KR101327076B1 - 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포로부터 연골, 골, 신경세포 또는 지방세포를 분화시키는 방법 - Google Patents

사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포로부터 연골, 골, 신경세포 또는 지방세포를 분화시키는 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포로부터 골, 연골 또는 신경세포로 분화를 유도하는 방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로 본 발명은 사람 하비갑개 조직에서 분리한 중간엽 기질세포를 성장인자가 포함된 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포로부터 골, 연골, 신경세포 또는 지방세포로 분화를 유도하는 방법 및 상기 방법으로 분화된 세포를 유효성분으로 포함하는 연골손상 질환, 뼈 손상 또는 골대사성 질환, 또는 신경손상 질환의 예방 또는 치료용 조성물에 관한 것이다. 본 발명에 따라 사람 하비갑개 유래의 중간엽 기질세포로부터 분화된 골, 연골, 신경세포 또는 지방세포는 상기 세포들의 손상으로 야기되는 질환을 치료하기 위한 세포 대체 요법 및 재생의학 분야에 사용될 수 있는 효과가 있고, 본 발명에서 사용하는 사람 하비갑개 조직은 하비갑개 수술 과정에서 폐기 처리되는 조직을 사용한 것으로서 용이하게 세포 공급원을 수득할 수 있는 장점이 있다.

Description

사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포로부터 연골, 골, 신경세포 또는 지방세포를 분화시키는 방법{Method of inducing chondrogenic, osteogenic, neurogenic or adipocytic differentiation of human turbinate mesenchymal stromal cells}
본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포로부터 연골세포, 골세포, 신경세포 또는 지방세포를 분화시키는 방법 및 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포로부터 분화된 연골세포, 골세포, 지방세포 또는 신경세포를 유효성분으로 포함하는 약학적 조성물에 관한 것이다.
의학의 발달에 따라 질병이나 외상에 의해 기능이 소실된 조직이나 장기를 유사한 자가조직이나 기능이 동일한 장기로 대체하는 시술법이 개발되어 왔지만 이는 공여부 결손의 문제를 일으킨다. 최근에 이러한 문제를 해결하기 위해 공여부에서 소량의 세포를 얻어 세포배양기술을 이용해 증식시켜 이식하는 조직공학기법이 장기이식이나 조직이식을 대신할 수 있는 방법으로 시도되고 있다.
인체의 지지구조인 연골은 복원이나 재생 능력이 매우 낮아 선천적이나 후천적으로 손상된 연골조직의 재건에 연골세포의 배양을 통한 치료방법이 개발되고 있다. 특히 연골은 동질성 연골세포의 무혈관조직으로 실험실내 세포분리 및 배양이 비교적 용이하고 세포분화의 연구에 유리한 조건을 가지고 있어 재생된 조직의 연구에 대한 모델이 되어 왔다. 작은 크기의 연골은 신체의 여러 곳에서 쉽게 얻을 수 있는데, 특히 비중격연골은 유리연골(hyaline cartilage)로서 공여부의 큰 합병증 없이 얻을 수 있고 조직공학기법으로 배양 증식되었을 때 원래의 연골조직과 가장 유사한 강도나 조직학적 조밀성을 보인다. 그러나 이러한 성체 세포 역시 공여가 제한되어 있어 이를 대신하기 위해 줄기세포를 이용한 연구가 시도되고 있다.
인체의 골격을 이루는 골조직의 결손이나 재건을 위해 90%이상에서 자가골편(autograft) 이식이나 동종골편(allograft) 이식이 이용되고 있고, 약 10% 정도에서 천연소재나 합성 생체재료(biomaterial)가 이용되는데, 이식된 골편들은 결손된 골 부위를 재건하기에 적합할 수 있지만 사용의 제한점이 있다. 자가골편 이식의 경우 공여부위의 제한과 공여부위의 결손으로 인한 부작용이 있게 되며, 동종골편 이식의 경우에는 보다 쉽게 골 이식편을 얻을 수 있지만 생물학적으로 활성이 없는 골편을 이용하게 되며 공여자로부터 질병 전염의 가능성과 면역 거부반응을 경험할 수 있다. 그리고, 동종골편 이식과 함께 흔히 사용되는 생체재료들은 많은 양을 사용할 수 있고 조직이 자라 들어올 수 있는 지지체 역할을 하지만, 활성을 지닌 세포들이 없기 때문에 인체 골격 구조의 재생이라는 역할에는 한계가 있다.
최근에 이러한 문제를 해결하기 위해 공여부에서 소량의 세포를 얻어 세포배양기술을 이용해 증식시켜 이식하는 조직공학 기법이 장기이식이나 조직이식을 대신할 수 있는 방법으로 시도되고 있다. 결손된 골조직을 재건하기 위한 세포의 공급원으로 골모세포(osteoblast)를 이용하는 것은 골모세포를 분리하고 실험실 내에서 증식시키는 것이 어려워 골 재생을 위한 세포의 공급원으로는 적당하지 않다. 이와 같은 이유로 골모세포와 유사한 기능을 할 수 있는 대체 세포 공급원의 필요성이 대두되면서, 줄기세포의 특성을 갖는 중간엽 기질세포를 세포 공급원으로 이용한 골 조직공학에 대한 연구가 시도되고 있다.
줄기세포의 특성을 갖는 중간엽 기질세포(mesenchymal stromal cell)는 성체조직인 골수, 흡입된 지방조직 등에서 얻을 수 있으며 다양한 종류의 세포로 분화할 수 있어 조직공학과 재생의학의 영역에서 많은 연구가 이루어지고 있다. 골수유래 중간엽 기질세포는 다양한 세포로의 분화를 위한 가장 좋은 재료이나 획득이 어렵고 골수 조성의 일부분 만이 중간엽 줄기세포의 특성을 갖는 중간엽 기질세포이므로 임상적 이용을 위해서는 더 많은 연구가 필요하다.
한편, 최근에는 중간엽 기질세포의 공여부위로 지방조직에 대한 연구도 활발히 진행되고 있는데, 사람의 피하지방조직에서 분리된 중간엽 기질세포를 이용한 실험에서 알지네이트를 지지체로 연골화 분화를 유도하는 삼차원배양을 한 후 II형과 VI형 아교질, chondroitin 4-sulfate 등과 같은 연골특이기질들을 만드는 기술도 개발되었으나, 골수유래 중간엽 기질세포와 비교했을 때 연골특이기질의 생성 정도가 낮고, 쉽게 수득할 수 없어 줄기세포의 특징을 갖는 중간엽 기질세포의 공급원 및 이를 이용한 다분화능의 연구가 필요한 실정이다.
이에 본 발명자들은 다분화능을 갖는 새로운 중간엽 기질세포의 공급원을 찾던 중, 폐기 조직의 재활용의 관점에서 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 이용하게 되었고, 이러한 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 의료학적 용도로 사용할 수 있는 연골, 골, 지방세포 또는 신경세포로 분화시킬 수 있는 조건을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.
따라서 본 발명의 목적은 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 신경성장인자가 포함된 배지(medium)에서 배양하는 단계를 포함하는 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 연골세포, 골세포 또는 신경세포로 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포로부터 분화된 연골세포, 골세포 또는 신경세포를 유효성분으로 포함하는 골, 연골 또는 신경손상 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 분리된 사람 하비갑개 조직으로부터 중간엽 기질세포를 분리하는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 지방세포 분화배지에서 배양하는 단계를 포함하는 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 지방세포로 분화시키는 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포로부터 분화된 지방세포를 포함하는 피부조직 재생을 위한 지방세포 이식용 조성물을 제공하는 것이다.
상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 TGF(transforming growth factor)-β1 또는 IGF(insulin like growth factor)-I 이 첨가된 연골분화 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포(human turbinate mesenchymal stromal cells, hTMSCs)를 연골세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배지는 덱사메타손(dexamethasone), 아스코르브산(ascorbate), 인슐린-트랜스퍼린 소듐 셀레니트(insulin-transferrin sodium selenite), 피루브산 나트륨(sodium pyrubate), 프롤린(proline) 및 L-글루타민(glutamine)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배양은 사람 비중격 연골에서 분리 배양한 비중격 연골세포와 공배양(co-culture)하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 연골세포로 분화시키는 방법으로 분화된 연골세포를 함유하는 연골손상 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 연골손상 질환은 퇴행성 관절염 또는 류마티스성 관절염일 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 연골세포로 분화시키는 방법으로 분화된 연골세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 인공관절의 제조방법을 제공하며, 상기 방법으로 제조된 인공관절을 제공한다.
