KR20120049364A

KR20120049364A - 와우각 흥분독성에 의해 유발된 이명의 치료를 위한 ｎｍｄａ 수용체 길항제의 용도

Info

Publication number: KR20120049364A
Application number: KR1020127007363A
Authority: KR
Inventors: 마띠외 귀통; 쟝-뤼끄 푸엘; 레미 퓌졸
Original assignee: 앵스티띠 나셔날 드 라 쌍뜨 에 드 라 르셰르슈 메디깔; 아우리스 메디칼 아게
Priority date: 2004-03-29
Filing date: 2005-03-29
Publication date: 2012-05-16
Also published as: CN1972677B; CN104906079B; EP1729753B1; DK1729753T3; PT1729753E; NZ549399A; PL1729753T3; RU2006138153A; ZA200607161B; CN1972677A; WO2005094799A3; WO2005094799A2; JP2011105740A; CN104906079A; KR101429735B1; RU2380094C2; CA2558896A1; EP1729753A2; BRPI0508251A; EP2077108A1

Abstract

본 발명은 와우각 흥분독성 (cochlear excitotoxicity)에 의해 유발된 이명을 치료하기 위해 약학적 화합물을 내이에 전달하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 음향 외상, 노인성 난청, 허혈, 무산소증, 1종 이상의 내이독성 약제를 이용한 치료, 또는 돌발성 난청과 같은 사건에 의해 유발된 와우각 흥분독성의 급성, 반복성 또는 장기간 또는 만성적인 발발에 뒤이은 청각 신경의 NMDA 수용체 매개형 이상 활성을 억제하기 위해 내이(內耳)에 N-메틸-D-아스파테이트 (NMDA: N-Methyl-D-Aspartate) 수용체 길항제를 국소 투여함으로써, 이러한 사건의 경우 이명을 차단하는 것에 관한 것이다.

Description

와우각 흥분독성에 의해 유발된 이명의 치료를 위한 ＮＭＤＡ 수용체 길항제의 용도 {USE OF AN NMDA RECEPTOR ANTAGONIST FOR THE TREATMENT OF TINNITUS INDUCED BY COCHLEAR EXCITOTOXICITY}

[0001]본 발명은 와우각 흥분독성 (cochlear excitotoxicity)에 의해 유발된 이명을 치료하기 위해 약학적 화합물을 내이에 전달하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 음향 외상, 노인성 난청, 허혈, 무산소증, 1종 이상의 내이독성 약제를 이용한 치료, 또는 돌발성 난청과 같은 사건에 의해 유발된 와우각 흥분독성의 급성, 반복성 또는 장기간 또는 만성적인 발발에 뒤이은 청신경의 NMDA 수용체 매개형 이상 활성을 억제하기 위해 내이 (內耳)에 N-메틸-D-아스파테이트 (NMDA: N-Methyl-D-Aspartate) 수용체 길항제를 국소 투여함으로써, 이러한 사건의 경우 이명을 차단하는 것에 관한 것이다.

[0002] 외부의 음향 자극 없이 소리를 지각하는 현상인 이명 (耳鳴)은 매우 흔한 내이 (內耳) 질환이다. 미국 인구의 약 3 퍼센트에 달하는 약 860만명이 만성적인 이명에 시달리는 것으로 집계되고 있다 (Centers for Disease Control and Prevention, Vital and Health Statistics, Series 10, #200, Oct 1999). American Speech-Language-Hearing Association (ASHA)에 따르면, 100만명 이상이 이명으로 인해 정상적인 생활을 영위하지 못하는 것으로 밝혀졌다 (인구의 0.3%). 유럽인을 대상으로 한 연구에 따르면 인구 집단의 7% 내지 14%가 자신들의 주치의에게 이명에 관해 상담하였고, 인구의 약 1% 내지 2.4%에서 잠재적으로 불구가 되는 이명이 발생하는 것으로 조사되었다 (Vesterarger V., British Medical Journal 314 (7082): 728-731 (1997)).

[0003] 이명의 급속한 확산 및 사람들의 건강과 생활 품질에 미치는 심각한 영향에도 불구하고, 이명에 대한 효과적인 치료 방법은 없다. 현재의 치료 접근법에는 내이독성 약제의 사용 자제, 알코올, 카페인 및 니코틴 소비 감소, 스트레스 감소, 배경 소음 또는 착용가능한 이명 차단기의 사용 (때로 청각 보조구와 병용하기도 함), 최면과 같은 거동 요법, 인지요법 및 바이오피드백, 이명 재교육 요법 (TRT:tinnitus retraining therapy), 약학적 및 기타 보완 요법의 사용이 포함된다.

[0004] 이명은 질병은 아니며, 그보다는, 마치 통증이 다른 많은 병증을 수반하는 것과 마찬가지로, 여러가지 청각 장애에 공통적인 증상이라고 할 수 있다. 이 증상은 가장 흔하게는 소음 유도형 청력 소실, 노인성 난청 및 메니에르씨 질환과 관련이 있다 (Nicolas-Puel 외, International Tinnitus Journal 8 (1): 37-44 (2002)). 이보다 덜 흔한 요인으로는 내이독성 약물 (아미노글리코사이드 항생제, 고용량의 루프 이뇨제, 비스테로이드계 항염제 및 특정 화학치료제)에 대한 노출, 혈류 감소 (허혈), 자가면역 프로세스, 감염성 질환, 전음성 난청, 귀경화증, 두부 외상 등을 들 수 있다. 이명이 공지 유래의 청력 소실과 관련이 있는 경우는 90%가 넘으며, 70% 이상은 내이에 기원한다 (Nicolas-Puel 외, International Tinnitus Journal 8 (1): 37-44 (2002)).

[0005] 지난 수십년간, 내이의 병생리학 연구에 있어서 주요 성과들로 인해, 내유모 (內有毛) 세포 (細胞) 시냅스 복합체가 이명의 가장 흔한 격발 원인인 와우각 흥분독성에 의해 유발되는 이명의 발생에 핵심적인 역할을 한다는 것이 밝혀졌다. Olney 외, J. Neuropathol . Exp . Neurol . 31(3): 464-488 (1972)에 의해 최초로 설명된 흥분독성은 일반적으로 청각계통 뿐만 아니라 중추 신경계에 있어서도 가장 중요한 신경전달물질인 글루타메이트의 과도한 시냅스 방출로 특징지어진다. 이것은 시냅스후 글루타메이트 수용체 (이오노트로픽 및 메타보트로픽)를 활성화시키는데, 이것은 탈극 및 신경 흥분을 일으킨다. 그러나, 흥분독성의 경우와 같이, 글루타메이트의 과도한 방출로 인해 수용체가 과도하게 활성화되면, 표적 뉴런이 손상을 입게 되어 결국 죽고 만다 (Puel J. L, Prog Neurobiol . 47(6): 449-76 (1995)).

*[0006] 와우각 흥분독성은 급성 또는 반복적인 음향 외상과 같은 과도한 소음에 대한 노출 (소음 유도형 청력 소실 또는 노인성 난청으로 이어짐), 돌발성 난청 또는 무산소증/허혈에 의해 일어나거나 (Pujol and Puel, Ann . NY Acad . Sci . 884: 249-254 (1999)) 또는 1종 이상의 특정 내이독성 약제를 이용한 치료에 의해 일어난다. 글루타메이트의 과량 방출은 음향 외상의 경우에는 와우각 기관으로 유입되는 소리 압력이 과도하거나, 무산소증/허혈성 돌발 난청의 경우 글루타메이트 조절 시스템에 대한 혈액 유입량 감소로 인해 유도된다. 모든 경우, 흥분독성은 다음의 2 단계 메카니즘에 의해 특징지어진다: 첫째, 이오노트로픽 글루타메이트 수용체에 의해 매개되는 I형 수입형 수상돌기의 급성 팽창이 있고, 이는 시냅스후 구조의 파괴 및 기능 상실로 이어진다. 5일 이내에, 와우각 전위차의 전체적인 또는 부분적인 복구와 함께 시냅스 복구 (새로운 시냅스 형성)가 관찰된다 (Puel 외, Acta Otolaryngol . 117 (2): 214-218 (1997)). 심한 외상 및/또는 반복적인 상해 후 전개될 수 있는 흥분독성의 두번째 페이즈에서는, Ca² ⁺의 유입에 의해 격발된 연쇄적인 대사 사건이 나선형 신경절 뉴런의 뉴런 사멸로 이어진다.

[0007] 와우각 흥분독성은 시냅스후 구조의 파열 과정 동안 이명을 유도할 수 있으며, 만일 이 파열이 종결되지 않으면, 내유모 세포 (inner hair cell) 시냅스 복합체에서 새로운 시냅스가 형성된다 (Puel 외, Audiol . Neurootol . 7 (1): 49-54 (2002)). 흥분독성 후 기능 회복에서 NMDA 수용체가 핵심적인 역할을 하는데 이 수용체는 생리적 조건 하에서는 청신경 섬유의 활성에 관여하지 않지만 (Puel 외, Audiol . Neurootol . 7 (1): 49-54 (2002)), 그들의 높은 칼슘 (Ca² ⁺) 투과성으로 인해 (Sattler and Tymianski, Mol . Neurobiol . 24 (1-3): 107-129 (2001)), 새로운 시냅스 형성 과정시 상향-조절된다 (Puel 외, C. R. Acad . Sci . III . 318 (1): 67-75 (1995)). 와우각 시냅스 복구 메카니즘의 동물 모델에서 관찰할 수 있는 바와 같이, NMDA 수용체 길항제 D-AP5의 국소 투여에 의해 NMDA 수용체를 차단하면 기능 회복과 청각 수상 돌기의 재성장이 지연되었다 (Gervais D'Aldin 외, Int. J. Dev . Neurosci . 15 (4-5): 619-629 (1997)). 따라서 글루타메이트는 신속한 흥분 신경전달물질로서의 역할 뿐만 아니라, NMDA 수용체의 활성화를 통한 향신경 (neurotrophic) 역할도 하는 것으로 결론지을 수 있다.

