문이다. 이러한 결과로부터 보건대 본 발명에 따라 제작된 재조합 바이러스로부터 다중 역분화 유도 유전자 발현 유닛이 효과적으로 작동되는 것을 확인할 수 있다.
실시예 4. 세포 배양 및 iPS 세포주 형성 측정
6웰 플레이트에 최종농도 10%의 정제된 소혈청 (defined FBS)과 항생제인 페니실린(100U/ml)과 스트렙토마이신(100ug/ml)이 보충된 DMEM (Gibco) 배지를 가하고, 인간 포피 섬유아세포 (human foreskin fibroblast cell: ATCC, SCRC-1041)를 한 웰 당 1x104 - 1x105 정도로 접종하고, 실시예 2에서 얻어진 바이러스를 1 M.O.I 정도로 가하고 37 ℃, 5% C의 조건에서 배양하였다. 3일 마다 한번 씩 3회 상기 과정을 반복하였다. 마지막으로 바이러스를 가한 후, 5일 째에 배양세포(인간 포피 섬유아세포)들을 STO 피더세포 (feeder cell layer) 위로 이동시켜 배양하였으며, 12일 째에 bFGF가 포함 되어 있는 인간 배아줄기세포 배양배지(0.05mM 베타-머캅토에탄올, 1% 비필수아미노산, 20% 넉-아웃 혈청 대체물(knock out serum replacement), 100U/ml 페니실린, 100ug/ml 스프렙토마이신, 및 4ng/ml bFGF로 보충된 DMEM-12 배지)로 교체하여 배양하였다. 상기 배양 과정을 요약하면 도 7과 같다. 마지막으로 바이러스를 가한 후 15일 째에 iPS 세포 콜로니가 형성되기 시작하였으며, 17일 째에 배아줄기세포의 콜로니처럼 자라는 세포들을 수확하였다.
17일 째에 얻어진 iPS 세포 콜로니를 관찰한 결과는 도 7의 하단과 같다. 도 7의 하단은 17일 째에 관찰된 수확하기 직전의 대표적인 iPS 세포 콜로니 4 개의 형태를 보여준다 (A, B, C, D).
도 1은 본 발명에 따른 유전자 구조체의 작동 메커니즘을 모식도로 나타낸 것이다.
도 2는 다중 역분화 유전자 구조체를 포함하는 재조합 플라스미드의 제작과정의 일 예를 모식도로 나타낸 것이다.
도 3은 다중 역분화 유전자 구조체가 재조합된 다중 역분화 유도 인자 발현 플라스미드의 개열지도의 일 예이다.
도 4는 다중 역분화 유도 인자 발현 플라스미드, BAC DNA, 및 pEBHICP27 플라스미드를 사용하여, 무-헬퍼 바이러스 시스템을 통한 바이러스 제작과정의 일 예를 나타낸다.
도 5는 다중 역분화 유도 유전자 구조체를 동시에 전달/발현시켜 역분화 만능 줄기세포 (iPS cell)을 제조하는 방법을 모식도로 나타내 것이다.
도 6의 왼쪽 위 그림은 Oct3/4를 발현하는 바이러스 (HSVamp-Oct3/4 promoter-Oct3/4)를 감염시킨 후 얻은 형광사진이며, 왼쪽 아래 그림은 Oct3/4가 2A로 연결된 유전자 구조체 안에 포함 되어 있는 바이러스 (HSVamp-hOct4promoter-Oct3/4-2A-Nanog-2A-Sox2)를 감염시킨 후 얻은 형광사진이다. 도 6의 오른쪽 그림은 바이러스 감염결과 얻은 G16-9 세포 추출물들을 SDS-PAGE 전기영동을 한 후에 Oct3/4에 특이적인 항체로 웨스턴 블럿팅을 한 결과이다.
도 7은 인간 표피 섬유아세포 (human foreskin fibroblast cell)로부터 iPS 세포를 얻는 배양과정을 나타낸 것이며(상단), 도 7의 하단은 17일 째에 관찰된 수 확하기 직전의 대표적인 iPS 세포 콜로니 4 개의 형태를 보여준다 (A, B, C, D).