또한, 본 발명은 소태아형청(FBS)이 포함되지 않은 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포(human turbinate mesenchymal stromal cells, hTMSCs)를 골세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 배지는 페니실린, 스트렙토마이신(streptomycin), 덱사메타손(dexamethasone), 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate) 및 아스코르브산-2-인산염(ascorbate-2-phosphate)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명에 따른 골세포로 분화시키는 방법을 통해 분화된 골세포를 함유하는 뼈 손상 질환 또는 골대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 GDNF (Glial-derived neurotrophin factor), BDNF (Brain-derived neurotrophin factor), NT3 (Neurotrophin-3), B-27 첨가물 및 L-글루타민(glutamin)을 포함하는 신경분화 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포(human turbinate mesenchymal stromal cells, hTMSCs)를 신경세포로 분화시키는 방법을 제공하며, 상기 신경세포로 분화시키는 방법을 통해 분화된 신경세포를 함유하는 신경 손상 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 인슐린, 인도메타신(indomethacin), 덱사메타손(dexamethasone), 3-이소부틸-1-메틸산틴(3-isobutyl-1-methylxanthine) 및 소태아혈청(FBS)이 첨가된 지방세포분화 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 지방세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
또한, 본 발명은 상기 본 발명의 방법으로 분화된 지방세포를 포함하는 피부조직 재생을 위한 지방세포 이식용 조성물을 제공한다.
나아가 본 발명은 분리된 사람의 하비갑개 조직을 절단한 후, 배양 접시에 상기 하비갑개 조직을 유착시켜 배양한 다음, 부착되지 않은 세포들은 제거하고, 상기 접시에 부착된 사람 하비갑개 유래의 중간엽 기질세포를 수득하는 단계를 포함하는 분리된 사람 하비갑개 조직으로부터 중간엽 기질세포를 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포는 골, 연골 또는 신경세포로의 다분화될 수 있는 능력이 있음을 확인함으로써 본 발명에 따라 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포로부터 분화된 골, 연골 또는 신경세포는 상기 세포들의 손상으로 야기되는 질환을 치료하기 위한 세포 대체 요법 및 재생의학 분야에 사용될 수 있는 효과가 있고, 본 발명에서 사용하는 사람 하비갑개 조직은 하비갑개 수술 과정에서 폐기 처리되는 조직을 사용함으로써 용이하게 세포 공급원을 수득할 수 있는 장점이 있다.
도 1은 1차 체외배양(explants culture) 2주 후의 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포의 사진을 나타낸 것이다.
도 2는 2주의 배양 동안 hTMSCs-접종PCL 스캐폴드(scaffold) 산물의 조직학적 조사 결과를 나타낸 것으로서, hTMSCs 의 미세혹-유사(Micronodule-like) 콜로니들이 PCL 스캐폴드의 공간(pore) 안에 산재해 있으며, A: H&E 염색. B: 톨루이딘 블루-O (Toluidine blue-O) 염색. C: 타입 II 콜라겐에 대한 면역형광 염색을 나타낸 것이다.
도 3은 2주간의 배양 동안 hTMSCs 및 hSCs-접종 PCL 스캐폴드 산물의 조직학적 조사 결과를 나타낸 것으로서, 혼합된 hTMSCs 및 세포외 구조를 포함한 연골세포들이 PCL 스캐폴드의 포어(pore) 안으로 산재해 있고, A: H&E 염색. B: 톨루이딘 블루-O (Toluidine blue-O) 염색. C: 타입 II 콜라겐에 대한 면역형광 염색을 나타낸 것이다.
도 4는 2주간의 배양 동안 hSCs-접종 PCL 스캐폴드 산물의 조직학적 결과를 나타낸 것이며, A: H&E 염색. B: 톨루이딘 블루-O (Toluidine blue-O) 염색. C: 타입 II 콜라겐에 대한 면역형광 염색을 나타낸 것이다.
도 5는 2주째 hTMSCs 및/또는 hSCs-접종 PCL 스캐폴드 산물 내의 타입 II 콜라겐(collagen) 및 어그레칸(aggrecan) mRNA 발현의 RT-PCR 분석을 나타낸 것이다.
도 6은 접종 2주 후에 실시간(real time) PCR을 이용하여 타입 II 콜라겐 mRNA 수준들을 나타낸 것이다.
도 7은 배양 2주간 hTMSCs-접종 PCL 스캐폴드 산물로부터의 연골 특이적 타입 II 콜라겐을 면역블럿 방법을 통해 확인한 결과를 나타낸 것이다.
도 8은 골 세포 분화된 hTMSCs 에서 타입 I 콜라겐, bone sialoprotein(BSP), Runt-related transcription factor 2(Runx2), bone morphogenetic protein-2(BMP-2), osterix(Osx), 및 osteocalcin(OC)의 mRNA 발현정도를 RT-PCR 분석을 통해 수득한 결과를 나타낸 것이다.
도 9는 hTMSCs의 골 세포 분화를 나타낸 것으로서, A: 배양 1주째 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase) 염색. B: 배양 1주째 알리자린 레드(alizarin red) 염색. C: 배양 2주째 알칼리 포스파타아제 염색. D: 배양 2주째 알리자린 레드 염색을 나타낸 것이다.
도 10은 배양 14일째 hTMSCs의 신경세포 분화를 나타낸 것이다.
도 11은 hTMSCs의 형광-활성 세포 분류(Fluorescence-activated cell sorting (FACS)) 분석을 나타낸 것이다.
도 12는 hTMSCs의 지방세포로의 분화를 Oil Red 염색을 통해 관찰한 사진을 나타낸 것이다.
본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 골, 연골 또는 신경세포 분화용 배지(medium)에서 배양하는 단계를 포함하는, 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 골, 연골 또는 신경세포로 분화시키는 방법을 제공함에 그 특징이 있다.
본 발명에서 각 세포로 분화하기 위해 사용한 사람 하비갑개는 사람의 코 안에 존재하는 조직으로서 내부에 망상의 정맥동이 다량 분포하고 이들 주위에 중간엽 기질세포가 다수 존재하는 점막하 조직이 풍부한 조직으로서, 코막힘 증상의 개선을 위해 이비인후과 영역에서 시행되는 하비갑개 부분 절제술의 과정에서 수득한 것을 사용할 수 있다.
또한, 수술실이 아닌 이비인후과 외래에서 환자의 통증 없이 짧은 시간 내에 쉽게 조직을 생검한 것을 사용할 수 있다.
그러므로 본 발명은 증상의 완화를 목적으로 인체의 해부학적 구조를 개선하기 위해 시행 되어지는 많은 수술 과정 중 제거되어 폐기되는 조직을 이용하여 자가 공여와 이식을 위한 재료를 제공할 수 있으며, 폐기 조직의 재활용 및 이를 이용한 환자의 맞춤형 조직 및 세포 은행의 확립에 기여할 수 있는 특징이 있다.
이에 본 발명자들은 사람의 하비갑개 조직에서 중간엽 기질세포를 분리하여 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포(human turbinate mesenchymal stromal cells, hTMSCs)가 연골, 골 및 신경세포로 분화가능한지를 조사하였다.
먼저, 사람 하비갑개 조직으로부터 분리한 중간엽 기질세포에 대해 상기 중간엽 기질세포가 연골로 분화될 수 있는지를 확인하기 위해, 본 발명의 일실시예에서는, TGF-β1 및 IGF-I의 성장인자가 첨가된 배양 배지에 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 배양한 결과, 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포들이 연골 특이적인 기질을 생성해낸 다는 사실을 Toluidine blue 염색 및 type II 콜라겐에 대한 면역조직염색 방법, RT-PCR 방법을 통해 확인할 수 있었다.