[0008] 와우각 흥분독성에 의해 유도된 NMDA 수용체의 mRNA의 상향 조절은 이명으로서 지각될 수 있는 청신경 섬유의 비정상적인 자발적 "발화 (firing)"에 책임이 있는 것으로 추정되어 왔다 (Puel J.-L. 외, Audiol . Neurootol . 7 (1): 49-54 (2002)). 새로운 시냅스 형성 과정이 진행되는 동안 구심성(afferent) 수상돌기는 임계 상태에 있고, 따라서 NMDA 수용체의 활성화에 의한 흥분에 특히 민감할 수 있다. 이러한 비정상적인 흥분, 따라서, 불완전한 새로운 시냅스 생성으로 인해 무한히 계속될 수 있는 이명을 피하기 위해서는, NMDA 수용체를 특이적으로 길항하는 치료적 전략이 추구된다. 앞서 입증된 바와 같이, 와우각에 대한 NMDA 수용체 길항제를 국소 투여하면 음향 외상 또는 허혈에 의해 유도된 흥분독성이 예방된다 (Duan 외, Proc . Natl . Acad . Sci . USA 97 (13): 7597-7602 (2000); Puel , Prog. Neurobiol . 47 (6): 449-476 (1995); Puel 외, J. Comp . Neurol . 341 (2): 241-256 (1994)). 비록 2-아미노-3-(3-히드록시-5-메틸이속사졸-4-릴)프로피오네이트 (AMPA) 또는 카이네이트 (kainate) 수용체 길항제를 적용하여 흥분독성을 차단할 수도 있지만, 이들을 통해 초기의 구심성 수상돌기의 급성 팽창이 일어나기 때문에(Puel 외, J. Comp . Neurol . 341 (2): 241-256 (1994)), 이러한 접근은 청각 기능에 잠재적으로 심각한 부정적인 영향을 미칠 수 있다. 내유모 세포와 청신경 섬유 사이의 신속한 흥분성 신경전달은 주로 바람직한 AMPA 수용체에 의해 매개되기 때문에 (Ruel 외, J. Physiol . London 518: 667-680 (1999)), 이들의 차단은 청신경의 바람직하지 못한 과도한 자극뿐만 아니라, 소망되는 정규적인 흥분도 억압함으로 해서 청력 소실을 일으킨다.

[0009] 이명 발생에 있어서 NMDA 수용체가 미치는 것으로 추정되는 영향은 이제까지 살리실레이트-유발형 이명의 거동 모델에 대해서만 생체내 (in vivo) 테스트되어 입증되어 왔다 (Guitton 외, J. of Neuroscience 23 (9): 3944-3952 (2003)). 이명이 직접적으로 관찰될 수 없음에 따라, 이명을 측정하기 위해 개발되어야만 했던 이 거동 모델은 능동적 회피 패러다임 (active avoidance paradigm)에 기초한 것이었다: 동물들로 하여금 특정 소리가 들릴 때마다 막대 위로 점프하도록 조건화시켰다. 살리실레이트를 투여하면 심지어 외부 소리가 없어도 점프 횟수가 유의적으로 증가했는데 (거짓 양성), 이는 이명을 지각했음을 가리키는 것이다. 정원창 막 (round window membrane)을 통해 NMDA 길항제인 MK-801, 7-CK 및 가시클리딘을 동물의 와우각 부위에 전달하자 거짓 양성 횟수가 현저히 감소하였는데, 이는 이명이 억제되었음을 가리키는 것이다.

[0010] 이러한 결과는 이명의 발병에 있어서 NMDA 수용체의 가설로 세워진 영향을 처음으로 확인해 주는 것이지만, 살리실레이트에 의해 유발된 이명은 매우 희귀한 유형의 이명이므로, 모든 종류의 이러한 내이성 질환에 대해 명백하게 일반화될 수는 없는 것이다. 아스피린의 활성 성분인 살리실레이트는 과량 복용할 경우, 이명을 유발할 수 있다는 것이 100여년 전부터 알려져 왔다 (Cazals Y., Prog . Neurobiol. 62: 583-631 (2000)). 이것은 와우각 흥분독성의 경우 또는 기원을 달리하는 다른 경우에서와 같이 이명과 유사한 감각을 불러 일으킬 수 있지만, 대개는 가역적이며 특이한 분자 메카니즘에 기초한다. 잘 알려진 사이클로옥시게나제 저해제인 메페나메이트를 살리실레이트 대신 투여해도 거짓 양성 반응 횟수가 증가되었는데, 이는, 살리실레이트-유발형 이명이 사이클로옥시게나제 경로의 억제와 관련이 있음을 시사하는 것이다. 와우각 흥분독성에 의해 유발되는 이명은 연쇄적인 글루타메이트 매개형 과정의 결과로 NMDP 수용체의 mRNA의 하향 조절을 유발하지만, 살리실레이트-유발형 이명은 아라키돈산 대사의 변화에 의해 매개된다 (예컨대, Cazals Y., Prog . Neurobiol . 62: 583-631 (2000) 참조). 살리실레이트는 사이클로옥시게나제 활성을 억제하는 것으로 알려져 있다 (예컨대, Vane and Botting, Am. J. Med . 104: 2S-8S (1998)). 아라키돈산이 NMDA 수용체 흐름을 증강시킨다는 증거가 있다 (Miller 외, Nature 355: 722-725 (1992); Horimoto 외, NeuroReport 7: 2463-2467 (1996); Casado and Ascher, J. Physiol . 513: 317-330 (1998)). 전기생리학 연구에 따르면 아라키돈산은 소뇌 과립 세포, 해리된 피라미드 세포, 피질 뉴런, 및 성인의 해마 슬라이스를 비롯한 다양한 시스템에서 NMDA 수용체의 채널 개방 가능성을 증가시키는 것으로 입증되었다 (예컨대, Miller 외, Nature 355: 722-725 (1992); Horimoto 외, NeuroReport 7: 2463-2467 (1996); Yamakura and Shimoji, Prog . Neurobiol . 59: 279-298 (1999)). 따라서, 흥분독성에 의해 유발된 이명과는 달리, 내유모 세포 시냅스 복합체에는 아무런 형태학적 손상이 없으며, 특히, 살리실레이트-유발형 이명에서 나타나는 시냅스 말단의 손상도 관찰되지 않는다.

[0011] Sands의 미국특허 제5,716,961호에는 이명 치료를 위해 NMDA 수용체에 특이적인 길항제를 투여하는 것이 개시되어 있다. 그의 신경보호 특성 (neuroprotective properties)은 글루타메이트 흥분독성의 경우 세포 배양체에서 입증된다. 그러나, 생체내 병생리학적 환경 하에서의 이 화합물의 약리학적 작용과 효능은 밝혀지지 않았으므로, 와우각 흥분독성에 의해 유발되는 이명과는 아무 관계가 없다. 이것은 내유모 세포 시냅스 복합체의 복잡성을 고려할 때 심각한 결격사유라 하지 않을 수 없다. 또한, Sands는 NMDA 수용체 길항제의 경구 투여를 교시하면서, 환자가 약을 삼키지 못하거나 다른 이유로 경구 투여 경로가 손상될 경우에 한해서 국소 투여에 관해 논의하고 있다. 국소 투여는 "용액, 로션, 연고, 고약 등"의 형태로 비특이적으로 개시되어 있다.

[0012] 내이 질환을 치료하기 위해 NMDA 수용체 길항제를 전신 투여하는 것은 대개 효과가 없는데, 이는, 뇌와 마찬가지로 와우각 기관은 생물학적 장벽에 의해 보호되기 때문이다. 따라서, 소망하는 치료 효과를 거두기 위해서는 비교적 다량의 투여량이 요구되지만, 학습능력 저하, 기억력 또는 운동능력 감퇴 등과 같은 NMDA 수용체 길항제의 여러가지 잠재적인 부작용들로 인해 최대 관용 투여량은 크게 제약을 받는다. NMDA 수용체 길항제에 의한 CNS 질환의 치료를 위한 여러가지 사람 모델에서 나타난 바와 같이, 잠재적인 나쁜 CNS 효과, 긴장, 혈압 상승, 무감각증으로 인해, 임상 투여량을 제한하여야만 했기 때문에, 전신 투여 후 혈장 농도는 동물 모델에서 최대 신경 보호에 필요한 것보다 일관되게 낮았다 (Kemp and McKernan, Nature Neuroscience 5, supplement: 1039-1042 (2002)). 다른 한편, NMDA-AMPA 수용체 길항제 카로베린을 내이에 국소 투여하자 높은 와우각 내부 농도가 초래된 반면, 전신 투여에서 관찰되는 것과 같은 혈장 및 뇌척수액에서의 높은 2차 농도는 회피된 것으로 나타났다 (Chen 외, Audiol . Neurootol . 8: 49-56 (2003)).

[0013] Zenner 등의 미국특허 제 6,066,652호는 공지의 NMDA 수용체 길항제인 아다만탄을 투여함으로써 이명을 치료하는 방법을 개시하고 있다. 이 특허의 발명자들은 전신 투여에 따른 임상 연구 결과를 개시하고 있는데, 이에 따르면 치료가 진행되는 동안 이명이 감소된 것으로 나타나 있다. 얻어진 결과를 설명하기 위해 동원된 가설들은 외유모 세포 (outer hair cells)와 프리시냅스에 집중되어 있을 뿐, 특별히 NMDA 수용체의 역할을 다루고 있지는 않다.

[0014] NMDA 수용체가 와우각 흥분독성에 의해 유발되는 이명의 발생에 중요한 역할을 한다는 것을 뒷받침해주는 몇가지 개시가 있지만, 전술한 논의들은 분자 메카니즘이 여전히 불분명하기 때문에, NMDA 수용체 길항제를 사용할 경우 이명의 이러한 특정 유형을 효과적으로 차단할 수 있는지를 신뢰할 수 있을 정도로 예측하는 것은 불가능하다. 또한, 그 가설을 검증하여 특이적이고도 진정한 효과가 있는 치료적 전략을 세우기 위해서는 이명의 발생에 대한 병생리학적 연구 역시 필요하다.

