KR101422559B1

KR101422559B1 - 지방유래 줄기세포 배양액, 이의 제조방법, 및 이를 포함하는 발모촉진용 조성물

Info

Publication number: KR101422559B1
Application number: KR1020120024487A
Authority: KR
Inventors: 김동완; 서미정; 이광; 주우홍; 김선희
Original assignee: 창원대학교 산학협력단
Priority date: 2012-03-09
Filing date: 2012-03-09
Publication date: 2014-07-24
Also published as: KR20130103115A; US20150037435A1; WO2013133494A1; US9999589B2

Abstract

본 발명은 지방유래 줄기세포의 배양액, 이의 제조방법, 및 상기 배양액을 포함하는 발모촉진용 조성물에 관한 것이다. 본 발명의 지방유래 줄기세포(ADSC-T)는 일차 지방유래 줄기세포(ADSC)에 비해 수명이 길고 세포증식속도가 향상되며, 증식기간이 연장되므로 지방유래 줄기세포에 관한 연구 및 지방유래 줄기세포 배양액의 대량생산에 매우 유용하게 사용할 수 있다. 또한 본 발명의 SV40의 T 항원을 발현하는 지방유래 줄기세포(ADSC-T) 배양액은 모발증식효과가 우수하여 탈모방지 및 발모촉진제의 원료로 매우 유용하게 사용할 수 있다.

Description

지방유래 줄기세포 배양액, 이의 제조방법, 및 이를 포함하는 발모촉진용 조성물{Culture medium of adipose-derived stem cell, method for preparing the same, and composition for promoting hair growth comprising the same}

본 발명은 지방유래 줄기세포 배양액, 이의 제조방법, 및 상기 배양액을 포함하는 발모촉진용 조성물에 관한 것이다.

최근 미용에 대한 관심이 높아지면서 탈모 치료에 관한 관심 또한 높아지고 있다. 모발은 생명에 직접적인 중요한 생리적 기능은 가지고 있지 않지만 외부의 충격으로부터 완충과 자외선 차단, 외부자극으로부터 인체를 보호하며, 신체에 불필요한 비소, 수은, 아연 등의 중금속을 흡수하여 체외로 배출하는 기능을 가지고 있다. 모발은 모발이 성장하는 성장기(anagen), 성장이 멈추고 모구부가 축소되면서 대사과정이 늦어지는 퇴행기(catagen), 모낭이 수축되면서 모근이 위쪽으로 밀려 올라가 모발이 빠지게 되는 휴지기(telogen)로 구분되며, 같은 장소에서 새로운 모발이 생성됨으로 인해 오래된 모발이 탈락하고 성장기로 전환되는 모주기(hair cycle)을 가지고 일생동안 성장과 탈락을 반복한다. 이러한 모발이 정상적으로 있어야 할 곳에 없는 상태를 탈모라 하며, 그 원인으로 남성호르몬 관여에 의한 모포 기능의 저하, 두피생리기능의 저하, 두피 긴장에 의한 국소혈류장애, 영양불량, 스트레스, 약물에 의한 부작용, 유전적 요인, 화학물질, 백혈병, 결핵, 악성 임파종 등의 질병을 들고 있다. 위와 같은 기능 외에 탈모가 심한 경우 사회생활을 하는데 문제가 있을 수 있으며 심리적으로도 위축되어 심각한 영향을 미칠 수 있어 삶의 질 측면에서 탈모 치료는 매우 중요하다.

현재 탈모 치료법으로 가장 많이 쓰이고 있는 방법은 자기 자신의 머리털을 이용하여 이식하는 자가 모발이식 수술법과 미녹시딜과 프로페시아를 사용하는 약물 치료가 널리 사용되고 있다. 미녹시딜의 경우 혈관확장을 통한 모세포에 영양공급증가 및 칼륨 채널 개방 효과(potassium channel opening effect) 등이 모발 성장을 유도하며, 프로페시아의 경우 DHT(dihydrotestosterone)의 생성을 저해하는 효과로 모발 성장을 유도하지만 이 두 약물 모두 치료할 당시에는 발모 효능이 나타나나, 치료가 중단되면 탈모가 다시 진행되고 모발성장의 효과보다는 탈모방지의 효과가 더욱 크며, 프로페시아의 경우 성기능 장애, 임신한 여성의 경우 기형아 출산과 같은 부작용이 나타날 수 있다.

최근, 탈모와 관련된 유전자를 모낭에 전달하거나 유전자 발현을 차단하는 방법으로 시술되는 유전자 치료법이 개발되었으나, 치료의 효능 및 안전성이 불확실하고, 치료비용이 고가이어서 임상적용이 용이하지 않다는 문제점이 있다. 이러한 이유로 유전자 치료 외에 줄기세포를 이용한 탈모치료 방법이 최근 각광받고 있다.

