KR102050351B1

KR102050351B1 - 핑거루트 추출물의 독성 제거방법 및 이 방법에 의하여 독성이 제거된 핑거루트 추출물을 함유하는 피부 항상성 무독성 화장료 조성물

Info

Publication number: KR102050351B1
Application number: KR1020180056567A
Authority: KR
Inventors: 이호규; 이준수
Original assignee: 이호규; 충북대학교 산학협력단
Priority date: 2018-05-17
Filing date: 2018-05-17
Publication date: 2019-12-02
Also published as: KR20190131765A

Abstract

본 발명은 피부세포에 대한 독성이 강한 핑거루트 추출물의 독성을 제거하는 방법과 이 독성 제거방법에 의하여 독성이 제거된 핑거루트 추출물을 함유하여 피부세포의 항상성을 유지시키는 무독성 화장료 조성물을 제공하며, 본 발명에 따라 독성이 제거된 핑거루트 추출물은 판두라틴의 독성으로 인한 피부세포의 기능 저하, 이로 인한 피부노화 및 피부염증을 방지하고, 이를 통해 피부 항상성 무독성 화장료 조성물을 제공하는데 효과적이다.

Description

핑거루트 추출물의 독성 제거방법 및 이 방법에 의하여 독성이 제거된 핑거루트 추출물을 함유하는 피부 항상성 무독성 화장료 조성물{Method for detoxing fingerroot extracts and skin homeostasis and nontoxicity cosmetic compositions containing detoxed fingerroot extracts}

본 발명은 피부 항상성 유지에 도움을 주는 핑거루트 추출물에 관한 것으로, 특히 피부세포에 대한 독성이 강한 핑거루트 추출물의 독성을 제거하는 방법과 이 독성 제거방법에 의하여 독성이 제거된 핑거루트 추출물을 함유하여 피부세포의 항상성을 유지시키는 무독성 화장료 조성물에 관한 것이다.

핑거루트(fingerroot, 학명: Boesenbergia pandurata)는 동남아시아에서 자생하는 생강과의 식물로 피클, 카레, 음료 등 아시아 전통요리뿐만 아니라, 출산을 위한 강장제, 위통, 설사, 헛배부름, 소화불량, 궤양치료제, 백혈구예방제, 비용보조제 등 다양한 용도로 사용되어 왔다.

핑거루트는 소화불량, 위염을 비롯한 헬리코박터 파일로리 박테리아의 감염을 억제하는 플로보노이드 성분을 함유하고 있으며, 세포보호효과가 있는 피노스트로빈 성분이 함유되어 있어 위 점액을 증가시켜 위궤양 형성면적을 감소시킴으로써 소화성궤양 치료에도 효과적이다.

그 외에도 암세포의 성장을 억제할 수 있는 플라보노이드 유도체, 피노셈브린, 피노스트로빈, 일피네틴, 타다모닌, 판두라타, 판두라틴A 등의 성분이 함유되어 있으며, 특히 판두라타(pandurata) 성분은 암세포 성장을 억제하고, 판두라틴A(panduratin A) 성분은 전립선암 및 대장암에 대한 예방효과가 있는 것으로 알려져 있다.

최근, 환경 친화적이고 자연지향적인 추세에 따라 화장품에 사용되는 유효성분들도 화학물질뿐만 아니라 식물 유래의 천연물이 그 유용성을 기반으로 하여, 피부에 부작용이 적은 천연 재료가 여러 가지 형태로 화장품에 배합되어 이용되고 있다.

