KR20110120813A

KR20110120813A - 비단풀 추출물을 포함하는 주름개선용 화장료 조성물

Info

Publication number: KR20110120813A
Application number: KR1020110007616A
Authority: KR
Inventors: 박선기; 차영권; 안현철; 전봉주; 금종필; 김용수; 하정욱
Original assignee: 주식회사 코스메카코리아
Priority date: 2010-04-29
Filing date: 2011-01-26
Publication date: 2011-11-04

Abstract

본 발명은 비단풀(Euphorbia supina) 추출물을 유효성분으로 함유하는 주름개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법에 관한 것으로서, 보다 구체적으로는 비단풀 추출물의 콜라게나아제(Collagenase) 활성억제 및 콜라겐(Collagen) 생성 촉진효능을 이용한 주름개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

Description

비단풀 추출물을 포함하는 주름개선용 화장료 조성물{Cosmetic composition comprising Euphorbia supina for improving skin wrinkle}

비단풀(Euphorbia supina)은 대극과에 딸린 한해살이 풀로서 우리나라와 중국, 일본, 동남아시아, 남북미 등 온대와 열대지방에 널리 분포하는 야생 잡초이며, 모양은 쇠비름과 비슷하지만 쇠비름보다 훨씬 작고, 풀밭이나 마당, 길바닥에 더러 자라지만 작아서 별로 눈에 띄지 않는다. 줄기는 땅바닥을 기면서 자라고 줄기나 잎에 상처를 내면 흰 즙이 제법 많이 나온다. 밑동에서부터 많은 가지가 갈라져서 땅을 덮으면 줄기에 털이 약간 있고, 가지는 보통 두 개씩 갈라지고 붉은빛이 돈다(도 1 참조).

고령화 사회로 접어들면서 피부 노화에 대한 관심도가 급증하고 있으며, 피부의 주름에 대한 관심도가 날로 높아지고 있고 2000년도 기능성화장품법 실시로 주름개선 화장품에 대한 시장이 급팽창하고 있으며, 안전성이 확보된 천연주름개선 화장품소재에 대하여 많은 연구가 진행되고 있다.

본 발명의 목적은 피부 독성이 없으면서 주름개선효과가 우수한 천연소재를 이용한 화장료 조성물을 제공하는 데에 있다.

상기한 목적을 달성하기 위한 본 발명자의 연구에서 비단풀(Euphorbia supina) 추출물은 피부독성이 없으며 항산화(DPPH, ORAC) 효과, 특히 콜라게나아제(Collagenase) 활성억제 및 콜라겐(Collagen) 생성 촉진 효과가 우수하다. 특히 비단풀 추출물의 용매분획으로 분리 정제하여 얻은 이소퀘르시트린(isoquercitrin)은 피부독성이 없으며 항산화 효과, 콜라게나아제 활성억제 및 콜라겐(Collagen) 생성 촉진 효과가 우수하여 비단풀 추출물 또는 비단풀 유래 이소퀘르시트린을 이용하면 항주름 기능성이 우수한 주름 개선용 화장료를 제조할 수 있게 된다는 사실을 발견하여 본 발명을 완성하게 되었다.

본 발명은 비단풀(Euphorbia supina) 추출물을 유효성분으로 함유하는 주름개선용 화장료 조성물 및 이의 제조방법을 제공함으로써, 콜라게나아제(Collagenase) 활성억제 및 콜라겐(Collagen) 생성 촉진효능이 우수한 주름개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있다. 특히 비단풀(Euphorbia supina)로부터 분리된 이소퀘르시트린(Isoquercitrin) 성분은 콜라게나아제 활성억제 및 콜라겐 생성 촉진 효과가 뛰어나며, 따라서 본 발명은 비단풀로부터 분리된 이소퀘르시트린을 유효성분으로 포함하는 주름개선용 화장료 조성물을 제공할 수 있다.

