KR20120115237A - 암 치료 방법 및 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 3-(이미다조[1,2-b]피리다진-3-일에티닐)-4-메틸-N-(4-((4-메틸피페라진-1-일)-메틸)-3-(트리플루오로메틸)페닐)벤즈아마이드를 사용하여 암을 치료하는 방법, 키트, 및 약제학적 조성물을 특징으로 한다.

Description

암 치료 방법 및 조성물 {METHODS AND COMPOSITIONS FOR TREATING CANCER}

본 발명은 강력한 경구 활성 억제제인 포나티닙("화합물 1") 및 이의 약제학적 조성물 및 용도에 관한 것이다.

본 발명은 종양, 암, 및 병리학적 혈관신생 관련 질환과 같은 병리학적 세포 증식과 관련된 장애의 치료를 위한 멀티-키나아제 억제제인 포나티닙(ponatinib)("화합물 1")에 기초한 약제학적 조성물 및 치료 방법에 관한 것이다.

단백질 키나아제는 매우 다양한 세포 과정의 조절에 중심적인 역할을 하는 단백질들의 거대 패밀리이다. 이러한 키나아제의 목록의 비제한적인 일부에는 abl, Akt, BCR-ABL, Blk, Brk, c-KIT, c-met, c-src, CDK1, CDK2, CD 3, CDK4, CDK5, CDK6, CDK7, CDK8, CDK9, CDK10, cRafl , CSK, EGFR, ErbB2, ErbB3, ErbB4, Erk, Pak, fes, FGFR1, FGFR2, FGFR3, FGFR4, FGFR5, Fgr, FLT1, FLT3, Fps, Frk, Fyn, Hck, IGF-1R, INS-R, Jak, KDR, Lck, Lyn, MEK, p38, PDGFR, PIK, PKC, PYK2, ros, tie, tie2, TRK, 및 Zap70이 포함된다. 비정상적인 단백질 키나아제 활성은 건선과 같이 생명에는 지장이 없는 질병에서 암과 같은 극히 심각한 질병에 이르는 여러 장애들과 관련되어 있다.

키나아제 억제제는 몇 가지 중요한 성과를 거두며 개발되고 치료적으로 사용되어왔다. 그러나 모든 표적 환자들이 이들 키나아제 억제제들에 반응하는 것은 아니며, 몇몇은 키나아제에서 돌연변이가 발생함으로써 혹은 다른 메커니즘에 의해 특정 억제제에 반응하지 않게 된다. 현재 승인된 키나아제 억제제는 문제시되는 부작용들을 일으킬 수 있으며, 몇몇 환자들은 특정 억제제를 받아들이지 못하거나, 받아들이지 못하게 된다. 불행하게도, 새롭고 보다 나은 치료를 위한 상당한 충족되지 않은 의학적 필요성이 계속된다.

예컨대 비정상적인 티로신 키나아제인 BCR-ABL은 만성 골수성 백혈병(CML) 및 필라델피아 염색체 양성 급성 림프구성 백혈병(Ph+ ALL)의 특징이다. 이마티닙(BCR-ABL의 티로신 억제제("TKI"))으로 치료된 몇몇 환자들은 이마티닙에 대한 저항이 발생한다. 이마티닙에 대한 저항은 BCR-ABL에서의 여러 가지 돌연변이들의 출현과 연관되어 있다. 2세대 BCR-ABL 억제제인 다사티닙과 닐로티닙은 중요한 기여를 해왔으며, 많은 돌연변이 BCR-ABL 종을 억제하지만, 하나 이상의 이러한 돌연변이, T315I 돌연변이에 대해서는 여전히 효과가 없다. 현재, 2세대 TKI의 실패 이후에 CML 또는 Ph⁺ 급성 골수성 백혈병 환자를 위한 표준 치료법은 없다. 중요하게, T315I 돌연변이(모든 현재 승인된 TKI에 대해 저항력이 있는 돌연변이)를 지닌 환자를 위해 이용할 수 있는 표적 치료법은 없다.

다발성 암의 시작 및 진행에 관련되었음을 나타내는 티로신 키나아제의 다른 예들에는 FMS-유사 티로신 키나아제 3(FLT3), 섬유아세포 증식 인자 수용체(FGFR), 혈관 내피 성장 인자(VEGF) 수용체, 및 안지오포이에틴 수용체인 TIE2가 포함된다.

내부 일렬 중복(ITD)으로 인한 FLT3의 구조적 활성화는 급성 골수성 백혈병(AML)인 환자들의 대략 1/3에서 발견된다.

섬유아세포 증식 인자 수용체(FGFR)는 자궁내막암, 유방암, 비소세포 폐암(NSCLC) 및 위암을 포함한 몇몇 고형 종양에서뿐만 아니라 다발성 골수종에서도 활성화되는 것으로 알려져 있다.

VEGFR 및 다른 키나아제에 의해 매개된 부적절한 혈관신생은 교모세포종 및 대장암과 같은 여러 암들은 물론 여러 가지 다른 증식성 장애에도 관련되어 있음을 나타낸다.

다수의 단백질 키나아제들 및 관련된 질병들을 고려하여, 그 중에서도, BCR-ABL^T315I를 억제할 수 있는 ABL 억제제를 포함한, 여러 단백질 키나아제들에 대해 선택성이 있고 관련된 질병들의 치료에 유용할 수 있는 새로운 억제제들, 또는 억제제들의 조합물에 대한 필요성이 계속하여 존재한다.

본 발명은 강력한 경구 활성 억제제인 포나티닙("화합물 1") 및 이의 약제학적 조성물 및 용도에 관한 것이다. 화합물 1의 매우 유망한 약리학적 프로파일이 생화학적 검사, 세포-기반 실험, 동물 연구, 및 지금까지의 인간 임상 연구로부터의 결과를 기초로 하여 구체화되었다.

하기에 보다 상세하게 개시되어 있듯이, 화합물 1은 경구 활성 다중-표적 키나아제 억제제이다. 이는 지금까지 만들어진 가장 강력한 BCR-ABL 억제제이며 다른 약제들에 대한 저항을 유도하는 현재 치료할 수 없는 T315I 돌연변이를 포함한 표적의 모든 알려진 돌연변이 형태를 억제할 수 있는 최초의 pan-BCR-ABL 억제제이다. 1 상 임상 시험에서, 이는 다사티닙 및 닐로티닙이 효과적이지 않은 환자들을 포함한 난치성 혈액 암인 환자들(CML 및 Ph+ ALL인 다수의 환자들 포함)에게서 매력적인 안전 프로파일을 가지며 상당한 항백혈병 활성인 것으로 입증되었다.

신체에서 이의 키나아제 억제 활성, 흡수, 분배, 대사 및 배설 행동을 나타내는 화합물 1의 약동학적 및 약력학적 특징들은, 표적 키나아제를 억제하고 BCR-ABL의 경우에 저항성 돌연변이를 발현하는 세포들의 생성물(outgrowth)를 억제하는데 유효한 농도를 달성할 수 있는, 경구적으로 생체이용가능한 화합물의 특징들이다. 지금까지의 매력적인 안전 프로파일은 정상적인 기능에 필요한 키나아제 활성의 과도한 의도하지 않은 억제 없이 이러한 목적들을 달성한다는 성과를 나타낸다.

이러한 선택성 및 안전 프로파일의 중요성은 BCR-ABL와 이의 돌연변이들을 넘어서 다양한 키나아제들을 억제하는 화합물 1의 강력한 활성에 의해 강조된다. 예컨대, 화합물 1은 FLT3, FGF 수용체 패밀리의 모든 4개의 멤버, 모든 3개의 VEGF 수용체들, 안지오포이에틴 수용체 TIE2를 억제하였지만, 인슐린 수용체, 오로라 키나아제, 및 사이클린-의존성 키나아제 패밀리들을 포함한 많은 다른 키나아제 종류들에 대해서는 비활성이었다.

따라서 본 발명은 하기 도시된 3-(이미다조[1,2-b]피리다진-3-일에티닐)-4-메틸-N-(4-((4-메틸피페라진-l-일)-메틸)-3-(트리플루오로메틸)페닐)벤즈아마이드(화합물 1) 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 함유하는 약제학적 조성물과 키트, 및 암 및 다른 질병들을 치료하기 위한 이의 치료적 용도를 특징으로 한다:

화학식 1

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따라서, 본 발명의 일 양태는 개체에 투여되는 경우 종양, 암, 또는 과다증식성 장애를 치료하기에 유효한 양의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 하나 또는 그 초과의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 경구 투여에 적합한 약제학적 조성물을 특징으로 한다. 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은, 예컨대 염산염일 수 있다. 특정 구현예들에서, 약제학적 조성물은 단위 투여 형태로 제조된다. 특정 구현예들에서, 단위 투여 형태는 30 내지 300㎎의 화합물 1을 함유할 수 있다. 예시적인 단위 투여 형태들은 5 내지 100㎎, 5 내지 80㎎, 5 내지 50㎎, 5 내지 20㎎, 7 내지 100㎎, 7 내지 80㎎, 7 내지 50㎎, 7 내지 20㎎, 10 내지 100㎎, 10 내지 80㎎, 10 내지 50㎎, 15 내지 100㎎, 15 내지 80㎎, 15 내지 60㎎, 15㎎ 내지 50㎎, 20 내지 100㎎, 20 내지 80㎎, 20 내지 50㎎, 30 내지 100㎎, 35 내지 100㎎, 40 내지 100㎎, 50 내지 100㎎, 60 내지 100㎎, 70 내지 100㎎, 30 내지 80㎎, 35 내지 80㎎, 40 내지 80㎎, 50 내지 80㎎, 60 내지 80㎎, 50 내지 300㎎, 60 내지 300㎎, 70 내지 300㎎, 50 내지 200㎎, 60 내지 200㎎, 70 내지 200㎎, 100 내지 300㎎, 120 내지 300㎎, 140 내지 300㎎, 또는 100 내지 200㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 다른 구현예들에서, 단위 투여 형태는 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 40±8㎎, 45±9㎎를 함유할 수 있다. 예시적인 단위 투여 형태들은 5±1㎎, 7±1.5㎎, 10±2㎎, 15±3㎎, 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 40±8㎎, 45±9㎎, 55±11㎎, 60±12㎎, 65±13㎎, 70±14㎎, 75±15㎎, 80±16㎎, 90±18㎎, 100±20㎎, 120±24㎎, 140±28㎎, 160±32㎎, 180±36㎎, 200±40㎎, 220±44㎎, 240±48㎎, 또는 260±52㎎의 화합물 1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 갖는 것들을 포함한다.

또 다른 구현예에서, 약제학적 조성물은 고형 단위 투여 형태(예컨대, 정제, 연질 캡슐, 또는 경질 캡슐)로 제조된다. 특정 구현예들에서, 단위 투여 형태는 30 내지 300㎎의 화합물 1을 함유할 수 있다. 예시적인 단위 투여 형태들은 5 내지 100㎎, 5 내지 80㎎, 5 내지 50㎎, 5 내지 20㎎, 7 내지 100㎎, 7 내지 80㎎, 7 내지 50㎎, 7 내지 20㎎, 10 내지 100㎎, 10 내지 80㎎, 10 내지 50㎎, 15 내지 100㎎, 15 내지 80㎎, 15 내지 60㎎, 15㎎ 내지 50㎎, 20 내지 100㎎, 20 내지 80㎎, 20 내지 50㎎, 30 내지 100㎎, 35 내지 100㎎, 40 내지 100㎎, 50 내지 100㎎, 60 내지 100㎎, 70 내지 100㎎, 30 내지 80㎎, 35 내지 80㎎, 40 내지 80㎎, 50 내지 80㎎, 60 내지 80㎎, 50 내지 300㎎, 60 내지 300㎎, 70 내지 300㎎, 50 내지 200㎎, 60 내지 200㎎, 70 내지 200㎎, 100 내지 300㎎, 120 내지 300㎎, 140 내지 300㎎, 또는 100 내지 200㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 다른 구현예들에서, 단위 투여 형태는 5±1㎎, 7±1.5㎎, 10±2㎎, 15±3㎎, 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 40±8㎎, 45±9㎎을 함유할 수 있다. 예시적인 단위 투여 형태들에는 5±1㎎, 7±1.5㎎, 10±2㎎, 15±3㎎, 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 40±8㎎, 45±9㎎, 55±11㎎, 60±12㎎, 65±13㎎, 70±14㎎, 75±15㎎, 80±16㎎, 90±18㎎, 100±20㎎, 120±24㎎, 140±28㎎, 160±32㎎, 180±36㎎, 200±40㎎, 220±44㎎, 240±48㎎, 또는 260±52㎎의 화합물 1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 갖는 것들이 포함된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 개체에 30 내지 300㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 경구 투여함으로써, 종양, 암, 또는 과다증식성 장애의 치료가 필요한 개체의 종양, 암, 또는 과다증식성 장애를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 예시적인 단위 투여 형태들은 5 내지 100㎎, 5 내지 80㎎, 5 내지 50㎎, 5 내지 20㎎, 7 내지 100㎎, 7 내지 80㎎, 7 내지 50㎎, 7 내지 20㎎, 10 내지 100㎎, 10 내지 80㎎, 10 내지 50㎎, 15 내지 100㎎, 15 내지 80㎎, 15 내지 60㎎, 15㎎ 내지 50㎎, 20 내지 100㎎, 20 내지 80㎎, 20 내지 50㎎, 30 내지 100㎎, 35 내지 100㎎, 40 내지 100㎎, 50 내지 100㎎, 60 내지 100㎎, 70 내지 100㎎, 30 내지 80㎎, 35 내지 80㎎, 40 내지 80㎎, 50 내지 80㎎, 60 내지 80㎎, 50 내지 300㎎, 60 내지 300㎎, 70 내지 300㎎, 50 내지 200㎎, 60 내지 200㎎, 70 내지 200㎎, 100 내지 300㎎, 120 내지 300㎎, 140 내지 300㎎, 또는 100 내지 200㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 다른 구현예들에서, 단위 투여 형태는 5±1㎎, 7±1.5㎎, 10±2㎎, 15±3㎎, 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 40±8㎎, 45±9㎎을 함유할 수 있다. 예시적인 단위 투여 형태들은 5±1㎎, 7±1.5㎎, 10±2㎎, 15±3㎎, 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 40±8㎎, 45±9㎎, 55±11㎎, 60±12㎎, 65±13㎎, 70±14㎎, 75±15㎎, 80±16㎎, 90±18㎎, 100±20㎎, 120±24㎎, 140±28㎎, 160±32㎎, 180±36㎎, 200±40㎎, 220±44㎎, 240±48㎎, 또는 260±52㎎의 화합물 1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 갖는 것들을 포함한다. 특정 구현예들에서, 평균 1일 투여량인 30 내지 300㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은, 단위 투여 형태로(예컨대, 20 내지 100㎎, 20 내지 80㎎, 20 내지 50㎎, 30 내지 100㎎, 35 내지 100㎎, 40 내지 100㎎, 50 내지 100㎎, 60 내지 100㎎, 70 내지 100㎎, 30 내지 80㎎, 35 내지 80㎎, 40 내지 80㎎, 50 내지 80㎎, 60 내지 80㎎, 50 내지 300㎎, 60 내지 300㎎, 70 내지 300㎎, 50 내지 200㎎, 60 내지 200㎎, 70 내지 200㎎, 100 내지 300㎎, 120 내지 300㎎, 140 내지 300㎎, 또는 100 내지 200㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 평균 1일 투여량; 또는 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 40±8㎎, 45±9㎎, 55±11㎎, 60±12㎎, 65±13㎎, 70±14㎎, 75±15㎎, 80±16㎎, 90±18㎎, 100±20㎎, 120±24㎎, 140±28㎎, 160±32㎎, 180±36㎎, 200±40㎎, 220±44㎎, 240±48㎎, 또는 260±52㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 평균 1일 투여량) 개체에 경구투여된다. 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은, 1주일에 1일 이상 또는 매 7일에 평균 4 내지 7회(예컨대, 1주일에 4회, 1주일에 5회, 1주일에 6회, 또는 1주일에 7회) 개체에 투여될 수 있다. 특정 구현예들에서, 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 개체에 매일 투여된다. 특정 구현예들에서, 개체는 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 골수이형성증후군, 위암, 자궁내막암, 방광암, 다발성 골수종, 유방암, 전립선암, 폐암, 대장암, 신장암, 또는 교모세포종을 지닌다. 또한 다른 구현예들에서, 개체는 이마티닙, 닐로티닙, 또는 다사티닙으로 치료하기 어려운 질환을 지닌다. 추가의 구현예들에서, 개체는 이마티닙, 닐로티닙, 또는 다사티닙을 이용한 치료를 받아들이지 않는 질환을 지닌다. 다른 구현예들에서, 개체는 필라델피아 염색체 양성 질환을 지닌다. 또한 다른 구현예들에서, 개체는 VEGF 또는 VEGF-R 억제제 또는 길항제(예컨대, 베바시주맙, 소라페닙, 또는 수니티닙)로 치료하기 어려운 고형암을 지닌다. 추가의 구현예들에서, 개체는 VEGF 또는 VEGF-R 억제제 또는 길항제(예컨대, 베바시주맙, 소라페닙, 또는 수니티닙)를 이용한 치료를 받아들이지 않는 질환을 지닌다. 몇몇 구현예들에서, 개체는 BCR-ABL 돌연변이(예컨대, BCR-ABL^T315I, BCR-ABL^F317L, 또는 BCR-ABL^F359C)를 발현하는 암을 지닌다. 다른 구현예들에서, 개체는 FLT3, KIT, FGFR1, 또는 PDGFR 돌연변이(예컨대, FLT3-ITD, c-KIT, FGFR10P2-FGFR1, 또는 F1P1L1 -PDGFRα)를 발현하는 암을 지닌다. 추가의 구현예에서, 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은, 각각 함께 상기 종양, 암, 또는 과다증식성 장애를 치료하기에 유효한 양으로 mTOR 억제제와 함께 또는 동시에 투여된다. 몇몇 구현예들에서, mTOR 억제제는 시롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, 바이롤리무스, 조타롤리무스, LY294002, Pp242, WYE-354, Ku-0063794, XL765, AZD8055, NVP-BEZ235, OSI-027, 보르트만닌, 퀘르세틴, 마이리세틴, 및 스타우로스포린, 및 이들의 약제학적으로 허용가능한 염으로부터 선택된다.

추가의 양태에서, 본 발명은 (i) 개체에 투여되는 경우 종양, 암, 또는 과다증식성 장애를 치료하기에 유효한 양의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 하나 또는 그 초과의 약제학적으로 허용가능한 부형제의 경구 투여에 적합한 약제학적 조성물; 및 (ii) 종양, 암, 또는 과다증식성 장애의 치료를 위해 개체에 약제학적 조성물을 투여하기 위한 설명서를 포함하는 키트를 특징으로 한다. 몇몇 구현예들에서, 개체는 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 골수이형성증후군, 위암, 자궁내막암, 방광암, 다발성 골수종, 유방암, 전립선암, 폐암, 대장암, 신장암, 또는 교모세포종을 지닌다.

또한 또 다른 양태에서, 본 발명은 개체에 5 내지 300㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 경구 투여함으로써, 종양, 암, 또는 과다증식성 장애의 치료를 필요로 하는 개체의 종양, 암, 또는 과다증식성 장애를 치료하는 방법을 특징으로 한다. 예시적인 단위 투여 형태들은 5 내지 100㎎, 5 내지 80㎎, 5 내지 50㎎, 5 내지 20㎎, 7 내지 100㎎, 7 내지 80㎎, 7 내지 50㎎, 7 내지 20㎎, 10 내지 100㎎, 10 내지 80㎎, 10 내지 50㎎, 15 내지 100㎎, 15 내지 80㎎, 15 내지 60㎎, 15㎎ 내지 50㎎, 20 내지 100㎎, 20 내지 80㎎, 20 내지 50㎎, 30 내지 100㎎, 35 내지 100㎎, 40 내지 100㎎, 50 내지 100㎎, 60 내지 100㎎, 70 내지 100㎎, 30 내지 80㎎, 35 내지 80㎎, 40 내지 80㎎, 50 내지 80㎎, 60 내지 80㎎, 50 내지 300㎎, 60 내지 300㎎, 70 내지 300㎎, 50 내지 200㎎, 60 내지 200㎎, 70 내지 200㎎, 100 내지 300㎎, 120 내지 300㎎, 140 내지 300㎎, 또는 100 내지 200㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한다. 다른 구현예들에서, 단위 투여 형태는 5±1㎎, 7±1.5㎎, 10±2㎎, 15±3㎎, 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 40±8㎎, 45±9㎎, 55±11㎎, 60±12㎎, 65±13㎎, 70±14㎎, 75±15㎎, 80±16㎎, 90±18㎎, 100 + 20㎎, 120 + 24㎎, 140±28㎎, 160±32㎎, 180±36㎎, 200±40㎎, 220±44㎎, 240±48㎎, 또는 260±52㎎의 화합물 1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 함유할 수 있다. 특정 구현예들에서, 평균 1일 투여량인 5 내지 300㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은, 단위 투여 형태로(예컨대, 5 내지 100㎎, 5 내지 80㎎, 5 내지 50㎎, 5 내지 20㎎, 7㎎ 내지 100㎎, 7㎎ 내지 80㎎, 7 내지 50㎎, 7 내지 20㎎, 10㎎ 내지 100㎎, 10㎎ 내지 80㎎, 10 내지 50㎎, 15㎎ 내지 100㎎, 15㎎ 내지 80㎎, 15 내지 60㎎, 15㎎ 내지 50㎎, 20 내지 100㎎, 20 내지 80㎎, 20 내지 50㎎, 30 내지 100㎎, 35 내지 100㎎, 40 내지 100㎎, 50 내지 100㎎, 60 내지 100㎎, 70 내지 100㎎, 30 내지 80㎎, 35 내지 80㎎, 40 내지 80㎎, 50 내지 80㎎, 60 내지 80㎎, 50 내지 300㎎, 60 내지 300㎎, 70 내지 300㎎, 50 내지 200㎎, 60 내지 200㎎, 70 내지 200㎎, 100 내지 300㎎, 120 내지 300㎎, 140 내지 300㎎, 또는 100 내지 200㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 평균 1일 투여량; 또는 5±1㎎, 7±1.5㎎, 10±2㎎, 15±3㎎, 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 40±8㎎, 45±9㎎, 55±11㎎, 60±12㎎, 65±13㎎, 70±14㎎, 75±15㎎, 80±16㎎, 90±18㎎, 100±20㎎, 120±24㎎, 140±28㎎, 160±32㎎, 180±36㎎, 200±40㎎, 220±44㎎, 240±48㎎, 또는 260±52㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 평균 1일 투여량) 개체에 경구 투여된다. 추가의 양태들에서, 상기 방법은 개체에 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 40 내지 600nM의 화합물 1에 대한 평균 정상 상태(steady state) 최저 농도를 초래하는 양으로, 투약 횟수로, 및 기간 동안 투여함으로써 개체에서 암 세포들의 증식을 억제하는 것; 개체에 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 40 내지 600nM의 화합물 1에 대한 평균 정상 상태 최저 농도를 초래하는 양으로, 투약 횟수로, 및 기간 동안 투여함으로써 개체에서 혈관신생을 억제하는 것; 30 내지 300㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 개체에 매일 경구 투여함으로써 혈관신생 억제를 필요로 하는 개체에서 혈관신생을 억제하는 것; 개체에 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을, 40 내지 600nM의 화합물 1에 대한 평균 정상 상태 최저 농도를 초래하는 양으로, 투약 횟수로, 및 기간 동안 투여함으로써 개체에서 BCR-ABL-발현 세포의 증식을 억제하는 것; 세포들을 저항성 서브클론의 발생을 억제하기에 충분한 양의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염과 접촉시킴으로써, BCR-ABL-발현 세포들의 증식을 억제하면서 저항성 서브클론의 발생을 억제하는 것; BCR-ABL-발현 세포들의 증식을 억제하면서 복합 돌연변이의 발생을 억제하는 것으로서, 세포들을 복합 돌연변이의 발생을 억제하기에 충분한 양의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염과 접촉시키는 것을 포함하는 방법; 30 내지 300㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 개체에 매일 경구 투여함으로써, BCR-ABL-발현 세포들 또는 이들의 돌연변이의 증식의 억제를 필요로 하는 개체에서 BCR-ABL-발현 세포들 또는 이들의 돌연변이의 증식을 억제하는 것; 또는 30 내지 300㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 개체에 매일 경구 투여함으로써, 돌연변이-발현 세포들의 증식의 억제를 필요로 하는 개체에서 돌연변이-발현 세포들의 증식을 억제하는 것을 포함한다.

본원에 기재된 양태들 중 임의의 양태에서, 단위 투여 형태에서의 화합물 1의 양 및 평균 1일 투여량은 보다 적은 투약(예컨대, 어린이의 경우에는 보다 적은 투약)으로 변경될 수 있다. 몇몇 구현예들에서, 단위 투여량은 5 내지 300㎎를 포함하거나, 평균 1일 투여량은 5 내지 300㎎이 된다. 특정 구현예들에서, 단위 투여 형태는 5 내지 100㎎, 5 내지 80㎎, 5 내지 50㎎, 5 내지 20㎎, 7 내지 100㎎, 7 내지 80㎎, 7 내지 50㎎, 7 내지 20㎎, 10 내지 100㎎, 10 내지 80㎎, 10 내지 50㎎, 15 내지 100㎎, 15 내지 80㎎, 15 내지 60㎎, 15㎎ 내지 50㎎, 20 내지 100㎎, 20 내지 80㎎, 20 내지 50㎎, 30 내지 100㎎, 35 내지 100㎎, 40 내지 100㎎, 50 내지 100㎎, 60 내지 100㎎, 70 내지 100㎎, 30 내지 80㎎, 35 내지 80㎎, 40 내지 80㎎, 50 내지 80㎎, 60 내지 80㎎, 50 내지 300㎎, 60 내지 300㎎, 70 내지 300㎎, 50 내지 200㎎, 60 내지 200㎎, 70 내지 200㎎, 100 내지 300㎎, 120 내지 300㎎, 140 내지 300㎎, 또는 100 내지 200㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 함유할 수 있다. 예시적인 단위 투여 형태들은 5±1㎎, 7±1.5㎎, 10±2㎎, 15±3㎎, 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 40±8㎎, 45±9㎎, 55±1 1㎎, 60±12㎎, 65±13㎎, 70±14㎎, 75±15㎎, 80±16㎎, 90±18㎎, 100±20㎎, 120±24㎎, 140±28㎎, 160±32㎎, 180±36㎎, 200±40㎎, 220±44㎎, 240±48㎎, 또는 260±52㎎의 화합물 1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 갖는 것들을 포함한다.

