CN102203284A - 适于在封闭***中实施的温度控制的核酸检测方法 - Google Patents

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CN102203284A CN2009801413297A CN200980141329A CN102203284A CN 102203284 A CN102203284 A CN 102203284A CN 2009801413297 A CN2009801413297 A CN 2009801413297A CN 200980141329 A CN200980141329 A CN 200980141329A CN 102203284 A CN102203284 A CN 102203284A
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    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6806—Preparing nucleic acids for analysis, e.g. for polymerase chain reaction [PCR] assay

Abstract

本发明涉及在封闭***中利用嗜热蛋白酶处理核酸的方法，其与其他方法串联使用，以快速检测样品中存在的靶核酸。这些组合方法使得经简化的温度控制设备能够在接近关注下列广泛应用时进行精确地、流线型检测：医药、工业、环境、质量控制、安全和研究领域。

Description

适于在封闭***中实施的温度控制的核酸检测方法
相关申请的交叉引用
本申请要求于2008年8月14日提交的第61/089,001号美国临时专利申请的优先权，其全部内容通过引用并入本文。本专利申请与US 61/019,809、US 61/038,389、US 10/477,422、US 11/640,495、WO 05/127,709和WO 08/013,462相关。
技术领域
本发明总体涉及一种可以在设备中操作以快速检测样品中的靶核酸的方法。更具体地，其涉及与可用于在封闭***设备中检测样品中存在的靶核酸的温度控制检测方法相容的核酸处理方法。
背景技术
可以精确并且有效地检测样品中之核酸的便携式设备对于医药、工业、环境、安全、研究和质量控制目的是理想的。优选地，这类设备也是快速的，能够产生精确的结果并且利用封闭***操作，即为了防止产生分解或者意外污染不期望有的核酸或核酸酶而在分析过程中无需打开的***。核酸检测方法可以分成3个阶段：核酸处理、信号扩增和信号检测/分析。这些阶段的主要难题是它们一般需要不同的设备来进行。因此贯穿始终的自动化设备需要用于每个阶段的不同仪器以及将原料从一个内部仪器转移至下一个的方法。将每个阶段的技术组合的需求使微型化设计复杂化。
对于核酸处理步骤，基于核酸的检测步骤常常需要从天然物质中制备核酸。其应用范围从法医学的DNA指纹鉴定到医药、农业和环境监测。核酸处理时无污染是很重要的，特别是当初始样品中的核酸浓度很低或者污染可以产生错误的结果时。特别是在法医学和证据分析中更是如此，此时初始材料的量可能是皮克级或者更少。由于在制备步骤中样品管可能需要在各个阶段打开和关闭，此时样品管向环境打开或者被技术员触碰很容易发生污染，因此标准的核酸处理技术存在问题。由于存在样品可以被污染的情况，因此优选可重复的核酸处理技术利用旨在使这种污染最小化的方案。
核酸经处理以使污染最小化后，可以进行核酸检测方法来确定样品中是否存在靶核酸。很多情况会出现，其中需要在多元混合物中检测低水平的特定核酸序列。为此目的而设计的方法必须是高度特异的和敏感的。目前不存在可以直接检测特定序列之单个核酸分子的简单方法，而且目前应用的方法包括扩增信号的一个或者多个步骤。用于达到此目的的最普遍的方法是聚合酶链式反应(PCR)。该方法通过利用热循环和耐热型DNA聚合酶提供靶分子的指数扩增。
目前用于扩增信号的PCR技术通常在进行PCR前需要过长的纯化步骤，包括与蛋白酶孵育、苯酚/氯仿提取和最后的乙醇盐沉淀步骤。此外，涉及细胞的DNA纯化步骤通常包括将样品与蛋白酶K和去污剂孵育，这使得细胞在各温度下溶解，此时有害酶从细胞中释放出来，可以使样品DNA降解并且干扰靶核酸序列的检测。PreTaqTM作为蛋白酶K的耐热型替代品市售，用以清洗DNA而不发生降解，但是PreTaqTM的温度活性谱并不理想，因为其保持活性并且在高温下不易清除，因而自身成为一种污染物。因此研发一种能够进行简单、关闭管的反应的方法将是有利的，所述反应能够使污染的可能性最小化并且无需使用蛋白酶K和可能干扰PCR的其他物质。
该方法的一个内在复杂性是需要在高温和低温之间进行重复性循环反应。因此，该方法需要更难于微型化的仪器。响应于该局限性，已经花费了大量的精力用于研发PCR的单一温度或者等温等价物。一种方法已经使用了同时完成链置换和链合成的聚合酶，因此无需进行传统PCR方法中的高温步骤来产生单链DNA。
显然，需要一种精确、快速和易于操作的方法来鉴定靶核酸，特别是在多种情况中或者混合群体中之微生物的核酸。术语“靶区域”、“靶序列”、“靶核酸”、“靶核酸序列”、“靶多聚核苷酸”和“靶多聚核苷酸序列”以及其语法等价物是指被检测的核酸区域。因此，本文中使用的术语“靶核酸”或者“靶核酸序列”包括被检测的靶核酸，例如样品中存在的靶核酸。