본 발명은 비단풀(Euphorbia supina) 추출물과 비단풀 추출물에서 분리한 이소퀘르시트린의 콜라게나아제 활성억제 및 콜라겐 생성 촉진기능을 활용하여 다양한 제형의 주름개선용 화장료에 이용할 수 있으며, 천연물질의 추출물 또는 천연물질로부터 추출된 성분을 유효성분으로 함유함으로써 친환경적이고, 부작용이 거의 없다는 장점이 있다.

도1은 비단풀(Euphorbia supina)의 사진이다.
도2는 비단풀(Euphorbia supina)의 1차추출 공정도를 나타낸 것이다.
도3은 비단풀(Euphorbia supina) 1차추출물의 용매분획공정도를 도시한 것이다.
도4는 비단풀(Euphorbia supina)에서 이소퀘르시트린(Isoquercitrin)을 분리하기까지의 과정을 나타낸 것이다.
도5는 비단풀(Euphorbia supina)에서 분리된 이소퀘르시트린(Isoquercitrin)의 ESI-MS (positive) 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도6은 비단풀(Euphorbia supina)에서 분리된 이소퀘르시트린(Isoquercitrin)의 ESI-MS (negative) 스펙트럼을 나타낸 것이다.
도7은 비단풀(Euphorbia supina)에서 분리된 이소퀘르시트린(Isoquercitrin)의 1H NMR 스펙트럼 결과이다.
도8은 비단풀(Euphorbia supina)에서 분리된 이소퀘르시트린(Isoquercitrin)의 화학구조식이다.
도 9는 MMP-9 분석에서 젤라틴 자아모그래피 밴드 그래프이다.
도 11은 MMP-9 분석에서 처리된 무모쥐의 MMP-9의 발현(Expression)을 보여주는 그래프이다.
도 11은 콜라겐 분석(Collagen assay)에서 처리된 무모쥐의 콜라겐 레벨을 보여주는 그래프이다.
도 12는 피검자의 양측 상완 내측에 인체첩포 테스트하는 방법을 보여주는 사진이다.
도 13은 본 실시예에서 제조된 로션의 안정도 관찰 결과를 보여주는 그래프이다.
도 14는 본 실시예에서 제조된 크림의 안정도 관찰 결과를 보여주는 그래프이다.
도 15 및 16은 본 발명의 일 구현에 따라 비단풀을 추출, 농축하여 화장료에 적용하기에 적합한 용매와 혼합한 후 방부처리하는 과정을 보여주는 공정도로서, 도 15는 방부처리 전까지의 공정도이고, 도 16은 방부처리시의 공정도이다.

이하, 본 발명을 구체적으로 설명하기로 한다.

본 발명은 비단풀(Euphorbia supina) 추출물을 유효성분으로 함유하는 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다. 본 발명의 주름개선용 화장료 조성물은 비단풀(Euphorbia supina) 추출물을 유효성분으로 함유하는 것으로서, 특히 비단풀 추출물은 콜라게나아제 활성억제 및 콜라겐 생성 촉진효과를 갖는다.

상기 비단풀(Euphorbia supina) 추출물은 유기용매 추출물인 것을 특징으로 하며, 유기용매로는 C₁ _-4 저급 알코올, 염소화탄화수소류 용매, 탄화수소류 용매, 방향족 탄화수소류 용매 또는 이들의 혼합용매로 구성된 그룹으로부터 선택되는 용매를 사용할 수 있다.

본 발명의 일양태에서, 상기 유기용매로는 에탄올, 메탄올, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 헥산, 헵탄, 벤젠, 톨루엔 또는 이들의 혼합용매가 사용될 수 있다.

본 발명은 또한 비단풀(Euphorbia supina) 추출물로부터 분리된 이소퀘르시트린(Isoquercitrin)을 유효성분으로 함유하는 주름개선용 화장료 조성물을 제공한다. 상기 이소퀘르시트린은 콜라게나아제 활성억제 및 콜라겐 생성 촉진효과가 우수하다. 실제, 비단풀을 EtOH 70%로 추출하여 1차적으로 효능을 스크린하고 이에 따라 물질을 액체분리(Liquid seperation)하여 재차 효능을 검증하고, 또한 소분획(Subfraction)하여 그 효과 및 지표성분으로써 물질을 확인한 결과 비단풀에서의 유효성분 및 지표성분으로 이소케르시트린(Isoquercitrin)을 확인할 수 있었다.

