KR20150114637A

KR20150114637A - ＳｅｒｐｉｎＡ1 유전자의 발현을 저해하는 저해제를 유효성분으로 포함하는 위암 치료용 약학적 조성물

Info

Publication number: KR20150114637A
Application number: KR1020140038834A
Authority: KR
Inventors: 박도윤; 권채화; 박혜지
Original assignee: 부산대학교 산학협력단; 부산대학교병원
Priority date: 2014-04-01
Filing date: 2014-04-01
Publication date: 2015-10-13

Abstract

본 발명은 SerpinA1 유전자 또는 SerpinA1 단백질의 발현을 저해하는 저해제를 유효성분으로 포함하는 위암 개선 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다. 또한, 임의의 위암치료 후 시료 내 SerpinA1 유전자 또는 SerpinA1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 위암의 치료 효과에 대한 정보 제공방법, 위암의 치료 효과 확인용 진단 키트, SerpinA1 유전자 또는 단백질의 발현 억제 방법, 및 위암 개선 또는 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 저해제를 이용하는 경우, 암세포의 침윤 및 이동성 수준을 감소시켜 위암의 개선 또는 치료에 효과적으로 적용될 수 있다.

Description

ＳｅｒｐｉｎＡ1 유전자의 발현을 저해하는 저해제를 유효성분으로 포함하는 위암 치료용 약학적 조성물{Pharmaceutical Composition for Treating Gastric Cancer Comprising an Inhibitor for Gene Silencing of SerpinA1}

본 발명은 SerpinA1 유전자의 발현을 저해하는 저해제를 유효성분으로 포함하는 위암 치료용 약학적 조성물에 관한 것이다.

위암(gastric cancer)은 전세계적으로 암 관련 질환에 대하여 사망률이 2, 3위를 차지할 정도로 사망률이 높은 암의 하나이다. 우리나라에서도 위암은 전체 암 발생의 두 번째를 차지한다. 위암의 대부분은 선암(adenocarcinoma)으로서 해부학적으로나 조직학적으로 특징이 다양하고, 환자의 임상적 경과도 다양하다. 위암의 검사수단은 위장 X-선 촬영과 위내시경과 같은 물리적인 것이 대부분이다. 또한 현재까지 진행되고 있는 위암의 최선의 치료는 외과적인 절제방법 밖에는 없다. 광범위한 절제로 인한 후유증과 항암제 투여에 따른 부작용이 야기되기도 한다. 따라서 위암을 치료할 수 있는 치료법의 개발이 필수적이다. 세린 프로테아제 저해제(Serine protease inhibitors, serpins)는 프로테아제 저해제(protease inhibitors)의 상과에 속하고, 세포외 물질(extracellular molecules)인 clade A와 intracellular serpins인 clade B로 분류된다(참조 J Biol Chem 2001, 276:33293 33296 및 Genome Biol 2006, 7:216). 세프린 페티다아제 저해제 클레이드 A 멤버 1(Serpin peptidase inhibitor clade A member 1, SerpinA1) 은 1-proteinase inhibitor 또는 1-antitrypsin(AAT)로도 알려져 있다. AAT의 발현증가가 폐암, 대장암, 편평상피세포암에서 전이의 불량한 예후와 관계가 있다고 보고되어 있다(참조 Br J Cancer 1992, 65:300-302, Int J Cancer 1990, 45:244-250 및 Am J Pathology 2011, 179:1110-1119). 또한 위암에서도 진행된 선암(well-differentiated adenocarcinoma)과 관련성이 있음이 확인되었다(참조 Hum Pathol 1984, 15:957-964).

따라서, 본 발명자들은 위암에서 SerpinA1의 발현과 중요한 임상적 특징과의 관계에 대해 분석하여, 위암세포에서 그 기능이 밝히고자 하였다. 이러한 암종에서 과발현 혹은 미발현되는 유전자를 동정하고 생물학적 기능을 밝히는 과정은 다양한 유전적 변화에 의해 이루어지는 위암의 발생 및 악성과정을 이해하는데 있어 중요하다.

