ES2862224T3 - Preparación de muestras para tipos de muestra difíciles - Google Patents

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Abstract

Procedimiento de recogida de muestra, que comprende: recoger una muestra que comprende una sustancia biológica o medioambiental para proporcionar una muestra recogida, poner en contacto la muestra recogida con un hisopo, colocar el hisopo con la muestra recogida en un tampón de muestra, transfiriendo, de este modo, como mínimo, una porción de la muestra recogida que comprende un organismo al tampón de muestra para proporcionar un tampón de muestra que comprende el organismo, y filtrar el tampón de muestra que comprende el organismo; en el que el procedimiento no comprende una etapa de tratamiento previo que dure más de 2 minutos, y en el que el tampón de muestra comprende un detergente en una cantidad, como mínimo, del 10 % en volumen del tampón de muestra.

Description

DESCRIPCIÓN
Preparación de muestras para tipos de muestra difíciles
ESTADO DE LA TÉCNICA ANTERIOR
1. Sector técnico
Realizaciones de la presente invención se refieren, en general, a procedimientos y a dispositivos para extraer ácidos nucleicos a partir de una muestra.
2. Estado de la técnica anterior
En los Estados Unidos, Canadá y Europa occidental, la enfermedad infecciosa representa aproximadamente el 7 % de la mortalidad en seres humanos, mientras que, en zonas en desarrollo, la enfermedad infecciosa representa más del 40 % de la mortalidad en seres humanos. Las enfermedades infecciosas conducen a una variedad de manifestaciones clínicas. Entre las manifestaciones sintomáticas comunes se encuentran la fiebre, neumonía, meningitis, diarrea y diarrea que contiene sangre. Aunque las manifestaciones físicas sugieren algunos patógenos y eliminan otros como el agente etiológico, sigue habiendo una variedad de posibles agentes causantes, y un diagnóstico claro requiere, a menudo, realizar una variedad de ensayos. Las técnicas de microbiología tradicionales para diagnosticar patógenos pueden tardar días o semanas, a menudo retrasando un transcurso de tratamiento apropiado.
En los últimos años, la reacción en cadena de la polimerasa (PCR, polimerase chain reaction) se ha convertido en un procedimiento de elección para el diagnóstico rápido de agentes infecciosos. La PCR puede ser una herramienta rápida, sensible y específica para diagnosticar una enfermedad infecciosa. Un desafío para la utilización de PCR como medio primario de diagnóstico es la variedad de posibles organismos o virus causantes y los bajos niveles de organismo o virus presentes en algunas muestras patológicas. A menudo, no resulta práctico ejecutar grandes paneles de ensayos por PCR, uno para cada posible organismo o virus causante, la mayoría de los cuales se espera que sean negativos. El problema se agrava cuando el ácido nucleico del patógeno se encuentra a una baja concentración y requiere un gran volumen de muestra para reunir moldes de reacción adecuados. En algunos casos, la muestra es inadecuada para ser sometida a ensayo de detección de todos los agentes etiológicos posibles. Una solución es ejecutar “PCR múltiple”, en la que la muestra se somete a ensayo simultáneamente para detectar múltiples dianas en una única reacción. Aunque la PCR múltiple ha demostrado ser valiosa en algunos sistemas, existen inconvenientes en cuanto a la robustez de reacciones múltiples de alto nivel y dificultades para el análisis claro de múltiples productos. Para resolver estos problemas, el ensayo se puede dividir posteriormente en múltiples PCR secundarias. Anidar reacciones secundarias dentro del producto primario aumenta la robustez. Los sistemas cerrados, tales como FilmArray@ (BioFire Diagnostics, LLC, Salt Lake City, UT), reducen la manipulación, disminuyendo de este modo el riesgo de contaminación.
La preparación de muestras es, a menudo, un equilibrio entre condiciones rigurosas de extracción y lisis para liberar ácidos nucleicos a partir de materiales más resistentes, tales como esporas y muestras conservadas en parafina, y condiciones de lisis más suaves que pueden minimizar la degradación de los ácidos nucleicos, particularmente en contaminantes que experimentan lisis más fácilmente y que tienen cromosomas más largos. Sería deseable poder extraer ácidos nucleicos a partir de materiales más resistentes sin degradar otros ácidos nucleicos que pueden estar presentes en la muestra.
Además, determinados tipos de muestra pueden ser difíciles de manipular. Puede ser difícil introducir una muestra sólida, semisólida o viscosa en un sistema de procesamiento biológico. Los tipos de muestra, tales como el esputo, son difíciles de pipetear y medir y, a menudo, requieren un tratamiento previo durante un periodo de tiempo antes del procesamiento de la muestra, de manera ilustrativa con calor o ditiotreitol, para reducir la viscosidad y ayudar a romper la matriz de muestra. Además del esputo, otras muestras biológicas difíciles incluyen, pero sin limitación a las mismas, mucosa, BAL y otros tipos de muestras respiratorias, heces, tejido, homogeneizado tisular, tejido triturado, tejido incrustado en formalina tratado con parafina, hueso, homogeneizado de hueso, escaras, pus, líquido sinovial, aspirados de ganglios linfáticos y lavados estomacales. Las muestras medioambientales, de manera ilustrativa tierra, superficies, polvos o alimentos son, a menudo, sólidas o semisólidas y también pueden presentar desafíos. Además, la manipulación extensa durante el tratamiento previo de la muestra puede conducir a contaminación cruzada, puede requerir mucho tiempo y, a menudo, diluye la muestra, conduciendo, a menudo, a una sensibilidad disminuida. La Patente US 2014/073517 da a conocer un aparato de ensayo biológico autónomo basado en microfluidos, procedimientos asociados y aplicaciones. La Patente US 2012/024788 da a conocer procedimientos para separar plasma sanguíneo de sangre completa que comprenden un módulo de filtro. La Patente US 2011/217694 da a conocer procedimientos para la detección de microbios diana en una muestra mediante citometría de flujo. La Patente Us 2015/353919 da a conocer un sistema para la recogida, el procesamiento y análisis de muestras, que comprende un módulo de recogida de muestra y un cartucho de reacción. La Patente WO 03/016552 da a conocer procedimientos para la purificación rápida de ácidos nucleicos a partir de fuentes muy contaminadas con material muy particulado. La Patente WO 03/070898 da a conocer la extracción selectiva de ADN a partir de un tipo de célula en un grupo de células; y la Patente WO 2013/074391 da a conocer viales canulados. La presente invención aborda diversos problemas referentes a la preparación de una muestra antes de realizar pruebas adicionales, por ejemplo, para la purificación de ácidos nucleicos a partir de una muestra, para su análisis biológico.
CARACTERÍSTICAS DE LA INVENCIÓN
La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. En un aspecto de la presente invención, se da a conocer un procedimiento de recogida de muestra, comprendiendo el procedimiento recoger una muestra que comprende una sustancia biológica o medioambiental para proporcionar una muestra recogida, poner en contacto la muestra recogida con un hisopo, colocar el hisopo con la muestra recogida en un tampón de muestra, transfiriendo de este modo, como mínimo, una porción de la muestra recogida que comprende un organismo al tampón de muestra para proporcionar un tampón de muestra que comprende el organismo, y filtrar el tampón de muestra que comprende el organismo; en el que el procedimiento no comprende una etapa de tratamiento previo que dure más de 2 minutos y en el que el tampón de muestra comprende un detergente en una cantidad, como mínimo, del 10 % en volumen del tampón de muestra. En diversas realizaciones ilustrativas, el tampón de muestra puede incluir una proteasa y la muestra se puede recoger y transferir al tampón de muestra utilizando un hisopo flocado.
Realizaciones ilustrativas pueden incluir hacer pasar la muestra a través de un filtro.
En otro aspecto, se da a conocer un procedimiento de recogida de muestra, comprendiendo el procedimiento recoger una muestra que comprende una sustancia biológica o medioambiental poniendo en contacto la muestra con un material que recoge y libera, preferentemente, el organismo a lo largo de la matriz de muestra, y colocar el material con la muestra recogida en un tampón de muestra. De manera ilustrativa, el material puede ser un material hidrófilo o un material adsorbente. En un ejemplo, una cantidad fijada del material absorbe y libera de manera reproducible una cantidad de la muestra dentro de un intervalo cuádruple.
En otro aspecto de la presente invención, se da a conocer un vial canulado, comprendiendo el vial canulado un cuerpo de vial que tiene una superficie superior en un extremo, una superficie inferior en un extremo opuesto y una pared exterior entre las mismas que define un volumen interior del vial, teniendo la superficie superior una abertura, una cánula que se extiende desde la superficie inferior y que tiene un primer extremo, un segundo extremo y una superficie externa entre las mismas que define un volumen de cánula, estando el primer extremo en comunicación fluida con el volumen interior del vial y un filtro dispuesto entre el cuerpo de vial y la cánula, y un aditivo proporcionado en el vial canulado.
En otro aspecto de la presente invención, se da a conocer un recipiente de muestra, comprendiendo el recipiente de muestra una abertura configurada para recibir una muestra, un cuerpo configurado para contener un fluido, una abertura configurada para permitir la salida del fluido, un filtro dispuesto entre el cuerpo y la salida y un aditivo proporcionado para tratar la muestra. De manera ilustrativa, el aditivo se puede proporcionar secado en el recipiente de muestra. Entre los aditivos ilustrativos se incluyen proteasas, ADNasas, inhibidores de ADNasa, ARNasas, inhibidores de ARNasa y lisozimas.
En todavía otro aspecto de la presente invención, se da a conocer un procedimiento para introducir un aditivo en un sistema, comprendiendo el procedimiento obtener el recipiente de muestra tal como se describió anteriormente, conteniendo el recipiente de muestra el fluido, introducir la muestra a través de la abertura en el fluido, hacer pasar el fluido a través del filtro y hacia fuera por la salida.
En un aspecto más, se dan a conocer procedimientos para amplificar ácidos nucleicos a partir de una muestra de sangre directa, comprendiendo los procedimientos añadir la muestra de sangre directa a un tampón de muestra, agitar con perlas el tampón de muestra, extraer los ácidos nucleicos a partir del tampón de muestra y amplificar los ácidos nucleicos. De manera ilustrativa, tales procedimientos se pueden realizar en un recipiente de muestra cerrado. En otro procedimiento ilustrativo, las etapas se realizan sin ninguna o varias de centrifugación, precipitación con etanol y digestión de ADN.
En la siguiente descripción se expondrán características y ventajas adicionales de las realizaciones de la presente invención o se pueden aprender mediante la práctica de tales realizaciones. Las características y ventajas de tales realizaciones se pueden realizar y obtener por medio de los instrumentos y las combinaciones destacados particularmente en las reivindicaciones adjuntas. Estas y otras características resultarán más evidentes a partir de la siguiente descripción y las reivindicaciones adjuntas, o se pueden aprender mediante la práctica de tales realizaciones tal como se exponen a continuación en el presente documento.
DESCRIPCIÓN BREVE DE LOS DIBUJOS
Con el fin de describir la manera en la que se pueden obtener las ventajas y características indicadas anteriormente y otras de la presente invención, una descripción más particular de la presente invención descrita de manera breve anteriormente se presentará con referencia a realizaciones específicas de la misma que se ilustran en los dibujos adjuntos. Entendiendo que estos dibujos representan sólo realizaciones típicas de la presente invención y, por tanto, no se deben considerar que limitan su alcance, la presente invención se describirá y explicará con especificidad y detalle adicionales mediante la utilización de los dibujos adjuntos, en los que:
La figura 1 muestra un estuche flexible, según una realización de la presente invención.
La figura 2 es una vista en perspectiva en despiece ordenado de un instrumento para su utilización con el estuche de la figura 1, que incluye el estuche de la figura 1, según una realización de ejemplo de la presente invención. La figura 3 muestra una vista en sección transversal parcial del instrumento de la figura 2, que incluye los componentes de bolsa de la figura 2, mostrándose el estuche de la figura 1 en líneas discontinuas, según una realización de ejemplo de la presente invención.
La figura 4 muestra un motor utilizado en una realización ilustrativa del instrumento de la figura 2.
La figura 5 muestra una estación de carga para cargar el estuche de la figura 1, que incluye el estuche de la figura 1, según una realización de ejemplo de la presente invención.
La figura 6 muestra un vial de muestra para cargar una muestra en el estuche de la figura 1.
La figura 7 muestra un vial de hidratación para proporcionar un fluido de hidratación al estuche de la figura 1, según una realización de ejemplo de la presente invención.
La figura 8 muestra una estación de carga comparable a la figura 5, pero que presenta una configuración de la estación de carga diferente y viales para su utilización con la estación de carga, según una realización de ejemplo de la presente invención.
La figura 9 muestra una porción del vial de muestra de la figura 8 y cómo el vial de muestra se conecta al receptáculo de vial de muestra de la estación de carga de la figura 8, según una realización de ejemplo de la presente invención.
La figura 10 muestra una porción de un vial de hidratación de la figura 8 y cómo el vial de hidratación se conecta al receptáculo de vial de hidratación de la estación de carga de la figura 8, según una realización de ejemplo de la presente invención.
DESCRIPCIÓN DETALLADA
A continuación, se describen realizaciones de ejemplo con referencia a los dibujos adjuntos. Son posibles muchas formas y realizaciones diferentes sin desviarse de las enseñanzas de la presente invención y, por tanto, no se debe interpretar que la presente invención esté limitada a las realizaciones de ejemplo expuestas en el presente documento. En vez de eso, estas realizaciones de ejemplo se proporcionan de modo que la presente invención sea minuciosa y completa y transmita el alcance de la presente invención a los expertos en la materia. En los dibujos, los tamaños y tamaños relativos de capas y zonas se pueden exagerar para una mayor claridad. Números de referencia similares se refieren a elementos similares a lo largo de toda la descripción.