줄기세포는 미분화 상태로 자가 증식하고 다른 조직의 세포로 다중 분화될 수 있는 세포로 우리 몸의 많은 조직에 존재한다는 것이 밝혀졌으며, 가장 먼저 알려진 것이 골수에서 유래된 골수유래 줄기세포이다. 이후 탯줄 혈액뿐 아니라 말초혈액, 태반, 피부, 신경조직, 지방, 근육 등 우리 몸 어느 곳에서나 성체줄기세포가 존재한다는 것이 밝혀졌다. 반면, 지방에서 추출한 지방유래 줄기세포는, 골수유래 줄기세포와 마찬가지로 중간엽 조직 유래의 세포이며, 지방세포, 섬유아세포, 평활근세포, 내피세포와 지방전구세포 등 여러 가지 종류의 세포로 분화가 가능할 뿐만 아니라, 상피, 연골, 신경, 지방, 근육세포 등으로도 분화가 가능하다. 또한 지방유래 줄기세포는 그 재료가 되는 지방조직을 지방흡입술 과정에서 부수적으로 대량 추출할 수 있어 입수가 용이하며, 효소에 의해 쉽게 분리될 뿐 아니라 이식 후 질병의 발생률이 낮다고 보고되었다.

그러나 현재 줄기세포를 이용한 탈모치료 방법은 줄기세포를 탈모나 무모의 증상을 나타내는 부위에 직접 주입하여 모낭 세포로 분화하도록 유도하는 방법이 대부분인데, 이러한 방법은 자가 줄기세포가 아니면 치료가 불가능하며, 치료효과가 지속적으로 유지되지 못할 뿐만 아니라, 오랜 시간과 고가의 비용이 소요된다는 단점이 있다. 이러한 문제점을 개선하기 위하여 줄기세포가 아닌 줄기세포 배양 시 생산되는 배양액을 사용하여 탈모를 치료하고자 하는 시도가 이루어지고 있다.

한편, 모발성장에 영향을 주는 신호전달물질에는 외적인 요인과 내적인 요인이 존재하며, 내적인 요인으로는 성장인자(growth factor)와 사이토카인(cytokine)을 들 수 있는데, 줄기세포는 배양시 성장인자와 단백질 활성물질을 분비하여 이러한 물질들이 배양액 속에 녹아있게 된다. 이러한 배양액을 모발증식제로 사용하기 위하여는 대량의 배양액이 생산되어야 하지만, 지방유래 줄기세포의 경우 in vitro 상에서 장기간 배양 시 세포노화(cellular senescence)에 의해 세포 증식 능력이 점점 감소되면서 결국은 성장이 중지 되는 복제노화현상(replicative senescence)을 나타내며, 분화능력도 감소하게 된다. 따라서, 이러한 문제점을 극복하기 위해서는 지방유래 줄기세포의 특성을 유지하면서 세포의 수명과 증식속도를 증가시켜 대량의 배양액을 생산할 수 있는 기술의 개발의 필요성이 절실히 요구되고 있다.

본 발명자들은 지방유래 줄기세포의 특성을 유지하면서 세포의 수명을 연장하고 증식속도를 향상시키는 방법에 대해 연구하던 중, SV40의 T 항원을 도입한 지방유래 줄기세포의 수명이 길어지고 빠른 증식속도를 나타내며, 지방유래 줄기세포 배양액의 모발 증식 효과가 우수하게 나타남을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 지방유래 줄기세포의 배양액, 이의 제조방법, 및 상기 방법에 의하여 제조된 배양액을 포함하는 발모촉진용 조성물을 제공하고자 한다.

본 발명은 지방유래 줄기세포의 배양액 및 이의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 지방유래 줄기세포 배양액을 포함하는 발모촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 지방유래 줄기세포(ADSC-T)는 일차 지방유래 줄기세포(ADSC)에 비해 수명이 길고 세포증식속도가 향상되며, 증식기간이 연장되므로 지방유래 줄기세포에 관한 연구 및 지방유래 줄기세포 배양액의 대량생산에 매우 유용하게 사용할 수 있다. 또한, 본 발명의 SV40의 T 항원을 발현하는 지방유래 줄기세포(ADSC-T) 배양액은 모발증식효과가 우수하여 탈모방지 및 발모촉진제의 원료로 매우 유용하게 사용할 수 있다.