또한, 사람 하비갑개 조직으로부터 분리한 중간엽 기질세포와 증식이 느리고 연골특이 세포외기질을 많이 생산해 내는 것을 알려진 사람 비중격 연골세포를 공배양하여 연골의 분화를 조사한 결과, 이 또한 연골 특이적인 기질을 생성하는 것으로 나타났다(도 2 내지 도 5 참조).
그러므로 본 발명은 TGF(transforming growth factor)-β1 또는 IGF(insulin like growth factor)-I 이 첨가된 연골분화 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포(human turbinate mesenchymal stromal cells, hTMSCs)를 연골세포로 분화시키는 방법을 제공할 수 있으며, 상기 배양에 사용되는 배지는 TGF(transforming growth factor)-β1 또는 IGF(insulin like growth factor)-I 이 외에도 덱사메타손(dexamethasone), 아스코르브산(ascorbate), 인슐린-트랜스퍼린 소듐 셀레니트(insulin-transferrin sodium selenite), 피루브산 나트륨(sodium pyrubate), 프랄린(praline) 및 L-글루타민(glutamine)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상을 더 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에서 사용한 상기 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포는 하비갑개 조직을 세척 및 절단 등의 방법을 이용하여 분리하고, 이를 중간엽 기질세포 배양용 배지에서 배양함으로써 수득할 수 있으며, 상기 분리한 중간엽 기질세포는 2~5회, 바람직하게는 3~4회, 더욱 바람직하게는 3회 계대 배양한 것을 사용할 수 있다.
따라서 본 발명은 분리된 사람의 하비갑개 조직을 절단한 후, 배양 접시에 상기 하비갑개 조직을 유착시켜 배양한 다음, 부착되지 않은 세포들은 제거하고, 상기 접시에 부착된 사람 하비갑개 유래의 중간엽 기질세포를 수득하는 단계를 포함하는 분리된 사람 하비갑개 조직으로부터 중간엽 기질세포를 분리하는 방법을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 연골세포로 분화시키는 방법은 먼저, 하비갑개로부터 중간엽 기질세포를 분리시키고, 분리된 중간엽기질세포를 세포가 자라는 배양 배지에 연골성장인자를 처리함으로써 연골세포로 분화시킬 수 있으며, 또한, 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 사람 비중격 연골에서 분리 배양한 비중격 연골세포와 공배양(co-culture)하여 연골세포로 분화를 촉진시킬 수 있다.
상기 하비갑개 유래 중간엽 기질세포는 당업계에 공지된 중간엽 기질세포 분리 방법이라면 모두 사용 가능하다. 일실시예로서, 척추동물로부터 채취한 세포를 밀도 구배 원심분리를 수행하여 세포 분획을 회수한 후, 중간엽 기질세포만을 분리하여 이를 배양함으로써 수득할 수 있다. 이때 상기 밀도 구배 원심분리는 일정한 비중을 가지는 세포 분획만을 수득할 수 있는 방법으로서, 밀도 구배 원심을 위한 용액, 예를 들면, 피콜(ficol), 퍼콜(percol) 및 히스토페이크(histopaque)와 같은 용액 내에서 세포가 그 비중에 상응한 위치를 차지하는데 충분한 시간동안 일정한 속도로 회전시키는 과정을 말한다.
상기와 같은 방법으로 수득한 하비갑개 유래 중간엽 기질세포는 이후 세포가 자라는 배양배지에 연골성장인자를 처리하고 배양함으로써 연골세포로 분화시킬 수 있다.
상기에서 배양배지는 통상적으로 사용하는 동물세포 배양용 배지라면 모두 사용가능하며, 이에 제한되지는 않으나, DMEM, 알파-DMEM, 이글스 기본 배지(Eagle's basal mediu,), RPMI 1640 배지, NPBM(Neural progenitor cell basal medium: SClonetics) 등을 사용할 수 있다.
연골은 인체 조직 중 체중의 부하가 가장 큰 조직으로 마모로 인한 손상에 쉽게 노출된다. 관절 연골은 유리 연골(hyaline cartilage)로서 연골세포와 풍부한 세포외기질로 이루어져 있다. 연골세포는 연골 총부피의 10% 미만을 차지하고 있으며, 세포외기질을 합성 및 분비하므로 관절 연골의 유지에 중요한 역할을 한다. 또한, 특이하게 관절 연골은 혈관, 신경 및 임파 조직이 없으므로 손상 후 스스로 재생이 불가능한 조직이다. 현재의 의학적 방법으로는 관절 연골을 정상적으로 재생할 수 있는 방법이 매우 제한적이다. 자가 연골세포 이식법에 의한 연골조직의 재생이 최근 시도되어 임상적으로 매우 효과적인 수술법으로 알려지고 있으나 연골의 광범위한 손상 부위에는 사용할 수 없다는 것, 관절 연골의 손상 위치, 환자의 나이 등에 따라 제한점을 가지고 있다.
따라서 최근에는 이와 같은 문제점을 해결하고 보다 안전한 수술 방법을 개발하고자 하는 노력에 의해 연골의 조직공학적 재생(kang et al. Tissue Engineering , 11(3-4), pp.438-447, 2005)방법에 개발되었으며, 이러한 인공연골의 제작에 관한 연구는 현재 외국에서 활발하게 수행 중에 있다. 특히, 줄기세포에서 분화된 연골세포의 조직공학적 관절연골 제작은 연골세포화된 줄기세포 및 생분해성 지지체가 필수적이다. 또한, 연골 세포화된 줄기세포는 골수로부터 단일핵 세포를 분리 후 배양하면서 연골세포로 분화를 유도하며, 이상적인 연골세포는 증식능력이 좋아야 하며, 연골세포의 특이 표현형인 콜라겐 타입(collagen type) II를 유지하는 세포이다.
한편, 본 발명의 방법으로 제공될 수 있는 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포는 연골세포로의 분화가 가능하며, 증식력도 우수하고 연골세포 특이적인 콜라겐 타입(collagen type) II를 유지하므로 연골손상 등을 치료하기 위한 세포대체요법용 세포 조성물의 유효성분으로 이용될 수 있다.
따라서 본 발명은 본 발명의 방법으로 분화된 연골세포를 유효성분으로 함유하는 연골 손상 질환 치료용 조성물을 제공할 수 있으며, 상기 연골손상 질환으로는 이에 제한되지는 않으나, 퇴행성 관절염, 류마치스성 관절염 및 외상이 포함될 수 있다.
본 발명의 방법에 의해 분화된 연골세포를 유효성분으로 하는 상기 조성물은 공지의 방법에 따라 환자의 관절 내로 직접 주입되거나, 3차원 배양 후 스캐폴드와 함께 이를 필요로 하는 부위에 이식될 수도 있으며(Kim, G. et al, J. Vet. Med. Sci., 66:263, 2004, Lee,J.W. et al., Yonsei Med. J., 30:41, 2004), 치료하고자 하는 질환, 질환의 중증도, 투여경로, 환자의 체중, 연령 및 성별 등의 여러 관련 인자를 고려하여 투여하는 세포 수를 조절하는 것이 바람직하다.
본 발명의 방법에 의해 분화된 연골세포를 일정한 형태의 스캐폴드(scaffold)에서 계속 배양하는 통상의 방법을 사용하여 일정 형태의 인공연골 또는 인공관절을 얻을 수 있으며, 이를 이용하여, 인공관절 또는 귀나 코 등 인체 특정 부위의 성형에 사용되는 인공연골을 제조할 수 있다.
따라서 본 발명은 본 발명의 방법에 의해 분화된 연골세포를 사용하는 것을 특징으로 하는 인공관절을 제조하는 방법을 제공할 수 있고, 상기 방법으로 제조된 인공관절을 제공할 수 있다.
또한, 본 발명자들은 본 발명에 따른 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포의 골 분화를 조사하였는데, 본 발명의 일실시예에 따르면, 사람 하비갑개 조직에서 분리한 중간엽 기질세포를 소태아혈청(FBS)이 없는 배지에서 배양하여 골분화를 유도한 결과, 알칼리 포스파타아제(alkaline phosphatase) 염색 및 알리자린 레드(Alizarin red) 염색을 통해 시행하여 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포가 골분화 되었음을 확인할 수 있었고, RT-PCR을 통해 골분화 특이 유전자인 type I collagen, bone sialoprotein(BSP), Runt-related transcription factor 2(Runx2), bone morphogenetic protein-2(BMP-2), osterix(Osx) 및 osteocalcin(OC) 유전자의 발현을 확인할 수 있었다(도 8 및 도 9 참조).