A menos que se defina lo contrario, todos los términos (incluyendo términos técnicos y científicos) utilizados en el presente documento tienen el mismo significado que el que entiende habitualmente un experto habitual en la materia a la que pertenece la presente invención. Además, se entenderá que se debe interpretar que los términos, tales como aquellos definidos en diccionarios utilizados habitualmente, tienen un significado que es compatible con su significado en el contexto de la presente solicitud y la técnica relevante y no se deben interpretar en un sentido idealizado o excesivamente formal, a menos que se defina expresamente así en el presente documento. La terminología utilizada en la descripción de la presente invención en el presente documento tiene sólo el propósito de describir realizaciones particulares y no se pretende que sea limitativa de la presente invención. Aunque se pueden utilizar varios procedimientos y materiales similares o equivalentes a los descritos en el presente documento en la práctica de la presente invención, sólo se describen en el presente documento determinados materiales y procedimientos a modo de ejemplo.
Diversos aspectos de la presente invención, que incluyen dispositivos, sistemas, procedimientos, etc., se pueden ilustrar con referencia a una o varias implementaciones a modo de ejemplo. Tal como se utilizan en el presente documento, los términos “de ejemplo” e “ilustrativo” significan “que sirve como un ejemplo, caso o ilustración”, y no se deben interpretar necesariamente como preferente o ventajoso con respecto a otras implementaciones dadas a conocer en el presente documento. Además, la referencia a una “implementación” o “realización” de la presente divulgación o invención incluye una referencia específica a una o varias realizaciones de la misma, y viceversa, y se pretende que proporcione ejemplos ilustrativos sin limitar el alcance de la presente invención, que se indica por las reivindicaciones adjuntas en vez de por la siguiente descripción.
Cabe destacar que, tal como se utiliza en la presente memoria descriptiva y las reivindicaciones adjuntas, las formas en singular “un”, “uno/una” y “el/la” incluyen los referentes en plural, a menos que el contenido indique claramente lo contrario. Por tanto, por ejemplo, la referencia a “una placa” incluye una, dos o más placas. De manera similar, se debe interpretar que la referencia a una pluralidad de referentes comprende un único referente y/o una pluralidad de referentes, a menos que el contenido y/o contexto indique claramente lo contrario. Por tanto, la referencia a “placas” no requiere necesariamente una pluralidad de tales placas. En vez de eso, se apreciará que, independientemente de la conjugación, en el presente documento se contemplan una o varias placas.
Tal como se utilizan a lo largo de la totalidad de la presente solicitud, los términos “puede” y “pueden” se utilizan en un sentido permisivo (es decir, que significa que tiene el potencial de), en vez del sentido obligatorio (es decir, que significa que debe). Adicionalmente, las expresiones “que incluye”, “que tiene”, “que implica”, “que contiene”, “caracterizado por”, variantes de las mismas (por ejemplo, “incluye”, “tiene”, “implica”, “contiene”, etc.) y términos y expresiones similares, tal como se utilizan en el presente documento, que incluyen las reivindicaciones, serán inclusivos y/o abiertos, tendrán el mismo significado que la expresión “que comprende” y variantes de la misma (por ejemplo, “comprenden” y “comprende”) y no excluyen elementos o etapas de procedimiento no indicados adicionales, de manera ilustrativa.
Tal como se utilizan en el presente documento, las expresiones de dirección y/o arbitrarios, tales como “parte superior”, “parte inferior”, “izquierda”, “derecha”, “arriba”, “abajo”, “superior”, “inferior”, “parte interior”, “parte exterior”, “interno”, “externo”, “interior”, “exterior”, “proximal”, “distal”, “directo”, “inverso” y similares se pueden utilizar únicamente para indicar direcciones y/u orientaciones relativas y pueden no pretender limitar de otro modo el alcance de la divulgación, incluyendo la memoria descriptiva, la presente invención y/o las reivindicaciones.
Se entenderá que, cuando se menciona que un elemento está “acoplado”, “conectado” o es “sensible” a, o está “encima de”, otro elemento, puede estar directamente acoplado, conectado o ser sensible a, o estar encima de, el otro elemento, o también pueden estar presentes elementos intermedios. En cambio, cuando se menciona que un elemento está “directamente acoplado”, “directamente conectado” o es “directamente sensible” a, o está “directamente encima de”, otro elemento, no hay elementos intermedios presentes.
En el presente documento se describen realizaciones de ejemplo de los conceptos de la presente invención con referencia a ilustraciones en sección transversal que son ilustraciones esquemáticas de realizaciones (y estructuras intermedias) idealizadas de ejemplos de realización. De este modo, son de esperar variaciones con respecto a las formas de las ilustraciones como resultado, por ejemplo, de técnicas y/o tolerancias de fabricación. Por tanto, no se debe interpretar que las realizaciones de ejemplo de los conceptos de la presente invención estén limitadas a las formas particulares de zonas ilustradas en el presente documento, sino que deben incluir desviaciones de las formas que resultan, por ejemplo, de la fabricación. Por consiguiente, las zonas ilustradas en las figuras son de naturaleza esquemática y no se pretende que sus formas ilustren la forma real de una zona de un dispositivo y no se pretende que limiten el alcance de las realizaciones de ejemplo.
Se entenderá que, aunque en el presente documento se pueden utilizar los términos “primero”, “segundo”, etc., para describir diversos elementos, estos elementos no deben estar limitados por estos términos. Estos términos se utilizan sólo para distinguir un elemento de otro. Por tanto, un “primer” elemento se podría denominar un “segundo” elemento sin apartarse de las enseñanzas de las presentes realizaciones.
También se debe entender que se pueden utilizar diversas implementaciones descritas en el presente documento en combinación con cualquier otra implementación descrita o dada a conocer, sin apartarse del alcance de la presente invención. Por tanto, productos, miembros, elementos, dispositivos, aparatos, sistemas, procedimientos, procesos, composiciones y/o kits según determinadas implementaciones de la presente invención pueden incluir, incorporar o comprender de otro modo propiedades, características, componentes, miembros, elementos, etapas y/o similares descritos en otras implementaciones (incluyendo sistemas, procedimientos, aparatos y/o similares) dadas a conocer en el presente documento sin apartarse del alcance de la presente invención. Por tanto, no se debe interpretar que la referencia a una característica específica con respecto a una implementación esté limitada sólo a las aplicaciones dentro de dicha implementación.
Los títulos utilizados en el presente documento son sólo con propósitos organizativos y no se pretende que se utilicen para limitar el alcance de la descripción o las reivindicaciones. Para facilitar la comprensión, se han utilizado números de referencia similares, cuando ha sido posible, para designar elementos similares comunes en las figuras. Además, cuando ha sido posible, se ha utilizado una numeración similar de elementos en diversas figuras. Además, cada una de las configuraciones alternativas de un elemento particular puede incluir letras independientes adjuntas al número de elemento.
El término “aproximadamente” se utiliza en el presente documento para significar de manera aproximada, en la zona de, en la proximidad de o alrededor de. Cuando el término “aproximadamente” se utiliza junto con un intervalo numérico, modifica ese intervalo ampliando los límites por encima y por debajo de los valores numéricos expuestos. En general, el término “aproximadamente” se utiliza en el presente documento para modificar un valor numérico por encima y por debajo del valor indicado mediante una variación del 5 %. Cuando se expresa un intervalo de este tipo, otra realización incluye desde un valor particular y/o hasta el otro valor particular. De manera similar, cuando se expresan valores como aproximaciones, mediante la utilización del antecedente “aproximadamente”, se entenderá que el valor particular forma otra realización. Además, se entenderá que los puntos de extremo de cada uno de los intervalos son significativos tanto con respecto al otro punto de extremo como independientemente del otro punto de extremo.
El término “o”, tal como se utiliza en el presente documento, significa un miembro cualquiera de una lista particular y también incluye cualquier combinación de miembros de esa lista.
Por “muestra” se entiende un animal; un tejido u órgano de un animal; una célula (ya sea dentro de un individuo, tomada directamente de un individuo o una célula mantenida en cultivo o de una línea celular cultivada); un lisado celular (o fracción de lisado) o extracto celular; una solución que contiene una o varias moléculas derivadas de una célula, material celular o material vírico (por ejemplo, un polipéptido o ácido nucleico); o una solución que contiene un ácido nucleico que no se produce de manera natural, que se somete a ensayo, tal como se describe en el presente documento. Una muestra también puede ser cualquier líquido o excreción corporal (por ejemplo, pero sin limitación a los mismos, sangre, orina, heces, saliva, lágrimas, bilis o líquido cefalorraquídeo) que puede contener o no células de huésped o de patógeno, componentes celulares o ácidos nucleicos.
La expresión “ácido nucleico”, tal como se utiliza en el presente documento, se refiere a un oligonucleótido o polinucleótido que se produce de manera natural o sintético, ya sea ADN o ARN o un híbrido de ADN-ARN, monocatenario o bicatenario, sentido o antisentido, que se puede hibridar con un ácido nucleico complementario mediante apareamiento de bases de Watson-Crick. Los ácidos nucleicos de la presente invención también pueden incluir análogos de nucleótidos (por ejemplo, BrdU) y enlaces internucleosídicos distintos de fosfodiéster (por ejemplo, ácido nucleico peptídico (ANP) o enlaces tiodiéster). En particular, los ácidos nucleicos pueden incluir, sin limitación a los mismos, ADN, ARN, ADNc, ADNg, ADNmc, ADNbc o cualquier combinación de los mismos
Por “sonda”, “cebador” u “oligonucleótido” se entiende una molécula de ácido nucleico monocatenario de secuencia definida que puede experimentar apareamiento de bases con una segunda molécula de ácido nucleico que contiene una secuencia complementaria (la “diana”). La estabilidad del híbrido resultante depende de la longitud, el contenido de GC y el grado de apareamiento de bases que se produce. El grado de apareamiento de bases se ve afectado por parámetros, tales como el grado de complementariedad entre las moléculas de sonda y de diana y el grado de rigurosidad de las condiciones de hibridación. El grado de rigurosidad de la hibridación se ve afectado por parámetros, tales como la temperatura, la concentración de sal y la concentración de moléculas orgánicas, tales como formamida, y se determina mediante procedimientos conocidos por un experto en la materia. Las sondas, los cebadores y los oligonucleótidos se pueden marcar de forma detectable, ya sea de forma radiactiva, fluorescente o no radiactiva, mediante procedimientos bien conocidos por los expertos en la materia. Se pueden utilizar colorantes de unión a ADNbc para detectar ADNbc. Se entiende que un “cebador” está configurado específicamente para extenderse mediante una polimerasa, mientras que una “sonda” o un “oligonucleótido” pueden estar configurados de este modo o no.
Por “colorantes de unión a ADNbc” se entiende colorantes que emiten una fluorescencia diferente cuando se unen a ADN bicatenario que cuando se unen a ADN monocatenarios o están libres en solución, habitualmente por fluorescencia más intensa. Aunque se hace referencia a colorantes de unión a ADNbc, se entiende que en el presente documento se puede utilizar cualquier colorante adecuado, describiéndose algunos colorantes ilustrativos no limitativos en la Patente US 7,387,887. Se pueden utilizar otras sustancias productoras de señales para detectar la amplificación y fusión de ácidos nucleicos, de manera ilustrativa, enzimas, anticuerpos, etc., tal como se conocen en la materia.
Por “se hibrida específicamente” se entiende que una sonda, un cebador o un oligonucleótido reconoce e interacciona físicamente (es decir, experimenta apareamiento de bases) con un ácido nucleico complementario sustancialmente (por ejemplo, un ácido nucleico de muestra) en condiciones de rigurosidad alta, y no experimenta apareamiento de bases sustancialmente con otros ácidos nucleicos.
Por “condiciones de rigurosidad alta” se entiende que se produce, de forma general, aproximadamente a la temperatura de fusión (Tf) menos 5 °C (es decir, 5 °C por debajo de la Tf de la sonda). De manera funcional, las condiciones de rigurosidad alta se utilizan para identificar secuencias de ácido nucleico que tienen, como mínimo, el 80 % de identidad de secuencia.
Aunque la PCR es el procedimiento de amplificación utilizado en los ejemplos en el presente documento, se entiende que cualquier procedimiento de amplificación que utilice un cebador puede ser adecuado. Tales procedimientos adecuados incluyen reacción en cadena de la polimerasa (PCR); amplificación por desplazamiento de cadena (SDA, strand displacement amplification); amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico (NASBA, nucleic acid sequence-based ampliiication); amplificación por círculo rodante en cascada (CRCA, cascade rolling circle ampliiication), amplificación isotérmica mediada por bucle (LAMP, loop-mediated isothermal ampliiication) de ADN; amplificación isotérmica e iniciada por cebadores quiméricos de ácidos nucleicos (ICAN, isothermal and chimeric primer-initiated ampliiication o i nucleic acids); amplificación dependiente de la helicasa basada en diana (HDA, target based-helicase dependent ampliiication); amplificación mediada por transcripción (TMA, transcription-mediated ampliiication) y similares. Por tanto, cuando se utiliza el término PCR, se debe entender que incluye otros procedimientos de amplificación alternativos. Para los procedimientos de amplificación sin ciclos diferenciados, se puede utilizar un tiempo de reacción en el que se realizan mediciones en ciclos o Cp, y se puede añadir un tiempo de reacción adicional en el que se añaden ciclos de PCR adicionales en las realizaciones descritas en el presente documento. Se entiende que puede ser necesario ajustar los protocolos en consecuencia.
Aunque diversos ejemplos en el presente documento hacen referencia a dianas humanas y patógenos humanos, estos ejemplos son sólo ilustrativos. Los procedimientos, kits y dispositivos descritos en el presente documento se pueden utilizar para detectar y secuenciar una amplia variedad de secuencias de ácido nucleico a partir de una amplia variedad de muestras, incluyendo humanas, veterinarias, industriales y medioambientales.
