KR20110100679A - Ｓｙｋ 키나아제의 억제제로서 피리미딘카르복사미드 유도체 - Google Patents

Ｓｙｋ 키나아제의 억제제로서 피리미딘카르복사미드 유도체 Download PDF

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Abstract

하기 화학식(I)의 화합물 또는 이의 염, 바람직하게는 이의 약제학적으로 허용되는 염은 비장 티로신 키나아제(Syk)의 억제제이므로 부적절한 비만 세포 활성화로부터 초래된 질병, 예를 들어 알레르기 및 염증 질환을 치료하는데 잠재적으로 사용되며, 또한 암 치료, 특히 헴 악성종양 치료에 잠재적인 용도를 지닌다:

Description

ＳＹＫ 키나아제의 억제제로서 피리미딘카르복사미드 유도체 {PYRIMIDINECARBOXAMIDE DERIVATIVES AS INHIBITORS OF SYK KINASE}
본 발명은 비장 티로신 키나아제(Syk 키나아제)에 대해 활성을 지니는 신규한 화학적 화합물, 이의 제조방법, 이를 함유하는 약제학적으로 허용되는 제형 및 치료에서의 이의 용도에 관한 것이다.
Syk 키나아제는 증식, 분화 및 포식작용을 포함하는, 다양한 세포 반응을 매개하는 시그널 다운스트림 사건에 활성화된 면역수용체를 커플링하는데 관여하는 비-수용체 티로신 키나아제이다. Syk 키나아제는 조혈 세포로서 널리 표현된다. Syk 키나아제 억제제는 잠재적인 항염증 및 면역조절 활성을 지닌다. 이들은 Syk 키나아제-매개된 IgG Fc 엡실론 및 감마 수용체 및 BCR 수용체 시그널링을 억제하여, 비만 세포, 포식세포, 및 B-세포의 활성화 및 관련 염증 반응과 조직 손상을 억제한다. 따라서, Syk 키나아제 억제제는 류마티스 관절염, B-세포 림프종 및 천식/비염의 치료를 포함하는, 다수의 치료 분야에서 매력적인 관심사이다.
류마티스 관절염 (RA)은 개체의 대략 1%에 영향을 주는 자가면역 질환이다. 이것은 뼈와 연골이 약해져 파괴되는 관절의 염증을 특징으로 한다. 가역적인 B 세포 고갈을 야기하는 리툭시맙(Rituximab)을 이용한 최근의 임상 연구는 (J. CW. Edwards et al 2004, New Eng. J. Med. 350: 2572-2581), B 세포 기능을 표적화하는 것이 RA와 같은 자가면역 질환에서 적절한 치료적 전략임을 제시하였다. 임상적 이익은 자가-반응성 항체 (또는 류마티스 인자)의 감소와 관련이 있는데, 이러한 연구들은 B 세포 기능 및 실제로 자가-항체 생성이 질환의 진행성 병리의 핵심이라고 제안한다.
Syk 키나아제 결핍 마우스로부터의 세포를 이용한 연구는, B 세포 기능에서의 이러한 키나아제의 논-리던던트(non-redundant) 역할을 입증하였다. Syk 키나아제의 결핍은 B 세포 발생의 차단이라는 특징이 있다 (M. Turner et al 1995 Nature 379: 298-302 and Cheng et al 1995, Nature 378: 303-306). 이러한 연구들은, Syk 키나아제가 결핍된 성숙한 B 세포에 대한 연구와 함께 (Kurasaki et al 2000, Immunol. Rev. 176:19-29), Syk 키나아제가 B 세포의 분화 및 활성화에 필요함을 입증하였다. 따라서, RA 환자에서 Syk 키나아제의 억제는 B 세포 기능을 차단하고 류마티스 인자 생성을 감소시킬 것으로 여겨진다. RA의 치료와 관련하여, B 세포 기능에서의 Syk 키나아제의 역할에 추가하여, Fc 수용체 (FcR) 시그널링에 Syk 키나아제 활성이 요구된다. RA에서 면역 복합체에 의한 FcR 활성화는 다수의 프로-염증 매개체의 방출에 기여하는 것으로 제안되었다.
RA의 병리에 대한 Syk 키나아제 의존적인 공정의 기여도가 왕 등(Wong et al, 2004, ibid)에 의해 검토되었다. Syk 키나아제 억제제 R788 (포스타마티닙 이나트륨, Rigel)에 대한 12주 임상 시험의 결과가 공개되었다: [Treatment of rheumatoid arthritis with a syk kinase inhibitor: A twelve-week, randomized, placebo-controlled trial, Arthritis & Rheumatis, 58(11), 2008, 3309-3318].
Syk 억제제는 또한 암 치료, 구체적으로 헴(heme) 악성종양, 특히 난포 (FL), 외투 세포, 버킷 및 미만성 큰 B 세포 (DLBCL) 림프종을 포함하는 비호지킨 림프종(Non- Hodgkin's Lymphomas)의 치료에 유용할 수 있다.
연구들로부터, 다양한 일차 B-림프종 종양 및 또한 B-림프종 세포주에서 Syk가 과발현 및/또는 항시적 활성화에 의해 이상조절되는 것으로 밝혀졌다. Syk는 PI3K/AKT 경로, PLD 경로 및 AKT 독립적인 시그널링을 통해 mTOR (라파마이신의 포유동물 표적)를 활성화시키는데, 이것은 다시 B-세포 생존 및 증식을 증가시킨다. 시험관내에서 Syk의 억제는 감소된 mTOR 활성화 및 FL 세포에서 간대성(clonicity)의 감소를 초래한다. B 림프종의 뮤린 모델에서 (BKS-2) 쿠르쿠민을 이용한 Syk 키나아제의 억제는 총 비 세포(splenocyte) 수에 의해 측정되는 종양 부담의 현저한 감소를 야기하였다 (Leseux L. et al. Blood 15 Dec 2006, Vol 108, No 13 pp 4156-4162 and Gururajan M. et al. Journal of Immunology, 2007, 178 pp 111-121).
재발성 또는 무반응성 B-세포 비호지킨 림프종 (NHL) 환자에서 R788 (포스타마티닙 이나트륨)의 2상 임상 시험 결과, 상기 화합물이 이러한 환자에 의해 잘-관용될 뿐 아니라 미만성 큰 B 세포 림프종 (DLBCL) 및 만성 림프성 백혈병/소림프성 백혈병 (CLL/SLL) 환자에서 치료적 이익을 나타내었다. 상기 임상에 등록된 환자가 진행된 질병 환자이고 시판되는 치료제를 이용한 치료에 실패했었다는 사실에도 불구하고, 이들 중 상당수가 R788을 이용한 Syk 억제에 특히 반응성이었다 (www.Rigel.com).
Syk 억제제는 또한 천식과 비염 치료에 유용할 수 있는데, 그 이유는 이들이 FcεR1 및/또는 FcγR1 수용체를 가교시키는 것과 관련된 다운스트림 세포의 시그널을 변환시키는데 중요하고, 시그널링 캐스캐이드의 초기에 정위되기 때문이다. 예를 들어, 비만 세포에서, 수용체-IgE 복합체의 알레르겐 가교 이후에 FcεR1 시그널링의 초기 서열은 처음 Lyn (Src 패밀리 티로신 키나아제) 다음에 Syk 키나아제를 포함한다.
알레르기 비염 및 천식은 비만 세포, 호산구, T 세포 및 가지 세포를 포함하는 다수의 세포 유형을 포괄하는 염증 사건 및 과민 반응과 관련된 질병이다. 알레르겐에 노출 후, IgE (FcεR1) 및 IgG (FcγR1)에 대한 고 친화성 면역글로불린 수용체가 가교되고 비만 세포 및 다른 세포 유형에서 다운스트림 공정을 활성화시켜 프로-염증 매개체 및 기도 스파스모겐(spasmogen)을 방출시킨다. 비만 세포에서, 예를 들어, 알레르겐에 의한 IgE 수용체 가교는 미리-형성된 과립으로부터 히스타민을 포함하는 매개체를 방출시킬 뿐만 아니라 프로스타글란딘 및 류코트리엔을 포함하는 지질 매개체를 합성하고 새롭게 합성된 지질 매개체를 방출시킨다.
알레르기 비염의 치료를 위한 I/II 상 연구에서 비내로 투여된 Syk 키나아제 억제제 R112 (Rigel)는 알레르기 콧물의 개선과 고도로 관련되며 지시자의 범위를 가로질러 안전한 중요한 면역 매개체인 PGD2를 통계적으로 현저히 감소시키는 것으로 나타났고, 이에 따라 국소적 Syk 키나아제 억제제의 임상적 안전성 및 효능에 대한 첫 번째 증거를 제공하였다 (Meltzer, EIi O.; Berkowitz, Robert B.; Grossbard, Elliott B). 비내 Syk 키나아제 억제제 (R112)는 공원 환경에서 계절성 알레르기 비염의 증상을 개선시켰다 (Journal of Allergy and Clinical Immunology (2005), 115(4), 791-796). 그러나, 알레르기 비염에 대한 추가의 II 상 임상 연구에서, R112는 플라세보에 비해 효능이 부족한 것으로 나타났다 (Clinical Trials.gov Identifier NCT0015089).
EP1184376B1/WO200007513 및 EP1054004/WO9903101073 (Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd)는 Syk 억제 활성을 지니는 신규한 헤테로시클릭 카르복사미드 유도체를 개시한다. 이들은 문헌["Synthetic studies on novel Syk Inhibitors. Part 1: Synthesis and structure-activity relationships of 5-pyrimidine-5-carboaxamidr derivatives (H. Hisamichi et al, Bioorg Med Chem 13 (2005) 4936 - 4951)]에 추가로 개시되어 있다. 특히, 바람직한 화합물이 하기 화학식(A)의 화합물임은 상기 논문으로부터 자명할 것이다:
Figure pct00001
WO9903101073호는 에틸렌 디아민 부분이 시스-1,2-디아미노시클로헥실로 대체된 세트를 포함하는, 더 넓은 범위의 유사체를 기술한다.
WO 04/035604호는 인간 Syk 단백질의 구조적 코-오디네이트를 개시한다.
그러나, Syk 키나아제의 억제제인 추가의 화합물을 동정할 필요성이 남아있다.
따라서, 첫 번째 발명의 양태에서, 본 발명은 하기 화학식(I)의 화합물 또는 이의 염, 바람직하게는 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다:
Figure pct00002
화학식(I)의 화합물은:
2-{[(3R,4R)-3-아미노테트라히드로-2H-피란-4-일]아미노}-4-[(4-메틸페닐)아미노]-5-피리미딘카르복사미드의 화학적 명칭을 지닌다.
본 발명의 화합물은 Syk의 억제제로서 유용하다. 본 발명의 화합물은 또한 다른 중요한 키나아제, 특히 키나아제 VEGFR2 및 오로라(Aurora) B에 비해 Syk 키나아제에 대해, 예를 들어 적어도 10x의 선택성 (효소에 대한 pKi 또는 pIC50 값에 기초하여)을 나타낸다. 또한 본 발명의 화합물은 잠재적인 심장 독성의 중요한 측정법인 hERG 검정에서 낮은 활성을 나타낸다.
따라서, 본 발명의 화합물은 일부 암 치료, 특히 헴 악성종양 뿐만 아니라 B 세포 및/또는 활성화된 포식세포를 수반하는 염증 질환, 및 또한 부적절한 비만 세포 활성화로부터 초래된 질환, 예를 들어 알레르기 및 염증 질환을 치료하는데 잠재적인 용도를 지닌다.
본 명세서에서 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는"은 합리적인 이익/위험 비에 상응하는, 과도한 독성, 자극, 또는 다른 문제나 합병증 없이 타당한 의학적 판단의 범위 내에서 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기에 적합한 화합물, 물질, 조성물, 및 투여 형태를 지칭한다. 당업자는 본 발명의 화합물의 약제학적으로 허용되는 염이 제조될 수 있음을 인지할 것이다.
본 명세서에서 사용된 용어 "약제학적으로 허용되는 염"은 대상 화합물의 요망되는 생물학적 활성을 보유하고 바라지 않는 최소의 독성 효과를 나타내는 염을 지칭한다. 이러한 약제학적으로 허용되는 염은 화합물의 최종 분리 및 정제 동안, 또는 정제된 화합물을 이의 유리 산 또는 유리 염기 형태로 적합한 염기 또는 산과 각각 분리하여 반응시킴에 의해 동일반응계내에서 제조될 수 있다. 실제로, 본 발명의 특정 구체예에서, 약제학적으로 허용되는 염은 개개 유리 염기 또는 유리 산에 비해 우선시될 수 있는데, 그 이유는 그러한 염이 분자에 더 큰 안정성 또는 용해성을 부여함으로써 투여 형태로의 제형화를 촉진시키기 때문이다.
