KR20120051258A

KR20120051258A - Ｇｋｎ１을 함유하는 항암용 조성물

Info

Publication number: KR20120051258A
Application number: KR1020100112610A
Authority: KR
Inventors: 박원상; 윤정환
Original assignee: 가톨릭대학교 산학협력단
Priority date: 2010-11-12
Filing date: 2010-11-12
Publication date: 2012-05-22
Also published as: WO2012064146A3; EP2641610A2; CN103209702A; WO2012064146A9; EP2641610A4; KR101215069B1; WO2012064146A2

Abstract

본 발명은 GKN 1을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 항암 활성이 우수한 GKN 1 유전자를 포함하는 발현벡터 또는 GKN 1 단백질을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따른 GKN 1은 암세포의 발생을 억제하는 활성이 우수할 뿐만 아니라, 과발현시 암 세포의 전이를 억제하는 활성도 우수한 특징이 있으므로 항암 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

Description

ＧＫＮ１을 함유하는 항암용 조성물{A composition comprising Gastrokine 1 for anti-cancer}

본 발명은 GKN 1을 함유하는 항암용 조성물에 관한 것으로서, 특히 위암의 발생을 억제하고 암 세포의 전이를 억제하는 활성이 우수한 GKN 1 유전자의 신규한 용도에 관한 것이다.

위암(胃癌, Stomach cancer)은 전 세계적으로 한국, 일본 등에서 많이 발생하는 암으로써 미국, 유럽 등의 서구에서는 발생율이 낮으나, 한국의 경우 암 발생율 1위가 위암이고, 사망율은 폐암에 이어 2위를 차지하고 있다. 위암의 분류를 살펴보면 전체의 95%가 위벽 점막의 샘 세포에서 생기는 선암이며, 그 외 림프계에서 발생하는 림프종, 간질조직에서 발생하는 위장관 간질성종양이 있다.

위암을 일으키는 다양한 발병원 중에서 특히 음식물은 가장 중요한 발병원인으로 밝혀져 있는데, 가공된 육류에 많이 포함되어 있는 질산염, 아질산염이 강력한 발암물질로 알려져 있고, 탄 음식, 맵고 짠 음식이 위암의 원인이 된다고 알려져 있다. 그 밖에 최근 많은 관심을 받고 있는 헬리코박터 파일로리균은 위염과 위궤양의 원인균으로 위암 발생과 연관성이 있는 것으로 밝혀졌다.

또한 암 발병의 원인을 살펴보면, 암을 유발하는 발암 유전자의 비정상적인 활성화로 인해 세포가 증식하거나 반대로 세포의 비정상적인 증식을 억제하거나 세포사멸 프로그램을 작동시켜 특정 세포를 사멸시킴으로써 암세포의 생성을 차단하는 암 억제 유전자에 이상이 생겨 발생하게 되는데, 일단 비정상적으로 활성화된 암 유전자를 갖는 세포라 할지라도 암 억제 유전자가 정상적인 활성을 나타내게 되면 그 세포는 암을 형성하지 못하고 사멸된다. 그러므로 암세포가 되기 위해서는 발암 유전자의 활성화 뿐 아니라 암 억제 유전자의 불활성화가 하나의 세포에서 동시에 나타나야 한다.

이에 최근 들어 전 세계적으로 암의 생성 및 치료와 관련된 유전자의 기능 연구를 통해 치료용 표적을 발굴하고 이들을 진단 및 치료제 개발에 이용하기 위한 치열한 경쟁이 불붙고 있다. 게놈 연구의 활성화와 함께 인간 유전자 DNA 칩 또는 프로테옴 분석 연구가 활발하게 이루어지고 암과 관련된 유전자가 대량 발굴됨에 따라 많은 유전자들의 목록과 관련 데이터베이스는 구축되어 있으나 대부분 이들 유전자들에 대한 세포 내에서의 구체적 생물학적 기능 및 암 관련성은 아직 연구되지 않았거나 불확실하여 실제 암 관련성 또는 진단 및 표적 유전자로서의 활용과 함께 나아가 암을 효과적으로 치료할 수 있는 유전자의 발굴에 상당한 어려움이 있다. 따라서 지금까지 밝혀진 암 관련 유전자 이외에도 새로운 유전자들의 발굴이 필요한 실정이다.

한편, 현재 암을 치료하는 방법 중 3가지 주요 치료법으로는 외과적 치료법, 약물 요법, 방사선 요법이 있는데, 약물요법은 치료에 동반되는 고통이 적고, 외과적 치료나 방사선 치료에 비해 치료 후에도 암의 재발이 상대적으로 적으므로 이에 대해 기대가 모아지고 있다. 따라서 이에 부응할 만한 수많은 항암제가 개발되어 사용되고 있는데, 이들 대부분의 항암제는 암의 이상증식을 염두에 두고 활발하게 분열하는 세포를 선택적으로 죽게 함으로써 항암 효과를 나타내는 것이다. 이러한 항암제는 일반적으로 인체 내에서 활발하게 분열하는 세포인 면역세포, 모근세포와 같은 정상세포도 함께 죽이게 되는 심각한 부작용을 동반하므로 장기간 사용이 불가능한 문제점을 안고 있다. 또한 위암치료를 위한 방법으로는 림프절 절제술, 내시경적 점막절제술, 복강경적 위절제술 등의 방법이 사용되고 있는데, 내시경적 점막절제술은 점막 내 조기위암에 대해 암 병변이 있는 위 점막 주위에 생리식염수를 주입하여 병변부위를 볼록하게 부풀린 다음 병변이 있는 점막을 절제하는 방법으로, 간단한 내시경 시술로 위 절제수술의 고통을 피할 수 있다는 장점이 있지만, 점막에 국한된 조기위암 중 림프절 전이가능성이 낮은 경우에 한해 사용할 수 있다는 한계가 있다.

그러므로 암 발병과 관련하여 주된 기능을 담당하고 이를 이용하여 암의 초기에 예방하고 치료할 수 있는 새로운 항암제의 개발을 위한 표적 유전자의 발굴이 필요한 실정이다.

이에 본 발명자들은 GKN 1 유전자가 정상 위 점막세포에서 발현되고 위암 조직에서 그 발현이 저하되어 있는 것에 착안하여 상기 유전자의 기능을 연구한 결과, GKN 1 유전자는 위암세포의 증식 및 활성을 억제하고, 암 전이를 저해하는 기능을 갖는다는 사실을 최초로 규명하였고 상기 유전자를 암 치료제로 사용할 수 있다는 사실을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 GKN 1(Gastrokine 1) 단백질 또는 GKN 1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항암용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 목적은 GKN 1 단백질 또는 상기 단백질을 발현하는 재조합 세포와 후보물질을 배양하는 단계 및 GKN 1 단백질의 활성 또는 세포 내 발현수준 증가에 미치는 효과를 측정하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 GKN 1(Gastrokine 1) 단백질 또는 GKN 1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항암용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 GKN 1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 GKN 1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드는 발현벡터 내에 포함되어 있는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 발현벡터는 도 12의 개열지도를 갖는 pcDNA 3.1-GKN 1일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 암은 위암일 수 있다.

또한 본 발명은 GKN 1 단백질 또는 상기 단백질을 발현하는 재조합 세포와 후보물질을 배양하는 단계 및 GKN 1 단백질의 활성 또는 세포 내 발현수준 증가에 미치는 효과를 측정하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 후보물질이 GKN 1 단백질의 활성을 증가시키거나 세포 내에서 GKN 1 유전자의 발현수준을 증가시킬 경우, 항암활성을 갖는 항암제로 판단하는 단계를 추가하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 GKN 1 단백질의 활성 또는 세포 내 발현수준은 면역침전법(coimmunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행하는 것일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 항암제는 위암을 예방 또는 치료할 수 있는 것일 수 있다.