일 양태에서, 본 발명은 30 내지 300㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 단위 투여 형태로 경구 투여용으로 제조된 약제학적 조성물을 특징으로 한다. 특정 구현예들에서, 단위 투여 형태는 20 내지 100㎎, 20 내지 80㎎, 20 내지 50㎎, 30 내지 100㎎, 35 내지 100㎎, 40 내지 100㎎, 50 내지 100㎎, 60 내지 100㎎, 70 내지 100㎎, 30 내지 80㎎, 35 내지 80㎎, 40 내지 80㎎, 50 내지 80㎎, 60 내지 80㎎, 50 내지 300㎎, 60 내지 300㎎, 70 내지 300㎎, 50 내지 200㎎, 60 내지 200㎎, 70 내지 200㎎, 100 내지 300㎎, 120 내지 300㎎, 140 내지 300㎎, 또는 100 내지 200㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 함유할 수 있다. 특정 구현예들에서, 단위 투여 형태는 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 40±8㎎, 45±9㎎, 55±11㎎, 60±12㎎, 65±13㎎, 70±14㎎, 75±15㎎, 80±16㎎, 90±18㎎, 100±20㎎, 120±24㎎, 140±28㎎, 160±32㎎, 180±36㎎, 200±40㎎, 220±44㎎, 240±48㎎, 또는 260±52㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 함유할 수 있다. 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은, 예컨대 염산염일 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을, 40 내지 600nM의 화합물 1에 대한 평균 정상 상태 최저 농도를 초래하는 양으로, 투약 횟수로, 및 기간 동안 개체에 투여함으로써, 개체에서 암 세포들의 증식을 억제하는 방법을 특징으로 한다. 특정 구현예들에서, 화합물 1에 대한 평균 정상 상태 최저 농도는 40 내지 200nM, 50 내지 200nM, 60 내지 200nM, 70 내지 200nM, 80 내지 200nM, 90 내지 200nM, 40 내지 120nM, 50 내지 120nM, 60 내지 120nM, 70 내지 120nM, 80 내지 120nM, 200 내지 600nM, 220 내지 600nM, 240 내지 600nM, 250 내지 600nM, 270 내지 600nM, 280 내지 600nM, 200 내지 400nM, 200 내지 300nM, 250 내지 400nM, 300 내지 500nM, 350 내지 550nM, 400 내지 600nM, 또는 450 내지 600nM이다. 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은, 매 7일에 평균 4 내지 7회(예컨대, 1주일에 4회, 1주일에 5회, 1주일에 6회, 또는 1주일에 7회) 개체에 투여될 수 있다. 특정 구현예들에서, 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은, 개체에 매일 투여된다. 특정 구현예들에서, 평균 1일 투여량인 30 내지 300㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은, 단위 투여 형태로(예컨대, 20 내지 100㎎, 20 내지 80㎎, 20 내지 50㎎, 30 내지 100㎎, 35 내지 100㎎, 40 내지 100㎎, 50 내지 100㎎, 60 내지 100㎎, 70 내지 100㎎, 30 내지 80㎎, 35 내지 80㎎, 40 내지 80㎎, 50 내지 80㎎, 60 내지 80㎎, 50 내지 300㎎, 60 내지 300㎎, 70 내지 300㎎, 50 내지 200㎎, 60 내지 200㎎, 70 내지 200㎎, 100 내지 300㎎, 120 내지 300㎎, 140 내지 300㎎, 또는 100 내지 200㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 평균 1일 투여량; 또는 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 40±8㎎, 45±9㎎, 55±11㎎, 60±12㎎, 65±13㎎, 70±14㎎, 75±15㎎, 80±16㎎, 90±18㎎, 100±20㎎, 120±24㎎, 140±28㎎, 160±32㎎, 180±36㎎, 200±40㎎, 220±44㎎, 240±48㎎, 또는 260±52㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 평균 1일 투여량) 개체에 경구 투여된다. 특정 구현예들에서, 개체는 위암, 자궁내막암, 방광암, 다발성 골수종, 유방암, 또는 본원에 기재된 임의의 다른 암을 지닌다. 다른 구현예들에서, 개체는 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 또는 급성 골수성 백혈병을 지닌다. 또한 다른 구현예들에서, 개체는 골수이형성증후군(예컨대, 아세포 그룹 1(RAEBI)이 과잉된 불응성 빈혈 또는 아세포 그룹 2(RAEBII)가 과잉된 불응성 빈혈)을 지닌다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 30 내지 300㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 개체에 매일 경구 투여함으로써, 암 세포들의 증식의 억제를 필요로 하는 개체에서 암 세포들의 증식을 억제하는 방법을 특징으로 한다. 특정 구현예들에서, 20 내지 100㎎, 20 내지 80㎎, 20 내지 50㎎, 30 내지 100㎎, 35 내지 100㎎, 40 내지 100㎎, 50 내지 100㎎, 60 내지 100㎎, 70 내지 100㎎, 30 내지 80㎎, 35 내지 80㎎, 40 내지 80㎎, 50 내지 80㎎, 60 내지 80㎎, 50 내지 300㎎, 60 내지 300㎎, 70 내지 300㎎, 50 내지 200㎎, 60 내지 200㎎, 70 내지 200㎎, 100 내지 300㎎, 120 내지 300㎎, 140 내지 300㎎, 또는 100 내지 200㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 개체에 매일 경구 투여된다. 특정 구현예들에서 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 40±8㎎, 45±9㎎, 55±11㎎, 60±12㎎, 65±13㎎, 70±14㎎, 75±15㎎, 80±16㎎, 90±18㎎, 100±20㎎, 120±24㎎, 140±28㎎, 160±32㎎, 180±36㎎, 200±40㎎, 220±44㎎, 240±48㎎, 또는 260±52㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 개체에 매일 경구 투여된다. 특정 구현예들에서, 개체는 위암, 자궁내막암, 방광암, 다발성 골수종, 유방암, 또는 본원에 기재된 임의의 다른 암을 지닌다. 다른 구현예들에서, 개체는 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 또는 급성 골수성 백혈병을 지닌다. 또한 다른 구현예들에서, 개체는 골수이형성증후군(예컨대, 아세포 그룹 1(RAEBI)이 과잉된 불응성 빈혈 또는 아세포 그룹 2(RAEBII)가 과잉된 불응성 빈혈)을 지닌다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을, 40 내지 600nM의 화합물 1에 대한 평균 정상 상태 최저 농도를 초래하는 양으로, 투약 횟수로, 및 기간 동안 개체에 투여함으로써 개체에서 혈관신생을 억제하는 방법을 특징으로 한다. 특정 구현예들에서, 화합물 1에 대한 평균 정상 상태 최저 농도는 40 내지 200nM, 50 내지 200nM, 60 내지 200nM, 70 내지 200nM, 80 내지 200nM, 90 내지 200nM, 40 내지 120nM, 50 내지 120nM, 60 내지 120nM, 70 내지 120nM, 80 내지 120nM, 200 내지 600nM, 220 내지 600nM, 240 내지 600nM, 250 내지 600nM, 270 내지 600nM, 280 내지 600nM, 200 내지 400nM, 200 내지 300nM, 250 내지 400nM, 300 내지 500nM, 350 내지 550nM, 400 내지 600nM, 또는 450 내지 600nM이다. 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은, 매 7일에 평균 4 내지 7회(예컨대, 1주일에 4회, 1주일에 5회, 1주일에 6회, 또는 1주일에 7회) 개체에 투여될 수 있다. 특정 구현예들에서, 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은, 개체에 매일 투여된다. 특정 구현예들에서, 평균 1일 투여량인 30 내지 300㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은, 단위 투여 형태로(예컨대, 20 내지 100㎎, 20 내지 80㎎, 20 내지 50㎎, 30 내지 100㎎, 35 내지 100㎎, 40 내지 100㎎, 50 내지 100㎎, 60 내지 100㎎, 70 내지 100㎎, 30 내지 80㎎, 35 내지 80㎎, 40 내지 80㎎, 50 내지 80㎎, 60 내지 80㎎, 50 내지 300㎎, 60 내지 300㎎, 70 내지 300㎎, 50 내지 200㎎, 60 내지 200㎎, 70 내지 200㎎, 100 내지 300㎎, 120 내지 300㎎, 140 내지 300㎎, 또는 100 내지 200㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 평균 1일 투여량; 또는 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 40±8㎎, 45±9㎎, 55±11㎎, 60±12㎎, 65±13㎎, 70±14㎎, 75±15㎎, 80±16㎎, 90±18㎎, 100±20㎎, 120±24㎎, 140±28㎎, 160±32㎎, 180±36㎎, 200±40㎎, 220 + 44㎎, 240±48㎎, 또는 260±52㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 평균 1일 투여량) 개체에 경구 투여된다. 특정 구현예들에서, 개체는 전립선암, 폐암, 유방암, 대장암, 신장암, 또는 교모세포종을 지닌다. 또한 다른 구현예들에서, 개체는 VEGF 또는 VEGF-R 억제제 또는 길항제(예컨대, 베바시주맙, 소라페닙, 또는 수니티닙)으로 치료하기 어려운 고형암을 지닌다. 또한 다른 구현예들에서, 개체는 VEGF 또는 VEGF-R 억제제 또는 길항제(예컨대, 베바시주맙, 소라페닙, 또는 수니티닙)를 이용한 치료를 받아들이지 않는 고형암을 지닌다. 특정 구현예들에서, 개체는 비정상적 혈관신생과 관련된 질환, 예컨대 당뇨망막병증, 류마티스 관절염, 건선, 죽상동맥경화증, 만성염증, 비만, 황반변성, 또는 심혈관계 질병에 결려 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 30 내지 300㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 개체에 매일 경구 투여함으로써, 혈관신생의 억제를 필요로 하는 개체에서 혈관신생을 억제하는 방법을 특징으로 한다. 특정 구현예들에서, 20 내지 100㎎, 20 내지 80㎎, 20 내지 50㎎, 30 내지 100㎎, 35 내지 100㎎, 40 내지 100㎎, 50 내지 100㎎, 60 내지 100㎎, 70 내지 100㎎, 30 내지 80㎎, 35 내지 80㎎, 40 내지 80㎎, 50 내지 80㎎, 60 내지 80㎎, 50 내지 300㎎, 60 내지 300㎎, 70 내지 300㎎, 50 내지 200㎎, 60 내지 200㎎, 70 내지 200㎎, 100 내지 300㎎, 120 내지 300㎎, 140 내지 300㎎, 또는 100 내지 200㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이, 개체에 매일 경구 투여된다. 특정 구현예들에서, 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 40±8㎎, 45±9㎎, 55±11㎎, 60±12㎎, 65±13㎎, 70±14㎎, 75±15㎎, 80±16㎎, 90±18㎎, 100±20㎎, 120±24㎎, 140±28㎎, 160±32㎎, 180±36㎎, 200±40㎎, 220±44㎎, 240±48㎎, 또는 260±52㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 개체에 매일 경구 투여된다. 특정 구현예들에서, 개체는 전립선암, 폐암, 유방암, 대장암, 신장암, 또는 교모세포종을 지닌다. 또한 다른 구현예들에서, 개체는 VEGF 또는 VEGF-억제제 또는 길항제(예컨대, 베바시주맙, 소라페닙, 또는 수니티닙)으로 치료하기 어려운 고형암을 지닌다. 또한 다른 구현예들에서, 개체는 VEGF 또는 VEGF-R 억제제 또는 길항제(예컨대, 베바시주맙, 소라페닙, 또는 수니티닙)를 이용한 치료를 받아들이지 않는 고형암을 지닌다. 특정 구현예들에서, 개체는 비정상적 혈관신생과 관련된 질환, 예컨대 당뇨망막병증, 류마티스 관절염, 건선, 죽상동맥경화증, 만성염증, 비만, 황반변성, 또는 심혈관계 질병을 지닌다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 (i) 30 내지 300㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함한 단위 투여 형태로 경구 투여용으로 제조되는 약제학적 조성물, 및 (ii) 암의 치료를 위해 또는 비정상적 혈관신생과 관련된 질환의 치료를 위해 개체에 약제학적 조성물을 투여하기 위한 설명서를 포함하는 키트를 특징으로 한다. 특정 구현예들에서, 단위 투여 형태는 20 내지 100㎎, 20 내지 80㎎, 20 내지 50㎎, 30 내지 100㎎, 35 내지 100㎎, 40 내지 100㎎, 50 내지 100㎎, 60 내지 100㎎, 70 내지 100㎎, 30 내지 80㎎, 35 내지 80㎎, 40 내지 80㎎, 50 내지 80㎎, 60 내지 80㎎, 50 내지 300㎎, 60 내지 300㎎, 70 내지 300㎎, 50 내지 200㎎, 60 내지 200㎎, 70 내지 200㎎, 100 내지 300㎎, 120 내지 300㎎, 140 내지 300㎎, 또는 100 내지 200㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 함유할 수 있다. 특정 구현예들에서, 단위 투여 형태는 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 40±8㎎, 45±9㎎, 55±11㎎, 60±12㎎, 65±13㎎, 70±14㎎, 75±15㎎, 80±16㎎, 90±18㎎, 100±20㎎, 120±24㎎, 140±28㎎, 160±32㎎, 180±36㎎, 200±40㎎, 220±44㎎, 240±48㎎, 또는 260±52㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 함유할 수 있다. 특정 구현예들에서, 개체는 위암, 자궁내막암, 방광암, 다발성 골수종, 유방암, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 또는 골수이형성증후군(예컨대, 아세포 그룹 1(RAEBI)이 과잉된 불응성 빈혈 또는 아세포 그룹 2(RAEBII)가 과잉된 불응성 빈혈), 또는 본원에 기재된 임의의 다른 암을 지닌다. 특정 구현예들에서, 개체는 당뇨망막병증, 류마티스 관절염, 건선, 죽상동맥경화증, 만성염증, 비만, 황반변성, 또는 심혈관계 질병을 지닌다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 40 내지 600nM의 화합물 1에 대한 평균 정상 상태 최저 농도를 초래하는 양으로, 투약 횟수로, 및 기간 동안 개체에 투여함으로써, 개체에서 BCR-ABL-발현 세포들의 증식을 억제하는 방법을 특징으로 한다. 특정 구현예들에서, 화합물 1에 대한 평균 정상 상태 최저 농도는 40 내지 200nM, 50 내지 200nM, 60 내지 200nM, 70 내지 200nM, 80 내지 200nM, 90 내지 200nM, 40 내지 120nM, 50 내지 120nM, 60 내지 120nM, 70 내지 120nM, 80 내지 120nM, 200 내지 600nM, 220 내지 600nM, 240 내지 600nM, 250 내지 600nM, 270 내지 600nM, 280 내지 600nM, 200 내지 400nM, 200 내지 300nM, 250 내지 400nM, 300 내지 500nM, 350 내지 550nM, 400 내지 600nM, 또는 450 내지 600nM이다. 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은, 저항성 서브클론의 발생을 억제하기에 충분한 양으로 투여될 수 있거나, 복합 돌연변이의 발생을 억제하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은, 매 7일에 평균 4 내지 7회(예컨대, 1주일에 4회, 1주일에 5회, 1주일에 6회, 또는 1주일에 7회), 및 2주, 1개월, 2개월, 4개월, 8개월, 1년, 또는 18개월의 연속적인 치료를 포함한 기간 동안 개체에 투여될 수 있다. 특정 구현예들에서, 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은, 개체에 매일 투여된다. 특정 구현예들에서, 평균 1일 투여량인 30 내지 300㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은, 단위 투여 형태로(예컨대, 20 내지 100㎎, 20 내지 80㎎, 20 내지 50㎎, 30 내지 100㎎, 35 내지 100㎎, 40 내지 100㎎, 50 내지 100㎎, 60 내지 100㎎, 70 내지 100㎎, 30 내지 80㎎, 35 내지 80㎎, 40 내지 80㎎, 50 내지 80㎎, 60 내지 80㎎, 50 내지 300㎎, 60 내지 300㎎, 70 내지 300㎎, 50 내지 200㎎, 60 내지 200㎎, 70 내지 200㎎, 100 내지 300㎎, 120 내지 300㎎, 140 내지 300㎎, 또는 100 내지 200㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 평균 1일 투여량; 또는 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 40±8㎎, 45±9㎎, 55±11㎎, 60±12㎎, 65±13㎎, 70±14㎎, 75±15㎎, 80±16㎎, 90±18㎎, 100±20㎎, 120±24㎎, 140±28㎎, 160±32㎎, 180±36㎎, 200±40㎎, 220±44㎎, 240±48㎎, 또는 260±52㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 평균 1일 투여량) 개체에 경구 투여된다. 특정 구현예들에서, 개체는 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 또는 급성 골수성 백혈병으로부터 선택된 질환을 지닌다. 또한 다른 구현예들에서, 질환은 화합물 1 외의 키나아제 억제제로 치료하기 어렵다(예컨대, 질환은 이마티닙, 닐로티닙, 또는 다사티닙으로 치료하기 어렵다). 또한 다른 구현예들에서, 개체는 VEGF 또는 VEGF-R 억제제 또는 길항제(예컨대, 베바시주맙, 소라페닙, 또는 수니티닙)를 이용한 치료를 받아들이지 않는 고형암을 지닌다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 세포들을 저항성 서브클론의 발생을 억제하기에 충분한 양의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염과 접촉시킴으로써, BCR-ABL-발현 세포들의 증식을 억제하면서 저항성 서브클론의 발생을 억제하는 방법을 특징으로 한다. 세포들은 20nM 내지 320nM, 30nM 내지 320nM, 20nM 내지 220nM, 30nM 내지 220nM, 20nM 내지 120nM, 30nM 내지 120nM, 40nM 내지 320nM, 40nM 내지 220nM, 40nM 내지 120nM, 50nM 내지 320nM, 50nM 내지 220nM, 50nM 내지 120nM, 70nM 내지 320nM, 70nM 내지 220nM, 90nM 내지 320nM, 90nM 내지 220nM, 110nM 내지 320nM, 또는 110nM 내지 220nM의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염과 접촉될 수 있다. 세포들은 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염과, 2주, 1개월, 2개월, 4개월, 8개월, 1년, 또는 18개월의 연속적인 노출을 포함한 기간 동안 접촉될 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 BCR-ABL-발현 세포들의 증식을 억제하면서 복합 돌연변이의 발생을 억제하는 방법을 추가로 특징으로 하며, 상기 방법은 세포들을 복합 돌연변이의 발생을 억제하기에 충분한 양의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염과 접촉시키는 것을 포함한다. 세포들은 160nM 내지 1μΜ, 260nM 내지 1μM, 360nM 내지 1μM, 160nM 내지 800nM, 260nM 내지 800nM, 360nM 내지 800nM, 160nM 내지 600nM, 260nM 내지 600nM, 360nM 내지 600nM, 160nM 내지 400nM, 260nM 내지 400nM, 360nM 내지 500nM, 또는 460nM 내지 600nM의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염과 접촉될 수 있다. 세포들은 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염과, 2주, 1개월, 2개월, 4개월, 8개월, 1년, 또는 18개월의 연속적인 노출을 포함한 기간 동안 접촉될 수 있다.

상기 방법들 중 임의의 방법에서, 세포들은 화합물 1 외의 키나아제 억제제로 치료하기 어려울 수 있다(예컨대, 이마티닙, 닐로티닙, 또는 다사티닙으로 치료하기 어렵다). 상기 방법들 중 임의의 방법에서, 세포들은 VEGF 또는 VEGF-R 억제제 또는 길항제(예컨대, 베바시주맙, 소라페닙, 또는 수니티닙)을 이용한 치료를 받아들이지 않을 수 있다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 30 내지 300㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 개체에 매일 경구 투여함으로써, BCR-ABL-발현 세포들 또는 이들의 돌연변이의 증식의 억제를 필요로 하는 개체에서 BCR-ABL-발현 세포들 또는 이들의 돌연변이의 증식을 억제하는 방법을 특징으로 한다. 특정 구현예들에서, 20 내지 100㎎, 20 내지 80㎎, 20 내지 50㎎, 30 내지 100㎎, 35 내지 100㎎, 40 내지 100㎎, 50 내지 100㎎, 60 내지 100㎎, 70 내지 100㎎, 30 내지 80㎎, 35 내지 80㎎, 40 내지 80㎎, 50 내지 80㎎, 60 내지 80㎎, 50 내지 300㎎, 60 내지 300㎎, 70 내지 300㎎, 50 내지 200㎎, 60 내지 200㎎, 70 내지 200㎎, 100 내지 300㎎, 120 내지 300㎎, 140 내지 300㎎, 또는 100 내지 200㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 개체에 매일 경구 투여된다. 특정 구현예들에서, 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 40±8㎎, 45±9㎎, 55±11㎎, 60±12㎎, 65±13㎎, 70±14㎎, 75±15㎎, 80±16㎎, 90±18㎎, 100±20㎎, 120±24㎎, 140±28㎎, 160±32㎎, 180±36㎎, 200±40㎎, 220±44㎎, 240±48㎎, 또는 260±52㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 개체에 매일 경구 투여된다. 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은, 저항성 서브클론의 발생을 억제하기에 충분한 양으로 투여될 수 있거나, 복합 돌연변이의 발생을 억제하기에 충분한 양으로 투여될 수 있다. 특정 구현예들에서, 개체는 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 또는 급성 골수성 백혈병으로부터 선택된 질환을 지닌다. 또한 다른 구현예들에서, 질환은 화합물 1 외의 키나아제 억제제로 치료하기 어렵다(예컨대, 질환이 이마티닙, 닐로티닙, 또는 다사티닙으로 치료하기 어렵다). 또한 다른 구현예들에서, 질환은 화합물 1 외의 키나아제 억제제를 이용한 치료를 받아들이지 않는다(예컨대, 질환이 이마티닙, 닐로티닙, 또는 다사티닙을 이용한 치료를 받아들이지 않는다). 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은, 매 7일에 평균 4 내지 7회(예컨대, 1주일에 4회, 1주일에 5회, 1주일에 6회, 또는 1주일에 7회), 및 2주, 1개월, 2개월, 4개월, 8개월, 1년, 또는 18개월의 연속적인 치료를 포함한 기간 동안 개체에 투여될 수 있다. 특정 구현예들에서, 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은, 개체에 매일 투여된다.

또 다른 양태에서, 본 발명은 (i) 30 내지 300㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 단위 투여 형태로 경구 투여용으로 제조된 약제학적 조성물, 및 (ii) BCR-ABL-발현 세포들의 증식과 관련된 질환으로 고통받는 개체에 약제학적 조성물을 투여하기 위한 설명서를 포함하는 키트를 특징으로 한다. 특정 구현예들에서, 단위 투여 형태는 20 내지 100㎎, 20 내지 80㎎, 20 내지 50㎎, 30 내지 100㎎, 35 내지 100㎎, 40 내지 100㎎, 50 내지 100㎎, 60 내지 100㎎, 70 내지 100㎎, 30 내지 80㎎, 35 내지 80㎎, 40 내지 80㎎, 50 내지 80㎎, 60 내지 80㎎, 50 내지 300㎎, 60 내지 300㎎, 70 내지 300㎎, 50 내지 200㎎, 60 내지 200㎎, 70 내지 200㎎, 100 내지 300㎎, 120 내지 300㎎, 140 내지 300㎎, 또는 100 내지 200㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 함유할 수 있다. 특정 구현예들에서, 단위 투여 형태는 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 40±8㎎, 45±9㎎, 55±1 1㎎, 60±12㎎, 65±13㎎, 70±14㎎, 75±15㎎, 80±16㎎, 90±18㎎, 100±20㎎, 120±24㎎, 140±28㎎, 160±32㎎, 180±36㎎, 200±40㎎, 220±44㎎, 240±48㎎, 또는 260±52㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 함유할 수 있다. 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은, 예컨대 염산염일 수 있다. 특정 구현예들에서, 개체는 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 또는 급성 골수성 백혈병으로부터 선택된 질환을 지닌다. 또한 다른 구현예들에서, 질환은 화합물 1 외의 키나아제 억제제로 치료하기 어렵다(예컨대, 질환은 이마티닙, 닐로티닙, 또는 다사티닙으로 치료하기 어렵다). 또한 다른 구현예들에서, 질환은 화합물 1 외의 키나아제 억제제를 이용한 치료를 받아들이지 않는다(예컨대, 질환은 이마티닙, 닐로티닙, 또는 다사티닙을 이용한 치료를 받아들이지 않는다).

또 다른 양태에서, 본 발명은 30 내지 300㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 개체에 매일 경구 투여함으로써, 돌연변이-발현 세포들의 증식의 억제를 필요로 하는 개체에서 돌연변이-발현 세포들의 증식을 억제하는 방법을 특징으로 한다. 특정 구현예들에서, 20 내지 100㎎, 20 내지 80㎎, 20 내지 50㎎, 30 내지 100㎎, 35 내지 100㎎, 40 내지 100㎎, 50 내지 100㎎, 60 내지 100㎎, 70 내지 100㎎, 30 내지 80㎎, 35 내지 80㎎, 40 내지 80㎎, 50 내지 80㎎, 60 내지 80㎎, 50 내지 300㎎, 60 내지 300㎎, 70 내지 300㎎, 50 내지 200㎎, 60 내지 200㎎, 70 내지 200㎎, 100 내지 300㎎, 120 내지 300㎎, 140 내지 300㎎, 또는 100 내지 200㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은, 개체에 매일 경구 투여된다. 특정 구현예들에서, 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 40±8㎎, 45±9㎎, 55±11㎎, 60±12㎎, 65±13㎎, 70±14㎎, 75±15㎎, 80±16㎎, 90±18㎎, 100±20㎎, 120±24㎎, 140±28㎎, 160±32㎎, 180±36㎎, 200±40㎎, 220±44㎎, 240±48㎎, 또는 260±52㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 개체에 매일 경구 투여된다. 특정 구현예들에서, 돌연변이는 FLT3 돌연변이(예컨대, FLT3-ITD), 키트 돌연변이(예컨대, c-KIT 또는 N822K), FGFR 돌연변이(예컨대, FGFR1OP2-FGFR1), PDGFRα 돌연변이(예컨대, F1P1L1-PDGFRα), 또는 본원에 기재된 임의의 돌연변이이다. 다른 구현예들에서, 개체는 급성 골수성 백혈병 또는 골수이형성증후군(예컨대, 아세포 그룹 1(RAEBI)이 과잉된 불응성 빈혈 또는 아세포 그룹 2(RAEBII)가 과잉된 불응성 빈혈)을 지닌다. 또한 다른 구현예들에서, 질환은 화합물 1 외의 키나아제 억제제로 치료하기 어렵다(예컨대, 질환은 이마티닙, 닐로티닙, 또는 다사티닙으로 치료하기 어렵다). 또한 다른 구현예들에서, 질환은 화합물 1 외의 키나아제 억제제를 이용한 치료를 받아들이지 않는다(예컨대, 질환은 이마티닙, 닐로티닙, 또는 다사티닙을 이용한 치료를 받아들이지 않는다). 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은, 매 7일에 평균 4 내지 7회(예컨대, 1주일에 4회, 1주일에 5회, 1주일에 6회, 또는 1주일에 7회), 및 2주, 1개월, 2개월, 4개월, 8개월, 1년, 또는 18개월의 연속적인 치료를 포함한 기간 동안 개체에 투여될 수 있다. 특정 구현예들에서, 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 개체에 매일 투여된다.

일 양태에서, 본 발명은 개체 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 mTOR 억제제와 함께 또는 동시에 각각 함께 암을 치료하기에 유효한 양으로 개체에 투여함으로써, 암의 치료를 필요로 하는 개체에서 암을 치료하는 방법을 특징으로 한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 또한 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을, mTOR 억제제와 함께 또는 동시에, 각각 함께 종양을 치료하기에 유효한 양으로 개체에 투여함으로써, 종양의 치료를 필요로 하는 개체에서 종양을 치료하는 방법을 특징으로 한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 추가로 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 mTOR 억제제와 함께 또는 동시에, 각각 함께 혈관신생을 억제하기에 유효한 양으로 개체에 투여함으로써, 혈관신생의 억제를 필요로 하는 개체에서 혈관신생을 억제하는 방법을 특징으로 한다. 또 다른 양태에서, 본 발명은 세포들과 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 mTOR 억제제와 함께 또는 동시에 각각 함께 증식을 억제하기에 충분한 양으로 접촉시킴으로써, 세포들의 증식을 억제하는 방법을 특징으로 한다.

상기 양태들 중 임의의 양태에서, mTOR 억제제는 시롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, 바이롤리무스, 조타롤리무스, 및 이들의 약제학적으로 허용가능한 염으로부터 선택되는 라파마이신 매크로라이드이다. 바람직하게, mTOR 억제제는 리다포롤리무스 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다. 다른 구현예들에서, mTOR 억제제는 LY294002, Pp242, WYE-354, Ku-0063794, XL765, AZD8055, NVP-BEZ235, OSI-027, 보르트만닌, 퀘르세틴, 마이리세틴, 스타우로스포린, 및 이들의 약제학적으로 허용가능한 염으로부터 선택되는 비-라파마이신 유사체이다.

병용 요법은 식이요법을 포함할 수 있으며, 여기서 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 mTOR 억제제는 서로 12일, 8일, 5일, 4일, 3일, 또는 2일 이내에 동시에 투여되거나; 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 mTOR 억제제는 서로 24시간 이내에 동시에 투여되거나; 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 mTOR 억제제는 함께 투여된다. 화합물 1 및 mTOR 억제제는 본원에 기재된 임의의 식이요법을 사용하여 본 발명의 병용 요법과 같이 투여될 수 있다.

특정 구현예들에서, 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은, 적은 투여량으로 투여되거나; mTOR 억제제가 적은 투여량으로 투여되거나; 화합물 1 및 mTOR 억제제가 모두 적은 투여량으로 투여된다.

특정 구현예들에서, 병용 요법은 40 내지 600nM의 화합물 1에 대한 평균 정상 상태 최저 농도를 초래하는 양으로, 투약 횟수로, 및 기간 동안 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 개체에 투여하는 것을 포함한다. 예컨대, 화합물 1에 대한 평균 정상 상태 최저 농도는 10 내지 100nM, 10 내지 60nM, 15 내지 100nM, 15 내지 70nM, 20 내지 100nM, 40 내지 200nM, 50 내지 200nM, 60 내지 200nM, 70 내지 200nM, 80 내지 200nM, 90 내지 200nM, 40 내지 120nM, 50 내지 120nM, 60 내지 120nM, 70 내지 120nM, 80 내지 120nM, 200 내지 600nM, 220 내지 600nM, 240 내지 600nM, 250 내지 600nM, 270 내지 600nM, 280 내지 600nM, 200 내지 400nM, 200 내지 300nM, 250 내지 400nM, 300 내지 500nM, 350 내지 550nM, 400 내지 600nM, 또는 450 내지 600nM일 수 있다. 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은, 매 7일에 평균 4 내지 7회(예컨대, 1주일에 4회, 1주일에 5회, 1주일에 6회, 또는 1주일에 7회) 개체에 투여될 수 있다. 특정 구현예들에서, 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염은 개체에 매일 투여된다. 특정 구현예들에서, 30 내지 300㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 평균 1일 투여량은, 단위 투여 형태로(예컨대, 10 내지 70㎎, 10 내지 50㎎, 10 내지 30㎎, 20 내지 100㎎, 20 내지 80㎎, 20 내지 50㎎, 30 내지 100㎎, 35 내지 100㎎, 40 내지 100㎎, 50 내지 100㎎, 60 내지 100㎎, 70 내지 100㎎, 30 내지 80㎎, 35 내지 80㎎, 40 내지 80㎎, 50 내지 80㎎, 60 내지 80㎎, 50 내지 300㎎, 60 내지 300㎎, 70 내지 300㎎, 50 내지 200㎎, 60 내지 200㎎, 70 내지 200㎎, 100 내지 300㎎, 120 내지 300㎎, 140 내지 300㎎, 또는 100 내지 200㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 평균 1일 투여량; 또는 7±1.5㎎, 10±2㎎, 15±3㎎, 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 40±8㎎, 45±9㎎, 55±11㎎, 60±12㎎, 65±13㎎, 70±14㎎, 75±15㎎, 80±16㎎, 90±18㎎, 100±20㎎, 120±24㎎, 140±28㎎, 160±32㎎, 180±36㎎, 200±40㎎, 220±44㎎, 240±48㎎, 또는 260±52㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염의 평균 1일 투여량) 개체에 경구 투여된다.

본 발명의 병용 요법은 방광, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 두경부, 담낭, 난소, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선, 전립선, 또는 피부; 편평세포암종; 자궁내막암; 다발성 골수종; 림프 계열의 조혈 종양(예컨대, 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포-림프종, 호지킨(Hodgkin's) 림프종, 비-호지킨 림프종, 모발성 세포 림프종, 또는 버킷(Burkitt's) 림프종); 골수 계열의 조혈 종양(예컨대, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 다발성 골수성 백혈병, 골수이형성증후군, 또는 전골수구성 백혈병); 중배엽성의 종양(예컨대, 섬유육종 또는 횡문근육종); 중추 또는 말초 신경계의 종양(예컨대, 성상세포종, 신경아세포종, 신경교종, 또는 신경초종); 흑색종; 정상피종; 기형암종; 골육종; 또는 카포시육종의 암종이 있는 개체를 치료하는데 사용될 수 있다. 특정 구현예들에서, 개체는 비소세포 폐암, 유방암, 난소암, 방광암, 전립선암, 침샘암, 췌장암, 자궁내막암, 대장암, 신장암, 두경부암, 위암, 다발성 골수종, 갑상선여포암, 또는 다형성교모세포종을 지닌다.

본 발명의 병용 요법은 비정상적 혈관신생과 관련된 질환에 걸린 개체를 치료하는데 사용될 수 있다. 비정상적 혈관신생과 관련된 질환은 고형종양 (예컨대, 전립선암, 폐암, 유방암, 대장암, 신장암, 교모세포종, 또는 본원에 기재된 임의의 고형종양), 당뇨망막병증, 류마티스 관절염, 건선, 죽상동맥경화증, 만성염증, 비만, 황반변성, 또는 심혈관계 질병일 수 있다.

관련 앙태에서, 본 발명은 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, mTOR 억제제, 및 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 희석제를 포함하는 약제학적 조성물을 특징으로 한다. 특정 구현예들에서, mTOR 억제제는 시롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, 바이롤리무스, 조타롤리무스, 및 이들의 약제학적으로 허용가능한 염으로부터 선택되는 라파마이신 매크로라이드이다. 바람직하게, mTOR 억제제는 리다포롤리무스 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이다. 다른 구현예들에서, mTOR 억제제는 LY294002, Pp242, WYE-354, Ku-0063794, XL765, AZD8055, NVP-BEZ235, OSI-027, 보르트만닌, 퀘르세틴, 마이리세틴, 스타우로스포린, 및 이들의 약제학적으로 허용가능한 염으로부터 선택된 비-라파마이신 유사체이다.

본 발명은 추가로 (i) 30 내지 300㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 포함하는 단위 투여 형태로 경구 투여용으로 제조된 제 1 약제학적 조성물, 및 (ii) mTOR 억제제를 포함하는 제 2 약제학적 조성물을 포함하는 키트를 특징으로 하며, 여기서 상기 제 1 약제학적 조성물 및 제 2 약제학적 조성물은 개별 투여량으로 별도로 제조된다.

본 발명은 또한 30 내지 300㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 mTOR 억제제를 포함하는 단위 투여 형태로 경구 투여용으로 제조된 약제학적 조성물을 포함하는 키트를 특징으로 한다.

상기 키트들의 특정 구현예들에서, 단위 투여 형태는 10 내지 70㎎, 10 내지 50㎎, 10 내지 30㎎, 20 내지 100㎎, 20 내지 80㎎, 20 내지 50㎎, 30 내지 100㎎, 35 내지 100㎎, 40 내지 100㎎, 50 내지 100㎎, 60 내지 100㎎, 70 내지 100㎎, 30 내지 80㎎, 35 내지 80㎎, 40 내지 80㎎, 50 내지 80㎎, 60 내지 80㎎, 50 내지 300㎎, 60 내지 300㎎, 70 내지 300㎎, 50 내지 200㎎, 60 내지 200㎎, 70 내지 200㎎, 100 내지 300㎎, 120 내지 300㎎, 140 내지 300㎎, 또는 100 내지 200㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 함유할 수 있다. 특정 구현예들에서, 단위 투여 형태는 7±1.5㎎, 10±2㎎, 15±3㎎, 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 40±8㎎, 45±9㎎, 55±11㎎, 60±12㎎, 65±13㎎, 70±14㎎, 75±15㎎, 80±16㎎, 90±18㎎, 100±20㎎, 120±24㎎, 140±28㎎, 160±32㎎, 180±36㎎, 200±40㎎, 220±44㎎, 240±48㎎, 또는 260±52㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 함유할 수 있다.

상기 키트들의 특정 구현예들에서, mTOR 억제제는 시롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, 바이롤리무스, 조타롤리무스, 및 이들의 약제학적으로 허용가능한 염으로부터 선택되는 라파마이신 매크로라이드이다. 상기 키트들의 다른 구현예들에서, mTOR 억제제는 LY294002, Pp242, WYE-354, Ku-0063794, XL765, AZD8055, NVP-BEZ235, OSI-027, 보르트만닌, 퀘르세틴, 마이리세틴, 스타우로스포린, 및 이들의 약제학적으로 허용가능한 염으로부터 선택되는 비-라파마이신 유사체이다.