도 1A는 흡입지방조직으로부터 분리한 모든 세포를 플레이트에 도말한 후 현미경 으로 관찰한 도이며, 도 1B는 부유세포를 제거한 후 플레이트에 부착된 세포만을 계대 배양한 후 현미경으로 관찰한 도이다(각 x100 확대).
도 2는 지방유래 줄기세포(ADSC)가 지방세포로 분화되었는지 Oil-Red O로 염색한 결과를 나타낸 도이다[지방유래 줄기세포의 분화유도 전(A), 분화유도 30일 후(B), 분화유도 30일 후 Oil-Red O로 염색한 결과(C)].
도 3은 ADSC-T 세포의 형태학적 변화를 현미경으로 관찰한 도이다[일차 지방유래 줄기세포(primary ADSC)(A), pEF321β-T 플라스미드의 도입에 의해 형성된 지방유래 줄기세포의 고밀도 세포 군집(high-density focus)(B, C), 고밀도 세포 군집에서 얻은 세포를 배양하여 수립한 ADSC-T 세포(D)](각 x100 확대).
도 4는 ADSC-T 및 대조군으로 사용한 COS-1 세포 내에 발현된 SV40 T 항원을 형광항체 염색법으로 관찰한 도이다.
도 5는 T 항원의 단일클론항체(monoclonal antibody)를 이용하여 ADSC-T 세포의 T 항원의 웨스턴 블롯(western blotting) 분석 결과를 나타낸 도이다[일차 지방유래 줄기세포(A), ADSC-T(B, C, D), COS-1(E)].
도 6은 일차 지방유래 줄기세포(primary ADSC)와 ADSC-T 의 3개 세포(ADSC-T-1, ADSC-T-2, ADSC-T-3)의 증식 속도를 나타낸 도이다.
도 7은 탈모 마우스 모델의 배부를 제모한 후 생리식염수를 도포한 대조군과 ADSC-T 의 배양액을 도포한 후 육안으로 관찰한 결과를 나타낸 도이다.
도 8은 탈모 쥐 모델(6마리)의 배부를 제모한 후 생리식염수 또는 ADSC-T 의 배양액을 도포한 후 푸른 반점이 나타나기까지 소요된 날짜를 나타낸 도이다.

이하 본 발명을 보다 상세하게 설명하기로 한다.

본 발명자들은 SV40의 T 항원의 발현이 여러 가지 세포의 수명을 연장시킨다는 것에 기초하여, 흡입지방으로부터 줄기세포 (Adipose-Derived Stem Cells, ADSC)를 분리하고, 분리한 지방유래 줄기세포의 증식속도를 증가시키고 증식수명을 연장하기 위하여 SV40의 T 항원을 발현하는 벡터를 도입하면 지방유래 줄기세포의 수명이 연장될 것이라고 예상하였다. 이를 확인하기 위하여 SV40의 T 항원을 발현하는 벡터인 pEF321β-T 플라스미드를 지방유래 줄기세포에 도입하였고 그 결과, SV40의 T 항원을 발현하는 지방유래 줄기세포의 수명이 연장되고, 증식속도가 향상되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 결과로부터, SV40의 T 항원을 발현하는 지방유래 줄기세포를 사용하면 지방유래 줄기세포의 배양액을 대량으로 생산할 수 있어, 지방유래 줄기세포의 배양액을 유효성분으로 함유하는 발모촉진용 조성물의 원료를 대량으로 수득할 수 있음을 확인할 수 있었다.

상기 "흡입지방"은 지방 흡입술(liposuction) 과정에서 부수적으로 얻을 수 있고, 이러한 지방 조직은 대량으로 추출될 수 있다는 장점이 있다. 상기 조직에 포함되어 있는 지방 유래 줄기세포는 지금까지 상피세포, 연골세포, 골 형성, 지방 세포, 신경세포, 연골세포, 및 근육세포 등으로 분화할 수 있다는 보고가 있으며, 최근 연구에서는 근육 재생능 및 신경혈관분화를 촉진하는 능력이 있음이 확인되었다 (Zuk et al., Tissue Eng., 7:211, 2001;Rodriguez et al., BBRC., 315:255, 2004; Brzoska et al., BBRC, 330:142, 2005; Safford et al., BBRC, 294:371, 2005; Biomaterials, 25:3211, 2004; Fujimura et al., BBRC, 333:116, 2005; 미국특허 6,777,231).

본 발명에 있어서 '지방흡입술(liposuction)'은 지방 제거의 미용 또는 성형 수술의 한 기법으로서, 지방질 부분을 절개하여 진공 펌프로 지방질을 뽑아내는 것 또는 주사기의 압력으로 뽑아내는 것을 의미한다.

본 발명에 있어서 “SV40(Simian Virus 40)”는 폴리오마 바이러스 과, 폴리오마 바이러스 속, 시미안 바이러스40 종에 속하는 바이러스로서, 5245개의 염기로 이루어지는 고리형 이중가닥 유전체를 가지며, 숙주범위가 넓어 여러 가지 세포의 형질전환 벡터로서 사용된다.

상기 SV40의 “T 항원”은 종양을 유발하는 바이러스인 SV40의 감염초기에 합성되는 초기 단백질로서, 감염세포의 종양화에 기여하는 단백질이다. T 항원은 세포의 형질전환시, 세포측의 암억제 유전자산물(p53 등)과 결합하여 그 활성을 억제하는 작용이 있어 여러 가지 세포의 불멸화(immortalization)에 응용된다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 (a) 흡입지방조직에 콜라게나아제 효소를 처리한 후 원심분리하여 지방유래 줄기세포를 분리하여 배양하는 단계; (b) 플라스미드 발현 벡터(pEF321β-T)를 상기 (a) 단계에서 배양한 지방유래 줄기세포에 형질 감염시켜 SV40 T 항원을 발현하는 지방유래 줄기세포(ADSC-T)를 제조하는 단계; 및 (c) 상기 제조된 지방유래 줄기세포(ADSC-T)를 배양하여 배양액을 수득하는 단계;를 포함하는, 지방유래 줄기세포(ADSC-T) 배양액의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 지방유래 줄기세포 배양액의 제조방법을 단계별로 상세히 설명하면 다음과 같다.