이에 따라, 핑거루트 추출물 및 판두라타 또는 판두라틴A와 관련한 선행기술로는, 아토피성 피부질환에 효과를 가지는 판두라틴A 또는 보에센베르기아 판두라타 추출물에 대한 연구(한국 공개특허공보 제10-2012-0113201호, 2012.10.12. 공개), 판두라틴 유도체를 함유하는 피부 미백용 화장료 조성물(한국 등록특허공보 제10-0829819호, 2008.05.08. 등록), 보센벌지아 로툰다 추출물을 함유하는 피부 미백 및 항산화 조성물(한국 등록특허공보 제10-1521579호, 2015.05.13. 등록), 판두라틴 에이 또는 그의 유도체의 신규한 용도(한국 등록특허공보 제10-0973221호, 2010.07.26. 등록), 판두라틴 유도체 또는 이를 함유하는 카엠페리아 판두라타 추출물의 신규한 용도(한국 등록특허공보 제10-1088069호, 2011.11.23. 등록), 신규 캘콘 유도체(일본 등록특허공보 제10-3840536호, 2006.08.18. 등록) 등이 있다.

최근 문헌에 의하면, 생강과 식물, 특히 핑거루트의 뿌리에서 추출한 기능성 원료인 판두라틴(Panduratin)은 핑거루트의 뿌리에서 추출한 밝은 황갈색의 분말로서, 식품의약품안전처에서 2013년 건강기능식품의 기능성 원료로 인정되었으며 생리활성기능 2등급을 받은 바 있다.

판두라틴은 핑거루트라는 식물의 뿌리에서 추출한 밝은 황갈색의 분말로서, 식품의약품안전처에서 2013년 건강기능식품의 기능성 원료로 인정(생리활성기능 2등급)되었으며, 자외선에 의한 피부 손상으로부터 피부 건강을 유지하고 체내 에너지 항상성 유지를 위한 센서 단백질인 'AMPK(AMP-activated protein kinase)'를 활성화시켜 체지방을 감소하는데 기여하는 것으로 알려져 있다.

그러나 핑거루트 뿌리 추출분말인 판두라틴은 강한 독성이 있어 사용에 주의를 요한다.

최근, 새로운 소재로서 천연물로부터 유효성분을 추출 정제하는 연구로부터, 단순히 피부보호 차원에서 머물던 화장품이 그 효능에 있어서 피부개선의 범주까지 확대된 기능성 화장품에 대한 수요가 급증하고 있다.

이에, 이미 그 효용성이 검증된 핑거루트 추출물을 이용하여 기능성 화장료 조성물을 제공하는데 있어서 판두라틴의 피부세포에 대한 독성이 큰 걸림돌이 되고 있으며, 이에 따라 핑거루트 추출물의 독성을 제거 또는 완화시킬 수 있는 방안이 시급히 요구된다.

KR 10-2012-0113201 A (2012.10.12. 공개), KR 10-0829819 B1 (2008.05.08. 등록), KR 10-1521579 B1 (2015.05.13. 등록), KR 10-0973221 B1 (2010.07.26. 등록), KR 10-1088069 B1 (2011.11.23. 등록), JP 10-3840536 B1 (2006.08.18. 등록)

본 발명자들은 천연재료를 이용한 복합기능성 화장품에 대한 시장의 요구가 높아짐에 따라 자외선에 의한 피부 손상으로부터 피부 건강을 유지하고 체내 에너지 항상성 유지를 위한 센서 단백질인 'AMPK(AMP-activated protein kinase)'를 활성화시켜 체지방을 감소하는 데 기여할 수 있는 핑거루트 추출물의 주요 성분인 판두라틴의 독성을 제거 및 완화시킬 수 있는 효과적인 독성 제거방법을 밝혀내어 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 핑거루트 추출물의 독성을 효과적으로 제거할 수 있는 방법을 제공하는데 있다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 독성이 제거된 핑거루트 추출물을 함유하는 피부 항상성 무독성 화장료 조성물을 제공하는데 있다.

여기서 본 발명이 해결하고자 하는 기술적 과제 및 목적은 이상에서 언급한 기술적 과제 및 목적으로 국한하지 않으며, 언급하지 않은 또 다른 기술적 과제 및 목적들은 아래의 기재로부터 당업자가 명확하게 이해할 수 있을 것이다.