본 발명의 키트들은 추가로, 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 mTOR 억제제를 암을 치료하기 위한 개체에(예컨대, 방광, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 두경부, 담낭, 난소, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선, 전립선, 또는 피부; 편평세포암종; 자궁내막암; 다발성 골수종; 림프 계열의 조혈 종양(예컨대, 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포-림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 모발성 세포 림프종, 또는 버킷 림프종); 골수 계열의 조혈 종양(예컨대, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 다발성 골수성 백혈병, 골수이형성증후군, 또는 전골수구성 백혈병); 중배엽성의 종양(예컨대, 섬유육종 또는 횡문근육종); 중추 또는 말초 신경계의 종양(예컨대, 성상세포종, 신경아세포종, 신경교종, 또는 신경초종); 흑색종; 정상피종; 기형암종; 골육종; 또는 카포시육종의 암종에 걸린 개체) 또는 비정상적 혈관신생과 관련된 질환(예컨대, 고형종양, 당뇨망막병증, 류마티스 관절염, 건선, 죽상동맥경화증, 만성염증, 비만, 또는 황반변성)에 걸린 개체에 투여하기 위한 설명서를 포함할 수 있다.

본 발명의 방법들에서, 화합물 1 및 mTOR 억제제의 투여량 및 투여 횟수는 독립적으로 조절될 수 있다. 예컨대, 하나의 화합물이 매일 경구투여될 수 있는 반면, 두 번째 화합물은 하루에 한 번 정맥주사로 투여될 수 있다. 화합물들은 또한 한 번의 투여로 두 화합물을 모두 전달하도록 함께 제조될 수 있다.

투여될 mTOR 및 화합물 1의 예시적인 투여량은 장애의 유형 및 정도, 개체의 전반적인 건강상태, 선택된 mTOR 억제제의 치료지수, 및 이들의 투여 경로와 같은 변수들에 따라 다를 것이다. 본 발명의 임의의 특정 조합에 대한 투여량 및 투약 횟수를 최적화하기 위해 표준 임상 시험이 사용될 수 있을 것이다.

본 발명에 유용한 화합물들에는 본원에 기재된 것들의 이성질체, 예컨대 부분입체이성질체 및 거울이성질체, 이성질체들의 혼합물, 이들의 염을 포함한 이들의 약제학적으로 허용가능한 형태의 임의의 형태가 포함된다.

정의

본원에서 사용된 바와 같이, 용어 "BCR-ABL-발현 세포들"은 본래의 BCR-ABL, 저항성 서브클론, 또는 BCR-ABL의 복합 돌연변이 중 어느 하나를 발현하는 세포들을 나타낸다.

본원에서 사용되는 용어 "평균 정상 상태 최저 농도"는 정상 상태 약동학을 초래하기에 충분한 기간에 걸쳐(즉, 매일 투약한 23일의 기간) 투여된 본 발명의 치료법을 위한 투약 방법의 일부로서 개체들의 군에 대해 관찰된 화합물 1의 평균 혈장 농도를 나타내며, 여기서 평균 최저 농도는 식이요법에서 그 다음 예정된 투여 직전에(즉, 1시간 이내에) 모든 개체에 대한 평균 혈중(circulating) 농도이다(예컨대, 일일 식이요법의 경우, 최저 농도는 화합물 1의 투여 후 약 24시간 및 그 다음의 일일 투여 직전에 측정된다).

"복합 돌연변이의 발생을 억제하기에 충분한 양"은 BCR-ABL-발현 세포들의 증식을 억제하는데 필요한 화합물 1의 최소 농도에서 발생하는 복합 돌연변이의 발생 비율과 비교할 때, 시험관 내(in vitro) 또는 생체 내(in vivo)에서 복합 돌연변이의 발생을 어느 정도 감소시키는 화합물 1의 양을 의미한다.

"저항성 서브클론의 발생을 억제하는데 충분한 양"은 BCR-ABL-발현 세포들의 증식을 억제하는데 필요한 화합물 1의 최소 농도에서 발생하는 저항성 서브클론의 발생 비율과 비교할 때, 시험관 내 또는 생체 내에서 저항성 서브클론의 발생을 어느 정도 감소시키는 화합물 1의 양을 의미한다.

"BCR-ABL-발현 세포들의 증식을 억제하는 것"은 시험관 내 또는 생체 내에서 BCR-ABL-발현 세포들의 성장률을 어느 정도 침체시키거나, 정지시키거나, 후진시키는 것을 의미한다. 바람직하게, 세포 성장률의 측정에 적합한 어세이(예컨대, 본원에 기재된 세포 성장 어세이)를 사용하여 측정했을 때, 성장률의 침체(slowing)는 20% 이상, 30% 이상, 50% 이상, 또는 심지어 70% 이상이다.

"암 세포들의 증식을 억제하는 것"은 시험관 내 또는 생체 내에서 암 세포들의 성장률을 어느 정도 침체시키거나, 정지시키거나, 후진시키는 것을 의미한다. 바람직하게, 세포 성장률의 측정에 적합한 어세이(예컨대, 본원에 기재된 세포 성장 어세이)를 사용하여 측정했을 때, 성장률의 침체는 20% 이상, 30% 이상, 50% 이상, 또는 심지어 70% 이상이다.

"세포들의 증식을 억제하는 것"은 시험관 내 또는 생체 내에서 세포들의 성장률을 침체시키거나, 정지시키거나, 후진시키는 것을 의미한다. 바람직하게, 세포 성장률의 측정에 적합한 어세이(예컨대, 본원에 기재된 세포 성장 어세이)를 사용하여 측정했을 때, 성장률의 침체는 20% 이상, 30% 이상, 50% 이상, 또는 심지어 70% 이상이다.

용어 "투여(administration)" 또는 "투여하는 것(administering)"은 포유류에 약제학적 조성물의 투여를 제공하는 방법을 나타내며, 여기서 상기 방법은, 예컨대, 경구, 정맥주사, 복강 내, 동맥 내, 또는 근육 내 투여이다. 바람직한 투여 방법은 다양한 인자, 예컨대, 약제학적 조성물의 성분, 가능한 또는 실제의 질병 부위 및 질병의 중증도(severity)에 따라 다를 수 있다. 화합물 1은 일반적으로 경구로 투여될 것이지만, 본 발명의 방법들을 수행하는데 다른 투여 경로들이 유용할 수 있다.

용어 "단위 투여 형태"는 알약, 정제, 당의정, 경질 캡슐 또는 연질 캡슐과 같이 단일 투여로서 적합한 물리적으로 별개인 유닛들을 나타내며, 각각의 유닛은 예정된 양의 화합물 1을 함유한다.

본원에 사용되는 용어 "약제학적으로 허용가능한 염"은 제약 산업에 일반적으로 사용되는, 무독성 산 부가 염 또는 금속 착물과 같은 임의의 약제학적으로 허용가능한 염을 나타낸다. 산 부가 염의 예들에는 유기산, 예컨대 아세트산, 락트산, 파모산, 말레산, 시트르산, 말산, 아스코르브산, 숙신산, 벤조산, 팔미트산, 수베르산, 살리실산, 타르타르산, 메탄설폰산, 톨루엔설폰산, 또는 트리플루오로아세트산, 및 무기산, 예컨대 염산, 브롬화수소산, 황산, 및 인산이 포함된다.

본원에 사용되는, 용어 "치료하는(treating)"은 예방 및/또는 치료를 목적으로 약제학적 조성물을 투여하는 것을 나타낸다. "질병을 예방하는 것"은 아직 병들지 않았지만 특정 질병에 민감하거나 그렇지 않으면 특정 질병의 위험이 있는 개체의 예방 치료를 나타낸다. "질병을 치료하는 것" 또는 "치료학적 치료"를 위한 사용은 개체의 질환을 개선하거나 안정시키기 위해 이미 질병으로 고통받고 있는 개체에 치료제를 투여하는 것을 나타낸다. 따라서, 청구항 및 구현예들에서, 치료하는 것은 치료 또는 예방을 목적으로 개체에 투여하는 것이다.

mTOR 억제제 및 화합물 1을 "동시에(concurrently)" 투여하는 것은 mTOR 억제제 및 화합물 1이 별도로 제조되어 서로 2, 3, 4, 5, 6, 또는 7일 이내에 별도로 투여되는 것을 의미한다.

mTOR 억제제 및 화합물 1을 "함께(together)" 투여하는 것은 mTOR 억제제 및 화합물 1이 단일 약제학적 조성물로 함께 제조되어 함께 투여되는 것을 의미한다.

본원에서 사용되는, 종양, 암, 또는 과다증식성 장애를 "치료하기에 유효한 양"은 성장을 침체시키거나, 세포들이 원래 부위에서 신체의 다른 부분들로 번지는 것을 침체시키거나, 종양, 암, 또는 과다증식성 장애에 의해 야기된 증상을 완화시켜주는 화합물 1의 양을 나타낸다. 종양, 암, 또는 과다증식성 장애가 본원에 기재된 치료법에 반응하는 경우 완화되는 증상에는 통증, 또는 다른 유형의 불편함이 포함된다.

병용 요법을 나타내는 경우, 본원에서 사용되는, 종양 또는 암을 "치료하기에 유효한 양"은 함게 성장을 침체시키거나, 세포들이 원래 부위에서 신체의 다른 부분들로 번지는 것을 침체시키거나, 종양 또는 암에 의해 야기된 증상을 완화시켜주는 화합물 1 및 mTOR 억제제의 양을 나타낸다. 종양 또는 암이 본원에 기재된 병용 요법에 반응하는 경우 완화되는 증상에는 통증, 및 다른 유형의 불편함이 포함된다.

용어 "개체" 및 "환자"는 본원에서 교환가능하게 사용된다. 이들은 질병 또는 장애(예컨대, 암, 종양, 또는 비정상적 혈관신생)에 걸리거나 민감하지만 질병 또는 장애를 갖거나 갖지 않을 수 있는 인간 또는 다른 포유류(예컨대, 마우스, 랫트, 토끼, 개, 고양이, 소, 돼지, 양, 말 또는 영장류)을 나타낸다. 특정 구현예들에서, 개체는 인간이다.

용어 "암"은 전형적으로 조절되지 않은 세포 성장을 특징으로 하는, 포유류에서의 생리학적 질환을 나타낸다. 예들에는 암종, 림프종, 아세포종, 육종, 및 백혈병이 포함되지만 이에 제한되는 것은 아니다. 보다 특히, 이러한 암의 예들에는 편평세포암종, 소세포 폐암, 비소세포 폐암, 췌장암, 다형성교모세포종, 식도/구강 암, 자궁경부암, 난소암, 자궁내막암, 전립선암, 방광암, 간암, 유방암, 결장 또는 대장암, 두경부암, 위암, 다발성 골수종, 신장암, 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 골수이형성증후군, 및 본원에 기재된 다른 암이 포함된다.

용어 "종양"은 전형적으로 비정상적인 세포 증식을 특징으로 하는, 포유류에서의 생리학적 질환을 나타낸다. 종양의 비제한적인 예들에는 본원에 기재된 임의의 종양, 예컨대 고형종양이 포함된다. 보다 특히, 종양의 예들에는 위 또는 위장 암, 자궁내막암, 방광암, 다발성 골수종, 유방암, 전립선암, 폐암, 대장암, 신장암, 및 다형성교모세포종으로부터의 고형종양이 포함된다.

용어 "과다증식성 장애"는 병리학적 세포 증식 또는 병리학적 혈관신생과 관련된 장애들을 나타낸다. 비정상적 혈관신생과 관련된 질환의 비제한적인 예들에는 고형종양, 당뇨망막병증, 류마티스 관절염, 건선, 죽상동맥경화증, 만성염증, 비만, 황반변성, 및 심혈관계 질병이 포함된다.

"적은 투여량"은 종양, 암, 또는 비정상적 혈관신생과 관련된 질환의 치료를 위한 단독요법(monotherapy)에서 개체에 일반적으로 제공되는 제제의 투여량보다 적은 투여량을 의미한다(예컨대, 단독요법으로서 투여되는 양의 70% 미만, 60% 미만, 50% 미만, 40% 미만, 또는 30% 미만). 본 발명의 조합은, 단독요법으로서 mTOR 억제제 또는 화합물 1을 단독으로 투여함으로써 동일한 효과를 달성하는데 필요한 투여량보다 훨씬 적은 미만으로 실질적으로 병용 요법의 개별적인 성분들의 투여량을 감소시키는데 사용될 수 있다. 화합물 1 및 mTOR 억제제의 예시적인 적은 투여량은 다음과 같다: 화합물 1은 7-42㎎으로 매일 경구 투여(예컨대, 7±1.5㎎, 10±2㎎, 15±3㎎, 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 또는 35±7㎎으로 매일 경구 투여); 리다포롤리무스는 7-28㎎ 경구 qdx5/주(예컨대, 7±1.5㎎, 10±2㎎, 15±3㎎, 20±4㎎, 또는 25±3㎎ 경구 qdx5/주); 에베롤리무스는 2-7㎎으로 매일 경구 투여(예컨대, 2±0.4㎎, 3±0.6㎎, 4±0.8㎎, 5±0.9㎎, 또는 6±1.2㎎으로 매일 경구 투여); 템시롤리무스는 3-21㎎으로 매주 정맥주사 주입(예컨대, 3±0.6㎎, 5±1㎎, 7.5±1.5㎎, 10±2㎎, 15±3㎎, 또는 18±3.5㎎으로 매주 정맥주사 주입); 시롤리무스는 0.5-12㎎을 매일 경구 투여(예컨대, 0.5±0.1㎎, 1±0.2㎎, 2±0.4㎎, 3±0.6㎎, 4±0.8㎎, 5±0.9㎎, 6±1.2㎎, 8±1.5㎎, 또는 10±2㎎으로 매일 경구 투여); 바이롤리무스는 100-600μg으로 매일 정맥주사 주입(예컨대, 100±20μg, 150±30μg, 200±40μg, 300±50μg, 400±50μg, 또는 500±50μg으로 매일 정맥주사 주입); 조타롤리무스는 100-600μg으로 매일 정맥주사 주입(예컨대, 100±20μg, 150±30μg, 200±40μg, 300±50μg, 400±50μg, 또는 500±50μg으로 매일 정맥주사 주입); NVP-BEZ235는 5-50㎎으로 매일 경구 투여(예컨대, 5±1㎎, 10±1.5㎎, 15±3㎎, 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 35±7㎎, 40±8㎎, 45±9㎎, 또는 50±10㎎으로 매일 경구 투여); 보르트만닌은 10-70㎎으로 매일 경구 투여(예컨대, 10±2㎎, 15±5㎎, 20±6㎎, 30±7㎎, 40±8㎎, 50±9㎎, 70±10㎎으로 매일 경구 투여); 퀘르세틴은 1-5g으로 매일 경구 투여(예컨대, 1±0.1㎎, 2±0.2㎎, 3±0.3㎎, 4±0.5㎎, 또는 5±1㎎으로 매일 경구 투여); 마이리세틴은 15-100㎎으로 매일 경구 투여(예컨대, 15±5㎎, 20±6㎎, 30±7㎎, 40±8㎎, 50±9㎎, 75±10㎎, 또는 100±25㎎으로 매일 경구 투여); 및 스타우로스포린은 10-50㎎으로 매일 경구 투여(예컨대, 10±1.5㎎, 15±3㎎, 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 35±7㎎, 40±8㎎, 45±9㎎, 또는 50±10㎎으로 매일 경구 투여). 단독요법에 대해 지금 기재한 것들보다 적은 투여량으로 하기 화합물들이 투여될 수 있다: LY294002, Pp242, WYE-354, Ku-0063794, XL765, AZD8055, 및 OSI-027.

본 발명의 다른 특징들 및 이점들은 하기 상세한 설명, 도면, 및 청구항으로부터 명백할 것이다.

본 발명은 화합물 1의 투여를 포함하는, 암을 치료하기 위한 방법을 제공한다. 암의 비제한적인 예들에는 고형종양, 예컨대 급성 골수성 백혈병, 위 또는 위장 암, 자궁내막암, 방광암, 다발성 골수종, 또는 유방암을 초래하는 것들이 포함된다. 암의 다른 예들에는 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 또는 골수이형성증후군(예컨대, 아세포 그룹 1(RAEBI)이 과잉된 불응성 빈혈 또는 아세포 그룹 2(RAEBII)가 과잉된 불응성 빈혈)이 포함된다.

전술한 암 이외에도, 본 발명의 방법 및 조성물이 하기 유형의 암들뿐만 아니라 다른 암들을 치료하는데 사용될 수 있다: 피부(예컨대, 편평세포암종, 기저세포 암종, 또는 흑색종), 전립선, 뇌 및 신경계, 두경부, 고환, 폐, 간(예컨대, 간암), 신장, 뼈, 내분비계(예컨대, 갑상선 및 뇌하수체 종양), 및 림프계(예컨대, 호지킨 및 비-호지킨 림프종) 암. 본 발명의 방법을 사용하여 치료될 수 있는 다른 유형의 암들에는 섬유육종, 신경외배엽 종양, 중피종, 표피 암종, 및 카포시육종이 포함된다.

화합물 1은 강한 항혈관형성 성질을 지니며, 이에 따라 고형암(예컨대, 전립선암, 폐암, 유방암, 대장암, 신장암, 및 교모세포종), 당뇨망막병증, 류마티스 관절염, 건선, 죽상동맥경화증, 만성염증, 비만, 황반변성, 및 심혈관계 질병을 포함한 비정상적 혈관신생과 관련된 질환의 치료에 유용할 수 있는 것으로 밝혀졌다.

특히, 화합물 1은 pan-BCR-ABL 억제제이다. 이마티닙에 의한 발암성 BCR-ABL 티로신 키나아제의 억제는 만성기의 만성 골수성 백혈병(CML)에 걸린 많은 환자들에게서 내구적 반응을 일으키는 반면, 후기 CML 및 Ph+ 급성 림프구성 백혈병에서는 재발이 일반적이다. 이마티닙 저항은 보통 BCR-ABL 키나아제 도메인 돌연변이에 기인하며, 2차(second-line) BCR-ABL 억제제인 닐로티닙 및 다사티닙은 이들 환자들에 대한 치료 대안을 제공한다. 그러나, 순차적인 ABL 키나아제 억제제 요법에 대해 선택된 BCR-ABL^T315I 돌연변이 및 다중-저항성 복합 돌연변이 교차-저항은 임상적 관심에 머물러 있다. 여기서, 본 발명자들은, 시험관 내 및 생체 내에서 BCR-ABL 및 다른 저항성 돌연변이들의 강력한 억제제인 화합물 1의 평가를 기재한다. 화합물 1은 BCR-ABL의 비활성 형태를 억제하는 것으로 밝혀졌다. 세포 기반의 돌연변이 스크린에서, 화합물 1은 T315I 돌연변이를 포함한 특정 농도에서의 저항을 완전히 억제시켰다. 화합물 1과 같은 경구 투여된 pan-BCR-ABL 티로신 키나아제 억제제의 이용가능성은, 치료 중에 BCR-ABL 키나아제 도메인 돌연변이 기반의 약제 내성의 발생을 최소화함으로써 1차 수용량(capacity)으로 중요한 치료적 이점들을 제공한다.

또한, 본 발명자들은 병리학적 세포 증식을 치료하고, 혈관신생을 억제하고, 암 세포들의 아포토시스를 증가시키기 위해 mTOR 및 화합물 1의 병용이 라파마이신 매크로라이드 단독요법 또는 화합물 1 단독요법보다 효과적임을 발견하였다. 본 발명의 조성물, 방법, 또는 키트을 사용하여 치료될 수 있는 암들의 비제한적인 예들에는 방광, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 두경부, 담낭, 난소, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선, 전립선, 또는 피부; 편평세포암종; 자궁내막암; 다발성 골수종; 림프 계열의 조혈 종양(예컨대, 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포-림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 모발성 세포 림프종, 또는 버킷 림프종); 골수 계열의 조혈 종양(예컨대, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 다발성 골수성 백혈병, 골수이형성증후군, 또는 전골수구성 백혈병); 중배엽성의 종양(예컨대, 섬유육종 또는 횡문근육종); 중추 또는 말초 신경계의 종양(예컨대, 성상세포종, 신경아세포종, 신경교종, 또는 신경초종); 흑색종; 정상피종; 기형암종; 골육종; 또는 카포시육종의 암종이 포함된다. 본 발명의 조성물, 방법, 또는 키트를 사용하여 치료될 수 있는 비정상적 혈관신생과 관련된 질환의 비제한적인 예들에는 고형종양(예컨대, 전립선암, 폐암, 유방암, 대장암, 신장암, 또는 교모세포종), 당뇨망막병증, 류마티스 관절염, 건선, 죽상동맥경화증, 만성염증, 비만, 황반변성, 및 심혈관계 질병이 포함된다.

화합물 1의 합성 및 제조

화합물 1은 도식 1에 기재된 바와 같이, 그리고 PCT 공개번호 제WO 2007/075869호에 기재된 바와 같이 합성될 수 있다. 택일적으로, 단계에서 사용된 산 염화물은 단계 5의 변경을 기재하는 도식 2에 설명된 바와 같이 메틸 에스터로 대체될 수 있다.

도식 1

도식 2

임상 시험을 수행하기 위해, 매우 적은 수용성 유리 염기 대신에 화합물 1의 모노-염산염을 사용하였다. 모노-HCl 염은 재생 가능한 많은 용매들로부터 형성된 결정질의 무수 고체인 것으로 밝혀졌다. 화합물 1의 염산염은 pH 3.7의 1.7㎎/niL의 완충되지 않은 물에서 열역학적 용해도를 갖는다.

화합물 1에 대한 추가의 확인된 정보에는 하기의 것들이 포함된다:

화학명: 3-(이미다조[1,2-b]피리다진-3-일에티닐)-4-메틸-N-(4-((4-메틸피페라진-l-일)메틸)-3-(트리플루오로메틸)페닐)벤즈아마이드, 염산염;

USAN 명: 포나티닙(INN pending);

CAS 등록 번호: 1114544-31-8(HCl 염) 및 943319-70-8(유리 염기);

CAS 색인명: 벤즈아마이드,3-(2-이미다조[l,2-b]피리다진-3-일에티닐(ylethnyl))-4-메틸-N-[4-[(4-메틸-1-피페라지닐)메틸]-3-(트리플루오로메틸)페닐]-하이드로클로라이드(1:1);

분자식: C₂₉H₂₈ClF₃N₆0(HCl 염) 및 C₂₉H₂₇F₃N₆0(유리 염기)(카이랄 중심 없음); 및

분자량: 569.02g/mol(HCl 염) 및 532.56g/mol(유리 염기).

화합물 1, 또는 바람직하게는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 예컨대 모노 HCl 염은, 이러한 목적에 유용한 임의의 물질 및 방법을 이용하여 경구 투여용으로 제조될 수 있다. 경구 투여에 적합한 화합물 1을 함유하는 약제학적으로 허용가능한 조성물은 종래의 물질 및 방법을 사용하여 제조될 수 있으며, 다양한 것들이 잘 알려져 있다. 조성물은 용액, 현탁액 또는 에멀젼 형태로 존재할 수 있지만, 고체 투여 형태, 예컨대, 정제, 겔 캡, 당의정 등이 현재 가장 관심 있는 것이다. 전술한 단위 투여 형태를 포함한 포뮬레이션을 제조하기 위한 당업계에 잘 알려진 방법은, 예컨대 "Remington: The Science and Practice of Pharmacy" (20th ed., ed. A.R. Gennaro, 2000, Lippincott Williams & Wilkins)에서 발견된다. 화합물 1은 순수하게 캡슐에 제공될 수 있거나, 하기에 예시된 바와 같이 하나 또는 그 초과의 임의적인 약제학적으로 허용가능한 부형제, 예컨대 충전제, 바인더, 안정화제, 방부제, 활택제, 붕괴제, 착색제, 필름 코팅물 등과 결합하여 제공될 수 있다.

예컨대, 명목적으로 2㎎의 화합물 1 유리 염기를 함유하는 화이트 오페이크 캡슐들을 제조하여, 부형제 없이 염산염으로서 제공하였다. 또한 5㎎, 15㎎, 또는 20㎎의 화합물 1 유리 염기를 함유하는 화이트 오페이크 캡슐을 제조하여, 종래의 부형제와 혼합된, 염산염으로서 제공하였다. 예시적인 캡슐 블렌드에서 부형제로서 사용되는 비활성 성분들은 충전제, 유동 개선제, 윤활제, 및 붕괴제 중 하나 또는 초과를 포함한다. 예컨대, 캡슐 블렌드는, 화합물 1 HCl 염 및 콜로이드 실리콘 디옥사이드(ca. 0.3% w/w, 유동 개선제), 락토오스 무수물(ca. 44.6% w/w, 충전제), 마그네슘 스테아레이트(ca. 0.5% w/w, 윤활제), 미정질 셀룰로스(ca. 44.6% w/w, 충전제), 및 전분글리콜산나트륨(ca. 5% w/w, 붕괴제)을 함유하는, 5, 15 및 20㎎의 캡슐에 대해 제조하였다. 캡슐 쉘(shell)은 젤라틴 및 티타늄 디옥사이드를 함유한다.

제조 프로세스는 종래의 블렌딩 및 캡슐화 공정 및 기계를 사용하였다. 화합물 1의 염산염, 및 마그네슘 스테아레이트를 제외한 모든 블렌드 부형제들을 V-블렌더에서 혼합하고 스크리닝 밀을 통해 밀링시켰다. 마그네슘 스테아레이트를 첨가하고, 그 물질을 다시 혼합하였다. 블렌드 균일성을 측정하기 위해 V-블렌더를 샘플링하였다. 블렌드의 부피 밀도, 가공 밀도, 흐름, 및 입자 크기 분배를 시험하였다. 그 다음 블렌드를 단위 투여 형태의 내구력(strength)에 따라 크기 "3", 크기 "4", 또는 크기 "1"의 캡슐 쉘로 캡슐화하였다.

또한 보다 높은 내구력의 캡슐에 사용되는 것과 비슷하게 블렌드 내에 충전제나 충전제들의 혼합물, 붕괴제, 활택제, 윤활제, 필름 코팅물, 및 코팅 용매 중 하나 또는 초과를 포함하는 종래의 약제학적 부형제를 사용하여 화합물 1을 정제로 제조하였다. 예컨대, 정제는 사용되는 약제의 양에 기초하여 조절된 락토오스 모노하이드레이트의 양과 하기의 상대적인 양 및 비율(중량/중량(weight/weight))을 이용해 제조될 수 있다: 화합물 1(90g, HCl 염으로 제공됨, 15.0% w/w), 콜로이드 실리콘 디옥사이드(1.2g, 0.2% w/w), 락토오스 모노하이드레이트(240.9g, 40.15% w/w), 마그네슘 스테아레이트(3g, 0.5% w/w), 미정질 셀룰로스(240.9g, 40.15% w/w), 및 전분글리콜산나트륨(24g, 4.0% w/w).

화합물 1 및 부형제는 캡슐의 경우에 사용했던 바와 동일한 종류의 기계 및 작업을 사용하여 혼합할 수 있다. 결과적으로 생성된 균일한 블렌드를 그 다음 종래의 수단, 예컨대 표적 정제 중량, 예컨대 45㎎ 정제의 경우 300㎎ 또는 15㎎ 정제의 경우 100㎎; 예컨대 45㎎ 정제의 경우 13kp 및 15㎎ 정제의 경우 3kp의 평균 경도; 및 1% 이하의 이쇄성(friability)에 대해 조절되는 회전식 정제 프레스에 의해 정제로 압축될 수 있다. 이에 따라 제조된 정제 코어는 종래의 필름 코팅 물질, 예컨대 Opadry? II White의 수성 현탁액으로 스프레잉되어, 정제 코어 중량에 비해 예컨대 ~2.5%의 중량 증가를 야기할 수 있다.

mTOR 억제제

일반적으로 mTOR로 알려진 포유류 라파마이신의 표적은, 세포 성장, 세포 증식, 세포 운동성, 세포 수명, 단백질 합성, 및 전사를 조절하는 세린/트레오닌 단백질 키나아제이다. 라파마이신 및 이의 유사체들을 포함한 mTOR 억제제는, mTOR 또는 mTOR를 포함한 키나아제들의 조합물(예컨대, PI3K 및 mTOR 둘 모두의 억제제로서의 역할을 하는 제제들)로부터의 시그널링을 특히 억제하는 치료법의 일종이다. mTOR은 다중 미토겐 시그널링 경로에서 중요한 매개물이며, 정상 조직 및 종양 프로세스에서 증식 및 혈관신생을 조절하는 중심적 역할을 한다. mTOR 억제 화합물에는 두 종류가 있다: 라파마이신 매크로라이드 및 비-라파마이신 유사체.

라파마이신(시롤리무스)는 스트렙토마이시스 하이그로스코피쿠스에 의해 제조되는 면역억제성 락탐 매크로라이드이다. 예컨대, 본원에 참조로서 통합된 J.B. McAlpine et al., J. Antibiotics, 1991, 44: 688; S.L. Schreiber et al., J. Am. Chem. Soc, 1991, 113: 7433; 및 미국특허 제3,929,992호를 참고하라.

라파마이신과 이의 유사체들의 원자를 넘버링하기 위한 인정된 방법이 하나 이상 있기 때문에, 본원에 사용된 넘버링 방법은 하기에 서술하였다:

참고로, 다수의 화합물들에 대한 R 기는 하기 표에 설명하였다:

본 발명의 병용 요법에 사용하기에 바람직한 라파마이신 매크로라이드는 라파마이신(시롤리무스 또는 라파뮨(와이어스(Wyeth))), 템시롤리무스 또는 CCI-779(와이어스, 미국특허 제5,362,718호 및 제6,277,983호를 참조하라, 상기 특허들의 내용은 본원에 그 내용이 전체로서 통합된다), 에베롤리무스 또는 RAD001(노바티스(Novartis)), 리다포롤리무스 또는 AP23573(아리아드(Ariad)), 바이롤리무스(노보리(Nobori)), 및 조타롤리무스 또는 ABT 578(애보트 랩스(Abbott Labs.))을 포함하지만, 이에 한정되지는 않는다.

템시롤리무스는 라파마이신, 라파마이신 42-에스터와 3-하이드록시-2-(하이드록시메틸)-2-메틸프로피온산의 용해성 에스터 프로드러그이며, 이는 미국특허 제5,362,718호에 개시되어 있다. 템시롤리무스는 시험관 내 및 생체 내 모델 모두에서 종양 성장에 대해 상당한 억제 효과를 보여주었다. 템시롤리무스는 세포독성 성질과 대조적으로 세포분열 억제를 나타내며, 종양의 진행 시간 또는 종양 재발 시간을 지연시킬 수 있다. WO 00/240000에 개시된 바와 같이, CCI-779는 신장, 유방, 자궁경부, 자궁, 두경부, 폐, 전립선, 췌장, 난소, 결장, 림프종, 및 흑색종을 포함한 다양한 근원의 암들의 치료에 유용할 수 있다.

에베롤리무스는 40-O-(2-하이드록시)에틸-라파마이신이며, 이의 구조 및 합성은 WO 94/09010에 개시되어 있다. 강력한 면역억제성 제제인 것으로 나타난 에베롤리무스(미국특허 제5,665,772)는, 또한 항종양성 성질의 증거를 나타낸다(예컨대, A. Boulay et al., Cancer Res., 2004, 64: 252-261). 이러한 성질들로 인해, 에베롤리무스는 동종이식편 거부반응(allograft rejection)의 예방을 위한 면역억제제로서 몇몇 나라들에서 현재 거래되고 있으며(B. Nashan, Ther. Drug. Monit., 2002, 24: 53-58), 항암제로서 임상 시험을 받았다(S. Huang and PJ. Houghton, Curr. Opin. Invest. Drugs, 2002, 3: 295-304; M.M. Mita et al., Clin. Breast Cancer, 2003, 4: 126-137; 및 M. Hidalgo and E.J. Rowinsky, Oncogene, 2000, 19: 6680-6686).