본 발명에 따른 GKN 1은 암세포의 발생을 억제하는 활성이 우수할 뿐만 아니라, 과발현시 암 세포의 전이를 억제하는 활성도 우수한 특징이 있으므로 항암 치료용 조성물로 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 위암 조직의 GKN 1 면역염색 결과로써, (A)는 소와세포와 표재성 위 상피세포에서의 면역활성을 나타낸 것이고, (B)는 위 선종에서의 면역양성을 나타낸 것이며, (C)는 관상선종에서의 음성 면역염색결과이고, (D)는 위암에서의 면역양성을 나타낸 것이며, (E)와 (F)는 장형위암과 확산형 위암에서의 음성 면역염색 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 GKN 1의 메틸화 상태를 나타낸 것으로써, (A)는 위암조직(T)과 정상 위점막(N)에서 GKN 1 유전자에 대해 메틸화된 DNA(M)와 비메틸화된 DNA(U)를 나타낸 것이고, (B)는 위암세포주에서 GKN 1 유전자에 대한 메틸화된(M) DNA와 비메틸화된(U) DNA를 나타낸 것이다.
도 3은 위암에서 대조군과 비교한 (A) GKN 1 DNA 카피 수와 (B) GKN 1 mRNA 발현의 폴드변화를 나타낸 그래프이다.
도 4는 각각 장형(I), 확산형(D) 및 혼합형(M)의 위암조직(T)과 정상 위점막(N)에서 GKN 1 발현을 나타낸 것이다.
도 5의 (A)는 MTT 분석법을 이용하여 GKN 1이 형질주입된 위암세포에서 시간의 흐름에 따른 세포 생존력을 나타낸 것이고, (B)는 BrdU 분석법을 이용하여 GKN 1이 형질주입된 위암세포에서 시간의 흐름에 따른 세포 증식을 나타낸 그래프이다.
도 6은 GKN 1 형질주입 후 시간에 따른 세포 사멸을 아넥신 V 결합 분석법으로 측정하여 나타낸 것이다.
도 7은 GKN 1 형질주입 24 시간 후 caspase-3 억제제(Z-DEVD-fmk)와 caspase-8 억제제(Z-IETD-fmk) 처리하여 세포 사멸을 아넥신 V 결합 분석법으로 측정하여 나타낸 것이다.
도 8의 (A)는 웨스턴 블롯 분석을 수행하여 GKN 1 형질주입 24 시간 후 사멸과 관계된 단백질들의 활성을 나타낸 것이고, (B)는 caspase-3 억제제(Z-DEVD-fmk)와 caspase-8 억제제(Z-IETD-fmk)를 처리함으로써, caspase 활성 억제에 대한 결과를 웨스턴 블롯을 수행하여 나타낸 것이다.
도 9는 상처-치유 방법을 통해 세포 이동에 대한 GKN 1의 효과를 나타낸 것으로 점선은 흠집 결함의 경계를 나타낸 것이다.
도 10의 위암세포주 AGS에서 transwell 이동에 대한 GKN 1의 효과에 관한 것으로써, (A)는 멤브레인을 Diff-Quik으로 염색한 결과를 나타낸 것이고, (B)는 광 현미경(light microscopy)하에 세포 수를 계산하여 나타낸 그래프이다.
도 11의 세포 침윤에 대한 GKN1의 효과를 matrigel 분석법을 수행하여 나타낸 결과로써, (A)는 형질주입 24시간 후 매트릭스를 통과하여 침윤한 세포를 촬영한 것이고, (B)는 세포 수를 계산하여 나타낸 그래프이다.
도 12는 본 발명에 따른 GKN 1 유전자를 삽입하여 제조한 재조합 벡터 pcDNA 3.1-GKN 1 벡터의 개열지도를 나타낸 것이다.

본 발명은 GKN 1(Gastrokine 1)을 유효성분으로 함유하는 항암용 조성물을 제공함에 그 특징이 있으며, 보다 구체적으로는 GKN 1(Gastrokine 1) 단백질 또는 GKN 1(Gastrokine 1) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항암용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명자들은 암 발생을 억제할 수 있는 새로운 암 치료제의 개발을 위해 연구하던 중, 최근 포유동물의 위점막 세포로부터 분리된 신규한 단백질인 GKN 1에 주목하였다.

GKN 1(Gastrokine 1)은 AMP-18(antrum mucosal protein-18) 또는 CA11로도 알려져 있으며, 위 전정부에서 발현되어 있는 것으로 알려져 있고, 전정부 점막을 보호하고, 상처 후 회복과 증식을 용이하게 함으로써 치유를 촉진시키는 활성이 있다고 알려진 바 있다(Toback. F. G. et al., Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol, 285: G344-353, 2003). 그러나 아직까지 GKN 1이 갖는 다른 기능에 대해서는 거의 알려진 바가 없다.

이에 본 발명자들은 정상세포와는 달리 암세포에서 GKN 1 유전자의 발현이 감소되어 있다는 사실을 확인함으로써 GKN 1 유전자가 암의 발병기작에 관여하고 있다고 추측하였으며, 실제적으로 GKN 1이 항암 활성을 갖는다는 사실을 최초로 규명하였다.

먼저, 본 발명의 일실시예를 통해 GKN 1 유전자의 발현이 암세포에서 감소되거나 소실되어 있다는 사실을 확인했는데, 즉 본 발명의 일실시예에 따르면, 면역조직화학적 방법으로 위암 조직에서의 GKN 1 단백질의 발현을 조사하였는데, 위암 조직을 고정시켜 절편을 제작한 다음 GKN 1 항체, biotinylated goat anti-mouse 항체를 이용하여 검출하고, 페록시다아제가 연결된 아비딘-바이오틴 복합체와 배양한 다음, 디아미노벤지딘을 색원체로 이용하였고, 슬라이드는 메이어 헤마토크실린 용액으로 대비 염색하여 발현을 분석한 결과, 전정부(antrum)와 체부(corpus)의 정상 위점막 세포 세포질에서 면역양성을 보였으며, 위 선종(adenomas)과 암(carcinomas) 조직에서는 GKN 1의 발현이 감소하거나 소실된 것으로 관찰되었다(도 1 및 표 1 참조).

또한 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 동결 위암 샘플로부터 추출한 GKN 1 게놈 DNA와 mRNA를 정량화하여 Stratagene Mx 3000P QPCR 시스템에서 real time SYBR Green QPCR를 수행한 결과, GKN 1의 카피수는 정상 위점막 조직 DNA와 비교하여 위암 DNA에서 50% 이상 감소하였으며, GKN 1 mRNA 발현수치는 정상 위 점막 조직에서는 GKN 1 유전자 전사물을 발현하는 반면, 모든 위암 조직은 발현이 감소하거나 소실되었다(도 3 참조).

이러한 결과를 토대로 본 발명자들은 본 발명의 GKN 1 유전자가 항암 활성을 가질 수 있다는 예측 하에, 암세포에서 GKN 1 유전자를 과발현 시킬 경우, 암 세포의 세포증식과 세포사멸에 미치는 영향을 조사하였는데, 즉 본 발명의 일실시예에 따르면, 위암세포주 AGS에 형질주입 시킨 GKN 1을 시간의 흐름에 따라 MTT분석과, BrdU 결합 분석을 수행한 결과, 형질주입된 세포에서 세포 생존력과 세포 증식이 눈에 띄게 억제되었으며(도 5참조), FITC-표지된 annexin V 세포 염색한 결과, GKN 1 형질주입된 세포에서 사멸세포가 시간이 흐름에 따라 증가하였다(도 6참조).

따라서 본 발명에 따른 GKN 1은 암 세포의 증식을 억제하고 사멸을 유발하는 특징이 있다.

또한 본 발명의 다른 일실시예에 따르면, 시험관 내(in vitro)에서 상처-치유, transwell chemotaxis, 침윤 분석을 수행한 결과, GKN 1 발현 벡터로 형질주입된 AGS 세포와 비교하여 GKN 1 유전자가 삽입되지 않은 대조군 발현벡터와 GKN 1 siRNA로 형질주입된 세포는 형질주입 후 눈에 띄게 상처 부위로 이동하였고(도 9참조), GKN 1 형질주입된 AGS 세포의 이동은 감소하였으며(도 10참조), GKN 1이 과발현된 AGS세포에서 침윤이 눈에 띄게 억제되었다(도 11참조),

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 GKN 1이 암 세포 이동을 막아 상피세포의 간질세포로의 전환을 억제하고, 과발현시 위암세포주에서 침윤도 억제한다는 사실을 알 수 있었다.

그러므로 본 발명은 GKN 1(Gastrokine 1) 단백질 또는 GKN 1(Gastrokine 1) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항암용 조성물을 제공할 수 있다.

바람직하게, 상기 GKN 1 단백질은 서열번호 1로 기재되는 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있으며, 상기 GKN 1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2로 기재되는 염기서열을 갖는 것일 수 있다.