본 발명자들은 SerpinA1과 위암의 연관성을 확인하기 위하여 예의 연구노력하였다. 그 결과, 위암에서 SerpinA1의 과발현 여부와 환자의 임상병리학적 특징과의 연관성을 조사하였고, 이러한 결과를 기반으로 SerpinA1 유전자 또는 SerpinA1 단백질의 발현을 저해하는 저해제를 이용하여 위암세포에서 SerpinA1의 기능을 억제함으로써, 위암의 치료에 응용할 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명의 목적은 SerpinA1 유전자 또는 SerpinA1 단백질의 발현을 저해하는 저해제를 유효성분으로 포함하는 위암 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공하는 데 있다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 SerpinA1 유전자 또는 SerpinA1 단백질의 발현을 저해하는 저해제를 유효성분으로 포함하는 위암 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 개체의 위암치료 후, 상기 개체로부터 얻어진 생물학적 시료 내의 SerpinA1 유전자 또는 SerpinA1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 위암의 치료 효과에 대한 정보 제공방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 개체의 위암치료 후, 상기 개체로부터 얻어진 생물학적 시료 내의 SerpinA1 유전자 또는 SerpinA1 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암의 치료 효과 확인용 진단 키트를 제공한다

또한, 본 발명은 SerpinA1 유전자의 발현을 저해하는 저해제를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 SerpinA1 유전자 또는 단백질의 발현 억제 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 조성물을 개체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 위암 개선 또는 치료 방법을 제공한다.

이하, 본 발명에 대하여 더욱 자세하게 설명한다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 SerpinA1 유전자 또는 SerpinA1 단백질의 발현을 저해하는 저해제를 유효성분으로 포함하는 위암 개선 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.

바람직하게는, 본 발명의 상기 SerpinA1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성되며, 상기 SerpinA1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성된다.

본 발명의 가장 큰 특징은 SerpinA1 유전자 또는 단백질의 발현을 억제하는 저해제를 세포 내로 도입시켜, SerpinA1 유전자의 발현을 특이적으로 억제하여 위암을 치료하는 효과를 갖는다는 것이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "저해제"는 "억제제"와 동일한 의미이며, 특정 유전자 또는 단백질의 기능을 억제, 저하 또는 경감시킬 수 있는 어떠한 것도 포함한다.

바람직하게는, 본 발명의 저해제는 SerpinA1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA(short interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide), 펩타이드(peptide), 항체 및 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이며, 보다 바람직하게는 SerpinA1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA(short interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA) 및 miRNA(microRNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상이고, 가장 바람직하게는 SerpinA1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA(short interfering RNA)이다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "siRNA(short interfering RNA)"는 특정 mRNA의 절단(cleavage)을 통하여 RNAi(RNA interference) 현상을 유도할 수 있는 짧은 이중사슬 RNA를 의미한다. 표적유전자의 mRNA와 상동인 서열을 가지는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 가지는 안티센스 RNA 가닥으로 구성된다. siRNA는 표적 유전자의 발현을 억제할 수 있기 때문에 효율적인 유전자 넉다운 방법으로서 또는, 유전자치료(gene therapy)의 방법으로 제공된다.

siRNA는 RNA끼리 짝을 이루는 이중사슬 RNA 부분이 완전히 쌍을 이루는 것에 한정되지 않고 미스매치(대응하는 염기가 상보적이지 않음), 벌지(일방의 사슬에 대응하는 염기가 없음) 등에 의하여 쌍을 이루지 않는 부분이 포함될 수 있다. 전체 길이는 10 내지 100 염기, 바람직하게는 15 내지 80 염기, 더욱 바람직하게는 20 내지 70 염기이다. siRNA 말단 구조는 표적유전자의 발현을 RNAi 효과에 의하여 억제할 수 있는 것이면 평활(blunt)말단 혹은 점착(cohesive) 말단 모두 가능하다. 점착 말단 구조는 3 말단 돌출한 구조와 5 말단 쪽이 돌출한 구조 모두 가능하다. 돌출하는 염기 수는 한정되지 않는다. 예를 들어, 염기 수로는 1 내지 8 염기, 바람직하게는 2 내지 6 염기로 할 수 있다. 본 명세서에서 siRNA의 전장은, 중앙의 이중사슬 부분의 길이와 양 말단의 단일사슬 돌출을 구성하는 길이의 합으로 나타내었다. 또한, siRNA는 표적유전자의 발현억제 효과를 유지할 수 있는 범위에서 예를 들어, 한 쪽 말단의 돌출 부분에 저분자 RNA(예를 들어, tRNA, rRNA, 바이러스 RNA와 같은 천연의 RNA분자 또는 인공의 RNA분자)를 포함할 수 있다. siRNA 말단구조는 양측 모두 절단 구조를 가질 필요는 없고, 이중사슬 RNA의 일방의 말단 부위가 링커 RNA에 의하여 접속된 스템 루프형 구조일 수도 있다. 링커의 길이는 스템 부분의 쌍을 이루는 데 지장이 없는 길이면 특별히 한정되지 않는다.