화학식(I)의 화합물은 따라서 일반적으로 적합한 산으로의 처리에 의해 약제학적으로 허용되는 산 부가염을 형성할 수 있다. 적합한 산으로는 약제학적으로 허용되는 무기산 및 약제학적으로 허용되는 유기산이 있다. 대표적인 약제학적으로 허용되는 산 부가염으로는 히드로클로라이드, 히드로브로마이드, 니트레이트, 메틸니트레이트, 설페이트, 바이설페이트, 설파메이트, 포스페이트, 아세테이트, 히드록시아세테이트, 페닐아세테이트, 프로피오네이트, 부티레이트, 이소부티레이트, 발레레이트, 말레에이트, 히드록시말레에이트, 아크릴레이트, 푸마레이트, 말레이트, 타르트레이트, 시트레이트, 살리실레이트, p-아미노살리시클레이트, 글리콜레이트, 락테이트, 헵타노에이트, 프탈레이트, 옥살레이트, 숙시네이트, 벤조에이트, o-아세톡시벤조에이트, 클로로벤조에이트, 메틸벤조에이트, 디니트로벤조에이트, 히드록시벤조에이트, 메톡시벤조에이트, 만델레이트, 탄네이트, 포르메이트, 스테아레이트, 아스코르베이트, 팔미테이트, 올레에이트, 피루베이트, 파모에이트, 말로네이트, 라우레이트, 글루타레이트, 글루타메이트, 에스톨레이트, 메탄설포네이트(메실레이트), 에탄설포네이트(에실레이트), 2-히드록시에탄설포네이트, 벤젠설포네이트(베실레이트), p-아미노벤젠설포네이트, p-톨루엔설포네이트(토실레이트), 및 나프탈렌-2-설포네이트가 있다.
본 발명의 화합물은 고체 또는 액체 형태로 존재할 수 있다. 고체 상태에서, 본 발명의 화합물은 결정질 또는 비결정질 (무정형) 형태, 또는 이들의 혼합로서 존재할 수 있다. 본 발명의 화합물이 결정질 형태로 존재하는 경우, 당업자는 용매 분자가 결정화 동안 결정 격자에 혼입된 약제학적으로 허용되는 용매화물이 형성될 수 있음을 인지할 것이다. 용매화물은 비-수성 용매, 예를 들어 비제한적으로 에탄올, 이소프로판올, n-부탄올, i-부탄올, 아세톤, 테트라히드로푸란, 디옥산, DMSO, 아세트산, 에탄올아민, 및 에틸 아세테이트를 포함할 수 있거나, 결정 격자로 혼입되는 용매로서 물을 포함할 수 있다. 결정 격자로 혼입된 용매가 물인 용매화물은 통상적으로 "수화물"로서 언급된다. 수화물은 화학량론적 수화물 뿐만 아니라 다양한 양의 물을 함유하는 조성물을 포함한다. 본 발명은 그러한 모든 용매화물을 포함한다.
당업자는 다양한 용매화물을 포함하는, 결정질 형태로 존재하는 본 발명의 화합물이 다형성 (즉, 상이한 결정 구조에 나타나는 용량)을 나타낼 수 있음을 추가로 인지할 것이다. 이렇게 상이한 결정질 형태는 통상적으로 "다형태"로서 공지되어 있다. 본 발명은 그러한 모든 다형태를 포함한다. 다형태는 동일한 화학적 조성을 지니나, 패킹, 기하학적 배열, 및 결정질 고체 상태의 다른 기술적인 특성에 있어서 상이하다. 따라서, 다형태는 형상, 밀도, 경도, 가변형성(deformability), 안정성 및 용해 특성과 같은 상이한 물리적 특성을 지닐 수 있다. 다형태는 통상적으로 동정에 이용될 수 있는 상이한 용융점, IR 스펙트럼, 및 X-선 분말 회절 패턴을 나타낸다. 당업자는, 예를 들어 화합물을 제조하는데 사용되는 반응 조건 또는 시약을 바꾸거나 조정함에 의해, 상이한 다형태를 생성할 수 있음을 인지할 것이다. 예를 들어, 온도, 압력, 또는 용매를 변화시켜 다형태를 초래할 수 있다. 또한, 하나의 다형태는 특정 조건 하에 자발적으로 또 다른 다형태로 전환될 수 있다.
화학식(I)의 화합물은 하기 개시된 일반적인 합성식에 의해 제조될 수 있다.
반응식 1- 1,1-디메틸에틸[(3R,4R)-4-아미노테트라히드로-2H-피란-3-일]카르바메이트의 합성
Figure pct00003
(i) 메실 클로라이드, Et3N, DCM;
(ii) DBU;
(iii) mCPBA, CHCl3;
(iv) [(1S)-1-페닐에틸]아민, 2-PrOH/70℃ 또는 2-BUOH/90℃;
(V) Pd(OH)2/C, H2, EtOH;
(vi) (BoC)2O, Et3N, MeOH;
(vii) 메실 클로라이드, Et3N, DCM;
(viii) NaN3, NaOAc, DMF;
(ix) PtO2, H2, EtOH.
반응식 2 - 3,6-디히드로-2H-피란의 대안적인 합성
Figure pct00004
(i) 1ON NaOH.
반응식 3
Figure pct00005
(i) PCl5;
(ii) NH3, 1,4-디옥산;
(iii) P-톨루이딘, Et3N, DMF;
(iv) 1,1-디메틸에틸 [(3R,4R)-4-아미노테트라히드로-2H-피란-3-일]카르바메이트, Et3N, DMF;
(v) HCl / 이소프로판올.
따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은 하기 화학식(II)의 화합물을 하기 화학식(III)의 화합물로 처리하고, 그 후 보호기를 제거하는 것을 포함하여 화학식(I)의 화합물을 제조하는 방법을 제공한다:
Figure pct00006
Figure pct00007
상기 식에서, P는 보호기, 예를 들어 t-부톡시카르보닐 (Boc)이다.
하기 화학식(IV)의 중간체 화합물은 신규하며, 화학식(I)의 화합물에 제조에 사용되므로 본 발명의 추가의 양태를 제공한다:
Figure pct00008
상기 식에서, X는 N3 또는 NH2이고, Y는 보호기, 예를 들어 t-부톡시카르보닐 (Boc)이며, (3R,4R) 입체화학을 지닌다.
화학식(III) 및 (IV)의 화합물의 제조에서 중요한 양태는 C-3 및 C-4에서 적절한 입체화학의 도입이다. 이것은 상승된 온도, 바람직하게는 환류 조건에서 C2-4 알콜, 바람직하게는 이차 알콜, 예를 들어 2-프로판올 또는 2-부탄올에서 키랄 아민 전구체, 예를 들어 [(1S)-1-페닐에틸]아민과의 반응에 의해, 하기 화학식(V)의 C-3에서 에폭시드를 부위특이적(regiospecific) 개방시킴에 의해 유리하게 수행될 수 있는 것으로 나타났다:
Figure pct00009
상기 반응을 또한 트리메틸알루미늄의 존재하에 디클로로메탄과 같은 용매에서 수행한 후, 소듐 플루오라이드로 처리함으로써(work-up) 알루미네이트를 분해시킬 수 있다. 초기 반응 생성물은 아마도 두 C-3 부분입체이성질체 및 두 C-4 부분입체이성질체의 혼합물이고, C-3:C-4 비는 에폭시드 고리 개방의 부위특이성에 의존적이다. 그 후, C-3 위치이성질체 혼합물을 분리하고 키랄 부분을 제거하여, 요망되는 하기 화학식(VI)의 3-아미노, 4-히드록시 테트라히드로피란 중간체를 높은 거울상이성질체 순도로 수득할 수 있다:
Figure pct00010
.
따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은 화학식(IV) 또는 (IV)의 화합물을 제조하는 방법을 제공하며, 상기 방법은 화학식(V)의 화합물을 C2 -4 알콜, 바람직하게는 이차 알콜, 예를 들어 2-프로판올 또는 2-부탄올에서 상승된 온도, 바람직하게는 환류 조건에서 키랄 아민 전구체, 예를 들어 [(1S)-1-페닐에틸]아민과 반응시키는 단계를 포함한다.
일부 예에서 보호기를 사용하는 것이 유용할 수 있음을 인지할 것이다. 보호기의 예 및 이들을 제거하기 위한 수단은 문헌[T. W. Greene 'Protective Groups in Organic Synthesis' (J. Wiley and Sons, 1991)]에서 찾아볼 수 있다. 적합한 아민 보호기는 비제한적으로 설포닐 (예를 들어, 토실), 아실 (예를 들어, 벤질옥시카르보닐 또는 t-부톡시카르보닐) 및 아릴알킬 (예를 들어, 벤질)을 포함하고, 이들은 적절한 경우 가수분해 또는 가수소분해(hydrogenolysis)에 의해 제거될 수 있다. 다른 적합한 아민 보호기로는 염기 촉매화된 가수분해에 의해 제거될 수 있는 트리플루오로아세틸 (-C(O)CF3), 또는 산 촉매화된 가수분해 (예를 들어, 트리플루오로아세트산 이용)에 의해 제거될 수 있는 고체상 수지 결합된 벤질기, 예를 들어 메리필드(Merrifield) 수지 결합된 2,6-디메톡시벤질기 (Ellman 링커)가 있다. 본 발명의 화합물은 Syk의 억제제로서 유용하며, 따라서 일부 암 치료, 특히 헴 악성종양 뿐만 아니라 B 세포를 수반하는 염증 질환, 및 또한 부적절한 비만 세포 활성화로부터 초래된 질환, 예를 들어 알레르기 및 염증 질환을 치료하는데 잠재적인 용도를 지닌다.
따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은 치료에 사용되는 화학식(I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 치료가 필요한 환자에게 유효량의 화학식(I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 투여하여 Syk 키나아제를 억제하는 방법을 제공한다.
Syk 억제제는 암 치료, 구체적으로 헴 악성종양, 특히 난포 (FL), 외투 세포, 소림프구 림프종/만성 림프구 림프종(SLL/CLL), 버킷 및 미만성 큰 B 세포 (DLBCL) 림프종을 포함하는 비호지킨 림프종의 치료에 유용할 수 있다.
따라서, 추가의 양태에서, 본 발명은 치료가 필요한 환자에게 유효량의 화학식(I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하여, 암, 구체적으로 헴 악성종양, 특히 난포 (FL), 외투 세포, 버킷 및 미만성 큰 B 세포 (DLBCL) 림프종을 포함하는 비호지킨 림프종을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 화합물은 또한 당 분야에 공지되어 있는 다른 부류의 암 화학치료제와 병용하여 암 화학요법에 사용될 수 있다. 비호지킨 림프종의 경우 그러한 병용에 사용되는 대표적인 부류의 제제로는 리탁시맙(ritaximab), BEXXAR (토시투모맙(tositumomab) 및 아이오딘(Iodine) I 131 토시투모맙), 픽산트론(pixantrone) 및 화학요법제가 있다. 본 발명의 화합물을 또한 CHOP 약물 계획 (시클로포스파미드, 아드리아마이신, 빈크리스틴, 프레드니손) 또는 CHOP 플러스 리탁시맙 (CHOP+R)과의 병용에 이용할 수 있다.
본 발명의 화합물은 B 세포 및/또는 포식세포 활성화를 포함하는 자가면역 질환, 예를 들어 전신 홍반 루푸스(systemic lupus erythematosus), 쇼그렌 증후군(Sjorgens Syndrome), 베그너스 육아종증(Wegners granulomatosis), 수포성 유천포창(Bullous Pemphigoid), 특발성 혈소판감소성 자반병(Idiopathic Thrombocytopenic Purpura) (ITP), 거대세포 동맥염(Giant Cell Arteriosis), 자가-항체 상태가 있거나 없는 만성 특발성 두드러기(Chronic Idiopathic Urticaria) (만성 자가면역 두드러기) (New concepts in chronic urticaria Current Opinions in Immunology 2008 20:709-716), 사구체신염(Glomerulonephritis), 만성 이식 거부(Chronic Transplant Rejection), 및 류마티스 관절염을 치료하는데 잠재적으로 사용된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 치료가 필요한 환자에게 유효량의 화학식(I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하여, B 세포를 수반하는 염증 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
본 발명의 화합물은 부적절한 비만 세포 활성화로부터 초래된 질병, 예를 들어 알레르기 및 염증 질환을 치료하는데 잠재적으로 사용된다.