实质上，核酸检测过程中的3个阶段是核酸的制备或者处理、显示样品中存在靶核酸之信单一因素的扩大、以及由样品中靶核酸的存在而检测单一产品。目前的方法在每个阶段需要不同的仪器，而且必须在经微型化的设备中加入多个元件以及必须通过流体静力或者电动力使材料在这些元件中转移。优选使每个步骤简单化并且适于在封闭***中操作，此时在所述***中可以在相容的缓冲条件下在相同的元件中进行不同阶段的反应，因而限制了其复杂性、费用、污染并且使核酸检测简化。
发明概述
本文中描述了适于在温度控制设备中使用的检测样品中靶核酸的方法。该方法包括i)处理样品中的核酸，ii)产生显示样品中存在靶核酸之单一因素，和iii)检测由样品中靶核酸的存在而产生的单一因素。
在第一个方面中，一个实施方案提供了检测样品中的靶核酸的方法，该方法包括：
a.用嗜热蛋白酶处理样品，以制备用于检测的靶核酸，
b.提供产生显示样品中存在靶核酸之信号的检测试剂，和
c.检测信号，以确定靶核酸的存在，
步骤i)、ii)和iii)在单个容器或者管中有利地进行。
在一个实施方案中，容器或者管是设备。在进一步的实施方案中，设备是手持设备。
在一个实施方案中，一个或者多个步骤i)、ii)或iii)是温度控制的。
在一个实施方案中，嗜热蛋白酶是EA1。
在一个实施方案中，步骤a)在大约65-80℃的温度下进行足以消化蛋白的时间。
在进一步的实施方案中，步骤a)进一步包括将嗜热蛋白酶在大约90℃或者以上的温度下孵育足以使蛋白酶失活的时间。
在一个实施方案中，该方法进一步包括步骤：
a.用嗜温酶处理样品，和
b.将样品在低于大约40℃的温度下孵育足以实现从细胞中去除细胞壁的时间。
在进一步的实施方案中，嗜温酶是纤维素酶。
在一个实施方案中，信号是荧光。
在一个实施方案中，通过PCR检测方法进行检测。在进一步的实施方案中，PCR检测方法是实时PCR。
在一个实施方案中，通过等温检测方法进行检测。在进一步的实施方案中，等温检测方法是通过核酸的链置换扩增、滚环扩增、环介导的等温扩增、嵌合引物起始的等温扩增、Q-β扩增***或者OneCutEventAmplificatioN进行。而又一个进一步的实施方案中，所述等温检测方法利用核酸酶链式反应(NCR)、RNA酶介导的核酸酶链式反应(RNCR)、聚合酶核酸酶链式反应(PNCR)、RNA酶介导的检测(RMD)、串联重复限制性酶促(TR-REF)链式反应或者反式反向互补限制性酶促(IRC-REF)链式反应。
在一个实施方案中，检测试剂由微流体或者固体分配器提供。
在一个实施方案中，检测试剂由微胶囊提供。在进一步的实施方案中，微胶囊预设置在容器或者管中。而又一个进一步的实施方案中，微胶囊是不耐热胶囊。在进一步的实施方案中，不耐热胶囊是琼脂糖或者蜡珠。而在又一个实施方案中，不耐热胶囊在高于提取步骤中使用的优选孵育温度的温度下释放检测试剂。
在一个实施方案中，检测试剂抵抗处理过程，特别是检测步骤所需的任一种酶均抵抗以从生物材料中制备核酸为目的而存在之蛋白酶的蛋白酶剪切。
在一个实施方案中，靶核酸的检测是自动的。
在一个实施方案中，样品是血液、尿液、唾液、***、粪便、组织、拭子(swab)、泪液或者粘液。
在另一个实施方案中，样品是细菌、真菌、古细菌、真核生物、原生动物或者病毒。
在进一步的实施方案中，设备或者设备的元件是一次性的。在一个进一步的实施方案中，设备包括进口、出口、腔室、发射荧光检测器和激发光源。
在进一步的实施方案中，设备进一步包括微流体、微芯片、纳米孔技术和微型设备。
附图说明
图1.温度控制设备中核酸检测方法的概述。
图2.利用液体依次递送试剂的单个腔室核酸处理和检测步骤。
图3.利用经包裹试剂的单个腔室核酸处理和检测步骤。
图4.利用经包裹试剂的、基于管的核酸处理和检测步骤。
图5.实时PCR轨迹，其中在相同的封闭管中进行处理和检测步骤。
图6.当在单个容器中进行DNA提取和qPCR时，对于不同细胞数量的qPCR反应中所获得的CT值。
发明详述
核酸检测方法可以分成3个阶段：核酸处理、信号扩增和信号检测/分析。因此，任何全自动的核酸检测设备均需要用于每个阶段的不同仪器，以及将原料从一个内部仪器转移至下一个的方法，这使得微型化设计复杂化。与所有扩增方法(无论是等温或者循环)相同，本文中公开的嗜热蛋白酶核酸处理方法是受温度调节的。此外，嗜热处理所需的条件与大部分扩增过程的条件相容。由于这些因素，可以将设备简化成带有加热/致冷机制的一个容器，以对原始样品材料进行加工并直至产生可检出的信号。还可以容易地加入检测仪。因此，本文公开的方法使得设备不带有泵或者不需要微流体，但是如果需要，这些可以用于更复杂的下游应用中。
本文中描述了核酸处理、信号扩增和检测的方法，其可用于利用热控制反应链的封闭***设备中。该设备可以是便携式的。利用热稳定性蛋白酶制备样品中的核酸，并且随后利用核酸鉴定技术，包括PCR或者等温检测方法。利用温度依赖性酶混合物或者温度控制释放经包裹试剂的热控制***使得目前核酸诊断设备的设计简单化。降低复杂性可以降低相关的失效率和费用。这些技术具有可以进行同时鉴定混合样品中多个靶核酸之多重检测的附加益处。