본 명세서에서 사용되는 용어 "특이적"은 세포 내에서 다른 유전자에 영향을 미치지 않고 목적 유전자만 억제하는 능력을 의미하고, 본 발명에서는 SerpinA1 특이적이다. 본 발명의 siRNA는 SerpinA1 특이적으로 작동하도록 SerpinA1 mRNA와 상동인 서열을 포함하는 센스 RNA 가닥과 이와 상보적인 서열을 포함하는 안티센스 RNA 가닥을 가진다.

본 명세서에서 사용되는 표현 "유전자 또는 단백질 발현의 저해" 란 목적 유전자에서 생성된 mRNA 및/또는 단백질의 수준이 제거 또는 감소된 것을 의미하고, 이는 mRNA의 절단(cleavage)을 통해 일어나는 RNA 간섭(RNA interference) 현상에 의한다.

siRNA를 제조하는 방법은 시험관에서 siRNA를 직접 합성한 뒤, 형질전환(transfection) 과정을 거쳐 세포 안으로 도입시키는 방법과 siRNA가 세포 안에서 발현되도록 제조된 siRNA 발현 벡터 또는 PCR-derived siRNA 발현 카세트를 세포안으로 형질전환 또는 감염(infection) 시키는 방법이 있다. siRNA를 제조하고 세포 또는 동물로 도입하는 방법의 결정은 실험의 목적 및 표적 유전자 산물의 세포 생물학적 기능에 따라 달라질 수 있다.

또한, 본 발명의 siRNA는 SerpinA1 mRNA를 특이적으로 감소시킬 수 있는 한, 서열과 길이는 특별히 제한되지 않으며, 본 발명의 실시예에서는 상업적인 siRNA를 이용하였으며, siRNA가 세포내 SerpinA1의 세포 내 수준을 감소시키고 암세포의 침윤 및 이동성을 감소시켰음을 확인하였다. 따라서, SerpinA1의 발현수준을 감소시키는 저해제인 siRNA를 유효성분으로 이용하여 위암을 치료 또는 개선할 수 있다.

본 발명의 조성물은 약학적으로 허용 가능한 희석제, 부형제 또는 담체를 추가로 포함할 수 있다.

상기 담체는 제제시에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘 및 미네랄 오일 등을 포함하나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등을 추가로 포함할 수 있다. 적합한 약학적으로 허용되는 담체 및 제제는 Remington's Pharmaceutical Sciences(19th ed., 1995)에 상세히 기재되어 있다.

본 발명의 약학적 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있고, 바람직하게는 비경구 투여이고, 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 국소 주입, 근육 주입 등으로 투여할 수 있다.

본 발명의 약학적 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 한편, 본 발명의 약학적 조성물의 투여량은 바람직하게는 1일 당 0.0001-100 mg/kg(체중)이다.

본 발명의 약학적 조성물은 당해 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 개체의 위암치료 후, 상기 개체로부터 얻어진 생물학적 시료 내의 SerpinA1 유전자 또는 SerpinA1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 위암의 치료 효과에 대한 정보 제공방법을 제공한다.

상기 방법은 개체의 위암치료 후 SerpinA1의 발현 수준을 측정한 것을 치료 전의 발현 수준 측정값과 비교하는 단계를 더 포함할 수 있다.

