KR20120044918A - 핵산 정제 - Google Patents

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Abstract

미처리된 샘플로부터 핵산, 세포 용출액 및 세포 현탁액을 분리하기 위한 신규한 자기 수납형 장치로서, 장비와 함께 사용되며, 적어도 하나의 투입물과, (ⅰ) 수집 기구로부터 미처리된 샘플을 수용하기 위한 챔버와, 적어도 하나의 충진된 액체 정제 시약 저장소를 포함하는 마크로유체 부품; (ⅱ) 상기 마크로유체 부품과 적어도 하나의 마이크로유체 소자를 통해 소통하며, 적어도 하나의 핵산 정제 매트릭스를 더 포함하는 마이크로유체 부품; 및 (ⅲ) 상기 마이크로유체 소자와 상기 핵산 정제 매트릭스를 통해 상기 액체 정제 시약을 구동하기 위한 상기 장비 상의 구동 메커니즘;을 포함하며, 상기 장치에 대한 투입은 상기 챔버와 상기 구동 메커니즘을 통해서만 이루어진다.

Description

핵산 정제 {NUCLEIC ACID PURIFICATION}
본 출원은 2009년 2월 3일자로 출원된 미국 가특허 출원번호 제61/206,690호 및 2009년 2월 6일자로 출원된 미국 가특허 출원번호 제61/207,017호를 우선권 주장하며, 상기 미국 가특허 출원들은 각각 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서에 편입된다.
정부의 이해 관계 진술
본 출원은 미국 법무부 법무성 산하 국립사법연구소가 허여한 승인번호 제2007-DN-BS-K184호 및 "필드 전개식 가속 핵 DNA 장비"란 명칭으로 2009년 9월 30일자의 MIT 링컨 연구소와의 계약에 의해 지원되었다.
A. 충족되지 않은 요구 - 미처리된 임상 법의학 샘플
19세기 후반 미셰르와 알트만이 핵산을 처음 분리(미셰르, 프리드리히의 조직화학 및 생리학 연구 제2권 제3행 내지 제23행의 "고름 세포의 화학적 조성에 대하여"(1871년) 참조)한 이래 현재 이용가능한 가장 복잡한 분자 생물학적 기술까지, DNA 추출 프로세스는 대폭 간소화되었다. 그럼에도 불구하고, 임상, 생물학적 위협 탐지 분야 및 법의학계에서는 신속하며, 비용효율적이고, 노동력이나 공간 집약적이지 않으며, 민감하고, 강력하며, 안정적이면서 통합된 DNA 정제 방법이 계속 요구되고 있다. 특히, 어떠한 수동 처리나 프로세싱 없이, 미처리된 임상 또는 법의학 분야 샘플로부터 핵산을 신속하게 정제할 수 있는 장치에 대한 요구가 충족되지 않고 있다.
이상적으로, POC(Point Of Care) 또는 유사 POC 어플리케이션, 및 게놈 정보 전달, 특히 필드에서의 게놈 정보 전달을 위한 수많은 다양한 기존 및 신흥 시장을 고려한 신규한 핵산 정제 방법이 요구된다. 예를 들어, 개인 식별 분야에서, 실험실이든 필드(예를 들어, 국경, 입국장, 전장 및 군대 검문소)이든, 법의학계에서는 DNA 지문을 신속하게 생성할 수 있어야 하는 요구가 충족되지 않고 있다.
마찬가지로, 민간인 및 군인을 보호하기 위하여, 환경 생물학적 위협에 대한 식별을 개선하는 것이 중요하다. 더 빠르고, 더 민감하며, 더 구체적이고, 그리고 더 상세한 식별은, 민간 및 군사 당국에 의한 개선된 전략적 및 전술적 대처를 가능하게 하고, 보다 효과적인 치료 행위를 가능하게 한다. 핵산 증폭, 하이브리드 형성 및 시퀀싱을 포함한 핵산 분석 기술의 신속한 응용은 이와 관련하여 중요한 정보를 제공할 수 있다.
또한, (생물학적 위협 또는 일반 병원균에 의해 유발된) 임상 감염을 신속하게 진단할 수 있는 능력은 사회에 지대한 영향을 미칠 것이다. 예를 들어, 패혈증 환자의 혈액 샘플을 채혈하고, 병원체 또는 병원균의 식별뿐만 아니라 한 시간 또는 그 이내에 핵산 분석을 기초로 그들의 항생물질 내성 프로파일을 모두 결정하면, 구체적인 항균 요법을 즉시 시작할 수 있게 된다(바이러스 진단 및 약제 내성 프로파일에 대한 유사한 상황도 매우 중요하다). 또한, 임상 샘플로부터 핵산 분석 정보를 신속하게 생성하는 능력은 암에서 면역 체계의 장애에 이르기까지 광범위한 질병의 진단 및 치료에 상당한 영향을 미칠 것이며, 본질적으로 모든 질병의카테고리에 영향을 미칠 것이다. 동일한 접근법이 게놈약학, 즉 주어진 약물 요법의 적합성을 예측하기 위한 유전 정보의 이용에도 적용될 수 있다.
B. DNA 의 정제에 대한 종래 기술의 접근법
포유류 세포에서 핵 DNA를 추출 및 정제하는 기본적인 접근법은 30년 전에 개발되었으며(엔. 블린. 디.더블유. 스태포드(1976). 진핵생물에서 고분자량의 DNA를 분리하는 일반적인 방법. 핵산 연구 3(9):2303-8), 관심 세포 유형의 용해, 및 용액 내의 다른 세포 요소(특히 단백질)와 세포 및 조직 파편으로부터의 DNA 정제라는 두가지 주요 단계를 갖는다. 세포 용해와 (적절한 경우라면) DNA 가용화는 (J. Brent(1998). 분리는 어렵지 않다: "A cacophony of sonicators, cell bombs and grinders" The Scientist 12(22):23에서 검토된) 기계적 및 비기계적 기술로 수행될 수 있다. 단순한 기계적 접근법은 블렌더(blenders)의 이용과, 제한된 개구를 통해 세포를 강제함으로써 이루어지는 균질화를 포함한다. 음파 처리(sonication)는 고주파 음파에 대한 세포의 노출을 기반으로 하고, 비즈 접근법은 다양한 비즈가 존재하는 상태에서 격렬한 혼합에 대한 세포의 노출을 기반으로 한다.
화학적 세포 파괴가 기계적 파괴의 대안이다. 세제(detergents)는 지질 이중막을 파괴함으로써 작용하는 중요한 화학적 용해제이다. 세제의 추가적 특성으로 인하여, 단백질 구조가 유지(예를 들면, 양성이온 및 비이온 세제)되거나 파괴(이온 세제)될 수 있다.
이온 세제인 소듐 도데실 설페이트(SDS)는 부분적으로 세포 내의 거대 분자를 가용화할 수 있고 단백질을 변성시킬 수 있기 때문에 법의학 DNA 추출 프로토콜에 일반적으로 사용된다(제이.엘. 하인스 등(2005)의 "인간 유전학에서의 현재 프로토콜" 제2권(2005 존 윌리 앤드 손스 인코포레이티드 출판사)). 프로테인키나아제 K가 세제 기반(예를 들어, SDS, 트윈(Tween)-20, 트리톤 X-100) 용해 프로토콜과 함께 종종 사용된다. 세제 용해의 다른 유형은 FTA 페이퍼에 기반한다(엘.에이. 버고인 (1997) "편리한 DNA 수집 및 프로세싱": 1997년 9월 17일부터 20일까지 플로리다주 올렌도에서 개최된 개인 식별에 대한 제8차 국제 심포지움, "자동 DNA 프로세싱과 호환가능한 비위협적인 구강 세포 수집 키트로서의 1회용 칫솔 및 FTA 페이퍼: 지.엠. 포모프스카이아 등의 미국특허 제6,958,392호). 이는 약염기, 음이온 세제, 킬레이트 시약 및 방부제가 함침된 셀룰로오스 필터이다.
임상 또는 환경 샘플의 경우, 핵산 분석을 향한 중요한 첫 번째 단계는 샘플 내에 존재하는 핵산의 일부 또는 전부를 분리 또는 정제하는 것이다. 샘플 내의 생물학적 물질이 용해될 수 있으며, 용해액 내의 핵산이 추가 분석하기 전에 정제될 수 있다. 대안적으로, 용해액 내에 포함된 핵산이 직접 분석될 수 있다(예를 들어, 퓨전 혈액 직접 PCR 키트(Finnzymes, Espoo, FN) 및 다니엘 등의 미국 특허 제7,547,510호).
미처리된 임상, 환경 또는 법의학 샘플로부터 핵산을 정제하기 위해서는 조사중인 특정 필드 샘플에 적합한 전처리 단계의 자동화가 필요하다는 것을 당업자는 이해할 것이다. 샘플 유형, 샘플 볼륨, 샘플링 기술, 샘플 수집 장치, 샘플 처리 요건 등의 다양성과, 필드 샘플 분석 고유의 복잡성으로 인하여, 다양한 샘플로부터 핵산을 정제하기 위한 강력한 방법 및 장치에 대한 충족되지 않은 요구가 생겼다.
C. 임상 및 환경 샘플로부터 정제하기 위한 마이크로유체 접근법
마이크로유체학 분야는 미처리된 임상, 환경 및 법의학적 샘플로부터 핵산을 분리할 수 있는 장치 및 방법에 대해 충족되지 않은 요구에 대한 잠재적인 솔루션을 제공한다. 마이크로유체학은 마이크로리터 또는 그 이하의 작은 유체 체적의 조작에 기초하며, 1990년대 초 분자생물학과 마이크로일렉트로닉스가 혼합되어 출현하였다(만즈 등의. 센스(Sens). 엑츄에이터 B1:244-248 (1990) 참조). 마이크로유체학의 주요 포커스는 여러 구성요소를 통합하여, 샘플을 투입하면 바로 결과가 나오는 기능을 가진 시스템을 개발하는 것이다(에릭슨 등의 Anal. Chimica Acta 507:11-26(2004)에서 검토됨).
생물학적 위협에 대한 환경 탐지와 관련하여, 이 접근법을 이용한 약간의 진보가 이루어졌다. 자동 병원균 감지 시스템(힌든 등, Anal. Chem. 77:284-289(2005))은 공기 샘플을 수집하여, 마이크로유체 DNA 추출, 그리고 탄저균(B. anthracis)과 페스트균(Y. pestis)을 검출할 수 있는 실시간 PCR을 수행한다(검출 한도는 농축 샘플 1 mL당 103 내지 107 개의 유기체). 또한, 세페이드사(서니 베일, 켈리포니아주)의 젠엑스퍼트(GeneXpert) 시스템도 공기 샘플을 수집하여, (마이크로 음파 처리에 의한) 탄저균 포자 용해, DNA 추출 및 실시간 PCR을 통합하여 수행한다(검출 한도는 아메스 포자 농축 샘플 1 mL당 68 cfu(148개의 포자에 대응)이고, 스턴 포자 농축 샘플 1 mL당 102 내지 103 cfu이다). 이러한 진보에도 불구하고, 인간의 개입없이 임상 또는 환경 샘플로부터 (또는 수동으로 수집된 환경 샘플로부터) 미처리된 핵산을 정제할 수 있는 이용가능한 시스템 또는 장치가 존재하지 않는다. 실제로 이용가능한 모든 기술은 그 단계의 일부 또는 전부의 수동 처리에 의존한다.
D. 법의학 샘플로부터의 DNA 정제
법의학 샘플에 대한 최초의 DNA 정제 방법 중 하나는 페놀/클로로포름 추출의 사용이다(디.엠. 월리스 (1987) 크고 작은 규모의 페놀 추출. 효소법. 152:33-41; 마니아티스, 티 등의 분자 복제에서의 "핵산의 정제". 실험실 매뉴얼 3판. 콜드 스프링 하버 연구소, 콜드 스프링 하버, 뉴욕). 이 방법에서, 대부분의 단백질은 유기상(organic phase) 또는 유기-수성 인터페이스로 이동하고, 가용화된 DNA는 수상(aqueous phase)으로 남는다. DNA를 포함한 상은 에탄올 침전될 수 있으며, 분리된 DNA는 일련의 원심 분리 및 세척 단계를 거친다.
실제 법의학에서, DNA는 마이크로콘 컬럼(밀리포어 코오포레이션, 빌러리카, 매사츄세츠주)과 같은 원심 투석 장치에 의해 수상으로부터 종종 복원된다. 유기 추출 접근법의 장점은 (단백질의 양이 상대적으로 낮고, 단백질 분해가 상대적으로 낮은) 고품질의 DNA 표본을 생산하고, 오늘날 이용가능한 가장 안정적인 방법 중 하나로 남아 있다. 주요 단점은 절차가 시간 및 노동 집약적이며, 복잡한 장비가 필요하고, 고수율 환경에 채용하기가 상대적으로 어렵다는 것이다.
따라서, 법의학계는 사용이 보다 용이한 일련의 정제 기술로 옮겨가고 있으며, 그 중 많은 수는 상업적으로 이용가능한 키트의 기초 역할을 한다. 많은 수의 핵산 정제 접근법이 있으며, 그 중 일부를 요약하면 다음과 같다:
실리카 매트릭스/무질서유발제( chaotropic agents ) . DNA 분리를 위한 실리카 비즈의 사용은 사반세기 동안 표준 기술이었으며, 초기 프로토콜은 소듐 이오다이드와 같은 무질서유발제가 존재하는 상태에서 실리카에 대한 DNA의 결합에 기반을 두고 있다(비. 보겔스테인 등, (1979) "아가로오스로부터 DNA의 예비적 및 분석적 정제" Proc Nat Acad Sci USA 76(2):615-9). 수년전, 구아니디니움 솔트가 거대 분자의 강력한 불안정제인 것으로 밝혀졌다(폰 하이펠 피.에이치. 등. (1964) "중성염: 거대분자 구조의 안정성에 대해 미치는 그들의 영향의 일반성). 사이언스 145:577-580). 또한, 특정 구아니디니움 솔트는 뉴클레아제를 비활성화시키는 장점을 갖는다(처그윈 제이.엠. 등, (1979) "리보뉴클레아제에 풍부한 소오스로부터 생물학적 활성 리보뉴클레아제산의 분리" 생화학 18(24):5294-9). 이러한 의견들은 구아니디니움 솔트의 두가지 관련 특성을 효과적으로 이용한 붐에 의해 통합되었다(붐, 알. 등, (1990) "핵산을 정제하기 위한 신속하고 간단한 방법" J Clin Microbiol. 28(3):495-503). 첫째, 세포를 용해하는 솔트의 능력과, 둘째, 실리카 입자에 대한 DNA 결합을 향상시키는 솔트의 능력은, 오늘날 법의학 실험실에서 많은 용해/정제 접근법이 광범위하게 이용될 수 있도록 하였다(예를 들어, DNAIQ 시스템, 프로메가, 메디슨, WI). 실리카 비즈에 대한 대안은 실리카 멤브레인의 사용이다(QIAamp, Qiagen Hiden, DE). 또한, 실리카 비즈 자체가 DNA 결합을 더 향상시키기 위해 변형될 수 있다.