또한 본 발명에 따른 상기 GKN 1 단백질은 바람직하게 서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드에 대해 기능적 동등물일 수 있다. 상기 '기능적 동등물'이란, 아미노산의 부가, 치환 또는 결실의 결과, 서열번호 1로 표시되는 아미노산 서열과 적어도 60%, 바람직하게는 70%, 보다 바람직하게는 80% 이상의 서열 상동성을 갖는 것으로서 본 발명의 GKN 1과 실질적으로 동질의 활성을 나타내는 폴리펩티드를 말한다. 여기서, '실질적으로 동질의 활성'이란 상기에서 기재한 GKN 1의 활성을 의미한다. 상기 기능적 동등물에는, 예를 들어, 본 발명에 따른 GKN 1의 아미노산 서열의 아미노산 중 일부가 치환되거나, 결실 또는 부가된 아미노산 서열 변형체가 포함될 수 있다. 아미노산의 치환은 바람직하게는 보존적 치환일 수 있으며, 천연에 존재하는 아미노산의 보존적 치환의 예는 다음과 같다; 지방족 아미노산(Gly, Ala, Pro), 소수성 아미노산(Ile, Leu, Val), 방향족 아미노산(Phe, Tyr, Trp), 산성 아미노산 (Asp, Glu), 염기성 아미노산 (His, Lys, Arg, Gln, Asn) 및 황함유 아미노산(Cys, Met). 아미노산의 결실은 바람직하게는 본 발명의 GKN 1의 활성에 직접 관여하지 않는 부분에 위치할 수 있다. 또한 상기 기능적 동등물의 범위에는 GKN 1의 기본 골격 및 이의 생리 활성을 유지하면서 폴리펩티드의 일부 화학 구조가 변형된 폴리펩티드 유도체도 포함될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 폴리펩티드의 안정성, 저장성, 휘발성 또는 용해도 등을 변경시키기 위한 구조변경 및 생리활성을 유지하면서 다른　단백질과　융합으로　만들어진　융합단백질 등이 이에 포함될 수 있다.

또한 상기 GKN 1(Gastrokine 1) 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 발현 벡터 내로 공지의 방법에 의해 도입시킨 후 상기 발현 벡터를 당업계에 공지된 다양한 방법으로 형질도입(transduction) 또는 형질주입(transfection)에 의해 발현형으로 표적 세포 내에 도입시킬 수 있다.

플라스미드 발현 벡터는 사람에게 사용할 수 있는 FDA의 승인된 유전자 전달방법이며 사람 세포에 직접적으로 플라스미드 DNA를 전달하는 방법으로(Nabel, E. G. et al., Science, 249:1285-1288, 1990), 플라스미드 DNA는 바이러스 벡터와는 달리 균질하게 정제될 수 있는 장점이 있다. 본 발명에서 사용할 수 있는 플라스미드 발현 벡터로는 당업계에 공지된 포유동물 발현 플라스미드를 사용할 수 있으며, 본 발명의 일실시예에서는 pcDNA3.1(Invitrogen) 플라스미드를 사용하여 GKN 1 유전자가 삽입된 도 12의 개열지도를 갖는 재조합 발현벡터인 pcDNA3.1-GKN 1을 제조하였다.

본 발명에 따른 핵산을 포함하는 플라스미드 발현 벡터(plasmid expression vector)는 당업계에 공지된 방법, 예를 들어 이에 한정되지는 않으나, 일시적 형질주입(transient transfection), 미세주사, 형질도입(transduction), 세포융합, 칼슘 포스페이트 침전법, 리포좀 매개된 형질주입(liposome-mediated transfection), DEAE 덱스트란-매개된 형질주입(DEAE Dextran- mediated transfection), 폴리브렌-매개된 형질주입(polybrene-mediated trans fection), 전기침공법(electropora tion), 유전자 건(gene gun) 및 세포 내로 DNA를 유입시키기 위한 다른 공지의 방법에 의해 종양세포 내로 도입할 수 있다(Wu. et al., J. Bio. Chem., 267:963-967, 1992; Wu. et al., Bio. Chem., 263:14621-14624, 1988). 바람직하게는, 일시적 형질주입방법을 사용할 수 있다.

또한 상기 GKN 1을 발현시킬 수 있는 벡터는 공지의 방법에 의해 세포, 조직 또는 체내로 투여될 수 있는데, 예를 들면, 국소적으로, 비경구, 경구, 비강, 정맥, 근육 내, 피하 내 또는 다른 적절한 수단에 의해 투여될 수 있다. 특히, 상기 벡터는 표적 조직의 종양세포를 치료하기 위한 유효량으로 표적 암 또는 종양세포 내로 직접 주사할 수 있다. 특히, 눈, 위장관, 비뇨생식기관, 폐 및 기관지 시스템과 같은 체강(body cavity)에 있는 암 또는 종양의 경우에는 본 발명의 약학적 조성물을 암 또는 종양에 의해 영향을 받는 유강 기관(hollow organ) 내에 바늘, 도관(catheter) 또는 다른 종류의 수송튜브를 이용하여 직접 주입할 수 있다.

한편, 본 발명의 GKN 1은 암세포의 증식을 억제하고, 세포사멸을 촉진시킴과 동시에 암세포의 전이 및 침윤을 억제하는 활성이 있으므로 본 발명은 상기 유전자를 이용한 항암제 스크리닝 방법을 제공할 수 있다.

즉, 본 발명에 따른 항암제 스크리닝 방법은, (a) GKN 1 단백질 또는 상기 단백질을 발현하는 재조합 세포와 후보물질을 배양하는 단계; 및 (b) GKN 1 단백질의 활성 또는 세포 내 수준 증가에 미치는 효과를 측정하는 단계를 포함할 수 있다.

상기에서 GKN 1 단백질의 세포 내 수준 증가의 의미는 GKN 1 유전자의 발현이 증가되거나 또는 GKN 1 단백질의 분해가 억제되어 GKN 1 단백질의 농도가 증가되는 것을 말한다. 상기 GKN 1 유전자 발현은 GKN 1 유전자의 전사 및 단백질로의 번역 과정을 포함한다. 따라서 상기 후보물질이 세포 내에서 GKN 1 유전자의 발현 및 단백질의 수준을 증가시킬 경우, 상기 후보물질을 항암활성을 가지는 물질로 판단할 수 있다.

또한, GKN 1 단백질의 활성 및 세포 내 수준을 측정하는 방법은 당업계에 공지된 여러 가지 방법을 사용할 수 있는데, 예를 들면, 이에 한정되지는 않으나 면역침전법(coimmunoprecipitation), 효소면역분석법(enzyme-linked immunosorbentassay), 방사능면역분석법(RIA), 면역조직화학, 웨스턴 블로팅(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)을 포함할 수 있다.

또한 본 발명의 GKN 1을 표적으로 한 스크리닝 방법은 고효율 스크리닝(high throughput screening; HTS)을 적용할 수 있다. HTS는 다수의 후보물질을 병행 시험하여, 다수의 후보물질의 생물학적 활성에 대해 동시에 또는 거의 동시에 스크리닝하는 방법이다. 특정 양태로서, 96-웰 미세역가 플레이트 또는 192-웰 미세역가 플레이트에서 세포주를 배양하고, 여기에 다수개의 후보물질을 처리한 다음 면역화학적 방법에 의해 GKN 1의 발현정도를 측정할 수 있다. 상기 웰은 전형적으로 50㎕ 내지 500㎕에 이르는 검정 용적을 필요로 하며, 플레이트 이외에, 96-웰 포맷을 광범위한 균일계 및 불균일계 검정에 적합하게 하기 위해 다수의 계기, 기구, 피펫터, 로봇, 플레이트 세척기 및 플레이트 판독기가 상업적으로 이용 가능하다.

또한, 본 발명에 따른 항암 조성물은 암을 예방 및 치료할 수 있는 약학적 조성물로 사용될 수 있으며, 상기 약학적 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995). 본 발명에 따른 약학적 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 약학적 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.

상기와 같은 방법으로 제형화된 약학적 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다. 또한 본 발명의 항암용 조성물은 암을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수도 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

GKN 1 이 삽입된 재조합 벡터 제조 및 위암세포로의 형질전환

GKN 1 을 위암세포주인 AGS에 형질주입하기 위해, 우선 위암세포주 AGS를 열로 불활성화된 10% 소태아혈청과 함께 5% CO₂의 RPMI-1640 배지에서 37℃로 배양하여 준비하였다. 이후, GKN1의 cDNA를 PCR 방법을 이용해 증폭시키고, pcDNA3.1(Invitrogen, Carlsbad, CA, USA) 벡터에 제한효소 사이트(EcoRⅠ과 BamHⅠ을 사용)를 이용하여 도 12의 개열지도를 갖는 pcDNA3.1-GKN 1 재조합 벡터를 제조한 다음, Escherchia coli DH5a 수용성 세포(competent cell)에 형질 전환하였다. 형질 전환된 세포는 앰피실린이 포함된 LB agar 고체배지에 배양한 후 콜로니로부터 culture seed를 만들어 대량 배양 하였으며, 배양액으로부터 세포를 수집하여 DNA를 정제하고, pcDNA3.1-GKN 1 벡터를 제조하였다. 그리고 직경 60mm디쉬에서 Lipofectamine Plus Transfection Reagent(Invitrogen)를 이용하여, 발현벡터(총 DNA 5㎍)를 배양한 AGS 세포로 형질주입 시켰다.