<110> College of Medicine Pochon CHA University Industry-Academic Cooperation Foundation <120> Method for preparing induced pluripotent stem cells using herpes simplex amplicon viruses containing reprogramming-inducing genes <130> PN0180 <160> 27 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 27 <212> PRT <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 1 Lys Leu Val Ala Pro Val Lys Gln Thr Pro Asn Phe Asp Leu Leu Lys 1 5 10 15 Leu Ala Gly Asp Val Glu Ser Asn Pro Gly Pro 20 25 <210> 2 <211> 81 <212> DNA <213> Foot-and-mouth disease virus <400> 2 aaaattgtcg ctcctgtcaa acaaactctt aactttgatt tactcaaact ggctggggat 60 gtagaaagca atccaggtcc a 81 <210> 3 <211> 317 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 3 Met Tyr Asn Met Met Glu Thr Glu Leu Lys Pro Pro Gly Pro Gln Gln 1 5 10 15 Thr Ser Gly Gly Gly Gly Gly Asn Ser Thr Ala Ala Ala Ala Gly Gly 20 25 30 Asn Gln Lys Asn Ser Pro Asp Arg Val Lys Arg Pro Met Asn Ala Phe 35 40 45 Met Val Trp Ser Arg Gly Gln Arg Arg Lys Met Ala Gln Glu Asn Pro 50 55 60 Lys Met His Asn Ser Glu 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Ala Glu Val Pro Glu Pro Ala Ala 275 280 285 Pro Ser Arg Leu His Met Ser Gln His Tyr Gln Ser Gly Pro Val Pro 290 295 300 Gly Thr Ala Ile Asn Gly Thr Leu Pro Leu Ser His Met 305 310 315 <210> 4 <211> 954 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 4 atgtacaaca tgatggagac ggagctgaag ccgccgggcc cgcagcaaac ttcggggggc 60 ggcggcggca actccaccgc ggcggcggcc ggcggcaacc agaaaaacag cccggaccgc 120 gtcaagcggc ccatgaatgc cttcatggtg tggtcccgcg ggcagcggcg caagatggcc 180 caggagaacc ccaagatgca caactcggag atcagcaagc gcctgggcgc cgagtggaaa 240 cttttgtcgg agacggagaa gcggccgttc atcgacgagg ctaagcggct gcgagcgctg 300 cacatgaagg agcacccgga ttataaatac cggccccggc ggaaaaccaa gacgctcatg 360 aagaaggata agtacacgct gcccggcggg ctgctggccc ccggcggcaa tagcatggcg 420 agcggggtcg gggtgggcgc cggcctgggc gcgggcgtga accagcgcat ggacagttac 480 gcgcacatga acggctggag caacggcagc tacagcatga tgcaggacca gctgggctac 540 ccgcagcacc cgggcctcaa tgcgcacggc gcagcgcaga tgcagcccat gcaccgctac 600 gacgtgagcg ccctgcagta caactccatg accagctcgc agacctacat gaacggctcg 660 cccacctaca gcatgtccta ctcgcagcag ggcacccctg gcatggctct tggctccatg 720 ggttcggtgg tcaagtccga ggccagctcc agcccccctg tggttacctc ttcctcccac 780 tccagggcgc cctgccaggc cggggacctc cgggacatga tcagcatgta tctccccggc 840 gccgaggtgc cggaacccgc cgcccccagc agacttcaca tgtcccagca ctaccagagc 900 ggcccggtgc ccggcacggc cattaacggc acactgcccc tctcacacat gtga 954 <210> 5 <211> 360 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 5 Met Ala Gly His Leu Ala Ser Asp Phe Ala Phe Ser Pro Pro Pro Gly 1 5 10 15 Gly Gly Gly Asp Gly Pro Gly Gly Pro Glu Pro Gly Trp Val Asp Pro 20 25 30 Arg Thr Trp Leu Ser Phe Gln Gly Pro Pro Gly Gly Pro Gly Ile Gly 35 40 45 Pro Gly Val Gly Pro Gly Ser Glu Val Trp Gly Ile Pro Pro Cys Pro 50 55 60 Pro Pro Tyr Glu Phe Cys Gly Gly Met Ala Tyr Cys Gly Pro Gln Val 65 70 75 80 Gly Val Gly Leu Val Pro Gln Gly Gly Leu Glu Thr Ser Gln Pro Glu 85 90 95 Gly Glu Ala Gly Val Gly Val Glu Ser Asn Ser Asp Gly Ala Ser