따라서 본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포(human turbinate mesenchymal stromal cells, hTMSCs)를 골 분화 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 골 세포로 분화시키는 방법을 제공할 수 있다.
상기 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 골세포로 분화시키는데 사용할 수 있는 배지로는 동물세포의 배양을 위해 사용하는 배지라면 모두 사용할 수 있으며, 이에 제한되지는 않으나, DMEM, 알파-DMEM, 이글스 기본 배지(Eagle's basal mediu,), RPMI 1640 배지, NPBM(Neural progenitor cell basal medium: SClonetics) 등을 사용할 수 있으며, 바람직하게는 소태아혈청(FBS)이 없는 DMEM 배지를 사용할 수 있다.
또한, 골 분화를 위해 사용하는 상기 배지에 페니실린, 스트렙토마이신(streptomycin), 덱사메타손(dexamethasone), 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate) 및 아스코르브산-2-인산염(ascorbate-2-phosphate)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상을 추가로 첨가하여 포함할 수 있다.
일반적으로 뼈 또는 골(bone)은 특별한 연결 조직으로 골격시스템을 형성하며 신체를 기계적으로 지지하고 근육활동과 운동을 용이하게 하며 내장기관을 보호한다. 골은 골격을 유지하고 장기를 보호하는 이외에 생화학적 대사를 조절하는 기관으로써 형성, 흡수, 역전, 형성의 단계가 계속 반복하는 활발한 대사가 일어나는 역동적인 기관이며(Raisv et al. Am J Med, 72; 193-202, 1982), 이러한 골 흡수(bone resorption)와 골 형성(bone formation)이 되풀이되는 과정을 골 개축(bone remodeling)이라 한다.
정상적인 경우, 인체에서 파골세포(osteoclast)가 활성화되어 골을 흡수하면서 파괴하면, 조골세포(osteoblast)가 새로운 골을 형성하면서 그 균형을 유지하는데(Roodman GD, Endocrinol Rev , 17, 308-332, 1996; Boyle W. J. et al., Nature, 423:337-342, 2003), 즉 상기 조골세포와 파골세포의 작용으로 인한 골 개축 시, 골 형성 양이 선행된 골 흡수 양과 일치하면 골 양의 소실이 없어 골의 양을 유지하게 된다. 그러나 어떤 이유로든지 골 형성량이 골 흡수량보다 적을 때(골 흡수가 증가하거나 또는 골 형성이 골 흡수보다 적을 때) 골량의 감소를 초래하게 되는데(Wasnich, R.D. Am J Med, 91; 54s-58s, 1991), 이러한 불균형은 골 질환을 유발하게 된다.
따라서 본 발명의 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포로부터 분화 유도된 골 세포는 골조직을 형성할 수 있으므로 뼈(골) 손상 질환 또는 골대사성 질환을 치료하기 위한 약학적 조성물로 사용될 수 있다.
본 발명에서 상기 "뼈(골) 손상 질환 또는 골대사성 질환"이란 골의 파괴 흡수가 과대하여 생리적 병리상태를 초래하는 질환을 말하며, 이러한 질환의 종류로는 이에 제한되지는 않으나, 골다공증, 유방암 또는 전립선암 등의 종양이 뼈로 전이된 뼈전이암 병소(bone metastatic lesion), 원발성(primary)으로 뼈에 생성된 종양, 치주질환, 염증성 치조골 흡수 질환, 염증성 뼈 흡수 질환 및 파게트 질병(Paget's disease)을 포함할 수 있다.
나아가 본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 신경분화 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 신경세포로 분화시키는 방법을 제공한다.
본 발명의 일실시예에 따르면, 사람 하비갑개 조직으로부터 분리된 중간엽 기질세포를 신경성장 인자인 GDNF, BDNF 및 NT3가 포함된 배지에서 배양한 결과, 면역형광염색법을 통해 신경세포로 분화됨을 확인할 수 있었다(도 10 참조).
본 발명에서 상기 신경세포 분화를 위해 사용할 수 있는 신경분화 배지는 통상적으로 사용하는 동물세포 배양용 배지라면 모두 사용가능하며, 신경성장인자들이 첨가된 배지를 사용할 수 있다.
상기 신경성장인자로는 이에 제한되지는 않으나, GDNF (Glial-derived neurotrophin factor), BDNF (Brain-derived neurotrophin factor) 또는 NT3 (Neurotrophin-3)을 포함할 수 있으며, 이 외에 B-27 첨가물 또는 L-글루타민(glutamin)을 포함할 수 있다.
상기와 같이, 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포가 신경세포로 분화가 가능하다는 사실을 통해 본 발명은 상기 본 발명의 방법으로 분화 유도된 신경세포를 유효성분으로 함유하는 신경 손상 질환의 예방 또는 치료용 조성물을 제공할 수 있다.
상기 신경 손상 질환으로는 이에 제한되지는 않으나, 척수손상(spinal cord injury), 파킨슨씨병, 알츠하이머, 헌팅톤병(Huntington's disease) 및 외상성 중추 신경계 질환(traumatic central nervous system diseases) 등과 같은 퇴행성 신경질환을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 연골손상 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 뼈 손상 질환 또는 골대사성 질환의 예방 또는 치료용 조성물, 및 신경 손상 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 약학적으로 유효한 양의 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포로부터 분화 유도된 연골세포, 골세포 또는 신경세포를 단독으로 포함하거나 하나 이상의 약학적으로 허용되는 담체, 부형제 또는 희석제를 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 유효한 양"이란 상기 질환을 예방, 개선 및 치료하기에 충분한 양을 말한다.
본 발명에 따른 상기 조성물에 함유된 유효성분인 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포로부터 분화된 연골세포, 골세포 또는 신경세포의 약학적으로 유효한 양은 0.5 ~ 100 mg/day/체중kg, 바람직하게는 0.5 ~ 5 mg/day/체중kg이다. 그러나 상기 약학적으로 유효한 양은 상기 질환의 증상 정도, 환자의 연령, 체중, 건강상태, 성별, 투여 경로 및 치료기간 등에 따라 적절히 변화될 수 있다.
나아가 본 발명자들은 앞서 수행한 실험들을 통해 본 발명의 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포가 연골세포, 골세포 및 신경세포로 모두 분화가 잘 이루어진다는 사실을 확인하였는데, 일반적으로 당업계에서 공론화된 중간엽 기질세포의 다분화능은 연골분화 및 골분화 뿐만 아니라 지방분화의 3가지 분화가 조직학적으로 관찰되는지의 여부를 통해 이를 인정하고 있다.
이에 사람 하비갑개로부터 유래된 중간엽 기질세포가 지방세포로 분화가 이루어지는지를 관찰하였는데, 그 결과, 본 발명의 일실시예에 따른 실험을 통해 지방세포로 분화가 일어나는 사실을 확인할 수 있었다.
따라서 본 발명은 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 지방세포 분화 배지에서 배양하는 단계를 포함하는 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 지방세포로 분화시키는 방법을 제공할 수 있다.
본 발명에 따른 상기 지방세포로의 분화 방법은 본 발명에서 분리한 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 인슐린, 인도메타신(indomethacin), 덱사메타손(dexamethasone), 3-이소부틸-1-메틸산틴(3-isobutyl-1-methylxanthine) 및 소태아혈청(FBS)이 첨가된 지방세포분화 배지에서 배양하는 단계를 포함할 수 있으며, 바람직하게는 5~15/ml 인슐린, 150~250인도메타신(indomethacin), 0.05~1.5덱사메타손(dexamethasone), 0.2~0.73-이소부틸-1-메틸산틴(3-isobutyl-1-methylxanthine) 및 5~15% 소태아혈청(FBS)이 첨가된 α-MEM 배지에서 2~4주간 배양시켜 분화시킬 수 있다.
이와 같이, 본 발명의 방법으로 분화된 지방세포는 피부조직 재생을 위한 지방세포 이식용 조성물의 용도로 사용될 수 있다.