Diversas realizaciones dadas a conocer en el presente documento utilizan un estuche de análisis de ácidos nucleicos autónomo para someter a ensayo una muestra para detectar la presencia de diversas sustancias biológicas, de manera ilustrativa, antígenos y secuencias de ácido nucleico, de manera ilustrativa, en un sistema cerrado individual. Tales sistemas, que incluyen estuches e instrumentos para su utilización con los estuches, se dan a conocer con más detalle en la Patente US 8,394,608; y la Patente US 8,895,295; y la Patente US 2014-0283945. Sin embargo, se entiende que tales estuches son sólo ilustrativos, y la preparación y las reacciones de amplificación de ácidos nucleicos comentadas en el presente documento se pueden realizar en cualquiera de una variedad de recipientes de muestra de sistema abierto o cerrado, tal como se conocen en la materia, que incluyen placas de 96 pocillos, placas de otras configuraciones, matrices, carruseles y similares, que utilizan una variedad de sistemas de purificación y amplificación de ácidos nucleicos, tal como se conocen en la materia. Aunque en el presente documento se utilizan las expresiones “pocillo de muestra”, “pocillo de amplificación”, “recipiente de amplificación” o similares, se pretende que estos términos abarquen pocillos, tubos y otros recipientes de reacción diversos que se utilizan en estos sistemas de amplificación. En una realización, se utiliza el estuche para realizar un ensayo para la detección de múltiples patógenos. El estuche puede incluir uno o varios blísteres utilizados como pocillos de muestra, de manera ilustrativa, en un sistema cerrado. De manera ilustrativa, se pueden realizar diversas etapas en el estuche desechable opcionalmente, que incluyen la preparación del ácido nucleico, PCR múltiple primaria de gran volumen, dilución del producto de amplificación primaria y PCR secundaria, culminando con la detección en tiempo real opcional o el análisis tras la amplificación, tal como análisis de la curva de fusión. Además, se entiende que aunque las diversas etapas se pueden realizar en estuches de la presente invención, para determinadas utilizaciones se pueden omitir una o varias de las etapas, y la configuración del estuche se puede alterar en consecuencia.
La figura 1 muestra un estuche ilustrativo 510 que se puede utilizar en diversas realizaciones, o se puede reconfigurar para diversas realizaciones. El estuche 510 es similar a la figura 15 de la Patente US 8,895,295, con elementos similares numerados de la misma manera. El montaje 590 está dotado de canales de entrada 515a a 515l, que también sirven como depósitos de reactivo o depósitos de residuo. De manera ilustrativa, los reactivos se pueden liofilizar en el montaje 590 y volver a hidratar antes de su utilización. Los blísteres 522, 544, 546, 548, 564 y 566, con sus canales respectivos 514, 538, 543, 552, 553, 562 y 565, son similares a los blísteres con el mismo número de la figura 15 de la Patente US 8,895,295. La zona de reacción de segunda etapa 580 de la figura 1 es similar a la de la Patente US 8,895,295, pero los pocillos de segunda etapa 582 de la matriz de alta densidad 581 están dispuestos en un patrón algo diferente. El patrón más circular de la matriz de alta densidad 581 de la figura 1 elimina los pocillos en las esquinas y puede tener como resultado un llenado más uniforme de los pocillos de segunda etapa 582. Tal como se muestra, la matriz de alta densidad 581 está dotada de 102 pocillos de segunda etapa 582. El estuche 510 es adecuado para su utilización en el instrumento FilmArray@ (BioFire Diagnostics, LLC, Salt Lake City, UT). Sin embargo, se entiende que la realización del estuche es sólo ilustrativa.
Aunque se pueden utilizar otros recipientes, de manera ilustrativa, el estuche 510 está formado por dos capas de una película de plástico flexible u otro material flexible, tal como poliéster, tereftalato de polietileno (PET), policarbonato, polipropileno, poli(metacrilato de metilo) y mezclas de los mismos, que se pueden realizar mediante cualquier proceso conocido en la materia, que incluye extrusión, deposición por plasma y laminación. También se pueden utilizar láminas metálicas o plásticos con laminación de aluminio. En la materia se conocen otros materiales de barrera que se pueden sellar entre sí para formar los blísteres y canales. Si se utiliza una película de plástico, las capas se pueden unir entre sí, de manera ilustrativa, mediante termosellado. De manera ilustrativa, el material tiene una capacidad de unión a ácido nucleico baja.
Para las realizaciones que emplean monitorización por fluorescencia, son preferentes las películas de plástico que tienen, de manera adecuada, una baja absorbancia y autofluorescencia a las longitudes de onda de funcionamiento. Tal material se podría identificar sometiendo a ensayo diferentes plásticos, diferentes plastificantes y proporciones de compuestos, así como diferentes grosores de la película. Para los plásticos con laminación de aluminio u otra lámina, la porción del estuche que se tiene que leer mediante un dispositivo de detección por fluorescencia se puede dejar sin la lámina. Por ejemplo, si se monitoriza la fluorescencia en los pocillos de segunda etapa 582 de la zona de reacción de segunda etapa 580 del estuche 510, entonces una o ambas capas en los pocillos 582 se dejarán sin la lámina. En el ejemplo de PCR, laminados de película compuestos por poliéster (Mylar, Dupont, Wilmington DE) con un grosor de aproximadamente 0,0048 pulgadas (0,1219 mm) y películas de polipropileno con un grosor de 0,001-0,003 pulgadas (0,025-0,076 mm) tienen un buen rendimiento. De manera ilustrativa, el estuche 510 se realiza a partir de un material transparente que puede transmitir aproximadamente el 80 %-90 % de la luz incidente.
En la realización ilustrativa, los materiales se mueven entre los blísteres mediante la aplicación de presión, de manera ilustrativa, presión neumática, sobre los blísteres y canales. Por consiguiente, en realizaciones que emplean presión, el material del estuche es, de manera ilustrativa, lo suficientemente flexible como para permitir que la presión tenga el efecto deseado. El término “flexible” se utiliza en el presente documento para describir una característica física del material del estuche. El término “flexible” se define en el presente documento como fácilmente deformable mediante los niveles de presión utilizados en el presente documento sin agrietarse, romperse, cuartearse o similares. Por ejemplo, láminas delgadas de plástico, tales como película para envolver Sara® y bolsas Ziploc®, así como una lámina delgada de metal, tal como lámina de aluminio, son flexibles. Sin embargo, sólo es necesario que determinadas zonas de los blísteres y canales sean flexibles, incluso en realizaciones que emplean presión neumática. Además, sólo es necesario que un lado de los blísteres y canales sea flexible, siempre que los blísteres y canales sean fácilmente deformables. Otras zonas del estuche 510 se pueden realizar a partir de un material rígido o se pueden reforzar con un material rígido.
De manera ilustrativa, se utiliza una película de plástico para el estuche 510. Una lámina de metal, de manera ilustrativa, aluminio, u otro material adecuado, se puede fresar o cortar de otro modo para crear un molde que tiene un patrón de superficies elevadas. Cuando se ajusta en una prensa neumática (de manera ilustrativa, el dispositivo A-5302-PDS, Janesville Tool Inc., Milton WI), de manera ilustrativa, regulada a una temperatura de funcionamiento de 195 °C, la prensa neumática funciona como una prensa de impresión, fundiendo las superficies de sellado de la película de plástico sólo donde el molde entra en contacto con la película. Se pueden sellar diversos componentes, tales como cebadores de PCR (de manera ilustrativa, colocados sobre la lámina y secados), sustratos de unión a antígeno, perlas magnéticas y perlas de silicato de circonio, dentro de los diversos blísteres a medida que se forma el estuche 510. Los reactivos para el procesamiento de muestras se pueden colocar sobre la película antes del sellado, ya sea de manera colectiva o por separado. En una realización, se colocan trifosfatos de nucleótido (NTP) sobre la película por separado de la polimerasa y los cebadores, eliminando esencialmente la actividad de la polimerasa hasta que se hidrata la reacción mediante una muestra acuosa. Si la muestra acuosa se ha calentado antes de la hidratación, esto crea las condiciones para una verdadera PCR de inicio en caliente y reduce o elimina la necesidad de componentes químicos de inicio en caliente caros.
El estuche 510 se puede utilizar de una manera similar a la descrita en la Patente US 8,895,295. En una realización ilustrativa, se inyecta una mezcla de 300 pl que comprende la muestra que se va a someter a ensayo (100 pl) y tampón de lisis (200 pl) en un puerto de inyección (no mostrado) en el montaje 590 cerca del canal de entrada 515a y se hace pasar la mezcla de muestra al interior del canal de entrada 515a. También se inyecta agua en un segundo puerto de inyección (no mostrado) del montaje 590 adyacente al canal de entrada 515l y se distribuye a través de un canal (no mostrado) proporcionado en el montaje 590, hidratando de este modo hasta once reactivos diferentes, cada uno de los cuales se proporcionó previamente en forma seca en los canales de entrada 515b a 515l. Estos reactivos pueden incluir, de manera ilustrativa, reactivos de PCR liofilizados, reactivos de extracción de ADN, soluciones de lavado, reactivos de inmunoensayo u otras entidades químicas. De manera ilustrativa, los reactivos son para la extracción de ácidos nucleicos, PCR múltiple de primera etapa, dilución de la reacción múltiple y preparación de reactivos de PCR de segunda etapa, así como reacciones de control. En la realización mostrada en la figura 1, todo lo que es necesario inyectar es la solución de muestra en un puerto de inyección y agua en el otro puerto de inyección. Después de la inyección, se pueden sellar los dos puertos de inyección. Para más información sobre las diversas configuraciones del estuche 510 y el montaje 590, véase la Patente US 8,895,295.
Después de la inyección, se mueve la muestra desde el canal de inyección 515a hasta el blíster de lisis 522 a través del canal 514. El blíster de lisis 522 está dotado de perlas o partículas 534, tales como perlas cerámicas, y está configurado para agitar con vórtex mediante impacto utilizando paletas o palas giratorias proporcionadas dentro del instrumento FilmArray@. La molienda con perlas, mediante agitación o agitación con vórtex de la muestra en presencia de partículas de lisis, tales como perlas de silicato de circonio (ZS) 534, es un procedimiento eficaz para formar un lisado. Se entiende que, tal como se utiliza en el presente documento, términos tales como “lisar”, “lisis” y “lisado” no se limitan a romper células, sino que tales términos incluyen la alteración de partículas no celulares, tales como virus.
La figura 4 muestra un motor de agitación con perlas 819 que comprende paletas 821 que pueden estar montadas en un primer lado 811 del elemento de soporte 802, del instrumento 800 mostrado en la figura 2. Las paletas se pueden extender a través de la ranura 804 para entrar en contacto con el estuche 510. Sin embargo, se entiende que el motor 819 puede estar montado en otras estructuras del instrumento 800. En una realización ilustrativa, el motor 819 es un motor Mabuchi RC-280SA-2865 DC (Chiba, Japón), montado en el elemento de soporte 802. En una realización ilustrativa, el motor se hace girar a de 5.000 a 25.000 rpm, de manera más ilustrativa, de 10.000 a 20.000 rpm y, de manera todavía más ilustrativa, de aproximadamente 15.000 a 18.000 rpm. Para el motor Mabuchi, se ha descubierto que 7,2 V proporcionan rpm suficientes para la lisis. Sin embargo, se entiende que la velocidad real puede ser algo más lenta cuando las paletas 821 impactan con el estuche 510. Se pueden utilizar otras tensiones y velocidades para la lisis, dependiendo del motor y las palas utilizados. Opcionalmente, se pueden proporcionar pequeños volúmenes de aire controlados en la bolsa 822 adyacente al blíster de lisis 522. Se ha descubierto que, en algunas realizaciones, el llenado parcial de la bolsa adyacente con uno o más volúmenes pequeños de aire ayuda a posicionar y soportar el blíster de lisis durante el proceso de lisis. De forma alternativa, se puede utilizar otra estructura, de manera ilustrativa, una junta de estanqueidad rígida o elástica u otra estructura de retención, alrededor del blíster de lisis 522 para restringir el estuche 510 durante la lisis. También se entiende que el motor 819 es sólo ilustrativo y se pueden utilizar otros dispositivos para moler, agitar o agitar con vórtex la muestra.
Una vez que las células se han lisado de manera adecuada, la muestra se mueve a través del canal 538, el blíster 544 y el canal 543, hasta el blíster 546, en el que la muestra se mezcla con una sustancia de unión a ácido nucleico, tal como perlas magnéticas recubiertas de sílice 533. Se deja incubar la mezcla durante un periodo de tiempo apropiado, de manera ilustrativa, de aproximadamente 10 segundos a 10 minutos. Un imán retráctil ubicado dentro del instrumento adyacente al blíster 546 captura las perlas magnéticas 533 a partir de la solución, formando un sedimento contra la superficie interior del blíster 546. A continuación, el líquido se mueve hacia fuera del blíster 546 y de nuevo a través del blíster 544 y al interior del blíster 522, que ahora se utiliza como receptáculo de residuo. Se proporcionan uno o varios tampones de lavado a partir de uno o varios canales de inyección 515c a 515e a través del blíster 544 y del canal 543 al blíster 546. Opcionalmente, el imán se retrae y las perlas magnéticas 533 se lavan moviendo las perlas hacia atrás y hacia delante desde los blísteres 544 y 546 a través del canal 543. Una vez lavadas las perlas magnéticas 533, las perlas magnéticas 533 se vuelven a capturar en el blíster 546 mediante la activación del imán y, a continuación, la solución de lavado se mueve al blíster 522. Este proceso se puede repetir, según sea necesario, para lavar el tampón de lisis y el residuo de la muestra de las perlas magnéticas de unión a ácido nucleico 533, de manera ilustrativa, que incluye 3 o más lavados, aunque un lavado puede ser suficiente para algunas realizaciones dadas a conocer en el presente documento y cualquier número de lavados se encuentra dentro del alcance de la presente invención.
Después del lavado, el tampón de elución almacenado en el canal de inyección 515f se mueve al blíster 548 y se retrae el imán. La solución se somete a ciclado entre los blísteres 546 y 548 a través del canal 552, descomponiendo el sedimento de perlas magnéticas 533 en el blíster 546 y permitiendo que los ácidos nucleicos capturados se disocien de las perlas y se disuelvan. El imán se activa de nuevo, capturando las perlas magnéticas 533 en el blíster 546, y la solución de ácido nucleico eluida se mueve al interior del blíster 548.