발명의 요약

[0015] 본 발명은 사람에 있어서 와우각 흥분독성에 의해 유발되는 이명을 예방 및/또는 치료하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 방법은 NMDA 수용체 길항제를 함유하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 사람에게 투여하는 것을 포함한다. 이명을 치료하는 방법에 있어서, 투여되는 NMDA 수용체 길항제는, 사람에 있어서, NMDA 수용체가 매개하는 비정상적인 청신경 활성을 억제 또는 감소시키는데 유용한 것이다. 예방 및/또는 치료하고자 하는 이명은 음향 외상, 노인성 난청, 허혈, 무산소증, 1종 이상의 귀독성 약제를 이용한 치료, 돌발성 난청, 또는 기타 와우각 흥분독성에 유발되는 사건에 의해 일어날 수 있는 것들이다.

개요

[0020] 본 발명은 와우각 흥분독성에 의해 유도된 이명의 동물 모델을 대상으로 한 실험적인 발견에 기초한다. 본 발명은 NMDA 수용체 길항제로서 특이적으로 작용하는 약학적 화합물들의 용도에 관한 것이다. 특정 이론에 구애됨이 없이, 본 발명의 NMDA 수용체 길항제는 그의 다양한 결합 부위들 중 하나에서 NMDA 수용체와 결합함으로써, 수용체의 이온 채널의 오프닝을 (부분적으로 또는 전적으로) 차단하는 것으로 믿어진다. NMDA 수용체가 활성화되는 방식은 복잡한데, 즉, 이온 채널을 열어서 칼슘이 유입되도록 하기 위해서는 글루타메이트와 글라이신 결합의 두가지가 모두 필요하다 (Kemp and McKernan, Nature Neuroscience 5, supplement: 1039-1042 (2002)). 글루타메이트는 활성 의존 방식으로 프리시냅스 말단으로부터 방출되기 때문에 신경전달물질 역할을 하는 반면, 보다 일정한 농도로 세포외액 중에 존재하는 글라이신은 조절자로서 작용한다. NMDA 수용체에 대한 이온 채널 인테그랄은 마그네슘에 의해 전압-의존적으로 차단되며, 이러한 차단은 분극에 의해 제거된다. 세개의 길항제 자리 중 어느 하나에 NMDA 수용체 길항제가 결합할 경우 NMDA 수용체가 부분적으로 또는 전적으로 차단되는 결과가 초래되기 때문에, 이온 채널의 개방 및 뉴런의 분극을 차단하거나 감소시킨다. 따라서 NMDA 수용체 길항제는 와우각 흥분독성에 수반될 수 있는 상향 조절된 NMDA 수용체를 통해 청신경의 비정상적인 흥분을 억압하며 따라서 이명의 지각을 감소 또는 제거시켜준다. NMDA 수용체 길항제의 전달에 이어, NMDA 수용체는 더 이상 상향 조절되지 않는다. 청신경의 NMDA 수용체 매개형 비정상적인 활성을 억제하기 위해, 병생리학적 조건 하에서는 상향 조절되기만 하는 특이적인 NMDA 수용체를 표적으로 함으로써, 청각에 미치는 바람직하지 못한 부작용을 회피하는 것이 가능한데, 이는 정상적인 청각 신경전달물질은 주로 AMPA 수용체에 의해 주로 매개되기 때문이다.

[0021] 한가지 구체예에서, 본 발명은 사람에 있어서 와우각 흥분독성에 의해 유도되는 이명을 치료하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 사람에게 NMDA 수용체 길항제를 함유하는 약학적 조성물을 치료적 유효량으로 투여하는 것을 포함하여 이루어진다. NMDA 수용체 길항제는 이러한 치료를 필요로 하는 사람의 청신경의 NMDA 수용체-매개형 이상(異常) 활성을 억제 또는 감소시키는데 유효한 양 및 기간으로 투여된다. 청신경의 NMDA 수용체-매개형 이상 활성의 억제 또는 감소는 치료된 개체에 있어서 이명을 억제시키거나 감소시킨다. 이러한 방법의 바람직한 구체예에서는, NMDA 수용체 길항제를 와우각 흥분독성을 유발하는 사건에 사람이 노출된 후 또는 노출되는 동안 투여한다.

[0022] 또 다른 구체예에서, 이러한 방법은 사람에 있어서 와우각 흥분독성에 의해 유도된 이명을 예방하는 방법에 관한 것이다. 이 방법은 사람에게 NMDA 수용체 길항제를 함유하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을 투여하는 것을 포함하여 이루어진다. 이 방법에서 NMDA 수용체 길항제는 이러한 치료를 필요로 하는 대상자에 있어서 청신경의 NMDA 수용체-매개형 이상 활성을 예방하는데 효과적인 시간동안 효과적인 양으로 투여된다. 청신경의 NMDA 수용체-매개형 이상 활성을 예방하면 치료된 개체예 있어서 이명이 방지된다. 이 방법의 바람직한 한가지 구체예에서는 NMDA 수용체 길항제를 와우각 흥분독성을 유발하는 사건에 사람이 노출되기 전 또는 노출되는 동안 투여한다. 본 발명의 한가지 목적은 와우각 흥분독성에 의해 유도된 이명을 예방 및/또는 치료하는 것이다. 와우각 흥분독성에 의해 유도된 이명이 어떠한 특정 종류의 사건에 의해 유발될 필요는 없고, 단지 그 사건이 와우각 흥분독성을 유발하여 이명을 유도하는 것이면 된다. 이 사건의 특성이 이명을 예방 및/또는 치료하는데 알려져야 할 필요는 없다. 예방 및/또는 치료되는 이명은 급성, 아급성 또는 만성일 수 있다.

[0023] 기술 분야에서는 이명이 음향 외상, 노인성 난청, 허혈, 무산소증, 1종 이상의 특정 내이독성 약제를 이용한 치료, 및/또는 돌발성 난청에 수반되는 와우각 흥분독성으로부터 결과된다는 것이 알려져있다. 음향 외상에 의해 유발되는 이명을 예방하는 것이 본 발명에 예시되어 있다. 당업자라면 본 발명에 제공된 방법은 음향 외상에 의해 유발된 이명 뿐만 아니라, 노인성 난청, 허혈, 무산소증, 1종 이상의 특정 내이독성 약제를 이용한 치료 및/또는 돌발성 난청에 의한 이명을 예방 및/또는 치료하는데도 효과가 있을 것임을 고도의 확신을 가지고 예상할 수 있을 것이다. 이는, 이러한 모든 사건으로부터 야기되는 이명은 공통의 메카니즘적인 원인을 공유하기 때문이다. 음향 외상, 노인성 난청, 허혈, 무산소증, 1종 이상의 특정 내이독성 약제를 이용한 치료 및/또는 돌발성 난청은 급성이며, 반복적이거나 또는 장기간의 증상을 갖는 것으로 특징지어질 수 있다. 당업자라면 이명이 와우각 흥분독성에 의해 유발된 것인 한, 음향 외상, 노인성 난청, 허혈, 무산소증, 1종 이상의 특정 내이독성 약제를 이용한 치료 및/또는 돌발성 난청 이외의 다른 원인에 의해 유발된 이명을 예방 및/또는 치료하는데도 본 발명의 방법이 효과적이리라는 것을 예상할 수 있을 것이다. 이러한 원인에 기인하는 와우각 흥분독성은 와우각 흥분독성을 유발하는 원인의 지속 기간에 따라서 급성, 반복성 또는 만성적인 것일 수 있다.

[0024] 본 발명의 문맥상 "내이독성 약제 (ototoxic medication)"이라는 용어는 치료 목적으로 투여시 와우각 흥분독성을 통해 이명을 유발할 수 있는 약물이면 모두 포괄하는 것으로 의도된다. 와우각 흥분독성은 청력 또는 청력 지각과는 무관할 수 있는 증상을 치료하기 위한 치료적 화합물로서 일반적으로 투여되는 내이독성 약제를 투여할 경우 부작용으로서 일어난다. 이러한 특징을 갖는 내이독성 약제의 예로는 아미노글리코시드 항생제 및 시스플라틴과 같은 화학치료제를 들 수 있다. 이러한 내이독성 약제의 사용과 와우각 흥분독성 및 이명 발생의 관계는 기술 분야에 잘 알려져 있으나, 본 발명 전에는, 효과적인 치료 방법이 없었다. 이러한 많은 약제들은 그의 내이독성 효과로 인해 현재 사용이 제한되고 있으며 그렇기 때문에 이러한 효과를 감소시키는 방법이 있다면 이들 약제들을 치료제로서 더욱 널리 사용할 수 있을 것이다.

화합물

[0025] 본 발명의 방법과 관련되어 투여되는 약학적 화합물의 포뮬레이션은 이온 채널 중의 경쟁적인 NMDA 길항제 결합 자리, 비경쟁적인 NMDA 길항제 결합 자리 또는 글라이신 자리 중 어느 하나에서 NMDA 수용체와 결합하는 선택적인 NMDA 수용체 길항제를 함유한다. 예시적인 화합물로는 이펜프로딜, 케타민, 메만틴, 디조실핀 (MK-801), 가시클리딘, 트락소프로딜 (비경쟁적인 NMDA 길항제), D-2-아미노-5-포스포노펜탄산 (D-AP5), 3-((±)2-카르복시피페라진-4-일)-프로필-1-포스폰산 (CPP), 코난토킨 (경쟁적 NMDA 길항제), 7-클로로키누레네이트 (7-CK), 및 리코스티넬 (글라이신 자리 길항제)를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에서 사용되는 NMDA 길항제는 NMDA 길항제 기능을 유지하는 한, NMDA 길항제의 어떠한 유도제, 유사체, 및/또는 에난티오머 형태여도 무방하다. 본 발명의 방법에 따라 투여되는 조성물은 1종 이상의 NMDA 수용체 길항제를 함유할 수 있다.