< 실시예 2>

면역조직화학을 통한 GKN 1의 발현 패턴 분석

면역조직화학적 분석을 위해, 포르말린 용액으로 고정한 후 파라핀 처리된 169개의 위암조직 샘플을 함유하도록 조직 마이크로어레이 수여부 블락을 설계하였다. 각 암으로부터 직경 2mm로 3개의 조직 코어를 취해 시판 마이크로어레이 기기(Beecher Instruments, Micro-Array Technologies, Silver Spring, MD, USA)를 이용하여 새로운 수여부 파라핀 블락으로 옮기고, 각 종양 근처에 위치한 정상 위 점막의 실린더 하나도 수여부 블락으로 옮겼다. 모든 샘플은 사용 전 날 2μm 절편으로 절단하여 표준 프로토콜에 따라 보관해 두었다. 또한 면역조직화학 시그널을 최대화하기 위해서, 구연산염 버퍼에서 항원 회복하는 방법과 biotinylated tyramide로 시그널을 증폭하는 방법을 둘 다 사용하였는데, 구체적으로 열로 유발된 에피토프(epitope) 회복 방법은 10 mmol/L 구연산염 버퍼(pH 6.0)로 채운 Coplin 용기에 슬라이드를 담그고, 700W 전자 레인지안의 압력 쿠커(Nordic Ware, Minneapolis, MN, USA)에서 30분 동안 버퍼를 끓여 수행한 다음, Coplin 용기를 20분 동안 식혔다. 그리고 streptavidin-peroxidase와 biotinylated tyramide를 함유하는 Renaissance TSA Indirect Kit(NEN Life Science, Boston, A, USA)를 사용하였는데, 우선 슬라이드를 PBS로 헹군 다음, 내인성 페록시다아제(endogenous peroxidase) 활성을 제거하기 위해 PBS로 희석된 1% H₂O₂에 담가 실온에서 15분간 처리하였다. 그리고 슬라이드를 TNT 버퍼(0.1 mol/L Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 mol/L NaCl, 0.05% Tween 20)로 20분간 세척한 다음, TNB 버퍼(0.1 mol/L Tris-HCl, pH 7.4, 0.15 mol/L NaCl, 0.5% blocking reagent) 처리하였다. 이후 절편을 GKN 1 항체(1/100; Sigma-Aldrich Co, St. Louis, MO, USA)와 함께 4℃에서 밤새 배양하고, biotinylated goat anti-mouse 항체(Sigma, St. Louis, MO, USA)를 이용하여 검출한 다음, 페록시다아제 연결된 아비딘-비오틴 복합체와 함께 배양하였다. 디아미노벤지딘을 색원체로 이용하였고, 슬라이드는 메이어 헤마토크실린 용액으로 대비 염색하였다. 항원 염색 결과 분석은 세포질의 30% 이상이 양성으로 염색되었을 때 양성이라고 간주하였으며, 두 명의 병리학자가 독립적으로 검토하였다. 음성 대조군으로, 일차 항체를 비면역성 혈청으로 대체한 것을 이용하였다.

Parameters	GKN 1 protein expression
Parameters	+	-	P value
Adenomas	4	36	-
Carcinomas	-	-	-
Tumor location	-	-	0.3722
Upper	3	15	-
Lower	17	155	-
Size	-	-	0.7814
<6.5 cm	11	99	-
>6.5 cm	9	71	-
No. of metastatic L/N^≠	-	-	0.3295
N0(=0)	2	19	-
N1(1≤ ≥6)	6	57	-
N2(7≤ ≥15)	10	90	-
N3(>15)	2	4	-
Differentiation^†	-	-	0.7459
Intestinal	9	83	-
Diffuse	11	87	-
≠lymph node; †Lauren’s classification

그 결과, 도 1에 나타낸 바와 같이, 위전정부(antrum)와 체부(corpus)의 정상 위점막 세포 세포질에서 GKN 1에 대해 중간부터 강한 면역양성이 눈에 띄게 나타났다. 그러나 섬유아세포 같이 주위의 상응하는 기질세포들은 GKN 1에 음성이었다.

또한 상기 표 1에 나타낸 바와 같이, 위 선종(adenomas)과 암(carcinomas)의 각 36(90%)개 샘플과 170(89.5%)개 샘플에서 GKN 1 발현이 감소하거나 손실된 것으로 관찰되었다. 그리고 92개 장형과 98개 미만형 위암 샘플의 각각 9(9,7%)개와 11(11.2%)개에서 GKN 1 단백질 발현이 관찰되었으며, 조기 위암과 진행형 위암의 각 19(90.5%)개와 151(95.0%)개 샘플에서 GKN 1 발현이 감소하거나 손실된 것으로 나타났다.

< 실시예 3>

GKN 1 유전자의 돌연변이( Mutation ) 분석

위암세포에서 GKN 1 발현이 감소되는 원인을 알아보기 위해 염기 서열 분석을 통해 GKN 1 돌연변이를 조사하였다. 이를 위해 methacarn 고정된 총 81개의 위암 샘플과 40개의 위 선종 샘플을 가톨릭대학교 의과대학 부속병원으로부터 제공받았으며, 위암 샘플의 45개는 장형이고 36개는 미만형이었다. 위암의 평균 크기는 6.5cm였고, 위선종의 크기는 모두 2cm보다 작았으며, 제공받은 샘플들은 모두 가족성 암이 아니었다. 각 종양 세포에 상응하는 정상 점막세포의 게놈 DNA는 GKN 1 유전자의 전체 코딩 영역을 커버하는 6세트의 프라이머로 증폭되었으며, 프라이머 서열을 하기 표 2에 나타내었다. 각 PCR(중합연쇄반응)은 표준 조건으로 수행되었으며 PCR 조건은 표 3에 나타내었다. PCR 결과물의 서열 분석은 cycle sequencing kit (Perkin-Elmer, Foster City, CA, USA)를 이용하였다.

6세트의 프라이머 서열

Exon 프라이머	프라이머서열	서열번호	Annealing Tm
E1 sense	5'-CAACCTGGTTAAGTACAAAT-3'	3	52℃
E1 anti-sense	5'-GCAGACCTCCTAAATCTC-3'	4	52℃
E2 sense	5'-CAACCTGGTTAAGTACAAAT-3'	3	50℃
E2 anti-sense	5'-GCAGACCTCCTAAATCTC-3'	4	50℃
E3 sense	5'-CACCTTTTCAAGTTTGCTAC-3'	5	52℃
E3 anti-sense	5'-ATTGCACGTTGACTACCTAC-3'	6	52℃
E4 sense	5'-TCACTATTTGCCATCTACTT-3'	7	50℃
E4 anti-sense	5'-AAACCTCTCCCCTCAC-3'	8	50℃
E5 sense	5'-CTCTCCCATTCTTCCTTTCT-3'	9	54℃
E5 anti-sense	5'-CCCACCAGCACTAACTTG-3'	10	54℃
E6 sense	5'-CATTAATATAGGCTTCTTCT-3'	11	50℃
E6 anti-sense	5'-CAGCATATTCAGATGACT-3'	12	50℃

PCR 조건

Initially Denatured	12 min at 94℃
Denatured	40 sec 94℃	┓ 35 cycle ┛
Annealing	40 sec at 50-54℃
Extension	40 sec at 72℃
Final Extension	5 min 72℃

그 결과, 위선종(gastric adenomas)과 위암(gastric carcinomas)에서 GKN 1 유전자의 돌연변이는 발견되지 않았다. 결과의 신빙성을 확실히 하기 위해 조직 미세절제(microdissection), PCR, 염기 서열분석을 포함한 실험들을 세 번 반복하여 수행하였고, 결과는 일치하였다.

따라서 위암세포에서 GKN 1 유전자의 발현 감소는 돌연변이에 의한 것이 아니라는 사실을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

GKN 1 의 메틸화 상태 분석

상기 실시예 3을 통해 위암세포에서 GKN 1의 발현 감소가 돌연변이에 의한 것이 아님을 확인함에 따라 GKN 1 프로모터영역의 메틸화와 관련이 있는지를 분석하기 위해, 25개의 동결 위암샘플과 13개의 위암세포주(AGS, MKN-1, MKN-45, MKN-74, KATO-III, SNU-1, SNU-16, SNU-216, SNU-484, SNU-520, SNU-601, SNU-638, SNU-668, SNU-719)를 이용하였는데, 이 샘플들은 보건복지가족부의 지원을 받는 인체자원중앙은행의 구성원인 전남대학교 화순병원 한국인체자원은행으로부터 제공받았다. GKN 1 유전자의 프로모터 영역에서 메틸화 상태는 DNA의 소디움 바이설파이트 처리 후 메틸화 특이적인 PCR(Methylation specific PCR, MSP)를 수행하여 결정되었다. 바이설파이트로 치환된 DNA 5㎕로 메틸화된 GKN 1과 비메틸화된 GKN 1에 대한 2 세트의 프라이머를 이용해 MSP 하였다. 프라이머 서열은 하기 표 4와 표 5에 나타냈으며, PCR 조성 및 조건을 각각 표 6과 표 7에 나타내었다. 각 PCR 결과물은 즉시 2% 아가로즈 겔로 옮겨 UV 광선 조명에 보일 수 있도록 에티듐 브로마이드로 염색한 다음 전기영동 하였다.