현재 지방세포의 자가이식은 널리 행해지고 있는데, 특히 지방이식은 나이로 인하여 노화된 피부의 주름 개선을 비롯하여, 입술선, 턱선, 이마선의 교정, 코 성형 등에 사용되고 있으며, 화상이나 상처로 인하여 함몰된 피부, 암 절제 수술로 상실된 부분 등에도 지방을 이식함으로써 결함 부위를 교정하는 수술로서 좋은 성과를 보이고 있다.
한편, 이러한 지방이식은 지방 덩어리로부터 섬유질, 혈액 등을 제거한 지방세포를 이용하여 이식을 하고 있으나 아직까지 그 효과가 만족스럽지 못한 실정이다(G Sattler et al., 2000, Dermatol. Sur. 26, 1140-1144).
따라서 본 발명은 지방조직이 아닌 사람 하비갑개 조직으로부터 분리한 중간엽 기질세포에서 분화된 지방세포를 이식을 위한 세포로 사용할 수 있으므로 이식으로 인한 목적하는 효과를 충분히 달성할 수 있다.
뿐만 아니라 본 발명에 따라 분화된 지방세포는 피부 탄력을 높이고, 주름 특히 얼굴의 팔자 주름 및 미간주름과 피부 처짐을 개선하며, 함몰부위를 성형을 통해 복구하도록 하기 위한 미용의 목적으로도 사용할 수 있으며, 유방 조직 형성 등에도 유용하게 사용할 수 있다.
또한, 본 발명에서 언급된 상기 조성물은 약학적으로 허용되는 담체를 추가로 포함할 수 있다. 상기에서 "약학적으로 허용되는"이란 생리학적으로 허용되고 인간에게 투여될 때, 통상적으로 위장 장애, 현기증 등과 같은 알레르기 반응 또는 이와 유사한 반응을 일으키지 않는 조성물을 말한다. 약학적으로 허용되는 담체로는 예를 들면, 락토스, 전분, 셀룰로스 유도체, 마그네슘 스테아레이트, 스테아르산 등과 같은 경구 투여용 담체 및 물, 적합한 오일, 식염수, 수성 글루코스 및 글리콜 등과 같은 비경구 투여용 담체 등이 있으며 안정화제 및 보존제를 추가로 포함할 수 있다. 적합한 안정화제로는 아황산수소나트륨, 아황산나트륨 또는 아스코르 브산과 같은 항산화제가있다. 적합한 보존제로는 벤즈알코늄 클로라이드, 메틸- 또는 프로필-파라벤 및 클로로부탄올이 있다. 그 밖의 약학적으로 허용되는 담체로는 다음의 문헌에 기재되어 있는 것을 참고로 할 수 있다(Remington's Pharmaceutical Sciences, 19th ed., Mack Publishing Company, Easton, PA, 1995).
본 발명에 따른 조성물은 상술한 바와 같은 약학적으로 허용되는 담체와 함께 당업계에 공지된 방법에 따라 적합한 형태로 제형화 될 수 있다. 즉, 본 발명의 조성물은 공지의 방법에 따라 다양한 비경구 또는 경구 투여용 형태로 제조될 수 있으며, 비경구 투여용 제형의 대표적인 것으로는 주사용 제형으로 등장성 수용액 또는 현탁액이 바람직하다. 주사용 제형은 적합한 분산제 또는 습윤제 및 현탁화제를 사용하여 당업계에 공지된 기술에 따라 제조할 수 있다. 예를 들면, 각 성분을 식염수 또는 완충액에 용해시켜 주사용으로 제형화될 수 있다. 또한, 경구 투여용 제형으로는, 이에 한정되지는 않으나, 분말, 과립, 정제, 환약 및 캡슐 등이 있다.
상기와 같은 방법으로 제형화된 조성물은 유효량으로 경구, 경피, 피하, 정맥 또는 근육을 포함한 여러 경로를 통해 투여될 수 있다. 상기에서 '유효량' 이란 환자에게 투여하였을 때, 예방 또는 치료 효과를 나타내는 양을 말한다. 본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여량은 투여 경로, 투여 대상, 연령, 성별 체중, 개인차 및 질병 상태에 따라 적절히 선택할 수 있다. 바람직하게는, 본 발명의 약학적 조성물은 질환의 정도에 따라 유효성분의 함량을 달리할 수 있으나, 바람직하게는 1~10000㎍/체중kg/day, 더욱 바람직하게는 10~1000㎎/체중kg /day의 유효용량으로 하루에 수회 반복 투여될 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 연골세포, 골세포 또는 신경세포의 손상과 관련된 질환의 예방 또는 치료용 조성물은 상기 질환을 예방, 개선 또는 치료하는 효과를 가지는 공지의 화합물과 병행하여 투여할 수도 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1>
사람하비갑개 유래 중간엽 기질세포( human turbinate mesenchymal stromal cells , hTMSCs )의 연골 분화유도
hTMSCs의 연골분화를 위해 일반적으로 이용되는 연골 분화의 표준성장인자인 TGF-β1 및 IGF-I을 사용하였고, 증식(proliferation)이 빠른 사람의 하비갑개 유래 중간엽 기질세포와 증식이 느리고 주로 연골특이 세포외기질(cartilage specific extracelular matrix)을 많이 생산해 내는 사람 비중격 연골세포의 특성을 이용하여, 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 동일인의 비중격 연골에서 분리 배양한 비중격 연골세포와 공배양(co-culture) 시켜 연골화 분화의 효율성을 높이는 실험을 동시에 진행하였으며, 접종 비율과 배양기간에 따른 세포의 성상 및 생성되는 세포외기질의 조직학적 형태를 관찰하고 type II 콜라겐과 에그레칸(aggrecan) 등과 같은 연골특이적 기질성분의 생성을 확인함으로써 이 세포들의 임상적 이용을 위한 최적의 배양조건을 다음과 같은 실험을 통해 확인하였다.
<1-1> 연골분화를 위한 배지 제조
10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media, Gibco)에 10-7M 덱사메타손(dexamethasone), 50㎍/㎖ 아스코르브산(ascorbate), 50 ㎎/㎖ Insulin-transferrin sodium selenite, 100 ㎍/㎖ sodium pyrubate 및 40 ㎍/㎖ praline, 2mM L-glutamine가 첨가된 연골분화 배지를 제조하였고, 2-3일 간격으로 배지를 교환해줄 때 TGF-β1(10ng/㎖, Sigma) 및 IGF-I (10ng/㎖, Sigma)을 첨가해 주었다.
<1-2> 세포분리 및 배양
비중격 연골과 하비갑개 조직은 비중격 교정술과 하비갑개절제술 시행과정에서 얻어진 조직으로서 수술 전 환자의 동의하에 수득한 것을 사용하였다. 비중격연골과 하비갑개 조직을 채취한 직후 젠타마이신(국제약품공업, 성남, 대한민국)이 포함된 생리식염수로 3회 세척하여 섬유모세포 및 연골세포를 분리하였다. 이후, 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포의 분리를 위해 수술과정에서 제거된 하비갑개 조직을 4℃에서 냉장보관 하였고, 이 조직을 실온에서 항생-항진균 용액(Gibco, Gaithersberg, MD)으로 3회 세척하였다. 이후 다시 중성의 PBS 용액으로 2회 세척한 뒤 작은 수술용 가위를 이용하여 1㎣ 크기로 잘게 절단한 뒤, 100㎜ 배양용 접시에 놓고 소독된 슬라이드 글라스로 덮어 배양용 접시에 유착시킨 다음, 10% FBS가 포함된 DMEM 배지를 첨가하여 37℃, 5% CO2 환경 하의 배양기에서 배양하였다. 3주간의 배양 후 슬라이드 글라스를 제거하고 배양액에 부유하는 세포를 세척하여 버리고 배양용 접시 바닥에 붙은 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 얻었으며, 3대까지 계대 배양하여 이를 사용하였다. 분리된 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포는 도 1에 나타내었다. 또한, 다른 방법으로서, 1㎣ 크기로 자른 하비갑개 조직에 0.1% 콜라게나제(Sigma, St. Louis, MO)를 포함한 DMEM 배지를 첨가하고 37℃, 5% CO2 환경하 배양기에서 1일간 유치시킨 후 원심분리하여 중간엽 기질세포를 분리하였다.