[0026] 아릴시클로알킬아민은 NMDA 길항제로서 본 발명과 연계적으로 사용되는 것이 바람직하다. 그 중에서도 다음 화학식 1을 갖는 (NMDA 길항제 기능을 보유하는) 아릴시클로알킬아민 화합물 클래스가 바람직하다:

식 중, R1, R2, R3, R4 및 R5는 독립적으로 H, Cl, F, I, CH₃, CH₂CH₃, NH₂, OH 또는 COOH이고 여기서 R6 및 R7은 독립적으로 H, CH₃, CH₂CH₃, OH, Cl, F, 또는 I가 바람직하다.

[0027] 바람직한 아릴시클로알킬아민은 케타민 (C₁₃H₁₆ClNO (유리 염기), 2-(2-클로로페닐)-2-(메틸아미노)-시클로헥산온)으로, 그 구조식은 다음 화학식 2로 표시된다:

각각 화학식 2 또는 I로 정의되는 케타민 또는 아릴시클로알킬아민 화합물의 여하한 유도체, 유사체 및/또는 에난티오머 형태들 모두가 NMDA 길항제로서 이용될 수 있다.

케타민은 이온 채널 내에 위치하는 NMDA-수용체 복합체의 별도 자리인 PCP-결합 자리에 결합하는 비경쟁적인 NMDA-수용체 길항제이기 때문에, 막투과성 이온 플럭스를 차단한다. 케타민은 미국특허 제3,254,124호에 개시된 방법에 의해 제공될 수 있다. 더욱 구체적으로는, 바람직한 화합물은 (S)-케타민인데, 이는, (R)-케타민에 비해 3~4배 더 높은 친화도로 NMDA 수용체의 PCP 결합 자리에 결합하기 때문이다 (Vollenweider 외, Eur . Neuropsychopharmacol . 7: 25-38 (1997)). 광학 이성체의 합성은 DE 2062620 또는 WO01/98265에 설명된 바와 같이 실시할 수 있으며, 이들 문헌 모두 본 발명에 참조로 통합되었다. 본 발명의 바람직한 구체예에서는, 케타민은 그의 유리 염기 형태인 염산염 (C₁₃H₁₇Cl₂NO) (케타민 염산염) 형태로서 투여되기도 한다.

본 발명의 다른 바람직한 화합물들은 NMDA 길항제 기능을 유지하는 치환된 치나졸린 클래스에 속한다. 본 발명과 관련할 때, 다음 화학식 3을 갖는 치나졸린 화합물이 NMDA 길항제로서 바람직하다:

식 중, R1', R2', R3', 및 R4'는 독립적으로 H, Cl, F, I, CH₃, CH₂CH₃, NH₂, OH 또는 COOH이고 여기서 R5' 및 R6'는 독립적으로 COOH, OH, CONH₂, H, CH₃, CH₂CH₃, OH, Cl, F, 또는 I이다.

치나졸린 클래스에서, 7-클로로키누레네이트 (7-CK)가 특히 바람직하다. 7-CK는 다음 화학식 4로 표시된다:

화학식 4에 따른 7-CK 또는 화학식 3에 의해 정의되는 기타 다른 화합물들의 여하한 유도체, 에난시오머 또는 유사체들 역시 본 발명의 방법에서 사용될 수 있다.

투여 및 포뮬레이션

[0028] 환자에게 화합물을 전달하는 것은 경구, 정맥내, 피하, 복강내, 근육내, 직장, 또는 국소적으로 수행할 수 있는데, 전신 투여 치료 유효량은 바람직하지 못한 부작용을 유발할 수 있기 때문에, 내이에 국소 투여하는 것이 일반적으로 바람직하다. 당업자라면 본 발명에서 NMDA 길항제는 기타 다양한 다른 경로로 투여하여도 무방함을 이해할 것이다. 본 발명에 있어서 유일한 투여시 요구 사항은 NMDA 길항제를 함유하는 약학적 조성물의 치료적 유효량이 대상 질환자의 청신경의 NMDA 수용체 매개형 이상 활성 자리까지 도달할 수 있어야 한다는 것이다.

[0029] 여러가지 전달 기술에 의해 화합물을 내이에 투여할 수 있다. 여기에는 약물이 내이 속으로 확산해 들어가거나 또는 활성적으로 주입되는 정원창 막 또는 난원창 막에 화합물을 표적 방식으로 전달 및/또는 운반하는 디바이스 또는 약물 담체를 사용하는 것이 포함된다. 오토윅 (otowicks: 예컨대, Silverstein의 미국특허 제6,120,484호 참조), 정원창 카테테르 (예컨대, Arenberg의 미국특허 제5,421,818호; 5,474,529호; 5,476,446호; 6,045,528호: 또는 Lenarz의 미국특허 제6,377,849호 및 그의 분할출원인 2002/0082554호 참조), 또는 다양한 종류의 젤, 발포체, 피브린 또는 기타 약물 담체를 들 수 있는데, 이들은 정원창 소와 또는 난원창에 넣을 수 있으며 지속적인 방출을 위해 화합물을 로딩할 수 있다. (예컨대, Manning의 WO 97/38698; Silverstein 외, Otolaryngology - Head and Neck Surgery 120 (5): 649-655 (1999); Balough 외, Otolaryngology - Head and Neck Surgery 119 (5): 427-431 (1998) 참조). 이러한 방법들은 와우각관 또는 와우각의 다른 부분 내로 삽입되는 디바이스를 사용하는 것을 추가로 포함한다 (예컨대, Kuzma의 미국특허 제 6,309,410호 참조). 이 화합물은 고실경유 주사에 의해 내이에 투여될 수도 있는데, 이 경로에서는 중이 또는 그의 일부를 화합물 액체 또는 다른 담체로 충전시킨다 (예컨대, Hoffer 외, Otolaryngologic Clinics of North America 36 (2): 353-358 (2003) 참조). 내이로의 바람직한 투여 방법은 정원창 막을 통해 확산시키는 것인데, 이 방법에 의해, 중이 공간으로부터 비교적 쉽게 접근할 수 있고 내이를 온전히 유지시킬 수 있기 때문에, 와우각 내액 (intracochlear fluids)이 누출되는 것으로 인한 여하한 문제점을 피할 수 있다.

[0030] 본 발명의 약학적 조성물에 함유되는 화합물은 약학적으로 허용가능한 염 형태로 제공될 수 있다. 이러한 염의 예로는 유기산 (예컨대, 아세트산, 젖산, 시트르산, 말산, 푸마르산, 타르타르산, 스테아르산, 아스코르브산, 숙신산, 벤조산, 메탄설폰산, 톨루엔설폰산, 또는 팜산), 무기산 (예컨대, 염산, 질산, 이인산, 황산 또는 인산), 및 폴리머산 (예컨대, 탄닌산, 카르복시메틸 셀룰로스, 폴리락트산, 폴리글리콜산, 또는 폴리락트산-글리콜산의 코폴리머)를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

[0031] 본 발명의 투여 경로에 따른 약학적 조성물은 활성 성분의 치료적 유효량과, 필요에 따라, 무기, 또는 유기의 약학적으로 허용되는 고상 또는 액상 담체를 함유할 수 있다. 내이에 국소 투여하기에 적합한 약학적 조성물은 수용액 또는 현탁액일 수 있으며, 이것은 활성 성분 단독 또는 활성 성분을 담체와 함께 함유하는 동결건조된 포뮬레이션의 경우, 사용 전에 조제할 수 있다. 이들은 또한 생분해 가능하거나 생분해 가능하지 못한, 수성 또는 비수성의 마이크로스피어 기제일 수 있는 젤을 더 포함한다. 이러한 젤의 예로는 폴록사머, 히알루로네이트, 자일로글루칸, 키토산, 폴리에스테르, 폴리(락티드), 폴리(글리콜리드) 또는 이들의 코폴리머 PLGA, 수크로스 아세테이트 이소부티레이트 및 글리세롤 모노올리에이트를 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다. 장용 (腸溶) 또는 비경구 투여에 적합한 약학적 조성물에는 전술한 바와 같이 정제 또는 젤라틴 캡슐 또는 수용액 또는 현탁액이 포함된다.

[0032] 본 발명의 약학적 조성물은 멸균처리될 수 있으며/ 또는 예컨대 방부제, 안정화제, 보습제 및/또는 유화제, 삼투압 조절을 위한 염류 및/또는 완충제와 같은 어쥬번트를 함유할 수도 있다. 본 발명의 약학적 조성물은 소망되는 경우, 또 다른 약학적으로 활성적인 물질을 함유해도 좋다. 이들은 통상적인 혼합, 과립화, 컨펙셔닝, 용해 또는 동결건조법과 같이 제약 기술 분야에 잘 알려진 방법에 의해 제조될 수 있으며, 활성 성분을 약 0.01 내지 100%, 바람직하게는 약 0.1 내지 50% (동결건조물 100%까지)를 함유한다.

바람직한 구체예에서 본 발명에 따른 약학적 조성물은 국소 투여용으로 조성된다. 귀에 투여하는데 적합한 비히클은 약학적으로 허용가능하면서 활성 화합물과는 반응하지 않는 무기 또는 유기 물질이며, 예컨대, 식염수, 알코올, 식물성유, 벤질 알코올, 알킬렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 글리세롤 트리아세테이트, 젤라틴, 전분 또는 락토스와 같은 탄수화물, 마그네슘, 스테아레이트, 탈크 및 퍼트롤륨을 들 수 있다. 표시 제제는 멸균시킬 수 있고/또는 윤활제, 방부제, 티오메르살 (예컨대 50% 농도), 안정화제 및/또는 보습제, 유화제, 삼투압에 영향을 미치는 염류, 완충 물질, 색소, 및/또는 방향성 물질와 같은 보조제를 함유할 수 있다.