메틸화 PCR 결과물을 이용한 MSP

프라이머	프라이머 서열	서열번호
methylated sense	5'-TAATGAATAGGAGTTTATTAAGCGA-3'	13
methylated anti-sense	5'-AAATACATAA ATAAACATAACTCTATCACG-3'	14

비메틸화 PCR 결과물을 이용한 MSP

프라이머	프라이머 서열	서열번호
unmethylated sense	5'-TTTGAATAATGAATAGGAGTTTATTAAGTG-3'	15
unmethylated anti-sense	5'-AATACATAAATAAACATAACTCTATCACAC-3'	16

PCR 조성

template DNA	5 ㎕
primer	0.5
dNTP	0.2
MgCI2	1.5 mM
Ampli Taq gold polymerase	0.4 unit
10X buffer	3 ㎕
총	30 ㎕

PCR 조건

Initially Denatured	1 min at 95℃
Denatured	30 sec 95℃	┓ 40 cycle ┛
Annealing	30 sec at 58℃
Extension	30 sec at 72℃
Final Extension	5 min 72℃

25쌍의 비암성 위점막과 위암조직에서 MSP를 수행하여 GKN 1 유전자의 바이설파이트-변형된 DNA 메틸화를 분석한 결과, 도 2A에 나타낸 바와 같이, 대부분의 암조직과 그에 상응하는 정상 위 점막에서 GKN 1 유전자에 대해 메틸화된 DNA와 비메틸화된 DNA가 둘 다 나타났다. GKN 1 프로모터 영역에서의 과메틸화(Hypermethylation)는 2개의 위암 샘플(4번과 8번)에서만 관찰되었다. 또한 도 2B에 나타낸 바와 같이, 14개의 위암 세포주에서는 메틸화된 PCR 결과물과 비메틸화 된 PCR 결과물을 모두 확인할 수 있었다.

따라서 상기 결과를 통해 위암세포에서의 GKN 1 유전자의 발현감소는 GKN 1 유전자의 프로모터 영역에서의 메틸화와는 크게 관련성이 없다는 것을 알 수 있었다.

< 실시예 5>

GKN 1 의 DNA 카피 수 변화와 mRNA 발현 분석

25개의 동결 위암 샘플로부터 추출한 게놈 DNA와 mRNA를 정량화한 다음, Stratagene Mx 3000P QPCR 시스템에서 real time SYBR Green QPCR를 수행하였다. GKN 1 DNA 카피 수 검출에 특이적인 프라이머는 Genbank의 게놈 서열에 따라 디자인하였고 이를 하기 표 8에 나타냈으며, 모든 샘플은 항상 발현되는 유전자 GAPDH에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머와 함께 PCR로 증폭되었고, normalize 되었다. GAPDH 프라이머는 하기 표 9과 같다.

프라이머	프라이머 서열	서열번호
GKN 1 sense	5'-CAACCTGGTTAAGTACAAAT-3'	3
GKN 1 anti-sense	5'-TCACTATTTGCCATCTACTT-3'	7

프라이머	프라이머 서열	서열번호
GAPDH sense	5'-ACCCAGAAGACTGTGGATGG-3'	17
GAPDH anti-sense	5'-TTCTAGACGGCAGGTCAGGT-3'	18

SYBR Green 분석을 위한 프라이머는 유전자 특이적인 비상동성 DNA 서열을 토대로 디자인하였고, mRNA 발현을 위해 cDNA를 Roche Molecular System reverse transcription kit(Roche, Mannheim, Germany)를 이용하여 합성하였다. QPCR을 위해 50ng cDNA는 Fullvelocity SYBR Green QPCR Master Mix(Stratagene, La Jolla, CA, USA)와 sense, anti-sense 프라이머 각각 20pmol/㎕를 이용하여 Stratagene Mx 3000P QPCR system에서 증폭되었다. mRNA를 위한 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머는 GKN 1 유전자에 대해 알려진 정보에 따라 제작하였고, 하기 표 10에 나타냈으며, DNA와 mRNA 추출과 역전사의 정확도를 확실히하기 위해, 모든 샘플은 항상 발현하는 유전자인 GAPDH에 특이적인 올리고뉴클레오티드 프라이머와 함께 PCR 증폭되었고, normalize되었다. 사용한 GAPDH 프라이머는 하기 표 11과 같다.

프라이머	프라이머 서열	서열번호
GKN 1 sense	5'-CAAAGTCGATGACCTGAGCA-3'	19
GKN 1 anti-sense	5'-CTTGCCTCTTGCATCTCCTC-3'	20

프라이머	프라이머 서열	서열번호
GAPDH sense	5'-AAATCAAGTGGGGCGATGCTG-3'	21
GAPDH anti-sense	5'-GCAGAGATGATGACCCTTTTG-3'	22

SYBR Green 분석을 위한 프라이머는 유전자-특이적인 비상동성 DNA서열을 토대로 제작하였다. 유전자 발현 산물의 상대적 양을 정량하기 위해 표준곡선 방법을 이용하였으며, 이 방법은 다양한 샘플에서 표적 DNA와 mRNA의 상대적인 함량의 직접적인 비교에 사용될 수 있는 유닛-리스(unit-less) normalized 발현 수치를 제공한다. 모든 샘플은 복제되어 테스트되었고 평균값을 정량에 사용하였다.

그 결과, 도 3A에 나타낸 바와 같이, real time-QPCR 분석에서 GKN 1의 카피수는 주위 위 점막 조직 DNA와 비교하여 20개의 위암 DNA에서 50% 이상 감소하였다. 또한 8개의 확장형 위암 중 5개, 14개의 장형 위암 중 10개, 3개의 혼합형 위암 중 3개 샘플에서 GKN 1의 카피 수가 감소한 것으로 검출되었다.

또한 위암 조직의 GKN 1 mRNA 발현 수치는 GAPDH에 normalization한 다음 대조군과 비교해 폴드 변화로 나타냈는데, 그 결과, 도 3B에 나타낸 바와 같이, 모든 비암성 위 점막 조직은 GKN 1 유전자 전사물을 발현한 반면, 모든 위암 조직은 손실이나 감소된 발현을 보였으며, 13개의 위암세포주는 유전자 전사물의 완벽한 부재(complete absence)를 보였다.

< 실시예 6>

위암세포주와 조직에서 GKN 1 단백질의 발현 분석

상기 실시예 2를 통해 확인한 바와 같이, 위암세포주 또는 조직에서 GKN 1 단백질의 수준이 정상세포 또는 조직에 비해 감소되는지를 재확인하기 위해, 웨스턴 블롯 법으로 25개의 동결 위암 샘플, 대응하는 주변 정상 위 조직, 그리고 13개의 위암세포주를 대상으로 실험하였다. 우선 샘플을 막자와 막자사발을 이용하여 액체 질소 하에 아주 고운 가루로 갈고, 1X protease inhibitor mix (Roche)가 보충된 차가운 Nonidet P-40 용해 버퍼에 현탁하였다. 그 다음 세포 용해물을 10% 폴리아크릴아미드 겔로 분리하고, hybond-PVDF transfer membrane (Amersham)에서 블롯한 다음, anti-GKN 1 단일 클론 항체(sigma)으로 탐침하고, Horse radish peroxicase(HRP)가 결합되어 anti-mouse IgG와 함께 배양하였다. 단백질 밴드는 enhanced chemiluminescence Western blotting detection reagents(Amersham)를 이용하여 검출하였다.

그 결과, 어떤 위암 세포주에서도 GKN 1 유전자의 발현을 확인할 수 없었다. 또한 위암 조직을 웨스턴 블롯으로 검사한 결과, 도 4에 나타낸 바와 같이, GKN 1 단백질 발현이 상응하는 위 점막 조직과 비교하여 25개의 암 조직 중 21개(84.0%)에서 감소하거나 손실되었는데, 8개의 미만형 위암 중 6개(75.0%), 14개의 장형 위암 중 13개(92.8%) 그리고 3개의 혼합형 위암 중 2개(66.7%)에서 GKN 1 단백질의 발현이 감소되었다. 유전자의 프로모터 영역에서 과메틸화(hypermethylation)된 2개의 위암 조직도 GKN 1 발현이 감소하거나 손실된 것으로 나타났다.