本申请中使用的术语“处理”指使样品中核酸的可利用度增加以进行其他操作的过程。“处理”的隐含意义是核酸不受例如抑制剂、核酸酶、其他酶和核蛋白的干扰，以使其在其他操作方法中是有效的。应当理解，核酸不需要纯化至没有非干扰性化合物，因为目前的设备达不到此目的。核酸的处理使干扰性化合物的负面影响最小化。
本文中使用的术语“核酸”、“核酸序列”、“多聚核苷酸”、“多聚核苷酸序列”和其等价物是指任意长度的单链或双链脱氧核糖核苷酸或核糖核酸多聚物，其非限定性实例包括基因的编码和非编码序列、正义和反义序列、外显子、内含子、基因组DNA、cDNA、mRNA前体、mRNA、rRNA、siRNA、miRNA、tRNA、核酶、重组多聚核苷酸、经分离和纯化的天然存在之DNA或者RNA序列、合成的RNA和DNA序列、核酸探针、引物、片段、基因构建物、载体和经修饰的多聚核苷酸。术语“核酸”、“寡核苷酸”和“多聚核苷酸”之间在长度上没有预定差别，这些术语将会交叉使用。
本文中详细描述的方法概述于图1中。在第一个步骤中，向样品中加入热稳定性蛋白酶(例如EA1)，以在对热稳定性蛋白酶活性最佳的温度下消化杂质蛋白。
可以从大量物质中获得样品，包括临床、食品和饮料或者环境样品。典型地，微生物样品可以通过提取液体或固体样品或者通过擦拭固体表面从环境资源中获得并用于食品检测。临床样品可以便利地从组织、血液、血清、血浆、脑脊髓液、尿液、唾液、***、拭子或者粘液中获得。组织样品可以利用标准技术(例如细胞刮取或者活检技术)收集动物组织而获得。类似地，通常进行血液取样以例如用于病原测试，并且提取血液样品的方法是本领域熟知的。同样地，用于贮存和加工生物样品的方法也是本领域熟知的。例如，组织样品可以冷冻直至进行测试。此外，本领域技术人员应当理解，一些受试样品在分级或者纯化步骤后更易于分析，例如将全血分离成血清或者血浆组分。
最初还可以利用嗜温酶降解细胞壁蛋白或者其他杂质。随后调整温度以使嗜热酶失活，而在某些实施方案中同时释放包含于不耐热材料中的检测试剂。从样品中制备核酸并且使蛋白酶失活后，核酸与为检测已知核酸序列而定制的检测试剂相结合。
可以利用传统PCR或者等温信号扩增方法通过荧光检测已知核酸序列。与PCR不同，等温信号扩增法不需要温度循环。PCR和等温检测方法均可以多重化，以同时检测多个目标靶序列。
在一个优选的实施方案中，所述方法在设备中进行。图2-4描述了如何在设备中应用该方法的多个实施例。优选设备是便携式的并且允许进行封闭***反应，因而仅仅需要在样品加入和结果产生之间进行简单的物理性调整。优选地，利用温度起始和终止依次的化学反应，使得可以在没有复杂的泵、阀或者微流体的情况下进行多个步骤。可以通过很多简单的设备进行热控制，包括微电子元件、LED、Peltier板或者白炽灯泡。
这种设备的一个优选实施方案具有从核酸处理至信号扩增再至信号检测过程中所有阶段的相容反应条件。该检测***可以与专门为缓冲相容性而设计的现有技术相结合。
在一个优选的实施方案中，设备包括单个腔室。在另一个实施方案中所述腔室具有外部供应的管，例如PCR管，其放置于设备内部。在一个进一步的实施方案中，设备包括进口，出口，腔室，发射荧光检测器和激发光源。
在其他实施方案中，设备进一步包括微流体、微芯片、纳米孔技术和微型设备。设备或者设备的元件可以是一次性的。
应当理解，本文所描述的设备和方法需要使用一系列核酸诊断技术，其中清洗核酸以去除杂质尤其有益，或者需要使用诊断技术，其中可以调整本文的设备和方法以达到相似的有益效果。
用于核酸处理的热稳定性蛋白酶
本领域技术人员应当清楚，适用于本文描述之方法的样品可以从环境(例如土壤、岩石、水和植物材料样品)中或者个体(包括个体的组织或者体液)中获得，以使样品含有被测核酸。
将热稳定性蛋白酶加入到样品中。热稳定性蛋白酶包括在高温下具有蛋白降解活性的蛋白酶。示例性但非限定性，申请人已经鉴定出EA1蛋白酶是优选的热稳定蛋白酶，其在高温下更易于去除。随后孵育样品并使其经历温度变化。温度变化后会发生蛋白降解。该步骤在65-80℃下进行，因为这些酶在这些温度之间是高度活化的。在该温度下，细胞裂解，蛋白酶使杂质蛋白降解。例如，它们快速去除降解DNA的核酸酶，使得这些核酸酶失活，因而使样品中靶核酸的降解最小化。
而在本文公开的优选实施方案中使用嗜热蛋白酶，可以预期除蛋白酶之外还可以使用嗜热酶。为了在说明书中易于引用，本文中嗜热酶是指蛋白酶。但是，这不应当看作是对也可以确定使用的其他酶的限制。
最初可以使用在较低温度下具有活性的嗜温酶和上述一种蛋白酶的混合物，以从植物、真菌组织、细菌、孢子和生物膜中弱化或者去除细胞壁，随后继续进行封闭***的步骤。
本文公开的方法应用于设备中依赖于在不同温度下具有不同活性的蛋白酶和/或蛋白酶/细胞壁降解酶。通过可变温度的循环，可以不需要打开***加入新的试剂而使不同的酶发挥其活性。
对于需要低温消化核酸的情况(例如DNA的限制性酶切)，在37℃时活性很低的蛋白酶不需要去除或者失活。当需要进行多个步骤或者多种酶的反应时，可以在酶混合物中使用蛋白酶。由于其在40℃以下活性很低，其他酶反应能够在蛋白酶存在时发生。
根据本文公开的一个方面，提供了一种在封闭***中处理核酸样品的方法，包括步骤：
1)将至少一种嗜热蛋白酶加入到含有测试核酸的样品中，和