상기 (a)단계는 흡입지방조직으로부터 지방유래 줄기세포를 분리하여 배양하는 단계로, 먼저 흡입지방조직에 콜라게나아제 효소를 1:1의 중량비로 혼합한 후 30~40℃에서 40~50분 동안 처리한 다음, 원심분리하여 지방유래 줄기세포를 분리한다.

상기 “콜라게나아제 효소”는 콜라겐의 가수분해를 촉진하는 효소로서, 지방조직의 콜라겐을 분해하여 지방줄기세포를 각각 분리시키는 역할을 한다.

상기 원심분리는 2~5분간 500~1000G에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 3분간 800G에서 수행되어 상등액을 얻고, 상등액에 부유된 지질과 지방세포층을 제거한 후 여과기를 이용하여 세포성 잔사를 제거한다. 상기 여과기는 100㎛ 여과기가 바람직하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 세포성 잔사를 제거한 후, 생리식염수를 넣고 원심분리를 반복하여 세포를 세척한다. 상기 원심분리는 2~5분간 150~500G에서 수행될 수 있고, 바람직하게는 300G에서 3분 동안 수행될 수 있다.

상기 분리된 지방유래 줄기세포(ADSC)를 10% FBS(Fetal Bovine Serum), 100units/ml 페니실린과 100㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media)배지에서 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하며, 세포의 밀도(confluence)가 80-90%가 되면 계대 배양한다. 상기 배양법은 당업계에 공지된 세포배양방법을 응용할 수 있다.

상기 (b)단계는 SV40 T 항원을 발현하는 지방유래 줄기세포(ADSC-T)를 제조하는 단계로, 플라스미드 발현 벡터(pEF321β-T)를 상기 (a) 단계에서 분리한 지방유래 줄기세포에 형질 감염시켜 SV40 T 항원을 발현하는 지방유래 줄기세포(ADSC-T)를 얻는다.

상기 “벡터”는 DNA 재조합 실험에 있어서, 목적하는 DNA 단편을 숙주세포 등에 도입시킬 수 있는 DNA로서, 벡터 DNA는 제한효소 등으로 절단, 개환하여 여기에 목적으로 하는 DNA 단편을 삽입하여 연결하고 숙주세포에 도입시킬 수 있다. 목적 DNA 단편을 연결한 벡터 DNA는 숙주세포의 염색체 DNA에 삽입되어 숙주의 분열과 더불어 각 세포로 분배되어 목적 DNA 단편을 대대로 유지하며 이어져 나간다.

상기 플라스미드 발현 벡터 “pEF321β-T” 는 SV40의 T 항원을 코딩하는 핵산서열을 포함하는 플라스미드를 의미한다.

상기 “형질 감염”은 유전자 DNA, 플라스미드 DNA, 바이러스 DNA·RNA 등을 세포의 배양액 또는 세포의 현탁액을 통해 세포에 주입하여 유전자 도입 및 감염을 유발시키는 것을 의미한다. 구체적으로, 상기 발현 벡터의 형질 감염은 당업계에 공지되어 있는 인산화칼슘 (calcium phosphate) 형질 감염, 전기천공법(electroporation), 미세주입법 (microinjection) 그리고 리포솜 주입법(liposome injection)등을 포함한 이용가능한 모든 형질 감염 방법을 사용할 수 있다. 또한 바이러스나 박테리아를 운반자로 사용하여 진핵세포에 DNA를 도입할 수도 있다.

예를 들어, 상기 pEF321β-T 플라스미드를 전기천공법으로 도입하는 방법은 지방유래 줄기세포를 무혈청 배지, 바람직하게는 무혈청 DMEM내에서 플라스미드와 혼합하고 전기충격을 주는 방법을 이용할 수 있으나, 이에 한정되지는 아니하며, 당업계에 알려진 전기천공 프로토콜을 사용하여 플라스미드를 도입할 수 있다.

외래 유전자를 도입한 세포는 일정시간 배양을 통하여 도입된 유전자의 발현을 유도하고 발현 여부를 검증해보아야 한다. 도입 유전자의 발현을 위한 배양은 바람직하게는 37℃에서 5% CO 배양기에 배양하는 것이나 이에 한정되지 않는다. 본 발명에 도입된 유전자는 SV40의 T 항원을 발현하는 유전자로서, T 항원의 발현여부는 상기 T 항원에 특이적으로 결합하는 항체를 이용한 항원-항체 결합 반응을 통해 지방유래 줄기세포내 발현된 T 항원을 검출함으로서 검증할 수 있다. 구체적으로는, 통상의 효소면역분석법(ELISA), 방사능면역분석법(Radioimmunoassay, RIA), 샌드위치 측정법, 면역조직화학염색법, 항원-항체 응집법 등을 이용하여 검증할 수 있고, 본 발명의 일실시예에서는 웨스턴블롯 및 형광항체염색법으로 T 항원의 발현여부를 검증하였다.