조타롤리무스는 예컨대 WO 99/15530에 개시된 바와 같이 이들의 43-에피 이성질체이거나, WO 98/02441 및 WO 05/016252에 개시된 바와 같이 라파마이신 유사체이다 .

리다포롤리무스는 인-함유 라파마이신 유도체(WO 03/064383의 실시예 9를 참조하라). 템시롤리무스 및 에베롤리무스와 같이, 리다포롤리무스는 교모세포종, 전립선, 유방, 췌장, 폐 및 결장을 포함한 다양한 PTEN-결핍 종양 세포주에서 항증식 활성을 보여주었다(E.K. Rowinsky, Curr. Opin. Oncol., 2004, 16: 564-575). 리다포롤리무스는 연조직 및 뼈 육종의 치료를 위해 미국 식품 의약국에 의해 패스트-트랙(fast-track) 제품으로 지정되었다. 리다포롤리무스에 혈액암 (예컨대, 백혈병 및 림프종) 및 고형종양(예컨대, 육종, 전립선암, 및 다형성교모세포종)을 표적으로 하는 다수의 임상 시험들을 시험하였다.

많은 라파마이신 매크로라이드가 당업계에 공지되어 있다. 본 발명의 방법, 키트, 및 조성물에 사용될 수 있는 라파마이신 매크로라이드에는, 예컨대 WO 2006/095185에 개시된 바와 같이(WO 2006/095185에서 이러한 화합물들은 이들의 넘버링 시스템에 기초하여 "39-데스메톡시" 화합물로서 표시된다), 라파마이신의 42-데스메톡시 유도체 및 이의 다양한 유사체들이 포함된다. 라파마이신의 유도체들은 본 발명을 실행하는데 있어서 특히 현재 이익이 있다.

추가로, 라파마이신의 다수의 다른 구조적 변이체들이 보고되어 왔으며, 이들은 일반적으로 대안적인 발효 산물로서 생기고/거나 합성의 결과로부터 생긴다. 예컨대, 유사체, 동족체, 유도체 및 라파마이신과 구조적으로 관련된 다른 화합물들("라팔로그")에 대한 광범위한 문헌은, 무엇보다도, 라파마이신과 관련된 하기 변화들 중 하나 또는 그 초과를 갖는 라파마이신의 변이체들을 포함한다: 탈메틸화, C7, C42 및/또는 C29에서 메톡시의 제거 또는 치환; C13, C43 및/또는 C28에서 하이드록시의 제거, 유도체화 또는 치환; C14, C24 및/또는 C30에서 케톤의 환원, 제거 또는 유도체화; 6-원 피페콜레이트 고리를 5-원 피롤릴 고리로 치환; 사이클로헥실 고리 상에서 택일적 치환 또는 사이클로헥실 고리를 치환된 사이클로펜틸 고리로 치환; C28 하이드록실기의 에피머화; 및 치환 인-함유 모이어티로 치환.

따라서, mTOR 억제제는, 예컨대 하기 특허들에 기재된 것들을 포함하는 라파마이신의 43- 및/또는 28-에스터, 에테르, 카보네이트, 카바메이트 등을 포함하며, 하기 특허들은 모두 본원에 참조로서 통합된다: 알킬 에스터(미국특허 제4,316,885호); 아미노알킬 에스터(미국특허 제4,650,803호); 플루오르화된 에스터(미국특허 제5,100,883호); 아마이드 에스터(미국특허 제5,118,677호); 카바메이트 에스터(미국특허 제5,118,678호); 실릴 에스터(미국특허 제5,120,842호); 아미노디에스터(미국특허 제5,162,333호); 설포네이트 및 설페이트 에스터(미국특허 제5,177,203호); 에스터(미국특허 제5,221,670호); 알콕시에스터(미국특허 제5,233,036호); O-아릴, -알킬, -알케닐, 및 -알키닐 에테르(미국특허 제5,258,389호); 카보네이트 에스터(미국특허 제5,260,300호); 아릴카보닐 및 알콕시카보닐 카바메이트(미국특허 제5,262,423호); 카바메이트(미국특허 제5,302,584호); 하이드록시에스터(미국특허 제5,362,718호); 입체장애(hindered) 에스터(미국특허 제5,385,908호); 헤테로사이클릭 에스터(미국특허 제5,385,909호); 젬-2치환된 에스터(미국특허 제5,385,910호); 아미노 알카노익 에스터(미국특허 제5,389,639호); 포스포릴카바메이트 에스터(미국특허 제5,391,730호); 카바메이트 에스터(미국특허 제5,411,967호); 카바메이트 에스터(미국특허 제5,434,260호); 아미디노 카바메이트 에스터(미국특허 제5,463,048호); 카바메이트 에스터(미국특허 제5,480,988호); 카바메이트 에스터(미국특허 제5,480,989호); 카바메이트 에스터(미국특허 제5,489,680호); 입체장애 N-옥사이드 에스터(미국특허 제5,491,231호) ; 비오틴 에스터(미국특허 제5,504,091호); O-알킬 에테르(미국특허 제5,665,772호); 및 라파마이신의 PEG 에스터(미국특허 제5,780,462호). 또한 포함되는 것에는 라파마이신의 환원된 생성물, 24-디하이드로-, 30-디하이드로- 및 24,30-테트라하이드로-라파마이신 유사체 및 28-에피 유사체(예컨대, WO 01/14387을 참조하라) 또는 임의의 전술한 화합물의 환원된 생성물, 24-디하이드로-, 30-디하이드로- 및 24,30-테트라하이드로-라파마이신 유사체 및 28-에피 유사체와, 임의의 전술한 화합물의 에스터 또는 에테르뿐만 아니라, 비-환원된 화합물의 옥심, 하이드라존, 및 하이드록실아민이 있다. 예컨대 미국특허 제5,373,014호, 제5,378,836호, 제5,023,264호, 제5,563,145호 및 제5,023,263호를 참조하라.

비-라파마이신 유사체 mTOR 억제 화합물들에는 LY294002, Pp242(Chemdea Cat. No. CD0258), WYE-354(Chemdea Cat. No. CD0270), Ku-0063794(Chemdea Cat. No. CD0274), XL765(Exelixis; J. Clin. Oncol., 2008, 2008 ASCO Annual Meeting Proceedings 26:15S), AZD8055(Astrazeneca), NVP-BEZ235(Sauveur-Michel et al., Mol. Cancer Ther., 2008, 7:1851), OSI-027(OSI Pharmaceuticals), 보르트만닌, 퀘르세틴, 마이리세틴, 스타우로스포린, 및 ATP 경쟁적 억제제(미국특허출원번호 제11/361,213호 및 제11/361,599호를 참조하라. 이들 각각은 그 전체 내용이 본원에 참조로서 통합된다)가 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 방법, 키트, 및 조성물에 사용될 수 있는 다른 비-라파마이신 유사체 mTOR 억제 화합물들에는 PCT 공개 번호 WO2009008992; WO2009007750; WO2009007751; WO2009007749; WO2009007748; WO2008032060; WO2008032036; WO2008032033; WO2008032089; WO2008032091; WO2008032064; WO2008032077; WO2008032041 ; WO2008023159; WO2008023180; WO2007135398; WO2007129044; WO2007080382; 및 WO2006090169에 기재된 것들이 포함되며, 이들은 각각 본원에 참조로서 통합된다.

약제학적 조성물

mTOR 억제제의 포뮬레이션은 당업계에 매우 잘 알려져 있으며, 이는 예컨대, 시롤리무스, 템시롤리무스, 리다포롤리무스, 및 에베롤리무스를 위해 경구 투여하기에 적합한 고체 투여 형태뿐만 아니라, 정맥주사 투여를 위한 템시롤리무스 및 리다포롤리무스의 다른 조성물들을 포함하다. 비-매크로라이드 mTOR 억제제의 포뮬레이션은 상기 표시된 특허 문헌들에 개시되어 있다. 화합물 1은 mTOR 억제제와 함께 제조될 수 있지만, 보다 일반적으로는 제조 공정을 복잡하게 하는 것을 피하고, 두 제제들의 투여 스케쥴링 및 투약 방법을 독립적이게 하며, 이후에 보다 편리하게 각 제제의 투여량을 조절하게 하기 위해 개별적으로 제조될 것이다.

투여량 및 투여

본 발명의 방법, 키트, 및 조성물에 따라, 치료는 일정 기간 동안 1회 투여량 또는 다수의 투여량으로 이루어질 수 있다. 화합물 1은 단독으로 또는 mTOR 억제제의 투여와 동시에 투여될 수 있다. 택일적으로, 화합물 1 및 mTOR 억제제는 연속적으로 투여될 수 있다. 예컨대, 화합물 1은 mTOR 억제제의 투여 이전 또는 이후에 투여될 수 있다(예컨대, 1일 또는 1일 초과 이전에 및/또는 1일 또는 1일 초과 이후에).

투여는 주어진 횟수(예컨대, 2-10 주기) 또는 무기한으로 반복되는 주기로, 매일, 매주(또는 언젠가 다른 수 일의 간격으로) 1회 또는 다회, 또는 간헐적 강화 계획(intermittent schedule)에 의할 수 있다.

투여 경로에 따라서, 유효적 투여량은 치료될 개체의 체중, 체표면적, 또는 장기 크기에 따라 계산될 수 있다. 적절한 투여량의 최적화는 인간 임상 시험에서 관찰되는 약동학적 데이터를 고려하여 당업계의 통상의 기술자에 의해 손쉽게 만들어질 수 있다. 최종 투여 방법은, 약제의 활동을 변화시키는 다양한 요인들, 예컨대 약제의 고유활성도, 개체의 손상 중증도 및 민감성, 개체의 나이, 상태, 체중, 성별 및 식습관, 임의의 존재하는 감염의 중증도, 투여 시기, 병존하는 치료법의 이용(또는 불이용), 및 다른 임상적 요인들을 고려하여 주치의에 의해 정해질 것이다. 연구들은 발명의 조합들을 이용하여 수행되었지만, 추가의 정보가 적절한 투여 수준 및 치료 기간과 관련하여 나올 것이다.

본 발명의 병용 요법에서, 화합물 1은 일반적으로 총 1일 투여량인 10-500㎎의 화합물 1의 반복 주기로 매일 경구 투여된다. mTOR 억제제는 동일하거나 상이한 투약 일정으로, 동일하거나 상이한 투여 경로에 의해, 화합물 1의 이전, 이후, 또는 동시에 제공될 수 있다. 상기 병용 요법에서 mTOR 억제제에 대한 투여량 수준은 일반적으로 1주의 치료 당 전체 10-800㎎의 범위, 예컨대, 몇몇 경우에는 35-250㎎/주이다. 이러한 전체적인 매주 투여량 수준은 다양한 투여 경로 및 투약 일정을 이용하여 달성될 수 있다. 투약 일정은 간헐적일 수 있다. "간헐적인" 투약은 투여량들 사이의 기간, 예컨대 이틀마다 투약, 사흘마다 투약을 제공하는 일정, 또는 보다 일반적으로, 투약 기간 사이에 1일 이상 또는 1주 이상의 "휴일"을 포함하는 일정을 나타낸다. 이러한 간헐적인 투약의 비제한적인 예들은 주당 7일보다 적게 투약하는 것뿐만 아니라, 1주간의 QDx4, QDx5, QDx6 또는 매일 투약에 이어서 예컨대, 1, 2 또는 3주의 약제 없는 기간 후에 또 다른 1주의 약물 처리의 재개에 이은 약제 치료 없는 1주(또는 수 주)의 투약 주기 등을 포함한다. 추가로 예시하기 위해, 격주로 QDx6으로 60㎎을 투여하는 것은 간헐적 단위로(즉, 격주) 주 1회 360㎎의 약제를 제공한다.

예컨대, 경구 투여의 경우, 2-160㎎의 약제가 주당 1일 이상, 예컨대 매일(QDx7), 주당 6일(QDx6), 주당 5일(QDx5) 등으로 제공될 수 있다. 따라서, 에베롤리무스는 3-20㎎/일, 예컨대, 5㎎ 또는 10㎎의 투여량으로 QDx7로 제공될 수 있다. 리다포롤리무스는 10-25㎎/일, 예컨대, 10, 12.5 또는 15㎎/일의 투여량으로 QDx7 p.o.로 제공될 수 있거나; 시롤리무스는 p.o. QDx7로 2 또는 4㎎, 몇몇 경우에는 6, 8, 또는 10㎎의 로딩 투여량으로 제공될 수 있다. 투약 일정은, QDx4, QDx5, 및 QDx6 일정으로 예시된 바와 같이 간헐적일 수 있다. 예들에는 30-lOO㎎의 mTOR 억제제를 QDx5 또는 QDx6으로 경구 투여하는 것이 포함된다. 예컨대, 본 발명의 실행에서, 리다포롤리무스, 에베롤리무스, 템시롤리무스 또는 시롤리무스는 10-50㎎ QDx5의 수준으로 경구 투여된다. 특정 예시에서, 30-50㎎의 투여량 수준으로 QDx5로 리다포롤리무스를 경구 투여하는 것이 바람직할 수 있다.

mTOR 억제제에의 바람직한 전체 노출 수준은 다양한 비경구 전달 일정들에 의해 택일적으로 달성될 수 있다. 이러한 경우, 10-250㎎의 mTOR 억제제는, 예컨대, 1 내지 4주의 기간 당 1회 이상으로, 15-60분, 보통 30-60분에 걸쳐 정맥주사 주입을 함으로써 투여된다. 이러한 일 방법에서, mTOR 억제제는 매 4주 주기로 3주 또는 4주 동안 매주 한 번 30-60분의 정맥주사 주입으로 투여된다. 이러한 정맥주사 전달은 리다포롤리무스, 시롤리무스 및 템시롤리무스의 경우에 특히 이익이 있으며, 이는 매 4주의 주기의 3주 또는 4주 동안, 예컨대, 10-250㎎의 주 1회 투여량, 예컨대, 25, 50, 75, 100, 150, 200, 또는 250㎎/주로 제공될 수 있다. 50 및 75㎎의 투여량 수준은 특히 현재 이익이 있다. 또 다른 방법에서, mTOR 억제제는 5-25㎎의 약제를 매 2주 QDx5로 정맥주사 주입함으로써 투여된다(예컨대, 매 둘째 주에, 월요일에서 금요일까지 정맥주사 주입). 10, 12.5, 15, 17.5, 및 20㎎의 투여량은 특히 현재 이익이 있다.

관심 있는 것은, 본원에 기재된 바와 같이 화합물 1과의 병용 요법의 일부로서 투여된, 단독요법에서 mTOR 억제제에 대해 이미 승인되거나 연구 중인 투여량 수준 및 투약 일정이다.

또한 관심 있는 것은, 개체에 투여되는 mTOR 억제제 및/또는 화합물 1의 적은 투여량(즉, 단독요법에 대해 사용되는 양보다 적은 양)을 초래하는 투여량 수준 및/또는 투약 일정의 병용 요법이다.

표시

본 발명의 방법, 키트, 및 조성물은 병리학적 세포 증식, 예컨대 종양, 암, 및 병리학적 혈관신생과 관련된 질환과 관련 있는 장애를 치료하는데 사용될 수 있다. 본 발명의 조성물, 방법, 또는 키트를 사용하여 치료될 수 있는 비정상적 혈관신생과 관련된 질환의 비제한적인 예들에는 고형종양, 당뇨망막병증, 류마티스 관절염, 건선, 죽상동맥경화증, 만성염증, 비만, 및 황반변성이 포함된다.

본 발명의 방법, 키트, 및 조성물은 원발성 및/또는 전이성 암, 및 다른 암 질환들을 치료하는데 사용될 수 있다. 예컨대, 본 발명의 조성물 및 방법은 고형종양의 크기 감소, 종양 성장 또는 전이의 억제, 다양한 림프 암의 치료, 및/또는 이러한 질병들로 고통받고 있는 포유류(인간 포함)의 생존 시간 연장에 유용해야 한다.

BCR-ABL 발현 세포들의 증식과 관련된 질환의 특정 예들에는 암, 예컨대 본원에 기재된 임의의 암들을 포함한다. 추가의 암에는 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 및 급성 골수성 백혈병이 포함된다.

FLT-3 돌연변이 발현 세포들의 증식과 관련된 질환의 특정 예들에는 암 및 암과 관련된 질환, 예컨대 본원에 기재된 임의의 암이 포함된다. FLT3 내의 활성 돌연변이는 급성 골수성 백혈병(AML)에서 유전자 변형의 가장 일반적인 유형이다. 다수의 이러한 돌연변이들은 수용체의 막근접 영역에서의 내부 일렬 중복(ITD)으로 인해 일어난다. 키나아제 활성화 루프 내에서의 활성 점돌연변이 또한 일어나지만 그 빈도는 보다 낮다. FLT3-ITD 돌연변이는, 표준 요법으로 치료되는 경우, 재발 및 전체 생존율(overall survival) 둘 모두의 측면에서, AML 환자들에 대한 보다 나쁜 예후와 관련되어 있다. 추가의 질환들에는 골수이형성증후군(MDS), 예컨대 불응성 빈혈, 아세포 과잉된 불응성 빈혈(RAEB)(예컨대, 5-9%의 아세포를 지닌 RAEBI 및 10-19%의 아세포를 지닌 RAEBII), 관상 철아구를 지닌 불응성 빈혈, 만성 골수단구성 백혈병(CMML), 및 비정형 만성 골수성 백혈병(a-CML)이 포함된다.

질환들의 다른 예들에는 FGFR1, PDGFRα, 및 KIT와 관련된 질환들이 포함된다. FGFR1 및 PDGFRα의 활성에 영향을 주는 전좌(translocation)는 희귀 골수증식 종양(MPNs)의 서브세트에서 발견된다. FGFR1 유전자 및 다양한 다른 염색체 파트너, 예컨대 FGFR1OP2 유전자와 관련된 전좌는, 대부분의 환자들이 궁극적으로, 그리고 급속히 AML로 진행되는 질병인 8p11 골수증식 증후군(EMS)을 특징으로 한다. FIP1L1-PDGFRα 융합 단백질은 만성 호산구성 백혈병/특발성 과호산구증가증(CEL/HEL)인 환자들의 대략 10-20%에서 발견되며, 이러한 환자들이 PDGFR 억제에 잘 반응한다는 것이 보고되었다. 또한, PDGFRα의 T674I 돌연변이는 BCR-ABL에 있는 T315I 게이트키퍼와 유사한 위치에서 돌연변이시킨다. KIT에서의 활성화 돌연변이(예컨대, cKIT 또는 N822K)는 또한 AML에서 발견된다. 키트 돌연변이는 덜 일반적이며, AML의 특정 세포유전 서브세트에서 전체 빈도 2-8%로 발견된다.

질환의 다른 예들에는 암 세포, 예컨대 고형종양을 초래하는 암 세포의 증식과 관련된 질환들을 포함한다. 예시적인 고형종양들에는 위 또는 위장 암, 자궁내막암, 방광암, 다발성 골수종, 유방암, 전립선암, 폐암, 대장암, 신장암, 및 다형성교모세포종이 포함된다.

치료될 수 있는 암 및 암 질환의 예들에는 뇌 및 중추 신경계의 종양(예컨대, 뇌척수막, 뇌, 척수, 뇌신경, 및 CNS의 다른 부분들, 예컨대 교모세포종 또는 수질 아세포종의 종양); 머리 및/또는 경부 암; 유방 종양; 순환계(예컨대, 심장, 종격 및 흉막, 및 다른 흉내 장기들, 혈관 종양, 및 종양-관련 혈관 조직)의 종양; 혈액 및 림프계의 종양(예컨대, 호지킨 질병, 비-호지킨 질병 림프종, 버킷 림프종, AIDS-관련 림프종, 악성 면역증식성 질병, 다발성 골수종, 악성 형질세포 종양, 림프성 백혈병, 골수성 백혈병, 급성 또는 만성 림프성 백혈병, 단구성 백혈병, 특이적 세포 유형의 다른 백혈병들, 비특이적 세포 유형의 백혈병, 림프성, 조혈성 및 관련 조직의 비특이적 악성 종양, 예컨대 미만성 거대 세포 림프종, T-세포 림프종, 또는 피부의 T-세포 림프종); 배설계(예컨대, 신장, 신우, 요관, 방광, 및 다른 비뇨기관)의 종양; 위장관(예컨대, 식도, 위, 소장, 결장, 대장, 직장구불결장 접합부, 직장, 항문, 및 항문관)의 종양; 간 및 간내담관, 담낭, 및 쓸개관의 다른 부분들, 췌장, 및 다른 소화기관과 관련된 종양; 구강(예컨대, 입술, 혀, 잇몸, 구저, 구개, 귀밑샘, 침샘, 편도, 인두, 비인두, 이상동, 하인두, 및 구강의 다른 부위들)의 종양; 생식계(예컨대, 외음부, 질, 자궁경, 자궁, 난소, 및 여성 생식기와 관련된 다른 부위들, 태반, 음경, 전립선, 고환, 및 남성 생식기와 관련된 다른 부위들)의 종양; 기도의 종양(예컨대, 비강, 중이, 부비동, 후두, 기관, 기관지, 및 폐, 예컨대 소세포 폐암 및 비소세포 폐암); 골격기관(예컨대, 사지, 뼈 관절연골, 및 다른 부위들의 뼈 및 관절연골)의 종양; 피부의 종양(예컨대, 피부의 악성 흑색종, 비-흑색종 피부 암, 피부의 기저세포 암종, 피부의 편평세포암종, 중피종, 및 카포시육종); 말초신경계와 자율신경계, 결합조직과 연조직, 복막후강과 복막, 눈과 자궁부속기, 갑상선, 부신, 및 다른 내분비선과 관련된 조직들을 포함하는 다른 조직들과 관련된 종양, 림프절의 2차 및 비특이적 악성 종양, 호흡계와 소화계의 2차 악성 종양 및 다른 부위들의 2차 악성 종양이 포함되지만, 이에 한정되지 않는다.

보다 구체적으로, 본 발명의 키트, 조성물, 및 방법은 육종을 치료하는데 사용될 수 있다. 몇몇 구체예들에서, 본 발명의 조성물 및 방법은 방광암, 유방암, 만성 림프종 백혈병, 두경부암, 자궁내막암, 비-호지킨 림프종, 비소세포 폐암, 난소암, 췌장암, 및 전립선암의 치료에 사용된다.

본 발명의 조성물 및 방법을 사용하여 유리하게 치료될 수 있는 종양에는 PTEN-결핍 종양(예컨대, M.S. Neshat et al., PNAS, 2001, 98: 10314-10319; K. Podsypanina et al., PNAS, 2001, 98: 101320-10325; G.B. Mills et al., PNAS, 2001, 98: 10031-10033; 및 M. Hidalgo and E.K. Rowinski, Oncogene, 2000, 19: 6680-6686을 참조하라)이 포함된다. 이미 전술한 바와 같이, FRAP/mTOR 키나아제는 포스파티딜 이노시톨 3-키나아제/Akt-시그널링 경로의 하류에 위치되며, 이러한 경로는 PTEN 종양 억제 유전자의 손실로 인해 다발성 암에서 조절된다(up-regulated). PTEN-결핍 종양은, 유전자형 분석 및/또는 생체외 배양 및 생체검사된 종양 샘플의 연구를 이용하여 확인될 수 있다. 포스파티딜-이노시톨 3-키나아제/Akt-mTOR 경로에서의 이상(abnormality)과 관련된 암의 비제한적인 예들에는, 비정상적인 성장 인자 수용체(예컨대, EGFR, PDGFR, IGF-R 및 IL-2)와 관련된, 신경교종, 림프종 및 폐, 방광, 난소, 자궁내막, 전립선, 또는 자궁경부의 종양; P13 키나아제의 이상과 관련된 난소 종양; PTEN의 이상과 관련된 유방, 전립선, 또는 자궁내막의 흑색종 및 종양; Akt의 이상과 관련된 유방, 위, 난소, 췌장, 및 전립선암; elF-4E에서의 이상과 관련된 림프종, 유방 또는 방광의 암, 및 두경부 암종; Cyclin D에서의 이상과 관련된 외투세포 림프종, 유방암, 및 두경부 암종; 및 P16에서의 이상과 관련된 가족성 흑색종 및 췌장 암종이 포함되지만, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 키트, 조성물, 및 방법은 또한 비정상적 혈관신생이 있는 질병, 예컨대 당뇨망막병증, 류마티스 관절염, 건선, 죽상동맥경화증, 만성염증, 비만, 황반변성, 및 심혈관계 질병을 치료하는데 사용될 수 있다.

약제학적 키트

본 발명을 실행하기 위해 매우 다양한 다른 패키징 선택들을 이용할 수 있다. 본 발명의 약제학적 키트는 화합물 1 및/또는 mTOR 억제제를 포함하는 약제학적 조성물의 성분들 중 하나 또는 그 초과를 함유하는 하나 또는 그 초과의 용기(예컨대, 바이알, 앰플, 시험관, 플라스크, 또는 보틀)를 포함하여, 화합물 1의 단독투여 또는 mTOR 억제제와 화합물 1을 함께 혹은 동시에 투여하는 것을 가능하게 한다. 키트는 임의적으로 투약, 투여, 및/또는 치료되는 환자 집단(patient population)에 대한 설명서를 포함한다.

약제학적 패키지의 상이한 성분들은 고체(예컨대, 동결건조된 형태) 또는 액체 형태로 공급될 수 있다. 각각의 성분은 일반적으로 이의 각각의 용기에 부분 표본(aliquoted)으로서 혹은 농축된 형태로서 제공되는 것이 적합할 것이다. 약제학적 팩 또는 키트는 동결건조된 성분들의 복원을 위한 메디아(media)를 포함할 수 있다. 키트의 개별적인 용기들은 바람직하게는 상업적인 판매를 위해 폐쇄된 상태로 유지될 것이다.

택일적으로, 화합물 1 및 mTOR 억제제는 모두 경구 투여되도록(예컨대, 경구 전달을 위한 단위 투여 형태로 화합물 1 및 경구 전달을 위한 단위 투여 형태로 리다포롤리무스, 시롤리무스, 또는 에베롤리무스를 또한 함유하는 키트) 제조된다. 경구 투여용으로 제조된 제품들, 예컨대, 캡슐, 정제 등은, 선택된 투약 일정에 따라 계획되고/거나 분류될 수 있는 블리스터 팩으로 패킹될 수 있다.

하기 예시들은 당업계의 통상의 기술자들에게 본원에 청구된 방법들과 화합물들이 수행되고, 제조되고, 평가되는지에 대한 완벽한 개시 및 설명을 제공하기 위해 제시되며, 본 발명의 오직 예시적인 것임을 의도하고 발명자들이 그들의 발명으로 간주하는 범위를 제한하고자 하지 않는다.