2)使样品在65-80℃下孵育所需优选的一段时间，以产生裂解细胞、消化蛋白、消化细胞壁酶中的一种或者多种作用。其中嗜热蛋白酶在65-80℃下是稳定且活化的，但是当样品在90℃或者以上孵育时不需要加入另外的变性试剂即可失活和/或变性。
在一个优选的实施方案中，蛋白酶来源包括芽孢杆菌菌株的EA1，其是一种中性蛋白酶。在所提及方法中使用之嗜热蛋白酶的优选特性是：
1)其在的温度范围内基本上是稳定且活化的，和
2)其能够在90℃或者以上易于失活和/或变性，和
3)可选地，其具有在40℃以下活性很低的温度-活性谱，以使例如同时使用的嗜温酶不被降解。
通过蛋白酶的活性以产生裂解细胞、消化蛋白、消化细胞壁酶中的一种或者多种作用所需的优选孵育温度是75℃。使得蛋白酶失活和/或变性所需的优选孵育温度是94℃。但是应当理解，这些温度仅仅是作为示例而并不是任何限定。可以预期，蛋白酶在温度范围内具有不同的酶活性和稳定性谱，并且这种酶动力学是本领域技术人员已知的。还可以预期，蛋白酶的这种酶谱可以用简单的实验确定。根据本文公开的另一个方面，提供了上述处理核酸样品的方法，该方法包括起始步骤：
1)将至少一种嗜温酶和至少一种非特异性嗜热酶加入到含有被测核酸的样品中，和
2)使样品在40℃以下孵育所需优选的一段时间，以通过嗜温酶的活性去除细胞壁。
在优选的实施方案中，嗜温酶是细胞壁降解酶。通过嗜温酶的活性以去除细胞壁所需的优选起始孵育温度是37℃。再次地，这不应看作是任何限定。
已经制备核酸并且蛋白酶已经失活后，接着检测样品中的靶核酸。可以通过下述基于PCR的检测方法或者基于等温的检测方法来检测已知的目标核酸序列。
靶核酸的信号产生和检测
在本文之应用方法的一个方面中，基于PCR的检测方法可以用于检测通过上面详述的处理方法制备的目标核酸序列。
“PCR试剂”指用于PCR的任何试剂，通常是用于每个靶核酸的一组引物、DNA聚合酶(优选热稳定性DNA聚合酶)、DNA聚合酶的辅助因子和一种或者多种脱氧核酸核苷-5’-三磷酸酯(dDTP’s)或类似的核苷。PCR中使用的其他可选试剂和材料描述于下面。
DNA聚合酶是在引物和模板的混合物中将脱氧核糖核苷单磷酸分子(通常是3’-羟基)加入到引物末端的酶，但是这种加入是以模板依赖为方式。一般地，延伸产物的合成以新合成链的5’至3’方向进行，直至合成终止。可用的DNA聚合酶包括例如Taq聚合酶、大肠杆菌(E.coli)DNA聚合酶I、T4 DNA聚合酶、Klenow聚合酶、逆转录酶和本领域已知的其他酶。优选地，DNA聚合酶是热稳定性的，即其对加热是稳定的，并且优选在较高温度下是活化的，特别是用于使DNA链与引物结合并延伸的高温。更特别地，热稳定性DNA聚合酶在本文中描述的聚合酶链反应中使用的高温下基本不失活。这种温度随一些反应条件而变化，包括pH值、核苷酸组合物、引物长度、盐浓度和本领域已知的其他条件。
特别地，可用的聚合酶从多种栖热菌属(Thermus)细菌菌种中获得，例如水生栖热菌(Thermus aquaticus)、嗜热栖热菌(Thermus thermophilus)、丝状栖热菌(Thermus filiformis)和黄栖热菌(Thermus flavus)。其他可用的热稳定性聚合酶从多种微生物来源获得，包括Thermococcus literalis、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)、热袍菌菌种(Thermotoga sp.)。这些描述于WO-A-89/06691(于1989年7月27日公布)中。一些可用的热稳定性聚合酶是市售的，例如AmpliTaqTM、Tth，和Perkin Elmer的UlTmaTM、Stratagene的Pfu，和Vent和New England Biolabs的Deep-Vent。从有机体中分离天然存在的聚合酶以及利用重组技术生产遗传工程酶的一些技术也是已知的。
DNA聚合酶辅助因子指一种非蛋白化合物，酶依赖其发挥活性。因此，不存在辅助因子时酶不具有催化活性。一些材料是已知的辅助因子，包括但不限于锰和镁盐，例如氯化盐、硫酸盐、乙酸盐和脂肪酸盐。优选是氯化镁和硫酸镁。
PCR还需要两种或者多种脱氧核酸核苷-5’-三磷酸酯，例如dATP、dCTP、dGTP和dTTP中的两种或者多种。其类似物例如dITP和7-脱氮-dGTP也是可以使用的。优选同时使用四种常见的三磷酸酯(dATP、dCTP、dGTP和dTTP)。
本文中描述的PCR试剂在PCR中以适宜的浓度提供和使用，以扩增靶核酸。扩增所需引物、DNA聚合酶、辅助因子和脱氧核酸核苷-5’-三磷酸的最小剂量和各自的适宜范围是本领域熟知的。DNA聚合酶的最小剂量一般是至少大约0.5单位/100μl溶液，优选从大约2至大约25单位/100μl溶液，更优选从大约7至大约20单位/100μl溶液。在特定的扩增***中可以使用其他剂量。本文中“单位”定义为74℃时在30分钟内将10nmol的总核苷酸(dNTP’s)加入到正在延伸的核酸链中所需的酶活量。引物的最小剂量是至少大约0.075μMol，优选从大约0.1至大约2μMol，但是其他剂量是本领域熟知的。辅助因子一般以从大约2至大约15mMol的剂量存在。每种dNTP的剂量一般是从大约0.25至大约3.5mMol。
PCR试剂可以单独提供，或者于多种组合物中，或者全部于pH值范围从大约7至大约9的缓冲溶液中，所述溶液利用任何适宜的缓冲物，其中很多都是本领域已知的。