상기 (c)단계는 지방유래 줄기세포(ADSC-T)를 배양하여 배양액을 수득하는 단계로, ADSC-T 세포를 각 1x10⁵cell/ml로 배양하는 단계; 세포의 밀도가 80%가 되고나서 계대 배양하는 단계; 및 세포의 밀도가 70~90%가 되고난 뒤 2일 후 배양액을 수거하는 단계에 의해 얻어진다.

상기 얻어진 배양액을 원심분리하여 세포의 잔사를 제거하고 상등액만 수득한다. 상기 원심분리는 500~1000G에서 2~5분간, 바람직하게는 800G에 3분간 원심 분리한다.

상기 방법에 의해 제조된 본 발명의 지방유래 줄기세포(ADSC-T)의 배양액은 탈모 마우스 모델에서 모발증식 효과가 우수하다. 따라서, 본 발명의 지방유래 줄기세포(ADSC-T)의 배양액은 탈모방지 및 발모촉진제의 원료로 유용하게 사용될 수 있다.

또한, 본 발명은 SV40의 T 항원을 발현하는 지방유래 줄기세포(ADSC-T)의 배양액을 유효성분으로 포함하는 발모촉진용 조성물을 제공한다.

본 발명의 조성물은 약학적 조성물 및/또는 화장료 조성물을 포함한다.

상기 약학적 조성물에 있어서, 상기 조성물은 약학적으로 허용가능한 담체를 포함할 수 있으며, 통상의 방법에 따라 액제, 현탁액, 에멀젼, 로오숀제, 연고제 등의 경피투여용 제형으로 제제화될 수 있다. 상기 약학적으로 허용가능한 담체는 인산 완충 식염수(phosphate buffered saline), 정제수, 멸균수 등의 수성 희석제 혹은 용제를 포함하며, 프로필렌글리콜(propylene glycol), 올리브 오일 등의 비수성 희석제 혹은 용제를 포함한다. 또한, 필요에 따라 습윤제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다. 상기 약학적 조성물에 함유되는 지방유래 줄기세포 배양액은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 예를 들면, 상기 지방유래 줄기세포 배양액은 1일 0.01~100mg/kg 으로, 바람직하게는0.1~10mg/kg 으로 투여할 수 있으며, 상기 투여는 하루에 한번 또는 수회 나누어 투여할 수도 있다.

상기 화장료 조성물에 있어서, 상기 지방유래 줄기세포 배양액을 사용하여 통상의 화장료 제조방법에 따라, 다양한 형태로 제조될 수 있다. 예를 들어, 상기 화장료 조성물은 상기 배양액을 함유하는 향장 제품, 샴푸, 헤어로션, 헤어크림, 헤어 젤 등의 형태로 제조될 수 있으며, 이는 통상의 클렌징액, 수렴액 및 보습액으로 희석되어 사용될 수 있다. 또한, 상기 화장료 조성물은 화장료 조성물 분야에서 통상적으로 사용되는 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료, 및 향료와 같은 통상적인 보조제를 포함할 수 있다. 상기 화장료 조성물에 있어서, 상기 배양액의 함량은 탈모방지 또는 발모촉진 효과를 달성하기에 유효한 양, 예를 들면, 조성물 총 중량에 대하여 0.001~10 중량%로 함유될 수 있고, 바람직하게는 약 0.01~1 중량%로 함유될 수 있다.

이하 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.

< 실시예 1> 지방조직으로부터 지방유래 줄기세포( Adipose - Derived Stem Cell )의 분리 및 배양

1. 지방조직으로부터 줄기세포의 분리

지방유래 줄기세포(ADSC)의 분리는 성형외과에서 지방흡입술을 시행한 환자에게 동의를 구한 후, 채취한 지방조직에서 지방유래 줄기세포(ADSC)를 추출하였다. 구체적으로는, 분리된 지방조직을 PBS(phosphate buffered saline)로 세척한 후 0.075% 콜라게나아제(sigma)와 1:1의 중량비로 혼합하여 37℃에서 45분 동안 처리하였다. 효소 처리 후, 800G에서 5분 동안 원심 분리하여 상등액을 얻었다. 상등액에 부유된 지질과 지방세포 층을 제거한 후 100㎛ 여과기로 여과하여 세포성 잔사를 제거하였다. 여과액에 생리식염수를 가한 후 300G에서 3분 동안 원심 분리하여 2-3번 정도 세포를 세척하여 지방유래 줄기세포(ADSC)를 얻었다.