도 1a 및 1b는 화합물 1이 음성 BCR-ABL 또는 BCR-ABL^T315I를 발현하는 CML 세포주에서 BCR-ABL 시그널링을 억제함을 보여주는 그래프이다. 도 1a는 이마티닙, 닐로티닙, 다사티닙, 또는 화합물 1로 처리된 음성 BCR-ABL을 발현하는 Ba/F3 세포에서의 CrkL 인산화의 면역블롯(immunoblot) 분석을 나타낸다. 세포들을 억제제의 존재 하에 4시간 동안 배양하고, 채취하고, 용해시키고(lysed), CrkL에 대한 항체, 인산화가 BCR-ABL 키나아제 활성의 확립된 임상 마커인 BCR-ABL의 기질을 사용한 면역블롯에 의해 분석하였다. 인산화된 형태 및 비-인산화된 형태들을 모두 전기영동 이동성에 의해 분해(resolve)되었으며, 밴드는 덴시토미트리(densitometry)에 의해 정량화되고, % 인산화된 CrkL로서 표시되었다. 도 1b는 이마티닙, 닐로티닙, 다사티닙, 또는 화합물 1로 처리된 Ba/F3 BCR-ABL-발현 세포들에서 CrkL 인산화의 면역블롯 분석을 나타낸다. 어세이 및 분석을 전술한 패널 (A)에서와 같이 수행하였다. 약어: NT, 처리하지 않음(no treatment). 도 1a 및 1b는 화합물 1이 음성 BCR-ABL 또는 BCR-ABL^T315I를 발현하는 CML 세포주에서 BCR-ABL 시그널링을 억제함을 보여준다.
도 2a-c는 CML 1차 세포를 화합물 1로 생체 외 처리하는 것이 세포 증식 및 BCR-ABL-매개된 시그널링을 억제함을 보여준다. 도 2a는 음성 BCR-ABL(N=3)이 잠복하고 있는 CML 골수성 아세포 발증(M-BC) 환자들로부터 및 건강한 개체들(N=3)로부터의 생체 외 화합물 1-처리된 단핵세포들에 대한 세포 증식 어세이의 플롯이다. 참고로, 파선은 비처리된 세포들에 대한 50%의 세포 생존도를 나타낸다. 도 2b는 화합물 1, 이마티닙, 닐로티닙, 또는 다사티닙에 대한 생체 외 노출에 따른 BCR-ABL^T315I가 잠복하는 CML 림프성 아세포 발증(L-BC) 환자로부터 단핵세포들에서의 CrkL 인산화의 면역블롯 분석을 나타내는 그래프이다. 세포들을 억제제들의 존재 하에 밤새 배양하고, 채취하고, 용해시키고, CrkL 면역블롯에 의해 분석하였다. 인산화된 형태 및 비-인산화된 형태는 모두 전기영동 이동성에 의해 분해되었으며, 밴드는 덴시토미트리에 의해 정량화되고, % 인산화된 CrkL로서 표시되었다. 도 2c는 도 2b의 CML L-BC BCR-ABL^T315I 환자로부터의 단핵세포들에서 전역 티로신 인산화의 FACS 분석을 나타내는 그래프이다. 억제제의 존재 하에 밤새 배양시킨 후에, 세포들을 고정시키고 투과가능하게 하였으며, 인산화된 티로신에 대한 FITC-라벨링된 항체로 배양하고, FACS에 의해 분석하였다. 기록된 값들은 언스테인드(unstained) 대조구들에 비하여 평균 형광 강도가 배로 증가된 값이다. 약어: NT, 처리하지 않음.
도 3a 및 3b는 화합물 1에 대한 콜로니 형성 어세이의 그래프이다. 도 3a는 BCR-ABL^T315I이 잠복하고 있는 CML AP 환자로부터의 단핵세포들을 사용한, 화합물 1, 닐로티닙, 및 다사티닙의 존재 하의 콜로니 형성 어세이의 그래프이다. 도 3은 건강한 개체로부터의 단핵세포들을 사용한, 화합물 1의 존재 하의 콜로니 형성 어세이의 그래프이다. BCR-ABL^T315I가 잠복하고 있는 CML 가속기(AP) 환자로부터의 및 건강한 개체로부터의 단핵세포들은 닐로티닙, 다사티닙, 또는 화합물 1을 함유하는 메틸셀룰로스에 플레이팅시키고, 14-18일 동안 배양하였다. 도립현미경 하에서 콜로니들을 세어보고, 그 결과를 세 번의 반복실험(replicates)의 평균으로서 표시하였다(에러 바는 S.E.M.을 나타낸다).
도 4a-4c는 화합물 1이 BCR-ABL에 의한 및 BCR-ABL^T315I에 의한 종양 성장의 마우스 이종이식 모델들에서 효과적임을 나타낸다. 도 4a 및 4b는 음성 BCR-ABL(도 4a) 또는 BCR-ABL^T315I(도 4b)를 발현하는 Ba/F3 세포의 정맥주사 주입 후의 SCID 마우스들의 생존에 대한 화합물 1의 영향을 보여주는 그래프이다. 음성 BCR-ABL 또는 BCR-ABL^T315I를 발현하는 Ba/F3 세포들을 SCID 마우스들의 꼬리 정맥(tail vein)에 주입하였으며, 동물들을 위관영양법(oral gavage)에 의해 비히클, 화합물 1, 또는 다사티닙으로 지시된 투약 기간(3일-21일) 동안 하루에 한 번 처리하였다. 도 4c는 BCR-ABL^T315I를 발현하는 Ba/F3 세포들을 사용한, 피하 이종이식 모델에서 화합물 1에 의해 BCR-ABL 인산화의 생체 내 효능 및 억제를 보여준다. 세포들을 누드 마우스들의 우측 내에 피하주입하였으며, 평균 종양 부피가 대략 500㎣에 도달하는 경우, 동물들을 연속적인 19일(지시된 투약 기간) 동안 위관영양법에 의해 하루에 한 번 비히클 또는 화합물 1로 처리하였다. 각각의 화합물 1 처리 군을 던넨트 시험(Dunnett's test)을 사용하여 비히클 군과 비교하였으며, 통계적 유의도(p<0.05)는 별표로 표시되어 있다. 위관영양법(N=3/군)에 의해 비히클 또는 30mg/kg의 화합물 1의 1회 투여량으로 처리된 동물들의 BCR-ABL 인산화를 평가하였다. 투약한지 6시간 후에, 마우스들을 희생시키고 종양 샘플들을 pBCR-ABL 및 eIF4E에 대한 항체(로딩 대조구)를 이용하여 면역블롯 분석에 의해 분석하였다.
도 5는 BCR-ABL^T315I를 발현하는 Ba/F3 세포들을 사용한, 마우스 모델들에서의 다사티닙의 효과를 보여주는 그래프이다. 지시된 투약 기간 동안 비히클 또는 다사티닙으로 처리된 마우스들에 대한 생존 커브가 도시되어 있다.
중앙값 생존은 카플란-메이어 방법을 사용하여 계산하였으며, 통계적 유의도 값들을 각각의 군에 대해 나타내었다.
도 6a 및 6b는 화합물 1의 다양한 농도의 존재 하에 회복된 BCR-ABL 돌연변이를 나타내는 그래프이다. 도 6a는 화합물 1의 단계적인 농도(10, 20, 40nM)의 존재 하에 배양된 음성 BCR-ABL로부터 시작하는 ENU-처리된 Ba/F3 세포들로부터 회복된 저항성 서브클론을 보여준다. 각각의 바는 회복된 서브클론들 중의 지시된 BCR-ABL 키나아제 도메인 돌연변이의 상대적인 백분율을 나타낸다. 잔존하는 저항성 서브클론들의 백분율 및 화합물 1의 농도는 반비례 관계에 있기 때문에, 상이한 수의 연속된 서브클론들이 화합물 1의 각각의 농도에 대해 그래프에 표시되어 있다(표 2 참조). 생성물을 함유하는 것으로 조사된 웰들의 퍼센트는 각각의 그래프의 우측에 나타내었다. 도 6b는 화합물 1의 단계적인 농도(40, 80, 160, 320, 640 nM)의 존재 하에 배양된 BCR-ABL^T315I를 발현하는 ENU-처리된 Ba/F3 세포들로부터 회복된 저항성 서브클론을 보여준다. 이러한 어세이는 BCR-ABL^T315I를 발현하는 세포들로부터 시작되었고, 모든 회복된 서브클론들은 각각의 그래프상에 나타낸 특정 2차 돌연변이뿐만 아니라 T315I 돌연변이를 포함한다. 이러한 데이터는, 단일 제제로서의 화합물 1이 세포-기반의 돌연변이유발 스크린에서 저항성 생성물을 억제할 수 있음을 나타낸다.
도 7a-7d는 화합물 1에 대한 약동학적 데이터의 그래프이다. 도 7a는 1주기, 1일(ClDl) 및 2주기, 1일(C2D1)에서 화합물 1의 다양한 투여량에 대한 Cmax를 보여준다. 도 7는 1주기, 1일(ClDl) 및 2주기, 1일(C2D1)에서 화합물 1의 다양한 투여량에 대한 AUC를 보여준다. 도 7c는 단회 경구 투여량을 따르는 농도 시간 프로파일 C1D1을 보여준다. 도 7d는 다회 경구 투여량을 따르는 농도 시간 프로파일 C2D1을 보여준다.
도 8a-8e는 화합물 1에 대한 약력학적 데이터를 보여준다. 도 8a는 임상 연구중인 모든 환자들 및 T315I 돌연변이를 갖는 환자들의 화합물 1에 대한 약력학적 데이터를 보여주는 그래프이다. 도 8b-8e는 그래프이다 F359C 돌연변이를 갖는 환자의 15㎎의 화합물 1에 대한 약력학적 데이터(도 8b), 돌연변이를 갖지 않는 환자의 30㎎의 화합물에 대한 약력학적 데이터(도 8c), F359C 돌연변이를 갖는 환자의 45㎎의 화합물 1에 대한 약력학적 데이터(도 8d), 및 T315I 돌연변이를 갖는 환자의 60㎎의 화합물 1에 대한 약력학적 데이터(도 8e)를 보여주는 그래프이다.
도 9는 AML 세포주에서 활성화된 티로신 키나아제의 수용체 인산화의 억제를 보여주는 그래프이다. 72시간 동안 화합물 1의 농도를 증가시키면서 AML 세포를 배양하였으며, MTS 어세이를 사용하여 세포 생존도를 평가하였다. MV4-11, Kasumi-1 및 EOL-1 데이터는 3번의 실험으로부터 평균±SD로서 나타내었으며, KG1 데이터는 2번의 실험으로부터 평균±SD로서 나타내었다.
도 10은 MV4-11 세포들에서 아포토시스의 성장 및 유도의 억제를 보여주는 그래프이다. MV4-11 세포들을 96-웰 플레이트에 공급하고(seeding), 화합물 1의 농도를 증가시키면서 처리하였으며, 카스파아제 3/7 활성을 지정된 시간에 측정하였다. 데이터는 비히클 처리된 세포들에 비해 카스파아제 활성의 유도가 배인 것으로 표시되어 있으며, 3번의 개별적인 실험으로부터 평균±SD로서 나타나 있다.
도 11a 및 11b는 V4-11 이종이식의 효능 및 표적 억제를 보여준다. 도 11a는 화합물 1의 다양한 투여량에 대한 종양 성장의 그래프이다. 1일 1, 2.5, 5, 10 및 25mg/kg의 투여량으로 4주 동안의 비히클 또는 화합물 1의 매일 경구 투여는 MV4-11 측면 이종이식 종양이 대략 200㎣(마우스 10마리/군)에 도달한 경우 개시하였다. 평균 종양 부피(±SEM)를 플롯으로 나타내었다(plotted). 비히클 대조군에서 10마리의 동물들 중 3마리가 종양 적하량(burden)으로 인해, 28일째, 마지막 처리 전에 희생되었다. 따라서, 종양 성장 억제를 0일째부터 24일째까지(별표로 나타낸 바와 같이) 계산하였으며, 그 다음 투약 단계 동안 종양 측정을 위해 마지막 시점까지 계산하였다. 도 11b는 화합물 1의 다양한 투여량에 대한 p-FLT3 및 p-STAT5의 억제를 보여주는 그래프이다. 확립된 MV4-11 종양 이종이식을 지닌 마우스들에 단회 경구 투여량의 화합물 1(마우스 4마리/군)을 지시된 수준으로 투여하였다; 대조구 동물들은 비히클만 단독으로 수용하였다(5마리의 마우스). 6시간 후에 종양을 채취하고, 면역블롯팅에 의해 인산화된 총 FLT3 및 STAT5의 수준을 분석하였다. GAPDH를 대조구로서 시험하였다. 두 개의 독립적인 실험으로부터의 평균(±SEM)으로서 FLT3 및 STAT5의 상대적인 인산화의 덴시토미트리에 의한 정량화가 도시되어 있다. FLT3 인산화를 GAPDH에 대해 정상화하였으며 STAT5 인산화를 총 STAT5 단백질에 대해 정상화하였다.
도 12는 선택적으로 FLT3-ITD 세포들을 억제하는 화합물 1로 1차 AML 세포를 생체 외 처리한 것을 보여주는 그래프이다. 1차 백혈병 아세포들을 4명의 개별적인 AML 환자들로부터의 말초혈로부터 분리하였다. 병리학 레포트에 의해 FLT3-ITD 상태를 밝히고 PCR로 확인하였다. 1차 세포 배양균을 지정된 농도의 화합물 1로 72시간 동안 처리하였으며, 이때 생존도를 MTS 어세이를 사용하여 평가하였다. 모든 값들을 약제의 부재 하에 배양된 세포의 생존도에 대해 정상화하였다.
도 13은 세포 성장 어세이에서 화합물 1의 급성 골수성 백혈병(AML)-유래된 KG1 세포에 대한 영향을 보여주는 그래프이다.
도 14는 세포 성장 어세이에서 wtFGFR2 SNUl 세포들과 비교하여, 화합물 1의 증폭된 FGFR2를 갖는 SNUl6 위암 세포들에 대한 영향을 보여주는 그래프이다.
도 15는 연한천 콜로니 형성 어세이에서 화합물 1의 SNUl6 위암 세포들에 대한 영향을 보여주는 그래프이다.
도 16은 세포 성장 어세이에서, wtFGFR2 HeclB 세포들과 비교하여, 화합물 1의 돌연변이 FGFR2(N549K)를 갖는 AN3CA 자궁내막암 세포들에 대한 영향을 보여주는 그래프이다.
도 17은 세포 성장 어세이에서, wtFGFR3 RT112 세포들과 비교하여, 화합물 1의 돌연변이 FGFR3b(Y375C)를 발현하는 MGH-U3 세포들에 대한 영향을 보여주는 그래프이다.
도 18은 세포 성장 어세이에서, wtFGFR3 NCI-H929 세포들과 비교하여, 화합물 1의 t(4;14) 전좌를 수반하며 돌연변이 FGFR3(K650E)을 발현하는 OPM2 다발성 골수종("MM") 세포들에 대한 영향을 보여주는 그래프이다.
도 19는 세포 성장 어세이에서, 돌연변이 FGFR4(Y367C)를 발현하는, 화합물 1의 MDA-MB-453 유방암 세포들에 대한 영향을 보여주는 그래프이다.
도 20은 화합물 1의 경구 투여가 FGFR2에 의한 AN3CA 자궁내막암 세포들을 지닌 이종이식 모델에서의 종양 성장에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다.
도 21은 화합물 1의 AN3CA 자궁내막암 세포들을 지닌 이종이식 모델에서의 경구 투여의 생체 내 약력학 및 약동학을 보여주는 그래프이다.
도 22는 화합물 1로 처리하자마자 자궁내막암 세포주(AN3CA 및 MFE-296) 및 야생형 FGFR2 세포주(Hec-l-B 및 RL95-2)의 세포 성장 어세이 결과를 보여주는 그래프이다.
도 23은 종양 성장시 AN3CA 자궁내막의 종양 이종이식에서 화합물 1의 경구 투여의 효과를 보여주는 그래프이다.
도 24a 및 24b는 세포 성장 어세이에서 화합물 1과 리다포롤리무스의 조합이 FGFR2-돌연변이 자궁내막암 세포들에 미치는 영향을 보여주는 그래프이다. 도 24a는 AN3CA 자궁내막암 세포주의 세포 성장 어세이 결과를 보여준다. AN3CA 세포를 처리하는데 사용되는 1×EC50 농도는 화합물 1에 대해서는 30nM이며, 리다포롤리무스에 대해서는 0.4nM이다. 도 24b는 MFE-296 자궁내막암 세포주의 세포 성장 어세이 결과를 보여준다. MFE-296 세포들을 처리하는데 사용되는 1×EC50 농도는 화합물 1에 대해서는 100nM이며, 리다포롤리무스에 대해서는 1nM이다. 데이터는 리다포롤리무스 단독에 대해("리다포롤리무스"), 화합물 1 단독에 대해("화합물 1"), 및 화합물 1과 리다포롤리무스의 조합에 대해("조합(Combination)") 도시되어 있다.
도 25a 및 25b는 화합물 1과 리다포롤리무스의 조합의 평균 유효 분석을 보여주는 그래프이다. 데이터는 AN3CA 세포주(도 25a) 및 MFE-296 세포주(도 25b)에 대해 도시되어 있다.
도 26은 처리에 따른 AN3CA 세포주에서 세포 주기 분석을 보여주는 그래프이다. 데이터에는 처리되지 않은("비처리된(untreated)") 세포들 또는 리다포롤리무스 단독으로 처리된, 화합물 1 단독으로 처리된, 또는 화합물 1과 리다포롤리무스의 조합으로 처리된 세포들이 도시되어 있다.
도 27은 가능한 FGFR2/MAPK 경로 및 mTOR 경로(Katoh M., J. Invest. Dermatol., 2009, 128: 1861-1867로부터 변경됨)를 보여주는 도식이다.
도 28a 및 28b는 AN3CA 자궁내막의 종양 이종이식에서 화합물 1과 리다포롤리무스의 경구투여의 효과를 보여주는 그래프이다. 도 28a는 10mg/kg 화합물 1과 리다포롤리무스의 적은 투여량 조합에 대한 데이터를 보여준다. 도 28b는 30mg/kg 화합물 1과 리다포롤리무스의 고 투여량 조합에 대한 데이터를 보여준다. 데이터는 리다포롤리무스 단독에 대해("Rid"), 화합물 1 단독에 대해("화합물 1"), 및 화합물 1과 리다포롤리무스의 조합에 대해("화합물 1, Rid") 도시되어 있다. 투여량은 괄호 안에 단위 mg/kg로 주어진다.
도 29는 리다포롤리무스 단독의, 화합물 1 단독의, 및 화합물 1과 리다포롤리무스의 조합의 경구 투여에 대한 약동학적 및 약력학적 데이터를 나타낸다. 데이터는 다양한 농도의 리다포롤리무스("Rid") 및 화합물 1("화합물 1")에 대해 도시되어 있다.

실시예 1: 만성 골수성 백혈병에 있어서 BCR - ABL 및 돌연변이의 억제

실험 방법

억제제: 이마티닙을 PBS 중에 용해시켜 10.0 mM 원액(stock solution)을 생성시키고, 10개의 분액(aliquot)으로 분배하고, -20 ℃에 저장하였다. 화합물 1, 닐로티닙 및 다사티닙을 DMSO 중에 용해시켜 10.0 mM 원액을 생성시키고, 10 μL 분액으로 분배하고, -20 ℃에 저장하였다. 각 실험에 사용하기 직전 10.0 mM 원액의 연속 희석을 수행하였다. 화합물 1 (3-(이미다조[l,2b]피리다진-3-일에티닐)-4-메틸-N-(4-((4-메틸피페라진-1-일)메틸)-3-(트리플루오로메틸)페닐)벤즈아마이드)이 본원에 기술된 바와 같이 제조될 수 있다.

ABL ^T315I 의 결정화 및 구조 결정: 화합물 1 복합체: 뮤린 ABL의 키나아제 도메인 (잔기 229-515)을 YopH 단백질 티로신 포스파타아제와 함께 대장균(E. coli)에서 공동발현 시키고, 이전에 보고된 바와 같이 (참고문헌) 정제하였다. 화합물 1의 존재 하에서 금속 친화성, 모노 Q, 및 크기 배제 크로마토그래피 컬럼의 조합을 이용하여 거의 동질성에 가깝게(> 95%) ABL^T315I의 정제를 수행하였다. 최종 정제된 화합물 1이 결합된 ABL^T315I의 일반적인 수율은 약 1 mg/L 였다. 동일 부피의 화합물 1:ABL^T315I 복합체 (25 mg/mL)와 웰 용액 (30% w/v 폴리에틸렌 4000, 0.2 M 소듐 아세테이트, 0.1 M Tris-HCl, pH 8.5)을 혼합함으로써 4 ℃에서 현적 증기 확산 방법(hanging drop vapor diffusion method)에 의해 ABL^T315I과 화합물 1의 공결정을 성장시켰다. 1 내지 2일 후, 결정은 50 x 50 x 300 μm³의 전형적인 크기에 이르렀고, 냉동보호제(cyroprotectant)로서 30% v/v 글리세롤이 보충된 모액 중에 수확하였다. X선 회절 데이터를 100K의 빔라인 19 BM (Advanced Photon Service, Argonne, IL)에서 수집하였다. HKL2000 패키지를 사용하여 공간군(space group) P21에서 데이터의 색인을 만들고 조정하였다. ABL^T315I과의 복합체에서 화합물 1의 구조를 이마티닙(PDB code: HEP)이 결합된 천연 ABL의 구조를 이용한 AMoRe에 의한 분자 대체(molecular replacement)에 의해 확인하였다. 비대칭 단위 중에 ABL^T315I 분자가 있었다. Quanta (Accelrys Inc., San Diego, CA)에서 매뉴얼 재구축과 더불어 구조물을 CNX로 정제하였고, 화합물 1을 몇차례의 정제 및 모델 구축 후의 밀도로 구축하였다. 추가적인 정제 및 모델 구축을 수렴에 이를 때까지 수행하였다. 1.95 A로 정제된 최종 모델은 활성화 루프 내의 386-397 잔기를 제외한 잔기 228 내지 511로 구성되며, 이는 장애를 갖는다. 결합된 억제제 화합물 1 뿐만 아니라 I315의 측쇄에 대한 전자 밀도는 두 복합체 모두에서 잘 분석되었으며, 억제제의 결합 모드에 대한 모호함을 남기지 않았다.

ABL ^T31SI 에 대한 자가인산화 분석: 전장(full length) 티로신-탈인산화된 ABL 및 ABL^T315I (Invitrogen; San Diego, CA)를 이용한 키나아제 자가인산화 분석을 이마티닙, 닐로티닙, 다사티닙 또는 화합물 1의 존재 하에서 이전에 기술된 바와 같이 수행하였다 (O'Hare et al. Blood 104:2532 (2004)). 사용된 억제제의 농도는 다음과 같았다: 0, 0.1, 1, 10, 100, 1000 nM.

세포주: Ba/F3 형질감염체 (전장, 천연 BCR-ABL 또는 단일 키나아제 도메인 돌연변이를 지닌 BCR-ABL을 발현함)를 37 ℃ 및 5% C0₂의 10% FCS, 1 단위/mL 페니실린 G 및 1 mg/mL 스트렙토마이신(완전배지)으로 보충된 RPMI 1640에서 유지시켰다. BCR-ABL1315A를 발현하는 Ba/F3 세포주는 캘리포니아대학교 샌프란시스코(UCSF)의 네일 샤 박사(Dr. Neil Shah)의 친절한 기증물이었다. 모세포 Ba/F3 세포는 WLHI-조정 배지에 의해 제공된 IL-3로 보충되었다. 세포 증식 분석에 앞서 RNA를 각 Ba/F3 세포주로부터 분리하였고, RT-PCR에 이어서 Mutation Surveyor 소프트웨어(SoftGenetics, State College, PA)를 이용한 DNA 서열 분석에 의해 키나아제 도메인 돌연변이를 확인하였다.

세포 증식 분석: Ba/F3 세포주를 96-웰 플레이트(4 x 10 세포/웰)로 분배하였고 화합물 1의 농도를 증가시키면서 72 시간 동안 배양하였다. 천연 또는 돌연변이 BCR-ABL을 발현하는 세포주에서 IC₅₀ 측정에 사용된 억제제의 농도는 다음과 같았다: 0, 0.04, 0.2, 1, 5, 25, 125 및 625 nM. 모세포 Ba/F3 세포에서 IC₅₀ 측정에 사용된 억제제의 농도는 다음과 같았다: 0, 1, 5, 25, 125, 625, 3125 및 10,000 nM. 메탄티오설포네이트(MTS)-기반 생존도 분석(CellTiter96 Aqueous One Solution 시약; Promega, Madison, WI)을 이용하여 증식을 측정하였다. IC₅₀ 값은 4번씩 수행된 3가지 독립된 실험의 평균값으로 보고되었다. CML 또는 정상 1차 세포를 이용한 세포 증식 실험을 위하여, 피콜 농도구배(GE Healthcare) 상에서 골수성 발증 (골수성 발증: M-BC) 환자의 말초 혈액 또는 건강한 개체로부터 단핵 세포를 분리하였다. 10% FBS, L-글루타민, 페니실린/스트렙토마이신 및 100μM β-머캅토에탄올로 보충된 RPMI에서 차등된 농도의 화합물 1 (0-1000 nM)에 걸쳐 96-웰 플레이트 (5 x 10⁴ 세포/웰)에 세포를 심었다. 72 시간 배양 후에, 세포를 MTS 분석 대상이 되게 하여 세포 생존도를 평가하였다. 모든 값은 약제가 없는 대조군 웰로 정규화하였다.

Ba /F3 세포주에서 CrkL 인산화: 천연 BCR-ABL 또는 BCR-ABL^T315I (웰당 5 × 10⁶)를 발현하는 Ba/F3 세포를 억제제의 부재 하에서 또는 이마티닙 (2000 nM), 다사티닙 (50 nM), 닐로티닙 (500 nM) 또는 화합물 1 (0.1-1000 nM)의 존재 하에서 10% FBS, L-글루타민 및 페니실린/스트렙토마이신으로 보충된 RPMI에서 4시간 배양하였다. 세포를 프로테아제 및 포스파타아제 억제제로 보충된 끓는 SDS-PAGE 로딩 버퍼로 직접 용해시켰다. 용해물을 SDS-PAGE의 대상이 되게 하였고, 항-CrkL 항체 C-20 (Santa Cruz)으로 면역블롯하였다. 차등적인 밴드 이동에 기초하여 인산화된 CrkL과 비인산화된 CrkL을 구별하였고, Lumi Imager (Roche) 상에서 농도계(densitometry)에 의해 밴드 신호 세기를 정량화하였으며, % 인산화된 CrkL로 표시하였다.

BCR - ABL ^T315I 환자 샘플의 화합물 1에 대한 생체 외( ex vivo ) 노출: 잘 알고 내린 동의(informed consent)를 얻은 후, BCR-ABL^T315I 돌연변이를 지닌 림프성 발증 중의 CML (CML L-BC)에 걸린 환자로부터의 말초 혈액 단핵 세포를 피콜 원심분리에 의해 분리하였다. RT-PCR 및 서열 분석은 샘플이 대부분 BCR-ABL^T315I 돌연변이를 함유하고 있다는 것을 보여주었다. 단핵 세포 (5 x 10⁶ 세포/웰)를 억제제의 부재 하에 또는 이마티닙 (1000 nM), 다사티닙 (50 nM), 닐로티닙 (200 nM) 또는 화합물 1 (50nM, 500 nM)의 존재 하에서, 20% BIT (StemCell), 40 g/mL 인간 저밀도 리포단백질 및 100μM β-머캅토에탄올로 보충된 무혈청 IMDM 배지 (Invitrogen)에서 밤샘 배양하였다. 세포 프로테아제 및 포스파타아제 억제제로 보충된 끓는 SDS-PAGE 로딩 버퍼로 직접 용해시켰다. 용해물을 SDS-PAGE의 대상이 되게 하였고, 항-CrkL 항체 C-20 (Santa Cruz)으로 면역블롯하였다. 차등적인 밴드 이동에 기초하여 인산화된 CrkL과 비인산화된 CrkL을 구별하였다. Lumi Imager (Roche) 상에서 농도계에 의해 밴드 신호 세기를 정량화하였다.

FACS 에 의한 글로벌 티로신 인산화: 억제제의 부재 하에 또는 이마티닙 (1000 nM), 다사티닙 (50 nM), 닐로티닙 (200 nM) 또는 차등된 농도의 화합물 1 (50, 500 nM)의 존재 하에서 단핵 세포 (2 × 10⁵)를 무혈청 배지에서 밤샘 배양하였다. 제조자의 설명서 (Caltag; San Diego, CA)에 따라 세포를 고정시키고 투과시켰으며, 2 μg의 항-포스포티로신 4G10-FITC 항체 (BD Biosciences, San Jose, CA)와 함께 1시간 동안 배양하였고, 1% BSA 및 0.1% 소듐 아지드로 보충된 PBS로 2회 세척하였으며, 1% 포름알데히드에 고정시켰다. FITC 신호 세기를 FACSAria 기계 (BD) 상에서 분석하였고, 평균 형광 세기 (MFI)를 계산하였다. 값들은 비염색 대조군에 상대적인 MFI의 폴드(fold) 증가로서 나타낸다.

1차 CML 세포 및 정상 골수의 조혈성 콜로니 형성 분석: BCR-ABL^T315I 및 정상 조혈성 전구세포를 품은 1차 CML 세포에 대한 화합물 1의 효과를 평가하기 위하여, 피콜 밀도 원심분리에 의해 분리된 골수 단핵 세포를 차등된 농도의 화합물 1 (CML 환자: 0, 10, 25, 50 nM; 건강한 개체: 0, 100, 200, 500, 1000 nM)과 함께 배양하였다. 세포를 50 ng/mL SCF, 10 ng/mL GM-CSF 및 10 ng/mL IL-3을 함유하는 1 mL의 IMDM:메틸셀룰로스 배지(1:9 v/v) (Methocult GF H4534; Stem Cell Technologies, Vancouver, British Columbia, Canada)에 3벌로 (5 × 10⁴ 세포/플레이트) 심어 과립백혈구/대식세포 콜로니 형성 (CFU-GM)을 평가하였다. 세포를 가습 인큐베이터에서 14-18일 동안 37℃에서 배양하였다. >50 세포/콜로니를 양성 콜로니 점수에 대한 기준으로 하여 콜로니 수를 세었다. 결과는 비처리 대조군±SEM에 상대적인 콜로니 비율로서 나타내었다.

약동학: 구강 튜브식(oral gavage)에 의한 1회량 투여 후에 CD-I 암컷 마우스에서 화합물 1의 약동학적 프로파일 (시트레이트 버퍼, pH 2.74에서)을 평가하였다. 혈액 샘플을 다양한 시점에서 수집하였고 혈장 내 화합물 1의 농도를 블랭크 마우스 혈장에서 준비된 교정 표준 및 단백질 침전을 이용한 내부 표준 LC/MS/MS 방법에 의해 측정하였다. 보고된 농도는 3-마우스/시점/투여군으로부터의 평균값이다.

Ba /F3 생존 모델: 천연 BCR-ABL 또는 BCR-ABL^T315I를 발현하는 Ba/F3 세포를 암컷 SCID 마우스의 미정맥(tail vein)으로 주사하였다 (무혈청 배지 중 100 μL의 1 x 10⁷ 세포/mL 현탁액). 시작 후 72시간 후, 마우스를 매일 1회씩 운반체 (25 mM 시트레이트 버퍼, pH 2.75), 화합물 1 또는 다사티닙과 함께 구강 튜브식으로 최대 19일 동안 연일 처리하였다. IACUC 가이드라인에 따라 동물이 빈사 상태가 되었을 때 동물을 희생시켰으며, 부검시 마우스의 평가는 종양 세포 침윤 때문에 일어난 비장 비대증으로 인한 사망과 일치하였다. 카플란-메이어(Kaplan-Meier) 방법을 이용해 생존 데이터를 분석하였고, 통계적 유의도를 운반체군과 함께 각 치료군의 생존 시간을 비교함으로써 로그순위법 (GraphPad PRISM)으로 평가하였다. p<0.05의 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였고 p<0.01의 값을 통계적으로 매우 유의한 것으로 간주하였다.

Ba /F3 종양 모델: BCR-ABL^T315I를 발현하는 Ba/F3 세포를 암컷 누드 마우스의 우측 옆구리로 피하 이식하였다 (무혈청 배지 중 100 μL의 1 x 10⁷ 세포/mL 세포 현탁액). 효능의 분석을 위해, 평균 종양 부피가 대략 500 mm³에 이르렀을 때 마우스를 상이한 치료군에 무작위로 배치하였다. 마우스를 매일 1회씩 운반체 (25 mM 시트레이트 버퍼, pH 2.75) 또는 화합물 1과 함께 구강 튜브식으로 최대 19일 동안 연일 처리하였다. 종양 부피 (mm³)는 다음 식을 이용해 계산하였다: 종양 부피 = L × W² × 0.5. 치료 기간이 끝났을 때 종양 성장 억제를 확인하기 위하여, 모든 동물들에 대하여 종양 부피의 변화율(percent change)을 다음 식을 이용하여 계산하였다: ΔV = (T_final - T_initial) / T_initial × 100, 여기서 T_initial은 치료 시작 시의 종양 부피이고 T_final은 동물이 희생된 시점의 부피이다. 각 치료군의 평균 종양 부피 변화를 일원 분산분석(one-way ANOVA) 테스트 (GraphPad PRISM)를 이용하여 다른 모든 군과 비교하였고 두네트의 테스트(Dunnett's test)를 이용하여 통계적 유의도를 위하여 운반체-처리된 마우스의 평균 종양 부피 변화와 비교하였으며, 여기서 p<0.05의 값을 통계적으로 유의한 것으로 간주하였고 p<0.01의 값을 통계적으로 매우 유의한 것으로 간주하였다. 티로신-인산화된 BCR-ABL 및 CrkL 수준의 분석을 위하여, 종양-함유 동물 (평균 종양 크기: 500 mm³)을 1회량의 운반체 또는 30 mg/kg 화합물 1과 함께 구강 튜브식으로 처리하였다. 마우스에 투약한지 6시간 후 (N=3/군), pBCR-ABL 및 eIF4E에 대한 항체 (Cell Signaling Technology) 및 전체 CrkL (C-20; Santa Cruz)을 이용한 웨스턴 블롯 분석을 위하여 동물을 희생시키고 종양 샘플을 수집하였다.

단일 제제 화합물 1을 이용한 가속화된 세포-기반 돌연변이유발 스크린: 천연 BCR-ABL을 발현하는 Ba/F3 세포를 N-에틸-N-니트로소우레아 (ENU; 50 μg/mL)로 밤샘 처리하고, 펠렛화하고, 신선 배지에 재현탁하고, 차등된 농도의 화합물 1로 보충된 200 μL 완전배지 중에 1 × 10⁵ 세포/웰의 밀도에서 96-웰 플레이트로 분배하였다. 도립 현미경 하에서 육안 검사에 의한 세포 성장 및 배지 색 변화를 관찰하기 위하여 28일의 실험 과정 전체에 걸쳐 매 2일마다 웰을 관찰하였다. 세포 생성물이 관찰되는 웰의 내용물은 초기 96-웰 플레이트와 동일한 농도에서 화합물 1로 보충된 2 mL 완전배지를 함유하는 24-웰 플레이트로 옮겼다. 만약 주어진 조건의 모든 웰에서 성장이 동시에 관찰되었다면, 추가적인 분석을 위하여 24개의 대표적인 웰들을 확장시켰다. 컨플루언시(confluency)에서, 24-웰 플레이트 내의 세포를 원심분리에 의해 수집하였다. DNEasy Tissue 키트 (QIAGEN, Inc., Valencia, CA)를 이용하여 세포 펠렛으로부터 DNA를 추출하였다. BCR-ABL 키나아제 도메인을 프라이머 B2A (5' TTCAGAAGCTTCTCCCTGACAT 3') 및 ABL4317R (5' AGCTCTCCTGGAGGTCCTC 3')을 사용하여 증폭시켰고, 프라이머 ABL3335F (5' ACCACGCTCCATTATCCAGCC 3') 및 ABL4275R (5' CCTGCAGCAAGGTAGTCA 3')을 사용하여 상업적 계약자(Agencourt Bioscience Corporation, Beverly, MA)에 의해 PCR 산물을 양방향으로 시퀀싱하였으며, Mutation Surveyor 소프트웨어 (SoftGenetics, State College, PA)를 이용하여 돌연변이에 대한 크로마토그램을 분석하였다. 이러한 스크린으로부터의 결과는 3개의 독립적인 실험으로부터의 누적형 데이터로 나타낸다 (표 2 참고). 단일의 독립된 실험에서 BCR-ABL^T315I (표 3 참고) 또는 BCR-ABL^E255V (표 4 참고)를 발현하는 Ba/F3 세포로 시작하는 단일 제제 화합물 1에 대한 돌연변이유발 스크린을 또한 전술한 바와 같이 수행하였다.

결과

(1) ABL ^T315I 과의 복합체에서 화합물 1의 X선 결정학적 분석.