PCR中可以使用的其他试剂包括例如热稳定性DNA聚合酶特异性抗体。可以在扩增前利用抗体抑制聚合酶。优选地，抗体是热稳定性DNA聚合酶特异性的，其在大约50℃以下的温度下抑制DNA聚合酶的酶活性，并且在更高温度下失活。可用的抗体包括单克隆抗体、多克隆抗体和抗体片段。优选抗体是单克隆抗体。可以利用已知方法制备抗体，例如描述于Harlow等人，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor，N.Y.(1988)中的那些抗体。
PCR和等温检测方法中可以使用发光标记。一种化合物的发光可以被第二种化合物淬灭的机制描述于Morrison，1992，Nonisotopic DNA Probe Techniques(Kricka ed.，Academic Press，Inc.San Diego，Calif.)，Chapter 13中。一个熟知的机制是荧光能量转移(FET)、非放射性能量转移、长距离能量转移、偶极耦合的能量转移和Forster能量转移。FRET主要需要作为能量供体的一种化合物的发射光谱必须与作为能量受体的另一种化合物的吸收光谱相重叠。Styer和Haugland，1967，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.98：719(并入本文作为参考)显示当间距小于10埃时，一些常见的发光物-淬灭物对的能量转移效率可以达到100％。能量转移率与能量供体和能量受体分子之间距离的6次方成比例地减少。结果，间距的少量增加使得能量转移率显著减少，导致能量供体的荧光增加以及能量受体的荧光减少(如果淬灭物的生色团也是荧光团)。在这些方法中，检测了与探针结合之标记(优选荧光标记)的信号发射。
检测序列的暴露是指使检测序列易于检测，例如易于与检测探针结合。相反地，术语“隐藏”或者“掩蔽”和其语法等价物是指使用这些术语所涉及的元素是不可接近的。例如，当检测序列与核酸分子而非检测探针结合时，其被“隐藏”或者“掩蔽”。术语“杂交”和其语法等价物是指多亚基结构(通常是二亚基结构)的形成，其是由两个或者多个单链核酸由于互补碱基配对作用结合形成。
由于处理***使用温度控制，因此PCR可以在与处理过程相同的容器中进行，并且利用设备中的相同仪器。在优选的实施方案中，PCR的缓冲条件与处理过程的缓冲条件是相容的。脱氧核糖核苷酸、二价离子和寡核苷酸引物可以与处理试剂一起提供，因为这些不受处理核酸时使用之酶和过程的影响。一些DNA聚合酶，例如Taq DNA聚合酶，被处理试剂中的嗜热蛋白酶降解。因此，必须考虑处理后递送聚合酶的方法。可能的方法是：(1)处理过程完成以后，递送聚合酶和任何其他敏感试剂。这可以利用微流体或者固体分配器从入口递送。(2)可以将聚合酶和其他敏感试剂以被保护的形式加入到处理试剂中。(3)可以对聚合酶进行修饰，以保护其不被蛋白酶降解，例如通过连接抗体。(4)可以使用抵抗蛋白水解切割的新型聚合酶。
提供PCR试剂后，可以利用处理过程中所使用的相同加热设备和控制器进行温度循环。PCR反应可以多重化，以同时对几个靶核酸进行检测。
本文公开的另一个方面是利用等温检测方法检测靶核酸，其中该方法依赖于信号的靶核酸依赖性扩增，所述信号来自与核酸探针结合的可检出标记。等温扩增可以通过核酸的链置换扩增、滚环扩增、环介导的等温扩增、嵌合引物起始的等温扩增、Q-β扩增***或者OneCutEventAmplificatioN进行。
在等温扩增过程中可以利用的技术是核酸酶链式反应(NCR)、RNA酶介导的核酸酶链式反应(RNCR)。这两种方法均用DNA一条链的选择性降解替代链置换。当一条链含有核糖核苷酸时，可以利用限制性内切核酸酶或者RNA酶H起始该过程。聚合酶核酸酶链式反应(PNCR)依赖于靶DNA存在时核酸酶的切割，随后利用DNA聚合酶进行延伸过程。RNA酶介导的检测法(RMD)是一种利用RNA酶H对DNA:RNA杂交体进行链降解的方法。RMD是一种有效的线性扩增***，其有时与其他方法结合使用。串联重复限制性酶促(TR-REF)链式反应或者反式反向互补限制性酶促(IRC-REF)链式反应是一种方法的两种变体，其依赖于循环产生含有串联重复的检测探针。这些重复由DNA聚合酶拷贝，这时特异性寡核苷酸引发物可以作为引物起作用。接着，限制性内切核酸酶攻击新形成的双链DNA，使得初始引物和第二引物释放，以便可以起始两个新的循环。等温扩增反应可以多重化，以同时对几个目标靶核酸序列进行检测。
还可以理解，存在一些具有“链侵入”性质的核酸，这种链侵入导致靶核酸的互补链发生置换，并且形成靶探针双链或者靶探针三链，而不需要靶序列首先是单链的。多肽核酸(PNAs)和其衍生物能够进行链侵入，因此本文公开的含有靶核酸结合区域(包含PNAs)的探针可以用于检测未完全成为单链的靶核酸。环状探针中要特别考虑使用包含PNAs的靶结合区域，此时在形成靶探针杂交体之前，探针的靶结合区域基本上是双链的。
本文中使用的“靶-结合结构域”和其等价物“靶结合结构域”是指核酸分子中存在的核酸序列，其与靶核酸中存在的核酸序列完全互补，以允许靶结合区域和靶核酸发生杂交因而形成靶探针杂交体。