Pro 100 105 110 Glu Pro Cys Thr Val Thr Pro Gly Ala Val Lys Leu Glu Lys Glu Lys 115 120 125 Leu Glu Gln Asn Pro Glu Glu Ser Gln Asp Ile Lys Ala Leu Gln Lys 130 135 140 Glu Leu Glu Gln Phe Ala Lys Leu Leu Lys Gln Lys Arg Ile Thr Leu 145 150 155 160 Gly Tyr Thr Gln Ala Asp Val Gly Leu Thr Leu Gly Val Leu Phe Gly 165 170 175 Lys Val Phe Ser Gln Thr Thr Ile Cys Arg Phe Glu Ala Leu Gln Leu 180 185 190 Ser Phe Lys Asn Met Cys Lys Leu Arg Pro Leu Leu Gln Lys Trp Val 195 200 205 Glu Glu Ala Asp Asn Asn Glu Asn Leu Gln Glu Ile Cys Lys Ala Glu 210 215 220 Thr Leu Val Gln Ala Arg Lys Arg Lys Arg Thr Ser Ile Glu Asn Arg 225 230 235 240 Val Arg Gly Asn Leu Glu Asn Leu Phe Leu Gln Cys Pro Lys Pro Thr 245 250 255 Leu Gln Gln Ile Ser His Ile Ala Gln Gln Leu Gly Leu Glu Lys Asp 260 265 270 Val Val Arg Val Trp Phe Cys Asn Arg Arg Gln Lys Gly Lys Arg Ser 275 280 285 Ser Ser Asp Tyr Ala Gln Arg Glu Asp Phe Glu Ala Ala Gly Ser Pro 290 295 300 Phe Ser Gly Gly Pro Val Ser Phe Pro Leu Ala Pro Gly Pro His Phe 305 310 315 320 Gly Thr Pro Gly Tyr Gly Ser Pro His Phe Thr Ala Leu Tyr Ser Ser 325 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sapiens <400> 8 atgagtgtgg atccagcttg tccccaaagc ttgccttgct ttgaagcatc cgactgtaaa 60 gaatcttcac ctatgcctgt gatttgtggg cctgaagaaa actatccatc cttgcaaatg 120 tcttctgctg agatgcctca cacggagact gtctctcctc ttccttcctc catggatctg 180 cttattcagg acagccctga ttcttccacc agtcccaaag gcaaacaacc cacttctgca 240 gagaagagtg tcgcaaaaaa ggaagacaag gtcccggtca agaaacagaa gaccagaact 300 gtgttctctt ccacccagct gtgtgtactc aatgatagat ttcagagaca gaaatacctc 360 agcctccagc agatgcaaga actctccaac atcctgaacc tcagctacaa acaggtgaag 420 acctggttcc agaaccagag aatgaaatct aagaggtggc agaaaaacaa ctggccgaag 480 aatagcaatg gtgtgacgca gaaggcctca gcacctacct accccagcct ttactcttcc 540 taccaccagg gatgcctggt gaacccgact gggaaccttc caatgtggag caaccagacc 600 tggaacaatt caacctggag caaccagacc cagaacatcc agtcctggag caaccactcc 660 tggaacactc agacctggtg cacccaatcc tggaacaatc aggcctggaa cagtcccttc 720 tataactgtg gagaggaatc tctgcagtcc tgcatgcagt tccagccaaa ttctcctgcc 780 agtgacttgg aggctgcctt ggaagctgct ggggaaggcc ttaatgtaat acagcagacc 840 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ctgcagcttc acctatccga tccgggccgg gaacgacccg 480 ggcgtggcgc cgggcggcac gggcggaggc ctcctctatg gcagggagtc cgctccccct 540 ccgacggctc ccttcaacct ggcggacatc aacgacgtga gcccctcggg cggcttcgtg 600 gccgagctcc tgcggccaga attggacccg gtgtacattc cgccgcagca gccgcagccg 660 ccaggtggcg ggctgatggg caagttcgtg ctgaaggcgt cgctgagcgc ccctggcagc 720 gagtacggca gcccgtcggt catcagcgtc agcaaaggca gccctgacgg cagccacccg 780 gtggtggtgg cgccctacaa cggcgggccg ccgcgcacgt gccccaagat caagcaggag 840 gcggtctctt cgtgcaccca cttgggcgct ggaccccctc tcagcaatgg ccaccggccg 900 gctgcacacg acttccccct ggggcggcag ctccccagca ggactacccc gaccctgggt 960 cttgaggaag tgctgagcag cagggactgt caccctgccc tgccgcttcc tcccggcttc 1020 catccccacc cggggcccaa ttacccatcc ttcctgcccg atcagatgca gccgcaagtc 1080 ccgccgctcc attaccaaga gctcatgcca cccggttcct gcatgccaga ggagcccaag 1140 ccaaagaggg gaagacgatc gtggccccgg aaaaggaccg ccacccacac