최근의 X선 결정학적 연구들은 천연 ABL에서 T315의 측쇄로 이루어진 것과는 달리, ABL 돌연변이의 키나아제 도메인 내의 T3151 돌연변이가 이마티닙, 닐로티닙 및 다사티닙 각각의 수소 결합 형성을 방해하는 단일 점 돌연변이로 작용함을 밝혀내었다. 화합물 1의 DFG-아웃 결합 모드 및 단백질 접합의 종합적인 네트워크는 다음의 적어도 한 가지의 중요한 차이를 제외하고는 이마티닙의 경우와 유사하다: 화합물 1 내의 에티닐 결합은 다른 억제제와 나타나는 입체적 충돌을 피하고 I315와의 생산적인 반데르발스 상호작용을 허용하도록 분자를 위치시킨다.

(2) 화합물 1은 ABL ^T315I 의 촉매 활성을 억제한다.

이마티닙, 닐로티닙 및 다사티닙과 비교한 화합물 1의 활성을 정제된, 탈인산화된, 전장 천연 ABL 키나아제 및 ABL^T315I 키나아제 단백질을 이용한 생화학적 분석으로 시험하였다. 전장 ABL^T315I 키나아제의 시험관 내 [γ-³²P]-ATP 자가인산화에 의해 측정시, 각각의 억제제가 천연 ABL의 효소적 활성을 감소시킨 반면, 오직 화합물 1만이 ABL^T315I 돌연변이에 대해 효과적이었다. ABL^G250E, ABL^Y253F 및 ABL^E255K를 포함하는 추가적인 임상적으로 적절한 시험된 이마티닙-저항성 ABL 돌연변이들에 대하여 화합물 1에 의한 유사한 강력한 억제를 관찰하였다. 이러한 결과는 화합물 1이 직접적으로 ABL^T315I 키나아제 돌연변이를 포함하여 천연 및 키나아제 도메인 돌연변이 ABL 키나아제를 표적화한다는 것을 확립한다.

(3) 화합물 1은 BCR - ABL ^T315I 를 포함하여 천연 또는 돌연변이 BCR - ABL 을 발현하는 Ba /F3 세포의 성장을 억제한다.

모세포 Ba/F3 세포 및 천연 BCR-ABL 또는 키나아제 도메인 (M244V, G250E, Q252H, Y253F, Y253H, E255K, E255V, T315A, T315I, F317L, F317V, M351T, F359V 또는 H396P) 내에 단일 돌연변이를 지니는 BCR-ABL을 발현하는 Ba/F3 세포를 이용하여 세포성 증식 분석을 수행하였다. 화합물 1은 천연 BCR-ABL을 발현하는 Ba/F3 세포의 증식을 강력하게 억제하였다 (IC₅₀: 0.5 nM). 특히, BCR-ABL^T315I 돌연변이 (IC₅₀: 11 nM)를 포함하여 시험된 모든 BCR-ABL 돌연변이는 화합물 1에 민감했다 (IC₅₀: 0.5-36 nM; 표 1). 아넥신 V를 이용한 염색은 화합물 1에 의한 증식의 억제가 아포토시스의 유도와 연관성이 있음을 보여주었다 (데이터 미도시). 1713 nM의 화합물 1의 농도까지도 모세포 Ba/F3 세포의 성장 억제가 IC₅₀에 도달하지 못했으며, 이는 억제 효과가 BCR-ABL 억제와 연관됨을 암시한다.

또한 환자-유래의 BCR-ABL-양성 및 -음성 세포주의 패널(panel)에 대하여 화합물 1을 시험하였다. K562, KY01 및 LAMA 세포 (발증의 CML 환자 유래)의 강력한 성장 억제를 관찰한 반면, IC₅₀이 Ba/F3 모세포의 IC₅₀과 비슷하거나 그보다 컸던 3가지 상이한 BCR-ABL-음성 백혈병 세포주에 대하여서는 유의한 활성을 관찰하지 못했다 (표 1).

(4) 화합물 1은 BCR - ABL ^T315I 를 발현하는 세포에서 BCR - ABL -매개 시그널링을 억제한다.

천연 BCR-ABL 또는 BCR-ABL^T315I를 발현하는 Ba/F3 세포에서의 표적 억제를 확인하기 위하여, 직접 BCR-ABL 기질 CrkL 및 BCR-ABL의 티로신 인산화 상태를 시험하였다 (도 1). CrkL 티로신 인산화 상태의 모니터링은 1차 인간 세포에서 BCR-ABL 키나아제 활성을 평가하는 편리한 수단을 제공하며, 새로운 BCR-ABL과 관련된 CML 임상 시험에서 바람직한 약력학적 분석법인데 (Druker et al. N Engl J Med 344:1031 (2001); Talpaz et al. N Engl J Med 354:2531 (2006)), 이는 단백질 가수분해의 불안정성으로 인해 1차 세포 용해물에서 인산화된 BCR-ABL 티로신 인산화 상태의 직접적인 측정이 실현 불가능하기 때문이다. 비교를 위하여, 임상 ABL 억제제인 이마티닙, 닐로티닙 및 다사티닙을 포함시켰다. CrkL 겔 이동 분석에서, 티로신-인산화된 CrkL의 비율은 BCR-ABL의 억제에 직접적으로 반응하여 감소한다. 시험된 모든 억제제가 천연 BCR-ABL을 발현하는 Ba/F3 세포에 대하여 효과적이었던 반면 (도 1a), 오직 화합물 1만이 T315I 돌연변이에 대한 활성을 보였다 (도 1b). 천연 BCR-ABL 또는 BCR-ABL^T315I를 발현하는 Ba/F3 세포에서의 유사한(parallel) 실험에서 BCR-ABL 인산화 억제를 관찰하였다. 시험된 천연 BCR-ABL 또는 BCR-ABL^T315I를 발현하는 Ba/F3 세포에서 이마티닙, 닐로티닙, 다사티닙 또는 화합물 1을 이용하여 밤새 BCR-ABL 인산화를 평가하였다. pBCR-ABL 및 eIF4E (로딩 대조군)에 대한 항체를 이용하여 면역블롯 분석에 의해 샘플을 분석하였다.

(5) 화합물 1을 이용한 CML 1차 세포의 치료는 세포성 증식을 억제한다.

BCR-ABL-유도 백혈병에 걸린 환자로부터 유래된 1차 세포에 대한 화합물 1의 효능을 평가하기 위하여, CML 골수성 발증 환자로부터의 단핵 세포 또는 건강한 개체로부터의 단핵 세포를 차등된 농도의 화합물 1에 노출시키고, 72시간 후에 생존한 세포를 분석하였다. 생화학적 및 세포주 생존도 데이터와 일관되게, 화합물 1은 정상 세포에 비해 1차 CML 세포에서 대략 500배 더 낮은 IC₅₀ 값을 갖는 생존한 세포수의 선택적 감소를 유도하였다 (도 2a).

(6) 화합물 1은 BCR - ABL ^T315I 키나아제 활성 및 정상 세포에 대해 최소한의 독성을 갖는 1차 CML 세포에서의 콜로니 형성을 억제한다.

T3151 돌연변이를 지닌 CML 림프성 발증 환자로부터 수득한 단핵 세포의 화합물 1에 대한 생체 외 노출 후에 뒤따르는 표적 억제를 평가하기 위하여, Ba/F3 세포주에 대하여 기술한 것과 유사한 분석을 수행하였으며, 여기서 세포를 억제제의 존재 하에서 밤샘 배양하였고, 수확하여 용해시키고, 면역블롯에 의해 CrkL 인산화를 분석하였다. 다른 3가지 임상 ABL 억제제들 중 어느 것도 아무런 효과를 나타내지 않은 반면 화합물 1에의 노출은 인산화된 CrkL 신호의 감소를 초래하였으며 (도 2b), 이러한 환자로부터의 세포의 FACS에 의한 글로벌 티로신 인산화 분석에서도 유사한 결과를 수득하였다 (도 2c).

또한 BCR-ABL을 지닌 CML 가속기 환자로부터의 단핵 세포 및 건강한 개체로부터의 단핵 세포를 이용한 골수성 콜로니 형성 분석에서 화합물 1의 효능을 평가하였다. 세포를 억제제의 존재 하의 메틸셀룰로스에 심었고, 대략 14일 내지 18일 동안 배양하였으며, 도립 현미경으로 세포수를 세었다. 닐로티닙 또는 다사티닙 모두 T315I 환자로부터의 세포에 대하여 어떠한 효과도 나타내지 않은 반면, 화합물 1은 농도-의존적 방식으로 콜로니 형성을 억제하였다 (도 3a). 대조적으로, 화합물 1은 정상 조혈모세포에 대하여 500nM 미만의 농도에서 독성을 나타내지 않았으며 (도 3B), 이는 정상 세포를 이용한 세포성 증식 분석과도 일관된다 (도 2a).

(7) 경구 화합물 1은 BCR - ABL ^T315I -의존성 질병에 걸린 마우스에서 생존을 연장시키고 종양 존재량(종양 Burden )을 감소시킨다.

화합물 1의 생체 내 약동학적 프로파일을 시험하기 위하여, CD-1 마우스에 1회량의 화합물 1을 (2.5 또는 30 mg/kg) 구강 튜브식으로 투여하였고, 화합물 1의 혈장 농도를 투여 후 2시간, 6시간 및 24시간 째에 LC/MS/MS에 의해 측정하였다. 화합물 1은 2.5 mg/kg 용량으로 처리된 마우스에서 2시간, 6시간 및 24시간 째에 각각 89.6, 58.2 및 1.9nM의 평균 혈장 수준을 달성하도록 경구로 생물학적으로 사용 가능하였다. 증가된 30 mg/kg 용량에서, 평균 혈장 수준은 2시간, 6시간 및 24시간 째에 각가 781.7, 561.3 및 7.9nM에 도달하였다. 2.5 mg/kg (AUC_{0 -24h}: 767 nmol·h/mL) 내지 30 mg/kg (AUC_{0 -24h}: 7452 nmol·h/mL) 용량에서 용량-노출 비례성을 관찰하였다. 이와 함께, 이러한 데이터는 모든 시험된 BCR-ABL 돌연변이에서 보통의 경구 용량으로 시험관 내 IC₅₀ 값을 초과하는 화합물 1의 혈액 수준이 수시간 동안 지속될 수 있다는 것을 입증해 준다.

다음으로 일부 잘 확립된 CML 마우스 모델에서 화합물 1의 생체 내 활성을 평가하였다. 우선, 천연 BCR-ABL을 발현하는 Ba/F3 세포가 마우스의 미정맥으로 정맥내 주사된 생존 모델에서 활성을 시험하였다. 도 4a에 나타난 바와 같이, 화합물 1 또는 다사티닙을 이용한 치료는 운반체-처리된 마우스의 19일의 중앙 생존에 비해 생존을 연장시켰다. 효과있는 식이요법으로 보고된 5-mg/kg 다사티닙의 일일 경구 용량은 (Lombardo et al., J Med Chem 47:6658 (2004)) 중앙 생존을 27일로 연장시켰다 (p<0.01). 유사하게, 2.5 및 5 mg/kg 화합물 1의 일일 경구 용량은 중앙 생존 기간을 각각 27.5일 및 30일로 연장시켰다 (두 용량 수준 모두에 대하여 p<0.01).

그 후에 화합물 1의 활성을 생존 모델 BCR-ABL^T315I를 발현하는 Ba/F3 세포를 이용한 이러한 동일한 생존 모델에서 평가하였다. 16일의 중앙 생존을 갖는 운반체-처리 마우스와 비교하여, 화합물 1의 처리는 (최대 19일 동안) 생존을 용량-의존적 방식으로 연장시켰다 (도 4b). 2.5 mg/kg 화합물 1의 매일 경구 투여가 중앙 생존을 단지 0.5일까지 증가시킨 반면 (p>0.05), 5, 15 및 25 mg/kg으로 투여된 화합물 1은 중앙 생존을 각각 19.5일, 26일 및 30일로 상당히 연장시켰다 (3가지 모든 용량 수준에 대하여 p<0.01). 대조적으로, 이러한 T315I 생존 모델을 이용한 독립적인 유사(parallel) 연구는 운반체 또는 다사티닙으로 처리된 마우스 간에 중앙 생존에 있어서 차이가 없다는 것을 확인하였다 (도 5).

화합물 1의 항-종양 활성을 BCR-ABL^T315I을 발현하는 Ba/F3 세포가 마우스로 피하 주사된 이종이식(xenograft) 모델에서 추가로 평가하였다. 10 및 30 mg/kg의 매일 경구 투여에 따른 (%T/C = 각각 68% 및 20%; 두 용량 수준 모두에 대하여 p<0.01) 종양 성장의 상당한 억제와 함께, 운반체 처리된 마우스에 비해 화합물 1에 의해 종양 성장이 용량-의존적 방식으로 억제되었다 (도 4c). 50 mg/kg 화합물 1의 매일 경구 투여는 치료 시작시에 비해 최종 측정시 평균 종양 부피의 96% 감소와 함께 상당한 종양 퇴행을 초래하였다 (%T/C = 0.9%, p<0.01). 표적 억제를 확인하기 위하여, 운반체 또는 화합물 1의 1회 투여 후 6시간 째에 마우스로부터 수확한 종양에서 인산화된 BCR-ABL^T315I 및 인산화된 CrkL의 수준을 평가하였다. 도 4c에 나타난 바와 같이, 30 mg/kg의 단일 경구 투여는 인산화된 BCR-ABL 및 인산화된 CrkL 수준을 뚜렷하게 감소시켰다.

(8) 단일 제제 화합물 1은 저항성 서브클론의 생성물을 완전히 억제하기에 충분하다.

세포 증식 Ba/F3 패널에서, 특히 화합물 1-특이적 돌연변이에서, 탐색되지 않은 저항성에 대한 취약점의 잠재적 위치를 조사하기 위하여 (예를 들어, 억제제-효소 접합 잔기) 그리고 화합물 1이 다른 단일 제제 억제제들에 비해 장점을 제공하는지 여부를 평가하기 위하여, 이전에 이마티닙, 닐로티닙 및 다사티닙에 대하여 입증했었던 우리의 확립된 가속화된 돌연변이유발 분석에서 이 화합물을 시험하였다.

천연 BCR-ABL을 발현하는 Ba/F3 세포로 시작한 일련의 실험에서, 화합물 1의 일부 농도에서 (5-40 nM) 저항성 프로파일을 확립하였으며 관찰된 돌연변이의 범위 및 생성물을 지닌 웰의 비율 모두에서 농도-의존적 감소를 발견하였다 (도 6a). 5nM 화합물 1에서, 모든 웰은 (576/576) 생성물을 보였고 90%의 시퀀싱된 대표적인 서브클론은 천연 BCR-ABL을 발현하였다 (표 2). 화합물 1의 농도를 10nM까지 증가시키는 것은 생성물의 뚜렷한 감소 (168/1440 웰; 11.7%) 및 돌연변이된 서브클론의 증가된 빈도 (33.1%; 표 2) 모두를 초래하였다. 회수된 돌연변이는 일부의 P-루프 잔기에서 발생된 것(G250, Q252, Y253 및 E255), C-헬릭스 (K285, E292 및 L298) 및 T315 (T315I)에서 또는 부근의 클러스터, F317, V339, F359, L387 및 S438을 포함하였다. 회수된 돌연변이들 중에서 거의 모두가 이전에 이마티닙 저항성 (또는 닐로티닙 또는 다사티닙 저항성)을 겪었었다 (O'Hare et al. Blood 110:2242 (2007)에서 검토됨). 화합물 1에 특이적인 신규한 돌연변이는 없었다. 위치 Y253, T315 및 F317은 접합 잔기이며, K285는 핵심적인 수소 결합 기여 인자인 E286에 인접해 있다.

T315I를 완전히 억제하는 농도에서 계속되는 돌연변이는 화합물 1에 대한 저항성에 있어서 핵심적인 사항을 대표하는 것일 수 있기 때문에, 다음으로 20nM 화합물 1을 조사하였고, 생성물이 급격히 감축되어 단지 2개의 돌연변이, E255V 및 T315I만이 지속되는 것을 발견하였다 (3/1440 웰; 0.2%; 도 6a, 표 2). 따라서, 우리의 광범위한 조사 내에서, 화합물 1에 대한 높은 수준의 저항성을 부여할 수 있는 이전에 발견되지 않은 돌연변이는 확인되지 않았다. 모세포 BaF/3 세포에 대한 IC₅₀ 보다 40배 넘게 낮은 40nM 화합물 1에서, 시험관 내 저항성의 완전 억제가 달성되었다. 이러한 저항성 생성물의 부재는 더 높은 농도의 화합물 1 (80, 160, 320 nM; 데이터 미도시)에서 추가로 확인하였다. 우리의 지식으로는, 다른 어떠한 단일 제제 BCR-ABL 억제제도 이러한 능력을 갖는 것으로 보이지 않았다.

(9) 복합 돌연변이에 대한 화합물 1의 영향.

이마티닙 및 하나 이상의 구조 치료제 (salvage therapy) (예컨대 FDA-승인된 2차 ABL 키나아제 억제제들 중 하나)의 실패에 있어서 화합물 1의 치료법이 시험될 것이기 때문에, T315I 또는 다른 저항성-부여 돌연변이의 선재(pre-existence)에 대한 상당한 가능성이 있다. 비록 지금까지 희귀하고 단지 적은 수의 사례들만이 기록되어 있지만, 환자는 또한 동일한 대립유전자에 선재하는 돌연변이와 함께 2차 키나아제 도메인 돌연변이와 관련된 복합 BCR-ABL 돌연변이로 기능을 상실할 수도 있다 (Khorashad et al. Blood 111:2378 (2008); Shah et al. J Clin Invest 117:2562 (2007); Stagno et al. Leuk Res 32:673 (2008)). 단일 키나아제 도메인 돌연변이의 수준에서 아주 제한된 저항성 민감성 프로파일을 발견하여, 우리는 복합 돌연변이에 대한 화합물 1의 취약점을 조사하고자 하였다.

화합물 1이 지배적인 T315I 서브클론을 갖는 환자를 치료하는 데에 사용되는 상황을 자극하기 위하여, 가속화된 돌연변이유발 분석을 다시 수행하였으며, 이번에는 기존의 T315I 돌연변이를 배경으로 시작하였다 (도 8b 및 표 3). 농도-의존적 체계가 아직 있었으며, 억제제가 여전히 모든 시험된 복합 돌연변이를 조절할 수 있었음을 발견하였다. Y253H/T315I 및 E255V/T315I를 제외한 모든 복합 돌연변이를 화합물 1의 160nM 농도에서 제거하였다. 320nM에서, 단 하나 남은 복합 돌연변이는 2개의 가장 저항력이 있는 단일 돌연변이를 연결한 E255V/T315I였으며, 생성물은 아직도 모세포 Ba F3 세포의 IC₅₀보다 3배 가까이 낮은, 가장 높은 시험된 농도 (640 nM)에서 완전히 억제되었다. 이러한 저항성 프로파일을, 화합물 1에 대하여 가장 저항력이 있는 단일 BCR-ABL 키나아제 도메인 돌연변이인 BCR-ABL^E255V의 배경으로부터 시작한 이후의 스크린에서, 320nM로 지속되고 640nM에서 제거되는 E255V/T315I 복합 돌연변이와 함께 확인하였다 (표 4).

고찰

화합물 1은 ABL 및 ABL^T315I의 키나아제 도메인의 불활성 DFG-아웃 형태에 결합하고 T315I 돌연변이 근위의 탄소-탄소 삼중 결합을 특징으로 하는 ABL 키나아제 억제제이다. X선 결정학적 연구는 화합물 1이 DFG-아웃 결합 모드의 ABL^T315I에 결합한다는 것을 확인해주었다. 화합물 1은 광범위한 수소 결합 네트워크를 유지하였고, 또한 이마티닙의 결합 부위와 상당히 중첩되는 키나아제의 영역을 차지하였다. 화합물 1은 많은 반데르발스 접합과 함께 키나아제에 대하여 5개의 수소 결합을 형성하여, 키나아제의 강력한 억제를 초래하였다 (ABL^T315I IC₅₀: 2.0 nM; 천연 ABL IC₅₀: 0.37 nM). 추가적으로, 삼중 결합 그 자체는 1315의 측쇄와 함께 생산적인 소수성 접합을 만들도록 최적으로 배치되며, 이의 선형 모양 및 견고한 기하학적 구조는 입체적 충돌을 피하고 화합물 1의 나머지 2개의 부분을 이들의 확립된 결합 주머니로 배치시키는 신축성 없는(inflexible) 커넥터로서 작용하는 형태적인 제약을 강요한다.

세포성 증식 분석에서 화합물 1의 평가는 BCR-ABL^T315I를 포함하여 천연 또는 키나아제 도메인 돌연변이 BCR-ABL을 발현하는 세포에 대한 화합물 1의 강력한 pan-BCR-ABL 억제 뿐만 아니라 Ph-음성 세포를 너머 필라델피아 염색체 (Ph)-양성 세포에 대한 높은 수준의 선택성을 확인해 주었다 (표 1). Ba/F3 세포에서, 이는 천연 BCR-ABL 및 모세포를 발현하는 세포들 사이의 민감성에 3000배보다 큰 차이를 가져왔다 (천연 IC₅₀: 0.5 nM; 모세포 IC₅₀: 1713 nM). 결과는 세포성 분석에서 (도 2a) 뿐만 아니라 조혈성 콜로니 형성 분석에서 (도 3) 화합물 1로 생체 외 처리한 1차 CML 세포 대 정상 세포와 일치하였다. 시험된 BCR-ABL 키나아제 도메인 돌연변이들 중에서, E255V 돌연변이가 화합물 1에 대해 가장 저항력이 있었으며 (IC₅₀: 36 nM), 이 돌연변이는 높은 수준의 저항성을 이마티닙에, 그리고 중간 수준의 저항성을 닐로티닙과 다사티닙 모두에 부여하는 것으로 보고되었다 (O'Hare et al. Blood 110:2242 (2007)). 특히, 그러나, 잔기 Y253 및 F359에서의 돌연변이 (닐로티닙 실패 당시에 보고되었음 (Kantarjian et al. Blood 110:3540 (2007)), 뿐만 아니라 F317에서의 돌연변이 (다사티닙에 대한 임상적 저항과 관련 있는 것으로 시사됨 (Burgess et al., Proc Natl Acad Sci U S A 102:3395 (2005))는, T315I 세포와 비슷하거나 이보다 적은 IC⁵⁰ 값에서 화합물 1에 의해 강력하게 억제되었다 (표 1).

BCR-ABL 시그널링의 재활성화는, 특히 만성기 질병을 가진 환자에서, 임상적 ABL 억제제에 대한 키나아제 도메인 돌연변이-매개 저항성의 자주 관찰되는 특성이기 때문에, 천연 및 돌연변이 BCR-ABL의 확립된 직접 기질인 CrkL 인산화에 대하여 면역블롯 분석에 의해 BCR-ABL^T315I-발현 세포들을 분석하였다. 시험관 내 Ba/F3 세포 및 생체 외 1차 CML BCR-ABL^T315I 세포 모두에서, 화합물 1을 이용한 치료는 % pCrkL에 뚜렷한 감소를 초래하는 반면, 3가지 임상적 ABL 억제제 중 어느 것도 아무런 효과를 나타내지 못했다 (도 1b 및 도 2b). Ba/F3 세포에서 pBCR-ABL 및 pBCR-ABL^T315I의 수준을 조사할 때 유사한 억제를 관찰하였고, % pCrkL 판독의 유효성을 확인하였다. 이러한 CrkL 이동 분석은 ABL 키나아제 억제제의 약력학적 효능을 시험하는 바람직한 수단이며, 화합물 1의 1기 평가에서 화합물 1에 대해서도 사용될 것이다.

화합물 1은 천연 BCR-ABL 또는 BCR-ABL^T315I에 의해 유도된 일련의 CML 마우스 모델에서 경구 투여 후의 강력할 활성을 입증해주었다. 천연 BCR-ABL을 발현하는 Ba/F3 세포를 이용한 생존 모델에서, 화합물 1은 2.5 및 5 mg/kg의 적은 투여량에서 생존을 상당히 연장시켰다 (도 4a). 5 mg/kg의 다사티닙을 사용하여 유사한 효능을 관찰하였으며, 이는 동일한 용량 수준에서, 마우스에서 천연 BCR-ABL에 대한 화합물 1의 생체 내 활성이 다사티닙의 경우와 유사함을 보여준다. 중요한 것은, BCR-ABL^T315I를 발현하는 Ba/F3 세포를 이용한 생존 및 피하 CML 모델 모두에서, 화합물 1은 5, 15 및 25 mg/kg에서 마우스의 생존을 현저하게 연장시켰다 (도 4b). 피하 종양 모델에서 종양 울체 또는 퇴행은 30 및 50 mg/kg에서 발생하였으며, BCR-ABL 시그널링 억제는 30 mg/kg의 용량에서 관찰되었다 (도 4c). 화합물 1은 본 연구에 사용된 모든 용량 수준에서 잘 용인되었다(tolerated). 이러한 결과는 몇가지 암시를 갖는다. 첫째로, 화합물 1이 경구로 생물학적으로 이용 가능하다는 사실은 임상에서 이전에 시도되어 왔던 다른 T315I 억제제들에 비해 장점을 제공한다. 특히, ABL/오로라(ABL/Aurora) 키나아제 억제제 MK-0457 및 PHA-739358은 모두 BCR-ABL 활성을 억제하기에 충분한 투여량을 달성하기 위하여 정맥주사 투여를 필요로 한다 (Giles et al. Blood 109:500 (2007); Gontarewicz et al. Blood 111 :4355 (2008)). 추가적으로, 이러한 억제제들은 모두 정상 세포 및 BCR-ABL^T315I 세포 모두를 비슷한 농도에서 억제한다. 대조적으로, 우리의 생체 내 데이터는 BCR-ABL^T315I 의존적인 CML 동물 모델에서 화합물 1이 5 내지 50 mg/kg의 넓은 치료적 범위를 가짐을 보여준다.

우리는 이전에 이마티닙, 닐로티닙 및 다사티닙에 임상적 저항성을 부여하는 BCR-ABL 키나아제 도메인 돌연변이의 스펙트럼을 예측하기 위하여 우리의 가속화된 세포-기반 돌연변이유발 스크린을 사용하였었다 (Bradeen et al. Blood 108:2332 (2006)). 각각의 2차 ABL 억제제로 치료된 CML 환자에 대한 추가적인 후속(follow-up) 데이터가 이용 가능해지면서, 몇몇 돌연변이들은 우리의 시험관 내 프로파일링과 상당히 일치하는 닐로티닙 (L248R, Y253H, E255K/V, T315I, F359I/V; (Kantarjian et al. Blood 110:3540 (2007)) 또는 다사티닙 (V299L, T315I, F317I/L; (Shah et al. J Clin Invest 1 17:2562 (2007))의 실패와 연관된 것으로 보고되었다. 화합물 1에 대한 우리의 가속화된 돌연변이유발 스크린에서, 우리는 생성물을 지닌 웰의 비율 및 관찰된 돌연변이의 범위 모두에서 농도-의존적 감소를 발견하였다. 비록 10nM 화합물 1에서 13개의 상이한 잔기에 걸쳐 16가지 상이한 치환을 관찰하였지만, 농도를 20nM로 급하게 증가시키는 것은 관찰된 전체 생성물 (10 nM에서 11.7%; 20 nM에서 0.2%) 및 회수된 돌연변이 유형 모두를 감소시켰다 (도 6a 및 표 2). 오직 20nM에서 회수된 저항성 서브클론만이 T315I 또는 E255V 돌연변이를 지녔으며, 40nM 화합물 1 및 20nM 화합물 1에서 생성물의 완전한 억제를 관찰하였다 (도 6a 및 표 2). 우리의 데이터는 적절한 수준으로 투여된 화합물 1이 단일-돌연변이-기반 저항성에 대한 민감성으로부터 면제될 수 있음을 암시한다. 단일 제제 화합물 1을 이용한 이러한 결과는, 닐로티닙 또는 다사티닙과 전임상 T315I 억제제의 이중-조합물의 존재 하에서만 이 분석에서 이전에 달성되었다 (O'Hare et al. Proc Natl Acad Sci U S A 105:5507 (2008)).

저항성 생성물을 억제하는 화합물 1의 능력의 정도를 추가로 탐구하기 위하여, 2개의 개별적으로 가장 저항성인 돌연변이들, BCR-ABL^T315I 또는 BCR-ABL^E255V를 발현하는 Ba/F3 세포의 배경에서 시작하는 가속화된 돌연변이유발 스크린을 수행하였다. 이러한 예측법은 특정한 복합 돌연변이, 특히 화합물 1에 대한 높은 수준의 저항성의 중간(moderate)인 Y253H, E255V 및 T315I로 구성된 세트 중 임의의 2개의 구성원과 관련된 복합 돌연변이를 암시하였다 (표 3 및 4). 이들 중에서, Y253H/T315I 및 E255V/T315I가 화합물 1에 대하여 가장 저항성인 쌍으로 예측된다 (도 6b 및 표 3 및 4). 특히, T315I 구성의 존재는 현재 승인된 임상적 BCR-ABL 억제제들 중 아무것도 이러한 돌연변이들에 활성을 갖지 않을 것임을 암시한다. 따라서, 화합물 1은 모든 다른 억제제에 매우 저항성일 것으로 예측될 수 있는 T315I 및 E255V와 관련된 복합 돌연변이를 제거하는 능력을 갖는다. 현재, BCR-ABL의 키나아제 도메인 내의 복합 돌연변이는 흔치 않으나 (표 5), 이들의 확산이 환자의 연장된 생존 및 순차적인 ABL 키나아제 억제제 치료를 받는 더 많은 환자들과 함께 증가할 것이며, 현재 이러한 돌연변이를 지닌 그러한 환자들에게 엄청난 문제를 나타내는 것으로 생각할 수 있다. 비록 어떠한 돌연변이유발 스크린도 전적으로 완전할 수는 없겠지만, 우리의 데이터는 화합물 1에 대한 결합을 완전히 없앨 수 있는 돌연변이가 충분한 키나아제 활성의 보존과 양립될 수 없을 것임을 시사한다. 이러한 각본 하에서, 억제로부터의 탈출이 "기능적 자살"의 대가로서 얻어질 것이다.

우리의 생화학적, 세포-기반 및 생체 내 연구의 조합된 결과는, 적절한 양으로 투여된 화합물 1이 천연 BCR-ABL 및 모든 시험된 BCR-ABL 돌연변이에 대하여 충분한 활성을 나타내 pan-BCR-ABL 억제제로서의 단일 제제 용도에 대한 고려를 타당하게 함을 시사한다. 또한, 우리의 결과는 화합물 1이 T315I와 관련된 복합 돌연변이를 조절할 가능성이 있음을 보여주며, 그러나 또한 단일-돌연변이 단계에서 저항성 서브클론을을 제거하는 것이 유리하다는 의식을 깨우쳐준다.

실시예 2: 임상 시험

화합물 1은 BCR-ABL^T315I, 천연 효소 및 모든 다른 시험된 변이체의 효소적 활성을 강력하게 억제하는, 경구적으로 이용가능한 티로신 키나아제 억제제이다. 이는 또한 < 40 nM의 IC₅₀을 갖는 이러한 BCR-ABL 변이체를 발현하는 세포주의 생존을 억제한다.

화합물 1의 안정성을 평가하고 임상적 활성의 예비 평가를 제공하기 위하여 1상 임상 시험을 수행하였다. 시험은 개방-표지(open-label) 용량 증가(dose escalation) 디자인을 채택하였다. 화합물 1은 본원에 기술된 바와 같이 합성하고 포뮬레이션하였다.

치료에 불응성이고 (또는 재발된 또는 이용가능한 표준 치료법이 없는), ECOG 상태 ≤ 2, QTcF ＜ 450 ms, 충분한 간과 신장 기능 및 정상 심기능을 갖는 혈액암 환자가 적격이었으며, 화합물 1의 단일 일일 경구 용량을 투여하였다. 혈액암은 CML (임의의 기(phase)), ALL, AML, MDS, MM 또는 CLL을 포함하였다. 또한, 환자는 등록 전 ≥ 21일 동안 화학요법을 받지 않거나 ≥ 14일 동안 시험용 제제를 받지 않았어야 한다.