< 실시예 7>

세포 증식과 세포 사멸에서 GKN 1의 역할 분석

<7-1> 세포 생존력 분석

앞서 살펴본 바와 같이, 정상세포에 비해 위암세포에서 GKN 1 유전자의 발현이 감소된다는 사실을 통해, 본 발명자들은 GKN 1이 위암의 억제활성을 갖는지를 다음과 같은 실험을 통해 분석하였다.

즉, 상기 실시예 1에서 제조한 GKN 1 발현 벡터를 이용하여 세포 생존력 분석을 수행하였는데, 발현벡터로 위암 세포주에 형질주입 시킨 다음 24, 48 및 72시간이 경과했을 때 각각 MTT[3-(4,5 dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazoliumbromide]분석을 수행하였다. 흡광도는 분광광도계를 이용하여 540nm에서 측정하였고, 생존능력은 대조군에 상대적인 발현을 통해 측정하였다. 또한 세포 증식에서의 GKN 1의 효과를 보기 위해, BrdU 세포 증식 분석 키트(Millipore, Billerica, MA, USA)를 이용하여 일시적으로 형질주입 시킨 후 24, 48 및 72시간이 경과했을 때 각각 BrdU(Bromodeoxyuridine) 결합 분석을 수행하였다. 흡광도는 분광광도계를 이용하여 450nm에서 측정하였고, 증식은 대조군에 상대적인 발현을 통해 측정하였다. 여기서 상기 대조군으로는 형질주입되지 않은 세포를 이용하였다.

그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, GKN 1을 발현하는 발현벡터로 형질주입된 세포에서는 대조군에 비해 세포 생존력과 세포 증식이 시간이 흐름에 따라 유의적으로 억제되었다.

<7-2> 세포 사멸 분석

세포사멸 분석을 위해, 아넥신V 결합 분석을 수행하였다. 아넥신V는 세포 멤브레인에 포스파티딜세린(Phosphatidylserine, PS)을 나타내는 세포와 결합하고, 프로피듐 아이오다이드(propidium iodide, PI)는 손상된 세포막을 가진 세포 DNA를 염색한다. 형질주입된 AGS세포를 차가운 PBS로 두 번 세척하고, 100㎕ 결합버퍼에 재현탁하였으며, 각 샘플마다 상층액 100㎕를 블로킹 용액 400㎕와 혼합하였다. 그 다음 아넥신 V-FITC 5㎕(1㎍/ml)와 PI 5㎕(2㎍/ml)를 혼합물에 추가하고, 빛이 없는 곳에서 15분 배양한 후, 형광활성화세포분류기(fluorescence activated cell sorter; BD Biosciences, USA)에서 세포를 분석하였다. PI에 염색되지 않고 형광에만 양성인 세포를 사멸 세포로 간주하였다. 또한 GKN 1이 caspase에 의한 세포자살을 유발하는지 확인하기 위해, 세포사멸의 억제를 위한 caspase-3 억제제(Z-DEVD-fmk; Calbiochem, San Diego, CA, USA)와 caspase-8 억제제(Z-IETD-fmk; Calbiochem)를 디메틸설폭사이드(dimethylsulphoxide)에 용해시켜 사용하였다.

FITC-표지된 annexin V 세포 염색을 통한 세포사멸 분석 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, GKN 1 발현벡터로 형질주입된 위암세포에서 사멸세포가 시간이 흐름에 따라 증가하는 것으로 나타났다. 또한 세포 사멸의 억제를 위해 각 50의 caspase 3 억제제(Z-DEVD-fmk), caspase-8 억제제(Z-IETD-fmk)를 처리한 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, GKN 1로 유발된 세포사멸은 두 caspase 억제제에 의해 억제되는 것으로 나타났다.

<7-3> 세포사멸의 웨스턴 블롯 분석

GKN 1 형질주입시킨 다음 세포사멸의 분자적 메카니즘을 확인하기 위해, 세포사멸과 관련된 단백질의 발현 수치를 측정하였는데, 이를 위해 anti-GKN 1, anti-cleaved caspase 8, anti-BAX, anti-cytochrome c, anti-caspase 3, anti-cleaved caspase 3, anti-PARP, anti-GAPDH, anti-mouse IgG, anti-rabbit IgG 등의 항체들을 사용하였고, 결합항체 검출을 위해 ECL plus Western blotting detection system(Amersham)을 사용하였으며, 웨스턴 블롯 후 밴드의 강도는 LAS 3000(Fuji Film, Japan)을 이용하여 정량하였다.

또한 GKN 1이 caspase에 의한 세포자살을 유발하는지 웨스턴 블롯을 통해 알아보기 위해, 세포 사멸 억제를 위한 caspase-3 억제제와 caspase-8 억제제 처리 후 웨스턴 블롯을 수행하였다.

웨스턴 블롯 분석으로 GKN 1 발현벡터로 형질주입된 세포 용해물에서 세포사멸과 관련된 단백질들을 확인한 결과, 도 8A에 나타낸 바와 같이, 잘린 형태의 caspase 8, caspase 3, PARP가 GKN 1 발현벡터로 형질주입된 세포에서 발견되었다. 그러나 BAX, cytochrome c를 포함한 미토콘드리아 경로를 통한 세포 사멸 관련 단백질들의 발현 변화는 나타나지 않았다. 또한 도 8B에 나타낸 바와 같이, GKN 1로 유발된 세포사멸은 두 caspase 억제제에 의해 확실하게 억제되었다.

따라서 상기 결과를 통해 본 발명자들은 GKN 1 유전자는 위암 세포의 세포사멸 촉진을 통해 항암 활성을 갖는다는 사실을 알 수 있었고, 세포 사멸 촉진은 caspase-3 및 caspase-8과 같은 세포사멸 인자의 활성을 통해 이루어진다는 사실을 알 수 있었다.

< 실험예 8>

세포이동과 침윤 분석

GKN 1의 또 다른 항암 활성 분석을 위해, GKN 1이 암세포의 이동과 침윤에 미치는 영향을 살펴보았는데, 즉 GKN 1 발현벡터와 GKN 1 siRNA를 AGS세포로 각각 형질주입시킨 후, 직접 200 ㎕ 피펫 팁으로 융합성 세포 단일층을 상처 내어 무세포(cell-free) 영역을 만들었다. 세포 이동은 형질주입시킨 후 6, 12 및 24 시간이 경과하였을 때마다 각각 평가하였다. 세포의 운동성은 48-웰 microchemotaxis 챔버에서 젤라틴 코팅된 8㎛ polyvinylpyrrolidine-free polycarbonate (Neuroprobe, Cabin John, MD, USA)로 분석되었다. 6 X 10⁴ 세포를 함유하는 세포 서스펜션은 각각 microchemotaxis 챔버의 상위 챔버로 추가하였고, 1% 소혈청알부민-RPMI를 함유하는 배지는 하부 챔버로 추가하였다. 이후 챔버를 37℃의 5% CO₂ 가습 인큐베이터에서 16시간동안 배양하고 나면, 이동세포는 멤브레인을 통과해 아래쪽 챔버로 이동하고 비-이동세포는 위쪽 챔버에 남아있게 되는데, 세포수는 독립적인 세 번의 실험으로 20X 필드에서 아래쪽 챔버에 있는 세포수를 계산함으로써 결정하였다. 침윤 정도는 BD Biocoat MatrigelTM 침윤 챔버(BD Bioscience, San Jose, CA, USA)에서 0.5 mm Matrigel이 코팅된 8 ㎛ 기공의 폴리카보네이트 필터와 함께 분석되었다. 각각 안으로 1X10⁵개 세포를 함유하는 상위 칸막이를 가진 침윤 챔버와 5% 소 혈청 알부민-RPMI 배지를 포함한 하부 챔버는 37℃의 5% CO₂ 가습 인큐베이터에서 24시간동안 배양하였다. 그 다음 멤브레인을 고정하고 Diff-Quik으로 염색하였으며, 두 번의 독립적인 실험을 통해 현미경 20X필드에서 직접 세포수를 계산하였다.

시험관내에서 상처 치료, transwell chemotaxis, 침윤 분석을 수행한 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, GKN 1 발현벡터로 형질주입된 AGS 세포와 비교하여 GKN 1 유전자가 삽입되지 않은 대조군 발현벡터(mock)와 GKN 1 siRNA로 형질주입된 세포는 각 12시간과 24시간 후 눈에 띄게 상처 부위로 이동한 반면, GKN 1이 과발현된 세포는 세포의 이동이 억제되는 것으로 나타났다.

또한 microchemotaxis 챔버와 chemoattractant로 혈청을 이용하여 주화성(chemotaxis)에의 GKN 1의 효과를 실험한 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, GKN 1 형질주입된 AGS 세포에서 하부 챔버로의 세포 이동은 대조군 발현벡터만 처리한 것과 siRNA 처리된 AGS 세포에 비해 41.5%로 감소하였다.