실리카 매트릭스/ 비무질서유발제 . 실리카 매트릭스도 무질서유발제가 부재한 상태에서 활용될 수 있다. 하나의 접근법은 주어진 pH에서 실리카 비즈가 플러스 전하를 갖고 DNA를 결합할 수 있도록 실리카 비즈를 변형시키는 것이다(베이커, 엠제이, 미국 특허 제6,914,137호). DNA 결합이 높은 pH에서(이온화기가 중성 또는 음전하인 경우), 때로는 고온에서 역전되도록, 수식(modification)은 이온화기(ionizable group)를 포함한다. 넓은 범위의 pH 변화가 DNA를 손상시킬 수 있기 때문에, 이 접근법의 중요한 특징은 상대적으로 좁은 pH 범위 내에서 DNA의 가역 결합을 허용하는 수식을 선택하는 것이다. 광범위하게 사용되는 이러한 유형의 접근법은 차지스위치(ChargeSwitch) 비즈(라이프 테크놀로지 인코포레이티드, 칼스바드, 켈리포니아)에 기반한 것이다.
자성 비즈 . DNA 결합 특성이 주어진 비즈의 표면 구조에 의해 주로 결정되지만, 자성 비즈의 사용은 DNA 정제 프로토콜에서 점점 더 중요해지고 있다. 이러한 입자들은 일반적으로 상자성이며, 이들은 그 자체로는 자성이 아니지만, 자기장에 노출되면 쌍극자를 형성한다. 이들 비즈의 유용성은 취급의 용이함과 자동화된 시스템에 대한 적응성과 관련된다. 예를 들어, 비즈는 세척과 이송을 효율적으로 할 수 있도록 하는 자석이 존재하는 상태에서 현탁액으로부터 용이하게 제거될 수 있다. 일반적으로 사용되는 자성 비즈는 상술한 차지스위치와 DNAIQ 비즈이다.
이온 교환 . 이온 교환은 DNA 분자가 부동성 비즈(immobile bead)에 가역적으로 결합할 수 있도록 한다. 일반적으로, 상기 비즈는 주어진 이온 강도에서 하나의 이온이 다른 이온으로 대체될 수 있도록 하는 대전 사이트(charged sites)를 가진 다공성 유기 또는 무기 고분자로 구성된다. 실제로, DNA 및 기타 거대 분자를 포함하고 있는 용액이 이온 교환 수지에 노출된다. 음전하 DNA는 (그 인산염 골격으로 인하여) 주어진 솔트 농도 또는 pH에서 상대적으로 강력하게 수지에 결합한다. 단백질, 탄수화물 및 기타 불순물들은 (결합한다고 하더라도) 상대적으로 약하게 결합하며, (예를 들어, 컬럼 포멧으로 또는 원심 분리에 의해) 비즈로부터 세척된다. 그 다음, 정제된 DNA는 고 이온 강도 버퍼에 용출될 수 있다. 오늘날 이용되는 상용 음이온 교환 수지는 DEAE-개질 실리카 비즈(Genomictip, Qiagen)에 기반한 것이다.
Chelex . Chelex-100(Bio-Rad, 헤라클레스, 캘리포니아)은 다원자가 금속 양이온을 효율적으로 결합하는 변태 수지이다. 이러한 양이온은 DNA를 분해하는 효소를 위해 필요하고 그들 자체가 PCR 효소를 억제하기 때문에, 이 방법은 DNA 정제 단계를 본질적으로 피하는 대표적인 방법이다(월시 피.에스. 등, 법의학적 재료로부터의 PCR 기반 분류를 위한 간단한 DNA 추출 배지로서의 Chelex-100. Biotechniques 10(4):506-13).
재료를 수집하기 위해 면봉을 사용하는 경우, 수집 후 면봉이 건조되면 생물학적 물질이 면봉에 부착될 수 있기 때문에, 면화 매트릭스(cotton matrix)로부터 생물학적 물질을 제거하는 문제가 있을 수 있다. 예를 들어, 정모세포막의 당질 구조로 인하여, 정모세포는 고체 지지체, 특히 면화에 점착된다(라자리노, 엠.에프. 등, (2008) DNA IQ 시스템에 의한 정액 면봉으로부터의 DNA 회수. Forensic Science Communications 10(1)). 면봉으로부터 최대량의 물질을 방출하기 위해, 다양한 버퍼가 실험되었으며, 표준 차동 추출 버퍼와 비교되었다. 1 내지 2% 소듐도데실 설페이트(SDS)와 같은 세제의 사용이 정자 세포 회수를 증대시키는 것으로 밝혀졌다(노리스, 제이.브이. 등, (2007) "강간 키트 분석을 위한 면봉으로부터의 화학적으로 향상된 신속한 정자 세포 회수" J Forensic Sci 52(4):800-5). 또한, 소량의 셀룰라아제의 첨가가 버퍼 용출 단독보다 면봉 매트릭스로부터 더 많은 상피 및 정자 세포를 방출하는 것으로 밝혀졌다(부어히, 제이.씨. 등, (2006) "강간 키트 분석을 위한 효소 소화를 통한 면봉으로부터의 향상된 정자 용출" J Forensic Sci 51(3):574-9).
소량 또는 저품질의 DNA를 포함하는 생물학적 물질로부터 법의학적 STR(Short Tandem Repeat) 프로파일을 얻기에는 많은 문제가 있을 수 있다. (50 내지 100 피코그램 미만의 DNA를 함유한) LNC(Low Copy Number) 샘플 뿐만 아니라 저품질의 손상된 샘플들은 매우 효율적인 수집, 추출 및 증폭 절차를 필요로 한다. 이 샘플들은 노화된 샘플과 접촉 증거를 포함하여 다양한 법의학적 증거에서 볼 수 있다. 라이프 테크놀로지의 Minifiler™와 같은 증폭 키트들은 이 어려운 시료들로부터 STR 프로파일을 얻는 능력을 높이는 것으로 밝혀진 더 작은 밴드(amplicon) 크기를 갖는다.
PCR 억제제는 또 다른 도전이며, 하류 어플리케이션이 수행될 수 있기 전에 제거되어야만 한다. 일반적인 억제제는 데님으로부터의 인디고 염료, 혈액으로부터의 헴(heme), 식물과 토양에서 발견된 부식산 및 다양한 조직에서 발견된 콜라겐이다. 이러한 억제제의 대부분은 실리카 기반 DNA 추출 방법, 또는 전하 또는 크기 배제 칼럼에 의한 추가적인 정제를 이용하여 효과적으로 제거된다. 억제제의 존재는 내부양성대조물질(internal positive control)로 PCR을 수행함으로써 감지될 수 있다. 만약 존재한다면, 일부 억제제는 소듐 하이드록사이드 세척을 포함한 다양한 처리 또는 밀리포어 마이크로콘사의 YM® 칼럼에 의한 추가적 정제에 의해 중화될 수 있다.
"현실 세계"의 샘플 수집 요건을 완전히 통합된 마이크로유체 DNA 프로세싱 바이오칩의 마이크로유체학적 요건과 조화시켜야 할 필요성은 "마크로와 마이크로의 경계" 또는 "세상과 칩의 경계"로써 지칭될 수 있다(프레드릭슨, 씨. 및 팬, 지. (2004) "마이크로유체 장치를 위한 마크로와 마이크로의 경계" Lab Chip 4(6):526-33). 이 인터페이스와 관련하여 보고된 많은 연구들이 마크로유체와 마이크로유체의 체적 요건 간의 불일치를 해소하는 것에 초점을 맞추고 있으나, 마이크로유체 장치와 특수한 법의학적 샘플링 요건 및 포멧의 조화에 관한 연구는 거의 또는 전혀 보고되지 않았다.
모세관을 이용하여 미량역가판(microtiter plate)으로부터 효소 검사용 칩(Lin 2003)으로 샘플을 흡입하는 애질런트사(산타 클라라, 캘리포니아)의 바이오어날라이저 2100에 의해 (비-법의학적) 체적 불일치가 상업적으로 해결되었다. 이와 유사하게, 웰 플레이트로부터 공급 노즐로 샘플을 흡입한 다음 회전 장치(Jasson 2003)를 향하여 상방향으로 전달하는 LabCD 시스템용 모세관 디스펜서인 자이로스(Uppsala, SE)가 개발되었다. 그러나, 이 장치들은 특히 면봉에 기반을 둔 일반적으로 사용되는 수집 장치로 수집된 법의학 샘플의 포멧 불일치를 해소하지 못한다.
E. 부분적으로 자동화된 DNA 정제
핵산을 부분적으로 자동 정제하기 위한 다양한 실험실 장비가 개발되었다. 예를 들어, 맥스웰 16 장비(Promega)는 법의학 샘플로부터 핵산을 정제하도록 설계되었다. 구강 면봉으로부터 DNA를 정제하기 위해, 운영자는 코튼 수집부를 반으로 절단하는 단계; 이를 1.5mL 원심분리관에 넣는 단계; 용해 시약을 준비하여 첨가하는 단계; 샘플을 히트 블럭에서 배양하는 단계; 튜브를 와류 혼합하는 단계; 시약과 면봉 샘플을 스핀 바스켓으로 이송하는 단계; 및 바스켓을 원심분리하는 단계를 포함하여 다수의 단계를 수행한다. 그 다음, 플런저가 맥스웰 카트리지 속에 위치되고, 샘플이 카트리지로 점적되며, 카트리지가 핵산 정제용 장비 속에 위치된다.
iPrep 장비(Life Technologies)도 핵산을 정제하기 위한 법의학 및 임상 샘플의 처리를 위해 사용된다. 예를 들어, 구강 면봉의 선단을 1.5mL 원심분리관에 넣고, 맥스웰 16에 필요한 것과 유사한 일련의 수작업 단계를 거친다. 샘플을 수동으로 준비한 후, 장비 내에서의 처리를 위해 미가공 용해액을 1 mL의 용출 튜브로 이송한다.
Qiagen EZ1, BioRobot M48 및 Qiacube 시스템(Qiagen)은 핵산 정제를 부분적으로 자동화한다. 수집된 구강 면봉은 두 시간 동안 건조되고, 본질적으로 전술한 장비에 의해 수동으로 처리된다. Innuprep(analytikJena, Itzehoe, DE), LabTurbo(Taigen, 타이페이, TW), Xiril 150(Xiril AG, Hombrechtikon, CH), 및 Quickgene(후지필름 코오포레이션, 도쿄, JP) 시스템은 실질적인 사용자의 조작 및 개입을 필요로 하는 부분적으로 자동화된 장비이다. 미국 특허출원 공개번호 제20080003564호(첸 등)는 면봉을 수용하고, 마크로유체 특성과 가요성 튜브를 이용하여 시약을 기계적으로 이송하는 마크로유체 샘플 처리 튜브를 개시하고 있다. 미국 특허출원 공개번호 제20070092901호(리글러, 에프. 등)는 반자동 핵산 정제를 위한 액체 생물학적 샘플을 사용하는 시스템을 개시하고 있다.
랜더스(울프, 케이.에이. 등 (2002) 핵산 분리를 위한 마이크로칩 기반 고상 추출 방법, Electrophoresis 23(5):727-33; 웬, 제이. 등 (2006) 테트라메틸 오소실리케이트가 그라프트된 광중합 모놀리식 고상을 이용한 DNA 추출, Anal Chem 8(5):1673-81; 이즐리, 씨.제이. 등 (2006) 샘플 인 앤서 아웃 기능을 가진 완전 통합형 마이크로유체 유전자 분석 시스템 PROC Natl Acad Sci USA 103(51):19272-7); 헤이건 케이.에이. 등 (2008) 생물학적 샘플로부터의 RNA 마이크로칩 기반 고상 정제, Anal Chem 80:8453-60), 로카시오(베커, 에이치. 등 (2002) 중합체 마이크로유체 장치 Talanta 56(2):267-287; 마르티노바 엘. 등 (1997) 각인법에 의한 플라스틱 마이크로유체 채널의 제조. Anal Chem 69(23):4783-9), 매디스(라겔리, 이.티. 등 (2001) DNA 분석을 위한 완전 통합형 PCR-모세관 전기 영동 마이크로시스템 Lab Chip 1(2):102-7; 영 에스.에이치. 등 (2006) 96 레인 미세제조된 모세관 어레이 전기 영동 마이크로장치를 이용한 신속하고 고처리량의 법의학적 STR(Short Tandem Repeat) 분류. J Forensics Sci. 51(4):740-7), 및 기타(리우 알.애이치. 등 (2004) "샘플 제조, 중합효소 연쇄 반응, 증폭 및 DNA 마이크로어레이 검출을 위한 자기 수납식 완전 통합형 바이오칩" Anal Chem 76(7):1824-31)의 연구를 포함하여 여러가지 그룹이 DNA 정제 및 분석을 위한 마이크로유체학을 발전시키기 위해 노력하였다(리우, 피. 및 매디스 알.에이.(2009) "고성능 유전자 분석을 위한 통합형 마이크로유체 시스템" Trends in Biotechnology 27(10):572-81에서 검토됨). 이즐리는 구아니디니움 용해/실리카 비즈 정제 프로토콜을 이용하여 750 나노리터의 전혈과 1 마이크로리터의 비강 흡인물로부터 DNA 분리를 시연하였다(이즐리, 씨.제이. 등 Proc Natl Acad Sci 서두). 전혈 샘플은 mL 당 약 2.5 백만개의 박테리아(탄저균)를 포함하고 있고(750 nL 샘플에 1500-2000 cfu), 농도가 너무 높아 임상 진단용으로 참조할 수 없었다. 미국 특허출원 공개번호 제2008/0014576A1호는 용액, 비즈, 콜로이드 또는 다상 용액에 정제용 샘플을 수용하고, 열순환기 및 분리 장비와 같은 하류 제조장치와 통합될 수 있는 핵산 정제 모듈을 개시하고 있다.
명세서의 발명은 미처리된 샘플로부터 핵산 분리, 세포 용해 및 세포 현탁을 위한 장치, 방법 및 장비를 포함한다. 하나의 발명에서, 상기 장치는 미처리된 샘플로부터 핵산을 분리하기 위한 자기 수납형 장치를 포함하고, 상기 장치는 장비와 함께 사용되며, 상기 장치는 적어도 하나의 투입물과,
(ⅰ) 수집 기구로부터 미처리된 샘플을 수용하기 위한 챔버와, 적어도 하나의 충진된 액체 정제 시약 저장소를 포함하는 마크로유체 부품;
(ⅱ) 상기 마크로유체 부품과 적어도 하나의 마이크로유체 소자를 통해 소통하며, 적어도 하나의 핵산 정제 매트릭스를 더 포함하는 마이크로유체 부품; 및
(ⅲ) 상기 마이크로유체 소자와 상기 핵산 정제 매트릭스를 통해 상기 액체 정제 시약을 구동하기 위한 상기 장비 상의 구동 메커니즘;을 포함하며,
상기 장치에 대한 투입은 상기 챔버와 상기 구동 메커니즘을 통해서만 이루어진다.
다른 발명에서, 상기 장치는 미처리된 샘플로부터 핵산을 분리하기 위한 자기 수납형 장치를 포함하며, 상기 장치는 장비와 함께 사용되고, 상기 장치는 적어도 하나의 투입물과,
(ⅰ) 수집 기구로부터 미처리된 샘플을 수용하기 위한 챔버,
적어도 2개의 미리 충진된 용해 시약 저장소,
미리 충진된 세척 시약 저장소 및
미리 충진된 용출 시약 저장소를 포함하는 마크로유체 부품;
(ⅱ) 상기 마크로유체 부품과 적어도 하나의 마이크로유체 소자를 통해 소통하며, 적어도 하나의 핵산 정제 매트릭스를 더 포함하는 마이크로유체 부품; 및
(ⅲ) 상기 마이크로유체 소자와 상기 핵산 정제 매트릭스를 통해 상기 제 1 및 제 2 용해 시약, 상기 세척 시약 및 상기 용출 시약을 순차적으로 구동하기 위한 상기 장비 상의 구동 메커니즘;을 포함하며,
상기 장치에 대한 투입은 상기 챔버와 상기 구동 메커니즘을 통해서만 이루어진다.