개체의 위암치료 후, 상기 개체로부터 얻어진 생물학적 시료 내의 SerpinA1 유전자 및/또는 SerpinA1 단백질의 발현 수준이 치료 전의 발현 수준보다 감소하면, 위암의 활성이 감소된 것으로 판단하며 이로써 임의의 치료 요법의 반응 경과를 확인할 수 있다.

본 발명에서 SerpinA1 유전자의 발현 수준 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 또한, 본 발명에서 SerpinA1 단백질의 발현 수준 변화의 측정은 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다.

본 발명의 방법은 상술한 SerpinA1의 발현 수준을 분석하는 과정을 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 조성물과 중복된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 개체의 위암치료 후, 상기 개체로부터 얻어진 생물학적 시료 내의 SerpinA1 유전자 또는 SerpinA1 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암의 치료 효과 확인용 진단 키트를 제공한다.

본 발명의 키트는 상술한 SerpinA1의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 조성물과 중복된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 SerpinA1 유전자의 발현을 저해하는 저해제를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 SerpinA1 유전자 또는 단백질의 발현 억제 방법을 제공한다.

상기 siRNA는 SerpinA1 유전자의 mRNA 수준을 세포에서 70% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상 감소시킨다.

본 발명의 방법은 상술한 SerpinA1의 발현 수준을 저해하는 저해제를 포함하기 때문에, 상술한 본 발명의 조성물과 중복된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 다른 양태에 따르면, 본 발명은 상기 조성물을 개체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 위암 개선 또는 치료 방법을 제공한다.

본 발명의 방법은 상술한 SerpinA1의 발현 수준을 저해하는 저해제를 포함하는 조성물을 투여하기 때문에, 상술한 본 발명의 조성물과 중복된 내용은 중복된 내용의 기재에 의한 본 명세서의 과도한 복잡성을 피하기 위하여 그 기재를 생략한다.

본 발명의 SerpinA1 유전자 또는 SerpinA1 단백질의 발현을 저해하는 저해제를 유효성분으로 포함하는 위암 개선 또는 치료제의 경우 위암 환자 조직에서 암세포의 침윤 및 이동성을 현저하게 감소시켜 위암의 개선 또는 치료에 효과적으로 적용될 수 있다.

도 1은 SerpinA1 발현과 그에 따른 위암 환자(n=400)의 누적 생존 확률을 확인한 Kaplan-Meier 생존분석 결과를 보여준다.
도 2는 SerpinA1을 과발현 시킨 후 위암세포주의 침윤과 이동성을 확인한 결과를 보여준다.
도 3은 serpinA의 발현을 억제 시킨 후 위암세포주의 침윤과 이동성을 확인한 결과를 보여준다.

이하, 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

실시예 1: SerpinA1 발현 여부 확인

SerpinA1 발현 여부는 부산대학교병원에서 위암 진단하에 수술을 시행한 환자 400명의 조직에서 SerpinA1의 항체(HPA000927, Sigma-Aldrich)를 이용한 면역조직화학 염색법으로 조사하였다. 상기 면역조직화학 염색법은 당업계에 공지된 일반적인 방법을 이용하였다. 도 1a 내지 1d에 도시된 바와 같이, SerpinA1 발현은 negative(-), mide(+), moderate(++), marked(+++)으로 구분하고, 발현이 없거나 낮은 그룹 ((-), (+))과 발현이 높은 그룹 ((++), (+++))으로 분류하여 분석하였다. SerpinA1의 과발현 여부와 환자의 임상병리학적 특징과의 연관성은 SPSS10.1을 이용하여 chi square 검정과 Kaplan-Meier 생존분석을 하였으며, 통계학적 유의성은 p<0.05를 기준으로 하였다. 상기 결과는 표 1에 나타내었다.