La mezcla madre de PCR de primera etapa a partir del canal de inyección 515g se mezcla con la muestra de ácido nucleico en el blíster 548. Opcionalmente, la mezcla se mezcla forzando que la mezcla pase entre los blísteres 548 y 564 a través del canal 553. Después de varios ciclos de mezcla, la solución está contenida en el blíster 564, en el que se proporciona un sedimento de cebadores de PCR de primera etapa, como mínimo, un conjunto de cebadores para cada diana, y se realiza la PCR múltiple de primera etapa. Si están presentes dianas de ArN, se puede realizar una etapa de rT antes de la PCR múltiple de primera etapa o simultáneamente con la misma. El ciclo de temperatura de la PCR múltiple de primera etapa en el instrumento FilmArray@ se realiza, de manera ilustrativa, durante 15-20 ciclos, aunque pueden ser deseables otros niveles de amplificación, dependiendo de los requisitos de la aplicación específica. La mezcla madre de PCR de primera etapa puede ser cualquier de diversas mezclas madre, tal como se conocen en la materia. En un ejemplo ilustrativo, la mezcla madre de PCR de primera etapa puede ser cualquiera de las químicas dadas a conocer en la Patente US 2015/0118715, para su utilización con protocolos de PCR que tardan 20 segundos o menos por ciclo.
Después de que la PCR de primera etapa haya avanzado durante el número de ciclos deseado, la muestra se puede diluir, de manera ilustrativa, forzando la mayor parte de la muestra de nuevo al interior del blíster 548, dejando sólo una pequeña cantidad en el blíster 564, y añadiendo mezcla madre de PCR de segunda etapa a partir del canal de inyección 515i. De forma alternativa, un tampón de dilución a partir de 515i se puede mover al blíster 566 y, a continuación, mezclar con la muestra amplificada en el blíster 564 moviendo los fluidos hacia atrás y hacia delante entre los blísteres 564 y 566. Si se desea, la dilución se puede repetir varias veces, utilizando tampón de dilución a partir de los canales de inyección 515j y 515k, o el canal de inyección 515k se puede reservar para la secuenciación o para otro análisis tras la PCR y, a continuación, añadir la mezcla madre de PCR de segunda etapa a partir del canal de inyección 515h a una parte o a la totalidad de la muestra amplificada diluida. Se entiende que el nivel de dilución se puede ajustar alterando el número de etapas de dilución o alterando el porcentaje de la muestra descartada antes de la mezcla con el tampón de dilución o la mezcla madre de PCR de segunda etapa que comprende componentes para la amplificación, de manera ilustrativa, una polimerasa, dNTP y un tampón adecuado, aunque pueden ser adecuados otros componentes, particularmente para procedimientos de amplificación distintos de PCR. Si se desea, esta mezcla de la muestra y la mezcla madre de PCR de segunda etapa se puede calentar previamente en el blíster 564 antes del movimiento a los pocillos de segunda etapa 582 para la amplificación de segunda etapa. Tal calentamiento previo puede eliminar la necesidad de un componente de inicio en caliente (anticuerpo, producto químico o de otro tipo) en la mezcla de PCR de segunda etapa.
La mezcla madre de PCR de segunda etapa ilustrativa es incompleta, al carecer de pares de cebadores, y cada uno de los 102 pocillos de segunda etapa 582 se carga previamente con un par de cebadores de PCR específicos. Si se desea, la mezcla madre de PCR de segunda etapa puede carecer de otros componentes de reacción, y estos componentes también se pueden cargar previamente en los pocillos de segunda etapa 582. Cada par de cebadores puede ser similar o idéntico a un par de cebadores de PCR de primera etapa o puede estar anidado dentro del par de cebadores de primera etapa. El movimiento de la muestra desde el blíster 564 hasta los pocillos de segunda etapa 582 completa la mezcla de reacción de PCR. Una vez llenada la matriz de alta densidad 581, las reacciones de segunda etapa individuales se sellan en sus blísteres de segunda etapa respectivos mediante cualquiera de varios medios, tal como se conoce en la materia. Modos ilustrativos de llenado y sellado de la matriz de alta densidad 581 sin contaminación cruzada se comentan en la Patente US 8,895,295. De manera ilustrativa, las diversas reacciones en los pocillos 582 de la matriz de alta densidad 581 se someten a ciclado térmico simultáneamente, de manera ilustrativa, con uno o varios dispositivos Peltier, aunque en la materia se conocen otros medios para el ciclado térmico.
En determinadas realizaciones, la mezcla madre de PCR de segunda etapa contiene el colorante de unión a ADNbc LCGreen® Plus (BioFire Diagnostics, LLC) para generar una señal indicativa de la amplificación. Sin embargo, se entiende que este colorante es sólo ilustrativo, y que se pueden utilizar otras señales, que incluyen otros colorantes de unión a ADNbc y sondas que se marcan de forma fluorescente, radiactiva, quimioluminescente, enzimática o similar, tal como se conocen en la materia. De forma alternativa, los pocillos 582 de la matriz 581 se pueden proporcionar sin una señal, notificándose los resultados mediante procesamiento posterior.
Cuando se utiliza presión neumática para mover los materiales dentro del estuche 510, en una realización, se puede emplear una “bolsa”. El conjunto de bolsa 810, una porción del cual se muestra en las figuras 2-3, incluye una placa de bolsa 824 que aloja una pluralidad de bolsas inflables 822, 844, 846, 848, 864 y 866, cada una de las cuales puede ser inflable individualmente, de manera ilustrativa, mediante una fuente de gas comprimido. Debido a que el conjunto de bolsa 810 se puede someter a gas comprimido y utilizar múltiples veces, el conjunto de bolsa 810 se puede realizar a partir de un material más resistente o más grueso que el estuche. De forma alternativa, las bolsas 822, 844, 846, 848, 864 y 866 pueden estar formadas por una serie de placas sujetas entre sí con juntas de estanqueidad, sellos, válvulas y pistones. Otras disposiciones se encuentran dentro del alcance de la presente invención.
El éxito de las reacciones de PCR secundarias depende del molde generado por la reacción múltiple de primera etapa. Normalmente, la PCR se realiza utilizando AdN de alta pureza. Procedimientos tales como extracción con fenol o kits comerciales de extracción de ADN proporcionan ADN de alta pureza. Las muestras procesadas a través del estuche 510 pueden requerir realizar adaptaciones para compensar una preparación menos pura. La PCR se puede inhibir por los componentes de muestras biológicas, lo cual es un posible obstáculo. De manera ilustrativa, se puede utilizar, opcionalmente, PCR de inicio en caliente, una mayor concentración de la enzima polimerasa taq, ajustes en la concentración de MgCl2, ajustes en la concentración de cebadores y adición de adyuvantes (tales como DMSO, TMSO o glicerol) para compensar una pureza de ácido nucleico más baja. Aunque es probable que los problemas de pureza sean más preocupantes con una amplificación de primera etapa, se entiende que también se pueden proporcionar ajustes similares en la amplificación de segunda etapa.
Cuando el estuche 510 se coloca dentro del instrumento 800, el conjunto de bolsa 810 se presiona contra una cara del estuche 510, de modo que, si se infla una bolsa particular, la presión forzará el líquido fuera del blíster correspondiente en el estuche 510. Además de las bolsas correspondientes a muchos de los blísteres del estuche 510, el conjunto de bolsa 810 puede tener accionadores neumáticos adicionales, tales como bolsas o pistones accionados de forma neumática, correspondientes a diversos canales del estuche 510. Las figuras 2-3 muestran una pluralidad ilustrativa de pistones o sellos duros 838, 843, 852, 853 y 865 que corresponden a los canales 538, 543, 553 y 565 del estuche 510, así como sellos 871, 872, 873, 874 que minimizan el flujo de retorno hacia el montaje 590. Cuando se activan, los sellos duros 838, 843, 852, 853 y 865 forman válvulas de pinza para pinzar y cerrar los canales correspondientes. Para confinar el líquido dentro de un blíster particular del estuche 510, los sellos duros se activan sobre los canales que conducen hasta el blíster y desde el mismo, de manera que los accionadores funcionan como válvulas de pinza para cerrar los canales mediante pinzado. De manera ilustrativa, para mezclar dos volúmenes de líquido en diferentes blísteres, se activa el accionador de válvula de pinza que sella el canal de conexión y se presurizan de manera alterna las bolsas neumáticas sobre los blísteres, forzando el líquido hacia atrás y hacia delante a través del canal que conecta los blísteres para mezclar el líquido en los mismos. Los accionadores de válvula de pinza pueden ser de diversas formas y tamaños y pueden estar configurados para pinzar más de un canal a la vez. Aunque en el presente documento se comentan accionadores neumáticos, se entiende que se contemplan otros modos de proporcionar presión al estuche, que incluyen diversos accionadores electromecánicos, tales como motores paso a paso lineales, levas accionadas por motor, palas rígidas accionadas por fuerzas neumáticas, hidráulicas o electromagnéticas, rodillos, balancines y, en algunos casos, muelles amartillados. Además, existen una variedad de procedimientos para cerrar de forma reversible o irreversible los canales además de aplicar presión normal al eje del canal. Estos incluyen retorcer la bolsa a través del canal, termosellar, hacer girar un accionador y una variedad de válvulas físicas selladas en el canal, tales como válvulas de mariposa y válvulas de bola. Adicionalmente, se pueden colocar pequeños dispositivos Peltier u otros reguladores de la temperatura adyacentes a los canales y ajustar a una temperatura suficiente para congelar el fluido, formando eficazmente un sello. Además, aunque el diseño de la figura 1 está adaptado para un instrumento automatizado que presenta elementos de accionador posicionados sobre cada uno de los blísteres y canales, también se contempla que los accionadores pueden permanecer estacionarios y el estuche 510 se puede desplazar en una o dos dimensiones, de manera que se puede utilizar un pequeño número de accionadores para varias de las estaciones de procesamiento, que incluyen la alteración de la muestra, la captura del ácido nucleico, la PCR de primera y segunda etapa y otras aplicaciones del estuche 510, tales como inmunoensayo e inmuno-PCR. Los rodillos que actúan sobre los canales y blísteres pueden resultar ser particularmente útiles en una configuración en la que el estuche 510 se traslada entre estaciones. Por tanto, aunque en las realizaciones dadas a conocer en la presente invención se utilizan accionadores neumáticos, cuando se utiliza la expresión “accionador neumático” en el presente documento se entiende que se pueden utilizar otros accionadores y otros modos de proporcionar presión, dependiendo de la configuración del estuche y del instrumento.
Otros instrumentos de la técnica anterior dan a conocer la PCR dentro de un recipiente flexible sellado. Véanse, por ejemplo, la Patente US 6,645,758 y la Patente US 6,780,617 y la Patente US 2014/0038272. Sin embargo, incluir la lisis celular dentro del recipiente de PCR sellado puede mejorar la facilidad de utilización y la seguridad, particularmente si la muestra que se va a someter a un ensayo puede contener un resigo biológico. En las realizaciones ilustradas en el presente documento, el residuo de la lisis celular, así como el de todas las demás etapas, permanece dentro del estuche sellado. Sin embargo, se entiende que el contenido del estuche se puede retirar para realizar más ensayos.
La figura 2 muestra un instrumento ilustrativo 800 que se puede utilizar con el estuche 510. El instrumento 800 incluye un elemento de soporte 802 que puede formar una pared de una carcasa o montarse dentro de una carcasa. El instrumento 800 también puede incluir un segundo elemento de soporte (no mostrado) que se puede mover opcionalmente con respecto al elemento de soporte 802, para permitir la inserción y la extracción del estuche 510. De manera ilustrativa, una tapa puede cubrir el estuche 510 una vez que se ha insertado el estuche 510 en el instrumento 800. En otra realización, se pueden fijar ambos elementos de soporte, con el estuche 510 mantenido en su sitio mediante otros medios mecánicos o mediante presión neumática.
En el ejemplo ilustrativo, hay calentadores 886 y 888 montados en el elemento de soporte 802. Sin embargo, se entiende que esta disposición es sólo ilustrativa y que son posibles otras disposiciones. La placa de bolsa 810, con las bolsas 822, 844, 846, 848, 864, 866, los sellos duros 838, 843, 852, 853, los sellos 871, 872, 873, 874, forman el conjunto de bolsa 808, que se puede montar de manera ilustrativa en una estructura de soporte móvil que se puede mover hacia el estuche 510, de tal manera que los accionadores neumáticos se colocan en contacto con el estuche 510. Cuando el estuche 510 se inserta en el instrumento 800 y el elemento de soporte móvil se mueve hacia el elemento de soporte 802, los diversos blísteres del estuche 510 están en una posición adyacente a las diversas bolsas del conjunto de bolsa 810 y los diversos sellos del conjunto 808, de tal manera que la activación de los accionadores neumáticos puede forzar líquido desde uno o varios de los blísteres del estuche 510 o pueden formar válvulas de pinza con uno o varios canales del estuche 510. La relación entre los blísteres y los canales del estuche 510 y las bolsas y los sellos del conjunto 808 se ilustra con más detalle en la figura 3.
Cada accionador neumático está conectado a la fuente de aire comprimido 895 a través de las válvulas 899. Aunque en la figura 2 sólo se muestran varios manguitos 878, se entiende que cada accesorio neumático está conectado a través de un manguito 878 a la fuente de gas comprimido 895. La fuente de gas comprimido 895 puede ser un compresor o, de forma alternativa, la fuente de gas comprimido 895 puede ser una botella de gas comprimido, tal como una botella de dióxido de carbono. Las botellas de gas comprimido son particularmente útiles si se desea portabilidad. Otras fuentes de gas comprimido están dentro del alcance de la presente invención.
El conjunto 808 está montado de manera ilustrativa en un elemento de soporte móvil, aunque se entiende que son posibles otras configuraciones.