나아가 AGS 위암세포 침윤에 GKN 1의 효과를 알아보기 위해 matrigel 침윤도 분석을 수행한 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 대조군 발현 벡터만 형질주입된 세포에서보다 GKN 1이 과발현된 AGS세포주에서 침윤이 눈에 띄게 억제되었으며, 이는 GKN 1 과발현이 위암 세포주에서 침윤도 억제함을 통해 항암 활성을 갖는다는 사실을 알 수 있었다.

통계분석

GKN 1발현과 위암의 임상병리학 변수간의 연관성 검정을 위해 카이스퀘어 테스트(Chi-square test)를 하였다. P값이 0.05미만인 수준에서 통계적 유의성으로 간주하였다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Catholic University <120> A composition comprising Gastrokine 1 for anti-cancer <160> 22 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 199 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> GKN 1 amino acid sequence <400> 1 Met Leu Ala Tyr Ser Ser Val His Cys Phe Arg Glu Asp Lys Met Lys 1 5 10 15 Phe Thr Ile Val Phe Ala Gly Leu Leu Gly Val Phe Leu Ala Pro Ala 20 25 30 Leu Ala Asn Tyr Asn Ile Asn Val Asn Asp Asp Asn Asn Asn Ala Gly 35 40 45 Ser Gly Gln Gln Ser Val Ser Val Asn Asn Glu His Asn Val Ala Asn 50 55 60 Val Asp Asn Asn Asn Gly Trp Asp Ser Trp Asn Ser Ile Trp Asp Tyr 65 70 75 80 Gly Asn Gly Phe Ala Ala Thr Arg Leu Phe Gln Lys Lys Thr Cys Ile 85 90 95 Val His Lys Met Asn Lys Glu Val Met Pro Ser Ile Gln Ser Leu Asp 100 105 110 Ala Leu Val Lys Glu Lys Lys Leu Gln Gly Lys Gly Pro Gly Gly Pro 115 120 125 Pro Pro Lys Gly Leu Met Tyr Ser Val Asn Pro Asn Lys Val Asp Asp 130 135 140 Leu Ser Lys Phe Gly Lys Asn Ile Ala Asn Met Cys Arg Gly Ile Pro 145 150 155 160 Thr Tyr Met Ala Glu Glu Met Gln Glu Ala Ser Leu Phe Phe Tyr Ser 165 170 175 Gly Thr Cys Tyr Thr Thr Ser Val Leu Trp Ile Val Asp Ile Ser Phe 180 185 190 Cys Gly Asp Thr Val Glu Asn 195 <210> 2 <211> 6408 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GKN 1 Polynucleotide sequence <400> 2 ataacaccta gtttgagtca acctggttaa gtacaaatat gagaaggctt ctcattcagg 60 tccatgcttg cctactcctc tgtccactgc tttcgtgaag acaagatgaa gttcacagtg 120 agtagatttt tccttttgaa tttaccacca aatgattgga gactgtcaat attctgagat 180 ttaggaggtc tgcttcttat ggccccatca tggaaaattt gttttaaaaa aattctctct 240 tcaaacacat ggacacagag aggggaacaa cacacactag gtcctgttgg ggggtggaga 300 gtgaggggag ggaacttaga ggacaggtca ataggggcag caaaccacca tggcacacat 360 atacctatgt aacaaacctg cacgttctgc acatgtatcc ctttttttta gaagaagaaa 420 taatgaaaaa aaatcttttt tctatttata taatcatggc atttataagc atctctatag 480 agaaggataa ttgtgctgag attagacagc tgtctgagca cctcacactg acctattttt 540 aacaaaatga ctttccgcat cacctgattc cggtctccat gcagggtaag cagttcctaa 600 gccctagaaa gtgccgatca tccctcattc ttgaattcct ccttttattt accaaaattc 660 ctgagcatgt tcaggaaaga tgaaaagctt attatcaaaa taagtggctg agatagactt 720 cttgtcacat ttgttacagt aaaatgggtc tccaagaaag aaagatttgc cttgggctct 780 agcatggcca tttatttaag aaagcatctg aaacatgaag ctaccacagc atctctcctg 840 tggttccaga cagaagcctg agagtctagg aggaggtgga ccgagaaacc ctgccaaagt 900 aactagtagt gccgggtttc tcacaacacg atgcaaaggg gctagaatca gatgactatt 960 ttcatgtttc aacatactac acactggaaa acgttacggc agactctact ttataatggg 1020 gctgcaaatg taaaatgact acctagaact aggtcctctt aatagcagca aagtttaaaa 1080 gggtcagagg gagctccaga cacaggttag atttgatttc tctcctagtt ctgctgtgaa 1140 caagaggtat aagtttggcc aactcactta acccctgaag ctcagttacc ttatctgtaa 1200 aatgattgca ttgtactagg tgttctctaa aatttcttct acctctgact ttttaggaga 1260 ctaattttta actccttttt aagctattgg gagaaaaatt taattttttt tcaaaagtta 1320 ccttgaatct ctagagcagt tctcaaaact attttgtccc aggcaaagga aatgagacta 1380 ggtacccaga atgaggcacc ctgcataaag ctctgtgctc tgaaaaccaa tgtcagggac 1440 cctgtgataa ataattaaac caagtatcct gggacactgc tagtgacatc gcctctgctg 1500 atcactcttg ccagcgagac actctatact tgctttctca tcattggcat ccaaactgcc 1560 tactaatcca ttgctttgga aagttttttt taataaaaag attatttcta ttaggaagaa 1620 aacatcccat gttaaatagg aaaattaact gaaatcattt tcagatgtga tttttagcac 1680 ttatagccat ctcaaaccat agtattcatt tatactatgc tatttattgt aaaacttctt 1740 tttttttcca aggaaaataa gatagtttgc tttattttaa aacagtaact ttcttatatt 1800 ggggcactga ccaaaattca atactggtac aaatatgtta cctaggaggt caaaatatgt 1860 gccaggtgaa ttttctgaat ttctctaaag agagaatttt aaaccttata aaacaattag 1920 aaacaagtga gtgagaggtg agcatcaaca acctgtgtaa cataagccac agtacaaatt 1980 taagctgaat aaccaagcca tgtcagttat cccaaatcat ttttgttaat atttaggagg 2040 atacacatat tttcaataac ttaaaagtga atctttactc ctatctctta atactcgaag 2100 aagtataact ttcttctttt actagattta aataatccaa atatctactc aaggtaggat 2160 gctgtcatta actatagctg agtttatcca aaatagaaaa atcatgaaga tttataaagc 2220 attttaaaaa taatcattta tagcaagtcc ttgaaagctc taaataagaa aggcagttct 2280 ctactttcta ataacaccta tggtttatat tacataatat aattcaacaa aacagcattc 2340 tgaccaatga taatttatag gaaattcatt tgccaagtat atgttttatt ataaagttaa 2400 tattttgacc aatcttaaaa atttttaaac tctattctga catttccaga agtattatct 2460 tagcaaagtc atctttatga taccacttat taaactgaag agaaacaaga tggtacattc 2520 tgggttttac tttaaaaggg atttgattca ataatttgat ttatcactac ttgaaaatta 2580 cattttcttc ctcagtactg gatggcaatg agatgaaagc agctttcctg gctctcaact 2640 tcccttcttc atcaattttt ccagcgtttc ataaggccta cactaaaaat tctaaaacta 2700 tatatcacat taatataatt acttataatt aatcagcaat ttcacattat cgttaaaacc 2760 tttatggtta aaaaatgcaa ggtaagagaa gaaaaaaaca cattgaacta gaactgaaca 2820 cattggtaaa attagtgaat acttttcata agcttggata gaggaagaaa gaagacatca 2880 ttttgccatg taacaggaga ccaatgttat ttgtgatttc agattgtctt tgctggactt 2940 cttggagtct ttctagctcc tgccctagct aactatgtaa gtctcacctt ttcaagtttg 3000 ctaccaaaat gcatttgcaa ggaaatgtga tattaaatca ctctcaatct cttataaact 3060 tcagaatatc aacgtcaatg atgacaacaa caatgctgga agtgggcagc agtcagtgag 3120 tgtcaacaat gaacacaatg tggccaatgt tgacaataac aacggatggg actcctggaa 3180 ttccatctgg gattatggaa atgtaggtag tcaacgtgca attttcactt tattgtttaa 3240 aaatacgatt tctttttaac aaaaaatgtg catgttaacc ataaagaaat taaaaataaa 3300 ttctaattac acatagcata cagttataag taaaggtgac cattttgctc atccgatttt 3360 gttccctaga gataactact gttaataagt gttgcatgat cagttaaaat tcaaaccaac 3420 aaacactatg ttcaagggat tgtgggtata tacaacaaat atgaacatcc ttttgccttg 3480 cctgcagata ccctcaataa tgctgaaaga cttatacaac attactgctt ccaaagctta 3540 gactatctca ctttgttttc aaaggaggtt ttacgacctt ctaaagagat tgaaattgac 3600 atttcaccta aaactcggga aatgtaaatg acaatattaa ttggtaagag aggaaagaag 3660 aaagaaagaa ggaaggaaag aaagaaagaa ggaaggaagg aaagaaagaa agaaagaaag 3720 aaagagagag aaagaaagaa aaagaaaaaa gagagaaaga gagaaggaaa gaaagagaga 3780 aggaaaggaa aagagaagca aagaaagaga ggagcaaaga aaggaacact tagcactagt 3840 taggagaccc aactctggaa ttatcagcta tatatttaac aaacgttata cttttaaata 3900 gcaaactctt tattgtttca attttatctg gtcaattgga aaaataattt ttgtcttatc 3960 tgtctccttg aaatgtgagg atcaaaggag actaaaacat gatagctttt aaagtctatt 4020 tcagtaaaac agacttatat agaggggttt ttatcatgct ggaacctgga aataaagcaa 4080 accagttaga tgctcagtct ctgccctcac agaattgcag tctgtcctca caaatgtcag 4140 caatagatat gattgccaag cagtgcccca tccagtgctc ttatcccagc tcatcacgat 4200 cttggagttc ccatttctct ctgcaggtgg aactgacctc tgataagaaa agctcctcgg 4260 agaacacatg cctcactatt tgccatctac tttaacaggg ctttgctgca accagactct 4320 ttcaaaagaa gacatgcatt gtgcacaaaa tgaacaagga agtcatgccc tccattcaat 4380 cccttgatgc actggtcaag gaaaagaagg taaaaataaa aggcttttta tttttggtga 4440 ggggagaggt tttacatcct tcagtaaata acgagaagat cacagtcatt ccctcttgac 4500 tacagtatgt tgtagtgtgc agcacaaagg gggaagttat tggtgattgc ctgagggaag 4560 gcaacttctg ccacatcaaa tgctgtggct cacacctacc tctacaaccg ctgagcaaag 4620 cacttgaaac cttgactgtt agaggagcaa agctctggtc acaccaatag gagcctcagt 4680 actttgccaa ggacattttt ctgcaagagt tagttagggt tattagattt agcaaatgaa 4740 aatagaagat atccagttag gtttgaattt taggtaagca gcaggtcttt ttagtataat 4800 atatcctatg caatatttgg gatatactaa aaaaagatcc attgtttatc tgaaattcaa 4860 atgtaactgg gtattgtata ttttgtctgg ccatactaat ccaggtgagt ggaaagaaga 4920 gatccataat gttttaaaat atttgcctga gttcatattc ctataactga taaatgagta 4980 cctttcattg acaaggtaga gaaaataaat aaactgcatt ctcagaagat gattattaca 5040 tagtctaatc caaggaatct atgatgacca aatgaggtcc aagttgcaga ataaattaag 5100 cctcagactt ctgtgtttat gagaagctga ggtttcaaac cagctaaatc ccttaggaca 5160 cttagaaatg ctaagatata cagaataagc tagaaatggc tcttcttcat cttgattatg 5220 gaaaaattta gctgagcaac actcactgtt ggcctcgtat acccctcaag tcaacaaacc 5280 actgggcttg gcattcattc tctcccattc ttcctttcta cctctctttt ccacactcag 5340 cttcagggta agggaccagg aggaccacct cccaagggcc tgatgtactc agtcaaccca 5400 aacaaagtcg atgacctgag caagttcgga aaaaacattg caaacatgtg tcgtgggatt 5460 ccaacataca tggctgagga gatgcaaggt gagtagcatc cctactgtgc accccaagtt 5520 agtgctggtg ggattgtcag actatcctcg cgcgtgtcca tagtgggcac cagtgatgca 5580 gggatggtca tcaaggccaa catttgtgca gtgcttgctc tgtgccaggt actgttctat 5640 gtgctttaag tgtgttaact cggttcttca cagcaatctt ataggttcta ttttaatcct 5700 actttatgga tgaggaaact gaggtacaga gaggtcacaa aatccttgcc tgggtcaatt 5760 ccaagcattt tggctgtgga ttctgtgctc ttaaatatta tggaacactg ccttttaagt 5820 gtgaatcaag agtagactca agtcatattc aaaagaatgc atgaatggct aaatgaaaga 5880 agaatgctaa tagaatctat taactttcta tagctcagac aatcacttaa tttctggaca 5940 ttcaaagaac agctgcacac aaacaaagtg tctacctagg gacctaactt aatggcaatt 6000 ttccagatct ctgaattgat tgatttcatc acaacaagta gataaacctt gacattagca 6060 catagctagt ttggaaaccc ctactccccc aatcccctcc aagaaaagag tccttaaata 6120 gacattaata taggcttctt cttttctctt tattagaggc aagcctgttt ttttactcag 6180 gaacgtgcta cacgaccagt gtactatgga ttgtggacat ttccttctgt ggagacacgg 6240 tggagaacta aacaattttt taaagccact atggatttag tcatctgaat atgctgtgca 6300 gaaaaaatat gggctccagt ggtttttacc atgtcattct gaaatttttc tctactagtt 6360 atgtttgatt tctttaagtt tcaataaaat catttagcat tgaattca 6408 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E1 sense primer <400> 3 caacctggtt aagtacaaat 20 <210> 4 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E1 anti-sense primer <400> 4 gcagacctcc taaatctc 18 <210> 5 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E3 sense primer <400> 5 caccttttca agtttgctac 20 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E3 anti-sense primer <400> 6 attgcacgtt gactacctac 20 <210> 7 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E4 sense primer <400> 7 tcactatttg ccatctactt 20 <210> 8 <211> 16 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E4 anti-sense primer <400> 8 aaacctctcc cctcac 16 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E5 sense primer <400> 9 ctctcccatt cttcctttct 20 <210> 10 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E5 anti-sense primer <400> 10 cccaccagca ctaacttg 18 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E6 sense primer <400> 11 cattaatata ggcttcttct 20 <210> 12 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> E6 anti-sense primer <400> 12 cagcatattc agatgact 18 <210> 13 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> methylated sense primer <400> 13 taatgaatag gagtttatta agcga 25 <210> 14 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> methylated anti-sense primer <400> 14 aaatacataa ataaacataa ctctatcacg 30 <210> 15 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> unmethylated sense primer <400> 15 tttgaataat gaataggagt ttattaagtg 30 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> unmethylated anti-sense primer <400> 16 aatacataaa taaacataac tctatcacac 30 <210> 17 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH sense primer <400> 17 acccagaaga ctgtggatgg 20 <210> 18 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH anti-sense primer <400> 18 ttctagacgg caggtcaggt 20 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GKN 1 sense primer <400> 19 caaagtcgat gacctgagca 20 <210> 20 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GKN 1 anti-sense primer <400> 20 cttgcctctt gcatctcctc 20 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH sense primer <400> 21 aaatcaagtg gggcgatgct g 21 <210> 22 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> GAPDH anti-sense primer <400> 22 gcagagatga tgaccctttt g 21