관련 발명에서, 청구된 상기 장치는 수집 기구를 가질 수 있고, 및/또는 챔버들에는 라벨이 부착되며, 상기 라벨은 바코드 또는 RFID를 포함한다. 다른 관련 발명에서, 상기 구동 메커니즘은 공압식, 기계식, 자기식 또는 유체식일 수 있다. 또 다른 관련 발명에서, 상기 미처리된 샘플은 (ⅰ) 비강 면봉, 비인강 면봉, 구강 면봉, 구강액 면봉, 대변 면봉, 편도선 면봉, 질 면봉, 경부 면봉, 혈액 면봉, 상처 면봉, 또는 혈액, 가래, 고름 물질 또는 흡인물이 담긴 튜브; (ⅱ) 법의학 면봉, 절단물, 접착 테이프 리프트 또는 카드; 또는 (ⅲ) 환경 공기 필터, 물 필터 또는 면봉을 포함한다.
다른 관련 발명에서, 청구된 장치의 핵산 정제 매트릭스는 실리카 멤브레인, 실리카 비즈, 실리카 자석 비즈, 이온 교환 수지 또는 이온 교환 비즈를 포함한다. 또 다른 관련 발명에서, 청구된 장치의 마이크로유체 부품은 채널, 저장소, 능동 밸브, 수동 밸브, 공압작동식 밸브, 반응 챔버, 혼합 챔버, 배기 소자, 접근 개구, 펌프, 계측 소자, 혼합 소자, 가열 소자, 자석 소자, 반응 챔버, 여과 소자, 정제 소자, 구동 라인 및 액츄에이션 라인을 포함한다.
본 명세서의 다른 발명은 미처리된 샘플로부터 핵산을 정제하는 방법으로서,
청구된 장치의 챔버에 핵산을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
상기 제 1 용해 시약 챔버로부터 제 1 용해 시약의 적어도 일부를 상기 챔버로 구동하여 제 1 혼합물을 제공하는 단계;
상기 제 2 용해 시약 챔버로부터 제 2 용해 시약의 적어도 일부를 상기 챔버로 구동하여 제 2 혼합물을 제공하는 단계;
상기 제 2 혼합물의 적어도 일부를 상기 정제 멤브레인을 통하여 구동하여 여과액과, 상기 핵산 중 적어도 일부를 포함하는 농축액을 제공하는 단계;
상기 세척 시약의 적어도 일부를 상기 정제 멤브레인을 통하여 구동하여 세척된 농축액과 폐액을 제공하는 단계;
상기 세척된 농축액을 선택적으로 건조시키는 단계; 및
상기 용출 시약 챔버로부터 용출 시약의 적어도 일부를 상기 정제 매트릭스를 통해 구동하여, 상기 세척된 농축액으로부터 핵산중 적어도 일부를 수집하는 단계;를 포함한다.
본 명세서의 또 다른 발명은, 미처리된 샘플로부터 핵산을 정제하는 방법으로서,
청구된 장치의 챔버에 핵산을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
상기 제 1 용해 시약 챔버로부터 제 1 용해 시약의 적어도 일부를 상기 챔버로 구동하여 제 1 혼합물을 제공하는 단계;
상기 제 1 혼합물에 기포를 발생시켜 교반된 제 1 혼합물을 제공하는 단계;
상기 제 2 용해 시약 챔버로부터 제 2 용해 시약의 적어도 일부를 상기 챔버로 구동하여 제 2 혼합물을 제공하는 단계;
상기 교반된 제 1 혼합물의 적어도 일부를 상기 정제 매트릭스를 통하여 구동하여 여과액과, 상기 핵산 중 적어도 일부를 포함하는 농축액을 제공하는 단계;
상기 세척 시약의 적어도 일부를 상기 정제 매트릭스를 통하여 구동하여 세척된 농축액과 폐액을 제공하는 단계;
상기 세척된 농축액을 선택적으로 건조시키는 단계;
상기 용출 시약 챔버로부터 용출 시약의 적어도 일부를 상기 정제 매트릭스를 통해 구동하여 용출된 핵산 용액을 제공하는 단계; 및
상기 용출된 핵산 용액에 기포를 발생시켜 균질화된 용출 핵산 용액을 제공하는 단계;를 포함한다.
본 명세서의 또 다른 발명은 전혈의 병원균으로부터 핵산을 정제하는 방법으로서,
청구된 장치의 샘플 수집 챔버에, 혈액 수집 튜브 내의 항응고처리된 전혈과 병원균을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
상기 혈액의 적어도 일부를 백혈구 잔류 필터를 통해 구동하여 저백혈구 여과액을 제공하는 단계;
상기 백혈구 잔류 필터를 통해 백혈구 세척 시약의 적어도 일부를 구동하여 세척된 저백혈구 여과액을 제공하는 단계;
상기 저백혈구 여과액의 적어도 일부를 병원균 포획 멤브레인을 통해 구동하는 단계;
상기 포획 멤브레인을 통해 병원균 재부유 용액의 적어도 일부를 구동하여 농축 병원균 현탁액을 제공하는 단계;
상기 농축 병원균 현탁액의 적어도 일부를 상기 제 1 용해 시약을 포함하고 있는 제 1 용해 시약 챔버로 구동하여 제 1 혼합물을 제공하는 단계;
상기 제 2 용해 시약 챔버로부터 제 2 용해 시약의 적어도 일부를 상기 제 1 용출 시약 챔버로 구동하여 제 2 혼합물을 제공하는 단계;
상기 2 혼합물의 적어도 일부를 상기 정제 멤브레인을 통하여 구동하여 여과액과, 상기 핵산 중 적어도 일부를 포함하는 농축액을 제공하는 단계;
상기 세척 시약의 적어도 일부를 상기 정제 멤브레인을 통하여 구동하여 세척된 농축액과 폐액을 제공하는 단계;
상기 세척된 농축액을 선택적으로 건조시키는 단계;
상기 용출 시약 챔버로부터 용출 시약의 적어도 일부를 상기 정제 매트릭스를 통해 구동하여 세척된 농축액으로부터 핵산의 적어도 일부를 수집하는 단계;를 포함한다.
본 명세서의 또 다른 발명은 전혈의 병원균으로부터 핵산을 정제하는 방법으로서,
청구된 장치의 샘플 수집 챔버에, 혈액 수집 튜브 내의 항응고처리된 전혈과 병원균을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
상기 혈액의 적어도 일부를 백혈구 잔류 필터를 통해 구동하여 저백혈구 여과액을 제공하는 단계;
상기 백혈구 세척 시약의 적어도 일부를 상기 백혈구 잔류 필터를 통해 구동하여 세척된 저백혈구 여과액을 제공하는 단계;
상기 잔류 필터를 통해 백혈구 재부유 용액의 적어도 일부를 구동하여 농축 백혈구 현탁액을 제공하는 단계;
상기 농축 백혈구 현탁액의 적어도 일부를 상기 제 1 용해 시약을 포함하고 있는 제 1 용해 시약 챔버로 구동하여 제 1 혼합물을 제공하는 단계;
상기 제 2 용해 시약 챔버로부터 제 2 용해 시약의 적어도 일부를 상기 제 1 용출 시약 챔버로 구동하여 제 2 혼합물을 제공하는 단계;
상기 2 혼합물의 적어도 일부를 상기 정제 멤브레인을 통하여 구동하여 여과액과, 상기 핵산 중 적어도 일부를 포함하는 농축액을 제공하는 단계;
상기 세척 시약의 적어도 일부를 상기 정제 멤브레인을 통하여 구동하여 세척된 농축액을 제공하는 단계;
상기 세척된 농축액을 선택적으로 건조시키는 단계;
상기 용출 시약 챔버로부터 용출 시약의 적어도 일부를 상기 정제 매트릭스를 통해 구동하여 세척된 농축액으로부터 핵산의 적어도 일부를 수집하는 단계;를 포함한다.
관련 발명에서, 상기 방법은, 백혈구 용해액을 상기 농축 백혈구 현탁액으로 구동하여 차동 용해된 현탁액을 제공하는 단계; 상기 차동 용해된 현탁액의 적어도 일부를 병원균 잔류 필터를 통해 구동하는 단계; 상기 잔류 필터 세척 시약의 적어도 일부를 병원균 잔류 필터를 통해 구동하여 세척된 병원균 농축액을 제공하는 단계; 및 상기 병원균 농축액으로부터 핵산을 재부유, 용해 및 정제하는 단계;를 추가적으로 포함한다.
본 명세서의 다른 발명은 미처리된 샘플로부터 세포 용출액을 생성하기 위한 자기 수납형 장치이며, 상기 장치는 장비와 함께 사용되며, 상기 장치는 적어도 하나의 투입물과,
(ⅰ) 수집 기구로부터 미처리된 샘플을 수용하기 위한 챔버와, 적어도 하나의 충진된 시약 저장소를 포함하는 마크로유체 부품;
(ⅱ) 상기 마크로유체 부품과 적어도 하나의 마이크로유체 소자를 통해 소통하는 마이크로유체 부품; 및
(ⅲ) 상기 마이크로유체 소자를 통해 상기 시약을 구동하기 위한 상기 장비 상의 구동 메커니즘;을 포함하며,
상기 장치에 대한 투입은 상기 챔버와 상기 구동 메커니즘을 통해서만 이루어진다.
본 명세서의 또 다른 발명은 미처리된 샘플로부터 세포를 용해하기 위한 자기 수납형 장치이며, 상기 장치는 장비와 함께 사용되며, 상기 장치는 적어도 하나의 투입물과,
(ⅰ) 수집 기구로부터 미처리된 샘플을 수용하기 위한 챔버와, 적어도 하나의 미리 충진된 용해액 저장소를 포함하는 마크로유체 부품;
(ⅱ) 상기 마크로유체 부품과 적어도 하나의 마이크로유체 소자를 통해 소통하는 마이크로유체 부품; 및
(ⅲ) 상기 마이크로유체 소자를 통해 상기 저장소 내의 시약을 구동하기 위한 상기 장비 상의 구동 메커니즘;을 포함하며,
상기 장치에 대한 투입은 상기 챔버와 상기 구동 메커니즘을 통해서만 이루어진다.
관련 발명에서, 샘플로부터 세포를 용해하는 방법은, 적어도 하나의 투입물을 포함하는 장치를 사용하는 단계; 세포를 포함한 샘플을 챔버에 제공하는 단계; 상기 챔버에 상기 용해 시약을 도입하여 혼합물을 제공하는 단계; 및 상기 혼합물에 기포를 발생시켜 교반된 혼합물을 제공하는 단계;를 포함하며, 상기 교반된 혼합물은 용해된 세포를 포함한다.
본 명세서의 또 다른 발명은 미처리된 샘플로부터 세포의 현탁액을 생성하기 위한 자기 수납형 장치이며, 상기 장치는 장비와 함께 사용되며, 상기 장치는 적어도 하나의 투입물과,
(ⅰ) 수집 기구로부터 미처리된 샘플을 수용하기 위한 챔버와, 실질적으로 등장성의 시약을 저장하는 적어도 하나의 충진된 시약 저장소를 포함하는 마크로유체 부품;
(ⅱ) 상기 마크로유체 부품과 적어도 하나의 마이크로유체 소자를 통해 소통하는 마이크로유체 부품; 및
(ⅲ) 상기 마이크로유체 소자를 통해 상기 시약을 구동하기 위한 상기 장비 상의 구동 메커니즘;을 포함하며,
상기 장치에 대한 투입은 상기 챔버와 상기 구동 메커니즘을 통해서만 이루어진다.
다른 발명에서, 청구된 신규한 장치를 포함하는 상기 장비는 열 순환, 모세관 전기영동, 마이크로유체 전기영동, 핵산 단편 사이징, STR, Y-STR, 미니-STR, 단일 염기 다형성, PCR, 고도로 다중화된 PCR, 실시간 PCR, 역전사 PCR, 시퀀싱, 혼성화, 마이크로어레이, VNTR, 면역분석, 질량분석 및 RFLP 분석 중 적어도 하나를 수행한다.
또 다른 발명에서, 본 발명의 장치는 열 순환, 모세관 전기영동, 마이크로유체 전기영동, 핵산 단편 사이징, STR, Y-STR, 미니-STR, 단일 염기 다형성, PCR, 고도로 다중화된 PCR, 실시간 PCR, 역전사 PCR, 시퀀싱, 혼성화, 마이크로어레이, VNTR, 면역분석, 질량분석 및 RFLP 분석 중 적어도 하나를 수행하는 다른 장비 내에 위치되거나 접속될 수 있다.
청구된 장치 및 장비가 온도, 습도 및 부유 입자중 적어도 하나의 전달 및 극한을 견디도록 내구성이 높게 제조된 것 또한 본 명세서의 발명이다.
도 1은 혈액 샘플로부터 생물학적 위협 탐지에 적합한 장치를 도시한 도면이고,
도 2는 정제 카트리지를 사용한 바실러스균(Bacillus subtilis)의 근사량적 회복을 보여주는 전기영동도이며,
도 3은 혈액 샘플용 정제 카트리지의 측면도로서, 혈액 수집 튜브는 참조번호 1, 커버는 참조번호 2, 마크로유체 부품은 참조번호 3, 마이크로유체 부품은 참조번호 4, 공압 인터페이스 포트는 참조번호 5로 표시되어 있고,
도 4는 혈액 샘플용 정제 카트리지의 마크로유체 부품의 측면도로서, 마크로유체 부품은 참조번호 3, 제 1 세척 시약 저장소는 참조번호 6, 용출액 균질화 챔버는 참조번호 7, 폐액 챔버는 참조번호 8, 용출 시약 저장소는 참조번호 9, 재부유 용액 저장소는 참조번호 10, 용해 챔버는 참조번호 11, 에탄올 저장소는 참조번호 12, 용해액 저장소는 참조번호 13, 보관 챔버는 참조번호 14, 제 2 세척 시약 저장소는 참조번호 15, 혈액 수집 튜브 공동은 참조번호 18로 표시되어 있으며,
도 5는 혈액 샘플용 정제 카트리지의 공압층의 평면도로서, 공압 채널은 참조번호 17, 마크로유체 부품의 시약 저장소와 챔버로의 관통 개구는 참조번호 18, 공압 인터페이스 포트는 참조번호 19로 표시되어 있고,
도 6은 혈액 샘플용 정제 카트리지의 마이크로유체 층의 평면도로서, 유체 채널은 참조번호 20, 트랙 에칭 멤브레인은 참조번호 21, 류코소르브 필터는 참조번호 22, 정제 필터는 참조번호 23으로 표시되어 있으며,
도 7은 법의학 카트리지의 측면도로서, 면봉 캡은 참조번호 24, 커버는 참조번호 25, 마크로유체 부품은 참조번호 26, 마이크로유체 부품은 참조번호 27, 공압 인터페이스 포트는 참조번호 28로 표시되어 있고,
도 8은 법의학 카트리지의 마크로유체 부품의 측면도로서, 마크로유체 부품은 참조번호 26, 세척 시약 저장소는 참조번호 29, 용출액 균질화 챔버는 참조번호 30, 용출 시약 저장소는 참조번호 31, 면봉 챔버는 참조번호 32, 에탄올 저장소는 참조번호 33, 용해 시약 저장소는 참조번호 34, 보관 챔버는 참조번호 35로 표시되어 있으며,
도 9는 법의학 카트리지의 공압층의 평면도로서, 공압 채널은 참조번호 36, 시약 저장소로의 관통 개구는 참조번호 37, 공압 인터페이스 포트는 참조번호 38로 표시되어 있고,
도 10은 법의학 카트리지의 마이크로유체 부품의 평면도로서, 유체 채널은 참조번호 39, 입자 필터는 참조번호 40, 정제 필터는 참조번호 41로 표시되어 있으며,
도 11은 구강 면봉으로부터 정제된 DNA에서 얻은 STR 프로파일이고,
도 12는 건조된 혈흔 샘플로부터 정제된 DNA에서 얻은 STR 프로파일이며,
도 13은 침에서 분리된 타액으로부터 정제된 DNA에서 얻은 STR 프로파일이고,
도 14는 접촉 샘플로부터 정제된 DNA에서 얻은 STR 프로파일이며,
도 15는 경부 면봉 카트리지의 측면도로서, 면봉 캡은 참조번호 42, 커버는 참조번호 43, 마크로유체 부품은 참조번호 44, 마이크로유체 부품은 참조번호 45, 공압 인터페이스 포트는 참조번호 46으로 표시되어 있고,
도 16은 경부 면봉 카트리지의 마크로유체 부분의 측면도로서, 세척 시약 저장소는 참조번호 47, 용출액 균질화 챔버는 참조번호 48, 용출 시약 저장소는 참조번호 49, 면봉 챔버는 참조번호 50, 에탄올 저장소는 참조번호 51, 용해 시약 저장소는 참조번호 52, 보관 챔버는 참조번호 53으로 표시되어 있다.