이들은 필요한 경우 1종 이상의 다른 활성 성분을 함유하기도 한다. 본 발명에 따른 귀를 위한 조성물은 항생제, 예컨대 플루오로퀴놀론, 항염제, 예컨대 스테로이드, 코르티손, 진통제, 해열제, 벤조카인, 프로카인 등과 같은 다른 생물학적 활성 제제를 비롯한 여러가지 성분들을 함유할 수 있다.

[0033] 국소 투여를 위한 본 발명의 조성물은 약학적으로 허용가능한 다른 성분들을 함유할 수 있다. 본 발명의 바람직한 구체예에서, 귀에 투여될 경우 전신 순환계나 중추 신경계로 활성 제제를 전달하는 것을 촉진하지는 않는 국소용 부형제가 선택된다. 예컨대, 일반적으로 국소용 부형제는 전신 순환계 내로의 점막을 통한 경피 전달을 촉진하는 폐색 특성은 실질적으로 없는 것이 바람직하다. 이러한 폐색성 비히클로는 탄화수소 베이스, 무수 흡수성 베이서, 예컨대 친수성 페트롤라툼 및 무수 라놀린 (예컨대, Aquaphor), 및 라놀린 및 콜드 크림과 같은 유중수형 에멀젼 베이스를 들 수 있다. 더욱 바람직한 것은 실질적으로 비폐색성인 것들로서, 일반적으로 수중유형 에멀젼 베이스 (크림 및 친수성 연고) 및 수용성 베이스, 예컨대 폴리에틸렌 글리콜-기제 비히클 및 메틸셀룰로스, 히드록시에틸 셀룰로스 및 히드록시프로필메틸셀룰로스와 같은 여러가지 제제와 함께 젤화된 수용액 (예컨대, K Y Gel)을 들 수 있다.

적절한 국소용 부형제 및 비히클은 특히 본 발명이 속한 기술 분야의 당업자가 사용하도록 통상적으로 선택되며, 특히 Remington's Pharmaceutical Sciences, Vol. 18, Mack Publishing Co., Easton, PA (1990), 특히 제87장과 같은 다양한 표준 텍스트 중 하나를 참조로 선택하는 것이 좋다. 예컨대, 본 발명에 따른 생물학적 활성 제제를 제제의 침투력을 증진시키는 침투조제와 병용할 수 있다.

[0034] 본 발명의 화합물은 흥분독성에 의해 이명이 유발되기 전, 유발되는 동안 또는 유발된 후에 투여될 수 있다. 투여량은 투여 방법, 치료 기간, 치료받고자 하는 대상자의 상태, 이명의 위중도 및 사용되는 특정 화합물의 효능, 연령, 체중, 일반적인 건강 상태, 성별, 다이어트, 투여 시간 및 투여 경로, 배설률에 따라 달라지며 약물 조합은 궁극적으로는 담당 의사가 결정한다. 치료 기간은 약 1시간 내지 수일, 수주일 또는 수개월 범위일 수 있으며, 장기간 치료로 연장될 수 있다. 전달하고자 하는 화합물의 치료적 유효량은 약 0.1 나노그램/시간 내지 약 100 마이크로그램/시간 범위일 수 있다. 본 발명의 물질은 일반적으로 귀에 투여되는 다른 화합물들과 유사한 방식으로 투여된다. 예컨대, 케타민은 이명 치료량으로 귀에 투여할 수 있으며, 바람직하게는 약 10 ㎍/30 ml 내지 약 10,000 ㎍/30 ml, 바람직하게는 약 500 ㎍/30 ml, 또는 1회 약 0.01-2㎍의 양으로 투여하는 것이 좋다. 국소 투여시 "투여량 (dosage)"이라는 용어는 1회 치료시 투여되는 약제의 양을 의미하며, 예컨대, 약 0.05-1 ㎍의 케타민을 귀에 두방울 투여하는 것이다. 본 발명에 언급된 다른 항이명 제제들 역시 약물의 효능을 감안해서 유사한 방식으로 투여할 수 있다.

[0035] 치료적 유효량은 치료되는 개체에 있어서 청신경의 NMDA 수용체-매개형 이상 활성을 억제 또는 감소하는데 효과적인 양으로서 정의된다. 치료적 유효량은 또한 이명에 걸린 개체에 있어서 이명을 억제 또는 감소시키는에 유효한 양이기도 하다. 전술한 바와 같이, 치료적 유효량은 치료를 위한 특이적인 NMDA 길항제의 선택 및 그의 투여 방법에 따라 달라질 수 있다. 예컨대, 동일한 NMDA 길항제 조성물이라도 귀의 정원창 막이나 난원창에 국소 투여될 경우보다 정맥 투여될 때 더 많은 양으로 투여할 필요가 있다. 또한, 본 발명의 NMDA 길항제는 NMDA 수용체에 NMDA 길항제가 더 낮은 친화도로 결합하는 경우보다 더 높은 친화도로 결합하므로 NMDA 길항제를 더 적은 양으로 투여해도 좋다. 그 결과, NMDA 수용체에 대해 높은 결합 친화도를 갖는 NMDA 길항제가 바람직하다. 전술한 바와 같이, (R)-케타민보다 NMDA 수용체의 PCP 결합 자리에 3-4배 더 높은 친화도로 결합하는 (S)-케타민 (Vollenweider 외, Eur . Neuropsychopharmacol . 7: 25-38 (1997))이 본 발명의 방법에 사용하기에 바람직한 화합물이다. 치료 기간은 치료가 요망되는 이명의 특정 형태, 예컨대 급성인지, 아급성인지, 또는 만성인지에 따라서도 달라진다. 참고적으로, 치료기간이 짧은 것이 바람직하며 일단 치료가 중단된 후 이명이 재발하지 않는다면 그러한 단기간 치료만으로 충분하다. 이명이 단기간 치료후 지속되는 경우에는 장기간 치료할 수도 있다.

[0036] 이명, 특히 와우각 흥분독성 (전술한 바와 같음)에 의해 유발되는 이명을 치료 또는 예방하기 위해 설명된 본 발명의 방법은 사람에 있어서 청신경의 NMDA 수용체 매개형 이상 활성을 억제 또는 감소시키는데 이롭게 유효한, NMDA 수용체 길항제를 함유하는 약학적 조성물의 치료적 유효량을, 이명, 특히 와우각 흥본독성에 의해 유발된 이명을 치료 또는 예방하기 위한 의약을 제조하는데 유사하게 이용될 수도 있다. 아릴시클로알킬아민 및 치나졸린 클래스의 화합물, 바람직하게는 화학식 1 또는 III의 화합물, 더욱 바람직하게는 케타민, 7-클로로키뉴레네이트, D-AP5, MK801 및 가시클리딘 중에서 선택된 NMDA 수용체 길항제를 사용하는 것이 특히 바람직하다. 또한, 국소 투여용으로, 특히 용액, 젤 또는 기타 조절방출형 포뮬레이션, 연고 또는 크림 또는 침입성 약물 전달 기술에 의해 국소 투여되기 위한 본 발명에 따른 약학적 조성물을 각각 정원창 막 또는 난원창 막을 통해 내이에 국소 전달하거나 또는 내이에 직접 국소 전달하는 것이 바람직하다.