추가의 양태에서, 본 발명은 치료가 필요한 환자에게 유효량의 화학식(I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하여, 부적절한 비만 세포 활성화를 치료하는 방법을 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 치료가 필요한 환자에게 유효량의 화학식(I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하여, 염증 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
추가의 양태에서, 본 발명은 치료가 필요한 환자에게 유효량의 화학식(I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하여, 알레르기 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
Syk 키나아제에 의해 매개되는 것으로 고려되는 질병 및 병리적 질환으로는 비만 세포 활성화를 수반하는 염증 및 알레르기 질환, 예를 들어 만성폐쇄폐병(chronic obstructive pulmonary disease) (COPD), 성인 호흡곤란 증후군(adult respiratory distress syndrome) (ARDS), 천식, 궤양성 대장염(ulcerative colitis), 크론병(Crohn's Disease), 기관지염(bronchitis), 결막염(conjunctivitis), 건선(psoriasis), 공피증(sclerodoma), 두드러기(urticaria), 피부염(dermatitis), 및 알레르기 비염(allergic rhinitis)이 있다.
본 발명의 화합물은 또한 당 분야에 공지된 다른 부류의 치료제와 함께 사용될 수 있다. 그러한 조합에 사용되는 대표적인 부류의 제제로는 천식을 치료하기 위한 항-염증 스테로이드 (특히, 코르티코스테로이드), PDE4 억제제, IKK2 억제제, A2a 효능제, β2-아드레날린수용체 효능제 (단기작용 및 장기작용 β2-아드레날린수용체 효능제 둘 모두를 포함), 알파 4 인테그린 억제제, 및 항-무스카린제(muscarinics), 및 알레르기를 치료하기 위한 전술한 제제 뿐만 아니라, H1 및 H1/H3 길항제를 포함하는 히스타민 수용체 길항제가 있다. 중증 천식을 치료하기 위한 병용 요법에 사용되는 대표적인 제제로는 국소적으로 작용하는 p38 억제제, 및 IKK2 억제제가 있다.
항-염증 코르티코스테로이드는 당 분야에 널리 공지되어 있다. 대표적인 예로서 플루티카손 프로피오네이트 (예를 들어, 미국특허 4,335,121호 참조), 베클로메타손 17-프로피오네이트 에스테르, 베클로메타손 17,21-디프로피오네이트 에스테르, 덱사메타손 또는 이의 에스테르, 모메타손 또는 이의 에스테르 (예를 들어, 모메타손 푸로에이트), 시클레소니드, 부데소니드, 및 플루니솔리드가 있다. 항-염증 코르티코스테로이드의 추가의 예가 WO 02/12266 A1 (Glaxo Group Ltd)에 개시되어 있고, 특히 실시예 1의 화합물 (6α,9α-디플루오로-17α-[(2-푸라닐카르보닐)옥시]-11β-히드록시-16α-메틸-3-옥소-안드로스타-1,4-디엔-17β-카르보티오산 S-플루오로메틸 에스테르) 및 실시예 41의 화합물 (6α,9α-디플루오로-11β-히드록시-16α-메틸-17α-[(4-메틸-1,3-티아졸-5-카르보닐)옥시]-3-옥소-안드로스타-1,4-디엔-17β-카르보티오산 S-플루오로메틸 에스테르), 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염이다.
β2-아드레날린수용체 효능제의 예로는 살메테롤 (예를 들어, 라세미체 또는 R-거울상이성질체와 같은 단일 거울상이성질체로서), 살부타몰, 포르모테롤, 살메파몰, 페노테롤 또는 테르부탈린 및 이들의 염, 예를 들어 살메테롤의 시나포에이트 염, 살부타몰의 설페이트 염 또는 유리 염기 또는 포르모테롤의 푸마레이트 염이 있다. 장기작용 β2-아드레날린수용체 효능제가 바람직하며, 특히 살메테롤 또는 포르모테롤과 같이 24시간의 기간 동안 치료 효과를 지니는 것들이다.
항-히스타민제의 예로는 메타피릴렌, 로라타딘, 세티리진, 데슬로라타딘 또는 페소페나딘이 있다.
항콜린성(anticholinergic) 화합물의 예로는 무스카린성(M) 수용체 길항제, 특히 M1, M2, M1/M2, 또는 M3 수용체 길항제, 특히 (선택적인) M3 수용체 길항제가 있다. 항콜린성 화합물의 예가 WO 03/011274 A2 및 WO 02/069945 A2 / US 2002/0193393 A1 및 US 2002/052312 A1에 개시되어 있다. 무스카린성 M3 길항제의 예로는 이프라트로피움 브로마이드, 옥시트로피움 브로마이드 또는 티오트로피움 브로마이드가 있다.
본 발명의 화합물과 함께 사용될 수 있는 대표적인 PDE4 또는 혼합된 PDE3/4 억제제로는 AWD-12-281 (Elbion), PD-168787 (Pfizer), 로플루밀라스트(roflumilast), 및 실로밀라스트(cilomilast) (GlaxoSmithKline)가 있다. PDE4 억제제의 추가의 예가 WO 2004/103998, WO2005/030212, WO2005/030725, WO2005/058892, WO2005/090348, WO2005/090352, WO2005/090353, WO2005/090354, WO2006/053784, WO2006/097340, WO2006/133942, WO2007/036733, WO2007/036734 및 WO2007/045861 (Glaxo Group Ltd)에 개시되어 있다.
본 발명은 또한 화학식(I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 β2-아드레날린수용체 효능제 및 항-염증 코르티코스테로이드와 함께 포함하는 소위 "3중 병용" 요법을 제공한다.
바람직하게는 상기 병용은 천식, COPD 또는 알레르기 비염의 치료 및/또는 예방을 위한 것이다. β2-아드레날린수용체 효능제 및/또는 항-염증 코르티코스테로이드는 상기 및/또는 WO 03/030939 A1에 개시된 바와 같을 수 있다. 그러한 "삼중" 병용의 대표적인 예는 화학식(I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염, 살메테롤 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염 (예를 들어, 살메테롤 시나포에이트) 및 플루티카손 프로피오네이트를 포함한다.
반드시 필요한 것은 아니나, 본 발명의 화합물은 일반적으로 약제 조성물로 제형화된 후 환자에게 투여될 것이다. 따라서, 또 다른 양태에서, 본 발명은 본 발명의 화합물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제 조성물에 관한 것이다.
본 발명의 약제 조성물은 본 발명의 화합물이 안전하고 효과적인 양으로 추출된 후 환자에게 제공되는, 분말 또는 시럽과 같은 벌크(bulk) 형태로 제조되고 패키징될 수 있다. 대안적으로, 본 발명의 약제 조성물은 물리적으로 분리된 각 단위가 안전하고 효과적인 양의 본 발명의 화합물을 함유하는 단위 투여 형태로 제조되고 패키징될 수 있다. 본 발명의 약제 조성물은 또한 둘 이상의 서브-단위 투여 형태가 단위 투여 형태를 제공하는 서브-단위 투여 형태로 제조되고 패키징될 수 있다. 단위 투여 형태로 제조되는 경우, 본 발명의 약제 조성물은 제형의 특성에 따라 통상적으로 약 0.1 내지 99.9 중량%의 본 발명의 화합물을 함유한다.
또한, 본 발명의 약제 조성물은 임의로 하나 이상의 추가의 약제학적으로 활성인 화합물을 추가로 포함할 수 있다.
본 명세서에서 사용된 "약제학적으로 허용되는 부형제"는 제공된 형태에 포함되고 약제 조성물과 일관성을 지니는 약제학적으로 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클을 의미한다. 각 부형제는 혼합시 약제 조성물의 다른 성분들과 상용가능하여, 환자에게 투여시 본 발명의 화합물의 효능을 실질적으로 감소시키고 약제학적으로 비허용될 수 있는 조성물을 초래할 상호작용을 회피한다. 또한, 각 부형제는 약제학적으로 허용될 수 있도록 충분히 높은 순도를 당연히 지녀야 한다.
본 발명의 화합물 및 약제학적으로 허용되는 부형제 또는 부형제들을 포함하는 본 발명의 조성물은 통상적으로 요망되는 투여 경로에 의해 환자에게 투여하기 위해 구성된 투여 형태로서 제공될 것이다. 예를 들어, 투여 형태는 (1) 흡입에 적합한 것들, 예를 들어 에어로졸 및 용액; (2) 비내 투여에 적합한 것들, 예를 들어 용액 또는 스프레이; (3) 경구 투여에 적합한 것들, 예를 들어 정제, 캡슐, 캐플릿(capletes), 알약, 트로키(troches), 분말, 시럽, 엘릭서(elixers), 현탁액, 용액, 에멀젼, 사쉐(sachets), 및 캐세이(cachets); 및 (4) 비경구 투여에 적합한 것들, 예를 들어 살균 용액, 현탁액 및 재구성용 분말을 포함한다.
흡입 또는 경구 투여를 위해 구성된 투여 형태는 일반적으로 COPD를 치료하는데 사용되고; 비내 투여를 위해 구성된 투여 형태는 일반적으로 알레르기 비염을 치료하는데 사용되며; 경구 투여를 위해 구성된 투여 형태는 일반적으로 류마티스 관절염 및 헴 악성종양을 치료하는데 사용됨이 인지될 것이다.
적합한 약제학적으로 허용되는 부형제는 선택된 특정 투여 형태에 따라 다양할 것이다. 또한, 적합한 약제학적으로 허용되는 부형제는 이들이 조성물에서 발휘할 특정 기능에 대해 선택될 수 있다. 예를 들어, 약제학적으로 허용되는 특정 부형제가 균일한 투여 형태의 생성을 촉진하는 이들의 능력에 대해 선택될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 특정 부형제는 안정한 투여 형태의 생성을 촉진하는 이들의 능력에 대해 선택될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 특정 부형제는 일단 환자에게 투여된 후 신체의 한 기관, 또는 부분으로부터 신체의 또 다른 기관, 또는 부분으로 본 발명의 화합물을 전달하거나 운반하는 이들의 능력에 대해 선택될 수 있다. 약제학적으로 허용되는 특정 부형제는 환자 수용성을 개선시키는 이들의 능력에 대해 선택될 수 있다.
적합한 약제학적으로 허용되는 부형제로는 하기 유형의 부형제가 있다: 희석제, 충전제, 결합제, 붕해제, 윤활제, 활제, 과립화제, 코팅제, 습윤제, 용매, 보조-용매, 현탁화제, 에멀젼화제, 감미제, 착향제, 향 차단제, 착색제, 케이킹 방지제(anticaking agents), 보습제, 킬레이팅제, 가소제, 점성 증가제, 항산화제, 보존제, 안정화제, 계면활성제, 및 완충제. 당업자는 약제학적으로 허용되는 특정 부형제가 하나를 초과하는 기능을 발휘할 수 있고, 얼마나 많은 부형제가 제형에 존재하는 지와 어떤 다른 성분들이 제형에 존재하는 지에 따라 대안적인 기능을 수행할 수 있음을 인지할 것이다.
당업자는 본 발명에 사용되는 적합한 약제학적으로 허용되는 부형제를 적절한 양으로 선택할 수 있는 지식과 기술을 소유한다. 또한, 약제학적으로 허용되는 부형제를 기술하고 있고 적합한 약제학적으로 허용되는 부형제를 선택함에 있어서 유용할 수 있는, 당업자가 이용가능한 다수의 자원이 존재한다. 예로는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company), Remington: The Science and Practice of Pharmacy, (Lippincott Williams & Wilkins), The Handbook of Pharmaceutical Additives (Gower Publishing Limited), and The Handbook of Pharmaceutical Excipients (the American Pharmaceutical Association and the Pharmaceutical Press)]이 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 당업자에게 공지된 기술 및 방법을 이용하여 제조된다. 당 분야에서 일반적으로 사용되는 방법들 중 일부가 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences (Mack Publishing Company)]에 개시되어 있다.