2. 지방유래 줄기세포( ADSC )의 배양

상기 1.에서 얻은 지방유래 줄기세포(ADSC)를 10% FBS(Fetal bovine Serum), 100units/ml 페니실린과 100㎍/ml 스트렙토마이신이 첨가된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media)배지에서 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 분리된 지방유래 줄기세포(ADSC)는 적혈구와 혼합되어 있으며, 이 적혈구를 제거하기 위하여 적혈구 용해 완충용액을 사용하기도 하나 적혈구 용해 완충용액 사용시 지방유래 줄기세포(ADSC)의 수가 감소되는 경향이 있다. 따라서 초기배양시 분리된 지방유래 줄기세포(ADSC) 원상태와 적혈구를 함께 배양하였다. 이러한 이유로 초기배양시 지방유래 줄기세포(ADSC)가 적혈구와 혼합되어 배양되었다(도 1A). 초기 배양 1일 후 지방유래 줄기세포(ADSC)가 플레이트에 다 부착되었을 거라고 판단하고 PBS로 2회 세척하여 부유세포 및 적혈구를 제거하였다. 완전히 제거되지 않은 적혈구는 계대배양 시 트립신 화(trypsinization)에 의해 제거하였다. 세포의 밀도(confluence)가 배양기의 80-90%가 되면 계대 배양하였다.

초기 배양 약 2-3일 후 섬유모세포 형태(fibroblast morphology)를 가진 지방유래 줄기세포(ADSC)가 나타남을 확인할 수 있었다. 이후 10cm 플레이트로 계대 배양 후 지방유래 줄기세포(ADSC)의 모양을 관찰하였다. 그 결과 지방유래 줄기세포(ADSC)는 다른 성체줄기세포처럼 섬유모세포와 같은 형태를 나타냄을 알 수 있었다(도 1B).

< 실시예 2> 지방유래 줄기세포( ADSC )가 지방세포( adipocyte )로의 분화 능력 확인

상기 실시예 1에서 분리 배양된 지방유래 줄기세포(ADSC)가 지방세포로 분화되는지 확인하기 위해 지방유래 줄기세포(ADSC)를 지방세포 분화 유도 배지를 사용하여 4주간 분화를 유도시킨 후, 지방세포로 분화되었는지를 확인하였다.

지방세포 분화유도 배지는 PromoCell사에서 판매중인 Preadipocyte Differentiation Medium을 사용하였고, 분화된 adipocyte의 지방세포 유지배지는 PromoCell사에서 판매중인 Adipocyte Nutrition Medium을 사용하였다.

구체적으로는, 지방유래 줄기세포(ADSC)를 지방세포 분화유도 배지에서, 3일 간격으로 배지를 교환하면서 10일간 배양하여 분화를 유도하였고, 이후 지방세포 유지 배지로 바꾸어서 20일간 추가로 더 배양하였다. 배양된 세포는 10%포르말린에 고정시키고 60% Oil-Red O 용액으로 염색하여 세포내 지방소적(lipid droplet)을 시각화하였다.

결과는 도 2에 나타내었다.[지방유래 줄기세포 분화유도 전(A), 분화유도 30일 후(B), 분화유도 30일 후 Oil-Red O 염색 결과(C)].

도 2에 나타난 바와 같이, 배양 30일 후 지방유래 줄기세포(ADSC)에서 지방세포 특유의 지방소적이 관찰되어 지방세포로 분화됨을 확인할 수 있었다. 또한, 배양 30일 후 Oil-Red O염색 결과 지방소적이 붉게 염색되어 지방세포로 분화되었음을 확인할 수 있었으며(C), 분화를 유도하지 않은 세포의 경우 염색이 되지 않은 것을 확인할 수 있었다(A). 따라서, 지방유래 줄기세포(ADSC)가 정상적인 지방세포로 분화할 수 있는 능력을 보유함을 알 수 있다.

< 실시예 3> SV40 T 항원의 발현에 의한 ADSC -T 세포주의 수립 및 특징

1. 형질 감염

SV40 T 항원을 지방유래 줄기세포(ADSC)에서 안정적으로 발현시키기 위해 SV40의 T 항원 유전자를 발현시키는 pEF321β-T 플라스미드 DNA를 지방유래 줄기세포(ADSC)에 전기천공 방법으로 도입하였다. 구체적으로는, 20㎍의 상기 플라스미드 벡터 pEF321β-T 와 1x10개의 지방유래 줄기세포를 800㎕의 무혈청 DMEM내에서 혼합하고 0.4㎠의 큐벳에 담아 전기충격을 주었다. 전기충격은 Gene Pluser X cell Electroporation System(BIO-RAD)을 이용하여 160V, 15msec의 조건으로 실시하였다.

플라스미드 벡터 pEF321β-T가 도입되어 고밀도 세포군집(High density focus)을 형성한 지방유래 줄기세포는 페니실린 캡(penicillin cap)을 씌워 trypsinization 한 다음 세포를 클로닝한 뒤 24well plate에 배양하고 세포가 배양기의 80-90%가 되었을 때 계대 배양하였으며, 이 세포주를 ADSC-T 로 명명하였다.

ADSC-T 세포의 형태학적 변화를 도 3에 나타내었다.