위암 환자 400례에서 SerpinA1 발현 및 임상병리학적 특징 간의 연관성

			No.	SerpinA1		P value
			No.	(-) (+)	(++) (+++)
나이(년)	400	582 ± 0.72	62.5 ± 0.86	<0.0001
크기(cm)	400	4.35± 0.19	5.27 ± 0.24	0.003
성별
남	258	148(57.4)	110(42.6)
여	142	101(71.1)	41(28.9)
위치 상부 중부	43 129	23(53.5) 89(69.0)	20(46.5) 40(31.0)	0.113
하부	228	137(60.1)	91(39.9)
병변 유형 *				<0.0001
융기형(Elevated)	91	44(48.4)	47(51.6)
편평/함몰형(Flat/Depressed)	151	126(83.4)	25(16.6)
함요형(Excavated)	158	79(50.0)	79(50.0)
병리학적 유형**				0.002
위장관형(Intestinal)	229	127(55.5)	102(44.5)
확산형(Diffuse) 혼합형(Mixed)	167 4	119(71.3) 3(75.0)	48(28.7) 1(25.0)
침윤 깊이***						<0.0001
T1	189	145(76.7)	44(23.3)
T2	61	32(52.5)	29(47.5)
T3	64	28(43.8)	36(56.2)
T4	86	44(51.2)	42(48.8)
신경 주위 침윤				<0.0001
음성	243	168(69.1)	75(30.9)
양성	157	81(51.6)	76(48.4)
림프 순환계 색전				<0.0001
음성	250	178(71.2)	72(28.8)
양성	150	71(47.3)	79(52.7)
림프절 전이****						<0.0001
N0	216	160(74.1)	56(25.9)
N1	55	33(60.0)	22(40.0)
N2	62	25(40.3)	37(59.7)
N3	67	31(46.3)	36(53.7)

* 융기형+편평/함몰형 vs 함요형, * 위장관+혼합형 vs 확산형, *** T1 vs T2+T3+T4, **** N0 vs N1+N2+N3

면역조직화학염색 결과, 대상환자(n=400) 중 37.75%(151/400)에서 SerpinA1 과발현 소견이 관찰되었다(도 1). serpinA 과발현 그룹 환자들의 평균연령은 62.5±0.86세, 그렇지 않은 그룹은 58.2±0.72세로 serpinA의 과발현 여부와 환자의 평균연령은 통계적으로 유의하였다(p=0.003). SerpinA1 과발현 그룹의 암종의 크기는 5.27±0.24 cm, 그렇지 않은 그룹은 4.35±0.19 cm로 serpinA의 과발현 여부와 암종의 크기 또한 통계적으로 유의한 차이가 나타났다(p=0.003). 그러나, 환자의 성별 및 암의 위치에 따른 SerpinA1의 발현여부는 통계적으로 유의한 차이가 없었다. 병변 유형에 따라 융기형(47례, 51.6%)와 편평/함몰형(25례, 16.6%)에 비해 함요형(79례, 50.0%)에서 통계적으로 유의하게 SerpinA1이 과발현되었다(p<0.0001). 병리학적 유형에 따라 확산형(48례, 28.7%)에 비해 혼합형(1례, 25.0%)과 위장관형(102례, 44.5%)에서 통계적으로 유의한 SerpinA1의 발현 증가를 보였다(p=0.002). 침윤 깊이에 따른 결과는 T1(44례, 23.3%)에 비해 T2(29례, 47.5%), T3(36례, 56.2%)와 T4(42례, 48.8%)에서 SerpinA1이 유의하게 과발현되었다(p<0.0001). 신경 주위 침윤(Perineural invasion)은 음성(75례, 30.9%)에 비해 양성(76례, 48.4%)에서 SerpinA1이 과발현되었다(p<0.0001). 또한, 림프순환계 색전(lymphovascular emboli)은 음성(72례, 28.8%)에 비해 양성(79례, 52.7%)에서 SerpinA1이 과발현되었다(p<0.0001). 림프절 전이에 따라 N0(56례, 25.9%)에 비해 N1(22례, 40.0%), N2(37례, 59.7%)와 N3(36례, 53.7%)에서 SerpinA1의 발현이 증가되었다(p<0.0001).

또한, 생존분석에서 SerpinA1 발현 증가에 따라 환자군의 생존률이 짧은 것을 확인하였다(도 1 E). SerpinA1 발현에 따른 (-), (+), (++), (+++)그룹의 평균생존시간이 각각 75.58월, 72.20월, 63.88월, 61.64월로 유의하게 감소하였다(p=0.001).