在本文公开的某些实施方案中，检测靶核酸的方法依赖于检测或者测定来自标记物的信号，优选经发光标记物标记之探针的光发射。本文中使用的术语“标记物”是指能够与核酸连接并且能够用于提供可检出信号或者与第二标记物相互作用以修饰第二标记物提供之可检出信号的任何原子、分子、化合物或者基团。优选的标记物是通过荧光、化学发光或者生物发光产生可检出信号的发光化合物。更优选的标记物是当与掩蔽基团(例如淬灭生色团)足够接近时信号消失或者不可检出的发光化合物。
还可以使用替代性标记***，其中显示将标记物从可以与固体基质结合的基团上切割下来。一个示例是生物素标记，其可以与经固定的抗生物素蛋白结合，因此探针的非切割部分可以与探针另一端存在的第二标记物结合。这种方法可以用于基于试条法的检测中。而更多的检测***可能使用能够用纳米孔技术识别的标记物。本文中描述的方法可用于经单个标记物标记之探针的检测，尽管可能会使用多个标记物。当利用切割作用使标记物(例如荧光团)从掩蔽基团(例如淬灭基团)完全移除，或者切割作用使得发生探针变性过程时，对经切割的探针进行检测。这减少了掩蔽基团与标记物的相互作用，因此使得信号发射。本文中使用的术语“掩蔽基团”是指可以与标记物相互作用以使标记物的信号发射减少的任何原子、分子、化合物或者基团。标记物和掩蔽基团的分离(由于切割作用或者切割作用所引起的探针变性过程而造成)反过来导致相连标记物之信号发射的可检出增加。取决于标记物的不同，信号发射可以包括光发射、粒子发射、有色化合物的出现或者消失以及类似。
优选的发光标记物和可以相互作用以对标记物发光进行修饰的掩蔽基团描述于下面。术语“生色团”是指吸收光能的一种非放射性化合物。一些生色团可以经激发而发光，或者通过化学反应产生化学发光，或者通过光吸收产生荧光。术语“荧光团”是指能够发出荧光的化合物，即在一个频率下吸收光并且在另一个(一般较低)频率下发射光。
术语“生物发光”是指一种化学发光形式，其中发光化合物在活的有机体中发现。生物发光化合物的示例包括细菌荧光素酶和荧火虫荧光素酶。术语“淬灭”是指由第二化合物引起的第一化合物荧光减少(无论以何种机制)。淬灭典型地需要化合物紧密接近。如本文中使用，化合物或者化合物的荧光均可称其被淬灭，并且可以理解两种用法均指相同的现象。
本领域描述的许多荧光团和生色团均适用于本文公开的方法中。选择合适的荧光团和淬灭生色团对，以使荧光团的发射光谱与生色团的吸收光谱相重叠。优选地，荧光团具有较高的斯托克斯位移值(Stokes shift)(最大吸收波长和最大发射波长之间的差异较大)，以使散射之激发光的干扰最小化。
本领域熟知的合适的标记物包括但不限于荧光素及其衍生物例如FAM、HEX、TET和JOE；若丹明及其衍生物例如Texas Red、ROX和TAMRA；Lucifer Yellow，和香豆素及其衍生物例如7-Me2N-香豆素-4-乙酸，7-OH-4-CH.3-香豆素-3-乙酸和7-NH2-4-CH3-香豆素-3-乙酸(AMCA)。FAM，HEX，TET，JOE，ROX和TAMRA由Perkin Elmer，Applied Biosystems Division(Foster City，Calif.)出售。Texas Red和很多其他合适的化合物由Molecular Probes(Eugene，Oreg.)出售。适于用作能量供体的化学发光和生物发光化合物的示例包括鲁米诺(3-氨基苯二甲酰肼)及其衍生物，和Luciferases。
而在大部分实施方案中，优选可检出标记物是发光标记物，掩蔽基团是淬灭物例如淬灭生色团，其他可检出标记物和掩蔽基团也是可以的。例如，标记物可以是酶，掩蔽基团是所述酶的抑制剂。当酶和抑制剂充分紧密接近而发生相互作用时，抑制剂能够抑制酶的活性。一旦探针发生切割或者变性，酶和抑制物分离并且不再能够相互作用，使得酶活化。多种能够催化产生可检出产物的酶和该酶活性的抑制剂是本领域技术人员熟知的，例如13-半乳糖苷酶和辣根过氧化物酶。
计算机相关的实施方案
可以通过标准电学方法进行设备控制，所述方法利用温度循环设备典型的硬件、软件和固件。同样地，任何集成的检测***可以使用类似的可程序化设备。
检测设备产生的数据可以从简单的是/否检测(当设备用于检测特定试剂时)至实时数据(此时测定信号达到预设阈值的时间，从而产生定量数据)。类似地，可以以获取到达检测仪(放置于毛细管电泳设备旁某点处)之荧光峰值的形式产生电泳数据。
可以利用通过外部电子端口、无线技术、内部存储设备或者内部固件向设备提供的计算机程序进行数据分析。为了简便的目的，例如具有确定单个靶核酸是否存在之特定作用的设备，可以以任何可见显示器例如光或者LCD或者LED显示的形式进行报告。
当数据需要更复杂的分析或者使用者输入的水平更高时，原始数据、经加工的数据或者部分经加工的数据可以通过任何形式的可移动存储设备或者通信电缆转移至外部计算机。
在某些实施方案中，结果可以利用无线技术以获取数据库信息，或者利用存储在设备中、可以辅助鉴定样品中存在之靶核酸的数据库信息。结果可以是二进制的，即存在或者不存在，或者其可以是定量或者多变量的。
实施例
本文公开的方面仅以实施例的方式描述，并且应当理解，在不偏离所附权利要求限定之范围的前提下，可以对其进行修饰和添加。
实施例1：液体递送试剂的单个腔室设备