본 발명은 다양한 생물학적 샘플 유형으로부터 핵산을 신속하고 효율적으로 정제하기 위해 사용될 수 있는 일련의 장치, 장비 및 방법을 제공한다. 본 명세서의 예에 설명된 바와 같이, 핵산은 마크로유체 및 마이크로유체 특성을 모두 구비한 기구와 그에 수반한 장비에 기반하여 정제될 수 있다. 일반적으로, 본 발명의 장치의 마크로유체 부품은 1 내지 1000 mL 또는 그 이상의 총체적과 1 mL 및 그 이상의 개별 체적을 가진 (샘플, 시약 저장소, 반응, 보관, 균질화 및 폐액 챔버를 포함한) 챔버들을 포함한다. 1 내지 250 mL 범위의 총체적이 특히 바람직하다. 또한, 마크로유체 부품은 20 내지 1000 μL의 체적을 가진 챔버를 선택적으로 포함할 수 있다. 마이크로유체 부품은 마이크로리터 및 나노리터 체적을 가진 마이크로유체 소자를 포함한다. 마이크로유체 소자는 0.1 내지 1000 μL의 개별 체적을 갖는 것이 바람직하며, 개별 소자가 0.1 내지 100 μL 범위의 체적을 갖는 것이 특히 바람직하다.
본 발명의 교시는, 핵산 생성물이 별도로 제거되고 분석될 수 있거나 핵산이 통합된 장비 내의 분석 모듈로 직접 전달될 수 있도록, 핵산 정제에 적용될 수 있다. 그러한 통합에 대한 접근법과 분석의 유형은 탄 등의 국제 특허출원 제PCT/US08/04462호의 "통합된 핵산 분석"에 개시된 것을 포함하며, 상기 특허출원은 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서에 통합되었다.
본 발명의 장치 및 장비는 미처리된 생물학적 샘플로부터 핵산이 정제될 수 있도록 한다. 미처리된 생물학적 샘플은 (샘플 수집 장비가 처리에 앞서 라벨 부착되거나 및/또는 저장될 수 있을지라도) 개인에 의해 수집되어 중간 처리 단계 없이 장치의 샘플 수용 챔버로 삽입되는 것들이다. 운영자는 샘플을 단지 수집하거나 구하여 장치에 삽입하고, 장치를 장비에 삽입(장치가 이미 장비 내에 위치된 경우에는 불필요함)한 다음 시작 버튼을 누르면 된다. 장치에 삽입하기 전에 샘플에 대한 처리, 조작, 또는 변경이 필요하지 않으며, 운영자가 면봉을 절단하거나, 혈액 튜브를 개방하거나, 조직 또는 생물학적 유체를 수집하거나, 다른 홀더로 샘플을 전송하거나, 샘플을 시약 또는 조건(예를 들어, 가열, 냉각, 진동)에 노출할 필요가 없다. 따라서, 운영자가 생물학적 과학지식 또는 실험 기술에 대한 강도높은 훈련을 받을 필요가 없다.
본 발명의 장치는 장치에 대한 투입이 샘플 수용 챔버와 구동 메카니즘에 의해서만 이루어지는 자기 수납형이다. 필요한 모든 시약이 장치의 미리 충진된 시약 저장소 내에 존재하기 때문에, 운영자가 처리 시약을 장치에 추가할 필요가 없다. 장치 내부에 모든 시약이 포함되어 있다는 사실은 작업의 용이성에 중요한 요소이다. 마찬가지로, 장비가 정제 처리 시약을 포함하지 않기 때문에, 운영자는 장비에 시약을 추가할 필요가 없다. 장치의 자기 수납 특성은 운영 절차, 유지 보수 절차 및 운영자 요구조건을 최소화한다. 이를 종합하면, 자기 수납형 장치와 미처리된 샘플의 사용은 핵산 정제 과정을 대폭 간소화한다. 본 발명의 자기 수납형 장치의 또 다른 장점은, 이 포맷이 샘플 오염의 가능성뿐만 아니라 샘플, 시약 및 공정 폐기물에 대한 운영자의 노출을 모두 줄일 수 있다는 것이다.
또한, 본 발명의 장치 및 장비는 통상의 실험실 환경 외부에서 실행될 수 있도록 설계되었다. 응용 분야에 따라, 이들은 온도, 습도 및 부유 입자의 전달 및 극한을 견디도록 내구성이 높게 제조될 수 있다. 사무실, 실외, 전장, 공항, 국경 및 항구, 검문소 등에서 비숙련자에 의한 본 발명의 이용은 사회에서 유전 기술이 보다 광범위하게 응용될 수 있도록 한다. 자기 수납형 장치에서 미처리된 샘플의 사용은 본 발명에 따른 방법의 광범위한 응용을 더 지원한다.
실제로, 생물학적 샘플은 본 발명의 장치와 함께 모두 사용할 수 있는 무수히 많은 수집 기구를 이용하여 수집된다. 일반적으로 수집 기구는 상업적으로 이용가능할 수 있지만, 주어진 응용분야에 따라 특수하게 설계 및 제조될 수도 있다. 임상 샘플에 있어서, 비강, 비인강, 구강, 구강액, 대변, 편도선, 질, 경부 및 상처 면봉을 포함하여 다양한 유형의 상용 면봉이 사용될 수 있다. 샘플 수집 기구의 크기와 소재는 다양하며, 특수한 손잡이, 캡, 파손을 용이하게 하고 파손 방향을 규정하는 눈금, 및 수집 매트릭스를 포함할 수 있다. 혈액 샘플은 상업적으로 이용가능한 다양한 체적의 광범위한 튜브로 수집될 수 있으며, 그중 일부는 (예를 들어, 헤파린, 구연산염 및 EDTA와 같은 항응고인자를 포함한) 첨가제, 샘플 투입을 용이하게 하는 진공, 바늘의 삽입을 용이하게 하는 스토퍼, 운영자가 샘플에 노출되지 않도록 하는 커버를 포함할 수 있다. 조직 및 체액(예를 들어, 가래, 고름 물질, 흡인액)도 일반적인 혈액 튜브와 구별되는 튜브로 수집된다. (신속한 구균 실험을 위한 인후/편도선 면봉에 대한 검사와 같은 특정 실험이 현장에서 수행될 수도 있으나) 이러한 임상 샘플 수집 기구는 일반적으로 실험을 위해 복잡한 병원 또는 상업적 임상 실험실로 보내진다. 환경 샘플은 (예를 들어, 환기 장치, 에어로졸 또는 물 여과 장치 등의) 필터 또는 필터 카트리지, 면봉, 분말 또는 유체로서 존재할 수 있다.
범죄 현장으로부터의 생물학적 증거 수집은, 다양한 표면으로부터 다수의 세포를 모으고, 분자 손상을 최소화하기 위해 수집된 세포를 보존하고, 하류 처리를 위해 수집된 물질의 방출을 허용하는 과정이다. 혈액, 정액, 상피 세포, 소변, 타액, 대변, 다양한 조직 및 뼈가 범죄 현장과 연관될 수 있으며, 신중하고 효과적인 수집을 필요로 한다(리, 에이치.씨. 등 (1998) "DNA 분류의 법학적 응용" 2부: DNA 증거의 수집 및 보존" Am J Forensic Med Pathol 19(1):10-8).
법의학 증거에 대한 일반적인 수집 기술은 면봉을 사용하여 수행된다. 하나의 면봉이 현장에서 취해지며, 습식-건식 이중 면봉 기술이 사용될 수 있다. 이중 면봉 기술은 가장 널리 사용될 수 있으며, 물, 식염수 또는 용해 버퍼를 포함한 여러가지 다수의 유체가 제 1 면봉을 습윤시키기 위해 사용될 수 있다(리먼스, P. 2006. "지문의 검사능 개선 전후의 LCN-DNA 분리 및 분석을 위한 평가 및 방법론" Int Congress Ser 1288:583-5). 이 기술은 건조된 샘플이 다시 수산화될 수 있도록 하며, 제 1 면봉으로 대부분의 물질을 수집하고, 제 2 면봉으로 나머지 샘플을 수집한다. 코튼과 아울러, 면봉 수집 매트릭스는 천연섬유(코튼)와 합성 매트릭스(개질 셀룰로오스, 발포제, 나이론, 폴리에스터 및 레이온)와 같은 다양한 재료로 구성될 수 있다. 면봉은 Bode(로튼, 버지니아), Puritan(길퍼드, 메인), Fitzco(스프링 파크, 미네소타), Boca(코랄 스프링스, 플로리다), Copan(무리에타, 캘리포니아) 및 Starplex(에토비코크, 올드노스, 캐나다)로부터 상업적으로 이용가능하다. 또한, 면봉 작업은 거즈와 같은 재료, 일회용 브러쉬 또는 상용 생물학적 샘플링 키트를 이용하여 실시될 수 있다(로크, 씨. 및 샤프, 제이. 2007 "우표로부터 DNA를 추출하기 위한 신규한 접근법" Forensic Science Communications 9(1)).
또 다른 법의학 수집 기술은 의복으로부터 생물학적 유체와 같은 관심의 영역의 절단물을 획득하는 것을 포함하지만, 이는 증거의 무결성을 파괴한다. 또한, 인간의 DNA를 포함할 수 있는 흔적 증거를 수집하기 위해 다양한 표면에 대하여 접착 테이프 리프트가 사용된다. FTA 카드(왓먼 피엘씨, 켄트, 영국)와 같은 카드도 샘플을 수집하기 위해 사용된다.
사람에 존재하는 각각의 생물학적 증거는 종종 구강 면봉을 이용하여 수집된다. 널리 사용되는 상용 구강 면봉은 SecurSwab(더 보드 테크놀로지 그룹, 로튼, 버지니아)이다. 구강 샘플은 피험자 또는 운영자가 입안의 뺨 안쪽면에 면봉을 넣고 1회 또는 그 이상 위아래로 면봉을 움직이도록 함으로써 수집된다.
본 발명의 미처리된 샘플이 수집된 후, 그들이 즉시 처리되지 않을 경우, 그들은 때로는 곰팡이 또는 박테리아의 성장을 억제하기 위해 건조될 수 있다. 일반적으로, 증거 표본은 플라스틱으로 즉시 밀봉되지 않는데, 이는 미생물의 성장을 유발하고 DNA를 손상시킬 수 있다. 일반적으로, 면봉이나 절단물은 종이 또는 판지로 만들어진 통기성 컨테이너 내에 위치된다. 시원하고 건조한 환경에 수집된 증거를 저장하면 샘플의 손상을 최소화하게 된다(리, 에이치.씨. 및 라드, 씨. (2001) "생물학적 증거의 보전 및 수집" Croat Med J 42(3):225-8). 법의학계에 진정으로 도움이 되기 위해서는, 핵산 정제 장치, 장비 및 방법이 상용 수집 기구로부터 고도로 정제된 핵산을 얻을 수 있어야 하고, 허용된 법의학적 수집 및 분석 프로토콜과 호환가능하여야 한다.
샘플의 종류에 관계없이, 장치의 샘플 수용 챔버와 (만약 있다면) 커버는 샘플 수집 기구가 끼워맞춤되도록 설계된다. 헝겊이나 접착 테이프와 같은 샘플(예를 들어, 손잡이 또는 캡이 없는 샘플 수집 기구)의 경우, 이들이 챔버 내부에 위치된 후, 끼워맞춤 캡이 커버상에 위치되어 챔버를 폐쇄한다. 응용 분야에 따라, 샘플 수집 장치는 장치에 대해 (가역적으로 또는 비가역적으로) 로킹될 수 있다. 더욱이, 상기 기구와 장치는 (기밀 및 수밀) 씰(seal)을 형성할 수 있으며; 이 경우, 배기구 또는 배기 멤브레인이 챔버로의 유체 흐름을 허용하도록 배치될 수 있다. 달리 명시되지 않는 한, 상기 장치의 임의의 지점으로부터 유체를 수용하는 상기 장치의 챔버는 챔버를 충진하는 동안 공기가 탈출할 수 있도록 배기구 또는 배기 멤브레인을 포함하여야 한다.
본 발명의 장치는 서로 소통하는 마크로유체 부품과 마이크로유체 부품을 포함한다. 상기 마크로유체 부품은 샘플 수집 기구로부터 생물학적 샘플을 수용하는 샘플 챔버와, 정제 시약 저장소, 보관 챔버, 균질화 챔버, 계측 챔버, 반응 챔버, 혼합 챔버 및 폐액 챔버를 포함할 수 있는 기타 챔버들을 포함한다. 상기 마이크로유체 부품은 핵산 정제 배지 및 적어도 하나의 마이크로유체 피쳐(feature) 및 하나의 공압 구동 라인을 포함하는 챔버를 포함한다. 상기 마크로유체 챔버는 마이크로유체 피쳐와 소통하고, 상기 마크로유체 챔버들은 마이크로유체 부품을 통해 서로 소통한다. 하나의 마크로유체 챔버로부터 나온 유체는 마이크로유체 부품을 통과하여 다시 다른 마크로유체 챔버로 전달된다. 챔버들의 체적은 정제된 핵산의 용도에 의해 결정된다. 예를 들어, 용출액 저장소의 체적은 정제된 핵산의 최종 농도가 후속 반응에 최적화되도록 선택된다.