ttgtgattac 1200 gcgggctgcg gcaaaaccta cacaaagagt tcccatctca aggcacacct gcgaacccac 1260 acaggtgaga aaccttacca ctgtgactgg gacggctgtg gatggaaatt cgcccgctca 1320 gatgaactga ccaggcacta ccgtaaacac acggggcacc gcccgttcca gtgccaaaaa 1380 tgcgaccgag cattttccag gtcggaccac ctcgccttac acatgaagag gcatttttaa 1440 1440 <210> 11 <211> 209 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 11 Met Gly Ser Val Ser Asn Gln Gln Phe Ala Gly Gly Cys Ala Lys Ala 1 5 10 15 Ala Glu Glu Ala Pro Glu Glu Ala Pro Glu Asp Ala Ala Arg Ala Ala 20 25 30 Asp Glu Pro Gln Leu Leu His Gly Ala Gly Ile Cys Lys Trp Phe Asn 35 40 45 Val Arg Met Gly Phe Gly Phe Leu Ser Met Thr Ala Arg Ala Gly Val 50 55 60 Ala Leu Asp Pro Pro Val Asp Val Phe Val His Gln Ser Lys Leu His 65 70 75 80 Met Glu Gly Phe Arg Ser Leu Lys Glu Gly Glu Ala Val Glu Phe Thr 85 90 95 Phe Lys Lys Ser Ala Lys Gly Leu Glu Ser Ile Arg Val Thr Gly Pro 100 105 110 Gly Gly Val Phe Cys Ile Gly Ser Glu Arg Arg Pro Lys Gly Lys Ser 115 120 125 Met Gln Lys Arg Arg Ser Lys Gly Asp Arg Cys Tyr Asn Cys Gly Gly 130 135 140 Leu Asp His His Ala Lys Glu Cys Lys Leu Pro Pro Gln Pro Lys Lys 145 150 155 160 Cys His 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atggcgggac acctggcttc ggatttcgcc ttctcgcccc ctccaggtgg tggaggtgat 60 gggccagggg ggccggagcc gggctgggtt gatcctcgga cctggctaag cttccaaggc 120 cctcctggag ggccaggaat cgggccgggg gttgggccag gctctgaggt gtgggggatt 180 cccccatgcc ccccgccgta tgagttctgt ggggggatgg cgtactgtgg gccccaggtt 240 ggagtggggc tagtgcccca aggcggcttg gagacctctc agcctgaggg cgaagcagga 300 gtcggggtgg agagcaactc cgatggggcc tccccggagc cctgcaccgt cacccctggt 360 gccgtgaagc tggagaagga gaagctggag caaaacccgg aggagtccca ggacatcaaa 420 gctctgcaga aagaactcga gcaatttgcc aagctcctga agcagaagag gatcaccctg 480 ggatatacac aggccgatgt ggggctcacc ctgggggttc tatttgggaa ggtattcagc 540 caaacgacca tctgccgctt tgaggctctg cagcttagct tcaagaacat gtgtaagctg 600 cggcccttgc tgcagaagtg ggtggaggaa gctgacaaca atgaaaatct tcaggagata 660 tgcaaagcag aaaccctcgt gcaggcccga aagagaaagc gaaccagtat cgagaaccga 720 gtgagaggca acctggagaa tttgttcctg cagtgcccga aacccacact gcagcagatc 780 agccacatcg cccagcagct tgggctcgag aaggatgtgg tccgagtgtg gttctgtaac 840 cggcgccaga agggcaagcg 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caactccacc gcggcggcgg ccggcggcaa ccagaaaaac 2760 agcccggacc gcgtcaagcg gcccatgaat gccttcatgg tgtggtcccg cgggcagcgg 2820 cgcaagatgg cccaggagaa ccccaagatg cacaactcgg agatcagcaa gcgcctgggc 2880 gccgagtgga aacttttgtc ggagacggag aagcggccgt tcatcgacga ggctaagcgg 2940 ctgcgagcgc tgcacatgaa ggagcacccg gattataaat accggccccg gcggaaaacc 3000 aagacgctca tgaagaagga taagtacacg ctgcccggcg ggctgctggc ccccggcggc 3060 aatagcatgg cgagcggggt cggggtgggc gccggcctgg gcgcgggcgt gaaccagcgc 3120 atggacagtt acgcgcacat gaacggctgg agcaacggca gctacagcat gatgcaggac 3180 cagctgggct acccgcagca cccgggcctc aatgcgcacg gcgcagcgca gatgcagccc 3240 atgcaccgct acgacgtgag cgccctgcag tacaactcca tgaccagctc gcagacctac 3300 atgaacggct cgcccaccta cagcatgtcc tactcgcagc agggcacccc tggcatggct 3360 cttggctcca tgggttcggt ggtcaagtcc gaggccagct