상술한 목적을 달성하기 위해 본 발명은 핑거루트 추출물의 독성을 제거하는 방법에 있어서, 핑거루트 파우더(Powder)에 에탄올(Ethanol)을 넣고 셰이커(shaker)를 이용하여 24h 동안 실온에서 추출하는 과정; 상기 에탄올 추출물을 필터링하고, 증류수(Water)를 첨가한 후 진공 상태에서 농축하여 에탄올을 제거하는 과정; 및 상기 에탄올이 제거된 농축액을 DMSO(Dimethyl sulfoxide)로 재용해한 후 멸균필터로 여과하여, 섭씨 영하 20도에서 보관하는 과정;으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 핑거루트 추출물의 독성 제거방법을 제공한다.

이때, 본 발명에 따른 핑거루트 추출물의 독성 제거방법은, 상기 에탄올이 제거된 농축액을 DMSO로 재용해하기 전에, 상기 에탄올이 제거된 농축액에 클로로포름(Chloroform)을 넣고 셰이킹(shaking)하여 방치한 뒤 분리 후 하층액을 제거하는 과정; 및 상기 하층액 제거 후, 에틸아세테이트(Ethyl Acetate)를 넣고 셰이킹하여 방치한 뒤 분리 후 하층액을 수집하고, 동결건조하여 파우더 형태로 만드는 과정;을 더 수행 후, 상기 파우더를 DMSO로 재용해하는 것을 특징으로 한다.

상술한 다른 목적을 달성하기 위해 본 발명은 상기 독성 제거방법에 따라 독성이 제거된 핑거루트 추출물을 함유하는 피부 항상성 무독성 화장료 조성물을 제공한다.

이때, 상기 핑거루트 추출물을 함유하는 피부 항상성 무독성 화장료 조성물에 있어서, 상기 핑거루트 추출물의 농도는 0.1-20μg/ml인 것이 바람직하다.

상기와 같이, 본 발명은 핑거루트 추출물의 독성을 효과적으로 제거할 수 있는 방법을 제공한다.

이에 따라, 본 발명에 따라 독성이 제거된 핑거루트 추출물은 판두라틴의 독성으로 인한 피부세포의 기능 저하, 이로 인한 피부노화 및 피부염증을 방지하고, 이를 통해 피부 항상성 무독성 화장료 조성물을 제공하는데 효과적이다.

도 1 내지 도 3은 용매별 핑거루트 추출물의 독성시험 결과를 나타낸 그래프,
도 4 내지 도 6은 용매별 핑거루트 추출물의 UVB 자극에 대한 보호효과를 측정한 결과를 나타낸 그래프,
도 7 및 도 8은 0.5 및 1 μg/ml의 농도에서 용매별 핑거루트 추출물의 UVB 자극에 대한 보호효과를 대비한 그래프,
도 9 및 도 10은 핑거루트 에탄올 추출물의 각 분획물의 농도에 따른 세포독성 시험 결과를 나타낸 그래프,
도 11 및 도 12는 핑거루트 에탄올 추출물의 각 분획물의 농도에 따른 UVB조사에 대한 세포 보호효과 시험 결과를 나타낸 그래프,
도 13은 핑거루트 에탄올 추출물의 물 분획물의 세포독성 시험 그래프
도 14는 핑거루트 에탄올 추출물의 물 분획물의 세포 보호효과 시험 그래프,
도 15는 핑거루트 에탄올 추출물의 물 분획물 1-20μg/ml 의 농도에서 세포독성 시험 그래프,
도 16은 핑거루트 에탄올 추출물의 물 분획물 1-20μg/ml 의 농도에서 세포 보호효과를 평가한 그래프,
도 17은 핑거루트 에탄올 추출물의 물 분획물 1-20μg/ml 의 농도에 따른 콜라겐 양의 변화를 나타낸 그래프,
도 18은 핑거루트 에탄올 추출물의 물 분획물 1-20μg/ml 의 농도에 따른 UVB조사시 MMP-1 생성량 측정 결과를 나타낸 그래프,
도 19는 핑거루트 에탄올 추출물의 물 분획물 1-20μg/ml 의 농도에 따른 UVB조사시 MMP-3 생성량 측정 결과를 나타낸 그래프,
도 20은 핑거루트 에탄올 추출물의 물 분획물 1-20μg/ml 의 농도에 따른 활성산소종(Reactive Oxygen Species, ROS) 생성을 측정하기 위한 형광 강도 측정 그래프.