Claims

GKN 1(Gastrokine 1) 단백질 또는 GKN 1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 항암용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 GKN 1 단백질은 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 GKN 1 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드는 서열번호 2의 염기서열로 이루어진 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 폴리뉴클레오티드는 발현벡터 내에 포함되어 있는 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
제4항에 있어서,
상기 발현벡터는 도 12의 개열지도를 갖는 pcDNA 3.1-GKN 1인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 암은 위암인 것을 특징으로 하는 항암용 조성물.
GKN 1 단백질 또는 상기 단백질을 발현하는 재조합 세포와 후보물질을 배양하는 단계; 및
GKN 1 단백질의 활성 또는 세포 내 발현수준 증가에 미치는 효과를 측정하는 단계를 포함하는 항암제 스크리닝 방법.
제7항에 있어서,
상기 후보물질이 GKN 1 단백질의 활성을 증가시키거나 세포 내에서 GKN 1 유전자의 발현수준을 증가시킬 경우, 항암활성을 갖는 항암제로 판단하는 단계를 추가하는 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
제8항에 있어서,
상기 GKN 1 단백질의 활성 또는 세포 내 발현수준은 면역침전법(coimmunoprecipitation), 방사능면역분석법(RIA), 효소면역분석법(ELISA), 면역조직화학, 웨스턴 블롯(Western Blotting) 및 유세포 분석법(FACS)으로 이루어진 군 중에서 선택되는 어느 하나의 방법으로 수행하는 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.
제7항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항암제는 위암을 예방 또는 치료할 수 있는 것을 특징으로 하는 항암제 스크리닝 방법.