사람 비중격 연골세포의 분리를 위해, 수술과정에서 제거된 비중격 연골 조직편을 냉장보관한 뒤 실온에서 항생-항진균 용액으로 3회 세척하고 이를 다시 중성 PBS 용액으로 2회 세척하였고 비중격 연골을 1㎣ 크기로 잘게 자른 후 배양용 접시에 놓고 10% 소태아혈청(fetal bovine serum, FBS)이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle Media, Gibco)를 20㎖ 넣은 후 0.3% 콜라게나제(Sigma, St. Louis, MO)를 첨가하여 12시간 동안 37℃ 세포 배양기에서 배양하였다. 이후 1000rpm으로 10분간 원심분리한 다음, 상층액은 버리고 PBS로 2회 세척 후 얻어진 연골세포를 이용하여 T75 flask(NUNC, Roskilde, Denmark)에 접종하였고 37℃, 5% CO2 세포 배양기에서 배양하였으며 배양액은 2-3일 마다 교체하였다.
<1-3> 세포의 접종 및 3 차원 배양
24-웰 플레이트(NUNC사)에 마이크로 광조영술을 이용해 제작된 표준화된 삼차원 지지체인 PCL(polycaprolactone) 스폰지를 지지체로 이용하여 삼차원 배양을 하였다. 즉, 상기 실시예에서 분리한 연골세포와 섬유모세포를 2×1 06/㎖ 세포수로 산정하여 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포와 동일인의 비중격 연골세포를 각각 1:0, 1:1, 0:1의 비율로 접종한 다음, 성장인자로서 TGF-β1(10ng/㎖, Sigma) 및 IGF-I(10ng/㎖, Sigma)와 10% FBS가 포함된 DMEM 배지를 첨가하였다. 배지는 배양기간 동안 3일 간격으로 교체해 주었고, 배양 2주에 배양 지지체를 취하여 다음과 같이 조직학적 방법, 면역조직화학법, 웨스턴 블럿 및 RT-PCR 방법을 통해 연골세포로의 분화를 관찰하였다.
<1-4> 조직학적 방법을 통한 분석
상기 <1-3>의 방법을 통해 배양한 2주 후의 배양지지체를 통상적인 조직학적 방법에 따라 10% 포르말린으로 고정한 후 파라핀에 포매하였고, 5㎛ 두께의 절편을 작성하여 H & E 염색과 Toluidine blue-O 염색을 시행하여 작성된 표본을 현미경으로 조직 관찰하였고, Spot software(Polaroid Digital Microscope Camera Ie v1.25, Polaroid, Waltham, MA)를 사용하여 디지털 영상을 촬영하였다.
<1-5> 타입 II 콜라겐에 대한 면역조직화학법을 통한 분석
조직학적 방법에서 사용한 동일한 배양지지체 절편을 대물유리에 붙인 후, 가수시켜 1.45 units/㎖ chondroitinase (Sigma)와 0.5 units/㎖ testicular hyaluronidase(Sigma)가 포함된 TBS 용액에 첨가한 후, 37℃에서 1시간 동안 처리하였고, 내인성 과산화효소(peroxidase)의 활성도를 소멸시키기 위해 0.3% 과산화수소가 포함된 TBS로 30분간 처리하였다. 이와 같이 처리된 배양지지체 절편을 10% 말혈청에서 20분간 반응시킨 후 혈청을 제거하였고, 사람 type II 콜라겐에 대한 1차 항체(Sigma)를 상온에서 8시간 동안 반응시켰다. 이후 이중 염색하는 1차 항체들은 모두 밤새 반응시켰고, 3% BSA가 포함된 PBS로 3회 세척하였다. 2차 항체인 Alexa 555는 1:100의 비율로 상온에서 1시간 동안 처리한 후 발현 유무를 확인하였다. 핵 염색을 위하여, DAPI가 결합된 마운팅 배지(Vectashild, Burlingame, CA)로 고정시켰다. 발현의 유무는 형광부착된 현미경(Olympus AX70TR62A02, Tokyo, Japan)을 이용하여 세포를 확인하였다.
그 결과, 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포의 연골 분화 배양 2주에 채취한 배양지지체의 조직학적 소견상 TGF-β1과 IGF-I의 성장인자로 자극된 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포는 지지체로 사용된 PCL 스폰지의 공간에 세포들이 모인 소결절들이 확대되어 기질 사이에 이들 세포들인 성글게 배열된 조직덩어리의 형태를 나타내었다(도 2 참고). 또한, 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포들이 연골 특이적 기질을 생성해 낸 것을 Toluidine blue 염색에서 붉게 염색된 부분으로 관찰할 수 있었고, type II 콜라겐에 대한 면역조직염색에서도 붉게 염색된 부분으로 확인할 수 있었다.
또한, 이렇게 연골 특이적 기질을 생성해내는 조직의 소견은 동일인의 비중격 연골세포와 동시 배양된 실험군에서도 관찰되었으며, 이러한 결과는 양성대조군으로 사용한 비중격 연골세포만을 배양한 군과 거의 유사하게 나타났다(도 3 및 도 4 참조).
<1-6> RNA 분리와 역전사효소연쇄중합반응 ( Reverse transcriptase polymerase chain reaction )　
조직학적 방법에서 사용한 동일한 배양지지체를 PBS로 세척하고 Ambion RNAqueous kit(Ambion, Austin, TX)를 이용하여 Tri-ZolTM 시약(Invitrogen, Carlsbad, CA) 1㎖를 첨가하여 제조자가 제시한 방법에 따라 RNA를 추출하였다. 즉, 균질기(Polytron, Luzern, Switzerland)를 이용하여 배양지지체를 갈은 후, 멸균 용기에 넣고 상온에서 10분간 Rocker(VS-95RK, Vision, 대한민국)로 혼합하였다. 혼합된 배양지지체에 클로로포름(Sigma) 0.2㎖를 첨가하여 혼합한 후 상온에서 3분간 유지시킨 다음, 14000rpm에서 15분간 원심분리하여 상층액을 분리하였고, 분리된 상층액에 isopropanol(Sigma) 0.5㎖를 넣고 상온에서 10분간 유지시킨 후 14000rpm에서 15분간 원심분리하여 펠렛을 수득하였으며, 70% 에탄올을 이용하여 세척하였다. 여기에 RNase가 없는 물을 30㎕ 넣고 55℃-65℃의 오븐에서 10분간 유지시켜 RNA를 분리하였다. Oligo dT-primed cDNA 합성은 MMLV-Reverse Transcriptase(MMLVRT, Invitrogen)을 이용하였고, cDNA의 PCR 증폭은 type II 콜라겐과 aggrecan 프라이머를 이용하여 수행하였으며, 사용한 프라이머들의 염기서열은 하기 표 1에 기재된 바와 같다.
프라이머 서열
유전자 프라이머 서열 PCR 산물크기
(base pairs)		 서열번호
β-actin(정방향) 5‘-GCCCCTCCATCGTCCACCGC-3’ 493 1
β-actin(역방향) 5‘-GGGCACGAAGGCTCATCATT-3’ 493 2
type II collagen(정방향) 5‘-TTTCCCAGGTCAAGATGGTC-3’ 377 3
type II collagen(역방향) 5‘-CTTCAGCACCTGTCTCACCA-3’ 377 4
aggrecan(정방향) 5‘-GCAGAGACGCATCTAGAAATT-3’ 507 5
aggrecan(역방향) 5‘-GGTAATTGCAGGGAACATCATT-3’ 507 6
그 결과, 도 5에 나타낸 바와 같이, RT-PCR 방법에 의해 배양 2주에 양성 대조군으로 이용된 β-actin 에 대한 mRNA와 type II 콜라겐 및 aggrecan에 대한 mRNA가 발현된 것을 확인할 수 있었고, RT-PCR로 정량 분석한 결과, 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포의 연골 분화 정도가 비중격 연골세포만을 배양 했을때와 유사한 것으로 확인됨에 따라 본 발명에 따른 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 이용하여 연골세포로 분화시킬 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
<1-7> 웨스턴 블럿팅을 통한 분석
조직학적 방법에서 사용한 동일한 배양지지체를 단백질분해 억제제(100 μg/ml phenylmethylsulfonyl fluoride, 1 μg/ml leupeptin)가 첨가된 RIPA(RadioImmunoPrecipitation) 버퍼 1 ml(150 mM NaCl, 1% NP-40, 50 mM Tris(pH 8.0), 1 mM EDTA, 0.5% Deoxycholate)에 넣고 균질화시켰다. 이 균질액을 15,000 rpm에서 10분간 원심분리 후 상층액을 웨스턴 블럿 분석에 이용하였으며, 단백질의 양은 Bio-Rad 단백질 분석(Bio-Rad, Hercules, CA, USA)을 이용하여 측정하였다. 정량적으로 측정된 단백질들은 SDS-PAGE를 사용하여 전기영동 하였고, 니트로셀룰로즈 필터(Amersham,Arlington Heights, IL, USA)에 옮긴 다음 4℃에서 12시간 동안 항 Alkaline phostatase 및 osteocalcin 항체를 반응시켰다. 이후, 필터를 0.1% Tween-20이 함유된 TBS 용액으로 세척한 후 peroxidase-conjugated donkey anti-rabbit antibody(Amersham)와 donkey anti-mouse antibody(Amersham)로 각각 반응시킨 후 ECL 용액(Amersham)을 이용하여 X-선 필름으로 확인하였다.