이하 본 발명의 바람직한 실시 예들의 상세한 설명이 첨부된 도면들을 참조하여 설명될 것이다. 하기 설명에서 구체적인 특정 사항들이 나타나고 있는데, 이는 본 발명의 보다 전반적인 이해를 돕기 위해 제공된 것일 뿐, 본 발명을 특정한 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 그리고 본 발명을 설명함에 있어, 관련된 공지 기능 혹은 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.

다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가진 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.

본 발명의 상세한 설명에서 사용되는 용어 "추출물(extract)"이란 천연물로부터 분리된 활성성분 즉, 목적하는 활성을 보이는 물질을 의미한다. 상기 추출물은 물, 유기용매 또는 이들의 혼합용매를 이용하는 추출 과정으로 획득할 수 있으며, 추출물 이의 건조 분말 또는 이를 이용하여 제형화된 모든 형태를 포함한다. 또한, 상기 추출물에는 상기 추출 과정을 거친 추출물을 분획한 것도 포함된다.

먼저, 본 발명에 따른 핑거루트 추출물로부터 독성을 제거하기에 앞서 용매별 추출물의 독성을 확인하고, UVB(Ultra Violet B)로 손상이 유도된 피부세포에서 핑거루트 추출물의 광노화 보호효과를 확인하기 위하여, 하기와 같이 각종 용매에 대하여 핑거루트 추출물을 제조하였다.

<핑거루트 추출물 제조>

본 발명에 사용되는 핑거루트 추출물은 파우더 형상의 핑거루트 중 5g을 취한 후, 용매별로 핵산(hexane), 클로로포름(chloroform), 에틸아세테이트(ethyl acetate), 에탄올(ethanol), 메탄올(methanol) 및 물(water) 100ml을 각각 넣고 셰이커(shaker)를 이용하여 24h 동안 실온에서 추출하였다. 필터(Whatman No.2 filter paper)를 이용하여 필터링한 후 용매별 추출물을 진공 상태에서 농축하였다. 농축액을 DMSO(dimethyl sulfoxide, 다이메틸 설폭사이드)로 재용해한 후 0.22um 멸균필터로 여과하고, 분석 전까지 －20℃에서 보관하였다. 물 추출물은 필터링한 후 동결건조하여 파우더를 50% DMSO에 재용해한 후 멸균필터로 여과하여 사용하였다.

도 1 내지 도 3은 용매별 핑거루트 추출물의 독성시험 결과를 나타낸 것이다. 시험에 사용한 AsA는 양성대조군(positive control)으로 아스코르브산(ascorbic acid, Vit.C)을 표기한 것이다.

도 1 내지 도 3은 핵산(hexane, H), 클로로포름(chloroform, Ch), 에틸아세테이트(ethyl acetate, EA), 에탄올(ethanol, Et), 메탄올(methanol, Me) 및 물(water, W)을 각각 용매로 한 추출물을 0.1, 0.5, 1, 5 μg/ml 농도로 피부세포 Hs68를 처리한 결과로서, 물 추출물을 제외한 나머지 추출물들 5μg/ml에서 모두 높은 독성이 나타났다.

다음으로, UVB 자극에 대한 세포 보호효과를 측정하기 위해 세포독성을 측정할 때와 같은 농도로 처리하여 용매별 핑거루트 추출물의 UVB 자극에 대한 세포 보호효과를 측정한 실험 결과를 도 4 내지 도 6에 나타내었다. 도 4 내지 도 6에 나타난 바와 같이, 에탄올과 메탄올을 제외한 나머지 시료에선 세포 보호효과가 뚜렷하게 나타나지 않았다.

따라서 핑거루트 추출물의 독성을 제거하고 활성을 유지하기 위한 본 발명의 목적에 따라, 메탄올 추출물은 제외하고 활성이 좋고 식품이나 화장품에 사용이 가능한 에탄올 추출물을 가지고 이하의 실험을 진행하였다.