Varios otros componentes del instrumento 810 también están conectados a la fuente de gas comprimido 895. Un imán 850, que está montado en un segundo lado 814 del elemento de soporte 802, se despliega y se retrae de manera ilustrativa utilizando gas a partir de la fuente de gas comprimido 895 a través del manguito 878, aunque en la técnica se conocen otros procedimientos para mover el imán 850. El imán 850 descansa en un rebaje 851 en el elemento de soporte 802. Se entiende que el rebaje 851 puede ser un conducto a través del elemento de soporte 802, de modo que el imán 850 puede entrar en contacto con el blíster 546 del estuche 510. Sin embargo, dependiendo del material del elemento de soporte 802, se entiende que no es necesario que el rebaje 851 se extienda totalmente a través del elemento de soporte 802, siempre que, cuando el imán 850 se despliegue, el imán 850 esté lo suficientemente cerca como para proporcionar un campo magnético suficiente en el blíster 546, y, cuando el imán 850 se retrae, el imán 850 no afecte significativamente a ninguna perla magnética 533 presente en el blíster 546. Aunque se hace referencia a retraer el imán 850, se entiende que se puede utilizar un electroimán y el electroimán se puede activar y desactivar controlando el flujo de electricidad a través del electroimán. Por tanto, aunque la presente memoria descriptiva comenta retirar o retraer el imán, se entiende que estos términos son lo suficientemente amplios como para incorporar otras maneras de retirar el campo magnético. Se entiende que las conexiones neumáticas pueden ser manguitos neumáticos o colectores de aire neumáticos, reduciendo por tanto el número de manguitos o válvulas requeridos.
Los diversos pistones neumáticos 868 de la matriz de pistones neumáticos 869 también están conectados a la fuente de gas comprimido 895 a través de los manguitos 878. Aunque sólo se muestran dos manguitos 878 que conectan los pistones neumáticos 868 a la fuente de gas comprimido 895, se entiende que cada uno de los pistones neumáticos 868 está conectado a la fuente de gas comprimido 895. Se muestran doce pistones neumáticos 868. Un par de dispositivos de calentamiento/enfriamiento, de manera ilustrativa calentadores Peltier, están montados en un segundo lado 814 del soporte 802. El calentador de primera etapa 886 está posicionado para calentar y enfriar el contenido del blíster 564 para la PCR de primera etapa. El calentador de segunda etapa 888 está posicionado para calentar y enfriar el contenido de los blísteres de segunda etapa 582 del estuche 510, para la PCR de segunda etapa. Sin embargo, se entiende que estos calentadores también se pueden utilizar para otros fines de calentamiento, y que se pueden incluir otros calentadores, según sea apropiado para la aplicación particular.
Cuando se desea una detección fluorescente, se puede proporcionar una matriz óptica 890. Tal como se muestra en la figura 2, la matriz óptica 890 incluye una fuente de luz 898, de manera ilustrativa una fuente de luz de LED filtrada, luz blanca filtrada o iluminación de láser, y una cámara 896. La cámara 896 tiene, de manera ilustrativa, una pluralidad de fotodetectores que corresponden, cada uno, a un pocillo de segunda etapa 582 en el estuche 510. De manera alternativa, la cámara 896 puede captar imágenes que contienen la totalidad de los pocillos de segunda etapa 582, y la imagen se puede dividir en campos separados correspondientes a cada uno de los pocillos de segunda etapa 582. Dependiendo de la configuración, la matriz óptica 890 puede ser estacionaria, o la matriz óptica 890 puede estar colocada en elementos móviles unidos a uno o varios motores y moverse para obtener señales a partir de cada pocillo de segunda etapa individual 582. Se entiende que son posibles otras disposiciones. Tal como se muestra, un ordenador 894 controla las válvulas 899 de la fuente de aire comprimido 895 y, por tanto, controla todos los componentes neumáticos del instrumento 800. El ordenador 894 también controla los calentadores 886 y 888, y la matriz óptica 890. Cada uno de estos componentes está conectado eléctricamente, de manera ilustrativa mediante los cables 891, aunque otras conexiones físicas o inalámbricas están dentro del alcance de la presente invención. Se entiende que el ordenador 894 puede estar alojado dentro del instrumento 800 o puede ser externo al instrumento 800. Además, el ordenador 894 puede incluir placas de circuitos incorporadas que controlan algunos o la totalidad de los componentes, y también puede incluir un ordenador externo, tal como un PC de sobremesa o portátil, para recibir y visualizar datos a partir de la matriz óptica. Se puede proporcionar una interfaz, de manera ilustrativa una interfaz de teclado, que incluye teclas para introducir información y variables, tales como temperaturas, tiempos de ciclo, etc. De manera ilustrativa, también se proporciona un elemento de visualización 892. El elemento de visualización 892 puede ser un elemento de visualización de LED, LCD u otro de este tipo, por ejemplo.
EJEMPLOS EJEMPLO 1: PCR DE ALTA DENSIDAD
En un ejemplo, se sabe que ensayos de inmunofluorescencia comerciales habituales para los virus respiratorios comunes pueden detectar siete virus: adenovirus, PIV1, PIV2, PIV3, RSV, influenza A e influenza B. Un panel más completo incluirá, de manera ilustrativa, ensayos para detectar otros virus, que incluyen: coronavirus, metaneumovirus humano, rinovirus y enterovirus distinto de RVH. Para virus altamente variables tales como adenovirus o RVH, es deseable utilizar múltiples cebadores para seleccionar como diana todas las ramificaciones del linaje del virus (de manera ilustrativa, 4 conjuntos de cebadores externos y 4 internos, respectivamente). Para otros virus, tales como coronavirus, hay 4 linajes diferenciados (229E, NL63, OC43, HKU1) que no varían de una temporada a otra, pero han divergido lo suficiente como para que se requieran conjuntos de cebadores independientes. El panel respiratorio de FilmArray@ (BioFire Diagnostics, LLC de Salt Lake City, UT) incluye adenovirus, coronavirus HKU1, coronavirus NL63, coronavirus 229E, coronavirus OC43, metaneumovirus humano, rinovirus/enterovirus humano, influenza A, influenza A/H1, influenza A/H3, influenza A/H1-2009, influenza B, virus parainfluenza 1, virus parainfluenza 2, virus parainfluenza 3, virus parainfluenza 4 y virus sincitial respiratorio. Además de estos virus, el panel respiratorio de FilmArray@ incluye tres bacterias: Bordetella pertussis, Chlamydophila pneumonía y Mycoplasma pneumonía. La matriz de alta densidad 581 puede albergar un panel de este tipo en un único estuche 510. Hay otros paneles disponibles para FilmArray@, cada uno de los cuales realiza ensayos para detectar, como mínimo, 20 patógenos.
EJEMPLO 2: CARGA DEL ESTUCHE
La figura 5 muestra una estación de carga 600. Tal como se muestra, el estuche 510 de la figura 1 se ha cargado en la ranura 610 de la estación de carga 600, de tal manera que sólo es visible el montaje 590 del estuche 510. Tal como se muestra, la estación de carga 600 está dotada de un receptáculo de vial de muestra 602 para contener el vial de muestra 650 y un receptáculo de vial de hidratación 604 para contener el vial de hidratación 670. Sin embargo, se entiende que los receptáculos y los viales son para ayudar al flujo de trabajo y son sólo ilustrativos. Otras configuraciones y su utilización con otros estuches y otros dispositivos están dentro del alcance de la presente invención.
Se transfiere con pipeta una muestra o se carga de otro modo en el vial de muestra 650. Tal como se comenta con más detalle a continuación, dependiendo del flujo de trabajo, el vial de muestra 650 puede contener ya un tampón u otro fluido 652 para recibir la muestra biológica, o el operario puede añadir la muestra biológica en un tampón apropiado al vial de muestra 650. Opcionalmente, el tampón se puede proporcionar en una ampolla independiente, con una cantidad apropiada de tampón asignada. De manera similar, el vial de hidratación 670 se puede cargar previamente con agua, tampón u otro fluido 672, o el operario puede cargar el vial de hidratación 670 con tal fluido. El montaje ilustrativo 590 incluye un puerto de inyección 541 formado, de manera ilustrativa, cerca de la segunda superficie 595 del montaje 590. Tal como se muestra, el puerto de inyección 541 está ubicado en la abertura de inyección de muestra 563, que está configurada para recibir un recipiente de transferencia canulado a través de la primera superficie 594 del montaje 590, tal como una jeringa canulada. En esta configuración ilustrativa, el puerto de inyección 541 está protegido frente a perforación accidental y no se abre hasta que se coloca un recipiente de transferencia canulado en la abertura de inyección de muestra 563. De manera similar, el montaje ilustrativo 590 incluye un segundo puerto de inyección 588 formado, de manera ilustrativa, cerca de la segunda superficie 595 del montaje 590, y está ubicado en la abertura de inyección de fluido de hidratación 583, que está configurada de manera similar a la abertura de inyección de muestra 563. Tal como se configura en esta realización ilustrativa, el puerto de inyección 541 es para recibir la muestra que se va a someter a prueba, muestra que se moverá a la cámara 592a o directamente al interior del blíster de lisis 522 (figura 1), y el segundo puerto de inyección 588 está configurado para recibir el fluido de hidratación 672 (presentado en la figura 7), tal como agua o tampón, fluido de hidratación 672 que se moverá a las cámaras 592b a 592l, para su movimiento posterior a través de los canales de entrada 515b a 515l. Se entiende que la disposición de los puertos de inyección 541 y 588 y las aberturas 563 y 583 es ilustrativa y que otras configuraciones están dentro del alcance de la presente invención.
El vial de muestra ilustrativo 650, tal como se muestra mejor en la figura 6, está compuesto por una superficie superior 662, un cuerpo de vial 654 y una cánula 655, en una disposición similar a muchas jeringas canuladas. En esta realización ilustrativa, en vez del émbolo que se encuentra en muchas jeringas canuladas, el vial de muestra 650 está dotado de un tapón 658 para extenderse a través de la superficie superior 662 para sellar el cuerpo 654. De manera ilustrativa, el operario verterá, transferirá con pipeta, insertará hisopo, transferirá con cuchara material sólido o semisólido o transferirá de otro modo un fluido y/u otros materiales a través de la abertura 657 en la superficie superior 662 y al interior del cuerpo de vial 654.
Dependiendo del tipo de muestra que se va a someter a prueba, el vial de muestra 650 puede estar dotado de un filtro 646 ubicado, de manera ilustrativa, en la superficie inferior hexagonal 666 del cuerpo de vial 654 o cerca de la misma. Tal como se muestra, el filtro 646 se mantiene en su sitio mediante una junta tórica 644. Sin embargo, se entiende que el filtro 646 se puede mantener en su sitio mediante adhesivo, soldadura, ajustándose a presión en su sitio o mediante otros medios, tal como se conocen en la materia. Cuando la cánula 655 se inserta en la abertura de inyección de muestra 563 y la muestra se hace pasar al interior del estuche 510, el material de muestra se filtra a medida que se hace pasar a través del filtro 646 y al interior de la cánula 655. Aunque la selección de material de filtro depende del tipo de muestra y el tamaño de partícula, los filtros adecuados para diversas muestras biológicas incluyen medio soplado por fusión de polipropileno Absolute Ultipleat de 100 pm de Pall y filtro de malla de polipropileno de 80 pm de Millipore. La mayor parte de los filtros de jeringa están diseñados para excluir organismos de un determinado tamaño, eliminando de este modo esos organismos del filtrado. A diferencia de tales filtros preexistentes, estos filtros ilustrativos se eligieron basándose en su capacidad para excluir materiales particulados más grandes que se encuentran en heces, tierra, polvo, etc., al tiempo que se permite que organismos diana (por ejemplo, organismos bacterianos, virales, protozoarios y fúngicos), de aproximadamente 60 pm o menos de diámetro, pasen a través del filtro. Además, el material de filtro ilustrativo es inerte (es decir, no se une a organismos o ácidos nucleicos) y es relativamente resistente a obstrucciones. Se entiende que estos filtros ilustrativos se eligieron para muestras que incluyen protozoos como organismos diana (hasta aproximadamente 60 pm). Dado que algunas configuraciones de estuche pueden someter a prueba para detectar únicamente dianas más pequeñas, se pueden desear filtros con un tamaño de poro más pequeño, tales como filtros con tamaños de poro de 1-10 pm para bacterias y hongos, y tamaños de poro de menos de 1 pm si sólo se tienen que detectar partículas virales. Evidentemente, el filtro con tamaño de poro más grande todavía se puede utilizar para filtrar dianas más pequeñas. Tales filtros pueden ser particularmente útiles para tipos de muestra que tienen una gran cantidad de material particulado, tales como tierra, heces y polvo, que pueden obstruir el sistema de fluido. Además, se entiende que el tamaño de poro se elige basándose en los materiales que se van a filtrar, y que otros tamaños de poro están dentro del alcance de la presente invención.
Se entiende que uno o varios componentes útiles para la preparación de muestra se pueden proporcionar secos en el cuerpo de vial 654. Tales aditivos pueden incluir agentes de tamponamiento, estabilizantes, proteasas, ADNasas, inhibidores de ADNasa, ARNasas, inhibidores de ARNasa, lisozimas, agentes reductores y similares. De forma alternativa, tales componentes se pueden incluir en el tampón de muestra o se pueden añadir posteriormente, después de que la muestra haya salido del vial 650 para su procesamiento adicional. Se entiende que la selección de tales aditivos depende del tipo de muestra y del procesamiento adicional deseado. Los aditivos que ayudan a reducir la viscosidad o ayudan en la solubilidad, para permitir que la muestra pase a través del filtro 646, son particularmente útiles.
Tal como se muestra, el tapón inferior 664 está dotado de una porción hexagonal 666, que está configurada para ajustarse en el receptáculo de vial de muestra de forma hexagonal 602. Aunque la porción hexagonal 666 y el receptáculo de vial de muestra son hexagonales en la realización ilustrativa, se entiende que se pueden utilizar otras formas y que las formas hexagonales u otras formas de enclavamiento o coincidencia se pueden proporcionar para ayudar al operario a retirar el tapón inferior 664. De forma alternativa, el operario puede retirar el tapón inferior 664 mediante otros medios, tales como utilizando las dos manos para girar el tapón inferior 664 a partir del cuerpo de vial 654. El tapón inferior 654 se puede ajustar a presión, enroscar o fijar de otro modo al cuerpo de vial 654.
En la realización ilustrativa, el tapón inferior 664 está dotado de un asiento 648, mediante lo cual un extremo inferior 659 de la cánula 655 se extiende al interior del asiento 648. De manera ilustrativa, el extremo inferior 659 de la cánula 655 se ajusta de manera apretada en el asiento 648, de tal manera que el asiento 648 proporciona un sello hermético alrededor del extremo inferior abierto 659 de la cánula 655. Opcionalmente, se proporcionan orificios de ventilación 649 entre el tapón inferior 664 y el cuerpo de vial 654.