정제와 같은 경구 투여 형태는 통상적으로 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함할 것인데, 이것은 예를 들어 만족스러운 가공 및 압축성을 부여하거나 정제에 추가의 요망되는 물리적 특성을 제공하는데 도움이 될 수 있다. 그러한 약제학적으로 허용되는 부형제는 희석제, 결합제, 활제, 윤활제, 붕해제, 착색제, 착향제, 감미제, 폴리머, 왁스 또는 다른 용해성-조절 물질로부터 선택될 수 있다.
비경구 투여용 투여 형태는 일반적으로 유체, 특히 정맥내 유체, 즉 당, 아미노산 또는 전해질과 같은 단순한 화학제의 무균 용액을 포함할 것인데, 이들은 순환계에 의해 용이하게 운반되고 흡수될 수 있다. 그러한 유체는 통상적으로 주입 USP용 물로 제조된다. 정맥내(IV) 용도에 일반적으로 사용되는 유체가 문헌[Remington, The Science and Practice of Pharmacy (상세 언급은 앞서 제공됨)]에 개시되어 있다. 그러한 IV 유체의 pH는 다양할 수 있고, 당 분야에 공지된 대로 통상적으로 3.5 내지 8일 것이다.
비내 또는 흡입 투여를 위한 투여 형태는 편리하게는 에어로졸, 용액, 점적액, 겔 또는 건조 분말로서 제형화될 수 있다.
비강으로의 국소 투여(비내 투여)를 위한 투여 형태로는 가압된 에어로졸 제형 및 가압 펌프에 의해 코로 투여되는 수성 제형이 있다. 비-가압되며 비내 투여를 위해 구성된 제형이 특히 흥미롭다. 적합한 제형은 이러한 목적을 위한 희석제 또는 담체로서 물을 함유한다. 코로 투여하기 위한 수성 제형은 완충제, 긴장성 조절제 등과 같은 통상적인 부형제와 함께 제공될 수 있다. 수성 제형은 또한 연무(nebulisation)에 의해 코로 투여될 수 있다.
추가의 구체예에서, 비내 투여를 위한 투여 형태는 계량(metered dose) 장치로 제공된다. 상기 투여 형태는 분배용 노즐 또는 분배용 오리피스가 구비된 유체 디스펜서로부터 전달되는 유체 제형으로서 제공될 수 있고, 사용자의 힘이 가해질 때 상기 노즐 또는 오리피스를 통해 계측된 양의 유체 제형이 유체 디스펜서의 펌프 메커니즘으로 분배된다. 그러한 유체 디스펜서는 일반적으로 유체 제형의 다수의 계측된 용량의 저장소를 구비하여 제공되며, 상기 용량들은 일련의 펌프 작동시에 분배될 수 있다. 분배용 노즐 또는 오리피스는 유체 제형을 비강으로 분무 분배하기 위해 사용자의 콧구멍에 삽입되도록 형성될 수 있다. 일 구체예에서, 유체 디스펜서는 WO-A-2005/044354호에 개시되고 도시된 일반적인 유형이다. 디스펜서는 유체 제형을 함유하기 위해 컨테이너 상에 탑재된 압축 펌프를 지니는 유체 방출 장치를 수용하는 하우징을 지닌다. 상기 하우징은 하나 이상의 손가락-작동가능한 측면 레버를 지니는데, 이것은 하우징에 대해 안쪽으로 움직일 수 있어서 컨테이너를 하우징에서 위로 왕복 운동(cam)시킬 수 있으므로 펌프가 압축되도록 하여 계측된 용량의 제형을 하우징의 코 노즐을 통해 펌프 줄기 밖으로 펌핑시킨다. 특히 바람직한 유체 디스펜서는 WO-A-2005/044354호의 도면 30-40에 도시된 일반적인 유형이다.
흡입 투여에 적합하고/거나 이를 위해 구성된 조성물의 경우, 화학식(I)의 화합물 또는 염은 입자-크기-감소된 형태인 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 크기-감소된 형태가 미크론화(micronisation)에 의해 수득되거나 수득될 수 있다. 크기-감소된 (즉, 미크론화된) 화합물 또는 염 또는 용매화물의 바람직한 입자 크기는 약 0.5 내지 약 10 미크론의 D50 값에 의해 정의된다 (예를 들어, 레이저 회절을 이용하여 측정됨).
예를 들어, 흡입 투여되는 에어로졸 조성물은 약제학적으로 허용되는 수성 또는 비-수성 용매 중에 활성 물질의 용액 또는 미세 현탁액을 포함할 수 있다. 에어로졸 제형은 밀봉된 컨테이너에서 살균된 형태로 단일 또는 다중용량으로 제공될 수 있는데, 상기 컨테이너는 카트리지의 형태일 수 있거나 사용을 위해 분무(atomising) 장치 또는 흡입기로 보충될 수 있다. 대안적으로, 밀봉된 컨테이너는 일단 컨테이너의 내용물이 고갈되면 처분할 목적인, 계측 밸브가 장착된 단일 용량 비내 흡입기 또는 에어로졸 디스펜서 (계량식 흡입기)와 같은 단일의 분배용 장치일 수 있다.
투여 형태가 에어로졸 디스펜서를 포함하는 경우, 이것은 가압 공기와 같은 압력하에 이산화탄소와 같은 적합한 추진제 또는 히드로플루오로카본(HFC)와 같은 유기 추진제를 함유하는 것이 바람직하다. 적합한 HFC 추진제로는 1,1,1,2,3,3,3-헵타플루오로프로판 및 1,1,1,2-테트라플루오로에탄이 있다. 에어로졸 투여 형태는 또한 펌프-분무기의 형태일 수 있다. 가압된 에어로졸은 활성 화합물의 용액 또는 현탁액을 함유할 수 있다. 이들은 현탁 제형의 분산 특성 및 균질성을 개선시키기 위해 보조-용매 및/또는 계면활성제와 같은 추가의 부형제의 혼입을 필요로 할 수 있다. 용액 제형에는 또한 에탄올과 같은 보조-용매의 첨가가 필요할 수 있다. 예를 들어, 제형의 안정성 및/또는 맛 및/또는 미세 입자 질량 특성 (양 및/또는 프로필)을 개선시키기 위해 다른 부형제 조절제가 또한 혼입될 수 있다.
흡입 투여에 적합하고/거나 이를 위해 구성된 조성물의 경우, 약제 조성물은 흡입가능한 건조 분말 조성물인 것이 바람직하다. 그러한 조성물은 락토오스, 글루코오스, 트레할로스, 만니톨 또는 전분과 같은 분말 기재, 화학식(I)의 화합물 또는 이의 염이나 용매화물 (바람직하게는 입자-크기 감소된 형태, 예를 들어 미크론화된 형태), 및 임의로 성능 개질제, 예를 들어 L-류신 또는 또 다른 아미노산, 셀로비오스 옥타아세테이트 및/또는 마그네슘 또는 칼슘 스테아레이트와 같은 스테아르산의 금속염을 포함할 수 있다. 바람직하게는, 흡입가능한 건조 분말 조성물은 락토오스 및 화학식(I)의 화합물 또는 이의 염의 건조 분말 배합물(blend)을 포함한다. 락토오스는 락토오스 히드레이트, 예를 들어 락토오스 일수화물인 것이 바람직하고/거나 흡입-등급 및/또는 미세-등급 락토오스인 것이 바람직하다. 바람직하게는, 락토오스의 입자 크기는 직경이 1000 미크론 (마이크로미터) 이하인 (예를 들어, 10-1000 미크론, 예를 들어 30-1000 미크론) 90% 이상 (중량% 또는 부피%)의 락토오스 입자, 및/또는 직경이 500 미크론 이하인 (예를 들어, 10-500 미크론) 50% 이상의 락토오스 입자로 정의된다. 보다 바람직하게는, 락토오스의 입자 크기는 직경이 300 미크론 이하인 (예를 들어, 10-300 미크론, 예를 들어 50-300 미크론) 90% 이상의 락토오스 입자, 및/또는 직경이 100 미크론 이하인 50% 이상의 락토오스 입자로 정의된다. 임의로, 락토오스의 입자 크기는 직경이 100-200 미크론 이하인 90% 이상의 락토오스 입자, 및/또는 직경이 40-70 미크론 이하인 50% 이상의 락토오스 입자로 정의된다. 보다 중요하게는, 입자의 약 3 내지 약 30% (예를 들어, 약 10%) (중량% 또는 부피%)가 50 미크론 이하 또는 20 미크론 이하의 직경인 것이 바람직하다. 예를 들어, 비제한적으로, 적합한 흡입-등급 락토오스는 E9334 락토오스 (10% 미세도(fines)) (Borculo Domo Ingredients, Hanzeplein 25, 8017 JD Zwolle, Netherlands)이다.
임의로, 특히 흡입가능한 건조 분말 조성물의 경우, 흡입 투여되는 약제 조성물은 적합한 흡입 장치 안쪽의 스트립 또는 리본에 세로로 탑재된 다수의 밀봉된 용량 컨테이너 (예를 들어, 건조 분말 조성물 포함)로 혼입될 수 있다. 컨테이너는 요구에 따라 떠뜨릴 수 있거나 벗겨낼(peel-openable) 수 있으며, 예를 들어 건조 분말 조성물의 용량을 글락소스미스클라인에 의해 시판되는 DISKUS™ 장치와 같은 장치를 통해 흡입에 의해 투여할 수 있다. DISKUS™ 흡입 장치는 예를 들어 GB 2242134 A에 개시되어 있고, 이러한 장치에서 분말 형태의 약제 조성물에 대한 하나 이상의 컨테이너 (컨테이너 또는 컨테이너들은 스트립 또는 리본에 세로로 탑재된 다수의 밀봉된 용량 컨테이너이다)는 두 부재 중 하나가 또 다른 하나에 대해 벗겨질 수 있게 고착되어 있는 두 부재 사이에 형성된다; 상기 장치는 상기 컨테이너 또는 컨테이너들의 개방 부위를 형성하는 수단; 개방 부위에 있는 부재들이 따로 벗겨져서 컨테이너를 개방하기 위한 부재; 및 개방된 컨테이너와 이어진 출구로서, 이를 통해 사용자가 개방된 컨테이너로부터의 약제 조성물을 분말 형태로 흡입할 수 있게 하는 출구를 포함한다.
비내 투여를 위한 본 발명의 조성물은 또한 건조 분말 제형으로서 흡입법(insufflation)에 의한 투여를 위해 구성될 수 있다.
본 발명의 화합물을 흡입, 정맥내, 경구 또는 비내 경로에 의해 일반적으로 투여되는 다른 치료제와 함께 투여할 때, 생성된 약제 조성물은 동일한 경로로 투여될 수 있음을 인지할 것이다.
본 발명의 화합물은 편리하게는, 예를 들어 1㎍ 내지 2g의 양으로 투여될 수 있다. 정확한 용량은 당연히 환자의 연령과 조건 및 선택된 특정 투여 경로에 의존적일 것이다.
생물학적 시험 방법
본 발명의 화합물을 하기 검정에 따라 시험관내 활성에 대해 시험할 수 있다:
기본적인 효소 활성
1. Syk 효소 검정 - 시간-분해(Time-resolved) 형광 공명 에너지 전달 키나아제 검정
재조합 인간 Syk를 His-태깅된(tagged) 단백질*로서 발현시켰다. Syk의 활성을 시간-분해 형광 공명 에너지 전달 (TR-FRET) 검정을 이용하여 평가하였다.
Syk를 16.6mM의 MgCl2, 8.3mM의 ATP의 존재하에 실온에서 30분 동안 예비-활성화한 다음 4OmM Hepes pH 7.4, 0.01% BSA에서 4nM으로 희석시켰다. 4OmM HEPES pH 7.4, 0.01% BSA 중의 비오티닐화된 펩티드, 비오틴-AAAEEIYGEI (최종 0.5μM), ATP (최종 30μM) 및 MgCl2 (최종 1OmM)를 함유하는 3㎕의 기질 시약을 그라이너(Greiner) 저부피 384 웰 블랙 플레이트에서 0.1 ㎕의 다양한 농도의 화합물 또는 DMSO 비히클 (최종 1.7%)을 함유하는 웰에 첨가하였다. 3㎕의 희석된 Syk (최종 2nM)를 첨가함에 의해 반응을 개시하였다. 반응물을 실온에서 60분 동안 인큐베이션한 다음, 4OmM HEPES pH 7.4, 0.03% BSA 중의 60 mM EDTA, 15OmM NaCl, 5OnM 스트렙타비딘 APC (Prozyme, San Leandro, California, USA), W-1024 유로퓸 킬레이트로 표지된 0.5nM 항포스포티로신 항체 (Wallac OY, Turku, Finland)를 함유하는 3㎕의 판독 시약을 첨가함에 의해 반응을 종료시켰다. 반응물을 실온에서 45분 동안 추가로 인큐베이션하였다. BMG 루비스타(Rubystar) 플레이트 판독기 (BMG LabTechnologies Ltd, Aylesbury, UK)를 특정 665 nm 에너지 전달 시그널 대 참조 유로퓸 620 nm 시그널의 비로서 이용하여 비오틴-AAAEEIYGEI의 포스포릴화 정도를 측정하였다.