요약하자면, 본 실험에서는 결과의 신뢰도를 높이기 위해 400명의 위암환자를 대상으로 하였고, 다양하고 중요한 임상병리학적 특징과 상관관계를 분석하였다. 환자의 평균연령이 높고, 암종의 크기가 큰 경우, 함요형, 혼합형 및 위장관형에서 SerpinA1이 과발현되었다. 또한 T1기의 위암보다 T2, T3, T4기의 위암에서 SerpinA1이 과발현되는 결과를 얻었다. 이것은 SerpinA1의 과발현이 위암의 병기에 특이적이라는 사실을 확인한 것이다. 또한, 신경주위 침윤이 있고, 림프순환계 색전이 양성이며, 림프절 변이가 있는 위암에서 SerpinA1 발현이 높은 빈도로 발현되는 것은 위암의 발생 및 진행에 영향을 미친다는 것을 나타낸다. 또한, SerpinA1의 발현과 5년 이상 생존률을 비교했을 때 SerpinA1 과발현된 환자의 생존률이 감소하는 것을 확인함으로써 SerpinA1이 위암의 진행에 있어 중요한 인자임을 확인하였다.

또한, 나라마다 다른 유전적, 환경적 특성이 질환에 반영되기 때문에 본 연구의 대상이 한국인이라는 점도 주목할 만 하다.

실시예 2: SerpinA1 기능 확인

SerpinA1의 기능을 조사하기 위해 한국 세포주 은행으로부터 구입한 위암세포주 AGS와 MKN45에 SerpinA1 플라스미드 또는 siRNA를 각각 이용하여 serpinA를 과발현 또는 억제시켜 세포의 침윤과 이동성을 트랜스웰 어세이를 이용하여 비교하였다.

암세포 배양 후 상기 플라스미드, 또는 siRNA를 세포내 도입하여 24시간 시간 동안 배양하여 형질 전환하였다. 세포의 침윤성은 상용의 마이크로케모어트랙션 챔버(microchemoattraction chamber) (Corning, Life sciences, NY, USA)인 트랜스웰(Transwell)을 이용하여 시행하였다. 하부 웰에는 1% 소혈청이 포함된 배지를 분주하고 폴리카보네이트 막(polycarbonate membrane)이 부착된 인서트(insert)는 매트리겔(matrigel)로 코팅을 한 다음 배양접시 중간에 삽입하여 위쪽에 배양한 세포를 분주하고 막을 통과한 세포, 즉 침윤이 일어난 세포를 아래쪽에서 관찰한다. 아래 쪽에 이동이 일어난 세포의 수를 Hoechst로 핵염색하여 형광현미경으로 관찰하고 이미지를 저장하였다. 그 이미지를 이용하여 세포의 수를 세고 대조군에 대해 유의성을 계산하였다. 또한, 세포의 이동성은 마이크로케모어트랙션 챔버를 이용하여 시행하였다. 폴리카보네이트 막 위쪽에 배양한 세포를 분주한 후 막을 통과한 세포, 즉 이동이 일어난 세포를 아래쪽에서 관찰한다. 이동이 일어난 세포의 수를 Hoechst로 세포의 핵을 염색하여 세포의 수를 세었으며 대조군에 대해 유의성을 계산하였다.

본 발명의 SerpinA1 유전자는 서열번호 1의 염기서열을 포함하며, SerpinA1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 포함한다.

SerpinA1 cDNA 플라스미드(pCMV6-SerpinA1, Origene Technology Inc.)를 이용하여 SerpinA1을 과발현 시킨 후 위암세포주인 MKN45(도 2a 내지 2e)와 AGS (도 2f 내지 2j)의 침윤과 이동성을 확인하였다. 그 결과, 도 2에 도시된 바와 같이, SerpinA1의 cDNA 플라스미드(SerpinA1)와 대조군으로 플라스미드 벡터 (Vector)를 각각 위암세포주에 도입하고, 웨스턴 블롯팅(western blotting)으로 serpinA1의 과발현을 확인하였다(도 2a, MKN45 세포; 도 2f, AGS 세포). 막과 매트리겔을 통과한 세포수가 대조군에 비하여 SerpinA1이 과발현된 세포주에서 증가하는 것을 확인함으로써 SerpinA1의 발현 증가가 암세포의 이동(도 2b 및 2c, MKN45 세포; 도 2g 및 2h, AGS 세포)과 침윤(도 2d 및 2e, MKN45 세포; 도 2i 및 2j, AGS 세포)을 유의하게 증가시키는 것을 알 수 있었다.