Pasando ahora a la figura 7, el vial de hidratación 670 puede estar configurado de manera similar al vial de muestra 650. Sin embargo, puede ser deseable cargar previamente el vial de hidratación 670 con fluido de hidratación 672 y sellar previamente el fluido de hidratación 672 en el vial de hidratación 670, tal como se muestra en la figura 7. El vial de hidratación ilustrativo 670, tal como se muestra en la figura 7, está compuesto por una superficie superior 682, un cuerpo de vial 674 y una cánula 675, en una disposición similar a la del vial de muestra 650. Sin embargo, la lengüeta 680 del tapón 678 del vial de hidratación ilustrativo 670 ya está ajustada a presión en la abertura 677 de la superficie superior 682, y el tapón 678 se puede sellar a la superficie superior 682, impidiendo de este modo la apertura del vial de hidratación 670. Esta disposición es sólo ilustrativa, y se entiende que otras maneras de sellar el fluido de hidratación 672 dentro del vial de hidratación 670 se prevén en el presente documento. De manera ilustrativa, el cuerpo de vial 674 y la cánula 675 se pueden proporcionar llenos completamente o llenos de manera esencialmente completa de fluido, de modo que la manipulación o rotación del vial de hidratación 670 no permitirá que entre aire en la cánula 675. De forma alternativa, algo de aire 685 u otro gas puede estar presente dentro del cuerpo de vial 674, y el operario puede mantener el cuerpo de hidratación en una posición erguida para impedir que entre aire en la cánula 675. En otra realización alternativa, el aire 685 se puede proporcionar a presión y la retirada del tapón inferior 684 tendrá como resultado que se fuerce fluido de hidratación a través de la cánula 675. Tal como se muestra, el vial de hidratación 670 no está dotado de un filtro, aunque se puede proporcionar uno, si se desea.
El tapón inferior 684 se puede proporcionar para retener cualquier fluido que pueda gotear desde la cánula 675, así como impedir la contaminación de fluido de hidratación 672 en la cánula 675. Se puede proporcionar un elemento de limpieza 683 en el tapón inferior 684 para limpiar el exceso de fluido a partir de la parte inferior de la cánula 675. La forma cónica del elemento de limpieza 683 también puede ayudar a retener goteos en el tapón inferior 684 durante la manipulación y eliminación posteriores. En la realización ilustrativa, el tapón inferior 684 está dotado de una porción hexagonal 686 para coincidir con el receptáculo de vial de hidratación de forma hexagonal 604, aunque son posibles otras formas, tal como se comentó anteriormente, con respecto al vial de muestra 650. La porción hexagonal 686 del vial de hidratación 670 y el receptáculo de vial de hidratación de forma hexagonal 604 pueden tener dimensiones diferentes y/o formas diferentes de la porción hexagonal 666 del vial de muestra 650 y el receptáculo de vial de muestra de forma hexagonal 602, de tal manera que sólo el vial de muestra 650 se ajustará fácilmente en el receptáculo de vial de muestra 602 y sólo el vial de hidratación 670 se ajustará fácilmente en el receptáculo de vial de hidratación 604, para reducir la probabilidad de que el operario confunda el vial de muestra 650 y el vial de hidratación 670, de modo que se inyectan los fluidos apropiados a través de los puertos 541 y 588. Además, el vial de muestra 650 y la abertura de inyección 563 se pueden proporcionar parcial o totalmente con un color específico coincidente, rojo de manera ilustrativa, mientras que el vial de hidratación 670 y la abertura de inyección 583 se pueden proporcionar parcial o totalmente con un color específico coincidente diferente, azul de manera ilustrativa, para proporcionar al operario ayuda visual para proporcionar los fluidos apropiados en los puertos 541 y 588. Para minimizar adicionalmente el riesgo de insertar el líquido equivocado en la abertura de inyección equivocada, el diámetro de la cánula 655 puede diferir del diámetro de la cánula 675, y los diámetros de la abertura de inyección de muestra 563 y la abertura de inyección de fluido de hidratación 583 pueden diferir de manera similar. Otras configuraciones están dentro del alcance de la presente invención.
Volviendo a la figura 5, de manera ilustrativa, para cargar el estuche 510, el operario colocará el vial de muestra 650 en el receptáculo de vial de muestra 602 y el vial de hidratación 670 en el receptáculo de vial de hidratación 604 en la estación de carga 600. El estuche 510 también se colocará en la ranura 610. La muestra se colocará en el tampón de muestra 652 de cualquier manera adecuada para el tipo de muestra, incluyendo insertar un hisopo 630, transferir con pipeta una muestra de fluido, añadir mediante goteo sangre de un paciente directamente en el cuerpo de vial y colocar una muestra sólida o semisólida, tal como heces, en el cuerpo de vial, con agitación con vórtex opcional u otra mezcla, tal como resulta habitual en la materia. Dependiendo del tipo de muestra y los ácidos nucleicos diana deseados, el tampón de muestra puede contener uno o varios aditivos o estabilizantes, de manera ilustrativa para tratar una muestra biológica o medioambiental, tal como proteasas, ADNasas, inhibidores de ADNasa, ARNasas, inhibidores de ARNasa, lisozimas y similares. De forma adicional o alternativa, estos aditivos se pueden proporcionar en el estuche 510. Preferentemente, antes de agitar con vórtex o mezclar, el operario cerrará el vial de muestra 650 colocando la lengüeta 660 del tapón 658 a través de la abertura 657. La inserción de la lengüeta 660 presuriza el aire contenido dentro del cuerpo de vial 654. De manera ilustrativa, la lengüeta 660 tiene un volumen igual a o mayor que el volumen de la cánula 655. De manera ilustrativa, cuando se retira el tapón inferior 664, se rompe el sello hermético entre el asiento 648 y el extremo inferior 659 de la cánula 655, y se fuerza sustancialmente todo el aire fuera de la cánula 655. Si el volumen de la lengüeta 660 es mayor que el volumen de la cánula 655, esto ayudará a garantizar que la cantidad máxima de aire se desplaza desde la cánula 655. Cualquier exceso de la cantidad de fluido que se fuerza al interior y posiblemente a través de la cánula 655 se puede capturar en el tapón inferior 664 y retirar a partir de la parte inferior de la cánula 655 mediante el elemento de limpieza 663. Llenando completamente o de manera esencialmente completa la cánula 655, se minimiza la cantidad de burbujas en el estuche 510 tras cargar el estuche. Uno o varios orificios de ventilación 649 pueden ayudar en la separación del tapón inferior 664 a partir del vial de hidratación 650.
Dado que el tapón inferior 664 está dotado de una porción hexagonal 666, que está configurada para ajustarse en el receptáculo de vial de muestra de forma hexagonal 602, el operario puede girar fácilmente el tapón inferior 654 mientras el tapón inferior está enganchado en el receptáculo 602, exponiendo de este modo la cánula 655. A continuación, la cánula 655 se inserta en la abertura de inyección de muestra 563 y se empuja, abriendo el puerto de inyección 541. Un vacío dentro del estuche 590 (o presión reducida dentro del estuche con respecto a la presión atmosférica o presión fuera del estuche) fuerza de manera ilustrativa la muestra a través del filtro (si está presente), con o sin presión a partir del cuerpo de vial, que se puede utilizar para hacer pasar la muestra al interior del estuche 510, de manera ilustrativa al interior de la cámara 592a en el montaje 590, para su movimiento posterior al interior de la cámara de lisis 522. Garantizando que la cánula 655 se llena sustancialmente con fluido 652, se minimiza la cantidad de aire u otro gas que se mueve desde el vial de muestra 650 al interior del estuche 510, minimizando de este modo el tamaño y la cantidad de burbujas. Además, cuando se utiliza una jeringa de la técnica anterior con un émbolo y el vacío dentro del estuche 590 hace pasar fluido, se hace pasar el émbolo hacia abajo por la jeringa, equilibrando de este modo la presión dentro de la jeringa. En la realización de las figuras 5-6, dado que la abertura en la parte superior de cada uno de los cuerpos de vial está sellada, cuando el vacío a partir del interior del estuche 590 hace pasar fluido a partir del vial, el vial también experimentará presión negativa y puede desgasificar la muestra y hacer pasar algunas burbujas de aire restantes fuera del estuche 590. A continuación, la cánula 655 se extrae de la abertura de inyección de muestra 563 y el vial de muestra 650 y el tapón inferior 664 se eliminan según protocolos. Dado que el cuerpo de vial 654 está a presión negativa, a medida que se extrae la cánula 655, se pueden hacer pasar burbujas de aire que se pueden haber acumulado cerca del puerto de inyección 541 fuera del estuche 510, reduciendo adicionalmente las burbujas de aire en el estuche.
De manera similar, el operario gira el tapón inferior 684 a partir el vial de hidratación 670, exponiendo de este modo la cánula 675. Si el contenido del vial de hidratación 670 se proporciona a presión, una pequeña cantidad de fluido de hidratación puede escapar al interior del tapón inferior 684 cuando se separa la cánula 675 a partir del asiento 692. Uno o varios orificios de ventilación 693 pueden ayudar en la separación del tapón inferior 684 a partir del vial de hidratación 670. A continuación, la cánula 675 se inserta en la abertura de inyección de hidratación 583 y se empuja, abriendo el puerto de inyección 588. El vacío a partir del interior del montaje 590 se puede utilizar para hacer pasar el fluido de hidratación al interior del estuche 510, de manera ilustrativa al interior de las cámaras 592b 592l, para su movimiento posterior al interior de diversos blísteres del estuche 510. La cánula 675 se retira de la abertura de inyección de hidratación 583, el estuche 510 se retira de la estación de carga 600 y se coloca en el instrumento 800, y se inicia la ejecución. Se entiende que la retirada de los viales es sólo ilustrativa. Si la configuración del instrumento y los viales lo permite, los viales se pueden insertar de manera permanente en los puertos de inyección, pasando de este modo a formar parte del sistema cerrado del estuche y minimizando la contaminación a partir de la muestra. En una realización de este tipo, puede no ser necesaria una barra de sellado.
En la realización ilustrativa del vial de muestra 650 comentada anteriormente, la lengüeta 660 tiene un volumen igual a o mayor que el volumen de la cánula 655. En una realización de ejemplo en la que el estuche 510 tiene un volumen de llenado de 1 ml, al cuerpo de vial 654 se le pueden proporcionar 1,5 ml de fluido de muestra 652 y un volumen de 1 ml de aire 645 por encima del fluido de muestra. Por tanto, el aire es el 40 % del volumen del cuerpo de vial 654. Sin embargo, se entiende que se pueden utilizar otros porcentajes de aire, que incluyen el 10 %, 20 %, 30 % 50 %, 60 %, 70 %, 80 % y cantidades entre medias. Cuando la lengüeta 660 se inserta a través de la abertura 657, el aire por encima del fluido de muestra se comprime, de manera ilustrativa en aproximadamente el 50 %, pero las compresiones en los intervalos del 40-60 %, 30-70 %, 20-80 % y 10-90 % son todas posibles. Se entiende que la elección del volumen de aire y el fluido de muestra depende del tamaño de muestra, diámetro de cánula, si se desea la retirada de los viales antes de la ejecución de la reacción de fluidos, y de varios otros factores. Por ejemplo, las muestras transferidas con cuchara o con hisopo pueden necesitar un volumen significativamente más grande de fluido de muestra, independientemente del volumen de llenado del sistema de fluido.
Los cuerpos de vial ilustrativos 654 y 674 son cilíndricos. Sin embargo, dado que estos viales ilustrativos se proporcionan sin émbolos, se entiende que no es necesario que los cuerpos de vial tengan secciones transversales circulares, y que cualquier forma de cuerpo está dentro del alcance de la presente invención.
Las figuras 8-10 muestran una realización alternativa a la estación de carga 600 y los viales 650, 670, indicando números iguales partes similares. La estación de carga 700, tal como se muestra en la figura 8, puede ser similar a la estación de carga 600, con el receptáculo de vial de muestra 702 y el receptáculo de vial de hidratación 704, y la ranura 710 para recibir el estuche 510, similares a los mostrados en la figura 1. Sin embargo, según, como mínimo, una realización, la forma y ubicación de los receptáculos son significativamente diferentes entre la estación de carga 600 y la estación de carga 700. Por ejemplo, como mínimo, en una realización, en comparación con los receptáculos 602, 604 de la estación de carga 600, los receptáculos 702 y 704 están más cerca del estuche 510. Con esta distancia reducida, hay menos oportunidad de que se produzcan goteos al cargar el estuche 510. Además, tal como se observa mejor en las figuras 9-10, el tapón inferior 764 del vial de muestra 750 está dotado de cuatro aletas relativamente cortas 767 que se ajustan dentro de cuatro ranuras coincidentes 703 del receptáculo de vial de muestra 702, y el tapón inferior 784 del vial de hidratación 770 está dotado de dos aletas relativamente más largas 787 que se ajustan dentro de dos ranuras coincidentes 705 del receptáculo de vial de hidratación 704. Estas aletas sustituyen a las porciones hexagonales 666 y 686 de los viales 650 y 670, respectivamente. El mayor número de aletas 767 en el tapón inferior 764 impide que se coloque el vial de muestra 750 en el receptáculo de vial de hidratación 704, y las aletas más largas 787 del tapón inferior 784 impiden que se coloque el vial de hidratación 770 en el receptáculo de vial de muestra 702. Sin embargo, se entiende que la utilización de aletas de tamaños y en números diferentes es sólo ilustrativa, y que diferentes sistemas de acoplamiento están dentro del alcance de la presente invención. Tal como se comentó anteriormente con respecto a la estación de carga 600, los receptáculos 702, 704 de la estación de carga 700 se pueden utilizar para ayudar a girar los tapones inferiores 764, 784 a partir de sus cuerpos de vial respectivos 754, 774, para ayudar con el proceso de carga.
Aunque los viales de muestra 650, 750 y los viales de hidratación 670, 770 se utilizan en el ejemplo ilustrativo para la carga del estuche 510, se entiende que estos viales de carga son adecuados para cargar cualquiera de los estuches dados a conocer en el presente documento. También son adecuados para cargar otro dispositivo de fluidos o microfluidos, especialmente dispositivos de fluidos que están configurados para hacer pasar líquido al interior del dispositivo de fluidos utilizando vacío o succión.