본 발명의 장치에서 정제 처리된 후, 제공된 핵산 용액은 추가적 분석 단계를 위해 이송될 수 있다. 상기 핵산 용액은 동일한 장비 내부의 다른 분석 모듈로 자동으로 이송될 수 있으며, 또는 장치 자체가 호환가능한 장비로 이송될 수 있다. 대안적으로, 정제된 핵산 샘플을 수집하는 챔버는 제거가능한 핵산 저장 튜브를 포함할 수 있다. 본 발명에 따라 처리된 샘플은 핵산 단편 사이징, STR, Y-STR 및 미니-STR, 단일 염기 다형성, PCR, 고도로 다중화된 PCR, 실시간 PCR, 역전사 PCR, 시퀀싱, 혼성화, 마이크로어레이, VNTR, 및 RFLP 분석을 포함하지만 이에 한정되지 않는 광범위한 분석 방법을 위한 전구체일 수 있다. 마찬가지로, 본 발명의 장치, 방법 및 장비는 일반적으로 면역분석, 단백질 및 질량 분광분석과, 당업자에게 잘 알려진 기타 분석 방법에도 적용될 수 있다.
또한, 본 발명의 장치는 장비의 구동 메커니즘과 각각의 개별 챔버 사이의 채널을 따라 선택적인 커버를 가질 수 있다. 또한, 상기 커버는 챔버 내부의 가스를 외부로 배출하고, 삽입된 샘플 수집 기구를 로킹하는 선택적 기능을 제공한다. 상기 커버는 바람직하게는 플라스틱으로 제조된 적어도 하나의 층을 포함한다. 공압 채널의 수 또는 경로의 복잡성 및 다른 피쳐가 증가함에 따라 추가적인 층이 부가될 수 있다. 층 피쳐는 마크로유체식 또는 마이크로유체식일 수 있으며, 피쳐들은 CNC 가공, 고온 엠보싱 패턴, 다이 커팅, 또는 플라스틱 시트의 레이저 커팅, 또는 열가소성 수지의 사출 성형에 의해 제조될 수 있다. 또한, 층에 대한 배기 멤브레인의 결합은 용접 및 접합에 의해 이루어질 수 있다. 2개 또는 그 이상의 층이 필요한 경우, 개별 층들이 단일 파트를 형성하도록 함께 접합된다. 커버 제조를 위한 접합 방법은 열 접합, 용매 접합, 초음파 접합, 접착제 및 레이저 접합을 포함한다.
상기 장치의 마이크로유체 부품은, (독립적이거나, 연결되거나 또는 네트워크화될 수 있는) 채널, 저장소, 밸브, 반응 챔버, 액체 및 동결 건조된 시약 저장 챔버, 혼합 챔버, 혼합 소자, 배기 소자, 접근 개구, 펌프, 계측 소자, 가열 소자, 자석 소자, 반응 챔버, 여과 소자, 정제 소자, 구동 라인, 액츄에이션 라인, 광 여기 및 검출 영역, 광학 윈도우를 포함하여, 다양한 정교한 피쳐 또는 마이크로유체 소자를 포함할 수 있다. 상기 장치의 마이크로유체 부품은 채널 내의 유체 흐름을 중지시키거나 허용하는 유동 제어 밸브를 사용할 수 있다. 밸브는 수동이거나 가장 바람직하게는 능동일 수 있고, 마이크로유체 기구의 밸브 방식은 당업계에 공지되어 있다(장, 씨. 등 (2007) "PCR 마이크로유체 칩 내의 마이크로펌프, 마이크로밸브, 마이크로믹서: 진보와 경향" Biotechnol Adv 25(5):483-514에서 검토됨). 능동 밸브 구조는 기계식(열공압식 및 형상 기억 합금), 비기계식(하이드로겔, 졸-겔, 파라핀 및 얼음) 및 외부(내장 모듈, 공압식, 비공압식) 마이크로밸브를 포함한다. 상기 공압식 및 기계식 마이크로밸브 구조는 탄성 또는 비탄성 멤브레인을 응용할 수도 있다. 수동 밸브는 인라인 중합 겔, 수동 플러그 및 소수성 밸브를 포함한다.
본 발명의 방법에 필요한 유체는 핵산 정제 시약 및 가스(예를 들어, 공기, 질소 또는 산소)이다. 정제 시약 및 배지는 문헌에 잘 특징지워진 임의의 방법에 기반할 수 있으며, 실리카 매트릭스/무질서유발제(붐, 알. 등 (1990), 상술함), 실리카 매트릭스/비무질서유발제, 이온 교환, 및 당업계에 공지된 바와 같은 다수의 물질을 포함한다. 그러한 많은 방법들이 분자 생물학의 현재 프로토콜 (아서벨 ㄷ등에 의해 편집됨, John Wiley and Sons, 2010)에 요약되어 있다. 마찬가지로, 많은 유형의 정제 배지가 상기 장치에서 사용될 수 있다. 실리카 핵산 결합 멤브레인들은, 예를 들어, 크기, 기공 크기, 유량, 잔류 체적, 시약 호환성, 및 결합 용량이 다르고, 주어진 응용에 따라 적절한 멤브레인이 선택된다. 또한, 분리되는 세포 물질의 물리적, 화학적 특성에 기반하여 세포 분리 배지도 선택된다. 마지막으로, 몇몇 경우에서, 하류의 분리 또는 정제 프로세스를 억제, 지연 또는 방해할 수 있는 입자를 바람직하게 제거하기 위하여, 입자 제거 필터가 사용될 수 있다. 많은 법의학 실시예에서, 입자 제거 필터는 바람직하다.
장치를 통한 유체 이송을 허용하는 구동 메커니즘은 공압식, 기계식, 자기식, 유체식, 또는 유체 운동의 정밀한 제어를 허용하는 다른 수단일 수 있다. 공압식 구동은 하나 이상의 구동 라인을 통해 장치에 대한 공기(또는 다른 가스들)의 제어된 흐름, 또는 제어된 압력, 또는 제어된 체적 변위를 가능하게 하며, 특히 바람직하다. 공압식 구동 라인은 액체를 이동시키고, 기포를 발생시키며, 호일을 파열시키고, 기계적 피쳐를 작동시키며, 주어진 핵산 정제 방법에 필요한 기타 다른 운동을 수행하기 위해 활용될 수 있다. 장비의 구동은 장치의 구동 라인과 인터페이스 되어야만 한다. 공압식 구동에 있어서, 인터페이스는 장치의 하나 또는 그 이상의 마크로유체 또는 마이크로유체 영역에 위치될 수 있다. 상기 구동은 장비 내에 수용되며, 전원, 장치를 수용하기 위한 하우징, 환경 노출로부터의 보호 및 저항을 허용하는 피쳐, 온보드 컴퓨터, 공정 제어기, 모니터, 및 실시되는 핵산 분석에 기반한 다른 피쳐를 또한 포함할 수 있다. 공압식 구동 시스템은 하기 부품들을 포함할 수 있다: 즉, 펌프, 전자기계식 밸브, 압력 조절기, 압력 탱크, 튜브, 공기 매니폴드, 및 유동 및 압력 센서. 공압식 구동 시스템은 장치의 각 공압 라인에 대한 규정된 유동, 압력, 또는 체적의 생성 및 전달을 허용한다. 공정 제어기는 미처리된 샘플이 장치에 삽입된 후 프로그램된 스크립트를 실행할 수 있다. 구동 메커니즘의 하나 이상의 클래스가 장치와 함께 활용될 수 있다. 그러나, 단일의 구동 메커니즘, 바람직하게는 공압식 메커니즘의 사용은 장비와 장치 모두의 복잡성을 줄인다.
샘플 챔버에서, 생물학적 샘플은 다양한 방법으로 용해될 수 있다. 무질서 버블링은 마크로유체 부품의 챔버로의 유체 유동, 바람직하게는 공기의 유동에 의해 발생된다. 유동은 난류일 수 있으며, 이는 세포 용해에 기여하는 전단력을 유발할 수 있고, 시약의 혼합 또는 균질화를 위해 적합할 수 있다. 용해를 강화하는 다른 방법은 진동, 초음파 및 열에 의한 기계적 액츄에이션을 포함한다.
본 발명의 일 실시예에서, 정제되는 핵산은 DNA이다. 다른 실시예들은 RNA 및 총핵산의 정제를 기반으로 한다. DNA, RNA, 및 총핵산의 정제를 위해 필요한 시약은 당업계에 잘 알려져 있다. 예를 들어, 저드, 디.티. 등의 RNA 정제 및 분석: 샘플 준비, 추출, 크로마토그래피 (2009 Wiley-VCH Pub.); 아수벨, 에프.엠. 등의 (Eds)., 분자 생물학에서의 현재 프로토콜 (2008 John Wiley Pub.) 참조. 본 발명의 다른 실시예에서, 상기 장치는 세포 분리를 허용하는 마크로유체 및 마이크로유체 소자들을 포함한다. 이러한 소자들은, 적혈구로부터의 백혈구(WBC) 분리, 숙주 세포로부터의 박테리아 또는 바이러스 분리, 질 상피 세포로부터의 정자 세포 분리, 포유동물 숙주로부터의 세포내 바이러스 및 박테리아 분리를 포함하여, 다양한 세포 분리를 허용할 수 있다.
본 발명의 장치는 다양한 방식으로 제조될 수 있다. 제조되는 장치의 수와 제조에 할당된 시간과 비용에 기초하여, 다양한 방법이 이용가능하다. 상기 장치는 유리로 제조될 수 있으며, 또는 더 바람직하게 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 환형 올레핀계 중합체 및 환형 올레핀계 공중합체와 같은 열가소성 고분자로 제조될 수 있다. 상기 장치는 하나 또는 그 이상의 파트, 마크로유체 및 마이크로유체로 제조될 수 있다. 상기 장치가 플라스틱 파트들로 제조되면, 상기 부품들은 클램핑, 열 접합, 초음파 접합, 용매 접합, 레이저 접합 또는 접착제 접합을 이용하여 함께 접합될 수 있다(접합 방법은 짜오와 드보우의 마이크로유체 나노유체 (2009년) 6:1-16에서 검토됨). 신속하고 간단한 제조 방법은 컴퓨터 수치 제어 기계가공에 의한 것이다. 다른 방법은 취입 성형, 압출 및 엠보싱을 포함한다.
바람직한 제조 방법은 사출 성형에 의한 것이다. 본 발명의 장치의 마크로유체 부분은 하나의 부분을 형성하기 위해 함께 사출 성형될 수 있는 관형 구조의 챔버 세트로 구성된다. 바람직하게, 각 챔버의 상부면은 개별 챔버 각각에 대하여 공압 구동을 제공하기 위해 커버에 공압식으로 결합된다. 바람직하게, 각 챔버의 바닥면은 마이크로유체 부품에 공압식으로 유체적으로 결합된다. 하나의 부분으로 사출 성형된 튜브형 구조는 96, 384 및 1,536개의 웰스를 가진 마이크로타이터 플레이트를 포함한다. 12x8 구조로 직경이 8.4 mm이고 깊이가 16mm인 96개의 웰스를 가진 미량 원심분리 플레이트는 터너(미국 특허번호 제6,340,589호)에 의해 개시되었다. 이 플레이트가 높은 실장 밀도로 고밀도의 관형 구조를 가지고 있지만, 이 튜브들의 깊이는 16mm 정도에 불과하다. 8 또는 12개의 튜브를 가진 PCR 튜브-튜브 스트립이 사출 성형에 의해 일직선으로 제조되었으며, 각각의 튜브는 0.2 mL를 수용할 수 있도록 직경이 8.65 mm이고, 깊이가 30 mm이다. 이들은 모두 게르켄(미국 특허번호 제4,713,219호)에 의해 개시된 플라스틱 반응 용기의 모든 결합 형태이다. 이러한 스트립 튜브는 낮은 실장 밀도를 갖고, 일직선으로 배향되어 있다. 마지막으로, 2개의 긴 결합된 튜브의 사출 성형이 스페하(미국 특허번호 제4,753,536호)에 의해 개시되었다.
마크로유체 부분의 관형 구조는 얇은 벽체를 갖는다. 사출 성형된 경우, 본질적으로 마크로유체 부분은 튜브가 천공된 고체 블럭에 대향하여 함께 유지되는 일련의 얇은 벽체의 튜브들이다. 튜브의 벽체 두께는 0.1 내지 5.0 mm이고, 바람직하게 0.3 내지 3.0 mm이며, 더 바람직하게 0.5 내지 1.5 mm이고, 보다 더 바람직하게 0.7 내지 1.3 mm이며, 가장 바람직하게 0.9 내지 1.2 mm이다.
바람직하게, 상기 마크로유체 부분의 사출성형된 관형 구조는 16mm를 초과하는 18mm, 20mm, 25mm, 30mm, 40mm, 50mm, 60mm, 70mm, 80mm, 90mm 또는 100mm의 튜브 길이를 갖는다. 관형 구조는 2차원 구조로 지향되어 있다. 관형 구조의 상단은 선택적 커버에 대한 강력한 공압 결합을 구현하기 위해 평탄해야만 하고, 관형 구조의 바닥은 마이크로유체 부분에 대한 강력한 공압 및 유체 결합을 구현하기 위해 평탄해야만 한다. 관형 구조의 간격은 마이크로유체 부분의 점유공간과 정확하게 일치하도록 유지되어야만 한다. 관형 구조는 마이크로유체 부품과의 정밀한 인터페이싱을 용이하게 하기 위해 상단부터 바닥까지 테이퍼질 수 있다. 마찬가지로, 관형 구조의 형태는, 무질서 버블링과 혼합을 용이하게 하기 위해 하부를 좁게하거나, 샘플 수집 기구의 위치를 유지하기 위해 중앙 또는 상부를 좁게 하는 것과 같이, 특수한 목적을 위해 조절될 수 있다.
마크로유체 부품의 관형 구조는 밀집되게 실장되며, 부품의 상단에서 약 200 mm2, 더 바람직하게는 약 150 mm2의 표면적 당 한 개의 튜브가 존재한다. 다른 응용예에서, 부품의 상단에서 바람직하게는 약 100 mm2의 표면적 당 한 개의 튜브가 존재하며, 가장 바람직하게는, 부품의 상단에서 약 50 mm2의 표면적 당 한 개의 튜브가 존재한다. 마찬가지로, 튜브 구조에 의해 점유된 표면적은 마크로유체 부품의 상단의 전체 면적과 비교할 때, 30 % 이상, 더 바람직하게 40% 이상이다. 다른 응용예에서, 50% 이상, 보다 더 바람직하게는 60% 이상, 가장 바람직하게는 90% 이상이다.
장치의 총 체적은 동시에 처리되는 샘플의 수와 챔버의 수 및 체적에 일부 기반한다. 체적은 적어도 2 mL이며, 45 mL, 65 mL, 100 mL, 500 mL, 1000 mL, 1500 mL 또는 그 이상일 수 있고, 바람직하게 45 내지 1500 mL 범위이며, 더 바람직하게는 65 내지 1500 mL 범위일 수 있다.
본 발명의 장치는 하나 또는 그 이상의 샘플을 수용하여 처리할 수 있다. 일부 실시예에 있어서, 상기 장치는 2, 4, 8, 16, 24, 36, 48, 96, 192, 또는 384개의 샘플을 수용하도록 구성될 수 있다. 유닛의 수가 증가함에 따라, 제조 방법이 변경될 수 있다. 예를 들어, 사출 성형으로 제조된 단일 샘플 유닛이 5-샘플 장치의 기반으로 사용될 수 있다. 5-샘플 장치 세트가 결합하여 10-샘플, 15-샘플 장치를 생성할 수 있다. 대안적으로, 15-샘플 장치가 단일의 대형 유닛으로서 제조될 수 있다. 본 발명의 장치, 장비 및 방법은 핵산의 신속한 정제를 가능하게 한다. 미처리된 샘플을 삽입한 후 프로세스가 개시된 시간부터 샘플로부터 정제된 핵산이 생성될 때까지, 바람직하게는 30분 미만, 더 바람직하게는 20분 미만, 보다 더 바람직하게는 10분 미만, 가장 바람직하게는 5분 미만이다.