본 발명의 일양태에서, 상기 화장료 조성물을 포함하는 화장품이 제공된다.

상기 화장품은 이로 제한되지는 않으나, 예컨대 화장수, 에멀젼, 영양로션, 영양크림, 마사지용 로션크림, 세안용 화장품, 팩, 바디용 제품, 유화 메이크업, 연고, 젤, 크림, 패취 또는 분무제 등의 제형으로 제품화될 수 있다.

본 발명의 일양태에서, 본 발명의 주름개선용 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어, 용액, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 겔, 크림, 로션, 파우더, 비누, 계면활성제-함유 클린싱, 오일, 분말 파운데이션, 유탁액 파운데이션, 왁스 파운데이션 및 스프레이 등으로 제형화될 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 보다 상세하게는, 유연 화장수, 수렴 화장수, 영양 화장수, 영양 크림, 마사지 크림, 에센스, 아이 크림, 클렌징 크림, 클렌징 포옴, 클렌징 워터, 팩, 스프레이 또는 파우더의 제형으로 제조될 수 있다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물성유, 식물성유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액인 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용해화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상의 희석제, 에톡실화이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 라놀린유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명은,

(a) 비단풀(Euphorbia supina)을 유기용매로 전처리하는 단계; 및

(b) 잔사를 건조시키고 C₁ _-4 저급알코올 용매를 이용하여 추출하는 단계를 포함하는 주름개선용 비단풀 추출물의 제조방법을 제공한다.

본 발명의 제조방법에서, 단계(a)의 유기용매로는 탄화수소류 용매가, 단계(b)의 용매로는 에탄올 또는 메탄올을 사용할 수 있으며, 보다 구체적으로 단계(a)의 유기용매로는 헥산을, 단계(b)의 용매로는 에탄올을 사용할 수 있다.

예컨대, 헥산으로의 전처리 단계는 유효성분이 에틸아세테이트 층에 존재하는 경우, 이에 대하여 비극성 물질로 오일 및 왁스층을 제거하고 에탄올로 추출하여 완전 농축하고 농축액을 화장료에 접목하기 용이하도록 화장료용 용매로 이행시키는 것이 바람직하기 때문에 선택되나, 전처리 용매의 종류는 추출용매의 종류 및 분획용매의 종류에 따라 적절히 선택될 수 있다. 상기와 같이 준비한 1차 추출액을 본 발명의 화장료 제조에 이용할 수 있다.

본 발명의 제조방법에서, 단계(b) 이후 용매로 분획하는 단계(c)를 추가로 포함할 수 있다.

상기 단계(c)에서 사용되는 용매로는 헥산, 메틸렌클로라이드, 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 정제수, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린 또는 벤젠을 들 수 있으며, 에틸아세테이트가 바람직하다. 또한, 용매분획할 경우에는 비용, 유기용매 잔류성 등이 문제가 될 수 있어 헥산으로 전처리하는 것이 바람직하다.

이하 본 발명을 다음의 실시예 및 실험예에 의해 설명하고자 한다. 그러나 이들은 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명의 권리범위가 이들에 의해 한정되는 것은 아니다.

[ 실시예 1 ]

도 2에 나타낸 바와 같은 공정에 따라 비단풀을 70% 에탄올로 1차 추출 후 도 2에 나타낸 공정에 따라 헥산(Hexane), 메틸렌클로라이드(Methylene chloride), 에틸아세티이트(Ethyl acetate), 부탄올(Butanol) 등의 용매를 순차적으로 처리하여 분획하여 각 분획의 활성을 측정하여 유효성분이 존재하는 분획을 검증하고 분획 내에 존재하는 성분을 확인하였다. 1차 추출물의 초기 수율은 28.2%이며 초기 추출물 대비 용매 분획의 수율은 도 3에 제시하였다.