EJEMPLO 3: PREPARACIÓN DE MUESTRAS
En esta realización ilustrativa, se utilizan muestras a partir de infecciones de las vías respiratorias bajas (LRTI, lower respiratory tract infections). Sin embargo, se entiende que los presentes procedimientos pueden ser adecuados para otros tipos de muestra, incluyendo, pero sin limitación a los mismos, tipos de muestras medioambientales y biológicas difíciles de procesar, y son particularmente útiles para cualquier tipo de muestra que se une selectivamente y, a continuación, se libera a partir del material de recogida. Las LRTI son afecciones comunes, pero la identificación del agente etiológico puede ser difícil como resultado de técnicas de diagnóstico con sesgo y características de muestras inhibidoras. El “procedimiento de referencia” actual para la identificación de patógenos es el cultivo bacteriano, que es altamente subjetivo, carece de sensibilidad y es un procedimiento de cribado incompleto, dado que el cultivo sólo puede identificar patógenos cultivables, mientras que los patógenos no cultivables no se detectan. Las muestras de LRTI incluyen múltiples tipos de muestra, tales como lavado bronquioalveolar (BAL), mini-BAL, lavados bronquiales, esputo y aspirados endotraqueales (ETA), todos los cuales presentan características únicas y con frecuencia difíciles. Las muestras de esputo y ETA pueden ser difíciles de manipular, pueden ser lentas de procesar y pueden ser altamente inhibidoras frente a procedimientos de detección molecular. Adicionalmente, los patógenos de LRTI incluyen bacterias gram-positivas y gram-negativas, virus y organismos fúngicos, requiriendo con frecuencia una variedad de procedimientos de procesamiento de muestra.
El esputo es una matriz de muestra semisólida, con viscosidad variable y materiales particulados. Los BAL pueden tener una viscosidad similar a solución salina limpia o pueden tener una viscosidad similar al esputo, ambos de los cuales presentan desafíos de procesamiento. Las dificultades incluyen muestras que no se pueden transferir con pipeta, volúmenes de transferencia con pipeta imprecisos debido a la viscosidad variable, bolsas de aire, tracción, restos y espumación durante la inyección en el estuche o manipulación de muestras. Con la alta viscosidad, puede ser difícil aislar patógenos a partir de la matriz de muestra. Además, la actividad ARNasa encontrada en tales muestras puede afectar a la detección de ARN. Con tales tipos de muestra, una combinación de lisis física y química puede ser eficaz.
La muestra de esputo se puede obtener utilizando cualquier medio adecuado, incluyendo hacer que el paciente expectore en un recipiente de recogida adecuado o inducir que el paciente produzca una muestra. La mayor parte de los procedimientos de detección de patógenos utilizan un sistema de transferencia de volumen que puede ser difícil de utilizar con esputo u otras muestras viscosas. Normalmente, la muestra se trata previamente para licuar la muestra para su posterior transferencia con pipeta. En una realización ilustrativa, se utilizan hisopos para transferir la muestra, reduciendo o eliminando la necesidad de una etapa de tratamiento previo. Aunque se pueden utilizar pipetas, otros hisopos y otros dispositivos de transferencia para la transferencia de la muestra, la utilización de hisopo flocado proporciona un procedimiento sencillo y fácil para introducir una muestra en el sistema de ensayo al tiempo que se minimizan problemas con la manipulación de muestras. Un hisopo adecuado es FLOQSwab® (Copan Diagnostics, Murrieta, CA). Este hisopo flocado ilustrativo es hidrófilo y es muy adecuado para recoger patógenos. Para tales muestras viscosas, que tienen, de manera ilustrativa, una viscosidad de 3 mPa.s o mayor, o muestras sólidas o semisólidas, el hisopo flocado puede recoger, preferentemente, el organismo sobre material sólido. El hisopo flocado también puede liberar preferentemente el organismo sobre el material de matriz de muestra. Otros materiales que recogen y liberan preferentemente el organismo sobre la matriz de muestra se pueden utilizar para transferir la muestra y se entiende que un formato de hisopo es sólo ilustrativo.
En una realización ilustrativa, el hisopo 630 se puede colocar en la muestra recogida a partir del paciente o se puede colocar en una muestra medioambiental. A continuación, el hisopo 630 se puede colocar directamente en el tampón de muestra 652 en el vial de muestra 650. El tampón de muestra 652 puede ser cualquier tampón, dependiendo del tipo de muestra. Tal como se muestra en la figura 6, si se desea, la punta del hisopo 630 se puede romper y el tapón 658 se puede utilizar para cerrar el cuerpo de vial 654. La presencia de la punta de hisopo 630 dentro del cuerpo de vial 654 no debe afectar significativamente a la utilización del vial 650. El vial 650 se puede agitar, de manera ilustrativa, mediante inversión tres veces, o agitar de manera más vigorosa, de manera ilustrativa durante 10 segundos, para liberar cualquier patógeno que esté presente a partir del hisopo 630. De forma alternativa, el hisopo 630 se puede mover formando remolinos en el tampón de muestra 652 y, a continuación, el hisopo 630 se puede retirar del vial 650. Aunque sin limitarse a la teoría, se cree que los hisopos flocados pueden recoger preferentemente células, organismos y virus con respecto a matrices de muestra y, a continuación, pueden retener una porción de las matrices de muestra, tal como material de esputo viscoso, mientras que, como mínimo, liberan organismos y virus. Sin embargo, se entiende que en diversas realizaciones se pueden utilizar otros hisopos o dispositivos de transferencia. De manera ilustrativa, cualquier material de transferencia que recoge y libera de manera selectiva la muestra deseada sobre la matriz de muestra se puede utilizar para concentrar la muestra. Tales materiales incluyen hisopos, cepillos, esponjas, filtros, utensilios, bucles, papel u otro material adsorbente que une y libera selectivamente la muestra deseada y se puede colocar en contacto con la muestra durante la transferencia de la muestra para su análisis.
Por tanto, se ha descubierto que un hisopo flocado de este tipo es adecuado tanto para la recogida como para la liberación de patógenos en muestras viscosas, tales como muestras de LRTI, y el hisopo flocado proporciona un volumen de recogida bastante uniforme. Un hisopo FLOQSwabs™ individual recoge aproximadamente de 150 a 300 pl de muestra, incluyendo tipos de muestra de viscosidad superior tales como esputo, de una manera bastante reproducible. Otros materiales que recogen de manera reproducible muestras viscosas con un pequeño intervalo de volumen de muestra, de manera ilustrativa, un intervalo de volumen de dos veces a cuatro veces, están dentro del alcance de la presente invención. Se entiende que un intervalo de volumen de muestra es el intervalo de volúmenes que un material de recogida de muestra recoge de manera reproducible, de tal manera que un intervalo de dos veces ilustrativo es de 150 a 300 pl y un intervalo de cuatro veces ilustrativo es de 150 a 600 pl, aunque otros intervalos, que incluyen otros intervalos de dos veces y cuatro veces, están dentro del alcance de la presente invención. Los ejemplos ilustrativos incluyen hisopos que están dimensionados para recoger de 50 a 150 pl, así como de 300 a 1.000 pl de muestra, y posiblemente de 5 a 10 ml, aunque se entiende que estos intervalos son ilustrativos y que son posibles otros intervalos de tamaño. Aunque tales hisopos se pueden utilizar para recoger muestras a partir de un paciente, en una realización ilustrativa, el hisopo se utiliza para recoger la muestra de una manera reproducible y para transferir la muestra desde un recipiente de recogida adecuado hasta otro recipiente para su procesamiento adicional. Sin embargo, se entiende que otros materiales de recogida y transferencia adecuados se pueden utilizar con diversas realizaciones dadas a conocer en el presente documento, tal como se conocen en la materia.
En la materia se conoce tratar previamente muestras difíciles durante un periodo de tiempo. Por ejemplo, el esputo se puede tratar con ditiotreitol (DTT) y/o calor durante 15 minutos o más, algunas veces 30 minutos o más. Se puede utilizar un tampón de muestra 652 que puede licuar parcial o completamente muestras similares a esputo, de manera ilustrativa sin un tratamiento previo de este tipo. Los tampones conocidos en la materia utilizan con frecuencia detergentes en cantidades del 10 % o menos en volumen. Un tampón de muestra ilustrativo 652, según la presente invención, puede contener el 10 % o más de detergente, de manera ilustrativa, el 12 %, 15 %, 18 %, 20 % o más detergente. Los detergentes adecuados incluyen detergentes no iónicos, iónicos y zwitteriónicos que se pueden utilizar. En una realización ilustrativa, se puede utilizar un detergente no iónico, tal como Triton-X al 15 %. Otros detergentes no limitativos incluyen Tween-20, SDS y NP-40. Se ha descubierto que esta concentración superior de detergente puede reducir o eliminar la necesidad de un tratamiento previo, tal como calentar la muestra o un tratamiento previo de mezcla con DTT, antes de la extracción de ácido nucleico. Por tanto, la muestra se puede procesar con tan sólo 5 minutos o menos, 2 minutos o menos, un minuto o menos, o incluso sin un tiempo de espera. Sin embargo, se entiende que un tratamiento previo puede ser deseable con algunos tipos de muestra. El tampón de muestra 652 también puede contener un compuesto de guanidinio, tal como clorhidrato de guanidina. En un ejemplo ilustrativo, el tampón es ácido, de manera ilustrativa con un pH desde aproximadamente 2 hasta aproximadamente 6. En determinados procedimientos de preparación de muestra, de manera ilustrativa cuando el tipo de muestra es sangre o un hemoderivado, se utiliza un alcohol, tal como isopropanol, en el tampón de muestra 652. Sin embargo, otros tampones de muestra pueden estar libres de alcohol. Se ha descubierto que, en diversas realizaciones ilustrativas que emplean detergentes a una concentración del 10 % o más, de manera ilustrativa el 15 %, el alcohol se puede omitir del tampón de muestra 652.
Tal como se comentó anteriormente, el vial de muestra 650 puede estar dotado del filtro 646. Cuando se inserta la cánula 655 en la abertura de inyección de muestra 653 y se hace pasar la muestra al interior del estuche 510, el material de muestra se filtra a medida que se hace pasar a través del filtro 646 y al interior de la cánula 655. Un filtro 646 de este tipo se puede obstruir con muestras viscosas, tales como esputo. En algunas realizaciones, el vial de muestra 650 se puede proporcionar con una proteasa, tal como proteinasa K, o la proteasa se puede proporcionar de otra manera en el vial de muestra 650 o se puede añadir junto con el tampón de muestra 652. Si la proteasa se proporciona en forma seca, la introducción del tampón de muestra 652 rehidrata la proteasa, y la introducción de la muestra en el tampón de muestra 652 permite que la proteasa comience a descomponer las proteínas en la muestra, incluso antes de que se transfiera la muestra al interior del estuche 510 y alcance el blíster de lisis 522. La acción de la proteasa puede ayudar a reducir la viscosidad de la muestra, mejorando de este modo la capacidad de la muestra para pasar a través del filtro 646, o mejorar otras etapas de procesamiento posteriores. Por tanto, se puede liberar una mayor cantidad de los patógenos a partir de la muestra con proteasa presente en el vial de muestra 650. Sin embargo, en algunas realizaciones que utilizan una proteasa, puede ser deseable añadir la proteasa al tampón de muestra directamente o añadir la proteasa más tarde en el proceso, de manera ilustrativa disponiéndola seca en el canal de entrada 515b, mientras que, en otras realizaciones, se puede omitir la proteasa.
Se entiende que, preferentemente, transfiriendo los patógenos utilizando un hisopo flocado, una concentración de detergente superior, filtrando a través de un filtro 646 en presencia de una proteasa o una combinación de los mismos, puede eliminar la necesidad de un tratamiento previo térmico o con DTT y puede descomponer suficientemente tales muestras viscosas. A continuación, tales muestras pueden estar listas para una etapa de lisis posterior, seguida por PCR u otras pruebas.
Aunque la descripción ilustrativa anterior se centra en esputo y otros tipos de muestra de LRTI, se entiende que los procedimientos y dispositivos anteriores se pueden utilizar con una amplia variedad de tipos de muestra, particularmente, pero sin limitación a los mismos, tipos de muestra difíciles. Además de esputo, BAL y otros tipos de muestra de LRTI, otras muestras biológicas difíciles incluyen, pero sin limitación a las mismas, mucosa, heces, tejido, homogeneizado tisular, tejido triturado, tejido incrustado en formalina tratado con parafina, hueso, homogeneizado de hueso, escaras, pus, líquido sinovial, aspirados de ganglios linfáticos y lavados estomacales. Las muestras medioambientales, de manera ilustrativa tierra, superficies, polvos o alimentos, también pueden presentar desafíos. La transferencia utilizando un hisopo flocado u otros medios de transferencia que recogen y liberan preferentemente patógenos permite una recogida relativamente sistemática de los patógenos, incluso a partir de muestras que son difíciles de transferir con pipeta o medir con precisión. Se puede utilizar un tampón de muestra que licúa parcial o completamente la matriz de muestra. Hacer pasar la muestra a través de un filtro, de manera ilustrativa en presencia de concentraciones superiores de detergente o aditivos para ayudar en la preparación de muestra, ayuda a descomponer la matriz de muestra para proporcionar una muestra en un formato adecuado para su procesamiento adicional.