57명의 환자가 (30명의 남성) 등록하고 치료를 받았고, 중간 나이는 61세 (26-85세 범위), 진단으로부터의 중간 연수는 5.4년 (0-21년)이었다. 진단은 50명의 CML (37명의 만성기 [CP], 7명의 가속화기 [AP], 6명의 급성기 [BP]), 3명의 Ph+ ALL, 그리고 4명의 다른 암 (2 골수섬유증, 1 골수종 및 1 MDS)을 포함하였다. 48명의 Ph+ 환자 중 BCR-ABL 돌연변이 상태는 돌연변이가 없는 14명의 환자와 돌연변이를 지닌 34명의 환자(14명의 T315I, 5명의 F317L, 4명의 G250E, 3명의 2개 이상의 돌연변이, 그리고 F359C 및 F359V를 포함하는 다른 돌연변이를 나타낸 나머지. 다른 특이한 돌연변이는 M351T, L273M/F359V, G250E, E279K, F359C, L387F 및 E453K였다.)를 포함하였다. 53명의 Ph+ 환자에서의 (CML 및 ALL) 사전 치료는 이마티닙 (환자의 96%), 다사티닙 (87%) 및 닐로티닙 (57%)을 포함하였고, 여기서 35명의 환자는 ≥ 3의 사전 TKI를 받았고 50명의 환자는 ≥ 2의 사전 TKI를 받았다.

환자들을 다음의 투여량 수준으로 치료하였다: 2㎎ (3명의 환자), 4㎎ (6명의 환자), 8㎎ (7명의 환자), 15㎎ (8명의 환자), 30㎎ (7명의 환자), 45㎎ (13명의 환자) 및 60㎎ (13명의 환자). 45㎎이 추가적인 조사를 위한 최대 내성 용량 (MTD)으로 확인되었다. 환자내 용량 증가(intra-patient dose escalation)를 허용하였다.

예비적 안정성 및 효능 데이터는 다음과 같이 나타났다: 2 내지 30㎎ 집단: DLT 없음; 45㎎ 집단: 가역성 발진이 1명의 환자에게 나타남; 60㎎ 집단: 4명의 환자가 가역성 췌장 관련 DLT (췌장염)가 생김. 가장 일반적인 임의 단계의 약제-관련 유해 사례 (AE)는 혈소판 감소증 (25%), 빈혈, 리파아제 증가, 구역질과 발진 (각각 12%), 및 관절통, 피로와 췌장염 (각각 11%)이었다.

약동학적 및 약력학적 (PK/PD) 연구는 중수소화된 화합물 1을 내부 표준으로 이용한 혈장 분석 (PK)과 전체 수준에 상대적인 BCR-ABL 기질 CRKL (p-CRKL)의 인산화된 수준의 측정 (PD)을 포함하였다. 처음 24시간 동안, 그리고 사이클 1 (C1)의 8, 15 및 22일 (D), 및 사이클 2 (C2)의 1일 (Dl) 째에 (사이클 = 28일) 투약에 앞서 샘플링을 수행하였다. PD 효과에 대한 분류는 평가할 수 없음 (기준치에서 p-CRKL ≤ 20%이거나 분석하기에 너무 적은 샘플), 일시적임 (2 이상의 투여 후 시점에서 p-CRKL 억제 ≥ 50%*, 하지만 사이클 1 동안 지속적이지 않음), 지속적임 (2 이상의 투여 후 시점에서 p-CRKL 억제 ≥ 50%*이며 사이클 1 동안 지속적임) 또는 효과 없음 (상기 기준에 의한 p-CRKL 억제 없음)을 포함하였다. *은 기준치 p-CRKL이 너무 낮아 (예컨대, 35%) ≥ 50% 감소를 믿을 수 있게 정량할 수 없는 경우 ≥ 25% 억제가 용인됨을 나타낸다.

약동학적 데이터는 화합물 1의 반감기가 19-45 시간임을 보여주었다. ≥ 30㎎ 용량에서, 반감기는 18 시간이다. 도 7a 및 도 7b는 투약 범위에 걸쳐 용량에 대한 Cmax와 AUC의 선형 관계를 보여준다. 도 7c 및 도 7d는 농도 시간 프로파일을 보여준다. 30㎎ 용량에서 1일 째의 Cmax는 대략 55 nM였다. 반복 투약 후에, 평가 가능한 환자에서 1.5 내지 3배 축적을 관찰하였다.

60㎎의 화합물 1을 매일 투여 받은 환자에 대한 약동학적 데이터가 표 6에 제공된다.

60㎎으로 매일 투여시의 평균 정상 상태 최저 혈중 농도(trough level) (1회의 28일 사이클 후의 투여 후 24 시간에서의 농도)는 약 45 ng/mL이며, 이는 이러한 개체체에서 저항성 서브클론의 발생을 억제하는데 유용할 수 있는 순환 농도인 약 90nM의 순환 혈장 농도에 상응한다. 30㎎ 이상의 용량에서 최저 혈중 농도는, 돌연변이 분석이 신생 클론의 완전한 억제를 입증했던 농도인 40nM (21 ng/mL)을 상회하였다 (도 6a와 같음).

PD 데이터는 8㎎ 및 그 초과의 용량에서 CrkL 인산화의 억제를 보여준다. 도 8a에 나타난 바와 같이, 전체 집단에서는 ≥ 8㎎ 용량에서, T315I 환자에서는 ≥ 15㎎ 용량에서 지속적인 표적 억제를 관찰하였다. 도 8b-8e는 상이한 투여량 및 상이한 돌연변이를 갖는 환자에 대한 약력학적 데이터를 보여준다. 종합적으로 가장 우수한 혈액학적 반응은 새로운 CHR 및 기준치 CHR을 포함하는 22명의 CP 환자 중 중 22명 (85%)에서의 완전 혈액학적 반응 (CHR), 그리고 12명의 AP, BP 또는 ALL 환자 중 5명에서의 주요 혈액학적 반응 (MHR)이었다. 세포유전학적 반응은 8명의 완전 세포유전학적 반응 (CCyR) 및 12명의 MCyR이었다. T315I 하위집합에서 가장 우수한 혈액학적 반응은 새로운 CHR 및 기준치 CHR을 포함하는 9명의 CP 환자 중 8명에서의 (89%) CHR, 그리고 8명의 AP, BP 또는 ALL 환자 중 3명에서의 MHR이었다. 12명의 T315I 환자 중 9명은 CyR에 대해 평가할 수 있었다: 5명의 CP 및 1명의 AP, BP 또는 ALL 환자는 CCyR을 달성하였고, 6명의 CP 및 3명의 AP, BP 또는 ALL은 MCyR을 달성하였다. 분자적 반응은 32명의 CP AML 환자 중 8명의 MMR을 포함하였다 (기준치에서 T315I 환자 중 4명).

결론: 최대 30㎎ 용량의 화합물 1에서는 DLT는 관찰되지 않았으며, 더 높은 용량에서 가역성 DLT가 관찰되었다. PK 및 PD는 30㎎에서의 혈액 수준이 T315I를 포함하는 저항성 돌연변이 BCR-ABL 이소폼의 시험관 내 억제에 필요한 정도를 초과함을 입증해 준다. 예비적 분석은 BCR-ABL의 T315I 돌연변이를 지닌 환자를 포함하여 승인된 2차 TKI인 다사티닙 및 닐로티닙에 저항성을 지닌 환자에서 임상적 항종양 활성의 증거를 밝혔다. 따라서 수득한 결과는 멀리 (1) 전체 집단에서 8mg 또는 그 초과의 용량에서 관찰되는 일관된 지속적인 표적 억제, (2) T315I 환자에서 15㎎ 용량 수준 또는 그 초과에서 관찰되는 지속적인 표적 억제, (3) MTD로서의 45㎎의 화합물 1의 확인, 및 (4) 치료를 받는 환자에서 저항성 서브클론의 발생을 억제하는데 필요한 높은 용량이 심각한 유해 사례 없이 용인됨을 보여준다. 화합물 1의 pan-BCR-ABL 활성에 대한 역치를 상회하는 최저 혈중 약제 농도가 ≥ 30 mg 용량에서 관찰된다. ≥ 15㎎ 용량에서, T315I를 포함하는 다양한 돌연변이를 지닌 환자에서 BCR-ABL의 지속적인 억제가 있었다. 이와 함께, 이러한 발견들은 현재 이용가능한 TKI로 실패했던 불응성 Ph+ 환자에서 항-백혈병 활성의 임상적 증거에 대한 연관성을 잘 보여준다.

실시예 3: 급성 골수성 백혈병에 있어서 FLT3 돌연변이의 억제

실험 방법

세포주, 항체 및 시약: MV4-11, RS4;11, 카스미-(Kasumi-1) 및 KG1 세포를 미국 종균협회 (American Type Culture Collection, Manassas, VA)로부터 수득하였고, EOL1 세포를 DSMZ (Braunschweig, Germany)로부터 수득하였다. 10% FBS (카스미-1 세포의 경우 20%)로 보충된 RPMI 1640을 이용하여 37 ℃, 5% (v/v) C0₂에서 표준 기술에 따라 세포를 유지시키고 배양하였다. 화합물 1을 아리아드 파마슈티칼스 (Cambridge, MA)에서 합성하였고, 소라페닙과 수니티닙을 아메리칸 커스텀 케미컬 코포레이션 (American Custom Chemical Corporation, San Diego, CA)으로부터 구입하였다. 모든 화합물은 DMSO 중에서 10 mM 원액으로 제조하였다. 사용된 항체는 다음을 포함하였다: 산타 크루즈 바이오테크놀로지 (Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA)로부터의 포스포-PDGFRα, PDGFRα, FLT3, FGFR1 및 GAPDH; 세포 시그널링 테크놀로지 (Cell Signaling Technology, Beverly, MA)로부터의 ST∧T5, KIT, 포스포-KIT, 포스포-FGFR 및 포스포-FLT3; BD 바이오사이언스 (BC Biosciences, San Jose CA)로부터의 포스포-STAT5.

세포 생존도 분석: Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, Madison WI)를 이용하여 세포 생존도를 평가하였다. 기하급수적으로 증가하는 세포주를 96-웰 플레이트에 심고 37 ℃에서 밤샘 배양하였다. 심은지 24시간 후에, 세포를 화합물 또는 운반체 (DMSO)로 72시간 동안 처리하였다. Wallac Victor 마이크로플레이트 리더 (PerkinElmer, Waltham, MA)를 이용하여 형광을 측정하였다. 데이터를 운반체-처리된 세포에 대한 상대적인 생존도 비율로 나타내었고, Microsoft Excel의 XLfit 버전 4.2.2를 이용해 IC₅₀ 값을 (50% 억제를 일으키는 농도) 계산하였다. 데이터는 각각 3회씩 수행된 3가지 독립된 실험으로부터의 평균 (± SD)으로 나타낸다.

면역블롯 분석: 수용체 티로신 키나아제 시그널링의 억제를 시험하기 위하여, 세포를 다양한 범위의 농도(0.03-100 nM)의 화합물 1로 1시간 동안 처리하였다. 세포를 아이스-콜드 SDS 용해 버퍼 (0.06 M Tris-HCL. 1% SDS 및 10% 글리세롤)에서 용해시키고, BCA 단백질 분석 (Thermo Scientific, Rockford, IL)을 이용하여 단백질 농도를 측정하였다. 세포성 용해물을 (50 μg) 전기영동에 의해 분해하고(resolve) NuPage 시약 (Invitrogen, Carlsbad, CA)을 이용하여 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 막을 인산화된 항체로 면역블롯하였고, 그 후 리스토어 웨스턴 블롯 스트리핑 버퍼 (Thermo Scientific)로 스트리핑 하였고, 전체 단백질 항체로 면역블롯 하였다. 운반체-처리된 세포에 상대적인 화합물 1-처리된 세포에서 인산화된 단백질 비율로 나타냄으로써 IC₅₀ 값을 계산하였다.

아포토시스 분석: 카스파아제 활성의 측정을 위해, MV4-11 세포를 검게 가려진 96-웰 플레이트에 1 × 10⁴ 세포/웰로 24시간 동안 심고, 그 후 지시된 시점 동안 화합물 1을 처리하였다. Apo-One Homogeneous Caspase 3/7 시약 (Promega, Madison, WI)을 제조자의 프로토콜에 따라 첨가하였고, Wallac Victor 마이크로플레이트 리더에서 형광을 측정하였다. PARP 절단을 측정하기 위하여, MV4-11 세포를 6-웰 플레이트에 심었고, 다음날 화합물 1을 24시간 동안 처리하였다. 치료 종료 후에, 세포를 SDS 버퍼로 용해시키고 면역블롯하여 전체 PARP 및 절단된 PARP 발현을 측정하였다 (세포 시그널링 테크놀로지).

피하 이종이식 모델: 피드몬트 리서치 센터 (Piedmont Research Center, Morrisville, NC)에 의해 MV4-11 인간 종양 이종이식 효능 연구를 수행하였다. 간단하게는, 암컷 CB.17 SCID 마우스의 우측 옆구리로의 MV4-11 세포 (50% 마트리겔 중 1 × 10⁷)의 피하 이식에 의해 종양 이종이식을 수행하였고, 투약은 평균 종양 부피가 ~200 mm³에 도달하였을 때 시작하였다. 화합물 1을 25 mM 시트레이트 버퍼 (pH=2.75) 운반체 중에 희석하였고, 마우스에 경구적으로 매일 1회씩 4주 동안 투여하였다. 종양을 캘리퍼스를 이용해 밀리미터 단위로 2차원적으로 (길이 및 너비) 측정하였다. 종양 부피 (mm³)는 다음 식을 이용해 계산하였다: 종양 부피 = (길이 × 너비 )/2. 종양 성장 억제 (TGI)는 다음과 같이 계산하였다: TGI = (l-ΔΤ / ΔC) × 100, 여기서 ΔΤ는 각 치료군의 평균 종양 부피 변화를 나타내고, AC는 대조군의 평균 종양 부피 변화를 나타낸다. 종양 부피 데이터를 수집하고 일원 분산분석 테스트 (GraphPad Prism, San Diego, CA)로 분석하여 군들 사이의 전반적인 차이를 측정하였다. 통계적 유의도를 위해 각각의 화합물 1 치료군들을 두네트의 다중 비교 테스트 (Dunnett's Multiple Comparison Test)를 이용하여 운반체 대조군과 추가로 비교하였다. p-값 <0.05를 통계적으로 유의한 것으로 간주하였고 p-값 <0.01을 통계적으로 매우 유의한 것으로 간주하였다.

약동학 및 약력학: MV4-11 이종이식 종양 확립 후에, 마우스에 단일 경구 용량의 화합물 1을 투여하였고, 6시간 후에 종양을 수확하였다. 개개의 종양을 프로테아제 및 포스파타아제 억제제를 함유한 아이스-콜드 RIPA 버퍼에서 균질화하였고 원심분리에 의해 정화(clarify)하였다. 샘플을 SDS-PAGE에 의해 분해하여 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼으며, 전체 및 인산화된 FLT3 및 STAT5에 대한 항체로 면역블롯 하였다. 혈장 내 화합물 1의 농도를 블랭크 마우스 혈장에서 준비된 교정 표준 및 단백질 침전을 이용한 내부 표준 LC/MS/MS 방법에 의해 측정하였다. Below quantitation limit (BQL) = <1.2 ng/ml 화합물 1. 보고된 농도는 4개의 마우스/군으로부터의 평균값이다.

1차 AML 환자 샘플의 생체 외 치료: 모든 환자의 샘플은 출처를 밝히지 않았으며 오리건 보건과학 대학의 임상시험 심사위원회로부터의 승인과 함께 잘 알고 내린 동의를 얻어 수집하였다. 단핵 세포를 피콜 농도구배에 따라 급성 골수성 백혈병 환자의 말초 혈액으로부터 분리하였고, 적혈구 세포 용해가 뒤따랐다. Guava ViaCount 시약 및 Guava Personal Cell Analysis 유세포 분석기 (Guava Technologies, Hayward, CA)를 이용하여 세포를 정량하였다. 세포를 10% FBS, 페니실린/스트렙토마이신, L-글루타민, 펀지존(fungizone) 및 10^-4 M 2-머캅토에탄올로 보충된 RPMI 중의 차등된 농도의 화합물 1 (1-1000 nM)에 걸친 96-웰 플레이트 (웰당 5 × 10⁴)에 심었다. 72시간 배양 후에, 세포 생존도의 평가를 위하여 세포를 MTS 분석 (Cell Titer Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay, Promega)의 대상이 되게 하였다. 모든 값들은 어떠한 약제도 없이 심어진 세포의 생존도에 대하여 정규화하였고, 생존도 비율을 각 샘플에 대한 화합물 1의 IC₅₀을 결정하는데 사용하였다. FLT3 상태는 각 환자로부터의 게놈 DNA에 대한 PCR에 의해 측정하였다.

결과

(1) 화합물 1은 돌연변이, 구성적으로 활성 FLT3 , KIT , FGFRl 및 PDGFR α에 의해 유도된 조혈성 세포주에서 시그널링 및 증식을 억제하였다.

화합물 1은 각각 13, 13, 2 및 1nM의 IC₅₀을 갖는 FLT3, KIT, FGFRl 및 PDGFRα의 시험관 내 키나아제 활성을 억제한다. 여기서, 화합물 1의 활성은 FLT3 (FLT3-ITD; MV4-11 세포) 및 KIT (N822K; 카스미-1 세포)에서 돌연변이를 활성화하거나, FGFR1 (FGFR1OP2-FGFR1; KG-1 세포)과 PDGFRα (FIP1L1-PDGFRα; EOL-1 세포)의 융합을 활성화하는 잠복처인 백혈병 세포주의 패널에서 평가하였다. 화합물 1은 0.3 내지 20nM의 IC₅₀으로 모든 4개의 RTK의 인산화를 용량-의존적 방식으로 억제하였다 (표 7).

백혈병유발 (Chalandon et al. Haematologica. 90:949-968 (2005))을 유도하는데 중요한 이러한 활성화된 수용체들과 일관되게, 화합물 1은 또한 0.5 내지 17nM의 IC₅₀을 갖는 모든 4개의 세포주의 생존을 강력하게 억제하였다 (도 9, 표 7). 반면, 이러한 4개의 수용체에서 돌연변이를 활성화시키지 못하는 RS4;11 세포의 억제에 대한 IC₅₀은 >100 nM였다. 이러한 데이터들은 화합물 1이 이러한 비정상적 RTK들 중 하나를 발현하는 백혈병 세포를 선택적으로 표적화함을 시사한다.

다음으로 병렬적인 동일한 세포주 패널의 생존에 대한 이들의 효과를 시험함으로써, 화합물 1의 효능 및 활성 프로파일을 2개의 다른 다중-표적화 키나아제 억제제, 소라페닙과 수니티닙의 효능 및 활성 프로파일과 비교하였다. FLT3 (각각 4 및 12nM의 IC₅₀) 및 PDGFRα (0.5 및 3 nM)에 대하여 소라페닙과 수니티닙의 강력한 억제 활성이 관찰된 반면 , 두 화합물 모두 화합물 1이 KIT (59 및 56 nM) 또는 FGFR1 (>100 및 >100 nM)에 대하여 갖는 높은 효능을 나타내지 못했다 (표 7).

(2) 화합물 1의 MV4 -11 세포에 대한 강력한 아포토시스 효과

AML에서 FLT3-ITD 돌연변이의 주요 임상적 관련성을 고려하여, 이후의 연구들은 이러한 표적에 대한 화합물 l의 활성의 특성에 초점을 맞추었다. FLT3-ITD-유도 MV4-11 세포의 생존에 대한 화합물 1의 효과의 근거를 시험하기 위하여, 아포토시스의 2가지 마커에 대한 화합물 1의 효과를 측정하였다. 10-30nM의 화합물 1에서 치료 16시간 이내에 보여진 최대의 유도 (최대 4배)와 함께, 카스파아제 3/7 활성에서 용량- 및 시간-의존적 증가가 관찰되었다 (도 10). 유사하게, ≥ 10nM 농도에서, 화합물 1은 세포 생존의 중요한 조절자, 돌연변이 FLT3-ITD 키나아제의 직접적 다운스트림 기질 (Choudhary et al. Blood. 110:370-374 (2007)) 및 STAT5의 인산화의 공동 억제, 및 PARP 절단의 최대치에 가까운 유도를 보여주었다. 종합하면, 이러한 데이터들은 화합물 1에 의한 FLT3-ITD의 억제가 아포토시스의 유도를 통한 MV4-11 세포 생존을 억제한다는 결론을 뒷받침해 준다.

(3) 생체 내 효능 및 약력학적 연구

화합물 1의 생체 내 FLT3-ITD-유도 종양 성장에 대한 효과를 시험하기 위하여, 화합물 1(1-25 mg/kg) 또는 운반체를 경구적으로 매일 1회씩 28일 동안 MV4-11 이종이식편을 지닌 마우스에 투여하였다. 도 11a에 나타난 바와 같이, 화합물 1은 용량-의존적 방식으로 종양 성장을 강력하게 억제하였다. 시험된 가장 낮은 용량인 1㎎/kg의 투여는 종양 성장의 상당한 억제를 야기하였으며 (TGI=46%, p<0.01), 2.5 mg/kg 또는 그 초과의 용량은 종양 퇴행을 초래하였다. 특히, 10 또는 25 mg/kg의 투약은 31일의 추적 조사(follow up) 동안 감지 가능한 종양의 검출 없이 완전하고 지속적인 종양 퇴행을 야기했다.

생체 내 표적 조절을 확인하기 위하여, MV4-11 이종이식편을 지닌 마우스에 단일 경구 용량의 운반체 또는 화합물 1을 1, 2.5, 5 또는 10 mg/kg으로 투여하였다. 6시간 후에 종양을 수확하였으며 인산화된 FLT3 및 STAT5 수준을 면역블롯 분석에 의해 평가하였다. 1회량의 1 mg/kg 화합물 1은 FLT3 시그널링에 대하여 보통의 억제 효과를 가졌으며, p-FLT3 및 p-STAT5의 수준을 대략 30% 까지 감소시켰다. 5 및 10 mg/kg 용량이 시그널링을 각각 대략 75 및 80% 까지 억제하면서, 증가된 용량의 화합물 1은 증가된 시그널링의 억제를 야기하였다. 약동학적 분석은 화합물 1의 혈장 내 농도와 FLT3-ITD 시그널링의 억제 사이의 양성의 연관성을 입증해 주었다 (도 11b). 이러한 데이터들은 화합물 1에 의한 시그널링의 억제가 효능의 정도와 관련이 있음을 보여주며 (도 11a), FLT3-ITD 시그널링의 억제가 이러한 모델에서 화합물 1의 항종양 활성의 이유가 된다는 결론을 뒷받침한다.

(4) 1차 AML 세포에서 화합물 1의 활성

AML 환자로부터의 1차 세포에서 화합물 1의 활성을 평가하기 위하여, 4명의 환자로부터 말초 혈액 모세포를 수득하였다; 야생형 FLT3을 발현하는 3명과 FLT3-ITD 돌연변이를 지니는 1명. FLT3 상태는 각 환자로부터의 게놈 DNA에 대한 PCR에 의해 확인하였다. 화합물 1에 72시간 동안 노출시킨 후에 세포 생존도를 측정하였다 (도 12). 세포주에서 얻은 결과와 일관되게, 야생형 모세포는 시험된 농도에서(최대 100 nM) 생존도를 감소시키지 않은 반면, 화합물 1은 FLT3-ITD 양성 1차 모세포의 생존도를 IC₅₀ 4nM로 감소시켰다. 종합하면, 이러한 발견들은 화합물 1이 FLT3-ITD 돌연변이를 지닌 백혈병 세포에 대하여 선택적인 세포독성을 갖는다는 결론을 뒷받침한다.

고찰

본원에서, 이러한 수용체들 각각의 활성화된 형태를 함유하는 백혈병 세포주를 이용하여, 우리는 화합물 1이 키나아제, 혈액암의 발병에서 시사되는 별개의 집합의 키나아제 (FLT3, KIT, 및 FGFR과 PDGFR 패밀리의 구성원)에 대하여 BCR-ABL에 대하여 관찰되는 것과 유사한 효능으로 활성을 나타낸다는 것, 즉, 표적 단백질 인산화의 억제 및 세포 생존에 대한 IC₅₀이 각각 0.3 -20nM 및 0.5 - 17nM 범위였음을 보인다. 다른 다중 표적화된 키나아제 억제제들, 예컨대 소라페닙 및 수니티닙은 이전에 이러한 키나아제의 하위집합에 대해 억제 활성을 갖는 것으로 나타났었다. 하지만, 우리는 화합물 1이 높은 효능으로 4가지 키나아제 모두의 활성을 억제하는 능력에 있어서 독특했음을 발견하였다. 화합물 1이 본원에서 시험된 모델에서 FLT3, KIT, FGFR1 및 PDGFRα에 대한 효능을 동등하게 보여주기 때문에, 화합물 1은 이러한 키나아제가 역할을 하는 질병의 치료에 유용할 수 있다.

FGFR1 및 PDGFRα의 유전적 재배열을 지닌 MPN은 흔치 않은 것으로 여겨진다; 하지만, 그 결과 생성된 융합 단백질은 이들 질병들의 발명에 주요한 역할을 하는 것이 입증되었다 (Gotlib et al. Leukemia 22:1999-2010 (2008); Macdonald et al. Acta Haematol. 107: 101-107 (2002)). EMS는 치료가 없으면 급격하게 AML로 변할 수 있는 공격성(aggressive disease) 질병이다. 우리는 본원에서 화합물 1이 FGFR1OP2-FGFR1 융합 단백질에 의해 유도되는 AML KG1 세포주의 생존을 강력하게 억제함을 보여, 이러한 질병 유형에서 화합물 1의 임상적 적용 가능성을 뒷받침하였다. PDGFRα 융합을 지닌 HEL/CEL 환자는 PDGFR 억제제 이마티닙으로 처리시 급격한 혈액학적 반응을 달성하며 (Gotlib et al. Leukemia 22:1999-2010 (2008)), 우리는 백혈병 EOL 세포주에서 입증했던 바와 같이 화합물 1이 FIPlLl-PDGFRα 융합 단백질에 대한 강력할 활성을 가짐을 보였다. 하지만, BCR-ABL에서의 T315I 게이트키퍼 잔기와 유사한 위치에서 돌연변이된 PDGFRα의 T674I 돌연변이는 환자에서 이마티닙에 대한 저항성을 부여하는 것으로 확인되었다 (Gotlib et al. Leukemia 22:1999-2010 (2008)). 중요한 것은, 화합물 1이 PDGFRα T674I 돌연변이 키나아제에 대하여 3nM의 IC₅₀의 강력할 활성을 가지며, 이는 이러한 융합 단백질을 가지는 환자의 치료에 대한 화합물 1의 적용을 뒷받침한다.

AML에서 FLT3-ITD 변형의 발생 및 예후의 유의성은 모두 이러한 키나아제가 질병의 발병에 핵심적인 역할을 한다는 것을 보여주며 (Levis et al. Leukemia 17:1738-1752 (2003)), 그와 같이, 치료제 발명에 대한 주요 표적을 나타낸다. 세포주 MV4-11을 발현하는 FLT3-ITD를 이용한 본원에 보고된 연구들에서, 우리는 시험관 내와 생체 내 모두에서의 FLT3 활성의 억제와 종양 세포 생존의 억제 사이의 밀접한 관계를 보여준다. 시험관 내, 화합물 1의 낮은 nM 농도는 (즉, <10 nM) FLT3 인산화의 감소, 생존도의 감소 및 아포토시스 마커의 증가를 야기하였다. 생체 내 이종이식 모델에서, 일일 경구 용량의 1 mg/kg 화합물 1은 종양 성장의 상당한 억제를 야기했으며, 5 mg/kg 또는 그 초과의 용량은 종양 퇴행을 야기했다. FLT3의 억제로 인한 것인 종양 성장에 대한 효과와 일관되게, 1회량의 1 mg/kg 화합물 1은 FLT3-ITD 및 STAT5 인산화의 부분적 억제를 야기했고, 반면 5 및 10 mg/kg의 용량은 상당한 억제를 야기했다. 마지막으로, 화합물 1은 FLT3-ITD 양성 AML 환자로부터 분리한 1차 모세포의 생존을 강력하게 억제하였으나 (4 nM의 IC₅₀), 3명의 FLT3 야생형 환자로부터 분리한 것은 그렇지 못하였다 (IC₅₀ >100 nM).

FLT3 활성을 갖는 다수의 화합물이 기술되었고, 지금까지 보고된 비교적 보통의 임상적 활성을 갖는 일부는 이미 환자에서 평가되었다 (예컨대, Stirewalt et al. Nat. Rev. Cnacer 3:650-665 (2003); Chu et al. Drug Resist. Updat. 12:8-16 (2009); Weisberg et al. Oncogene Jul 12 2010). FLT3-의존적 AML 세포 사멸에 효과적이기 위해 FLT3 억제가 지속적일 필요가 있음을 보인 전임상 시험에 기초하여, 극대화된 치료적 이점을 달성하기 위해서는 지속적이고 거의 완전한 FLT3 키나아제 억제가 필요할 것이라는 견해가 등장했다 (Pratz et al. Blood 113:3938-3946 (2009)). 우리의 시험관 내 연구는 완전한, 즉 지속적인 상당한, FLT3 인산화 및 기능의 억제가 ≤10nM 농도에서 수득될 수 있음을 입증하였다. 중요하게는, 견딜만한 수준으로 투여하였을 때, 화합물 1의 약동학적 특성의 예비적 분석은 40nM을 초과하는 최저 혈중 농도를 입증하였다 (즉, 다음의 매일 투여에 앞서). 이러한 데이터들은 화합물 1의 효능 및 약리학적 특성이 환자에서 지속적이고 거의 완전한 FLT3의 억제를 허용한다는 결론을 뒷받침해준다.

화합물 1은 FLT3의 강력한 억제를 나타내고 FLT3-ITD 돌연변이를 지닌 AML 세포에 세포독성인 다중-표적화 키나아제 억제제이다. 중요한 것은, 이 제제는 혈액암의 발병에도 역할을 하는 것으로 나타난 추가적인 RTK, FGFRl, KIT 및 PDGFRα에 대한 활성을 나타낸다. 특히, 이러한 시험관 내 RTK에 대한 화합물 1의 효능 및 인간에서 관찰된 화합물 1의 혈장 수준은 이러한 표적들에 대한 화합물 1의 임상적 역할을 뒷받침한다. 종합하면, 이러한 관찰들은 AML 및 다른 혈액암, 예컨대 KIT, FGFRl 또는 PDGFRα에 의해 유도된 혈액암에 대한 신규한 치료제로서의 화합물 1의 개발에 대한 강력한 전임상적 근거를 제공하며, 타당한 것으로 인정된다.

실시예 4: FLT3 돌연변이를 지닌 AML 환자에서 예비적 결과

실시예 3에서 논의했던 매우 유의적인 세포-기반 결과를 너머, 예비적 임상 시험 결과는 매일의 p.o로 주어지는 45㎎의 화합물 1로 치료 후 FLT3-ITD 돌연변이를 지닌 불응성 AML 환자에서의 완전 반응을 포함한다. 종합적으로, 이러한 결과들은 FLT3-ITD 유도 AML 및 다른 혈액암 환자에서 화합물 1의 개발을 뒷받침한다. 또한, 다른 키나아제에 대한 억제 프로파일을 고려할 때, 포나티닙이 또한 KIT, FGFRl, PDGFRα 또는 다른 키나아제, 천연 또는 돌연변이에 의해 유도된 다양한 암에 대해 중요한 역할을 할 수 있다.

실시예 5: 화합물 1의 키나아제 선택성 프로파일

시약: 본원에 기술된 바와 같이 화합물 1을 합성하였다. 다음의 화합물들은 구입하였다: PD173074 (Calbiochem, Gibbstown, NJ), BMS-540215 (American Custom Chemical, San Diego, CA), CHIR-258 및 BIBF-1120 (Selleck Chemical Co, London ON, Canada).