화학식(I)의 화합물은 본 검정에서 40 nM의 IC50 값을 갖는다.
* 재조합 인간 전장 비장 티로신 키나아제 ( Syk ) Syk 의 제조
전장 인간 Syk를 바큘로바이러스 시스템 (Invitrogen, Paisley, Scotland)을 이용하여 N-말단 상에 6His tag를 지니도록 발현시켰다. 세포를 다운스 균질화(dounce homogenisation)에 의해 파열시키고, 조직파편을 원심분리에 의해 제거하고 용해물을 NiNTA 슈퍼플로우(Superflow) (Qiagen, Crawley, UK)와 접촉시켰다. NiNTA를 컬럼에 패킹하고 10 컬럼 부피의 각 완충제 (2OmM Tris pH8.0, 30OmM NaCl, 1OmM βMcEtOH, 10% 글리세롤), 완충제 + 1M NaCl, 완충제 + 2OmM 이미다졸 및 완충제 + 30OmM 이마다졸을 이용하여 용리시켰다. 30OmM의 이미다졸 분획을 푸울링하고 G25M (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)을 이용하여 완충제를 2OmM MES pH 6.0, 2OmM NaCl, 1OmM βMcEtOH, 10% 글리세롤로 교환하였다. 완충제 교환된 6His-Syk를 소스(Source)15S 컬럼 (Amersham Biosciences, Buckinghamshire, UK)에 로딩하고 50 컬럼 부피 이상의 NaCl 구배 0-50OmM를 이용하여 컬럼을 용리시켰다. 6His-Syk 함유 분획을 푸울링하고 초-여과에 의해 농축시켰다. 6His-Syk의 주체성(identity)을 펩티드 질량 핑거 프린팅 및 완전 LC-MS에 의해 확인하였다.
키나아제 선택성
2. 오로라 B 효소 검정 - 형광 분극 키나아제 검정
재조합 인간 오로라 B (2-344)를 Flag-6His-Thr-태깅된 단백질*로서 발현시켰다. 오로라 B의 활성을 형광 분극 IMAP 검정 (Molecular Devices, Sunnyvale, US)을 이용하여 평가하였다.
오로라 B (2μM)를 3OmM Tris-HCl pH 8.0, 0.4mM ATP, 2mM MgCl2, 0.1 mM EGTA, 0.1% BME (베타 머캅토에탄올), 0.1 mM 소듐 바나데이트, 1OmM DTT에서 3시간 동안 30℃에서 동일 농도의 GST-INCENP$에 의해 예비활성화시켰다. 그 후, 용액을 5시간 동안 5OmM Tris-HCl, pH 7.5, 27OmM 수크로오스, 15OmM NaCl, 0.1 mM EDTA, 0.1 % BME, 1 mM 벤즈아미딘 및 0.2mM PMSF에 대해 4℃에서 투석시켰다. 오로라 B/INCENP 복합체를 분취시키고 -80℃에서 동결시켰다.
최종 농도의 2nM의 오로라 B/INCENP 복합체를 검정 완충제 (25mM HEPES, 25mM NaCl 0.0025% Tween-20, pH 7.2 0.015% BSA, 1 μM DTT)에 첨가하였다. 3㎕의 상기 용액을 그라이너 저부피 384 웰 블랙 플레이트에서 0.1 ㎕의 다양한 농도의 화합물 또는 DMSO 비히클을 함유하는 웰에 실온에서 30분 동안 첨가하였다. 최종 DMSO 수준이 1.7%이며 검정 완충제에 (25mM HEPES, 25mM NaCl 0.0025% Tween-20, pH 7.2 0.015% BSA, 1 μM DTT) 10OnM 5FAM-PKA-tide (GRTGRRNSI-NH2), 2μM ATP 및 2mM MgCl2를 함유하는 3㎕의 기질 시약의 존재하에 반응을 개시하였다. 반응물을 실온에서 추가로 120분 동안 인큐베이션한 다음, 제조자의 완충제 A (Part: R7285) 및 제조자의 완충제 B (Part: R7286)에서 6㎕의 1:500 희석 프로그레시브 바인딩 시약(Progressive Binding Reagent) 용액 (Part: R7287)을 첨가함에 반응을 종료시키고, 실온에서 120분 동안 인큐베이션되게 하였다. 여기 485nM, 53OnM에서 방출 및 505nmM 이색성 렌즈를 이용한 억퀘스트(Acquest) 플레이트 판독기 (Molecular Devices, Synnyvalce, US)를 이용하여 5FAM-PKA-tide (GRTGRRNSI-NH2)의 포스포릴화 정도를 측정하였다. 데이터를 평행하게 그리고 수직 방향으로 획득하여 기구에 의해 mp로 전환시켰다. 화학식(I)의 화합물은 본 검정에서 20 μM의 활성을 갖는다.
* 재조합 인간 전장 오로라 B의 제조
전장 인간 오로라 B를 바큘로바이러스 시스템 (Invitrogen, Paisley, Scotland)을 이용하여 N-말단 영역 상에 6His tag를 지니도록 발현시켰다. sf9 세포를 초음파분해에 의해 용해시키고, 조직파편을 원심분리에 의해 제거하고 용해물을 NiNTA 슈퍼플로우 (Qiagen, Crawley, UK)와 접촉시켰다. NiNTA를 컬럼에 패킹하고 1-300 mM 이미다졸 구배를 이용하여 용리시켰다. 30OmM의 이미다졸 분획을 푸울링하고 5OmM Tris-HCl, pH 8.0, 25OmM NaCl 및 2mM DTT에 대해 투석시켜 이미다졸을 제거하였다. 투석 후 대략 60% 순수한 단백질을 회수하였다. 오로라 B의 주체성을 N-말단 서열 분석 및 LC-MS에 의해 확인하였다.
§인간 INCENP (826-919) 클론 DU930을 던디 대학으로부터 수령하였고, 이것은 GST N-말단 태깅된 단백질이다.
3. VEGFR2 ( KDR ) 효소 검정 - 시간-분해 형광 공명 에너지 전달 키나아제 검정
재조합 인간 VEGFR2 (KDR) 세포내 도메인 (전체 키나아제 도메인 포함)을 GST-6His-태깅된 단백질*로서 발현시켰다. VEGFR2의 활성을 시간-분해 형광 공명 에너지 전달 (TR-FRET) 검정으로 평가하였다. 100% DMSO 또는 100% DMSO 비히클에서 요망되는 농도의 시험 화합물을 그라이너 저부피 384웰 블랙 플레이트 (#784076)에 0.1 ㎕로 첨가하였다. 플레이트를 1000 RPM에서 1분 동안 최소로 원심분리하여 모든 액체를 웰의 바닥으로 밀어낸 후 임의의 검정 시약을 첨가하였다.
VEGFR2 (통상적으로 10OnM)를 실온에서 20분 동안 10OmM HEPES, pH 7.5, 1OmM MgCl2, 100μM ATP, 300μM DTT, 및 0.1 mg/mL BSA의 존재하에 활성화시켰다. 2OmM MgCl2, 100μM ATP, 0.72μM 비오티닐화된 펩티드 (비오틴-아미노헥실-EEEEYFELVAKKKK-NH2)를 함유하는 기질 용액을 검정 플레이트에 5㎕로 첨가하였다. 활성화된 VEGFR2 용액을 20OmM HEPES, pH 7.5, 0.2mg/mL BSA, 및 0.6mM DTT에서 100배 희석하였다. 5㎕의 희석되고 활성화된 VEGFR2를 첨가함에 의해 VEGFR2 촉매화된 반응을 개시하였다. 최종 검정 농도는 10OmM HEPES, pH 7.5, 1OmM MgCl2, 50μM ATP, 0.1 mg/mL BSA, 300μM DTT, 0.36μM 비오티닐화된 펩티드 기질, 및 0.5nM VEGFR2 (VEGFR2의 최종 검정 농도는 효소의 상이한 배치의 특정 활성에 따라 달라질 수 있다)였다. 반응을 90분 동안 실온에서 진행시킨 다음, 5㎕의 15OmM EDTA, pH 8을 첨가함에 의해 종료시켰다. 웰에서 검정의 백그라운드 시그널을 확립하였고, 이 때 기질과 효소 용액을 첨가하기 전에 150mM EDTA를 대신 첨가하였다. 20OmM HEPES, pH 7.5, 0.1 mg/mL BSA, 3OnM 스트렙타비딘 슈어라이트(SureLight)®-APC (PerkinElmer, Boston, MA, USA), 및 4nM LANCE® 유로퓸-표지된 항포스포티로신 항체 (PerkinElmer, Boston, MA, USA)를 함유하는 HTRF 검출 용액을 5㎕로 첨가하였다. 10분 동안 실온에서 인큐베이션한 후, 비오티닐화된 펩티드 기질의 포스포릴화를 뷰룩스(Viewlux) 1430 ultraHTS 마이크로플레이트 이미저(Microplate Imager) (PerkinElmer, Turku, Finland)를 이용하여 특정 665nm 에너지 전달 시그널 대 참조 유로퓸 615nm 시그널의 비로서 측정하였다.
화학식(I)의 화합물은 본 검정에서 >7.9 μM의 IC50 값을 갖는다.
* 재조합 GST -6 His - VEGFR2 의 정제
GST-6His-VEGFR2를 Sf9 곤충 세포에서 바큘로바이러스 발현 시스템을 이용하여 N-말단 GST 및 6His 태그를 지니도록 과발현시켰다. 세포 (100-120 그램)를 5OmM HEPES pH 8.0, 10OmM NaCl, 및 2OmM 이미다졸 (5 ml/g 세포)에 실온에서 현탁시켰다. 모든 다른 정제 절차를 4℃에서 수행하였다. 세포를 브란손(Branson) 450 소니파이어(sonifier) (70% 파워, 1분 동안 50% 사이클)로 용해시키고, 세포 용해물을 30,000 x g으로 30분 동안 원심분리하였다. 상청액을 1.2㎛ 팔(Pall) 필터를 통해 여과한 다음, 5OmM HEPES pH 8.0, 10OmM NaCl, 및 2OmM 이미다졸로 평형화된 150ml 퀴아겐(Qiagen) Ni-NTA (QIAGEN Inc., Valencia, CA, USA) 컬럼에 로딩하였다 (10-20 ml/분). 컬럼을, 280 nm에서의 흡광도가 0.1 이하가 될 때까지 5OmM HEPES pH 8.0, 10OmM NaCl, 및 2OmM 이미다졸로 세척한 후, 5OmM HEPES pH 8.0, 10OmM NaCl, 2OmM 이미다졸에서 5OmM HEPES pH 8.0, 10OmM NaCl, 25OmM 이미다졸의 5 컬럼 부피 구배로 용리시켰다. 분획 (10-30 ml)을 수집하였다. 요망되는 단백질 분획을 푸울링하고, 5OmM HEPES pH 7.5, 15OmM NaCl, 및 2mM EDTA로 평형화된 25ml 글루타치온 세파로스 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) 컬럼에 로딩하였다 (5ml/분). 컬럼을 5OmM HEPES pH 7.5, 15OmM NaCl, 및 2mM EDTA로 세척하고, 단백질을 5OmM HEPES pH 7.5, 15OmM NaCl, 1 mM EDTA, 및 2OmM 글루타치온까지 3 컬럼 부피 구배로 용리시켰다. 분획을 수집하고, 요망되는 단백질 분획을 푸울링하고, 10,000 MWCO 막이 구비된 팔 점보셉(Pall JumboSep) 농축기 (Pall Corporation, Portsmouth, England)를 이용하여 대략 20ml로 농축시켰다. 1800ml 슈퍼덱스(Superdex) S200 또는 23ml G25 (GE Healthcare, Piscataway, NJ, USA) 컬럼을 2OmM HEPES pH 7.5, 5OmM NaCl, 0.1 mM EDTA, 및 1 mM DTT로 평형화하였다. 농축물을 컬럼에 8ml/분으로 로딩하고, 컬럼을 2OmM HEPES pH 7.5, 5OmM NaCl, 0.1 mM EDTA, 및 1 mM DTT로 용리시켰다. 단백질 분획 (대략 20ml)을 수집하고, 요망되는 분획을 푸울링하고, 10,000 MWCO 막이 구비된 팔 점보셉 농축기를 이용하여 농축시켰다. 농축된 단백질을 이후 VEGFR2 효소 활성 검정에 이용하기 위해 요망되는 부피의 분취량으로 -80℃에 저장하였다. GST-6His-VEGFR2의 주체성을 완전 액체 크로마토그래피 및 질량 분광계(LC/MS)에 의해 그리고 단백질분해에 이어 생성된 펩티드를 액체 크로마토그래피 및 일렬 질량 분광계 (LC/MS/MS)로 분석함에 의해 확인하였다.