성분을 분리하고 확인하기 위하여 용매의 극성에 따른 원론적인 분획을 실시하여 다음과 같은 수율을 확인하였고 분액별 농축액에 대한 유효성 평가를 주관연구기관에서 실시하여 도 3에 나타낸 바와 같이 물질 분리(추출물 Subfraction)를 실시하였다.

분리된 물질을 ESI-MS, 1H NMR 분석하여 이소퀘르시트린(Isoquercitrin)을 확인하였다. 도 5에는 비단풀 유래 이소퀘르시트린(Isoquercitrin)의 ESI-MS (positive) spectrum {ESI-MS (positive)m/z : 487[M+Na]}을, 도 6에는 비단풀 유래 이소퀘르시트린(Isoquercitrin)의 ESI-MS (negative) spectrum{ESI-MS (negative)m/z : 463[M-H]}가 제시되고, 도 7에는 비단풀로부터 분리된 이소퀘르시트린(Isoquercitrin)의 1H NMR spectrum (DMSO-d6, 400MHz)이 제시하였다.

¹H-NMR(DMSO-d₆, 400MHz, δ ppm) : 3.05~3.60(sugar H), 5.45(1H, d, J=7.4Hz, H-1"), 6.19(1H, d, J=1.9Hz, H-6), 6.39(1H, d, J=1.9Hz, H-8), 6.83(1H, d, J=9.0Hz, H-5'), 7.57(2H, m, H-2', 6'), 12.63(1H, brs, 5-OH)

도 8에는 이를 바탕으로 한 비단풀로부터 분리된 이소퀘르시트린(Isoquercitrin) 구조(Structure assign)를 제시하였다.

실험예 1. 세포증식 및 세포 독성 실험 ( MTT assay )

세포성장곡선은 3-(4,5-디메틸티아졸-2-일)-2,5-디벤질테트로졸리움(MTT;sigma, USA) 분석으로 측정하였다.

1)세포(Cell line : Mouse NIH/3T3 fibroblasts) 2 ×10³cells/well을 10% FBS(Fetal bovine serum)가 포함된 DMEM 96-웰플레이트(well plates)에서 5% CO₂, 37℃에서 48시간 배양한 후 추출 샘플(sample)을 직접 처리하였다. MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-dibenzyltetrozolium; sigma, USA) (5 mg/ml)를 10 μg/well로 투여한 후 4시간 배양하였다. 각 well에 100 μl의 DMSO를 가하고 상등액을 제거하였다. 10분간 배양 후 마이크로플레이트 리더(micro-plate reader) (SPCTRA MAX 340PC, Molecular Devices, USA)를 이용하여 550nm에서 흡광도를 측정하였다.흡광도는 생존한 세포의 수이며, 3회의 실험으로 재현성을 확인하였다.

세포 증식율 (%) = [OD₅₅₀ ₍ _sample ₎ - OD₅₅₀₍ _control ₎] / OD₅₅₀ ₍ _control ₎ × 100

비단풀 추출물, 용매 분획, 각각의 분리 물질에 대하여 세포 증식효과 및 세포독성을 평가한 결과 비단풀 추출물 및 각각의 용매분획에 따른 분리 물질에서 세포 증식효과가 우수하였으며, 세포독성은 매우 미미함을 확인할 수 있었다(표 1 참조).

실험예 2. 항산화 실험

프리라디칼 소거활성 분석( DPPH assay )

프리라디칼 소거활성 분석법은 푸니타 등(Funita et al)의 방법을 개선한 것으로서 안정한 1,1-디페닐-2-피크릴히드라질 라디칼(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl Radical: DPPH)을 사용하였다(proton-radical scavenger에 의해 탈색). DPPH 용액에 대황 및 비단풀 혼합추출물을 첨가하고 섞은 다음 실온에서 일정기간 방치 후 515 nm에서 흡광도의 세기를 측정하였다.