도 7 및 도 8은 용매별 핑거루트 추출물의 UVB 자극에 대한 세포 보호효과를 대비하기 위하여 0.5 및 1 μg/ml의 농도에 대하여 실험한 결과를 함께 나타낸 그래프이다. 도 7 및 도 8에 도시된 바와 같이, UVB자극에 대한 세포 보호효과 실험결과, 에탄올 추출물에서 효과가 가장 좋게 나타났으며, 1μg/ml보다 0.5μg/ml에서 보호효과가 유의적으로 증가하였다.

전술한 실험 결과, 핑거루트 에탄올 추출물의 UVB에 대한 세포 보호효과가 가장 높게 나타났으므로, 다음 단계에서 핑거루트 에탄올 추출물의 독성을 낮추고 활성은 유지하는 분획물을 찾고자 하였다. 따라서 에탄올 추출물을 용매의 극성에 따라 에탄올, 클로로포름, 에틸아세테이트, 물 순으로 분획물을 제조하였다. 하기에서 핑거루트 추출물의 분획물 제조방법을 상세히 설명한다.

<핑거루트 추출물의 분획물 제조>

파우더 형상의 핑거루트 100g을 취하여 에탄올 1L를 넣고 셰이커를 이용하여 24h 동안 실온에서 추출하였다. 필터(Whatman No.2 filter paper)를 이용하여 필터링한 후 1L 중 100ml를 취하여 증류수를 200ml 첨가하였다. 핑거루트 에탄올 추출물과 증류수의 혼합물을 진공 상태에서 농축하여 에탄올을 모두 날린 후 분액깔대기에 옮겼다. 여기에 클로로포름 총 2L를 넣고 충분히 셰이킹(shaking)하여 방치한 뒤 분리시켰고 하층액을 수집하여 농축하였다.

클로로포름 분획 후에는 에틸아세테이트 총 1L를 넣고 충분히 셰이킹하여 방치한 뒤 분리하여 상층액을 수집하여 농축하였다. 에틸아세테이트를 제거하고 남은 물층은 동결건조하여 파우더 형태로 만들었다. 농축액과 파우더는 모두 DMSO로 재용해한 후 이어서 0.22um 멸균필터로 여과하고, 분석 전까지 －20℃에서 보관하였다.

상기와 같이 에탄올, 클로로포름, 에틸아세테이트, 물로 분획된 핑거루트 에탄올 추출물에 대한 세포독성 실험을 실시하였다. 실시한 세포배양 및 세포독성 실험은 다음과 같다.

세포독성 실험에 사용된 인체 피부 섬유아세포주인 Hs68세포는 ATCC(American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA)에서 구입하였다. 10% FBS와 페니실린(penicillin, 100unit/ml), 스트렙토마이신(streptomycin, 50μg/ml)이 함유된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium)배지를 사용하여 37℃, 5% 이산화탄소(CO₂) 및 95% 습공기(humid air)로 조절된 배양기(Thermo Scientific, Tewksbury, MA, USA)에서 배양하였다. Hs68세포를 96-well plate에 1.0Х104cells/well의 농도로 분주하여 24h 배양 후 배지를 샘플이 함유되고, FBS가 함유되지 않은 배지로 교체하였다. 24h 시료 처리 후 MTT(1 mg/ml)용액 20uL를 각 well에 첨가하고, 2h 동안 배양하였다. 마지막으로 상층액을 제거하고, 생존세포에서 생성된 청색 포르마잔(formazan)결정을 DMSO로 가용화 시켜 Microplate reader(BioTek, Inc., Winooski, VT,USA)를 사용하여 550nm에서의 흡광도를 측정하였다. 시료처리 시에는 DMSO의 최종 농도가 0.1%(v/v) 미만이 되도록 샘플을 배지로 희석하여 사용하였다.