B 세포 활성 검정
4. 라모스( Ramos ) pErk 검정
검정의 원리
라모스 B 세포 (버킷 림프종의 인간 B 세포)를 항-IgM을 이용하여 자극하였다. 이에 의해 B 세포 수용체로의 Syk의 동원(recruitment)을 야기하였다. 후속적인 Syk의 자가포스포릴화가 시그널링 캐스캐이드를 개시하고, 그 결과 Erk MAP 키나아제 경로를 통한 B 세포 활성화가 초래되었다. 결과적으로, Erk가 포스포릴화되고, 이후의 세포 용해가 면역 포획 검정에 의해 검출되었다.
항- IgM 을 이용한 라모스의 자극
세포를 96 v-웰 폴리프로필렌 플레이트 중의 25㎕ 부피의 검정 배지 (10% 열 불활성화된 우태아 혈청, 1% L-글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI)에 5x105/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 25㎕의 적절히 희석된 화합물 용액을 첨가하고, 플레이트를 30분 동안 37℃에서 5% CO2와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 5㎕의 염소 항-인간 IgM (최종 5㎍/ml)의 Fab'2 단편으로 7분 동안 37℃에서 자극하였다. 55㎕의 2x RIPA 용해 완충제를 첨가함에 의해 세포를 2시간 동안 4℃에서 용해시켰다.
pErk MSD 검정
50㎕의 세포 용해물을 항-pErk1/2 (Thr/Thy: 202/204; 185/187) 포획 항체로 코팅된 96웰 MSD 플레이트로 옮기고 16시간 동안 4℃에서 인큐베이션하였다. 플레이트를 세척하고, 항-pErk 검출 항체 (25㎕/웰)를 2시간 동안 실온에서 첨가하였다. 이것을 제거하고, 150㎕의 MSD 판독 완충제를 첨가하고, 생성된 전기화학발광 시그널을 측정하였다.
화학식(I)의 화합물은 본 검정에서 50 nM의 IC50 값을 갖는다.
화합물 제조
화합물을 DMSO에서 1OmM 스톡(stock)으로 제조하고, 일련의 희석액을 9번의 연속하는 5배 희석을 이용하여 DMSO에서 제조하였다. 일련의 희석액을 검정 배지를 이용하여 추가로 1:100 희석시켜 5x10-5 내지 2.56x10-11M의 시험되는 농도 범위를 제공하였다. 화합물 희석액을 바이오멕(Biomek) 2000 및 바이오멕 Nx 자동화된 로봇 피펫팅 시스템을 이용하여 제조하였다.
5. CD69 PBMC 검정
검정의 원리
말초혈 B 세포를 항-IgM을 이용하여 생체외 자극하였다. 이에 의해 B 세포 수용체로의 Syk의 동원을 야기하였다. 후속적인 Syk의 자가포스포릴화가 시그널링 캐스캐이드를 개시하고, 그 결과 세포 표면 상에서 활성화 마커 CD69의 발현에 의해 지시된 대로 B 세포 활성화가 초래되었다. CD20/CD69+ve 전혈 B 세포를 흐름 세포측정에 의해 검출하였다.
항- IgM 을 이용한 말초혈 B 세포의 자극
말초혈 B 세포를 밀도 구배 원심분리에 의해 헤파린화된 인간 혈액으로부터 제조하였다. 세포를 96 v-웰 폴리프로필렌 플레이트 중의 25㎕ 부피의 검정 배지 (10% 열 불활성화된 우태아 혈청, 1% L-글루타민 및 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유하는 RPMI)에 1x105/웰의 밀도로 플레이팅하였다. 25㎕의 적절히 희석된 화합물 용액을 첨가하고, 플레이트를 30분 동안 37℃에서 5% CO2와 함께 인큐베이션하였다. 세포를 5㎕의 염소 항-인간 IgM (최종 5㎍/ml)의 Fab'2 단편으로 추가로 3.5시간 동안 앞서 개시된 조건하에 자극하였다. 존재하는 임의의 적혈구를 용해시키고, 200㎕의 라이스/픽스(Lyse/Fix) 완충제를 10분 동안 실온에서 첨가함에 의해 모든 다른 세포를 고정하였다.
CD69 검정
세포를 마우스 항-인간 CD20 FITC 및 마우스 항-인간 CD69 APC 컨주게이션된 항체의 칵테일을 이용하여 염색하였다. 샘플에 존재하는 CD20/CD69+ve B 세포를 흐름 세포측정에 의해 검출하였다.
화합물 제조
화합물을 DMSO에서 1OmM 스톡으로 제조하고, 일련의 희석액을 9번의 연속하는 5배 희석을 이용하여 DMSO에서 제조하였다. 일련의 희석액을 검정 배지를 이용하여 추가로 1:100 희석시켜 5x10-5 내지 2.56x10-11M의 시험되는 농도 범위를 제공하였다. 화합물 희석액을 바이오멕 2000 및 바이오멕 Nx 자동화된 로봇 피펫팅 시스템을 이용하여 제조하였다.
6. CD69 전혈 검정
검정의 원리
전혈 B 세포를 항-IgM을 이용하여 생체외 자극하였다. 이에 의해 B 세포 수용체로의 Syk의 동원을 야기하였다. 후속적인 Syk의 자가포스포릴화가 시그널링 캐스캐이드를 개시하고, 그 결과 세포 표면 상에서 활성화 마커 CD69의 발현에 의해 지시된 대로 B 세포 활성화가 초래되었다. CD20/CD69+ve 전혈 B 세포를 흐름 세포측정에 의해 검출하였다.
항- IgM 을 이용한 전혈 B 세포의 자극
100㎕의 헤파린화된 인간 혈액을 1㎕의 적절히 희석된 화합물 용액을 함유하는 5ml의 폴리프로필렌 튜브에 첨가하고, 30분 동안 37℃에서 5% CO2와 함께 인큐베이션하였다. B 세포를 10㎕의 염소 항-인간 IgM (최종 67.5㎍/ml)의 Fab'2 단편으로 추가로 3.5시간 동안 앞서 개시된 조건하에 자극하였다. 적혈구를 용해시키고, 20ml의 라이스/픽스 완충제를 10분 동안 실온에서 첨가함에 의해 모든 다른 세포를 고정하였다.
CD69 검정
세포를 마우스 항-인간 CD20 FITC 및 마우스 항-인간 CD69 APC 컨주게이션된 항체의 칵테일을 이용하여 염색하였다. 샘플에 존재하는 CD20/CD69+ve B 세포를 흐름 세포측정에 의해 검출하였다.
화합물 제조
화합물을 DMSO에서 1OmM 스톡으로 제조하고, 일련의 희석액을 7번의 연속하는 3배 희석을 이용하여 DMSO에서 제조하여 1x10-5 내지 4.5x10-10M의 시험되는 농도 범위를 제공하였다. 화합물 희석액을 바이오멕 2000 자동화된 로봇 피펫팅 시스템을 이용하여 제조하였다.
비만 세포 활성
7. LAD2 검정
검정의 원리
LAD2는 비만 세포 육종/백혈병 환자로부터의 골수 흡인물로부터 NIH에 의해 확립된 줄기 세포 인자 (SCF)-의존적인 인간 비만 세포주이다. LAD2 세포는 CD34+-유래된 인간 비만 세포와 유사하고 기능성 FcεR1을 발현시킨다. FcεR1은 IL-4, SCF 및 IgE의 존재에 의해 상향 조절되고, 후속적인 세포-결합된 IgE의 가교는 헥소스아미니다제 방출로서 측정될 수 있는 탈과립을 초래한다.
Fc ε R1 을 상향 조절하는 LAD2 세포 프라이밍( priming )
LAD2 세포를 인간 재조합 SCF (100ng/ml; R&D systems), 인간 재조합 인터루킨-4 (6ng/ml; R&D Systems) 및 IgE (100㎍/ml; Calbiochem)가 추가 보충된 완전 스템(stem) 프로-34SFM (스템 프로-34 영양 보충물 (1:40), 글루타민 (2mM), 페니실린 (100㎍/ml), 스트렙토마이신 (100㎍/ml)을 함유하는 Gibco Cat 10640-019 배지)에 1x105/ml로 재현탁시켰다. 그 후, 세포를 습윤된 대기에서 5% CO2와 함께 5일 동안 37℃에서 유지하였다.
화합물 제조
화합물을 100% DMSO에서 2mM 스톡으로부터 적정하여 9개의 연속하는 1:3 희석액 (V 96-웰 Nunc; Biomek 2000)을 수득하였다. 이러한 마스터 플레이트로부터 3㎕를 딸 플레이트 (flat 96-well NuncBiomek Fx)로 분배한 후, 2mM 글루타민을 지니는 RPMI에서 1:40으로 희석하고, 20㎕의 희석된 화합물을 그라이너 세포 플레이트로 옮겼다. 따라서, 최종 화합물의 농도 범위는 변치 않는 0.5% DMSO에서 1x10-5M 내지 5x10-10M이었다. 대조 웰을 0.5% DMSO로 처리하였다.
항- IgE 를 이용한 LAD2 세포의 활성화
프라이밍된 LAD2 세포를 원심분리하고 (40Og, 5분), 상청액을 폐기하고, 세포 펠렛을 글루타민(2mM)이 보충된 RPMI에서 1x104 세포/ml로 재현탁하였다. 추가의 원심분리 이후에 (40Og, 5분), 세포를 글루타민(2mM)을 지니는 새로운 RPMI에 재현탁하고, 5.7x105/ml의 밀도로 조정하고, 20㎕의 희석된 화합물 (상기 설명된 대로 제조됨)을 함유하는 살균 V-웰 플레이트 (70㎕/웰; 그라이너)로 피펫팅하였다. 그 후, 세포를 1시간 동안 인큐베이션한 후 (37℃, 습윤 대기 중 5% CO2) 서브-최대 농도의 항-IgE (1:2700의 최종 검정 희석액을 제공하는 1O㎕ 부피; Sigma)로 활성화시켰다. 40분간 인큐베이션한 후에 (37℃, 습윤 대기 중 5% CO2), 플레이트를 원심분리하고 (120Og, 10분, 4℃) 상청액을 헥소스아미니다제 검정을 위해 제거하였다. 세포 펠렛을 100㎕/웰 트리톤(triton)-X (RPMI 2mM 글루타민 중 0.5%)에서 37℃에서 30분 동안 용해시켰다.
베타- 헥소스아미니다제 검정
베타-헥소스아미니다제 활성을, 4-메틸룸벨리페릴 N-아세틸-ε-D 글루코사미니드 (Sigma)를 형광 생성물로 전환시킴에 의해 측정하였다.