산소라디칼 흡수능 분석( Oxygen radical absorbance capacity asssay : ORAC assay)

식물 추출물로 항산화력을 가진 물질을 선별해 내는 것을 목적으로 하는 실험이다. 반응과정은 완충액(Buffer)과 Sample, FL 용액(solution)을 혼합한 후, 라디칼 제너레이터(radical generator)인 AAPH를 첨가함으로써 반응이 시작되며, 그 원리는 AAPH에 의하여 FL 부패(decay)가 일어나는데 항산화제(Antioxidant)가 존재하면 FL decay반응이 억제(inhibition)된다. FL 세기(intensity) 측정은 2분마다 한 번씩 60분간 하였으며, 37℃, pH7.4의 조건에서 진행하였다.

준비물( Material )

- 추출물

- 검출염료(Detection dye): 플루오르세인 디소디움(Fluorescein disodium: FL)

- 2-2’-아조비스(2-아미디노-프로판) 디하이드로클로라이드 (AAPH)

- 96 웰 블랙플레이트(well black plate)

- Trolox (water soluble analogue of Vie E, positive Control)

- 플루오스타 갤럭시 플레이트 리더(FLUOstar Galaxy plate reader) 혹은 Model F-4500(HITACHI, Japan) - 일반 플루오로메터(Fluorometer)로 대체 및 Vmax assay로 가능.

프로토콜( Protocol )

1. 플푸오르메터(Fluoremeter)와 항온수조(water bath power on: 37℃)

2. B-PE, 포스페이트 완충액(phosphate buffer), 샘플은 15분 예배양(pre-incubation)

3. 반응부피(Reaction volume) = 200ul

- 75mM phosphate buffer (pH7.4)

- 대조군(Control): Trolox (final 0.5~10ug/ml)

- B-PE: FL (final 10uM)

- 샘플: final 0.5~10ug/ml

- 라디칼 제너레이터(Radical generator): AAPH (final 50mM)

AAPH가 제일 마지막에 첨가되도록 함. 각 샘플은 3번이상의 반복 실험 실시.

실험결과, 비단풀 추출물, 용매 분획, 각각의 분리 물질에 대하여 항산화 효과를 평가한 결과 비단풀 추출물 및 각각의 용매분획에 따른 분리 물질 특히 이소퀘르시트린(Isoquercitrin)의 항산화 활성 효과가 우수함을 확인할 수 있었다. (도 4, 표 2, 3, 및 4 참조)

실험예 3. 콜라게나아제 억제활성 및 콜라겐생성촉진 실험

콜라게나아제 분석법( Collagenase assay )

방선균 유래 콜라게나아제(Collagenase) 및 합성 기질 PZ-펩티드(PZ-Peptide)를 이용한 평가이다. 완충액은 0.1M Tris(염산) 완충액(pH 7.1, 20mM CaCl₂ 함유)을 사용하였다. 효소는 완충액에 0.1㎎/㎖로 제조하였고 기질은 완충액에 0.5㎎/㎖로 제조하였다. 시료는 50㎕, 효소 50㎕ 및 기질 400㎕를 혼합하고 37℃에서 30분간 반응시킨 후 25mM 구연산 용액 1㎖를 가해 반응을 정지시켰다. 다음으로 초산 에틸 5㎖을 가해 교반하고 초산 에틸층을 추출하였다.

원심 분리 (3000rpm, 5min) 후 파장 320㎚에서 흡광도를 측정하고 이하의 식에 따라 저해율을 산출하였다. 대조는 시료의 용매로 하고 반응 정지 후에 기질을 가해 Blank로 하고 시료와 Blank와의 흡광도 차를 이하의 식에 의하여 저해율을 산출하였다.