[0016] 도 1은 대조군 동물에 있어서 외상 후 7일이 경과한 때 CAP 측정 결과를 나타낸 것이다. 음향 외상에 의해 유발된 청력 소실을 외상으로부터 7일이 지난 후 CAP 측정값을 기록함으로써 평가하였다. 음향 외상으로부터 제7일째 10 kHz에서 최대 13 dB±2.0의 영구적인 역치 이동이 관찰되었다.
[0017] 도 2는 대조군 동물에 있어서 음향 외상 후 거짓 양성 반응과 점수 측정값을 도시한 것이다. (A) 음향 외상으로 인해 소리 자극에 대한 올바른 거동 반응이 감소되다가, 시간이 지남에 따라 부분적으로 회복되었는데, 이는, 유발된 청력 소실을 반영한다. (B) 거짓 양성의 횟수는 음향 외상에 이어 테스트된 동물들의 경우와 실제로 달랐다. 그룹 1의 동물들은 이명을 경험하지 않았고, 그룹 2의 동물들은 일시적으로만 이명을 경험한 반면, 그룹 3의 동물들은 이명을 일시적으로도 그리고 영구적으로도 모두 경험하였다.
[0018] 도 3은 음향 외상에 의해 유발된 유모 세포 소실 응답 청력 소실이 이명 발생에 유의적인 역할을 하는 것이 아님을 보여준다. D-JNKI-1로 처리하자 외상 후 점수가 신속히 회복되는 것으로부터 알 수 있는 바와 같이, 급성 음향 외상 후 청력 손실이 방지되었으나 (A), 이명의 유병률과 유형은 미처리 동물에서와 기본적으로 동일하였으므로, 이명의 예방에 유의적인 효과는 없었다 (B).
[0019] 도 4는 NMDA 길항제 7-CK를 정원창 막에 국소 투여하자 이명이 예방되었음을 보여준다. (A) 평균 거동 점수는 제0일부터 제1일까지 감소하였으나 이후에는 회복되었다; 그러나 미처리 동물에서보다는 느리게 개선되었다. (B) NMDA 길항제 7-CK의 국소 투여는 와우각 흥분독성에 의해 유발된 지속적인 이명을 억제하였다; 일시적인 이명의 경우만이 관찰되었다.
도 5는 NMDA 길항제인 S-(+)-케타민을 정원창 막에 국소 투여하자 지속적인 이명이 예방되었음을 보여준다. (A) 평균 거동 점수는 제0일부터 제1일까지 감소하였으나 이후에는 회복되었다; 그러나 미처리 동물에서보다는 느리게 개선되었다. (B) NMDA 길항제 S-(+)-케타민의 국소 투여는 와우각 흥분독성에 의해 유발된 지속적인 이명을 억제하였다, 일시적인 이명의 경우만이 관찰되었다.
도 6은 음향 외상이 감각 외유모 세포 (OHC: outer hair cells)와 내유모 세포 (IHC: inner hair cell) 시냅스 복합체에 대해서는 실질적인 형태적 손상을 가한 반면, 살리실레이트를 투여한 경우는 그렇지 않음을 보여준다. OHC와 IHC의 입체섬모는 살리실레이트를 2일간 주사한 후 그대로 유지된 반면 (6A), 음향 외상에 노출된 동물들은 OHC 입체섬모 다발이 얽혀 심각하게 손상 되었을 뿐만 아니라, 심지어는 IHC 입체섬모 다발이 융합되기도 하였다 (흑색 화살표로 표시함) (6D). IHC 시냅스 복합체의 저배율 사진은 살리실레이트 처리의 경우 초구조적 이상성 (ultrastructural abnormalities)을 나타내지 않은 반면 (6B), 외상을 입은 동물에 있어서는 관련이 있는 주파수 범위 대역에서 IHC의 폴(pole)의 기저 부분에서 방사형 구심성 수상돌기의 대대적이고도 극적인 팽창 (별표로 표시함)이 관찰되었다 (6E). IHC의 꼭대기 부분에 수많은 공포들 (vacuoles)이 존재하는 것과 비정상적인 형태를 한 입체섬모 (화살표로 표시함)가 눈에 띈다. IHC 폴 기저부를 고배율로 확대한 사진에서는 살리실레이트 처리된 동물의 경우 아무런 이상도 발견되지 않는다 (6C). 두개의 구심성 신경 말단 (a1 및 a2로 표시됨)은 정상적이고, 구심성 a2와 맞닿은 특징적인 프리시냅스 바디 (presynaptic body)도 선명하게 보인다. 이와 대조적으로, (6F)는 팽창되고 (a1) 파열된 (a2) 신경 말단과 a2에 맞닿은 프리시냅스 바디를 보여준다. A 및 D의 눈금 막대는 10 ㎛ (주사 전자 현미경)를, B와 E의 경우에는 5 ㎛, 그리고 C와 F의 경우에는 0.25 ㎛를 나타낸다 (모두 투과 전자 현미경).
도 7은 살리실레이트 또는 음향 외상에 노출된 후 와우각 NMDA 수용체의 NR1 서브유닛의 발현 정도를 나타낸 것으로, 발현은 웨스턴 블롯 면역측정에 의해 측정하였다. 이 도면으로부터 알 수 있는 바와 같이, 살리실레이트 처리는 NR1 NMDA 수용체 서브유닛 발현의 유의적인 변형을 유발하지 않았다 (대조군 동물보다 4% 높은 과발현). 이와 대조적으로, 음향 외상은 외상 발생 5일 경과 후 뚜렷한 과발현을 일으켰으며 (대조군 동물보다 +50% 과발현), 이는 지속적인 이명의 경우의 관찰 결과와 상통하는 것이다. 그러나, 외상으로부터 24시간 경과 후에는, 이렇다하게 인지할만한 (+8%) 유의적인 과발현이 없었는데, 이는 음향 외상 후 일시적 이명과 지속적 이명의 메카니즘이 기본적으로 서로 다른 것임을 시사하는 것이다. 대조군 동물의 뇌로부터의 임뮤노블롯을 수행하자 NR1 서브유닛의 분자량이 뇌와 와우각 부위 모두에서 동일한 것으로 입증되었다.

실시예 1

방법 및 재료

[0037] 본 발명자들은 음향 외상에 의해 유발된 와우각 흥분독성에 의해 유도되는 이명의 동물 모델을 개발하여 테스트하였다. 일반적으로 이명은 직접 관찰할 수는 없고, 와우각 흥분독성이 모든 개체에게서 이명을 야기시키는 것도 아니며, 이명의 지각이 흥분독성 발생 후 수시간 후에 그냥 사라지거나 계속 지속될 수도 있기 때문에, 이러한 동물 모델의 정의 및 실시는 실질적인 시도만을 나타내는 것이다. 이러한 고려는, 예컨대 연구를 위한 이명 건수를 충분히 확보하여 경시적으로 이명을 관찰할 수 있도록 하기 위해서는 보다 많은 동물들이 필요함을 의미하는 것이기도 하다. 와우각 흥분독성에 의해 유도되는 이명이 지속적인 것인지 아닌지 불명확하기 때문에, 그 초기 단계에서 연구를 실시하는 것이 바람직하다.

[0038] 실험은 두 단계로 수행하였다. 먼저, 이명 발생 뿐만 아니라 급성 음향 외상에 수반되는 청력 소실을 치료 화합물을 투여하지 않고 평가하였다. 두번째 단계에서는, 3종의 약학적 화합물에 대해 이명의 억제 효과를 테스트하였다: NMDA 수용체 길항제인 S-(+)-케타민 (Sigma-Aldrich), 참조물질로서 살리실레이트 유발형 이명 모델에서 앞서 테스트한 바 있는 또 다른 NMDA 수용체 길항제 (Guitton 외, J. of Neuroscience 23 (9): 3944-3952 (2003))인 7-클로로키누레네이트 (7-CK; Sigma-Aldrich), 및 음향 외상으로 인한 청각 유모세포 사멸 및 청력 손실을 방지하는 것으로 나타난 D-JNKI-1, c-Jun N-말단 키나아제의 펩티드 억제제 (Xigen S.A.) (Wang 외, J. of Neuroscience 23 (24): 8596-8607 (2003)). 첫 단계로부터 얻은 실험적인 결과 (즉, 약학적 화합물을 사용하지 않은 단계)를 대조군으로 삼았다.

동물

[0039] 다른 래트에 비해 탁월한 운동능력을 가진 롱-에반스 래트를 이용하여 실험을 수행하였다. 실험 기간 동안, 동물들을 12/12시간의 낮/밤 주기로 항온 조건으로 개별적으로 우리에 가두었다. 모든 거동 테스트를 매일 대략 동일한 시간대에서 각각의 동물에 대해 동물들의 일반적인 활동 시기인 암상 (dark phase)에서 수행하였다. 실험외적으로는, 동물들에게 물과 영양원을 맘껏 먹게 하였다. 총 60마리의 동물을 실험에 이용하였다; 30마리는 첫번째 단계 (그 중 25 마리는 거동 테크닉에 대해 테스트하고 5마리는 전기생리학에 대해 테스트하였음), 또 다른 30마리는 두번째 단계에서 사용하였으며 테스트된 약학적 화합물 대해 각각 10마리씩 사용하였다.

급성 음향 외상

[0040] 파형 신디사이저 (Hewlett-Packard 8904A)에 의해 발생된 6kHz의 연속적인 순음 (pure tone)에 의해 음향 외상을 일으켰다. 동물들을 마취시킨 다음 130 dB 음압 수준 (SPL: sound pressure level)에 20분간 노출시키고, 프로그램 가능한 어테뉴에이터를 통해 라우팅시킨 후 동물의 이마로부터 10 cm 정도 앞에 위치된 JBL 075 이어폰을 통해 귀에 자유장 (free vield)를 제공하였다. 사운드 레벨은 보정된 Bruel 및 Kjaer 마이크로폰 (4314) 및 Bruel 및 Kjaer 보정 증폭기 (2606)로 측정하였다.

거동 조건화 및 테스트

[0041] 동물들을 능동 회피 (active avoidance)를 달성하도록 조건화시켰다 (Guitton 외, J. of Neuroscience 23 (9): 3944-3952 (2003)). 거동 테스트는 사운드를 전기 마루 및 클라이밍 막대가 구비된 컨디셔닝 상자 내에서 소리가 날 때마다 태스크를 수행하는 것으로 이루어진다. 동물의 조건화는 총 10회 세션만에 달성되었으며, 각각의 지속 시간은 15분 내지 20분이었고, 10 kHz의 주파수에서 3초 동안 50 dB SPL의 순음 조건화 자극을 가하였다. 무조건적인 자극은 최대 30 초 동안 동물의 발에 전기 충격 (3.7 mA)을 가하는 것으로 이루어졌다. 자극과 자극 사이의 간격은 1초였다. 전기 충격은 일단 동물이 정확하게 막대 위에 올라가면 연구자가 중단시켰다. 매 시도 사이의 간격은 적어도 1분으로 하였다.

[0042] 소리에 응답하여 막대 위로 정확하게 동물이 올라가는 경우의 횟수를 측정함으로써 그 동물의 성적으로서 점수를 매겼다. 어떤 동물이 3회의 연속 세션 동안 80% 이상의 점수를 얻으면, 성공적으로 조건화된 것으로 간주하여 실험에 이용하였다.

*[0043] 10분을 한 세션으로 해서 총 10회 시도하는 동안 얻어진 점수와 거짓 양성 반응의 두가지 모두를 매일 측정하여 실험을 수행하였다. 거짓 양성 반응은 아무런 음향 자극이 없는, 즉, 시도와 시도 사이의 기간, 즉, 침묵 기간 동안에 막대 위로 올라가는 것을 가리킨다. 이러한 반응은 동물들이 마치 자극을 들은 것처럼 막대 위로 오르는 태스크를 수행하는 것이므로, 이명을 지각한 것으로 해석할 수 있다 (Guitton 외, J. of Neuroscience 23 (9): 3944-3952 (2003)). 소리 자극은 무작위적으로 주었으며, 발에 가하는 전기 충격은 동물이 소리에 응답해서 막대 위로 올라가지 않았을 때만 가하였다.