상청액 또는 용해물 (25㎕)을 같은 부피의 4-메틸룸벨리페릴 N-아세틸-ε-D 글루코사미니드 (0.2M 소듐 시트레이트 완충제 중 500μM, pH 4.5)와 함께 블랙 96-웰 플레이트 (Nunc)에서 1시간 동안 37℃에서 인큐베이션하였다. 그 후, 트리즈마(Trizma) pH9 (90㎕)를 첨가함에 의해 반응을 종료시키고, 형광 생성물을 여기 356nm 및 방출 450nm (Tecan Safire)을 이용하여 측정하였다.
hERG 활성
8. hERG 에 대한 Cy3B 도페틸리드 플루오로 - 리간드 결합 검정
화합물 역가를 플루오로-리간드 (Cy3b-도페틸리드) 형광 분극 검정에 의해 측정하였다.
hERG-발현 CHO-K1 막* (60㎍/ml)을 검정 완충제 (25mM HEPES, 1.2mM MgCl2, 10OmM KCl 및 0.1% 플루로닉, 5M KOH를 이용하여 7.4로 pH 조정됨)에서 1.OnM 플루오로-리간드§와 함께 인큐베이션하였다. 검정에서 최종 칼륨 농도는 10OmM이었다. 실온에서 70분간 어둠 속에서 혼합시킨 후에, 10㎕를 DMSO 중에 0.1 ㎕의 시험 화합물을 함유하는 블랙 LV 그라이너 384-웰 플레이트의 각 웰에 분배하였다. 플레이트가 평형을 이루도록 2시간 동안 방치한 후 액퀘스트™/어낼리스트(Analyst)™ 이미저 상에서 판독하였다. pIC50 데이터를 11-포인트 억제 곡선 (최고 검정 농도 50μM 및 1:3 단계-희석)을 이용하여 생성하였고, 6개 변수의 곡선-핏(fit)을 데이터를 분석하고 곡선 핏을 생성하기 위해 ABase 및 XC50을 이용하여 적용하였다.
화학식(I)의 화합물은 본 검정에서 25 μM의 IC50 값을 갖는다.
* CHO - K1 막
인간 hERG 수용체를 안정하게 발현시키는 차이니즈 햄스터 난소 (CHO) 세포를 80% 컨플루언시(confluency)로 성장시킨 후 트립신화 및 후속하는 50Og에서 10분간의 원심분리에 의해 회수하였다. 막 생성 이전에 세포 펠렛을 -80℃에서 동결시켰다. 동결된 펠렛을 얼음 위에서 해동시키고, 재현탁하고, 10 부피의 막 완충제 (5OmM HEPES, pH 7.4, 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 2x10-6M 펩스타틴 A)에서 균질화하였다. 막 현탁액을 20분간 50Og에서 원심분리하고, 펠렛을 폐기하고, 상청액을 48,00Og에서 30분간 다시 회전시켰다. 두 번째 원심분리 이후에, 막 분획을 함유하는 남아있는 펠렛을 적절한 부피로 재현탁하고 (동결된 세포 펠렛 각 ml에 대해 4ml) 단백질 농도에 대해 검정하였다.
§ 플루오로 - 리간드 ( 옥타히드로벤조[2",3"]인돌리지노 [8",7":5',6'] 피라노 [ 3',2':3,4]피 리도[1,2-a]인돌-5-윰-2- 설포네이트
문헌[J. M. C. 2007, 50(13), 2931-2941]에 개시된 TFA 염.
아세토니트릴 (100㎕) 중의 용액으로서 N-[4-({2-[(6-아미노헥실)(2-{4-[(메틸설포닐)아미노]페닐}에틸)아미노]에틸}옥시)페닐]메탄설폰아미드 (1.508mg)를 실란화된 4ml 바이알 중의 고형 Cy3B-ONSu (14-{2-[(2,5-디옥소-1-피롤리디닐)옥시]-2-옥소에틸}-16,16,18,18-테트라메틸-6,7,7a,8a,9,10,16,18-옥타히드로벤조[2",3"]인돌리지노[8",7":5',6']피라노[3',2':3,4]피리도[1,2-a]인돌-5-윰-2-설포네이트 (1.7 mg, WO9931181)에 첨가하였다. 두 번째 부분의 아세토니트릴 (1OO㎕)에 이어 후니그 염기(Hunig's base) (0.9㎕)를 첨가하였다. 두 부분 (2 x 50㎕)의 디메틸포름아미드를 첨가하고, 반응 혼합물을 감압하에 농축하였다. 잔류물을 디메틸포름아미드 (200㎕)에 재용해시켰다. 후니그 염기 (0.9㎕)를 첨가하고, 혼합물을 22시간 동안 와동 혼합시켰다. 반응 혼합물을 증발에 의해 건조시키고, 아세토니트릴/물/아세트산(5/4/1, ~500㎕)에 재용해시키고, 여과하고, 하기 구배로 용리되는 반-분취용 스페리솝(Spherisorb) ODS2 HPLC 컬럼에 적용하였다 (유속 = 5ml/분, AU 5.0, 214nm, AU 2, 256nm, A = 0.1%TFA/물, B = 90% 아세토니트릴/10% 물/0.1% TFA): t=0분: B=5%; t=10분: B=5%; t=30분: B=25%; t=90분: B=55%; t=105분: B=100%; t=120분: B = 100%. 주요 성분이 46% 내지 48%B에서 용리되었고 한 분획으로 수집하여 증발에 의해 건조시키고 자줏빛 고형물을 용매로서 메탄올을 이용하여 바이알로 옮겼다. 메탄올을 감압하에 제거하고, 자줏빛 고형물을 건조 에테르로 분말화하였다. 고형물을 밤새 1 mbar에서 건조 피스톨에서 건조시켜 표제 화합물을 수득하였다 (1.2mg).
N-[4-({2-[(6- 아미노헥실 )(2-{4-[( 메틸설포닐 )아미노] 페닐 }에틸)아미노]에틸} 옥시 ) 페닐 ] 메탄설폰아미드
미정제 N-[4-({2-[[6-(1,3-디옥소-1,3-디히드로-2H-이소인돌-2-일)헥실](2-{4-[(메틸설포닐)아미노]페닐}에틸)아미노]에틸}옥시)페닐]메탄설폰아미드 (142mg)를 메틸아민 (에탄올 중의 33%, 10ml, 0.216)에 용해시키고, 22℃에서 48시간 동안 방치하였다. 과도한 시약을 감압하에 증발시키고, 지성 잔류물을 두 추가 부분의 에탄올과 공비혼합시켰다. 미정제 생성물을 아세토니트릴/물/아세트산 (5/4/, <2ml)에 용해시키고, 절반을 페노메넥스 주피터(Phenomenex Jupiter) C18 HPLC 컬럼에 적용하고, 하기 구배를 이용하여 용리시켰다 (유속 = 10ml/분, AU 20.0, 214nm, AU 10, 256nm, A = 0.1%TFA/물, B= 90% 아세토니트릴/10% 물/0.1% TFA): t=0분: B=5%; t=10분: B=5%; t=100분: B=35%; t=115분: B=100%; t=130분: B=100%. 느리게 용리되는 성분을 주로 함유하는 분획 (>90%)을 푸울링하고, 증발시켜 표제 화합물을 수득하였다 (14.9mg). 남아있는 미정제물을 개질된 구배를 이용하여 C18 컬럼에 적용시켰다: t=0분: B=5%; t=10분: B=5%; t=15분: B=10%; t=95분: B=30%; t=110분: B=100%; t=125분: B=100%. 요망되는 생성물을 주로 함유하는 분획을 합치고, 이전과 같이 증발시켜 표제 화합물을 수득하였다 (21.3mg - 80% 순도). 추가 정제 없이 상기 물질을 이용하였다.
N-[4-({2-[[6-(1,3- 디옥소 -1,3- 디히드로 -2H- 이소인돌 -2-일) 헥실 ](2-{4-[( 메틸설포닐 )아미노] 페닐 }에틸)아미노]에틸} 옥시 ) 페닐 ] 메탄설폰아미드
2-[6-([2-(4-아미노페닐)에틸]{2-[(4-아미노페닐)옥시]에틸}아미노)헥실]-1H-이소인돌-1,3(2H)-디온 (108.3mg)을 DCM (5 ml)에 용해시키고 빙조에서 0-4℃로 냉각하였다. 후니그 염기 (0.227 ml)를 첨가하고, 이어서 메실클로라이드 (0.051 ml)를 적가하였다. 반응을 0-4℃에서 0.5시간 동안 유지한 다음 서서히 실온으로 가온되게 하였다. 3시간 후, 반응 혼합물을 증발에 의해 건조시키고, 미정제물을 다음 단계에 이용하였다.
2-[6-([2-(4- 아미노페닐 )에틸]{2-[(4- 아미노페닐 ) 옥시 ]에틸}아미노) 헥실 ]-1H-이 소인 돌-1,3(2H)- 디온
2-[6-([2-(4-니트로페닐)에틸]{2-[(4-니트로페닐)옥시]에틸}아미노)헥실]-1H-이소인돌-1,3(2H)-디온 (0.35g)을 에탄올 (40ml), 물 (5ml) 및 아세트산 (5ml)의 혼합물에 용해시키고, 생성된 용액을 감압하에 탈기시켰다. 10% 탄소상 팔라듐 (56% 페이스트, 0.27 g)을 첨가하고, 생성된 혼합물을 수소 분위기하에 (대기압) 강하게 12시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 셀라이트™를 통해 여과하고, 에탄올로 세척하였다. 여액 및 세척물을 증발에 의해 건조시켜 표제 화합물 (0.313g)을 수득하였고, 이것을 추가 정제없이 이용하였다.
2-[6-([2-(4- 니트로페닐 )에틸]{2-[(4- 니트로페닐 ) 옥시 ]에틸}아미노) 헥실 ]-1H-이 소인 돌-1,3(2H)- 디온
[2-(4-니트로페닐)에틸]{2-[(4-니트로페닐)옥시]에틸}아민 (253 mg) 및 2-(6-브로모헥실)-1H-이소인돌-1,3(2H)-디온 (1186 mg)을 DMF (4ml)에 용해시키고, DIPEA (0.665ml)를 첨가하여 염기화하였다. 반응물을 120시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 증발에 의해 건조시키고, 잔류물을 DCM에 용해시키고, 용액을 실리카 패드 상에 흡수시키고, 하기 구배로 용리되는 실리카 카트리지 (12g) 상에서 정제하였다: (A = DCM, B = 메탄올) t=0분: B=10%; t=7.5분: B=0%; t=22.5분: B=5%. 요망되는 생성물을 ~15%B (등용매)에서 용리시키고 용액을 증발에 의해 건조시켜 표제 화합물 (0.364g)을 수득하였다.
[2-(4- 니트로페닐 )에틸]{2-[(4- 니트로페닐 ) 옥시 ]에틸}아민
[[2-(4-니트로페닐)에틸]아민 (498.9 mg) 및 111-[(2-브로모에틸)옥시]-4-니트로벤젠 2-브로모에틸 4-니트로페닐 에테르 (513 mg)를 DMF (5 ml)에서 22℃에서 용해시키고 DIPEA (0.872ml)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 22℃에서 60시간 동안 방치하고, 증발에 의해 건조시키고, 잔류물을 DCM에 용해시켰다. 화합물을 실리카 상에 흡수시키고, 메탄올/DCM 구배 (0-15%)로 용리되는 두 개의 배치에서 실리카 카트리지 (12g) 상에서 정제하였다. 순수한 생성물을 함유하는 분획을 푸울링하고, 용매를 감압하에 제거하였다. 생성된 표제 화합물을 진황색 오일로서 분리하였고, 이것을 고진공하에 (253mg) 부분적으로 고형화하였다.
결과
Figure pct00011
* 괄호로 묶은 데이터를 제외하고, <5 및 5.2에서 2개의 동떨어진 데이터 포인트.
참조 실시예 1은 하기 화합물이며, WO9903101073 (Yamanouchi Pharmaceutical Co Ltd)에 실시예 35로서, 라세믹 혼합물로서 개시되어 있다:
Figure pct00012
중간체 및 실시예
총론
모든 온도는 ℃이다.
DBU는 1,8-디아자바이시클로[5.4.0]운덱-7-엔을 지칭한다.
DCM은 디클로로메탄을 지칭한다.
DMSO는 디메틸설폭사이드를 지칭한다.
DMF는 N,N-디메틸포름아미드를 지칭한다.
dppf는 1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센을 지칭한다.
Ether는 디에틸 에테르를 지칭한다.
HPLC는 고성능 액체 크로마토그래피를 지칭한다.
IPA는 프로판-2-올을 지칭한다.
mCPBA는 m-클로로퍼벤조산을 지칭한다.
r.t.는 실온을 지칭한다.
TBME는 t-부틸메틸에테르를 지칭한다.
THF는 테트라히드로푸란을 지칭한다.
1H NMR 스펙트럼은 테트라메틸실란에 관해, 브루커(Bruker) DPX 400MHz를 이용하여 기록하였다.