도 3A에 나타낸 바와 같이, 일차 지방유래 줄기세포(primary ADSC)의 경우 세포의 크기가 크고 긴 섬유모세포(fibroblast)의 형태로 접촉제어(contact inhibition)에 의해 증식이 정지되어 세포 단층(monolayer)을 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 3B 및 3C에 나타난 바와 같이, 일차 지방유래 줄기세포에 pEF321β-T 플라스미드가 도입되어 SV40 T 항원이 발현된 지방유래 줄기세포(ADSC-T)가 접촉제어 받지 않고 세포 단층(monolayer) 위에 세포들이 겹쳐 자라는 현상이 나타나 세포 밀도가 높은 고밀도 세포 군집(high-density focus)을 형성하는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 도 3D에 나타난 바와 같이, ADSC-T 는 세포의 크기가 작아지면서 방추형으로 변화되었음을 알 수 있었다. 이러한 ADSC-T 의 세포 형태 변화는 SV40 T 항원의 발현에 의한 것이라고 추정해 볼 수 있다.

2. ADSC -T 세포의 T 항원 발현 여부-형광항체염색법

ADSC-T 세포 내의 T 항원의 발현을 확인하기 위하여, SV40 T 항원에 대한 단일클론항체(monoclonal antibody)와 FITC(Fluorescein isothiocyanate)로 표식된 항-마우스 IgG를 사용하여 형광항체염색을 시행하여 UV 하에서 T 항원의 발현을 관찰하였다. 이때 대조군으로 COS-1 세포를 사용하였으며, COS-1 세포의 경우 SV40 T 항원을 이용하여 만들어진 세포로서 ADSC-T 세포의 SV40 T 항원 발현 유무를 비교 확인할 수 있다.

구체적으로는, ADSC-T 세포 및 COS-1 세포를 에탄올과 아세톤을 1:1로 혼합한 용액으로 18분간 고정하였다. 고정된 세포를 PBS로 세척한 후, SV40 T 항원에 특이적으로 결합하는 마우스의 단일클론항체와 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 배양된 세포를 PBS로 세척한 후 FITC로 표식된 토끼의 항-마우스 IgG와 함께 37℃에서 1시간 동안 배양하였다. 상기 배양된 세포를 형광 현미경으로 관찰하였다.

결과는 도 4에 나타내었다.

도 4에 나타난 바와 같이, 고밀도 세포 군집(high-density focus)에서 분리된 ADSC-T 세포가 SV40 T 항원에 대한 단일클론항체(monoclonal antibody)로 염색되어 COS-1 세포와 마찬가지로 T 항원이 발현되는 것을 확인할 수 있었다.

3. ADSC -T 세포의 T 항원 발현 여부- 웨스턴 블롯

3개의 ADSC-T 세포로부터 각각 총 세포추출물(Total cell extract)을 제조하여 웨스턴 블롯(western blotting)으로 세포 내에 존재하는 SV40 T 항원을 검출하였다. 구체적으로는, 동량의 단백질을 포함하는 각 세포의 추출물을 10% SDS-폴리아크릴아미드 겔로 전기영동한 후, 니트로 셀룰로오스막에 옮겼다. SV40 T 항원에 특이적으로 결합하는 마우스의 단일클론항체(IgG)를 결합시킨 후 퍼옥시다제가 접합된 항-마우스 IgG를 사용하여 발색시켰다.

결과는 도 5에 나타내었다.

도 5에 나타난 바와 같이, 웨스턴 블롯 결과 ADSC-T 의 3개의 세포(B, C, D)에서 양성 대조군인 COS-1(E) 세포처럼 T 항원이 발현됨을 확인할 수 있었으며, 음성 대조군인 일차 지방유래 줄기세포(primary ADSC)는 T 항원이 발현되지 않음을 확인하였다(A).

상기 결과로부터, 분리된 ADSC-T 세포주는 T 항원을 안정적으로 발현하고 있었으며, T 항원에 의해 세포증식이 증가되었고, 세포의 형태가 변화되었음을 알 수 있었다.

< 실시예 4> SV40 T 항원에 의해 수립된 ADSC -T 세포의 증식속도

SV40 T 항원에 의해 수립된 ADSC-T 와 일차 지방유래 줄기세포(primary ADSC)의 세포 증식 속도를 측정하여 비교하였다. 세포배양 시 세포의 밀도가 80%가 되었을 경우 계대배양을 시행하였고, 매 계대마다 세포를 계수하여 세포증식곡선(cell growth curve)을 작성하여 비교하였다.

결과는 도 6에 나타내었다.

도 6에 나타난 바와 같이, 일차 지방유래 줄기세포(primary ADSC)는 약 6-7일 간격으로 한 번씩 세포분열을 하는 반면, 3개의 ADSC-T 의 세포는 모두 약 2일에 한 번씩 세포분열을 하는 것으로 나타났다. 또한 일차 지방유래 줄기세포(primary ADSC)의 경우 증식 속도가 점점 떨어져 사멸하는 현상을 나타내었지만, ADSC-T 의 경우에는 3개의 세포주간에 약간의 차이는 있었으나 전체적으로 세포의 수명이 길어지고 빠른 증식속도를 나타내었다. 이러한 증식속도 향상은 약 6개월(50 계대)까지 계속되었고, 이후에는 세포의 증식속도가 떨어지는 양상을 나타내었다.