EJEMPLO 4: MUESTRAS DE SANGRE DIRECTA
En esta realización, se utilizan muestras de sangre directa para el análisis de ARN del huésped. Tal como se utiliza en el presente documento, “sangre directa” significa muestras de sangre que no se han cultivado. Las muestras de sangre directa ilustrativas incluyen sangre completa directa a partir de un organismo huésped, de manera ilustrativa un ser humano, una fracción de sangre completa (por ejemplo, plasma o suero), sangre completa recogida en una solución anticoagulante (por ejemplo, EDTA, citrato) o sangre completa recogida en una solución de estabilización de ARN. Se entiende que la respuesta del huésped frente a enfermedades infecciosas, agudas y/o crónicas tiene como resultado cambios en la producción de determinadas moléculas de ARN, incluyendo, pero sin limitación a los mismos, ARN ribosómico, ARN mensajero (ARNm), ARN no codificante largo o ARN de interferencia pequeño. Tales cambios en la producción de ARN se pueden utilizar para indicar la fuente de la enfermedad del huésped. El ARN en una muestra de sangre directa se purifica, en general, con procedimientos de extracción automatizados o manuales compuestos por centrifugación, lavado, adición de tampones optimizados, digestos de proteína y ácido nucleico, con frecuencia con lavado adicional, y elución. En muchos procedimientos de la técnica anterior, todo esto se completa utilizando equipos independientes de la herramienta de diagnóstico molecular de punto de extremo y con frecuencia requiere 90 minutos o más. A continuación, las muestras purificadas resultantes se añaden manualmente a un sistema de diagnóstico molecular de punto de extremo, tal como una micromatriz de ADNc o un instrumento de qPCR. El proceso para purificar muestras de ARN del huésped requiere, con frecuencia, un tiempo significativo, equipos externos y manipulación de muestras, todo lo cual puede influir en la integridad y calidad de la muestra. Un enfoque alternativo es añadir la muestra de sangre directa (de manera ilustrativa, en cualquiera de las formas definidas anteriormente) directamente a un tampón de muestra 652. Un tampón de muestra ilustrativo contiene un agente caotrópico que ayuda en la unión y recuperación de ácidos nucleicos, al tiempo que reduce proteínas, tales como ARNasas, que pueden degradar el ARN. De manera ilustrativa, la proporción de muestra de sangre directa con respecto a tampón de muestra está en un intervalo desde 1 con respecto a 8 hasta 1 con respecto a 1 , más específicamente en un intervalo desde 1 con respecto a 5 hasta 1 con respecto a 1,67, aunque se entiende que otras proporciones son posibles. A continuación, esta muestra se puede cargar directamente en el estuche 510, tal como se comentó anteriormente. El ARN del huésped se extrae y se purifica dentro del sistema cerrado, tal como se comentó anteriormente, de manera ilustrativa con tan sólo mezcla mínima en el vial 650 o sin ninguna manipulación adicional por el usuario. Tal preparación de muestra se puede completar sin cualquiera o ninguna de las etapas que implican centrifugación, precipitación con etanol y digestión de ADN. Por tanto, la muestra se puede procesar con tan sólo 2 minutos o menos y no requerir ningún equipo externo a partir de la herramienta de diagnóstico molecular de punto final.
Un ejemplo de esta aplicación es la detección de cambios de ARN del huésped en respuesta a una infección por influenza. Cien microlitros (100 pl) de muestra de sangre completa recogida en una solución de estabilización de ARN, según las instrucciones del fabricante, se añadieron al tampón de muestra 652, de manera ilustrativa el tampón de muestra proporcionado con el panel respiratorio de FilmArray (BioFire Diagnostics, LLC). De manera ilustrativa, se pueden utilizar de 300 a 900 pl, o 2-5 veces el volumen de la muestra, del tampón de muestra. A continuación, esta mezcla se inyectó en un estuche desechable 510. La extracción de muestra, purificación, transcripción inversa y dos etapas de reacción en cadena de la polimerasa tuvieron como resultado mediciones de ARN del huésped significativamente regulado por incremento en respuesta a la infección viral con respecto a un control sano. Todo el proceso de purificación de muestra y análisis por qPCR tardó menos de 70 minutos.
Un ejemplo adicional de esta aplicación es la detección de ARN del huésped a partir de sangre completa recogida en una solución anticoagulante (EDTA). Cien microlitros (100 pl) de esta muestra de sangre completa se añadieron a 800 pl del mismo tampón de muestra. A continuación, esta mezcla se inyectó en un estuche 510. La extracción de muestra, purificación, transcripción inversa y dos etapas de reacción en cadena de la polimerasa tuvieron como resultado mediciones de ARN del huésped. Todo el proceso de purificación de muestra y análisis por qPCR tardó menos de 70 minutos.
Estos ejemplos demuestran que se pueden extraer ácidos nucleicos, de manera ilustrativa ácidos nucleicos con alto número de copias, que incluyen, pero sin limitación a los mismos, diversas moléculas de ARN, bacterias, virus u otros microorganismos, a partir de muestras de sangre directa utilizando únicamente lisis, de manera ilustrativa lisis química y/o mecánica, y purificación de ácido nucleico, de manera ilustrativa mediante unión a un sustrato de sílice y la elución del mismo, de manera ilustrativa no más de 5 lavados, o no más de 3 lavados, pero un único lavado está dentro del alcance de la presente invención. Estos ácidos nucleicos se pueden extraer y preparar sin centrifugación o digestión enzimática, y sin muchas etapas de lavado repetidas. Además, tal como se demuestra, estos ácidos nucleicos extraídos son adecuados como molde para su amplificación posterior.
La presente invención se puede implementar en otras formas específicas sin alejarse de sus características esenciales. Se debe considerar que las realizaciones descritas son, en todos los aspectos, sólo ilustrativas y no limitativas. Por tanto, el alcance de la presente invención está indicado por las reivindicaciones adjuntas en vez de por la descripción anterior. Aunque determinadas realizaciones y detalles se han incluido en el presente documento y en la divulgación de la invención adjunta con fines de ilustrar la presente invención, resultará evidente para los expertos en la materia que se pueden realizar diversos cambios en los procedimientos y aparatos dados a conocer en el presente documento sin apartarse del alcance de la presente invención, que se define en las reivindicaciones adjuntas. Todos los cambios que entren dentro del significado y alcance de equivalencia de las reivindicaciones deben quedar abarcados dentro de su alcance.

Claims (12)

REIVINDICACIONES
1. Procedimiento de recogida de muestra, que comprende:
recoger una muestra que comprende una sustancia biológica o medioambiental para proporcionar una muestra recogida,
poner en contacto la muestra recogida con un hisopo,
colocar el hisopo con la muestra recogida en un tampón de muestra, transfiriendo, de este modo, como mínimo, una porción de la muestra recogida que comprende un organismo al tampón de muestra para proporcionar un tampón de muestra que comprende el organismo, y
filtrar el tampón de muestra que comprende el organismo;
en el que el procedimiento no comprende una etapa de tratamiento previo que dure más de 2 minutos, y
en el que el tampón de muestra comprende un detergente en una cantidad, como mínimo, del 10 % en volumen del tampón de muestra.
2. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la muestra es una sustancia que tiene una viscosidad de 3 mPa.s o mayor.
3. Procedimiento, según la reivindicación 2, en el que la sustancia es esputo.
4. Procedimiento, según la reivindicación 1, que comprende, además, poner en contacto la muestra recogida en el tampón de muestra con una proteasa.
5. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el hisopo es un hisopo flocado.
6. Procedimiento de recogida de muestra, según la reivindicación 1, en el que el tampón de muestra comprende un detergente en una cantidad en un intervalo del 12 % al 18 % en volumen del tampón de muestra.
7. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el tampón de muestra comprende Triton-X al 15 % en volumen del tampón de muestra.
8. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la etapa de filtración comprende hacer pasar el tampón de muestra que comprende el organismo a través de un filtro en presencia de una proteasa.
9. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la muestra comprende una matriz de muestra y el organismo, y el organismo es un patógeno,
en el que el hisopo retiene la matriz de muestra a la vez que libera selectivamente el patógeno en el tampón de muestra.
10. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que no hay tiempo de espera para una etapa de tratamiento previo.
11. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que la muestra es esputo y el esputo no se somete a tratamiento térmico o se trata con DTT antes de la etapa de colocación.
12. Procedimiento, según la reivindicación 1, en el que el tampón de muestra comprende un detergente seleccionado entre el grupo que consiste en un detergente no iónico, un detergente iónico, un detergente zwitteriónico y cualquier combinación de los mismos.
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Families Citing this family (18)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US9522396B2 (en) 2010-12-29 2016-12-20 S.D. Sight Diagnostics Ltd. Apparatus and method for automatic detection of pathogens
WO2014145765A1 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Ancera, Inc. Systems and methods for bead-based assays in ferrofluids
WO2014144782A2 (en) 2013-03-15 2014-09-18 Ancera, Inc. Systems and methods for active particle separation
US11285490B2 (en) 2015-06-26 2022-03-29 Ancera, Llc Background defocusing and clearing in ferrofluid-based capture assays
US9933445B1 (en) 2016-05-16 2018-04-03 Hound Labs, Inc. System and method for target substance identification
EP3490694A4 (en) * 2016-07-31 2020-04-15 Ancera Corp. MULTI-LAYER DISPOSABLE CARTRIDGE FOR FERROFLUID BASED ASSAYS AND METHOD OF USE
US11982611B2 (en) * 2017-03-20 2024-05-14 Nanocellect Biomedical, Inc. Systems, apparatuses, and methods for cell sorting and flow cytometry
US11305276B2 (en) 2017-05-24 2022-04-19 Biofire Defense, Llc Systems and methods for point of use evacuation of an array
US20200245899A1 (en) 2019-01-31 2020-08-06 Hound Labs, Inc. Mechanical Breath Collection Device
US11977086B2 (en) 2019-03-21 2024-05-07 Hound Labs, Inc. Biomarker detection from breath samples
CN110157702A (zh) * 2019-05-24 2019-08-23 中国水产科学研究院南海水产研究所深圳试验基地 一种用于提取珊瑚rna样品的采集操作台
US11933731B1 (en) 2020-05-13 2024-03-19 Hound Labs, Inc. Systems and methods using Surface-Enhanced Raman Spectroscopy for detecting tetrahydrocannabinol
AU2021278969A1 (en) * 2020-05-29 2023-01-05 The Rockefeller University Method and system for RNA isolation from self-collected and small volume samples
WO2021257819A1 (en) * 2020-06-18 2021-12-23 Nanocellect Biomedical, Inc. Microfluidic systems and methods for sorting particles
CN111822282B (zh) * 2020-07-24 2021-07-20 惠州法路源基因科技有限公司 一种取样拭子植绒设备
US11806711B1 (en) 2021-01-12 2023-11-07 Hound Labs, Inc. Systems, devices, and methods for fluidic processing of biological or chemical samples using flexible fluidic circuits
CN113136412A (zh) * 2021-04-22 2021-07-20 浙江珂瑞康生物医疗科技有限公司 用于含可溶性蛋白生物医用材料的生物负载测定处理液
WO2023144713A1 (en) * 2022-01-25 2023-08-03 S.D. Sight Diagnostics Ltd Sample carrier for use with a bodily sample

Family Cites Families (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6645758B1 (en) 1989-02-03 2003-11-11 Johnson & Johnson Clinical Diagnostics, Inc. Containment cuvette for PCR and method of use
US6780617B2 (en) 2000-12-29 2004-08-24 Chen & Chen, Llc Sample processing device and method
JP4679818B2 (ja) 2001-07-16 2011-05-11 アイダホ テクノロジー インコーポレーテッド 熱サイクルシステム及びその使用方法
CA2484062A1 (en) * 2001-08-20 2003-02-27 James C. Davis Dna purification and recovery from high particulate and solids samples
WO2003070898A2 (en) 2002-02-19 2003-08-28 Choicepoint Asset Company Selective extraction of dna from groups of cells
JP4286157B2 (ja) 2003-01-21 2009-06-24 デンカ生研株式会社 メンブレンアッセイ法
US20040157219A1 (en) * 2003-02-06 2004-08-12 Jianrong Lou Chemical treatment of biological samples for nucleic acid extraction and kits therefor
EP3718635A1 (en) * 2003-07-31 2020-10-07 Handylab, Inc. Processing particle-containing samples
US7387887B2 (en) 2004-04-20 2008-06-17 University Of Utah Research Foundation Nucleic acid melting analysis with saturation dyes
US8986614B2 (en) 2010-02-23 2015-03-24 Rheonix, Inc. Self-contained biological assay apparatus, methods, and applications
EP3714979A1 (en) 2005-05-09 2020-09-30 BioFire Diagnostics, LLC Self-contained biological analysis
US9481912B2 (en) * 2006-09-12 2016-11-01 Longhorn Vaccines And Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting and identifying nucleic acid sequences in biological samples
US8652782B2 (en) * 2006-09-12 2014-02-18 Longhorn Vaccines & Diagnostics, Llc Compositions and methods for detecting, identifying and quantitating mycobacterial-specific nucleic acids
US8895295B2 (en) 2006-11-15 2014-11-25 Biofire Diagnostics, Llc High density self-contained biological analysis
ES2586623T3 (es) 2008-08-15 2016-10-17 Aperture Bio, LLC Sistemas y métodos basados en citometría de flujo para la detección de microbios
NZ594443A (en) * 2009-02-03 2014-06-27 Netbio Inc Nucleic acid purification
BR112013002064B1 (pt) 2010-07-27 2020-11-24 Northwestern University Dispositivo e metodos para filtragem do plasma sanguíneo
WO2012027302A2 (en) * 2010-08-21 2012-03-01 The Regents Of The University Of California Systems and methods for detecting antibiotic resistance
WO2012050787A1 (en) 2010-09-29 2012-04-19 Ibis Biosciences, Inc. Fungal nucleic acid extraction
IT1403618B1 (it) 2011-01-05 2013-10-31 Copan Italia Spa Procedimento per realizzare un dispositivo per il prelievo ed il trasferimento di campioni per biologia molecolare
CA2854768C (en) 2011-11-10 2021-08-17 David E. Jones Loading vials
JP5612778B2 (ja) 2012-04-05 2014-10-22 株式会社ビーエル 結核菌群の免疫学的検出方法及び検出用キット
WO2013159116A1 (en) * 2012-04-20 2013-10-24 University Of Chicago Fluidic devices for biospecimen preservation
CN104662160B (zh) 2012-05-24 2018-02-23 犹他州大学研究基金会 极端pcr
EP2684947A1 (en) * 2012-07-09 2014-01-15 Biocartis SA A method for filtering a biological sample
JP6325077B2 (ja) 2013-03-15 2018-05-16 アボツト・モレキユラー・インコーポレイテツド 核酸を抽出するための組成物および方法
WO2015187849A2 (en) 2014-06-04 2015-12-10 Lucigen Corporation Sample collection and analysis devices

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