또한, 본 발명에서 사용한 siRNA는 Dharmacon(Thermo Fisher Scientific Biosciences Inc.)에서 구입하였고, 서열들은 다음과 같다: 5'-GAACUCACCCACGAUAUCA-3', 5'-GAUGAAGCGUUUAGGCAUG-3', 5'-CCUAUGAUCUGAAGAGCGU-3', 및 5'-CCAAGAAACAGAUCAACGA-3'.

상기 siRNA를 이용하여 serpinA의 발현을 억제 시킨 후 위암세포주인 MKN45(도 3a 내지 3e)와 AGS(도 3f 내지 3j)의 침윤과 이동성을 확인하였다. 그 결과, 도 3에 도시된 바와 같이, SerpinA1의 siRNA(si-SerpinA1)와 대조군으로 타겟하고자 하는 부분이 없는 non-targeted siRNA(si-NT)를 각각 위암세포주에 도입하고 웨스턴 블롯팅으로 serpinA1의 발현 억제가 이루어졌음을 확인하였다(도 3a, MKN45 세포; 도 3f, AGS 세포). 과발현시킨 경우와 달리, 막과 매트리겔을 통과한 세포수가 대조군에 비하여 SerpinA1의 발현이 억제된 세포주에서 감소하는 것을 확인함으로써 SerpinA1의 발현 억제가 암세포의 이동(도 3b 및 3c, MKN45 세포; 도 3g 및 3h, AGS 세포)과 침윤(도 3d 및 3e, MKN45 세포; 도 3i 및 3j, AGS 세포)을 유의하게 감소시키는 것을 알 수 있었다.

따라서 SerpinA1이 위암세포의 침윤과 이동에 중요한 역할을 한다는 것을 알 수 있다. 이는 SerpinA1이 암세포의 이동성 및 전이를 촉진함으로써 위암의 발생과 진행에 영향을 미칠 수 있다는 것을 나타내고 SerpinA1 유전자가 암 치료 타겟으로 활용 가능함을 제시하는 것이다.

<110> Pusan National University Industry-University Cooperation Foundation <120> Pharmaceutical Composition for Treating Gastric Cancer Comprising an Inhibitor for Gene Silencing of SerpinA1 <130> pusan1.178p <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1254 <212> DNA <213> Homo sapiens SerpinA1 mRNA <400> 1 atgccgtctt ctgtctcgtg gggcatcctc ctgctggcag gcctgtgctg cctggtccct 60 gtctccctgg ctgaggatcc ccagggagat gctgcccaga agacagatac atcccaccat 120 gatcaggatc acccaacctt caacaagatc acccccaacc tggctgagtt cgccttcagc 180 ctataccgcc agctggcaca ccagtccaac agcaccaata tcttcttctc cccagtgagc 240 atcgctacag cctttgcaat gctctccctg gggaccaagg ctgacactca cgatgaaatc 300 ctggagggcc tgaatttcaa cctcacggag attccggagg ctcagatcca tgaaggcttc 360 caggaactcc tccgtaccct caaccagcca gacagccagc tccagctgac caccggcaat 420 ggcttgttcc tcagcgaggg cctgaagcta gtggataagt ttttggagga tgttaaaaag 480 ttgtaccact cagaagcctt cactgtcaac ttcggggaca ccgaagaggc caagaaacag 540 atcaacgatt acgtggagaa gggtactcaa gggaaaattg tggatttggt caaggagctt 600 gacagagaca cagtttttgc tctggtgaat tacatcttct ttaaaggcaa atgggagaga 660 ccctttgaag tcaaggacac cgaggaagag gacttccacg tggaccaggt gaccaccgtg 720 aaggtgccta tgatgaagcg tttaggcatg tttaacatcc agcactgtaa gaagctgtcc 780 agctgggtgc tgctgatgaa atacctgggc aatgccaccg ccatcttctt cctgcctgat 840 gaggggaaac tacagcacct ggaaaatgaa ctcacccacg atatcatcac caagttcctg 900 gaaaatgaag acagaaggtc tgccagctta catttaccca aactgtccat tactggaacc 960 tatgatctga agagcgtcct gggtcaactg ggcatcacta aggtcttcag caatggggct 1020 gacctctccg gggtcacaga ggaggcaccc ctgaagctct ccaaggccgt gcataaggct 1080 gtgctgacca tcgacgagaa agggactgaa gctgctgggg ccatgttttt agaggccata 1140 cccatgtcta tcccccccga ggtcaagttc aacaaaccct ttgtcttctt aatgattgac 1200 caaaatacca agtctcccct cttcatggga aaagtggtga atcccaccca aaaa 1254 <210> 2 <211> 418 <212> PRT <213> SerpinA1 protein <400> 2 Met Pro Ser Ser Val Ser Trp Gly Ile Leu Leu Leu Ala Gly Leu Cys 1 5 10 15 Cys Leu Val Pro Val Ser Leu Ala Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala 20 25 30 Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn 35 40 45 Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln 50 55 60 Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser 65 70 75 80 Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr 85 90 95 His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro 100 105 110 Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn 115 120 125 Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu 130 135 140 Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys 145 150 155 160 Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu 165 170 175 Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys 180 185 190 Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu 195 200 205 Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val 210 215 220 Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe His Val Asp Gln Val Thr Thr Val 225 230 235 240 Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys 245 250 255 Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala 260 265 270 Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu 275 280 285 Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp 290 295 300 Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr 305 310 315 320 Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe 325 330 335 Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys 340 345 350 Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly 355 360 365 Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile 370 375 380 Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Asp 385 390 395 400 Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr 405 410 415 Gln Lys <210> 3 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SerpinA1 siRNA <400> 3 gaacucaccc acgauauca 19 <210> 4 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SerpinA1 siRNA <400> 4 gaugaagcgu uuaggcaug 19 <210> 5 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SerpinA1 siRNA <400> 5 ccuaugaucu gaagagcgu 19 <210> 6 <211> 19 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SerpinA1 siRNA <400> 6 ccaagaaaca gaucaacga 19