전기생리학

[0044] 동물의 정원창 막 상에 이식된 전극에 의해 청신경의 화합물 작용 전위 (CAP: compound action potential)를 측정하였다 (기준 전극은 목 근육에 놓는다). 기준 전극과 정원창 전극을 두개골에 고정시킨 플러그에 납땜하였다. 임의의 기능 발생기 (LeCroy Corp., 모델 9100R)에 의해 1초 당 10회의 톤 버스트를 (9 ms의 지속 기간 및 1 ms의 상승/하강 주기에 의함), JBL 075 이어폰을 통해 프리 파일된 동물의 귀에 가하였다. 10종의 주파수 (2, 4, 6, 8, 10, 12, 16, 20, 26, 및 32 kHz) 에 대해 5 dB 간격으로 0부터 100 dB SPL의 버스트 수준으로 테스트하였다. 청신경 반응을 증폭 (Grass P511K, Astro-Med Inc.), 필터링 (100 Hz 내지 3 kHz) 하고 PC (Dimension Pentium, Dell)를 이용하여 평균을 내었다. CAP 진폭을 최초의 네가티브 디프레션 N1과 후속적인 포지티브 웨이브 P1 사이의 피크 대 피크로서 측정하였다. CAP 역치는 측정가능한 반응 (5 ㎶ 이상)을 이끌어내는데 필요한 소리 강도 (dB SPL로 표시)로서 정의하였다.

약리학

[0045] 0.3 ml/kg의 6% 펜토바르비탈 (Sanofi)를 1회 복강 주사함으로써 동물들을 마취시킨 다음 1차 거동 테스트 직후 (제0일) 무균 조건 하에서 수술하였다. 뒤귓바퀴 외과 시술 (뒷쪽에서 접근)을 통해 두개의 기포 (bullae)를 열었다. 2개의 와우각을 노출시킨 후, 약학적 화합물을 함유하는 인공 외림프액 2.5 ㎕이 함침된 젤발포체 (Gelita tampon, B. Braun Medical AG)를 두개의 와우각의 각각의 정원창 위에 놓았다. 사용된 3종의 약학적 화합물의 농도는 모두 50 μM였다. 이어서 치과용 접착제 (Unifast Trad, GC Corporation)로 기포를 밀봉시키고 상처를 소독한 후 봉합하였다. 이어서 동물들을 외상성 음향에 노출시켰다. 음향 외상 (제1일) 후 24시간 경과한 후 거동 테스트를 재개하고 총 8일 동안 매일 반복하였다.

통계

[0046] 각각의 거동 실험에서, 대응하는 변수들의 비교를 측정 효과 (그룹 효과), 시간 효과 및 그룹 x 시간 상호작용을 테스트하기 위해 투웨이 (그룹 x 시간, 마지막 변수를 반복 측정함) 분산 분석 (ANOVA)를 이용하여 해당 변수들을 비교하였다. ANOVA 후에 post hoc 비교 실험 (Tukey 테스트)을 수행하였다. 원웨이 ANOVA에 이어 Dunnett 테스트에 따라 CAP 측정치의 통계적 분석을 수행하였다. 모든 결과들은 평균 ± SEM으로서 표시하였다.

결과

1단계, 치료적 화합물을 투여하지 않음

[0047] 예상했던 바와 같이, 외상성 음향으로 인해 영구적인 청력 손실이 일어났다 (전기생리학으로 테스트된 5마리 동물). 도 1에 도시된 바와 같이, 음향 외상으로부터 7일째 되는 날, 10 kHz에서 최대 13 dB ±2.0의 영구적인 역치 이동이 관찰되었다 (제1일에 일어났음).

[0048] 음향 외상은 또한 점수 감소를 야기시켰다 (거동 모델에서 테스트된 25마리 동물에서). 도 2A에 도시된 바와 같이, 평균 점수는 제0일 (음향 외상 전)의 87% ±1.6의 최초의 높은 수준에서 음향 외상이 발생한 제1일에는 59% ±1.0의 낮은 수준으로 현저히 감소하였다 (p < 0.001). 제2일부터 (69% ±1.2) 부분적인 기능 회복이 관찰되어 제4일에는 평균 점수 80% ±2.0으로 평준화되었다. 결과를 통계적으로 분석하자 관찰된 점수 감소는 제2일부터 제8일까지 (마지막날 80% ±1.4) 역시 유의적이었음을 보여주었다 (p < 0.05). 조건화된 소리 자극에 정확히 반응하는 동물들이 능력 감소는 외상성 음향에 의해 유발된 청력 손실이 해당 음향 자극 주파수의 소리를 듣는 그들의 능력을 현저히 감소시켰다는 사실과도 일치한다.

[0049] 흥미롭게도, 거짓 양성의 횟수는 도 2B에 도시된 바와 같이, 음향 외상 후 테스트된 동물 가운데서 실질적으로 다른 것으로 밝혀졌다. 어떤 한 그룹의 동물 (그룹 1로 표기; n=11)은 심지어 음향 외상 이후에도 거짓 양성 회수에 있어서 아무런 증가를 나타내지 않았다 (제0일과 제1일에 0.18 거짓 양성 ± 0.12). 그러나 나머지 14마리의 동물은 제0일에는 0.34±0.13으로부터 제1일에는 4.28 ±0.22로 거짓 양성 횟수가 현저히 증가되었다. 이러한 증가는 이들 중 6마리 (그룹 2)에는 역전된 것으로 나타났는데, 거짓 양성 횟수가 제2일 이후에는 정상 수준으로 돌아왔다. 그러나 다른 8마리 (그룹 3)는 거짓 양성이 일시적으로 다시 증가되었다. 이 두번째 페이즈에서 최대 거짓 양성 횟수는 제 5일에 3.87 ± 0.29인 것으로 관찰되었으며, 그 효과는 8일까지 통계적으로 유의적인 채로 남아있었다 (관찰 마지막 날 2.25 ± 0.25 거짓 양성). 달리 요약하면: 먼저 소리 자극에 대한 거짓 양성 반응 횟수가 가역적으로 증가된 후 영구적으로 증가된다. 이는 음향 외상 후 몇몇 동물들은 이명을 전혀 경험하지 않는 반면 (그룹 1), 몇몇은 일시적으로만 경험하고 (그룹 2), 몇몇은 처음에는 일시적으로, 그후에는 관찰 기간의 나머지 내내 영구적인 이명을 경험하는 것을 의미한다. 이러한 결과는 사람에 있어서 일반적인 관찰 결과와 이론상 일치한다.

2단계, 치료적 화합물을 투여함

음향 외상에 의한 이명 발생과 관련한 메카니즘이 와우각 유모 세포의 손실 및/또는 흥분독성 유도와 연관이 있는지 테스트하기 위해, 정원창 막에 D-JNKL-1을 적용하였다. 도 3A에 도시된 바와 같이, 약학적 화합물은 제0일부터 (88% ±2.5) 제1일 (65 ±1.7)까지 점수 감소를 방지하지 못하였다. 그러나, 이 치료는 제2일에는 외상전 수준으로 기능을 신속하게 완전히 복구시켰으며 (90% ±2.6), 이것은 그 후에도 지속되었다 (제8일에 92% ± 2.0).

[0050] D-JNK-1은 급성 음향 외상 후 영구적인 청력 손실을 방지하는 반면, 몇몇 거짓 양성에 대해서는 유의적인 효과를 나타내지 않았으므로, 이명의 예방에 대해서도 유의적인 효과는 없었다. 도 3B에 도시된 바와 같이, 거짓 양성 유형은 대조군 (도 2B)에 대해 관찰된 것과 거의 동일한 반면: 그룹 1 (n=4)은 아무런 증가를 나타내지 않았고 (양일 모두 0.25 ±0.25 거짓 양성), 다른 두 그룹은 제0일 (0.33 ± 0.21) 부터 제1일 (4.66 ±0.42)까지 거짓 양성 횟수에 있어 통계적으로 유의적인 증가 (p<0.05)를 다시 나타내었다. 그룹 2 (n=2)의 경우, 그 증가는 역시 단기간의, 전적으로 가역적인 증가였던 반면, 그룹 3 (n=4)의 일시적인 증가는 거짓 양성 횟수에 있어서 영구적인 증가를 수반하였다 (제4일에 3.50 ±0.29 거짓 양성 및 제8일에 2.25±0.25). 전반적으로, 이러한 결과는 음향 외상에 의해 유발된 유모 세포 손실이 이명 발생에 유의적인 역할을 하는 것이 아니라, 와우각 흥분독성이 그의 기본 메카니즘이라는 것을 가리키는 것이다.

[0051] 2종의 NMDA 수용체 길항제인 7-CK와 S-(+)-케타민을 국소투여하자 서로 매우 유사한 결과가 초래되었다. 도 4A 및 5A에 도시된 바와 같이, 평균 점수는 제0일부터 제1일까지는 심각하게 저하되었으나, 그 후 미처리 동물 보다 느린 속도로 점차 회복되었다. 미처리 동물과는 대조적으로, NMDA 수용체 길항제로 처리된 동물 그룹에서는 제6일에만 점수 안정화가 일어났다 (S-(+)-케타민과 7-CK로 처리된 동물에 있어서, 각각 89%±2.3 및 88% ±2.5). 이러한 차이에 대해서는, NMDA 수용체의 (부분적) 차단이 향신경성 효과를 갖는 새로운 시냅스 형성을 지연시켜, 기능 회복을 더디게 한다는 설명이 가능하다.

[0052] 이들 두가지 NMDA 길항제를 투여하면 한편으로 거짓 양성 횟수에 실질적인 영향이 미쳐졌다 (도 4B 및 5B). 미처리 동물 또는 D-JNKI-1로 처리된 경우와 달리, 최초의 일시적인 증가 후, 발생된 거짓 양성 응답 횟수가 영구적으로 증가된 그룹은 관찰되지 않았다. 거짓 양성의 증가도 전혀 없었으며 (그룹 1; S-(+)-케타민과 7-CK로 처리된 동물의 경우 각각 n = 5 및 n = 4), 제0일과 1일에 거짓 양성 0.22 ±0.22가 관찰되었거나, 음향 외상 직후 가역적인 증가가 있었으며 (그룹 2; 케타민과 7-CK로 치료된 동물의 경우 각각 n = 5 및 n = 6), 양성 거짓 횟수가 제0일에 0.2 ±0.2 (S-(+)-케타민) 및 0.33 ±0.21 (7-CK)로부터 제1일에 5±0.48 (S-(+)-케타민) 및 4.66 ± 0.42 (7-CK)로 증가되었다. 따라서, 일시적인 이명 발생이 이은 영구적인 이명의 개시는 관찰되지 않았다. 이러한 결과는 NMDA 수용체 길항제를 와우각에 국소 투여하면 와우각 흥분독성에 의해 유발된 이명이 지속되는 것을 억제할 수 있음을 입증하는 것이다.