그 결과, 도 7에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 분리한 사람의 하비갑개 유래 중간엽 기질세포로부터 실제로 Type II 콜라겐이 생성된 것을 확인할 수 있었다.
<실시예 2>
사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포( human turbinate mesenchymal stromal cells , hTMSCs )의 골 분화유도
상기 실시예 1을 통해 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 이용하여 연골로 분화시킬 수 있음을 확인함에 따라 본 발명자들은 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 이용하여 골 분화유도에 대한 실험을 다음과 같이 수행하였다.
<2-1> 골분화 배지의 제조
골분화 배지로 FBS가 포함되지 않은 DMEM 배지에 100U/ml 페니실린, 100μg/ml 스트렙토마이신, 10-8 M 덱사메탄손(dexamethasone), 5 mM β-glycerophosphate, 50 μg/ml ascorbate-2-phosphate를 첨가하여 이를 골분화를 위한 배지로 사용하였다.
<2-2> 세포의 접종 및 배양
12-웰 플레이트에 사람하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 2× 104/㎖ 세포수로 산정하여 접종하였다. 이후, 상기 <1-1>에서 제조한 골분화 배지를 배양기간 동안 2일 간격으로 교환해 주고, 10nM와 100nM 농도의 1,25-dihydroxyvitamin D3와 100 ng/mL BMP-2(bone morphogenic protein)를 첨가하여 골분화 정도의 차이를 확인하였다,
<2-3> Alizarin Red S 염색
상기 <2-2>에서 배양한 세포들이 포함된 각 웰을 PBS로 1회 세척하고, 멸균된 3차 증류수로 3회 세척 후, 4% paraformaldehyde로 15분간 고정시켰다. 이후, 멸균 3차 증류수로 3회 세척한 후 2% Alizarin Red S 용액(1㎖ of 40mM Alizarin Red S )으로 20분간 빛을 차단시킨 상태에서 약하게 흔들면서(gentle shaking) 실온에서 배양하면서 염색하였다. Unincorporated dye를 aspiration하고 well당 4ml의 멸균 3차 증류수로 5분간 shaking하면서 4회 세척하고 Inverted microscope으로 관찰하였다.
<2-4> 알칼리 포스파타아제( Akaline phosphatase ) 염색
상기 <2-2>에서 배양한 세포들이 포함된 각 웰을 PBS로 1회 세척하고, 멸균 3차 증류수로 3회 세척 후 citrate-acetone-formaldehyde 고정액으로 15분간 고정시켰다. 멸균 3차 증류수로 3회 세척한 후 alkaline dye 혼합액(Nitrite, FRV-alkaline, Naphthol AS-BI alkaline siolution, Sigma)로 상온에서 15분간 빛을 차단한 상태에서 염색하고 멸균 3차 증류수로 3회 세척한 후 inverted microscope하에서 관찰하였다.
Alizarin Red S 염색 및 알칼리 포스파타아제(Akaline phosphatase) 염색 수행 결과, 도 8에 나타낸 바와 같이, 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포의 골분화를 확인할 수 있었다.
<2-5> RNA 분리와 역전사효소연쇄중합반응 ( Reverse transcriptase polymerase chain reaction )
골분화 배양된 세포들을 PBS로 수세하고 Ambion RNAqueous kit를 이용하여 Tri-ZolTM reagent 1㎖를 넣어 제조자가 제시한 방법으로 추출하였다. 골분화 특이적인 mRNA의 확인을 위해 type I collagen, bone sialoprotein(BSP), Runt-related transcription factor 2(Runx2), bone morphogenetic protein-2(BMP-2), osterix(Osx), osteocalcin(OC) primer를 제작하여 당업계에 통상적인 RT-PCR방법을 사용하였으며, 사용한 프라이머의 서열은 하기 표 2에 기재된 바와 같다.
프라이머 서열
유전자 프라이머 PCR 산물
(base pairs)		 서열번호
COL 1(정방향) 5‘-TGACGAGACCAAGAACTG-3’ 599 7
COL 1(역방향) 5‘-CCATCCAAACCACTGAAACC-3’ 599 8
OC(정방향) 5‘-ATGAGAGCCCTCACACTCCTC-3’ 297 9
OC(역방향) 5‘-CGGGCCGTAGAAGCGCCGATA-3’ 297 10
BSP(정방향) 5‘-GCTCAGCATTTTGGGAATGGC-3’ 614 11
BSP(역방향) 5‘-CTGCATTGGCTCCAGTGACAC-3’ 614 12
Runx2(정방향) 5‘-GTGGACGAGGCAAGAGTTTCA-3’ 698 13
Runx2(역방향) 5‘-TGGCAGGTAGGTGTGGTAGTG-3’ 698 14
Osx(정방향) 5‘-CTTCAGTCTTCCCAACTTCTTACAC-3’ 486 15
Osx(역방향) 5‘-ACAAATTGGGTTAGCTACATCTCTG-3’ 486 16
BMP-2(정방향) 5‘-TTGCGCCTGCTCAGCATGTT-3’ 315 17
BMP-2(역방향) 5‘-CATCTTGCATCTGTTCTCGGAA-3’ 315 18
그 결과, 도 9에 나타낸 바와 같이, 분화된 세포들을 대상으로 RT-PCR을 수행한 결과, 골 분화 특이적인 유전자들이 발현된 것으로 나타났다.
따라서 상기 결과를 통해 본 발명에 따른 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포의 경우 골분화를 유도할 수 있다는 사실을 알 수 있었다.
<실시예 3>
사람하비갑개 유래 중간엽 기질세포 ( human turbinate mesenchymal stromal cells , hTMSCs )의 신경분화 유도
<3-1> 신경세포로의 분화 유도
나아가 사람하비갑개 유래 중간엽 기질세포가 신경세포로 분화가 가능한지를 조사하기 위해 기본 배지로 Neurobasal 배지를 사용하였고, 신경성장인자로 10ng/㎖ Glial-derived neurotrophin factor(GDNF)와 10ng/㎖Brain-derived neurotrophin factor(BDNF), 10ng/㎖Neurotrophin-3(NT3) 1㎖ B-27 supplement, L-glutamin 2mM를 사용하여 14일 동안 배양하였고, 3일 간격으로 배지를 교환해 주었다.