Claims

SerpinA1 유전자 또는 SerpinA1 단백질의 발현을 저해하는 저해제를 유효성분으로 포함하는 위암 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 SerpinA1 유전자는 서열번호 1의 염기서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 위암 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 SerpinA1 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열로 구성되는 것을 특징으로 하는 위암 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 저해제는 SerpinA1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA(short interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide), 펩타이드(peptide), 항체 및 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 위암 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
제 4 항에 있어서, 상기 저해제는 SerpinA1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA(short interfering RNA)인 것을 특징으로 하는 위암 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용 가능한 희석제, 부형제 또는 담체를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 위암 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
제 1 항에 있어서, 상기 조성물은 암세포의 침윤 및 이동성을 저해하는 것을 특징으로 하는 위암 개선 또는 치료용 약학적 조성물.
개체의 위암치료 후, 상기 개체로부터 얻어진 생물학적 시료 내의 SerpinA1 유전자 또는 SerpinA1 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 위암의 치료 효과에 대한 정보 제공방법.
개체의 위암치료 후, 상기 개체로부터 얻어진 생물학적 시료 내의 SerpinA1 유전자 또는 SerpinA1 단백질의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 위암의 치료 효과 확인용 진단 키트.
SerpinA1 유전자의 발현을 저해하는 저해제를 세포에 접촉시키는 단계를 포함하는 SerpinA1 유전자 또는 단백질의 발현 억제 방법.
제 10 항에 있어서, 상기 저해제는 SerpinA1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA(short interfering RNA), shRNA(short hairpin RNA), miRNA(microRNA), 리보자임(ribozyme), DNAzyme, PNA(peptide nucleic acids), 안티센스 올리고뉴클레오타이드(antisense oligonucleotide), 펩타이드(peptide), 항체 및 앱타머로 이루어진 군으로부터 선택된 1종 이상인 것을 특징으로 하는 억제 방법.
제 11 항에 있어서, 상기 저해제는 SerpinA1 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 siRNA(short interfering RNA)인 것을 특징으로 하는 억제 방법.
제 1 항에 따른 조성물을 개체(subject)에게 투여하는 단계를 포함하는 위암 개선 또는 치료 방법.