< 실시예 5> ADSC -T 세포 배양액의 모발 증식 효과 검증

ADSC-T 세포 배양액의 모발 증식 효능을 알아보기 위하여, 암컷 C57BL/6 마우스를 사용하여 동물실험을 수행하였다. 구체적으로는, 6주령의 C57BL/6 마우스 배부의 털을 동물용 클리퍼(clipper)를 사용하여 1차 제모하였으며, 2차적으로 일반 제모약을 사용하여 남아있는 털을 2-3분간 제모하여 나머지 털을 완전히 제거하고 깨끗이 닦아주었다. 실험군으로는 ADSC-T 의 배양액을, 대조군으로는 생리식염수를 사용하였다. 실험에 사용한 마우스는 총 12마리로, 각 군당 마우스를 6마리씩 할당하였다. 실험액의 피부 도포는 제모 후 다음날부터 매일 오전 11시에 제모한 배부에 매회 150㎕씩 점적한 후 소독한 면봉을 사용하여 마사지하듯 1회씩 도포하여 3주간 실험하였다.

ADSC-T 는 각 1x10⁵cell/ml로 세포 배양하였으며, 세포의 밀도가 80%가 되고나서 2일 후 배양액을 수거하였다. 수거한 배양액은 800G에 3분간 원심 분리하여 세포의 잔사를 제거하고 상등액만 수득하였으며, 이렇게 수득된 배양 상등액을 실험에 사용하였다.

발모상태를 확인하기 위하여, 실험개시 후 6일 간격으로 에테르(ether)를 사용하여 마우스에 가볍게 흡입마취한 후, 마우스의 배부를 육안으로 관찰하였다.

마우스의 제모한 배부에서 모발 증식 효과를 육안적으로 관찰한 결과는 도 7 에 나타내었으며, 푸른 반점이 나타나기까지 소요된 일자는 도 8에 나타내었다.

도 7에 나타난 바와 같이, 지방유래 줄기세포(ADSC-T)의 배양액을 도포한 실험군의 경우, 도포 후 4일 만에 1마리의 배부가 분홍색에서 푸른색의 반점이 나타났으며 피부색이 변하는 것을 확인하였다. 도포 후 5일째에는 3마리의 마우스에서 피부색이 변하였고, 6일째에는 1마리, 7일째에는 1마리로 일주일 만에 실험군 6마리 모두 배부에 푸른색의 반점이 나타나 피부색이 변하는 것을 확인하였다. 반면, 대조군으로 생리식염수를 도포한 경우, 4일째에 1마리의 마우스에서 피부색이 변화하였고, 8일째에 또 다른 1마리의 마우스에서 피부색이 변하였으며, 10일째에 1마리, 13일째에 2마리, 15일째 1마리로 2주의 기간이 경과되어서야 모든 대조군의 마우스의 배부색이 변하는 것을 확인하였다.

또한 도 8에 나타난 바와 같이, ADSC-T 의 배양액을 도포한 실험군의 마우스 배부에 나타난 푸른 반점은 시간이 지날수록 색이 검은색으로 바뀌면서 모발이 자라나는 것을 확인할 수 있었으며, 12일 경과 후 절반인 3마리의 마우스 배부의 색이 검은색으로 변하여 모발이 자라기 시작하였고, 나머지 3마리의 마우스는 푸른 반점 부위가 넓어지고 푸른색의 농도가 더 짙어졌다. 약 3주가 지났을 무렵에는 6마리 모두 제모 부위에 모발이 자라 모발 증식 효과가 있음을 확인할 수 있었다.

반면, 대조군의 경우 2주 후에 모든 마우스의 배부에 푸른색의 반점이 나타났지만, 처음으로 푸른 반점이 나타난 1마리의 마우스를 제외하고는 3주간의 기간에도 마우스의 배부 색이 검은색으로 변하지 않았으며 모발이 자라지 않았다. 단 맨 처음 반점이 나타난 마우스의 경우 15일째에 배부 색이 검은색으로 변하며 모발이 자라기 시작하였다.

상기 결과에 의해, ADSC-T 세포의 배양액을 도포한 마우스는 모두 제모한 배부의 피부색이 분홍색에서 검은색으로 변하면서 모발이 자라나는 것을 확인하였다. 따라서, 본 발명의 ADSC-T 세포의 배양액은 모발 증식 효과를 지니고 있음을 알 수 있다.

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SV 40의 T 항원을 발현하는 지방유래 줄기세포의 배양액을 유효성분으로 포함하는 발모촉진용 약학 조성물.
SV 40의 T 항원을 발현하는 지방유래 줄기세포의 배양액을 유효성분으로 포함하는 발모 촉진용 화장료 조성물.