실시예 I. 혈액에 존재하는 세포외 박테리아
포도구균, 연쇄구균 및 예르시아나 엔테로콜리티카와 같은 병원균이 혈액에 존재할 수 있다. 몇몇 경우에, 사람(또는 다른 동물 숙주)의 세포 성분으로부터 세포외 병원균을 분리하는 것이 유리하다. 예를 들어, 마이크로유체 기구의 장점을 최대한 활용하기 위하여, DNA 추출/정제 모듈의 최종 생성물인 정제된 DNA의 이상적인 체적은 25 μL 또는 그 이하이다. 이 체적은 마이크로유체 칩에 신속하게 전달되고 조작될 수 있다. 이 체적을 제한함으로써, 그러나, 그 체적 내에 존재할 수 있는 DNA의 최대량에 유사한 한계가 또한 적용된다. 3 mL의 전혈에 총 1500만개의 백혈구와 150개의 박테리아(mL 당 50 개)가 있는 것으로 가정한다. 이 샘플의 전체 DNA는 약 90 μg이며, 본질적으로 이 모든 것은 백혈구의 DNA에 기인한 것이다. 이 DNA가 25 μL의 용액에서 100 % 효율로 정제되고 복원된다면, DNA 농도는 3.6 mg/mL가 되고, PCR에 거의 확실하게 장애가 되며, 마이크로유체 조작을 위해서는 점도가 너무 높다(에프.비. 콕즈웰, 씨.이. 밴타, 티.지. 휴즈, 와이. 구, 및 엠.티 필립 (1996) 숙주 DNA는 PCR에 의한 피부 생검 시편에서 보렐리아 부르도르페리의 검출을 방해할 수 있다" J Clin Microbiology 34:980-982). 대조적으로, 25 μL에 존재하는 소량의 박테리아 DNA(약 5 Mbp/게놈 중 단지 250 게놈)는 약 1 pg이다. 전체 DNA의 10분의 1만이 마이크로유체 반응을 위해 사용될 것이며, 검출 한계는 정의하자면 10배 감소할 것이다. 혈액 체적이 증가할수록, 단위 혈액 체적 당 백혈구의 수는 증가하고, 마이크로유체 용액 체적은 감소하며, 샘플 당 유기체의 수는 감소하는데, 이 문제는 더욱 심각해진다. 이 분석으로부터 얻은 결론은, 특정 응용예에서(특히, 박테리아 부하가 초기 감염에서 낮은 경우), 최종 마이크로유체 체적에 도달하기 전에 대부분의 백혈구 DNA가 제거되어야 한다는 것이다. 이는 병원체 DNA의 대부분 또는 전부가 정제 후 분석될 수 있도록 한다. 마찬가지로, 환기구의 필터에 축적되는 것과 같은 배후 환경 DNA는 병원체 식별의 민감도와 특이성을 저해할 수 있다.
신선한 인간 전혈 3 mL에서 백혈구의 제거는 8 μm의 공칭 공극 크기를 가진 결합 배지를 13층으로 적층함으로써 구현되고(Leukosorb B 배지, Pall Corporation, 포트 워싱턴, 뉴욕), 0.25 psi의 초기 진공 압력을 이용하여 여과된 다음, 여과액의 최종 수집을 위해 25 psi로 증가된다. 결합 배지의 유용한 공극 크기의 범위는 1마이크론 내지 100마이크론 이상일 수 있으며, 분리되는 세포, 비리온, 박테리아, 곰팡이, 및 분리되는 입자의 종류에 따라 좌우된다. 1분 동안의 여과 작업이 완료되면 복원된 체적은 약 1.5 mL이다. 여과액에서 WBC의 수를 계산하면, 백혈구의 99 % 이상이 필터에 의해 잔류되었다는 것이 나타난다.
3 mL의 신선한 인간 전혈 샘플들에 100 μL의 고초균(ATCC® 7003 ™)이 소량 첨가되었으며, 각각의 100 μL는 샘플당 다양한 농도의 고초균을 포함하고 있다. 본 실험에서, 고초균은 병원성 유기체 및 생물학적 위협제(예를 들어, 탄저균)의 모델로서 사용되었다. 이러한 혈액-박테리아 샘플들은 도 1의 장치를 사용하여 적층 배지를 통과하게 된다. 그 후, 샘플 어플리케이션은, 처음에 결합 배지를 통과하지 못한 박테리아를 회수할 수 있도록 하는 3 mL TSB(트립신 소이 브로스 배지)로 세척된다. 약 4.5 mL의 수집된 관류는 단일 층의 0.2 μm 폴리카보네이트 트랙 에칭 멤브레인(SPI-Pore™ 트랙-에칭 멤브레인, 스트럭쳐 프로브 인코포레이티드, 웨스트 체스터, 펜실베니아)을 통과하고, 멤브레인 상에서의 포획을 통해 박테리아를 농축하게 된다. 이 농축 방법은 시약 체적, 정제 카트리지 저장소 챔버의 크기 및 공정 시간을 줄인다. 포획된 유기체들은 100 μL의 PBS(인산완충액)에서 재부유됨으로써 멤브레인의 표면으로부터 수집된다.
본 실시예에서, 박테리아 세포의 용해는 DNA 및 RNA에 대한 무질서유발염 추출 방법에 기반한 것이다. 특히, 바람직한 용해 완충액은 4M의 구아니디니움 하이드로클로라이드, 80mM의 Tris-HCL(pH 7.5), 20mg의 EDTA 및 5%의 Triton X-100(기타 유용한 용해 버퍼가 상술한 아수벨 등에 개시되어 있다). 100μL의 재부유된 유기체에 대하여, 최종 농도가 1 mG/mL인 프로테이나아제 K를 가진 용해 버퍼 450μL가 전달되어 공압 스크립트에 규정된 무질서 버블링 방법을 통해 정제 카트리지에서 완전히 혼합되었다. 이를 위하여, 550μL의 무수 (200 프루프) 에탄올이 첨가되고, 버블링에 의해 다시 혼합되었다. 용출액은 정제 장치의 마이크로유체 부분에서의 DNA 결합을 위해 실리카 기반 멤브레인을 마이크로유체식으로 통과하게 된다. 전체 용출액이 여과된 후, 상기 멤브레인은 200mM의 NaCl 용액 1 단위 체적, 200 프루프 에탄올 0.5 단위 체적, 및 > 99% 이소프로판올 0.5 단위 체적을 혼합하여 제조된 2 mL의 1X 세척액으로 세척된다. 세척 단계 후, 상기 멤브레인은 공압 시스템으로부터의 공기에 1분 동안 노출됨으로써 건조된다. pH 8.0, 20μL의 TE 버퍼에 DNA가 마침내 용출된다. 용해액 여과, 멤브레인 세척 및 건조, 그리고 용출액의 압력은 약 5 psi였다. 마이크로유체 바이오칩의 glnA(글루타민 합성효소) 프라이머를 이용하여 마이크로유체식으로 분리되고 검출된 고속 PCR 증폭(기세, 에이치. 등 (2009) "통상의 마이크로유체 STR 분석을 위한 고속 다중 중합효소 연쇄 반응" J Forensic Sci 54(6):1287-97)의 결과, 혈액 샘플 내의 투입물 카피에 비례한 신호 강도를 가진 고초균 glnA 유전자의 예상한 343-bp 단편 특성이 얻어졌다. PCR은 국제출원번호 제PCT/US08/04487호의 "목표 뉴클레오티드의 신속한 다중 증폭방법"에 개시된 바와 같은 고속 열 순환기와 바이오칩을 이용하여 실시되었으며, 상기 국제출원은 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서에 통합되었다. 분리와 검출은 국제출원번호 제PCT/US08/04462호의 "통합된 핵산 분석" 및 제PCT/US08/04405호의 "플라스틱 마이크로유체 분리 및 검출 플랫폼"에 개시된 바와 같은 Genebench에서 실시되었으며, 이 국제출원들은 인용에 의하여 그 전체가 본 명세서에 통합되었다. 도 2는 고초균의 약 2 Ge(genome equivalents)를 보여주는 전기영동도이며, 이는 33 cfu/mL의 혈액 샘플로부터 복원된 전체 물질의 단지 ~6%만 증폭되고, PCR 생성물의 40%를 전기영동 분석에 이용하였음을 나타낸다. 박테리아 복원은 준정량적이다.
대안적인 정량법은 Petroff-Hausser 챔버를 사용하는 것이다. 수집된 관류는 박테리아 복원에 대한 적층 배지의 여과 효과를 결정하기 위해 TSB-한천 플레이트에 플레이팅된다. 복원된 박테리아는 여과되지 않은 제어 샘플에 복원된 콜로니에 기반한 평판 배양 효율을 이용하여 표준화되었다. 혈액 내의 임상 관련 박테리아 농도에서, 약 100%의 박테리아가 복원되었다.
3 mL 의 혈액에서
예상한 박테리아 		여과 샘플을 플레이팅하여
복원된 콜로니의 수 		복원율 % 표준화된 복원율 %
~1000 860±239 85±18 104±10
~100 88±16 88±11 97±17
~10 9±2 96±19 103±26
도 3은 혈액 샘플을 위한 통합된 정제 카트리지를 도시하고 있다. 도 4, 도 5, 도 6은 통합된 정제 카트리지의 마크로유체 부품, 마이크로유체 부품의 공압층, 마이크로유체 부품의 마이크로유체층을 각각 도시하고 있다. 상기 장치의 마크로유체 부분(3)은 11개의 챔버(6-16)로 구성되며, DNA 정제 과정에서 보관/반응 챔버 역할을 하거나 미리 충진된 시약 용액을 유지한다. 하나의 챔버는 혈액 수집 튜브를 수용하기 위해 사용되며, 6개의 챔버는 3 mL의 세척 버퍼, 100 μL의 재부유 용액, 450 μL의 용해 용액, 550 μL의 무수 에탄올, 2 mL의 세척 버퍼 및 20 μL의 TE(pH 8) 용출 버퍼로 미리 충전된다.
상기 장치는 (분리 실험용) 표준 3cc 진공기 튜브를 수용하며, 혈액은 적절한 항응고제를 포함한 튜브에 수집되어야 한다. 혈액 수집 튜브(1)는 고무 스토퍼가 있는 단부를 아래로 하여 카트리지에 삽입된다. 사용자가 시작 버튼을 누르면, 정제 과정이 개시된다. 장비와 함께 장치가 자동화된 스크립트를 실행하고 정제된 DNA를 생성한다. 장비 내부에서, 혈액 수집 튜브는 혈액 수집 튜브 공동(16)의 베이스에 위치한 2개의 중공 핀을 향하여 밀리게 된다. 상기 중공 핀은 고무 스토퍼를 관통하여 유체적이면서 공압식으로 혈액 수집 튜브를 장치에 결합한다. 상기 혈액 수집 튜브(16)는 5 psi로 공압식으로 가압되어, 혈액 수집 튜브(16)로부터 류코소르브 필터(22) 및 트랙 에칭 멤브레인(21)을 통해 폐액 챔버(8)로 혈액을 구동한다. 상기 류코소르브 필터(22)를 통과하는 여과액은 분석을 위한 생물학적 물질(예를 들어, 박테리아성, 바이러스성 또는 곰팡이성 병원균)을 포함하며, 즉 백혈구 감소 여과액이다. 그 다음, 이 여과액은 트랙 에칭 멤브레인을 통해 구동되며, 문제의 병원균이 상기 멤브레인에 의해 잔류된다(병원체 포획 멤브레인의 공극 크기는 분석되는 병원균의 크기에 기초하여 선택된다). 세척 용액이 세척액 저장소 2(15)로부터 류코소르브 필터(22) 및 트랙 에칭 멤브레인(21)을 통해 폐액 챔버(8)로 공압식으로 구동된다. 재부유 용액 저장소(4-10)로부터 재부유 용액이 상기 트랙 에칭 멤브레인(6-21)의 표면에 도포된다. 이 용액은 트랙 에칭 멤브레인 상에 잔류된 병원균을 재부유시키고, (잔류 백혈구를 포함할 수 있는)농축된 병원체 재부유액을 생성한다. 이 재부유액은 용해/폐액 챔버(11)로 공압식으로 구동된다. 용해 시약이 상기 용해 챔버(11)로 공압식으로 구동된다. 상기 용해/폐액 챔버(11)로 공기가 공압식으로 구동되어, 용해/폐액 챔버(11) 내에서 용출액의 무질서 버블링을 유발한다. 이 버블링은 용출액 유동을 생성하여 세포 용해를 가능하게 한다. 에탄올이 에탄올 저장소(12)로부터 상기 용해/폐액 챔버(11)로 구동된다. 모든 에탄올이 제공된 후, 에탄올 저장소(12)를 통해 계속된 공압식 구동은 상기 용출액 및 에탄올 용액을 공기가 통과하도록 하여 무질서 버블링에 의한 혼합이 이루어지게 한다. 모든 용출액과 에탄올 혼합물은 보관 챔버(11)로 공압식으로 구동된다. 용출액과 에탄올 혼합물은 상기 보관 챔버(11)로부터 정제 멤브레인(23)을 통해 용해/폐액 챔버(11)로 공압식으로 구동된다. 세척 용액은 세척액 저장소 1(6)로부터 정제 멤브레인(23)을 통해 용해/폐액 챔버(11)로 공압식으로 구동된다. 이는 결합되지 않은 물질과 잔류 용해 용액을 제거한다. 모든 세척 용액이 제공된 후, 세척액 챔버(6)를 통해 계속된 공압식 구동은 정제 필터를 공기가 통과하도록 하여 상기 필터를 건조시킨다. 용출 용액이 용출액 저장소(9)로부터 정제 맴브레인(6-23)을 통해 용출액 균질화 챔버(7)로 공압식으로 구동된다. 모든 용출 용액이 제공된 후, 용출액 저장소(9)를 통해 계속된 공압식 구동은 용출액 균질화 챔버(7)를 공기가 통과하도록 하여 무질서 버블링에 의한 혼합이 이루어지게 한다. 상기 용출액 균질화 챔버(7) 내부의 균질화되고 정제된 DNA 용액은 후속 분석을 위한 준비가 되어 있다.
실시예 II . 혈액에 존재하는 세포내 박테리아.
야토균(Francisella tularenis)과 클라미디아 트라코마티스(Chlamydia trachomastis)와 같은 특정 박테리아는 수명 주기의 상당 부분을 포유류의 세포 내에서 소비한다. 일부는 세포내 유기체이며, 다른 것들은 선택적으로 세포내 유기체이다. 알려진 인간 병원균에 대한 포괄적인 요약이 고르바흐, 에스.엘. 등에 의해 제공되었다(Eds. 전염병(3판)(2004 리핀코트 윌리엄스 & 윌킨스 퍼브)). 혈액의 이러한 세포내 박테리아에 대한 DNA 정제 프로세스는 중요한 예외를 빼고 세포외 박테리아의 그것과 유사하다. 세포 분리 필터에 전혈을 도포하여 통과시킨 후, 필터에 의해 포획된 백혈구는 문제의 DNA를 포함하고 있다. 상기 필터는 세척되며, 100 μL로 재부유되고, 실시예 Ⅰ에서 설명한 바와 같이 구아니디니움에 기반하여 정제되며, 시약 체적은 대응하여 감소한다.