핑거루트 에탄올 추출물의 각 분획물의 농도에 따른 세포독성을 평가하기 위해 hs68세포에 0.1, 0.5, 1, 5 μg/ml를 처리하였다. 농도별로 처리한 결과, 도 9 및 도 10에 나타낸 바와 같이, 물 분획물을 제외한 나머지 분획물의 5μg/ml에서 모두 세포독성을 나타냈다. 도 9 및 도 10은 핑거루트 에탄올 추출물의 각 분획물의 농도에 따른 세포독성 실험결과를 나타낸 그래프이다.

Hs68세포를 96-well plate에 1.0Х104cells/well의 농도로 분주하여 24h 동안 배양한 후, 각 well에 FBS가 없는 배지로 샘플을 희석한 후 처리하여 24h 동안 배양하였다. 그 후 UVB램프(Sankyo Denki Lamps, GL20SE, Marine, Japan)를 이용하여 UVB(30 mJ/cm²)를 조사하였고, UV LIGHT METER(LT Lutron, UV-340A, Taiwan)를 사용하여 자외선 강도를 모니터링 하였다. 모든 UVB 조사는 96-well plate에 부착된 세포에 PBS를 얇게 도포한 후 수행하였다. 조사 후 FBS가 없는 배지에서 샘플을 희석하여 24h 동안 세포에 처리하였다. 대조군은 UVB 조사 없이 동일한 조건으로 진행되었다.

핑거루트 에탄올 추출물의 각 분획물에 대한 UVB조사에 대한 세포 보호효과를 평가하기 위하여 세포에 UVB조사 전 후에 각 용매별 추출물을 0.1, 0.5, 1, 5 μg/ml 농도로 처리하였다. 그 결과, 도 11 및 도 12에 나타낸 바와 같이 물 분획물만이 5 μg/ml까지 독성 없이 보호효과 활성이 유지되었다.

따라서 핑거루트 에탄올 추출물의 물 분획물을 선택하여 농도별(1, 5, 25, 50 μg/ml) 세포독성과 UVB에 대한 세포 보호효과를 측정하였다. 도 13에 나타난 바와 같이 세포독성의 경우 25μg/ml까지 세포독성을 나타내지 않았으나, 50μg/ml에서 세포 생존율이 86%로 감소하여 독성을 나타내는 것으로 판단하였다. 한편, 세포 보호효과의 경우, 도 14에 나타난 바와 같이 5μg/ml, 25μg/ml에서 세포 보호효과를 나타내었다. 세포독성 시험 그래프 및 세포 보호효과 시험 그래프를 각각 도 13 및 도 14에 나타내었다.

위 시험결과, 핑거루트 에탄올 추출물의 물 분획물 25μg/ml에서 세포생존율이 약간 감소하는 경향을 보였으므로, 샘플 처리시 농도의존적으로 증가하는 이상적인 결과를 도출하기 위하여 최고농도를 20μg/ml으로 설정하였다.

핑거루트 에탄올 추출물의 물 분획물 1-20μg/ml 의 세포독성 및 UVB에 대한 세포 보호효과를 측정한 결과, 20μg/ml까지 독성을 나타내지 않았고(도 15 참조), UVB에 의해 감소된 세포생존율을 농도의존적으로 증가시켰다(도 16 참조).

한편, UVB 조사는 세포의 콜라겐 생성을 감소시킨다. 따라서 핑거루트 추출물의 물 분획물이 세포 내 콜라겐 양에 미치는 영향을 측정하였다. 실험방법은 하기와 같다.

<MMP-1, MMP-3 및 수용성 콜라겐 생성량 측정>

UVB 조사에 의해 합성이 증가되는 MMP-1과 MMP-3의 측정은 human MMP-1, MMP-3 ELISA kit(Merck & Co. Inc., Whitehouse Station, NJ, USA)를 이용하여 enzyme-linked immunosorbent assay 방법으로 배지 중의 pro-MMP-1과 MMP-3의 생성량을 측정하였다. UVB 조사 후 수용성 콜라겐 생성량은 SircolTM soluble collagen assay kit를 사용하여 측정하였다. 세포를 배양한 배지를 수집하여 Sirco dye reagent와 혼합, 반응하여 원심분리 후 차가운 acid-salt washing reagent을 침전물에 첨가하여 혼합하였다. 혼합물을 원심분리한 후 침전물을 alkali reagent를 사용하여 용해시키고, 555 nm에서 흡광도를 측정하였다.