실시예 2

방법 및 재료

살리실레이트와 흥분독성이 유발하는 이명의 서로 다른 메카니즘을 평가하기 위해, 와우각 감각신경 구조의 형태학적 비교 분석과 이명 유발 사건의 서로 다른 두가지 유형에 이은 웨스턴 블롯 면역측정법을 수행하였다.

형태학

3 마리의 롱 에반스 래트의 2 그룹을 각각 하루 2회 350 mg/kg의 소듐 살리실레이트로 2일간 복강 주사하거나 실시예 1에서 설명된 바와 같이 외상을 가하였다. 래트를 깊이 마취시켜 (펜토바르비탈 50 mg/kg) 단두시킨 후, 관자뼈로부터 와우각을 제거하고 pH 7.3의 0.1 M 포스페이트-완충 염수 (PBS) 중 2.5% 글루타르알데히드 고정용액으로 관입시켰다. 이어서 이들을 주사전자현미경 (SEM) 또는 투과전자현미경 (TEM)으로 관찰하였다. SEM의 경우, 귀연골 주머니을 절개하여 혈관줄무늬, 덮개막 및 라이스너막 (Reissner's membrane)을 제거하였다. PBS (pH 7.3)로 헹군 후, 표본들을 일련 등급의 에탄올 (30-100%)에서 탈수시키고, CO₂에서 임계점 건조시킨 다음, 금 팔라듐으로 피복한 후, Hitachi S4000 현미경으로 관찰하였다. TEM의 경우, 오스뮴 테트록사이드의 1% 수용액에서 2시간 동안 와우각을 후고정시킨 다음, 포스페이트 완충액으로 헹구고, 일련 등급의 에탄올 (30-100%)에서 탈수시킨 다음, Epon 수지에 내장시켰다. 와우각의 꼭대기 절반으로부터 코티 (Corti) 기관의 가로 초박형 섹션을 떼어냈다. 포름바-피복되거나 메시 그리드 상에 이 섹션들을 마운트시키고, 우라닐 아세테이트와 구연산납으로 염색한 후 Hitachi 7100 현미경을 이용하여 관찰하였다.

면역측정

3 마리의 롱 에반스 래트의 세 그룹을 각각 350 mg/kg의 소듐 살리실레이트로 24시간 동안 2회 복강 주사하여 처리하거나 [0036]에서 설명된 바와 같이 외상을 입혔다. 사용된 살리실레이트 투여량은 이명을 유발하는 것으로 알려진 양이었다 (Guitton 외, J. of Neuroscience 23 (9): 3944-3952 (2003)). 다른 3마리 그룹은 대조군이었으며 살리실레이트 처리된 동물들과 동일한 용량의 NaCl 0.9% 용액을 복강 주사하였다. 24시간 후 살리실레이트 및 대조군 그룹으로부터 각각 표본들을 얻고, 음향 외상 그룹에서는 사건 발생 후 각 24시간, 5일 후에 표본들을 얻었다. 실시예 1에서 설명된 바와 같이, 일시적인 이명은 외상으로부터 24시간 후 발생하였으며, 제3일에 영구적인 이명이 관찰될 수 있었으므로; 지속적인 이명은 제5일에 존재한 것으로 예상할 수 있다. 살리실레이트는 지속성 이명을 유발하지 못하므로, 24시간 경과 후의 여하한 치료 및 측정은 그러한 24시간 후 얻어진 것과 다른 결과를 내리라고 예상될 수 없다.

차가운 PBS 중에 조직을 수확하여 표본 완충액 중에서 균질화시키고, 용해질(lysate)을 원심분리하여 세제-불용성 물질을 제거하고 Tris/Tricine 중 10% SDS-PAGE로 분리하였다. 젤 전기영동 후, 단백질들을 니트로셀룰로스 막에 전기영동적으로 이동시켰다 (PVDF 이동막 Hybond-P, Amersham Pharmacia Biotech, USA). 먼저 블롯을 NMDA NR1 수용체 서브유닛 (1/1000 희석: 토끼의 폴리클로날 항체, Chemicon international, USA)에 대한 1차 항-항체, 및 1차 항체 항액틴 (1/50000 희석, 마우스의 모노클로날 항-β-액틴, Sigma, USA)과 함께 4℃에서 하룻밤 인큐베이션시켰다. NR1 서브유닛의 분자량이 뇌와 와우각에서 동일함을 검증하기 위해, 대조군 동물들의 뇌로부터 임뮤노블롯을 실시하였다. 이어서, 항체 항토끼 IgG, 바이오티닐화된 종특이적인 전항체 (1/3500, Amersham Lifescience, USA) 및 항마우스 IgG, 바이오티닐화된 종특이적인 전항체 (1/3500, Amersham Lifescience, USA)를 이용하여 4℃에서 2시간 동안 인큐베이션시켰다. TBS-T (Tris buffer saline tween)로 5x10분간 세척한 다음, 스트렙트아비딘 알칼라인 포스파타제 컨쥬게이트(1/5000, Amersham Lifescience, USA)를 이용하여 4℃에서 2시간 인큐베이션시켰다. 단백질-항체 복합체를 BCIP/NBT (Sigma, USA)를 이용하여 측정하였다. 이어서 웨스턴 블롯의 영상 스캐닝을 Biorad Fluor-S 소프트웨어 (Quantity one)를 이용하여 NR1과 액틴 단백질의 발현 수준을 반정량적으로 수행하였다.

결과

예상된 바와 같이, 살리실레이트 유발성 이명의 메카니즘과 흥분독성 유발성 이명의 메카니즘은 상이한 경로에 의한 것으로서 서로 다른 형태학적 및 생리적 결과를 초래한다. 도 6에 도시된 바와 같이, 살리실레이트를 투여하면 감각 외유모 세포 (OHC)의 입체섬모와 내유모 세포 (IHC)의 입체 섬모는 온전하게 유지되는 반면, 음향 외상에 노출되었던 동물들은 OHC 입체섬모 다발이 심각하게 손상될 뿐만 아니라 심지어 몇몇 경우에는 IHC 입체섬모가 엉키고 융합되기까지 한다. 살리실레이트 처리의 경우에는 IHC 시냅스 복합체의 초구조적인 이상성은 관찰되지 않은 반면, 외상을 입은 동물에서는 집중적이고도 극적인 방사형 구심성 수상돌기의 팽윤이 해당 주파수 범위 대역에서 IHC의 폴 (pole) 기저부에서 극명하게 드러나, 이는 흥분독성이 발생하였음을 확인하여 주는 것이다. IHC의 꼭대기 부분에 수많은 공포들(vacuoles)과 비정상적인 형태를 한 입체섬모가 존재한다. IHC 폴 기저부를 고배율로 확대한 사진에서도 살리실레이트 처리된 동물의 경우 아무런 이상이 발견되지 않았다. 구심성 신경 말단은 정상적이고, 특징적인 프리시냅스 바디 (presynaptic body)도 선명하게 보인다. 이와 대조적으로, 외상 후에는 팽창되고 파열된 신경 말단이 나타난다.

도 7은 살리실레이트 또는 음향 외상에 노출된 후 와우각 NMDA 수용체의 NR1 서브유닛의 발현 정도를 나타낸 것으로, 발현은 웨스턴 블롯 면역측정에 의해 측정하였다. 살리실레이트 처리는 NR1 NMDA 수용체 서브유닛 발현의 유의적인 변형을 유발하지 않았다 (대조군 동물보다 4% 높은 과발현). 이와 대조적으로, 음향 외상은 외상 발생 5일 경과 후 뚜렷한 과발현을 일으켰으며 (대조군 동물보다 +50% 과발현), 이는 지속적인 이명의 경우의 관찰 결과와 상통하는 것이다. NMDA NR1 발현도의 차이는 음향 외상에 의해 유발된 이명은 NMDA 수용체를 상향 조절한 반면, 살리실레이트는 그렇지 않음을 나타낸다. 이것은 살리실레이트 유발형 이명은 전술한 바와 같이 다른 경로에 의해 매개됨을 확인해준다. 도 7은 또한 외상 발생 24시간 후, 이렇다하게 인지할만한 (+8%) 유의적인 과발현이 없음을 보여주며, 이는 음향 외상 후 일시적 이명과 지속적 이명의 메카니즘이 기본적으로 서로 다른 것임을 시사하는 것이다.

형태학적 및 면역측정 분석 결과를 함께 고려하면 살리실레이트 유발형 이명과 흥분독성 유발형 이명 간에는 그 작용 메카니즘이 기본적으로 다르다는 것을 확인할 수 있다. 살리실레이트와 달리, 흥분독성은 내유모 세포 시냅스 복합체를 손상시켜 NMDA 수용체의 상향 조절을 유발함으로써, 영구적인 이명 발생을 야기한다. 와우각 NMDA 반응 조절에는 두가지 서로 다른 경로가 관여하므로, 와우각 흥분독성에 의해 유발된 지속적인 이명을 억제하는데 있어서의 NMDA 수용체 길항제의 효능은 실제적으로는 살리실레이트 유발형 이명의 모델에 의해서 추정할 수는 없다.

Claims

사람에 있어서 청신경의 NMDA 수용체 매개형 이상 활성을 억제 또는 감소하는데 효과적인 NMDA 수용체 길항제를 함유하는, 와우각 흥분독성에 의해 유발된 이명의 치료 또는 예방용 약학적 조성물.