ccagcccccc tgtggttacc 3420 tcttcctccc actccagggc gccctgccag gccggggacc tccgggacat gatcagcatg 3480 tatctccccg gcgccgaggt gccggaaccc gccgccccca gcagacttca catgtcccag 3540 cactaccaga gcggcccggt gcccggcacg gccattaacg gcacactgcc cctctcacac 3600 atgtga 3606 <210> 17 <211> 6723 <212> DNA <213> herpes simplex virus 7 <400> 17 ggcagtacat caatgggcgt ggatagcggt ttgactcacg gggatttcca agtctccacc 60 ccattgacgt caatgggagt ttgttttggc accaaaatca acgggacttt ccaaaatgtc 120 gtaacaactc cgccccattg acgcaaatgg gcggtaggcg tgtacggtgg gaggtctata 180 taagcagagc tctctggcta actagagaac ccactgctta ctggcttatc gaaattaata 240 cgactcacta tagggagacc caagctggct agcgtttaaa cttaagcttg gtaccgagct 300 cggatccact agtccagtgt ggtggaattc tgcagatatc cagcacagtg gcggccgctc 360 gagtctagag ggcccgttta aacccgctga tcagcctcga ctgtgccttc tagttgccag 420 ccatctgttg tttgcccctc ccccgtgcct tccttgaccc tggaaggtgc cactcccact 480 gtcctttcct aataaaatga ggaaattgca tcgcattgtc tgagtaggtg tcattctatt 540 ctggggggtg gggtggggca ggacagcaag ggggaggatt gggaagacaa tagcgttaat 600 taaaattcca gctgagcgcc ggtcgctacc attaccagtt ggtctggtgt caaaaataat 660 aataaccggg caggccatgt ctgcccgtat ttcgcgtaag gaaatccatt atgtactatt 720 taaaaaacac aaacttttgg atgttcggtt tattcttttt cttttacttt tttatcatgg 780 gagcctactt cccgtttttc ccgatttggc tacatgacat caaccatatc agcaaaagtg 840 atacgggtat tatttttgcc gctatttctc tgttctcgct attattccaa ccgctgtttg 900 gtctgctttc tgacaaactc ggaacttgtt tattgcagct tataatggtt acaaataaag 960 caatagcatc acaaatttca caaataaagc atttttttca ctgcattcta gttgtggttg 1020 tccaaactca tcaatgtatc ttatcatgtc tggatctctg acctgagatt ggcggcactg 1080 aggtagagat gcccgaaccc ccccgaggga gcgcgggacg cgccggggag ggctggggcc 1140 ggggagggct ggggccgggg agggctgggg ccggggaggg ctggggccgg ggagggctgg 1200 ggccggggag ggctggggcc ggggagggct ggggctgggg agggctgggg ctggggaggg 1260 ggcggtggtg tgtagcagga gcggtgtgtt gcgccggggt acgtctggag gagcgggagg 1320 tgcgcggtga cgtgtggatg aggaacagga gttgttgcgc ggtgagttgt cgctgtgagt 1380 tgtgttgttg ggcaggtgtg gtggatgacg tgacgtgtga cgtgcggagt gcgccgtgct 1440 ctgttggttt cacctgtggc agcccgggcc ccccgcgggc gcgcgcgcgc gcaaaaaagg 1500 cgggcggcgg tccgggcggc gtgcgcgcgc gcggcgggcg tggggggcgg ggccgcggga 1560 gcggggggag gagcgggggg aggagcgggg ggaggagcgg 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gcgaccgacg cccgcagacg 4980 gcgccggcca cgaacgacgg gagcggctgc ggagcacgcg gaccgggagc gggagtcgca 5040 gagggccgtc ggagcggacg gcgtcggcat cgcgacgccc cggctcggga tcgggatcgc 5100 atcggaaagg gacacgcgga cgcggggggg aaagacccgc ccaccccacc cacgaaacac 5160 aggggacgca ccccgggggc ctccgacgac agaaacccac cggtccgcct tttttgcacg 5220 ggtaagcacc ttgggtgggc ggaggagggg gggacgcggg ggtggaggag gggggacgcg 5280 ggggcggagg aggggggacg cgggggcgga ggagggggga cgcgggggcg gaggaggggg 5340 gacgcggggg cggaggaggg ggctcacccg cgttcgtgcc ttcccgcagg aggaacgtcc 5400 tcgtcgataa gctgatccat cgccaccatg gtgagcaagg gcgaggagct gttcaccggg 5460 gtggtgccca tcctggtcga gctggacggc gacgtaaacg gccacaagtt cagcgtgtcc 5520 ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc tgaagttcat ctgcaccacc 5580 ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc tgacctacgg cgtgcagtgc 5640 ttcagccgct accccgacca catgaagcag cacgacttct tcaagtccgc catgcccgaa 5700 ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg gcaactacaa gacccgcgcc 5760 gaggtgaagt tcgagggcga caccctggtg aaccgcatcg agctgaaggg catcgacttc 5820 aaggaggacg gcaacatcct ggggcacaag ctggagtaca actacaacag ccacaacgtc 5880 tatatcatgg ccgacaagca gaagaacggc atcaaggtga acttcaagat ccgccacaac 5940 atcgaggacg gcagcgtgca gctcgccgac cactaccagc agaacacccc catcggcgac 6000 ggccccgtgc tgctgcccga caaccactac ctgagcaccc agtccgccct gagcaaagac 6060 cccaacgaga agcgcgatca catggtcctg ctggagttcg tgaccgccgc cgggatcact 6120 ctcggcatgg acgagctgta caagtaaagc ggccaacttg tttattgcag cttataatgg 6180 ttacaaataa agcaatagca tcacaaattt cacaaataaa gcattttttt cactgcattc 6240 tagttgtggt ttgtccaaac tcatcaatgt atcttatcat gtctggatcg gtttgaagat 6300 cttccgatgt acgggccaga tatacgcgtt gacattgatt attgactagt tattaatagt 6360 aatcaattac ggggtcatta gttcatagcc catatatgga gttccgcgtt acataactta 6420 cggtaaatgg cccgcctggc tgaccgccca acgacccccg cccattgacg tcaataatga 6480 cgtatgttcc catagtaacg ccaataggga ctttccattg acgtcaatgg gtggactatt 6540 tacggtaaac tgcccacttg gcagtacatc aagtgtatca tatgccaagt acgcccccta 6600 ttgacgtcaa tgacggtaaa tggcccgcct ggcattatgc ccagtacatg accttatggg 6660 actttcctac ttggcagtac atctacgtat tagtcatcgc tattaccatg gtgatgcggt 6720 ttt 6723 <210> 18 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 gggggctagc cgccatggcg ggacacctgg cttc 34 <210> 19 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 gggggcggcc gctcagtttg aatgcatggg ag 32 <210> 20 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 20 ggggctcgag ccgccatgta caacatgatg gagac 35 <210> 21 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 ggggtctaga tcacatgtgt gagaggggca gtgtg 35 <210> 22 <211> 36 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 ggggagatct gccgccatga gtgtggatcc agcttg 36 <210> 23 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 23 gggggaattc acacgtcttc aggttgcatg 30 <210> 24 <211> 103 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 gggggcggcc gcaaaattgt cgctcctgtc aaacaaactc ttaactttga tttactcaaa 60 ctggctgggg atgtagaaag caatccaggt ccaggatccg ggg 103 <210> 25 <211> 99 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 ccccgatcct ggacctggat tgctttctac atccccagcc agtttgagta aatcaaagtt 60 aagagtttgg acaggagcga caattttgcg gccgccccc 99 <210> 26 <211> 101 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 gggggaattc aaaattgtcg ctcctgtcaa acaaactctt aactttgatt tactcaaact 60 ggctggggat gtagaaagca atccaggtcc actcgagggg g 101 <210> 27 <211> 98 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 ccccctcgag tggacctgga ttgctttcta catccccagc cagtttgagt aaatcaaagt 60 taagagtttg gacaggagcg acaattttga attccccc 98

Claims (17)

  1. 삭제
  2. 삭제
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  5. 삭제
  6. (a) Sox2를 코딩하는 유전자; Oct3/4를 코딩하는 유전자; 및 Nanog을 코딩하는 유전자를 동시에 포함하는 1 종의 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스 존재하에서 인간에서 유래된 체세포 또는 불사화된 세포 주를 배양하는 단계; 및 (b) 단계(a)로부터 얻어진 배양물로부터 배아줄기세포-유사 콜로니를 분리하는 단계를 포함하는, 역분화 만능 줄기세포의 제조방법.