실험결과, UVB는 세포 내 콜라겐 양을 감소시켰고, 1μg/ml부터 20μg/ml까지 물 분획물 처리시 그 농도가 증가함에 따라 콜라겐 수준이 농도의존적으로 증가하였다. 시험결과를 도 17에 나타내었다.

이때, UVB 조사는 피부에 가장 많이 존재하는 단백질인 Type 1 콜라겐을 분해하는 효소인 MMP-1(Matrix MetalloProtease)의 생성을 증가시켜 콜라겐의 분해를 촉진한다. 따라서 MMP-1 생성에 미치는 핑거루트 추출물의 물 분획물의 영향을 전술한 방법으로 평가하였다. 그 결과, 도 18에 나타낸 바와 같이 UVB조사시 MMP-1 생성이 증가하였고, 물 분획물 처리시 1μg/ml부터 20μg/ml까지 농도가 증가함에 따라 MMP-1생성이 감소하였다.

또한, MMP-3는 MMP-1을 활성화시켜 콜라겐의 분해를 촉진하므로, MMP-1과 동일한 방법으로 MMP-3 생성량을 측정하였다. 실험결과, UVB조사시 MMP-3 생성이 증가하였고, 물 분획물 처리시 1μg/ml부터 20μg/ml까지 농도가 증가함에 따라 MMP-3생성이 감소하였다(도 19참조).

또한, UVB 조사는 세포 내 Reactive oxygen species(ROS, 활성산소종)의 생성을 촉진시킨다. 이러한 비정상적인 활성산소종의 증가는 산화적 스트레스를 유발하고 진피 섬유아세포(fibroblast)에서 MMPs을 유도하여 피부노화를 촉진한다. 따라서 핑거루트 추출물의 물 분획물의 ROS 생성에 미치는 영향을 평가하였다. 실험방법은 하기와 같다.

활성산소(Reactive Oxygen Species, ROS) 생성을 측정하기 위해 Hs68 세포에 샘플을 24h 동안 전처리하고, PBS로 세척한 후 세포를 UVB(30 mJ/cm²)로 조사하였다. UVB 조사 후 세포에 샘플을 30분간 처리한 후 25uM의 DCFH-DA로 염색하였다. 세포 내 ROS 생성에 해당하는 형광 강도는 485nm의 여기 파장 및 530nm의 방출 파장에서 2시간 동안 fluorescent spectrophotometer (Perkin-Elmer, Norwalk, CT, USA)로 측정하였다.

실험결과, 도 20에 나타낸 바와 같이 UVB조사는 세포 내 ROS의 생성을 증가시켰으며, 물 분획물 처리시 농도의존적으로 ROS 생성을 감소시켰다. 도 20은 핑거루트 에탄올 추출물의 물 분획물 1-20μg/ml의 농도에 따른 ROS 활성산소(Reactive Oxygen Species, ROS) 생성을 측정하기 위한 형광 강도 측정 그래프이다.

전술한 바와 같이, 본 발명에 따른 핑거루트 추출물의 독성 제거방법은 핑거루트 추출물의 독성을 효과적으로 제거함으로써, 독성 및 자극성으로 인하여 피부에 머무르는 시간을 최소화 해야 하고, 내성을 발생시켰던 문제를 해결하여 세포독성 및 자극성이 없이 안전하게 피부 항상성을 유지시킬 수 있다.