비단풀 추출물, 용매 분획, 각각의 분리 물질에 대하여 콜라게나아제(Collagenase) 활성억제 효과를 평가한 결과 비단풀 추출물 및 각각의 용매분획에 따른 분리 물질 특히 이소퀘르시트린(Isoquercitrin)의 콜라게나아제 활성억제 효과가 우수함을 확인할 수 있었다.(표 5 및 6 참조)

콜라겐 생성 촉진 효과

1) MMP-9 분석(assay)

MMP-9는 젤라티나아제 B(gelatinase B) 혹은 92 kDa 젤라티나아제(gelatinase)라고도 불리우며, 피부 세포간질 (ECM) 성분들 중 젤라틴(gelatin), 콜라겐(collagen) 타입(type) Ⅳ와 type V에 대한 분해 활성이 알려져 있다. 따라서 항주름(antiwrinkle) 기능성 화장료 원료의 경우 MMP-9 활성을 저해하는 정도가 클수록 주름 형성에 대한 보호 효과가 크며, 젤라틴(gelatin)과 콜라겐(collagen)을 유지하여 피부의 탄력 등을 개선시킬 수 있다.

자이모그래피( Zymography )

샘플 : 무모쥐(Hairless mouse)에 자외선 방사(UV irradiation)를 통하여 MMPs의 활성을 유도한 후 비단풀 EtOH 70% 추출 농축물을 4주간 도포하고 피부조직을 채취하여 시험에 사용하였다.

- 각각의 샘플을 0.1% 젤라틴이 포함된 10% 폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel)을 사용하여 전기 영동으로 분리

- Gel을 25% Triton X-100이 포함된 재생완충액(renaturating buffer)으로 실온에서 30분간 세척(Washing)

- 30분간 활성화(activation)에서 반응시킨 후 다시 37℃의 성장완충액(developing buffer)에서 15시간 이상 배양(incubation)

- 2% 브릴리안트 블루(brilliant blue), 50% 에탄올(ethanol), 10%

초산 용약(acetic sol.)에 1시간 염색(staining).

- 메탄올 초산 용액(Methanol/acetic sol.) (30:10%)에서 30분간 탈염(destaining).

- DW에 고정.

- 이미징 시스템(Imaging system)을 이용하여 밴드밀도(band density) 측정.

2) 콜라겐 분석(Collagen assay)

샘플 : 무모쥐에 UV 방사를 통하여 MMPs의 활성을 유도한 후 비단풀 EtOH 70% 추출 농축물을 4주간 도포하고 피부조직을 채취하여 시험에 사용하였다.

양성대조군으로 레티놀(Roche 사 제품) 25000IU를 사용하였다.

- 콜라겐 어세이 키트를 사용하여 콜라겐 함량 측정(collagen content determination)

- 동량의 프로틴 용해물(protein lysate)을 콜라겐 염료시제(collagen dye reagent)와 배양

- 반응한 침전물을 0.5 M NaOH에 용해시켜 마이크로플레이트 리더(microplate reader)를 사용하여 540nm에서 OD value 측정

분석결과는 도 9, 10 및 도 11(Expression of MMP-9 in the hairless mouse treated with vehicle. control and test chemical group)의 그래프에 제시하였다.

실험예 4. 비단풀 추출물의 자극성 시험

비단풀 추출물에 대하여 피부 자극성 및 피부에 대한 간이 임상 시험을 통하여 피부 자극 및 자극완화 효과를 시험하였다.

1) 비단풀 추출물의 피부자극성 시험

- 시험방법

피부반응의 평가는 식품의약품안전청고시 제1999-61호 “의약품등의 독성시험기준”에 표시된 피부반응의 평가기준에 따라 실시하였다. 또한 결과에 대한 자극성의 정도판정은 일반적으로 많이 이용되는 드라이즈(Draize)의 일차자극지수(PII, primary irritation index)의 산출방법에 따랐다.

시험결과

비단풀 추출물에 대한 피부자극성을 조사하기 위하여 EtOH 70% 추출 농축물을 정제수에 10% 용해시켜 시험물질을 제조한 후, 6마리의 뉴질랜드 화이트(New Zealand White)계 수컷토끼에 시험물질 0.5 ml을 찰과 및 비찰과부위에 각각 24시간 동안 적용하였다. 72시간의 관찰기간 동안 사망률, 일반증상, 체중변화 및 국소자극성을 평가하였다. 그 결과는 다음과 같다.