  7. (a) Sox2를 코딩하는 유전자; Oct3/4를 코딩하는 유전자; Nanog을 코딩하는 유전자; 및 Lin28을 코딩하는 유전자를 동시에 포함하는 1 종의 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스 존재하에서 인간에서 유래된 체세포 또는 불사화된 세포 주를 배양하는 단계; 및 (b) 단계(a)로부터 얻어진 배양물로부터 배아줄기세포-유사 콜로니를 분리하는 단계를 포함하는, 역분화 만능 줄기세포의 제조방법.
  8. (a) Sox2를 코딩하는 유전자; Oct3/4를 코딩하는 유전자; 및 Klf4를 코딩하는 유전자를 동시에 포함하는 1 종의 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스 존재하에서 인간에서 유래된 체세포 또는 불사화된 세포 주를 배양하는 단계; 및 (b) 단계(a)로부터 얻어진 배양물로부터 배아줄기세포-유사 콜로니를 분리하는 단계를 포함하는, 역분화 만능 줄기세포의 제조방법.
  9. (a) Sox2를 코딩하는 유전자; Oct3/4를 코딩하는 유전자; Klf4를 코딩하는 유전자; 및 c-Myc를 코딩하는 유전자를 동시에 포함하는 1 종의 헤르페스 심플렉스 앰플리콘 바이러스 존재하에서 인간에서 유래된 체세포 또는 불사화된 세포 주를 배양하는 단계; 및 (b) 단계(a)로부터 얻어진 배양물로부터 배아줄기세포-유사 콜로니를 분리하는 단계를 포함하는, 역분화 만능 줄기세포의 제조방법.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 제6항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 헤르페스 심플렉스 바이러스가
    (i) Sox2를 코딩하는 유전자, Oct3/4를 코딩하는 유전자, Nanog를 코딩하는 유전자, 및 선택적으로 Lin28을 코딩하는 유전자; 또는 Sox2를 코딩하는 유전자, Oct3/4를 코딩하는 유전자, Klf4를 코딩하는 유전자, 및 선택적으로 c-Myc를 코딩하는 유전자를 포함하는 유전자 구조체로서, 상기 유전자들이 서열번호 1의 펩타이드를 코딩하는 유전자를 매개로 연결된 유도 유전자 구조체를 헤르페스 심플렉스 바이러스 앰플리콘 플라스미드(Herpes simplex virus amplicon plasmid)에 재조합시켜 발현 플라스미드를 제작하는 단계, 및
    (ii) 단계(i)에서 얻어진 발현 플라스미드를 수용 세포(permissive cell line)에 패키징(packaging)시키는 단계를 포함하는 방법에 의해 얻어진 것임을 특징으로 하는 제조방법.
  14. 제13항에 있어서, 상기 서열번호 1의 펩타이드를 코딩하는 유전자가 서열번호 2의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  15. 제13항에 있어서, 상기 유전자 구조체가 서열번호 15 또는 16의 염기 서열로 구성된 것임을 특징으로 하는 제조방법.
  16. 제13항에 있어서, 상기 헤르페스 심플렉스 바이러스 앰플리콘 플라스미드가 서열번호 17의 염기서열을 갖는 것을 특징으로 하는 제조방법.
  17. 제13항에 있어서, 상기 패키징이 상기 발현 플라스미드, fHSV△pac△27 0+, 및 pEBHICP27를 상기 수용 세포에 공동-형질도입(co-transfection)시킴으로써 수행되는 것을 특징으로 하는 제조방법.
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