图2描述了本设备的一个实施方案，其包含利用液体依次递送试剂的单个腔室处理和检测步骤。容器的形状可以是环形、方形、三角形或者任何其他可用的形状，如果需要，其具有多个口。根据其应用，该腔室还可以进行优化以用于微流体样品或者更大容积。在步骤2A中，将处理试剂和底物加入到腔室中。在步骤2B中，调节反应温度以使其适合处理试剂。核酸释放至溶液中。在步骤2C中，温度进一步升高，以使处理试剂失活。在步骤2D中详细描述了等温扩增/检测***，其中使用单一温度。将检测加入到腔室中。调节反应温度以使其适合检测试剂。在本阶段进行特定对象的检测，在本实施例中通过荧光检测。在另一个实施方案中，例如步骤2E中描述，将检测试剂加入到腔室中。在本实施例中，使反应温度循环以进行定量PCR。在本阶段进行特定对象的检测，在本实施例中通过荧光检测。
实施例2：具有经包裹试剂的单个腔室设备
图3显示了利用经包裹试剂的单个腔室处理和检测设备。在步骤3A中，将处理试剂和底物以及检测试剂加入到腔室中，但是所述检测试剂经包裹，以保护其不被处理过程使用的蛋白酶降解。在步骤3B中，调节反应温度以使其适合处理试剂。核酸释放出来。在步骤3C中，完成后，调节温度以使处理试剂失活，同时随着包裹珠溶解，检测试剂释放出来。在步骤3D中，调节反应温度以使其适合检测试剂。对于等温扩增/检测***，使用单一温度。在本阶段进行特定对象的检测，在本实施例中通过荧光检测。在步骤2E中，在本实施例中，使反应温度循环以进行定量PCR。在本阶段进行特定对象的检测，在本实施例中通过荧光检测。
实施例3：具有经包裹试剂的管容纳设备
图4描述了利用经包裹试剂的、基于管的处理和检测步骤。在步骤4A中，将含有处理试剂、底物和经包裹之检测试剂的管置于设备中并盖上。在步骤4B中，调节反应温度以使其适合处理试剂。核酸释放出来。在步骤4C中，完成后，温度进一步升高以使处理试剂失活，同时随着包裹珠溶解，检测试剂释放出来。在步骤4D中，调节反应温度以使其适合检测试剂。对于等温扩增/检测***，使用单一温度。在本阶段进行特定对象的检测，在本实施例中通过荧光检测。在4E中，在本实施例中，使反应温度循环以进行定量PCR。在本阶段进行特定对象的检测，在本实施例中通过荧光检测。
实施例4：来自口腔细胞之核酸的封闭管检测
图5详细描述了显示在单个封闭容器中如何将嗜热酶与扩增和检测试剂结合使用的实验。在本实施例中，所有的试剂，包括未处理的口腔细胞、处理试剂、扩增试剂和检测试剂均密封于200μl的PCR管中，并且所有过程均利用单一温度进行，以从全细胞中实现核酸检测。
依照标准步骤从个体中获取口腔拭子。使用标准棉签，并指导参与者擦拭口腔和牙龈内部1分钟。将拭子上的碎片悬于1ml的5mM Tris(室温下pH值为8.3)中。制备下列PCR和检测试剂混合液。引物是，引物1：TCTCCTCCGATTTCAACAGTGA；引物2，5′-GGTCGTTGAGGGCAATGC.Platinum
Figure BPA00001348855700171
Taq DNA Polymerase Invitrogen，San Diego，USA。
Figure BPA00001348855700172
利用该主要混合物，制备下列混杂物(cocktail)。这些是多种试剂的组合物，包含处理试剂、全细胞或者对照DNA。
Figure BPA00001348855700173
Figure BPA00001348855700181
将25微升的5种混合物分别加入到透明PCR管中并密封。所有随后的反应均由加热控制并不再打开管。管在ABI5700 Sequence检测***(Applied Biosystems，Forster City，USA)中进行热循环，于75℃ 10分钟(处理步骤)；95℃ 10分钟(蛋白酶热灭活步骤和聚合酶活化步骤)；95℃ 30秒、60℃ 30秒、72℃ 30秒进行35个循环，最后步骤中测定荧光(扩增/检测步骤)。
图5中的结果显示当使用嗜热蛋白酶时，可以在热控制下进行细胞处理和检测。5A的轨迹显示Platinum Taq DNA聚合酶能够抵抗EA1蛋白酶的水解作用。5B的轨迹显示当将全细胞加入到混合物中时EA1蛋白酶存在或者缺失的效果。当未加入蛋白酶(轨迹5)时，CT值比EA1存在(轨迹4)时大约低2个循环。这等于产量的四分之一。这种产量的损失对于痕量样品是十分重要的。
图5显示qPCR轨迹，其中将处理试剂和扩增和检测试剂混合至一个密封管中。图5A显示加入对照DNA时所产生的轨迹。图5B显示加入全细胞时所产生的轨迹(包含用作参考的对照DNA)。样品1是阳性对照(1.25ng经纯化的人DNA)。样品2是显示Platinum Taq能够抵抗EA1蛋白酶之蛋白水解活性的阳性对照。样品3是阴性对照(无轨迹)。样品4显示可以在存在处理、扩增和检测试剂的封闭管中从人口腔细胞中制备DNA。样品5显示无蛋白酶时口腔细胞经热介导的裂解水平。
实施例5：来自细菌细胞之核酸的封闭管检测
对系列稀释的大肠杆菌(Escherichia coli)细胞进行下面的实验，其中利用通用的16S rRNA寡核苷酸引物检测其存在。这些引物是微生物分析中使用的典型类型。以所列出的可用浓度使用下列试剂和材料：1单位每μl的EA1蛋白酶(ZyGEM Corporation Ltd)；GIBCO UltraPureTM Distilled水(Invitrogen)；Quanta Bioscience qPCR试剂；透明96-孔PCR板(Axygen)；最大回收过滤器尖端(Axygen)；和10μM的pPCR引物：