원하는 경우, 상기 장치는 박테리아에 비해 포유동물 세포의 용해가 상대적으로 용이함을 활용하여, 처음에 백혈구를 (예를 들어, 삼투하여) 용해하도록 설계될 수 있다. 이 구성에서, 온전한 세포내 박테리아가 방출되고, 세포 추출액이 박테리아 포획 필터에 잔류되어 세척된다. 그 다음, 실시예 Ⅰ에서 설명한 바와 같이 박테리아 DNA가 정제된다. 마찬가지로, 세포 분리 없이 전혈이 용해될 수 있으며, 이는 세포내 또는 세포외 박테리아 또는 바이러스 DNA가 정제될 수 있도록 한다.
실시예 III . 인증된 법의학 수집 면봉에 의해 수집된 생물학적 샘플(들)로부터의 DNA 정제
법의학 샘플은 두 가지 유형으로 대별될 수 있다; 케이스워크(casework) 샘플은 범죄 현장에서 수집되거나 수사와 연관된 것들이고, 대조 샘플은 개인으로부터 직접 수집된 것이다. 분석되는 샘플의 특수한 유형에 따라 여러가지 수집 방법이 이용가능하며, 범죄 현장으로부터 생물학적 증거를 구하고 보호하도록 설계된다. 면봉법은 확실하게 자리잡은 법의학 샘플 수집 방법이며, 상용 면봉은 면화, 개질 셀룰로오스, 발포제, 나일론, 폴리에스테르 및 레이온과 같은 다양한 재료로 구성된 수집 매트릭스를 갖는다.
도 7은 법의학 면봉 샘플을 위한 정제 카트리지를 도시하고 있다. 도 8 내지 도 10은 정제 카트리지의 마크로유체 부품, 마이크로유체 부품의 공압층, 마이크로유체 부품의 마이크로유체층을 도시하고 있다. 상기 정제 카트리지의 마이크로유체 부분(27)은 마크로유체 부분(26), 입자 필터(40) 및 정제 필터(41)에 대한/이들로부터의 용액 유동을 제어하기 위한 밸브들을 포함한다.
법의학 면봉 샘플로부터 DNA를 정제하기 위하여, BodeSecur 면봉이 정제 카트리지의 샘플 수집 챔버로 수동으로 삽입되며, 샘플 처리를 위한 장소에 록킹된다. 면봉을 수용하는 챔버는 면봉 캡이 끼워맞춤될 수 있도록 설계된다. 상기 카트리지는 운영자가 면봉을 챔버에 삽입하고 더 이상 사용자의 추가 조작 없이 DNA 정제를 개시할 수 있도록 설계된다.
상기 정제 카트리지의 마크로유체 부분은 DNA 정제 과정에서 보관/반응 챔버 역할을 하거나 미리 충진된 시약 용액을 유지하는 7개의 챔버로 구성된다. 하나의 챔버는 DNA 샘플을 가진 코튼 면봉을 유지하기 위해 사용되며, 4개의 챔버는 550 μL의 용해 용액, 550 μL의 무수 에탄올, 2 mL의 세척 버퍼 및 100 μL의 TE(pH 8) 용출 버퍼로 미리 충전된다. 상기 정제 카트리지의 마이크로유체 부분은 마크로유체 부분, 입자 필터 및 정제 필터에 대한/이들로부터의 용액 유동을 제어하기 위한 밸브들을 포함한다.
상기 샘플 수집 면봉(Bode SecurSwab)(24)은 캡, 코튼 면봉 헤드 및 이들을 연결하는 샤프트로 구성되며, 이 샘플 수집 기구의 전체 길이는 약 9.1cm이다. 면봉 헤드의 공칭 크기는 직경이 5mm 내지 5.1 mm이고, 길이가 약 12mm이다. 상기 장치에 SecurSwab이 삽입되면, 면봉 헤드는 샘플 챔버의 관형부에 들어가게 되고, 샘플 챔버의 바닥으로부터 0 mm 내지 1.5 mm 사이에 위치하게 된다. 상기 관형부는 직경이 5.85 mm이고 길이가 24 mm이다. 직경이 1mm인 공기 입구 포트가 상기 관형부의 하단에 위치되어 있다. 상기 입구 포트의 직경(0.1 mm 내지 2.5 mm 사이의 범위, 바람직하게는 0.7 mm 내지 1.3 mm 사이의 범위)과 샘플 챔버의 관형부의 크기는 유체 유동과 무질서 버블링을 최적화하기 위해 변경될 수 있다.
정제 프로세스는 공압식 구동을 제어하는 자동화된 스크립트를 시작하도록 단순히 버튼을 누름으로써 개시된다. 상기 공압식 구동은 사람의 개입없이 모든 프로세스 단계들이 자동으로 수행될 수 있도록 필요한 시간 동안 필요한 압력 및 진공을 제공한다. 용해 용액이 용해 시약 저장소(34)로부터 면봉 챔버(32)로 공압식으로 구동되며, 상기 면봉과 접촉하게 된다. 모든 용해 시약이 제공된 후, 용해액 저장소(34)를 통해 계속된 공압식 구동은 면봉 챔버를 공기가 통과하도록 하여 "무질서 버블링"을 유발한다. 이는 60초 동안 5.7 psi 압력을 적용하여 실시되었다. 이 버블링은 면봉 헤드 주위에 난류를 생성하여, 면봉 헤드로부터의 세포 물질 제거와 세포 용해를 가능하게 한다. 에탄올이 에탄올 저장소(33)로부터 면봉 챔버(32)로 공압식으로 구동된다. 모든 에탄올이 제공된 후, 에탄올 저장소(32)를 통해 계속된 공압식 구동은 상기 용출액 및 에탄올 용액을 공기가 통과하도록 하여 30초 동안 무질서 버블링에 의한 혼합이 이루어지게 한다. 모든 용출액과 에탄올 혼합물은 입자 필터(40)를 통해 보관 챔버(35)로 공압식으로 구동된다. 용출액과 에탄올 혼합물은 상기 보관 챔버(35)로부터 정제 멤브레인(41)을 통해 면봉 챔버(32)로 공압식으로 구동된다. 이제, 상기 면봉 챔버는 소모된 프로세스 시약을 위한 폐액 챔버로서의 역할을 한다. 세척 용액은 세척액 저장소(29)로부터 정제 멤브레인(41)을 통해 면봉 챔버(32)로 공압식으로 구동된다. 세척 버퍼에 의한 정제 멤브레인의 세척이 실시되어 (단백질을 포함하여) 결합되지 않은 물질과 잔류 용해 용액을 제거한다. 모든 세척 용액이 제공된 후, 세척액 저장소(29)를 통해 계속된 공압식 구동은 정제 필터(41)를 공기가 통과하도록 하여 상기 필터를 105초 동안 건조시킨다. 용출 용액이 용출액 저장소(31)로부터 정제 맴브레인(41)을 통해 용출액 균질화 챔버(30)로 공압식으로 구동된다. 모든 용출 용액이 제공된 후, 용출액 저장소(31)를 통해 계속된 공압식 구동은 용출액 균질화 챔버(30)를 공기가 통과하도록 하여 무질서 버블링에 의한 혼합이 이루어지게 한다. 상기 용출액 균질화 챔버(30) 내부의 균질화되고 정제된 DNA 용액은 후속 분석을 위한 준비가 되어 있다.
상기 정제 카트리지에 의해 생성된 DNA를 평가하기 위하여, 고속 다중 PCR 반응을 약 17분간 7μL의 체적의 AmpFℓSTR® Identifiler® 프라이머(라이프 테크놀로지)를 이용하여 (상술한) 가이즈 등 (2009)이 개시한 바와 같이 실시하였다. 증폭된 생성물은 넷바이오의 Genebench를 이용하여 분리 및 검출되었다. 각 증폭된 생성물의 2.7 μL에 대하여, 10.2 μL의 Hi-Di formamide와 0.1 μL의 Genescan 500 LIZ 내부 레인 표준(모두 라이프 테크놀로지 제품)이 첨가되었다. 3분 동안 95℃에서 변성하고 얼음에서 급속 냉각된 후, 샘플은 분리 바이오 칩의 웰에 로딩되고, 90초 동안 350 V/cm의 전기장을 인가함으로써 분리 채널로 전기영동으로 이동되었다. 그 후, DNA 단편을 분리하기 위하여, 분리 채널을 따라 150 V/cm의 전기장을 인가하였다. 모든 분리는 50℃에서 이루어졌다. 로우 데이타는 GeneMarker® HID STR 인간 식별 소프트웨어, 버전 1.51(SoftGenetics LLC, 스테이트 칼리지, 펜실베니아)에 의해 분석되었다.
다양한 면봉 샘플(구강 면봉, 면봉의 건식 및 습식 전혈, 타액 및 세포 접촉)로부터 완전한 대립형질 프로파일이 생성되었다. 구강 세포 샘플(도 11)은 인간의 뺨 안쪽에 면봉을 가볍게 문지름으로써 얻어진다. 건식 혈액 샘플은 건조된 혈흔을 면봉으로 문질러 만들어진다(도 12). 타액 샘플(도 13)은 세라믹 타일에 존재하는 타액을 면봉으로 문지름으로써 수집된다. 접촉 샘플(도 14)은 단일의 공여자가 손댄 세라믹 면봉으로 문질러 만들어진다. 면봉의 헤드는 무균 초순수로 미리 습윤된다.
실시예 IV . 질 면봉으로부터의 박테리아 DNA
질 면봉이 면봉을 적소에 유지하는 클램핑 포트를 통해 정제 카트리지 샘플 챔버에 삽입된다. 정제는 실시예 III에서 법의학 면봉에 대한 설명과 실질적으로 동일하게 이루어지며; 주된 차이점은 샘플 챔버가 질 면봉을 수용하여 고정하도록 변형되었다는 것이다. 면봉의 수집 영역 또는 면봉 손잡이의 크기에 관계없이, 면봉 챔버의 기하학적 형태는 본질적으로 모든 면봉 유형에 부합하도록 변형될 수 있다. 상기 샘플 챔버는 면봉이 프로세싱을 위해 정제 카트리지로 직접 삽입될 수 있도록 설계된다. 면봉의 캡은 샘플 간의 오염 가능성을 최소화하기 위해 비가역적으로 로킹되도록 변형될 수 있고, 면봉 조립체는 (예를 들어, 바코드 또는 RFID 칩에 의해) 샘플 식별이 가능하도록 변형될 수 있다.
도 15는 질 또는 경부 면봉 샘플을 위한 정제 카트리지를 도시하고 있고, 도 16은 상기 카트리지의 마크로유체 부분을 도시하고 있다. 상기 마이크로유체 층들은 도 9 및 도 10의 것과 본질적으로 동일하다.
상기 정제 카트리지의 마크로유체 부분은 DNA 정제 과정에서 보관/반응 챔버 역할을 하거나 미리 충진된 시약 용액을 유지하는 7개의 챔버로 구성된다. 하나의 챔버는 DNA 샘플을 가진 코튼 면봉을 유지하기 위해 사용되며, 4개의 챔버는 550 μL의 용해 용액, 550 μL의 무수 에탄올, 2 mL의 세척 버퍼 및 100 μL의 TE(pH 8) 용출 버퍼로 미리 충전된다.
정제 프로세스는 공압식 구동을 제어하는 자동화된 스크립트를 시작하도록 단순히 버튼을 누름으로써 개시된다. 상기 공압식 구동은 사람의 개입없이 모든 프로세스 단계들이 자동으로 수행될 수 있도록 필요한 시간 동안 필요한 압력 및 진공을 제공한다. 용해 용액이 용해 시약 저장소(52)로부터 면봉 챔버(50)로 공압식으로 구동되며, 상기 면봉과 접촉하게 된다. 모든 용해 시약이 제공된 후, 용해액 저장소(52)를 통해 계속된 공압식 구동은 면봉 챔버를 공기가 통과하도록 하여 60초 동안 5 psi 압력으로 "무질서 버블링"을 유발한다. 이 버블링은 면봉 헤드 주위에 난류를 생성하여, 면봉 헤드로부터의 세포 물질 제거와 세포 용해를 가능하게 한다. 에탄올이 에탄올 저장소(51)로부터 면봉 챔버(50)로 공압식으로 구동된다. 모든 에탄올이 제공된 후, 에탄올 저장소(51)를 통해 계속된 공압식 구동은 상기 용출액 및 에탄올 용액을 공기가 통과하도록 하여 30초 동안 무질서 버블링에 의한 혼합이 이루어지게 한다. 모든 용출액과 에탄올 혼합물은 입자 필터(40)를 통해 보관 챔버(35)로 공압식으로 구동된다. 용출액과 에탄올 혼합물은 상기 보관 챔버(35)로부터 정제 멤브레인을 통해 면봉 챔버(50)로 공압식으로 구동된다. 이제, 상기 면봉 챔버는 소모된 프로세스 시약을 위한 폐액 챔버로서의 역할을 한다. 세척 용액은 세척액 저장소(47)로부터 정제 멤브레인을 통해 면봉 챔버(50)로 공압식으로 구동된다. 세척 버퍼에 의한 정제 멤브레인의 세척이 실시되어 (단백질을 포함하여) 결합되지 않은 물질과 잔류 용해 용액을 제거한다. 모든 세척 용액이 제공된 후, 세척액 저장소(47)를 통해 계속된 공압식 구동은 정제 필터를 공기가 통과하도록 하여 상기 필터를 105초 동안 건조시킨다. 용출 용액이 용출액 저장소(49)로부터 정제 맴브레인을 통해 용출액 균질화 챔버(48)로 공압식으로 구동된다. 모든 용출 용액이 제공된 후, 용출액 저장소(49)를 통해 계속된 공압식 구동은 용출액 균질화 챔버(48)를 공기가 통과하도록 하여 무질서 버블링에 의한 혼합이 이루어지게 한다. 상기 용출액 균질화 챔버(48) 내부의 균질화되고 정제된 DNA 용액은 후속 분석을 위한 준비가 되어 있다.
총 핵산 농도는 260nm에서 흡광도에 의해 계량된다. (클라미디아 트라코마티스, 인간 면역결핍 바이러스, 질편모충, 임질균을 포함하여) 성적으로 전달되는 질병에 대하여 특수하게 형광으로 라벨링된 프라이머 세트를 이용하는 바이오칩에서의 고속 PCR 증폭과 Genebench에서의 전기영동 분리 및 검출은 증상을 보이거나 보이지 않는 전염병을 유발하는 병원체의 특성 밴드를 생성한다.
이 발명들이 그 바람직한 실시예를 참조하여 특히 도시되고 설명되었으나, 당업자라면 첨부된 특허청구범위에 개시된 바와 같은 본 발명의 사상 및 범주를 벗어나지 않고 그 형식 및 세부 상항에 대한 다양한 변형이 이루어질 수 있음을 이해할 수 있을 것이다.