1) 시험기간 중 시험물질의 적용에 기인된 사망동물은 관찰되지 않았다.

2) 일반증상 관찰시 시험물질의 적용에 기인된 이상소견은 인정되지 않았다.

3) 체중측정 결과, 시험물질의 적용에 기인된 체중변화는 관찰되지 않았다.

4) 시험물질 도포종료 후 찰과 및 비찰과 부위의 국소자극성을 관찰한 결과, 시험물질의 적용에 의한 어떠한 이상소견도 인정되지 않았다. 따라서 본 시험물질의 1차 자극지수(primary irritation index)는 "0"으로서 무자극성 물질로 평가되었다.

이상의 결과로 보아 New Zealand White계 토끼에 있어서 비단풀 추출물의 피부적용은 찰과 및 비찰과부위에 어떠한 자극성도 유발하지 않는 것으로 나타났으며, 따라서 본 시험물질은 무자극성 물질인 것으로 판단된다.

2) 비단풀 추출물의 자극완화 간이 임상

- 비단풀 추출물을 이용하여 자극완화 간이임상시험을 진행하였다. 그 결과 자극완화 효과가 있음을 확인하였고 향후 화장료 처방에 있어서 민감성 피부용 화장료 개발에 가능성을 확인하였다.

비단풀 추출물 농축 분말을 정제수에 용해시켜 0.1%, 0.5%, 1%, 5%에 대하여 SLS(1.0%) 인체첩포(human patch test)을 이용한 자극완화 효과를 하기와 같은 방법으로 측정하였다. 대조군(control)은 정제수를 처리한 것이다.

도 12의 사진에 나타낸 바와 같이 SLS(1.0%) 인체첩포(human patch test)는 피검자의 양측 상완 내측에 1.0% SLS 용액)(w/v in distilled water)을 첩포 테스트(patch test)용으로 판매되는 첩포(Haye사의 test chambers, 미국)의 사각 챔버(가로 1cm, 세로1cm)에 20ul를 적셔서 24시간 부착하여 인위적으로 자극성 피부염을 유발하고 첩포를 제거하였다. 첩포가 제거된 동일한 위치에 첩포의 사각 챔버에 시료20ul를 적셔서 24시간 다시 부착한 후 첩포를 제거하고 30분 후에 실험부위 피부 반응정도를 평가하였다 (대한화장품학회지, 제30권 제1호, 2004, 63~71).

평가결과는 표 8에 제시된다.

피부 자극 완화 효과평가 기준 판정기준은 국제접촉피부염 연구위원회 (International Contact Dermatitis Research Group;ICDRG)의 다음과 같은 기준에 따랐다 (참조: Wooding et al, 1967; Rietschell, 1982; Fischer ＆ Maibach, 1984; Aberer et al,1993).

(판정기준)

0 = 발적없음

1 = 발적(erythema)

2 = 발적 및 구진(papules)

3 = 발적, 구진 및 소수포(vesicles)

4 = 심한 부종 및 소수포

시험에 사용된 물질은 화장료에 자극완화 물질로 사용되고 있는 추출물을 비단풀 추출물과 비교하였다. 도 11에 나타낸 1번(Control)은 물을 사용하였으며, 2번은 대표적인 자극완화 물질인 마치현추출물, 3번은 감초추출물, 4번은 자극완화 및 항노화(anti-aging)로 화장품에 사용되고 있는 일본 화장품 원료사의 안티에이징 복합 추출물이며 5번은 비단풀 추출물이다.

이상의 결과로 보아 피부 자극완화의 간이 임상에서 비단풀 추출물이 피부 자극완화 효과가 있는 것으로 나타났다.

제형

저자극 및 사용감 개선을 통하여 안티에이징 화장료의 기본 제형으로 로션과 크림을 선택하여 실시하였다.