正向：GTCGTCAGCTCGTGTTGTGA
反向：GCCCGGGAACGTATTCAC
所有的工作在位于密闭实验室(具有通过HEPA过滤器产生的正气压)的PCR罩中进行，并且仅使用之前未打开的试剂、管、PCR板和过滤器尖端(filter tip)。此外，实验前用1％的次氯酸钠擦拭所有表面。
大肠杆菌MG1655细胞在LB肉汤中生长过夜。随后细胞于12,000r.c.f离心5分钟，并重悬于水中至细胞密度为2x107/毫升。该密度等同于105个细胞/5μl。在超纯水中进行1∶10的系列稀释，其中最低细胞浓度大约是10个细胞/5μl。系列稀释后，将5μl的每份稀释液加入到透明96孔微量滴定板的8个孔中。下列溶液一式四份加入：
Figure BPA00001348855700191
此外，每种试剂混合物中加入4份水作为对照。随后用透明粘盖将板密封并在黑暗中于4℃放置5分钟，随后通过封口使板暴露于200mm距离处的600W卤素灯下5分钟，而管保持于4℃。该步骤不是必需的，但是对于例如描述于第61/222,912号美国临时申请中的附加预处理步骤是有用的。随后将样品置于Applied Biosystems 7300实时PCR***中并且进行如下循环：
DNA提取步骤：75℃ 15分钟
Taq活化步骤：95℃ 5分钟
Figure BPA00001348855700201
图6显示封闭容器反应中获得之CT值的图形。CT值是达到阈值之前进行的PCR循环数。CT值越高，DNA的初始量越小。结果清楚地显示可以不需要打开管而在单个反应容器中进行提取和检测。

Claims (28)

1.一种检测样品中的靶核酸的方法，该方法包括：
i)用嗜热蛋白酶处理所述样品，以制备用于检测的靶核酸，
ii)提供产生表明所述样品中存在所述靶核酸的信号的检测试剂，以及
iii)检测所述信号，以确定所述靶核酸的存在，
其中所述步骤i)、ii)和iii)在单一容器或者管中进行。
2.如权利要求1所述的方法，其中所述容器或者管是设备。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述设备是手持设备。
4.如权利要求1所述的方法，其中一个或者多个步骤i)、ii)或iii)是温度控制的。
5.如权利要求1所述的方法，其中所述嗜热蛋白酶是EA1。
6.如权利要求1所述的方法，其中所述步骤a)在大约65-80℃的温度下进行足以消化蛋白的时间。
7.如权利要求6所述的方法，其中所述步骤a)进一步包括将所述嗜热蛋白酶在大约90℃或者以上的温度下孵育足以使所述蛋白酶失活的时间。
8.如权利要求1所述的方法，进一步包括步骤：
i)用嗜温酶处理所述样品，和
ii)将所述样品在低于大约40℃的温度下孵育足以实现从细胞中去除细胞壁的时间。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述嗜温酶是纤维素或溶菌酶。
10.如权利要求1所述的方法，其中所述信号是荧光。
11.如权利要求1所述的方法，其中所述检测通过PCR检测方法进行。
12.如权利要求1所述的方法，其中所述PCR检测方法是实时PCR。
13.如权利要求1所述的方法，其中所述检测通过等温检测方法进行。
14.如权利要求1所述的方法，其中所述等温检测方法通过核酸的链置换扩增、滚环扩增、环介导的等温扩增、嵌合引物引发的等温扩增、Q-β扩增***或者OneCutEventAmplificatioN进行。
15.如权利要求1所述的方法，其中所述等温检测方法利用核酸酶链式反应(NCR)、RNA酶介导的核酸酶链式反应(RNCR)、聚合酶核酸酶链式反应(PNCR)、RNA酶介导的检测(RMD)、串联重复限制性酶促(TR-REF)链式反应、或者反式反向互补限制性酶促(IRC-REF)链式反应。
16.如权利要求1所述的方法，其中所述检测试剂由微流体或者固体分配器提供。
17.如权利要求1所述的方法，其中所述检测试剂由微胶囊提供。
18.如权利要求17所述的方法，其中所述微胶囊预设置在所述容器或者管中。
19.如权利要求17所述的方法，其中所述微胶囊是不耐热胶囊。
20.如权利要求19所述的方法，其中所述不耐热胶囊是琼脂糖或者蜡珠。
21.如权利要求20所述的方法，其中当暴露于足够温度以使胶囊融化或者溶解时，所述不耐热胶囊释放所述检测试剂。
22.如权利要求1所述的方法，其中所述检测试剂抵抗所述嗜热蛋白水酶的蛋白酶剪切。
23.如权利要求1所述的方法，其中所述靶核酸的检测是自动的。
24.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是血液、尿液、唾液、***、粪便、组织、拭子、泪液或者粘液。
25.如权利要求1所述的方法，其中所述样品是细菌、真菌、古细菌、真核生物、原生动物或者病毒。
26.如权利要求2所述的方法，其中所述设备或者所述设备的元件是一次性的。
27.如权利要求2所述的方法，其中所述设备包括进口、出口、腔室、发射荧光检测器和激发光源。
28.如权利要求2所述的方法，其中所述设备进一步包括微流体、微芯片、纳米孔技术和微型设备。
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