키나아제 분석: IC₅₀을 측정하기 위한 키나아제 억제 분석을 리액션 바이올로지 코포레이션 (Reaction Biology Corporation, RBC, Malvern, PA USA)에서 수행하였다. 화합물을 1μM에서 시작하는 3배 연속 희석과 함께 10-포인트 곡선을 이용하여 10μM ATP에서 시험하였다. 2개의 분석으로부터의 평균 데이터를 나타낸다.

세포 성장 분석: Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, Madison, WI) 또는 CyQuant cell proliferation Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 세포 성장을 평가하였다. 세포를 심고 24시간 후에 세포를 화합물로 처리하고 72시간 동안 성장시켰다. 시간 0에서 (치료 시점) 세포수를 검사하고 Microsoft Excel의 XLfit 버전 4.2.2를 사용하여 운반체(디메틸 설폭시드, DMSO) 처리된 세포에 대한 상대적인 성장 비율로 데이터를 나타냄으로써 50% 성장 억제를 유발하는 농도 (GI50)를 측정하였다. 데이터는 3회씩 수행된 3가지 독립된 실험으로부터의 평균 (±SD)으로 나타낸다.

연한천 ( soft agar ) 콜로니 형성 분석: CytoSelect 96-Well Cell Transformation Assay (Cell Biolabs, San Diego, CA)를 이용하여 연한천 분석을 수행하였다. 간단하게는, 세포를 0.08% 한천에 재현탁하고 96-웰 플레이트 내 0.06% 한천 상에 심었다. 심는 시점에서 세포를 화합물 1로 1회 처리하였고 8-10일 동안 배양하였다. 세포는 제조자의 프로토콜에 따라 아이오도니트로테트라졸리움클로라이드(Sigma, St. Louis, MO)로 염색하거나, 염료로 가용화하고 정량화였다. "ND"는 측정할 수 없었음을 의미한다.

웨스턴 면역블롯팅: 세포를 심은지 24시간 후에 처리하고 억제제와 함께 1시간 동안 배양하였다. 세포를 SDS 버퍼 또는 포스포-SafeTM 버퍼 (Novagen, Gibbstown, NJ)에서 용해시키고, 단백질 용해물을 밤샘 면역침전시키고/거나 지시된 항체로 면역블롯하였다. Quantity One 소프트웨어 (BioRad, Hercules, CA)를 이용해 단백질 발현을 정량화하였다. XLfit4를 이용하여 전체 단백질 신호에 대해 정규화된 포스포-신호의 억제 비율로 나타냄으로써 IC₅₀ 값 (50% 억제를 일으키는 농도)을 계산하였다. 표에 나타난 데이터는 2-3가지 분석으로부터의 평균 값이다.

피하 종양 모델: AN3CA 세포를 누드 마우스의 우측 옆구리로 이식하였다. 효능 분석을 위하여, 평균 종양 부피가 ~200 mm³에 도달하면, 12일 동안 억제제를 매일 경구 투여하였다. 각 치료군에 대해 평균 종양 부피 (± SE; 종양 부피= L x W² x 0.5)를 계산하였다.

약력학 /약동학: 약력학적 분석을 위해, 종양 샘플을 수집시 얼렸고, 포스포-SafeTM 버퍼에서 균질화하였고, 웨스턴 면역블롯팅에 의해 분석하였다. 혈장 내 억제제 농도를 블랭크 마우스 혈장에서 준비된 교정 표준 및 단백질 침전을 이용한 내부 표준 LC/MS/MS 방법에 의해 측정하였다. 나타낸 데이터는 3 마우스/시점/군으로부터의 평균값이다.

화합물 1의 시험관 내 효능 및 선택성을 많은 재조합 키나아제 도메인들과 펩타이드 기질들을 이용한 키나아제 분석에서 평가하였다 (표 8). 화합물 1이 수용체 티로신 키나아제의 PDGFR, FGFR 및 VEGFR 패밀리의 구성원 (예컨대 FLT1, FLT4 및 KDR)을 억제하는 것을 발견하였다 (표 1). 화합물 1은 FGFR1(V561M) 및 FGFR2(N549H) 뿐만 아니라 다음 4가지 FGF 수용체 모두의 강력한 억제제이며: FGFR1, FGFR 2, FGFR 3, FGFR 4 (표 8), 이는 4가지 FGFR 모두를 억제하지 않는 다른 다중-표적화 키나아제 억제제들 (예컨대 수니티닙, 소라페닙 및 다사티닙)과 비교할 때 독특하다. 특히, 하지만, 화합물 1은 오로라 또는 인슐린 키나아제 패밀리 구성원은 억제하지 않았으며, 사이클린-의존적 키나아제 2 (CDK2)/사이클린 E 역시 억제하지 않았다.

실시예 6: 암의 세포성 모델에서 화합물 1의 효과

화합물 1은 다양한 암 세포주에서 세포성 활성에 영향을 미쳤다. 실험 과정은 실시예 5에 기술된 것과 같이 수행하였다. FGFR1-FGFR10P2 융합 유전자를 발현하는 급성 골수성 백혈병-유도 KG1 세포주에서, 화합물 1은 세포 성장 및 FGFR1의 인산화를 억제하였다. 도 13a는 화합물 1의 10 nM의 측정된 GI50을 갖는 KG1 세포주에 대한 성장 억제를 나타낸다. 화합물 1은 10nM의 IC50으로 FGFR1의 인산화를 억제하였으며, 이는 화합물 1로 처리된 KG1 세포에서 P-FGFR1, T- FGFR1 및 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나아제 ("GADPH") 발현의 웨스턴 면역블롯 분석에 의해 측정하였다. GAPDH에 대한 데이터를 대조군으로 사용하였다.

화합물 1은 또한 정상 세포에 비교하여 암 세포의 세포성 활성에 선택적으로 영향을 미칠 수 있다. 화합물 1은 wtFGFR2 SNUl 세포와 비교하였을 때, 증폭된 FGFR2를 지닌 SNU16 위암 세포를 선택적으로 억제하였다 (도 14). 화합물 1은 SNU16 위암 세포에서의 단백질 발현에 대한 웨스턴 면역블롯 분석에서 인산화된 FGFR2, FRS2a, 및 Erk 1/2의 감소된 존재에 의해 측정되는 바와 같이, SNU16에서 시그널링을 억제하였다. 화합물 1은 또한 wtFGFR2 SNU1 세포와 비교하였을 때, 연한천에서 SNU16 콜로니 형성을 선택적으로 억제하였다 (도 15). 표 9는 wtFGFR2 SNU1 세포주와 비교한 위암 세포주 SNU16 및 KatoIII에서의 화합물 1의 활성의 요약을 제공한다. 화합물 1은 wt SNU1과 비교된 바와 같이, 위암 세포 SNU16 및 KatoIII의 FRS2a 및 Erk 1/2의 세포 성장 및 인산화를 선택적으로 억제하였다.

화합물 1은 wtFGFR2 HeclB 세포에 비교하였을 때, 돌연변이 FGFR2 (N549K)를 지닌 AN3CA 자궁내막암 세포를 선택적으로 억제하였다. 화합물 1은 490nM의 GI50을 갖는 HeclB 세포와 비교하여, 30nM의 GI50을 갖는 AN3CA 세포의 세포 성장을 억제하였다 (도 16). 화합물 1은 또한 화합물 1로 처리된 AN3CA 자궁내막암 세포에서 단백질 발현의 웨스턴 면역블롯 분석에 의해 측정된 바와 같이, AN3CA 세포에서 시그널링을, 특히 FRS2a 및 Erk 1/2의 인산화를 억제하였다. 표 10은 wtFGFR2 HeclB 및 RL95 세포주와 비교한 자궁내막암 세포주 AN3CA에서의 화합물 1의 활성의 요약을 제공한다.

화합물 1은 방광암 및 다발성 골수종 (MM)에 대한 세포성 모델에서 FGFR3을 억제하였다. 화합물 1은 wtFGFR3 RT1 12 세포에 비교하였을 때, 돌연변이 FGFR3b (Y375C)를 발현하는 방광암 MGH-U3 세포의 성장을 선택적으로 억제하였다 (도 17). 화합물 1은 또한 화합물 1로 처리된 MGH-U3 세포에서 단백질 발현의 웨스턴 면역블롯 분석에 의해 측정된 바와 같이, MGH-U3 (P-FRS2a에 대한 IC50 = 41 nM)에서 FRS2a의 시그널링을 억제하였다. 화합물 1은 wtFGFR3 NCI-H929 세포에 비교하였을 때, t(4;14) 전좌를 나르고 돌연변이 FGFR3 (K650E)을 발현하는 OPM2 MM 세포의 성장을 선택적으로 억제하였다 (도 18). 화합물 1로 처리된 OPM2 MM 세포에서 단백질 발현의 웨스턴 면역블롯 분석에 의해 측정된 바와 같이, OPM2 세포에서 FGFR3 시그널링은 화합물 1에 의해 억제되었다 (데이터 미도시). 또한, 화합물 1은 OPM2에서 FRS2a의 시그널링을 억제하였다 (P-FRS2a에 대한 IC50 = 65 nM).

화합물 1은 유방암에 대한 세포성 모델에서 FGFR4를 억제하였다. 돌연변이 FGFR4 (Y367C)를 발현하는 MDA-MB-453 유방암 세포에 대한 화합물 1의 효과는 화합물 1로 처리된 MDA-MB-453 세포에서 단백질 발현의 웨스턴 면역블롯 분석에 의해 측정된 바와 같이, 세포 성장의 억제 (도 19) 및 FGFR4 및 FRS2a의 세포성 시그널링의 억제를 포함하였다 (P-FGFR4에 대하여 IC50 = 12nM, P-FRS2a에 대하여 IC50 = 14nM).

표 11은 FGFR 모델에서 CHIR-258, BIBF-1120, BMS-540215 및 PD 173074를 포함하는 다양한 키나아제 억제제들에 대한 RTK 억제제 활성의 비교를 제공한다. IC50 (nM) 데이터를 RBC에 의해 수행된 키나아제 분석에 대해 나타내며, GI50 (nM) 데이터를 세포 성장 분석에 대해 나타낸다.

결론

화합물 1은 키나아제 및 세포성 분석에서 4가지 모든 FGF 수용체에 대한 강력한 활성을 나타내는 경구적으로 활성인 키나아제 억제제이다. FGFR1 및 FGFR2에 대해 관찰되는 가장 강력한 활성과 함께, 4가지 모든 FGFR을 발현하는 모델에서 시그널링 및 성장이 억제되었다. 화합물 1의 활성을 위, 자궁내막, 방광 및 다발성 골수종을 포함하는 다양한 암 유형에서 관찰하였다. 화합물 1의 활성은 알려진 FGFR 활성을 갖는 다른 억제제들에 필적하였으며, 그러한 억제제들은 임상에서 평가되고 있다.

실시예 7: FGFR2 -유도 AN3CA 이종이식 모델에서 화합물 1의 경구 전달은 고형종양 성장을 감소시키는데 효과가 있었다.

화합물 1은 AN3CA 종양 성장을 10 및 30 mg/kg의 경구 투여(dosage)에서 각각 36% 및 62%까지 억제하였다 (도 20). 비록 매일 투여 식이요법이 제공되지만, 간헐적인 투여 식이요법이 또한 효과적일 수 있다.

생체 내 약력학 및 약동학 관계를 또한 측정하였고, 여기서 화합물 1의 혈장 수준을 웨스턴 면역블롯 분석에 의해 투여 후 6시간 째에 측정하였다 (도 21). 화합물 1의 경구 투약은 AN3CA 이종이식에서 FRS2a 및 rkl/2 시그널링을 억제하였다 (도 21).

화합물 1의 경구 전달은 임상적으로 관련 있는 FGFR2 (N549K) 돌연변이를 발현한 자궁내막암 모델에서 종양 성장을 강력하게 억제하였다. 종양에서 세포성 성장의 억제는 다운스트림 시그널링의 억제와 연관성이 있다. 이러한 데이터들은 FGF 수용체 내의 변형에 의해 특징지어지는 다수의 종양 유형을 처리하는 데에 있어 화합물 1의 용도를 뒷받침한다.

실시예 8: 화합물 1 및 리다포롤리무스의 병용 요법

실험 방법

시약: 화합물 1 및 리다포롤리무스 (AP23573, K-8669)를 아리아드 파마슈티칼스에 의해 합성하였다. 다음의 화합물들은 구입하였다: BMS-540215 (American Custom Chemical, San Diego, CA), CHIR-258 및 AZD2171 및 BIBF-1120 (Selleck Chemical Co., London ON, Canada).

키나아제 분석: IC50을 측정하기 위한 키나아제 억제 분석을 리액션 바이올로지 코포레이션(RBC, Malvern, PA USA)에서 수행하였다. 화합물을 1μM에서 시작하는 3배 연속 희석과 함께 10-포인트 곡선을 이용하여 10μM ATP에서 시험하였다. 2개의 분석으로부터의 평균 데이터를 나타낸다.

세포 성장 분석: Cell Titer 96 Aqueous One Solution Cell Proliferation Assay (Promega, Madison, WI) 또는 CyQuant cell proliferation Assay (Invitrogen, Carlsbad, CA)를 사용하여 세포 성장을 평가하였다. 세포를 심고 24시간 후에 세포를 화합물로 처리하고 72시간 동안 성장시켰다. 시간 0에서 (치료 시점) 세포수를 검사하고 Microsoft Excel의 XLfit 버전 4.2.2를 사용하여 운반체(DMSO) 처리된 세포에 대한 상대적인 성장 비율로 데이터를 나타냄으로써 50% 성장 억제를 유발하는 농도 (GI50)를 측정하였다.

조합 분석( Combination assay ) 및 분석: 시험된 각 화합물에 대하여 50% 최대 억제 (ED50)에서의 효과적인 투여량을 측정하였고 1x로 정의하였다. 사용된 약제 농도는 고정된 ED 비율에서 0.125x 내지 8x 범위였다. 세포 성장에 대한 조합의 효과를 Chou and Talalay 방법을 이용해 (CalcuSyn software, Biosoft) 분석하였다.

웨스턴 면역블롯팅: 세포를 심은지 24시간 후에 처리하고 억제제와 함께 1시간 동안 배양하였다. 세포를 SDS 버퍼 또는 포스포-SafeTM 버퍼 (Novagen, Gibbstown, NJ)에서 용해시키고, 단백질 용해물을 밤샘 면역침전시키고/거나 지시된 항체로 면역블롯하였다. Quantity One 소프트웨어 (BioRad, Hercules, CA)를 이용해 단백질 발현을 정량화하였다. XLfit4를 이용하여 전체 단백질 신호에 대해 정규화된 포스포-신호의 억제 비율로 나타냄으로써 IC₅₀ 값 (50% 억제를 일으키는 농도)을 계산하였다. 표에 나타난 데이터는 2-3가지 분석으로부터의 평균 값이다.

피하 종양 모델: AN3CA 세포를 누드 마우스의 우측 옆구리로 이식하였다. 효능 분석을 위하여, 평균 종양 부피가 ~200 mm³에 도달하면, 화합물 1의 경우 21일 동안 매일 경구 투약에 의해, 또는 QDX5의 3주 동안의 i.p. 투약에 의해, 억제제를 투여하였다. 각 치료군에 대해 평균 종양 부피 (± SE; 종양 부피 = L x W² x 0.5)를 계산하였다.

약력학 /약동학: 약력학적 분석을 위해, 종양 샘플을 수집시 얼렸고, 포스포-Safe에서 균질화하였고, 웨스턴 면역블롯팅에 의해 분석하였다. 혈장 내 억제제 농도를 블랭크 마우스 혈장에서 준비된 교정 표준 및 단백질 침전을 이용한 내부 표준 LC/MS/MS 방법에 의해 측정하였다. 나타낸 데이터는 3 마우스/시점/군으로부터의 평균값이다.

화합물 1은 다양한 암 세포주에서 세포성 활성에 영향을 미쳤다. 표 12는 FGFR 세포성 모델에서 AZD2171, CHIR-258, BIBF-1120 및 BMS-540215를 포함하는 다양한 키나아제 억제제에 대한 RTK 억제제 활성의 비교를 제공한다. 화합물 1은 FGFR1-FGFR4에 대한 강력한 억제제이다. 키나아제 분석에 대한 IC50 (nM) 데이터를 RBC에 의해 수행하였다. 표 12는 세포 성장 분석에 대한 GI50 (nM) 데이터 및 시그널링에 대한 IC50 (nM) 데이터를 나타낸다.

화합물 1은 FGFR2-돌연변이 자궁내막암 세포주의 성장 및 시그널링을 선택적으로 억제하였다. 화합물 1은 wtFGFR2 Hec-l-B 및 RL95-2 세포주와 비교하였을 때, 자궁내막암 세포주 AN3CA 및 MFE-296을 억제하였다 (도 22). 화합물 1은 다양한 농도의 화합물 1의 AN3CA 세포에 대한 효과에 대한 웨스턴 면역블롯 분석에 의해 측정한 바와 같이, AN3CA 세포에서 시그널링을 억제하였고, 특히 FRS2a 및 Erk 1/2의 인산화를 억제하였다. 표 13은 wtFGFR2 Hec-l-B 및 RL95-2 세포주와 비교한 자궁내막암 세포주 AN3CA 및 MFE-296에서의 화합물 1의 활성의 요약을 제공한다.

화합물 1의 경구 전달은 FGFR-2 돌연변이 AN3CA 자궁내막 종양 이종이식편의 성장을 억제하였다. 화합물 1은 10 및 30 mg/kg에서 각각 AN3CA 종양 성장을 49% 및 82%까지 억제하였다 (도 23). 화합물 1은 투여 후 6시간 째에 약력학적 마커를 억제하였다. 화합물 1의 경구 투약은 인산화된 및 비-인산화된 FRS2a, 인산화된 및 비-인산화된 Erk1/, 및 대조군으로서의 글리세르알데히드-3-포스페이트 데히드로게나아제 대한 투여 후 6시간 째에 웨스턴 면역블롯 분석에 의해 측정된 바와 같이, AN3CA 이종이식편에서 FRS2a 및 Erk 1/2 시그널링을 억제하였다 (데이터 미도시).

이러한 데이터들은 화합물 1이 강력한, 경구적으로 이용가능한 pan- FGFR 억제제임을 보여준다. 활성은 위, 자궁내막, 방광 및 다발성 골수종을 포함하는 다양한 암 유형들에서 나타난다. 화합물 1의 활성은 알려진 FGFR 활성을 갖는 다른 억제제들에 필적하였으며, 그러한 억제제들은 임상에서 평가되고 있다. 또한, 경구 화합물 1은 임상적으로 관련 있는 FGFR2에 대한 N549K 돌연변이를 발현하는 자궁내막암 모델에서 종양 성장을 강력하게 억제한다.

실시예 9: 암 모델에서 화합물 1과 mTOR 억제제의 상승적인 항-종양 활성.

도 24a는 리다포롤리무스, 화합물 1 및 화합물 1과 리다포롤리무스의 조합물의 다양한 농도에 있어서 화합물 1의 AN3CA 세포주에 대한 성장 억제를 나타낸다. 도 24b는 리다포롤리무스, 화합물 1 및 화합물 1과 리다포롤리무스의 조합물의 다양한 농도에 있어서 화합물 1의 MFE-296 세포주에 대한 성장 억제를 나타낸다. 농도는 EC50의 함수로 주어진다. 화합물 1과 리다포롤리무스의 조합물은 두 화합물의 단독에 비해, FGFR2 -돌연변이 자궁내막암 세포주 AN3CA 및 MFE-296 모두에 대한 상승적인 효과를 제공하였다. 화합물 1과 리다포롤리무스의 조합물의 AN3CA 세포주에 대한 중앙 효과(median effect) 분석이 AN3CA 세포주 (도 25a) 및 MFE-296 세포주 (도 25b)에 대하여 제공된다. AN3CA 세포주의 경우, 4.3 내지 1000nM의 화합물 1과 0.05 내지 13nM의 리다포롤리무스의 농도 범위 내에서 상승적인 효과를 관찰하였다 (도 25a). MFE-296 세포주의 경우, 14 내지 750nM의 화합물 1과 0.14 내지 7.5nM의 리다포롤리무스의 농도 범위 내에서 상승적인 효과를 관찰하였다 (도 25b).

리다포롤리무스, 화합물 1 및 화합물 1과 리다포롤리무스의 조합물로 치료한지 24시간 후에 AN3CA 세포에서 세포 주기 분석을 수행하였다. 비처리되거나 하나의 화합물 단독으로 처리된 세포에 비해 화합물 1과 리다포롤리무스의 조합물로 처리했을 때, G0-G1 주기 동안 증가된 세포 주기 정지를 관찰하였다 (도 26).

AN3CA 세포주에서 다양한 시그널링 분자에 대한 화합물 1과 리다포롤리무스의 효과를 또한 투여 후 24시간에 웨스턴 면역블롯 분석에 의해 측정하였다. 화합물 1 (30 nM 또는 300 nM)과 리다포롤리무스 (0.5 nM 또는 5 nM)의 조합물은 FRS2a, Erk1/2 및 S6 시그널링의 억제를 초래하였다 (데이터 미도시).

도 27은 FGFR2 및 mTOR 경로의 가능한 모델을 나타낸 도식이다. 이론에 의해 제한되기를 바라지 않으면서, 이 모델에서 화합물 1은 FGFR2/MAPK 경로를 억제하는 것으로 보이고, 리다포롤리무스는 mTOR 경로를 억제하는 것으로 보인다.

화합물 1과 리다포롤리무스의 조합물의 경구 전달에 따라, FGFR2-돌연변이 AN3CA 종양 이종이식편에서 증가된 항-종양 활성을 관찰하였다. 도 28a는 적은 투여량의 화합물 1 (10 mg/kg)과 리다포롤리무스 (0.3 mg/kg 또는 1.0 mg/kg)의 조합물에 대한 AN3CA 종양 성장의 억제를 보여준다. 도 28b는 높은 투여량의 화합물 1 (30 mg/kg)과 리다포롤리무스 (0.3 mg/kg 또는 1.0 mg/kg)의 조합물에 대한 AN3CA 종양 성장의 억제를 보여준다. 1주일에 5일 동안의 리다포롤리무스의 매일 경구 투약 (도 28a 및 도 28b의 회색선) 및 화합물 1의 매일 경구 투약 (도 28a 및 도 28b의 검은선)에 대한 결과가 나타나 있다. 표 14는 AN3CA 이종이식 모델에서 화합물 1과 리다포롤리무스의 효능의 요약을 제공하며, 여기서 "TGI"은 운반체에 상대적인 종양 성장 억제를 나타낸다.

투여 후 6시간에서 생체 내 약력학 및 약동학 관계를 또한 측정하였다 (도 29). 또한 투여 후 6시간에서 화합물 1의 혈장 수준이 제공된다 (도 29).

FGFR2-돌연변이 자궁내막암 세포 성장에 대한 화합물 1과 리다포롤리무스의 상승적인 활성을 관찰하였다. 이러한 데이터들은 화합물 1과 리다포롤리무스가 FGFR2 -돌연변이 자궁내막암 모델에서 강력한 조합의 활성을 가짐을 보여준다. 이론에 의해 제한되기를 바라지 않으면서, 화합물 1과 리다포롤리무스에 의해 각각 FGFR2/MAPK 및 mTOR 경로를 통한 강력한 이중 억제를 달성하였다. 시험관 내 세포 성장 분석과 생체 내 종양 퇴행을 통해 화합물 1과 리다포롤리무스의 조합물의 상승적인 효과를 관찰하였다.

화합물 1은 다양한 FGFR-유도 종양 모델에서 강력할 활성을 갖는 pan-FGFR 억제제이다. 화합물 1에 의한 FGFR2 시그널링과 mTOR 억제제, 예컨대 리다포롤리무스에 의한 mTOR 시그널링의 이중 억제는 FGFR2-유도 자궁내막암 시험관 내 모델 및 생체 내 종양 퇴행 생체 내에서 상승적인 활성을 야기한다.

이러한 데이터들은 병리학적 세포 증식, 예컨대 종양, 암 및 병리학적 혈관신생과 연관된 질환(condition)과 연관된 장애들의 치료를 위한 mTOR 억제제와 조합된 화합물 1의 용도에 대한 근거를 제공한다. 본 발명의 조성물, 방법 또는 키트를 이용하여 치료될 수 있는 암의 비제한적인 예들은, 방광, 유방, 결장, 신장, 간, 폐, 두경부, 담낭, 난소, 췌장, 위, 자궁경부, 갑상선, 전립선 또는 피부의 암종; 편평세포암종; 자궁내막암; 다발성 골수종; 림프 계열의 조혈 종양 (예컨대, 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, B-세포 림프종, T-세포-림프종, 호지킨 림프종, 비-호지킨 림프종, 모발성 세포 림프종, 또는 버킷 림프종); 골수 계열의 조혈 종양 (예컨대, 급성 골수성 백혈병, 만성 골수성 백혈병, 다발성 골수성 백혈병, 골수이형성증후군, 또는 전골수구성 백혈병); 중배엽성 종양 (예컨대, 섬유육종 또는 횡문근육종); 중추 또는 말초 신경계의 종양 (예컨대, 성상세포종, 신경아세포종, 신경교종, 또는 신경초종); 흑색종; 정상피종; 기형암종; 골육종; 및 카포시육종을 포함한다. 본 발명의 조성물, 방법 또는 키트를 이용하여 치료될 수 있는 비정상적 혈관신생과 연관된 질환(condition)의 비제한적인 예들은, 고형종양, 당뇨망막병증, 류마티스 관절염, 건선, 죽상동맥경화증, 만성염증, 비만, 황반변성 및 심혈관계 질병을 포함한다.

다른 구체예

본 명세서에서 언급된 모든 공개, 특허 및 특허출원은, 각각의 독립된 공개 또는 특허출원이 구체적이고 개별적으로 참조로 통합되도록 명시된 것과 같은 정도로 본원에 참조로서 통합된다. 미국 임시 특허 출원 제61/256,669호 (2009년 10월 30일 출원), 제61/256,690호 (2009년 10월 30일 출원) 및 제61/261,014호 (2009년 11월 13일)가 본원에 참조로서 통합된다.

본 발명이 이들의 구체적인 구체예들과 관련되어 기술되어 있기는 하지만, 추가적인 변형이 이루어질 수 있으며, 본원은, 일반적으로, 본원 발명의 원리에 따른 본원 발명의 임의의 변형, 사용 또는 적합화를 포함하는 것으로 의도되고, 본원 발명이 속하는 기술 분야의 공지된 또는 관행적 실무에서 접하게 되고, 앞서 기술되어 있으며 청구항의 범위를 따르는 본질적인 특징에 적용될 수 있는, 본 발명의 기재로부터의 그러한 이탈을 포함하려는 것으로 의도되는 것을 이해할 것이다.

다른 구체예들은 청구항 내에 있다.

Claims (27)

1. 개체에 투여되는 경우 종양(neoplasm), 암, 또는 과다증식성 장애를 치료하기에 유효한 양의 화합물 1 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 하나 또는 그 초과의 약제학적으로 허용가능한 부형제를 포함하는, 경구 투여에 적합한 약제학적 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 화합물 1의 염산염을 포함하는 약제학적 조성물.
3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 단위 투여 형태로 제조되는 약제학적 조성물.
4. 제 3항에 있어서, 30 내지 300㎎의 화합물 1을 포함하는 약제학적 조성물.
5. 제 3항에 있어서, 20±4㎎, 25±5㎎, 30+6㎎, 40+8㎎, 또는 45±9㎎의 화합물 1을 포함하는 약제학적 조성물.
6. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 고형 단위 투여 형태로 제조되는 약제학적 조성물.
7. 제 6항에 있어서, 상기 고형 단위 투여 형태가 정제(tablet), 연질 캡슐, 또는 경질 캡슐인 약제학적 조성물.
8. 제 6항에 있어서, 30 내지 300㎎의 화합물 1을 포함하는 약제학적 조성물.
9. 제 6항에 있어서, 20+4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 40+8㎎, 또는 45±9㎎의 화합물 1을 포함하는 약제학적 조성물.
10. 치료를 필요로 하는 개체의 종양, 암, 또는 과다증식성 장애를 치료하는 방법으로서, 상기 방법이 상기 개체에게 30 내지 300㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염을 경구 투여하는 것을 포함하는 방법.
11. 제 10항에 있어서, 평균 1일 투여량인 20±4㎎, 25±5㎎, 30±6㎎, 40±8㎎, 또는 45±9㎎의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 단위 투여 형태로 개체에 경구 투여되는 방법.
12. 제 10항에 있어서, 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 개체에 일주일에 1일 이상 또는 매 7일에 평균 4 내지 7회 투여되는 방법.
13. 제 12항에 있어서, 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이 개체에 매일 투여되는 방법.
14. 제 10항 내지 제 13항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 골수이형성증후군, 위암, 자궁내막암, 방광암, 다발성 골수종, 유방암, 전립선암, 폐암, 대장암, 신장암, 또는 교모세포종에 걸린 방법.
15. 제 14항에 있어서, 개체가 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 또는 급성 골수성 백혈병에 걸린 방법.
16. 제 10항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 이마티닙(imatinib), 닐로티닙(nilotinib), 또는 다사티닙(dasatinib)으로 치료하기 어려운 질환에 걸린 방법.
17. 제 10항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 필라델피아 염색체 양성 질환에 걸린 방법.
18. 제 10항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 VEGF 또는 VEGF-R 억제제 또는 길항제(antagonist)로 치료하기 어려운 고형암에 걸린 방법.
19. 제 18항에 있어서, 고형암이 베바시주맙(bevacizumab), 소라페닙(sorafenib), 또는 수니티닙(sunitinib)으로 치료하기 어려운 방법.
20. 제 10항 내지 제 17항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 BCR-ABL 돌연변이를 발현하는 암에 걸린 방법.
21. 제 20항에 있어서, BCR-ABL 돌연변이가 BCR-ABL^T315I, BCR-ABL^F317L, 또는 BCR-ABL^F359C인 방법.
22. 제 10항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 개체가 FLT3, KIT, FGFR1, 또는 PDGFRα 돌연변이를 발현하는 암에 걸린 방법.
23. 제 22항에 있어서, 돌연변이가 FLT3-ITD, c-KIT, FGFR10P2-FGFR1, 또는 F1P1L1-PDGFRα인 방법.
24. 제 10항 내지 제 23항 중 어느 한 항에 있어서, 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염이, 각각 함께 종양, 암, 또는 과다증식성 장애를 치료하기에 유효한 양으로 mTOR 억제제와 함께 또는 동시에 투여되는 방법.
25. 제 24항에 있어서, mTOR 억제제가 시롤리무스(sirolimus), 에베롤리무스(everolimus), 템시롤리무스(temsirolimus), 리다포롤리무스(ridaforolimus), 바이롤리무스(biolimus), 조타롤리무스(zotarolimus), LY294002, Pp242, WYE-354, Ku-0063794, XL765, AZD8055, NVP-BEZ235, OSI-027, 보르트만닌(wortmannin), 퀘르세틴(quercetin), 마이리세틴(myricentin), 및 스타우로스포린(staurosporine), 및 이들의 약제학적으로 허용가능한 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 방법.
26. (i) 개체에 투여하는 경우 종양, 암, 또는 과다증식성 장애에 유효한 양의 화합물 1, 또는 이의 약제학적으로 허용가능한 염, 및 하나 또는 그 초과의 약제학적으로 허용가능한 부형제의 경구 투여에 적합한 약제학적 조성물; 및 (ii) 상기 약제학적 조성물을 상기 종양, 암, 또는 과다증식성 장애의 치료를 위해 개체에 투여하기 위한 설명서(instruction)를 포함하는 키트.
27. 제 26항에 있어서, 개체가 만성 골수성 백혈병, 급성 림프구성 백혈병, 급성 골수성 백혈병, 골수이형성증후군, 위암, 자궁내막암, 방광암, 다발성 골수종, 유방암, 전립선암, 폐암, 대장암, 신장암, 또는 교모세포종에 걸린 키트.

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