Claims (21)

  1. 미처리된 샘플로부터 핵산을 분리하기 위한 자기 수납형 장치로서,
    장비와 함께 사용되며,
    적어도 하나의 투입물과,
    (ⅰ) 수집 기구로부터 미처리된 샘플을 수용하기 위한 챔버와, 적어도 하나의 충진된 액체 정제 시약 저장소를 포함하는 마크로유체 부품;
    (ⅱ) 상기 마크로유체 부품과 적어도 하나의 마이크로유체 소자를 통해 소통하며, 적어도 하나의 핵산 정제 매트릭스를 더 포함하는 마이크로유체 부품; 및
    (ⅲ) 상기 마이크로유체 소자와 상기 핵산 정제 매트릭스를 통해 상기 액체 정제 시약을 구동하기 위한 상기 장비 상의 구동 메커니즘;을 포함하며,
    상기 장치에 대한 투입은 상기 챔버와 상기 구동 메커니즘을 통해서만 이루어지는,
    자기 수납형 장치.
  2. 미처리된 샘플로부터 핵산을 분리하기 위한 자기 수납형 장치로서,
    장비와 함께 사용되고,
    적어도 하나의 투입물과,
    (ⅰ) 수집 기구로부터 미처리된 샘플을 수용하기 위한 챔버,
    적어도 2개의 미리 충진된 용해 시약 저장소,
    미리 충진된 세척 시약 저장소 및
    미리 충진된 용출 시약 저장소를 포함하는 마크로유체 부품;
    (ⅱ) 상기 마크로유체 부품과 적어도 하나의 마이크로유체 소자를 통해 소통하며, 적어도 하나의 핵산 정제 매트릭스를 더 포함하는 마이크로유체 부품; 및
    (ⅲ) 상기 마이크로유체 소자와 상기 핵산 정제 매트릭스를 통해 상기 제 1 및 제 2 용해 시약, 상기 세척 시약 및 상기 용출 시약을 순차적으로 구동하기 위한 상기 장비 상의 구동 메커니즘;을 포함하며,
    상기 장치에 대한 투입은 상기 챔버와 상기 구동 메커니즘을 통해서만 이루어지는,
    자기 수납형 장치.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 수집 기구 및/또는 챔버에는 라벨이 부착되며, 상기 라벨은 바코드 또는 RFID를 포함하는,
    자기 수납형 장치.
  4. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 구동 메커니즘은 공압식, 기계식, 자기식 또는 유체식인,
    자기 수납형 장치.
  5. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 미처리된 샘플은 (ⅰ) 비강 면봉, 비인강 면봉, 구강 면봉, 구강액 면봉, 대변 면봉, 편도선 면봉, 질 면봉, 경부 면봉, 혈액 면봉, 상처 면봉, 또는 혈액, 가래, 고름 물질 또는 흡인물이 담긴 튜브; (ⅱ) 법의학 면봉, 절단물, 접착 테이프 리프트 또는 카드; 또는 (ⅲ) 환경 공기 필터, 물 필터 또는 면봉을 포함하는,
    자기 수납형 장치.
  6. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 핵산 정제 매트릭스는 실리카 멤브레인, 실리카 비즈, 실리카 자석 비즈, 이온 교환 수지 또는 이온 교환 비즈를 포함하는,
    자기 수납형 장치.
  7. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 마이크로유체 부품은 채널, 저장소, 능동 밸브, 수동 밸브, 공압작동식 밸브, 반응 챔버, 혼합 챔버, 배기 소자, 접근 개구, 펌프, 계측 소자, 혼합 소자, 가열 소자, 자석 소자, 반응 챔버, 여과 소자, 정제 소자, 구동 라인 또는 액츄에이션 라인을 포함하는,
    자기 수납형 장치.
  8. 미처리된 샘플로부터 핵산을 정제하는 방법으로서,
    청구항 제 2 항의 장치의 챔버에 핵산을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    상기 제 1 용해 시약 챔버로부터 제 1 용해 시약의 적어도 일부를 상기 챔버로 구동하여 제 1 혼합물을 제공하는 단계;
    상기 제 2 용해 시약 챔버로부터 제 2 용해 시약의 적어도 일부를 상기 챔버로 구동하여 제 2 혼합물을 제공하는 단계;
    상기 제 2 혼합물의 적어도 일부를 상기 정제 멤브레인을 통하여 구동하여 여과액과, 상기 핵산 중 적어도 일부를 포함하는 농축액을 제공하는 단계;
    상기 세척 시약의 적어도 일부를 상기 정제 멤브레인을 통하여 구동하여 세척된 농축액과 폐액을 제공하는 단계;
    상기 세척된 농축액을 선택적으로 건조시키는 단계; 및
    상기 용출 시약 챔버로부터 용출 시약의 적어도 일부를 상기 정제 매트릭스를 통해 구동하여, 상기 세척된 농축액으로부터 핵산중 적어도 일부를 수집하는 단계;를 포함하는,
    핵산 정제 방법.
  9. 미처리된 샘플로부터 핵산을 정제하는 방법으로서,
    청구항 제 2 항의 장치의 챔버에 핵산을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    상기 제 1 용해 시약 챔버로부터 제 1 용해 시약의 적어도 일부를 상기 챔버로 구동하여 제 1 혼합물을 제공하는 단계;
    상기 제 1 혼합물에 기포를 발생시켜 교반된 제 1 혼합물을 제공하는 단계;
    상기 제 2 용해 시약 챔버로부터 제 2 용해 시약의 적어도 일부를 상기 챔버로 구동하여 제 2 혼합물을 제공하는 단계;
    상기 교반된 제 1 혼합물의 적어도 일부를 상기 정제 매트릭스를 통하여 구동하여 여과액과, 상기 핵산 중 적어도 일부를 포함하는 농축액을 제공하는 단계;
    상기 세척 시약의 적어도 일부를 상기 정제 매트릭스를 통하여 구동하여 세척된 농축액과 폐액을 제공하는 단계;
    상기 세척된 농축액을 선택적으로 건조시키는 단계;
    상기 용출 시약 챔버로부터 용출 시약의 적어도 일부를 상기 정제 매트릭스를 통해 구동하여 용출된 핵산 용액을 제공하는 단계; 및
    상기 용출된 핵산 용액에 기포를 발생시켜 균질화된 용출 핵산 용액을 제공하는 단계;를 포함하는,
    핵산 정제 방법.
  10. 제 8 항 또는 제 9 항에 있어서,
    상기 미처리된 샘플은 (ⅰ) 비강 면봉, 비인강 면봉, 구강 면봉, 구강액 면봉, 대변 면봉, 편도선 면봉, 질 면봉, 경부 면봉, 혈액 면봉, 상처 면봉, 또는 혈액, 가래, 고름 물질 또는 흡인물이 담긴 튜브; (ⅱ) 법의학 면봉, 절단물, 접착 테이프 리프트 또는 카드; 또는 (ⅲ) 환경 공기 필터, 물 필터 또는 면봉을 포함하는,
    핵산 정제 방법.
  11. 전혈의 병원균으로부터 핵산을 정제하는 방법으로서,
    청구항 제 2 항의 장치의 샘플 수집 챔버에, 혈액 수집 튜브 내의 항응고처리된 전혈과 병원균을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    상기 혈액의 적어도 일부를 백혈구 잔류 필터를 통해 구동하여 저백혈구 여과액을 제공하는 단계;
    상기 백혈구 잔류 필터를 통해 백혈구 세척 시약의 적어도 일부를 구동하여 세척된 저백혈구 여과액을 제공하는 단계;
    상기 저백혈구 여과액의 적어도 일부를 병원균 포획 멤브레인을 통해 구동하는 단계;
    상기 포획 멤브레인을 통해 병원균 재부유 용액의 적어도 일부를 구동하여 농축 병원균 현탁액을 제공하는 단계;
    상기 농축 병원균 현탁액의 적어도 일부를 상기 제 1 용해 시약을 포함하고 있는 제 1 용해 시약 챔버로 구동하여 제 1 혼합물을 제공하는 단계;
    상기 제 2 용해 시약 챔버로부터 제 2 용해 시약의 적어도 일부를 상기 제 1 용출 시약 챔버로 구동하여 제 2 혼합물을 제공하는 단계;
    상기 2 혼합물의 적어도 일부를 상기 정제 멤브레인을 통하여 구동하여 여과액과, 상기 핵산 중 적어도 일부를 포함하는 농축액을 제공하는 단계;
    상기 세척 시약의 적어도 일부를 상기 정제 멤브레인을 통하여 구동하여 세척된 농축액과 폐액을 제공하는 단계;
    상기 세척된 농축액을 선택적으로 건조시키는 단계;
    상기 용출 시약 챔버로부터 용출 시약의 적어도 일부를 상기 정제 매트릭스를 통해 구동하여 세척된 농축액으로부터 핵산의 적어도 일부를 수집하는 단계;를 포함하는,
    핵산 정제 방법.
  12. 전혈의 병원균으로부터 핵산을 정제하는 방법으로서,
    청구항 제 2 항의 장치의 샘플 수집 챔버에, 혈액 수집 튜브 내의 항응고처리된 전혈과 병원균을 포함하는 샘플을 제공하는 단계;
    상기 혈액의 적어도 일부를 백혈구 잔류 필터를 통해 구동하여 저백혈구 여과액을 제공하는 단계;
    상기 백혈구 세척 시약의 적어도 일부를 상기 백혈구 잔류 필터를 통해 구동하여 세척된 저백혈구 여과액을 제공하는 단계;
    상기 잔류 필터를 통해 백혈구 재부유 용액의 적어도 일부를 구동하여 농축 백혈구 현탁액을 제공하는 단계;
    상기 농축 백혈구 현탁액의 적어도 일부를 상기 제 1 용해 시약을 포함하고 있는 제 1 용해 시약 챔버로 구동하여 제 1 혼합물을 제공하는 단계;
    상기 제 2 용해 시약 챔버로부터 제 2 용해 시약의 적어도 일부를 상기 제 1 용출 시약 챔버로 구동하여 제 2 혼합물을 제공하는 단계;
    상기 2 혼합물의 적어도 일부를 상기 정제 멤브레인을 통하여 구동하여 여과액과, 상기 핵산 중 적어도 일부를 포함하는 농축액을 제공하는 단계;
    상기 세척 시약의 적어도 일부를 상기 정제 멤브레인을 통하여 구동하여 세척된 농축액을 제공하는 단계;
    상기 세척된 농축액을 선택적으로 건조시키는 단계;
    상기 용출 시약 챔버로부터 용출 시약의 적어도 일부를 상기 정제 매트릭스를 통해 구동하여 세척된 농축액으로부터 핵산의 적어도 일부를 수집하는 단계;를 포함하는,
    핵산 정제 방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 방법은,
    백혈구 용해액을 상기 농축 백혈구 현탁액으로 구동하여 차동 용해된 현탁액을 제공하는 단계;
    상기 차동 용해된 현탁액의 적어도 일부를 병원균 잔류 필터를 통해 구동하는 단계;
    상기 잔류 필터 세척 시약의 적어도 일부를 병원균 잔류 필터를 통해 구동하여 세척된 병원균 농축액을 제공하는 단계; 및
    청구항 제 12 항에서와 같이 상기 병원균 농축액으로부터 핵산을 재부유, 용해 및 정제하는 단계;를 더 포함하는,
    핵산 정제 방법.
  14. 미처리된 샘플로부터 세포 용출액을 생성하기 위한 자기 수납형 장치로서,
    장비와 함께 사용되며,
    적어도 하나의 투입물과,
    (ⅰ) 수집 기구로부터 미처리된 샘플을 수용하기 위한 챔버와,
    적어도 하나의 충진된 시약 저장소를 포함하는 마크로유체 부품;
    (ⅱ) 상기 마크로유체 부품과 적어도 하나의 마이크로유체 소자를 통해 소통하는 마이크로유체 부품; 및
    (ⅲ) 상기 마이크로유체 소자를 통해 상기 시약을 구동하기 위한 상기 장비 상의 구동 메커니즘;을 포함하며,
    상기 장치에 대한 투입은 상기 챔버와 상기 구동 메커니즘을 통해서만 이루어지는,
    자기 수납형 장치.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 시약은 용해 시약을 포함하는,
    자기 수납형 장치.
  16. 미처리된 샘플로부터 세포를 용해하기 위한 자기 수납형 장치로서,
    장비와 함께 사용되며,
    적어도 하나의 투입물과,
    (ⅰ) 수집 기구로부터 미처리된 샘플을 수용하기 위한 챔버와, 적어도 하나의 미리 충진된 용해액 저장소를 포함하는 마크로유체 부품;
    (ⅱ) 상기 마크로유체 부품과 적어도 하나의 마이크로유체 소자를 통해 소통하는 마이크로유체 부품; 및
    (ⅲ) 상기 마이크로유체 소자를 통해 상기 저장소 내의 시약을 구동하기 위한 상기 장비 상의 구동 메커니즘;을 포함하며,
    상기 장치에 대한 투입은 상기 챔버와 상기 구동 메커니즘을 통해서만 이루어지는,
    자기 수납형 장치.
  17. 청구항 제 16 항의 장치를 이용하여 샘플로부터 세포를 용해하는 방법으로서,
    세포를 포함한 샘플을 챔버에 제공하는 단계;
    상기 챔버에 상기 용해 시약을 도입하여 혼합물을 제공하는 단계; 및
    상기 혼합물에 기포를 발생시켜 교반된 혼합물을 제공하는 단계;를 포함하며,
    상기 교반된 혼합물은 용해된 세포를 포함하는,
    세포 용해 방법.
  18. 미처리된 샘플로부터 세포의 현탁액을 생성하기 위한 자기 수납형 장치로서,
    장비와 함께 사용되며,
    적어도 하나의 투입물과,
    (ⅰ) 수집 기구로부터 미처리된 샘플을 수용하기 위한 챔버와,
    실질적으로 등장성의 시약을 저장하는 적어도 하나의 충진된 시약 저장소를 포함하는 마크로유체 부품;
    (ⅱ) 상기 마크로유체 부품과 적어도 하나의 마이크로유체 소자를 통해 소통하는 마이크로유체 부품; 및
    (ⅲ) 상기 마이크로유체 소자를 통해 상기 시약을 구동하기 위한 상기 장비 상의 구동 메커니즘;을 포함하며,
    상기 장치에 대한 투입은 상기 챔버와 상기 구동 메커니즘을 통해서만 이루어지는,
    자기 수납형 장치.
  19. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 장비는 열 순환, 모세관 전기영동, 마이크로유체 전기영동, 핵산 단편 사이징, STR, Y-STR, 미니-STR, 단일 염기 다형성, PCR, 고도로 다중화된 PCR, 실시간 PCR, 역전사 PCR, 시퀀싱, 혼성화, 마이크로어레이, VNTR, 면역분석, 질량분석 및 RFLP 분석 중 적어도 하나를 수행하는,
    자기 수납형 장치.
  20. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    상기 장치는 열 순환, 모세관 전기영동, 마이크로유체 전기영동, 핵산 단편 사이징, STR, Y-STR, 미니-STR, 단일 염기 다형성, PCR, 고도로 다중화된 PCR, 실시간 PCR, 역전사 PCR, 시퀀싱, 혼성화, 마이크로어레이, VNTR, 면역분석, 질량분석 및 RFLP 분석 중 적어도 하나를 수행하는 다른 장비 내에 위치되거나 접속될 수 있는,
    자기 수납형 장치.
  21. 제 19 항에 있어서,
    상기 장치 및 장비는 온도, 습도 및 부유 입자중 적어도 하나의 전달 및 극한을 견디도록 내구성이 높게 제조된,
    자기 수납형 장치.
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