<3-2> 면역형광엽색법 ( immunocytochemistry )을 통한 분석
사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 3회 계대배양하여 실험에 사용하였고, Lab-Tec 4-well cahmber slide(Nalgene Nunc International, Rochester, NY)에 1ⅹ104 cells/well로 계수하여 접종한 후, 상기 <3-1>의 배지로 신경분화를 유도하였다. 증식하는 세포의 표지자인 BrdU(5-Bromo-2'-deoxy-uridine Labeling and Detedtion Kit, Roche, Indianapolis, IN)를 사용하여 24시간 동안 BrdU를 표지(labeling)하였다. 3% BSA(Bovine serum qlbumin, 12 Williams Ave Keilor East, VIC 3033, Australia)가 포함된 PBS을 이용하여 표지한 세포를 3회 세척한 후 4% 파라포름알데히드(paraformaldehyde)로 20분간 고정시켰고, 0.5% Triton X-100(Promega Co. Medison, WI)으로 상온에서 20분간 처리하였다. 이후, 1차 항체인 anti-BrdU working solution(1:10)을 12시간 이상 처리하고, 3% BSA이 포함된 PBS로 3회 세척하고 2차 항체인 anti-mouse-Ig-Fluorescein working solution(1:10)으로 상온에서 1시간동안 처리하였다. 그런 뒤, 5% normal goat 용액으로 블럭킹하고 각각 특징적으로 분화된 세포의 특정 표지자로 아교세포(Glial cells) 표지자인 S-100(Abcam), 신경세포 표지자인 b-tubulin(Abcam), 신경계원종 표지자 Nestin(Abcam)을 사용하여 이중 염색을 수행하였다. 이중 염색하는 1차 항체들은 모두 밤새도록 반응시켰고, 3% BSA가 포함된 PBS로 3회 세척하였다. 2차 항체인 Alexa 555는 1:100의 비율로 상온에서 1시간 동안 처리한 후 발현 유무를 확인하였다. 핵 염색을 위하여 DAPI가 conjugate된 mouting medium (Vectashild, Burlingame, CA)으로 고정시켰으며, 발현은 형광 부착된 현미경(Olympus AX70TR62A02, Tokyo, Japan)을 이용하여 세포를 확인하였다.
그 결과, 도 10에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 사용한 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 배양배지에서 배양한 결과, 신경세포 표지자들이 관찰됨을 통해 신경세포로 분화됨을 확인할 수 있었다.
<실시예 4>
형광 활성 세포 분석을 통한 중간엽 기질세포 특성 확인
사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포가 중간엽 줄기세포의 특성을 갖는지 확인을 위해 사람 중간엽 줄기세포의 표면 표지자(cell surface marker)를 사용하여 분석하였는데, 상기 분석을 위해 3대로 계대배양된 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 계수하여 1ⅹ106 cells/㎖로 시험관에 분주하고 세척완충액(0.2% BSA, 0.1% NAN3, 0.5mM EDTA)으로 3회 세척하였다. 이후 Fluorescein Isothicyanate(FITC)와 Phycoerythrin(PE)가 결합되어 있는 CD34(Serotec Ltd., Station Approach, Kidlington, Oxford, UK), CD45(Serotec Ltd.), CD73, CD90, CD105(all from BD Bioscience, San Jose, CA) 항체를 1시간 동안 처리하고, 세척 완충액으로 3회 세척한 후, 유세포 분석기(FACS Caliber, Becton Dickson, San Diego, CA)장비를 이용하여 분석하였다.
그 결과, 도 11에 나타낸 바와 같이, 조혈모세포의 표지자인 CD34와 CD45의 표면 표지자는 거의 100% 음성으로 확인되었고, 중간엽 줄기세포의 표면 표지자로 알려진 CD73 표면 표지자는 65.45%, CD90 표면 표지자는 91.44%, CD105 표면 표지자에서는 7.78%로 양성반응을 나타내었다. 따라서 상기 결과를 통해 본 발명에서 사용한 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포의 경우, 중간엽 즐기세포의 특성을 갖는 것을 확인할 수 있었다. 또한, 조직적합성 항원인 HLA(Human leukocyte antigen)표면 표지자에 대하여 100% 음성을 나타냄으로써 인체 적합성에 면역학적 문제점이 없다는 것을 알 수 있었다.
<실시예 5>
사람하비갑개 유래 중간엽 기질세포( human turbinate mesenchymal stromal cells , hTMSCs)의 지방세포로의 분화유도
앞서 수행한 실험들을 통해 본 발명자들은 사람하비갑개 유래 중간엽 기질세포가 연골 및 골 분화가 모두 잘 이루어져 상기 기질세포의 다분화능을 확인할 수 있었다. 한편, 중간엽 기질세포의 다분화능은 당업계에서 연골분화 및 골분화 뿐만 아니라 지방분화의 3가지 분화가 조직학적으로 관찰되는지의 여부를 통해 이를 인정하고 있는 것이 공론화되어 있다.
이에 본 발명자들은 사람하비갑개로부터 유래된 중간엽 기질세포를 지방세포루 분화시키기 위해 다음과 같은 실험을 수행하였다.
상기 실시예에서 수득한 사람하비갑개 유래의 중간엽 기질세포를 6웰 플레이트에 3 X 103 세포수가 되도록 접종하고 10% fetal bovine serum과 항생제가 포함된 α-MEM(GIBCO) 배지에서 3일간 배양하였다. 이후 상기 세포들을 지방세포 분화배지(10/ml 인슐린(Sigma), 200indomethacin (Sigma), 0.1dexamethasone(Sigma), 0.53-isobutyl-1-methylxanthine (Sigma) 및 10% fetal bovine serum이 포함된 α-MEM 배지)에서 3주간 배양한 뒤 Oil red 염색을 시행하여 사람하비갑개 유래 중간엽 기질세포가 지방세포로 분화되는지의 여부를 관찰하였다. 또한 상기 Oil red 염색은 상기 배양된 세포들을 4% 파라포름알데히드로 30분 동안 고정시킨 후, 세척한 다음 0.16%의 오일 레드 O 시약으로 20분동안 염색한 다음 현미경을 통해 관찰하였다.
그 결과, 도 12에 나타낸 바와 같이, 본 발명에서 분리한 사람하비갑개 유래의 중간엽 기질세포는 지방세포로 분화된다는 사실을 확인할 수 있었고, 분화된 세포의 경우 지방 특이 세포질 내에 주황색으로 염색된 지방 방울(lipid droplet)이 존재함을 확인할 수 있었다.
이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.
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Claims (15)

  1. TGF(transforming growth factor)-β1 또는 IGF(insulin like growth factor)-I 이 첨가된 연골분화 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포(human turbinate mesenchymal stromal cells, hTMSCs)를 연골세포로 분화시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 배지는 덱사메타손(dexamethasone), 아스코르브산(ascorbate), 인슐린-트랜스퍼린 소듐 셀레니트(insulin-transferrin sodium selenite), 피루브산 나트륨(sodium pyrubate), 프롤린(proline) 및 L-글루타민(glutamine)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 연골세포로 분화시키는 방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 배양은 사람 비중격 연골에서 분리 배양한 비중격 연골세포와 공배양(co-culture)하는 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 삭제
  5. 삭제
  6. 삭제
  7. 삭제
  8. 소태아혈청(FBS)이 포함되지 않은 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포(human turbinate mesenchymal stromal cells, hTMSCs)를 골세포로 분화시키는 방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 배지는 페니실린, 스트렙토마이신(streptomycin), 덱사메타손(dexamethasone), 베타-글리세로포스페이트(β-glycerophosphate) 및 아스코르브산-2-인산염(ascorbate-2-phosphate)으로 이루어진 군 중에서 선택된 하나 이상을 더 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 삭제
  11. GDNF (Glial-derived neurotrophin factor), BDNF (Brain-derived neurotrophin factor), NT3 (Neurotrophin-3), B-27 첨가물 및 L-글루타민(glutamin)을 포함하는 신경분화 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포(human turbinate mesenchymal stromal cells, hTMSCs)를 신경세포로 분화시키는 방법.
  12. 삭제
  13. 분리된 사람의 하비갑개 조직을 절단한 후, 배양 접시에 상기 하비갑개 조직을 유착시켜 배양한 다음, 부착되지 않은 세포들은 제거하고, 상기 접시에 부착된 사람 하비갑개 유래의 중간엽 기질세포를 수득하는 단계를 포함하는 분리된 사람 하비갑개 조직으로부터 중간엽 기질세포를 분리하는 방법.
  14. 인슐린, 인도메타신(indomethacin), 덱사메타손(dexamethasone), 3-이소부틸-1-메틸산틴(3-isobutyl-1-methylxanthine) 및 소태아혈청(FBS)이 첨가된 지방세포분화 배지에서 배양하는 것을 특징으로 하는 사람 하비갑개 유래 중간엽 기질세포를 지방세포로 분화시키는 방법.
  15. 삭제
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