제조예 1. 로션

표 9에 열거된 바와 같은 조성으로 로션을 제조하였다. 로션 제조에는 유화제, 오일, 항산화제, 보존제를 유상 용해부에서 80~82℃로 가열 용해하여, 일부 첨가물과 용제를 78~80℃로 가열 용해되어진 제조부에 투입하여 호모믹서(HOMO MIXER)를 이용하여 유화 후 40℃까지 냉각, 나머지 첨가제를 넣고 혼합교반, 냉각하는 방법을 이용하였다.

제조된 로션의 안정도 관찰 결과는 표 10 및 도 13의 그래프에 제시하였다.

제조예 2. 크림

표 11에 열거된 바와 같은 조성으로 크림을 제조하였다. 크림제조에는 유화제, 오일, 항산화제, 보존제를 유상 용해부에서 80~82℃로 가열 용해하여, 일부 첨가물과 용제를 78~80℃로 가열 용해되어진 제조부에 투입하여 HOMO MIXER를 이용하여 유화 후 40℃까지 냉각, 나머지 첨가제를 넣고 혼합 교반, 냉각하는 방법을 이용하였다.

제조된 크림의 안정도 관찰결과는 표 12 및 도 14에 제시하였다.

비교실험

본 발명에 따르는 비단풀 추출물과 비교물질의 농도에 따른 세포증식율과 항산화효과(DPPH assay) 측정결과는 표 13 및 표 14에 각각 제시하였다.

Claims

비단풀(Euphorbia supina) 추출물을 유효성분으로 함유하는 주름개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 상기 비단풀(Euphorbia supina) 추출물은 유기용매 추출물인 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
제2항에 있어서, 상기 유기용매는 C₁ _-4 저급 알코올, 염소화탄화수소류 용매, 탄화수소류 용매, 방향족 탄화수소류 용매 및 이들의 혼합용매로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
제2항에 있어서, 상기 유기용매는 에탄올, 메탄올, 메틸렌클로라이드, 클로로포름, 헥산, 헵탄, 벤젠, 톨루엔 및 이들의 혼합용매로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상인 것을 특징으로 하는 주름개선용 화장료 조성물.
제1항에 있어서, 비단풀(Euphorbia supina) 추출물로부터 분리된 이소퀘르시트린(Isoquercitrin)을 유효성분으로 함유하는 주름개선용 화장료 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 화장료 조성물을 포함하는 화장품.
제6항에 있어서, 상기 화장품은 화장수, 에멀젼, 영양로션, 영양크림, 마사지용 로션크림, 세안용 화장품, 팩, 바디용 제품, 유화 메이크업, 연고, 젤, 크림, 패취 및 분무제로 구성된 그룹으로부터 선택되는 제형인 것을 특징으로 하는 화장품.
(a) 비단풀(Euphorbia supina)을 유기용매로 전처리하는 단계; 및
(b) 잔사를 건조시키고 C₁ _-4 저급알코올 용매를 이용하여 추출하는 단계를 포함하는 주름개선용 비단풀 추출물의 제조방법.
제8항에 있어서, 단계(a)의 유기용매는 탄화수소류 용매이고, 단계(b)의 용매는 에탄올 또는 메탄올인 것을 특징으로 하는 주름개선용 비단풀 추출물의 제조방법.
제8항에 있어서, 단계(a)의 유기용매는 헥산이고, 단계(b)의 용매는 에탄올인 것을 특징으로 하는 주름개선용 비단풀 추출물의 제조방법.
제8항에 있어서, 단계(b) 이후 용매로 분획하는 단계(c)를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 주름개선용 비단풀 추출물의 제조방법.
제11항에 있어서, 상기 용매가 헥산, 메틸렌클로라이드, 메틸아세테이트, 에틸아세테이트, 정제수, 메탄올, 에탄올, 부탄올, 1,3-부틸렌글리콜, 프로필렌글리콜, 글리세린 및 벤젠으로 구성된 그룹으로부터 선택되는 1종 이상의 용매인 것을 특징으로 하는 주름개선용 비단풀 추출물의 제조방법.