또한, 본 발명에 따라 독성이 제거된 핑거루트 추출물은 20 μg/ml까지 독성을 나타내지 않고, UVB에 의해 감소된 세포 생존율을 농도의존적으로 증가시키며, UVB조사에 의한 세포 내 콜라겐 양, MMP-1 및 MMP-3과, ROS를 농도의존적으로 감소시킴으로써, 판두라틴의 독성으로 인한 피부세포의 기능 저하, 이로 인한 피부노화 및 피부염증을 방지하고, 이를 통해 피부 항상성 무독성 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명에 따른 피부 항상성 무독성 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 피부과학적으로 허용 가능한 매질 또는 기제를 함유함으로써 피부과학 분야에서 통상적으로 사용되는 국소적용 또는 전신 적용할 수 있는 보조제 형태로 제조될 수도 있다.

적합한 화장료 조성물의 제형으로는 예를 들면 용액, 겔, 고체 또는 반죽 무수 생성물, 수상에 유상을 분산시켜 얻은 에멀젼, 현탁액, 마이크로에멀젼, 마이크로캡슐, 미세과립구 또는 이온형(리포좀), 비이온형의 소낭 분산제의 형태, 크림, 스킨, 로션, 파우더, 연고, 스프레이 또는 콘실 스틱(conceal stick)의 형태로 제공될 수 있다. 또한, 포말(foam)의 형태 또는 압축된 추진제를 더 함유한 에어로졸 조성물의 형태로도 제조될 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는 이에 한정되는 것은 아니나, 마스크팩, 스킨로션, 스킨 소프너, 스킨토너, 스프레이, 수렴화장수, 유연화장수, 영양화장수, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스처 로션, 영양로션, 바디크림, 마사지크림, 영양크림, 마사지 크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 에센스, 아이크림, 영양에센스, 팩, 비누, 샴푸, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션, 바디클렌저, 트리트먼트, 미용액, 유액, 프레스파우더, 루스파우더, 아이섀도 등의 제형을 포함한다.

한편, 본 발명의 상세한 설명에서는 구체적인 실시 예에 관해 설명하였으나, 본 발명의 범위에서 벗어나지 않는 한도 내에서 여러 가지 변형이 가능함은 물론이다. 그러므로 본 발명의 범위는 설명된 실시 예에 국한되어 정해져서는 안되며 후술하는 특허청구의 범위뿐 아니라 이 특허청구의 범위와 균등한 것들에 의해서 정해져야 한다.

이상 살펴본 바와 같이, 본 발명은 핑거루트 추출물의 독성 제거방법 및 독성이 제거된 핑거루트 추출물을 함유하는 피부 항상성 무독성 화장료 조성물을 제공하며, 본 발명에 따라 독성이 제거된 핑거루트 추출물은 항산화, 무독성 활성 및 염증억제 활성이 우수하여 피부 항상성 제품 제조에 효과적이어서 산업상 이용가능성이 높다.

Claims

핑거루트 추출물의 독성을 제거하는 방법에 있어서,
핑거루트 파우더(Powder)에 에탄올(Ethanol)을 넣고 셰이커(shaker)를 이용하여 24h 동안 실온에서 추출하는 과정;
상기 에탄올 추출물을 필터링하고, 증류수(Water)를 첨가한 후 진공 상태에서 농축하여 에탄올을 제거하는 과정;
상기 에탄올이 제거된 농축액에 클로로포름(Chloroform)을 넣고 셰이킹(shaking)하여 방치한 뒤 분리 후 하층액을 제거하는 과정;
상기 하층액 제거 후, 에틸아세테이트(Ethyl Acetate)를 넣고 셰이킹하여 방치한 뒤 분리 후 하층액을 수집하고, 동결건조하여 파우더 형태로 만드는 과정; 및
상기 동결건조된 파우더를 DMSO(Dimethyl sulfoxide)로 재용해한 후 멸균필터로 여과하여, 섭씨 영하 20도에서 보관하는 과정;으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 핑거루트 추출물의 독성 제거방법.
삭제
제 1항의 독성 제거방법에 따라 독성이 제거된 핑거루트 추출물을 함유하는 피부 항상성 무독성 화장료 조성물.
제 3항에 있어서,
상기 핑거루트 추출물의 농도는 0.1-20μg/ml인 것을 특징으로 하는 핑거루트 추출물을 함유하는 피부 항상성 무독성 화장료 조성물.