암모니아 용액 (용매 A) 및 아세토니트릴 (용매 B)을 하기 용리 구배 0-1.5분 1 - 97% B, 1.5-1.9분 97% B, 1.9-2.0분 100% B로 이용하여 pH 10으로 조정된 물에서 1 ml/분의 유속으로 10 mM 암모늄 비카르보네이트로 용리시키며, LC/MS (방법 A)를 액퀴티(Acquity) UPLC BEH C18 컬럼 (50mm x 2.1 mm i.d. 1.7㎛ 패킹 직경) 상에서 40℃로 수행하였다. UV 검출은 210nm 내지 350nm의 파장으로부터 합계된 시그널이었다. 질량 스펙트럼을 얼티네이트-스캔(Alternate-scan) 포지티브 및 네거티브 전기분무를 이용하여 워터스(Waters) ZQ 질량 분광계 상에 기록하였다. 이온화 데이터를 가장 근접한 정수로 반올림하였다.
물 중의 0.1% v/v 포름산 용액 (용매 A) 및 아세토니트릴 중의 0.1% v/v 포름산 용액 (용매 B)을 하기 용리 구배 0-1.5분 3 - 100% B, 1.5-1.9분 100% B, 1.9-2.0분 3% B로 이용하여 1 ml/분의 유속으로, LC/MS (방법 B)를 액퀴티 UPLC BEH C18 컬럼 (50mm x 2.1 mm i.d. 1.7㎛ 패킹 직경) 상에서 40℃로 수행하였다. UV 검출은 210nm 내지 350nm의 파장으로부터 합계된 시그널이었다. 질량 스펙트럼을 얼티네이트-스캔 포지티브 및 네거티브 전기분무를 이용하여 워터스 ZQ 질량 분광계 상에 기록하였다. 이온화 데이터를 가장 근접한 정수로 반올림하였다.
실리카 크로마토그래피 기술은 미리-패킹된 카트리지 (SPE) 또는 수동으로-패킹된 플래시 컬럼 상에서의 자동화 (Flashmaster) 기술 또는 수동 기술을 포함한다.
화합물 또는 시약 이름 다음에 공급사의 명칭이 제공될 때, 예를 들어 "화합물 X (Aldrich)" 또는 "화합물 X/Aldrich", 이것은 화합물 X가 지칭된 공급사와 같은 상업적 공급사로부터 수득될 수 있음을 의미한다.
유사하게, 화합물 이름 뒤에 문헌 또는 특허 번호가 제공된 경우, 예를 들어 화합물 Y (EP 0 123 456), 이것은 그 화합물의 제조방법이 지칭된 참조문헌에 개시되어 있음을 의미한다.
상기 언급된 실시예들의 명칭은 화합물 명명 프로그램 "ACD Name Pro 6.02"를 이용하여 수득되었다.
본 발명의 화합물은 (3R,4R) 완전 입체화학을 지닌다.
2,4- 디클로로 -5- 피리미딘카르보닐 클로라이드
Figure pct00013
인 옥시클로라이드 (230ml) 중의 2,4-디히드록시-피리미딘-5-카르복실산 (5Og) 및 오염화인 (239g)의 용액을 115℃에서 밤새 교반하였다. 과량의 인 옥시클로라이드를 진공으로 제거하고 에틸 아세테이트 (200ml)를 잔류물에 첨가하였다. 혼합물을 여과하고, 여액을 농축시켜 황색 오일 (78 g)을 미정제 2,4-디클로로-5-피리미딘카르보닐 클로라이드로 수득하였으며, 이것을 추가 정제없이 다음 단계에 이용하였다.
Figure pct00014
2,4- 디클로로 -5- 피리미딘카르복사미드
Figure pct00015
1,4-디옥산 (500ml) 중의 암모니아 (14g)의 용액을 1,4-디옥산 (400ml) 중의 2,4-디클로로-5-피리미딘카르보닐 클로라이드 (78g, 미정제)의 빙냉된 교반 용액에 질소하에 적가하였다. 빙조를 제거하고, 용액을 30분 동안 교반하고, 농축시켰다. 고형 잔류물을 에틸 아세테이트 (500ml)와 포화된 수성 소듐 비카르보네이트 (500ml) 사이에서 분배시키고, 유기물을 포화된 수성 소듐 비카르보네이트 (500ml, x2)에 이어서 염수 (300ml)로 세척하였다. 유기상을 건조시키고 (소듐 설페이트) 농축시켜 황색 고형물을 수득하였다. 잔류물에 디에틸 에테르 (50ml)를 첨가하고, 생성된 현탁액을 초음파하에 8분 동안 처리한 다음 여과시켰다. 잔류물을 에틸 에테르 (50ml)로 세척하여, 표제 화합물을 백색 고형물 (3Og)로서 수득하였다.
Figure pct00016
2- 클로로 -4-[(4- 메틸페닐 )아미노]-5- 피리미딘카르복사미드
Figure pct00017
DMF (100ml) 중의 p-톨루이딘 (46.9g)의 용액을 얼음 냉각시키며 DMF (300ml) 중의 2,4-디클로로-5-피리미딘카르복사미드 (8Og) 및 트리에틸아민 (63.9ml)의 용액에 적가하였다. 실온으로 가온되게 하면서 혼합물을 2시간 동안 교반한 다음, 물(1L)에 첨가하고 20분 동안 교반하였다. 슬러리를 여과하고, 고형물을 물로 세척하였다. 고형물을 메탄올 (500ml)과 에테르 (500ml)의 혼합물에 현탁시키고, 20분 동안 교반하고, 여과시켜 2-클로로-4-[(4-메틸페닐)아미노]-5-피리미딘카르복사미드를 옅은 황색 고형물 (94.2g)로서 수득하였다.
Figure pct00018
3,6- 디히드로 -2H-피란
Figure pct00019
수산화나트륨 (10N, 1745ml)을 4-브로모테트라히드로-2H-피란 (1133.7g)에 첨가하고, 혼합물을 교반하면서 90℃로 가온시키고, ~90℃에서 27시간 동안 교반하였다. 혼합물이 주위 온도로 냉각되게 하고, 1800ml의 수성상을 분리하고, 유기상의 벌크를 수집하였다. 남아있는 수성상과 소부피의 유기상 및 계면 물질을 물(20ml)로 세척하고, 여과하고, 여액을 수산화나트륨 용액 (10N, 5ml)으로 세척하였다. 유기상을 분리하고, 벌크 물질에 첨가하여 3,6-디히드로-2H-피란 (242.2g)을 수득하였다.
Figure pct00020
3,6- 디히드로 -2H-피란
Figure pct00021
테트라히드로-4-피라놀 (1005.2g), DCM (5530ml) 및 트리에틸아민 (1640ml)을 합치고 1℃로 냉각하였다. 메실 클로라이드 (1243.8g)를 냉각되고 교반된 혼합물에 ~2.5시간에 걸쳐 제어된 방식으로 15℃ 이하의 온도를 유지하며 첨가하였다. 메실 클로라이드를 DCM (500ml)으로 세척하고, 반응물이 밤새 주위 온도로 가온되게 하였다. 혼합물을 수성 암모늄 클로라이드 (~2L, 9.8% w/w)로 처리하고, 5분 동안 교반하고, 상들을 분리하였다. 유기상을 수성 암모늄 클로라이드 (-2L, 9.8% w/w), 물 (~2L)로 세척하고, 건조시켰다 (소듐 설페이트). 유기상을 진공에서 (39℃, ~15mbar) 오일로 농축시키고, 지속적으로(on standing) 급속하게 고형화하였다 (1733.9g). 상기 물질을 52℃에서 DBU (~30Oml)로 서서히 처리하고, 30분에 걸쳐 용액을 형성하고, 이것을 DBU (1.7L)로 처리하고, 혼합물을 1시간에 걸쳐 ~100℃ (외부 온도)로 가온시키고, 이 온도에서 2시간 동안 유지하였다. 온도를 148℃ (외부)로 서서히 상승시키고 증류시켜 3,6-디히드로-2H-피란 (527.5g)을 수집하였다.
Figure pct00022
1,5:3,4- 디안히드로 -2- 데옥시펜티톨
Figure pct00023
간격을 두고 클로로포름의 부분들로 (총 ~1.5L) 고형물을 용기 목으로부터 세척해 내면서, 클로로포름 (4.22L) 중의 mCPBA (71.1 %, 1524.2g)의 현탁액에 13℃에서 ~2시간에 걸쳐 3,6-디히드로-2H-피란 (526.5g)을 첨가하였다. 추가 부분의 클로로포름 (0.5L)을 첨가하고, 반응 혼합물을 15℃에서 2.25시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 40분에 걸쳐 2O℃로 가온시키고, 2O℃에서 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 O℃로 냉각하고, 여과하고, 고형물을 냉각된 클로로포름 (3.5℃, 1055ml)으로 세척하였다. 합친 여액 및 세척물을 수성 소듐 카르보네이트 (20% w/w, 1582ml)로 세척하고, 상들을 분리하고, 유기상을 소듐 설파이트 (1 kg)로 처리하였다. 유기물을 여과하고, 진공에서 (25℃, 150mbar) 농축시켜 표제 화합물 (506g)을 수득하였다. 진공에서 농축물로부터 용매를 재농축시켜 표제 화합물의 두 번째 부분 (41.2g)을 수득하였다.
Figure pct00024
1,5- 안히드로 -2,4- 디데옥시 -2-{[(1S)-1- 페닐에틸 ]아미노}-L- 트레오 - 펜티톨
Figure pct00025
방법 1
1,5:3,4-디안히드로-2-데옥시펜티톨 (589.2g, 92.7% w/w) 을 [(1S)-1-페닐에틸]아민 (66Og) 및 이소프로판올 (500ml)에 첨가하였다. 추가의 이소프로판올 (2800ml)을 첨가하고, 혼합물을 69℃로 가온시키고, 이 온도에서 96시간 동안 유지하였다. 용매를 진공에서 증발시키고, 미정제 생성물을 TBME (2640ml)로 슬러리화하였다. 혼합물을 여과하고, 잔류물을 TBME (660ml), TBME/헵탄 (1:1, 660ml), 및 헵탄 (2 x 1320ml)으로 세척하고, 4O℃에서 진공으로 밤새 건조시켜 표제 화합물 (297.5g)을 수득하였다. TBME 및 TBME/헵탄 세척물을 합치고 진공하에 농축 건조시켰다. 잔류물을 가온시키며 TBME (990ml)에 용해시키고, 용액을 32℃로 냉각하고, 밤새 회전시켰다. 고형물을 여과에 의해 분리하고, TBME (130ml), TBME/헵탄 (1:1, 130ml), 및 헵탄 (2 x 260ml)으로 세척하였다. 고형물을 4O℃에서 진공으로 밤새 건조시켜 두 번째 크롭의 표제 화합물 (58.69g)을 수득하였다.
Figure pct00026
방법 2
2-부탄올 (1.5ml)을 1,5:3,4-디안히드로-2-데옥시펜티톨 (1.68g, 90.4% w/w) 및 [(1S)-1-페닐에틸]아민 (2.02g)의 혼합물에 첨가하고, 반응물을 90℃에서 질소하에 20시간 동안 가열하였다. 반응물을 72℃로 냉각하고, 헵탄 (13.5ml)을 30분에 걸쳐 반응 혼합물에 적가하였다. 가열을 중단하고, 반응물이 34℃로 냉각되게 하고, 고형물이 생성되지 않았으므로 반응물을 40℃로 재가온하고, 1,5-안히드로-2,4-디데옥시-2-{[(1S)-1-페닐에틸]아미노}-L-트레오-펜티톨로 시딩하였다. 생성된 현탁액을 35℃에서 30분 동안 교반하고, 30분에 걸쳐 23℃로 냉각되게 한 다음, 이 온도에서 2시간 25분 동안 방치하였다. 고형물을 여과에 의해 수집하고, 2-부탄올/헵탄 (10% v/v, 3ml) 다음에 헵탄 (2 x 6ml)으로 세척하였다. 고형물을 진공으로 35℃에서 건조시켜 표제 화합물 (1.1Og)을 수득하였다.
Figure pct00027
1,5- 안히드로 -2,4- 디데옥시 -2-{[(1R)-1- 페닐에틸 ]아미노}-L- 트레오 - 펜티톨
Figure pct00028
질소하에 -5 내지 0℃에서 교반된 DCM (20ml) 중의 [(1R)-1-페닐에틸]아민 (3.5ml)의 용액에 톨루엔 중의 트리메틸 알루미늄 (14.6ml)의 용액을 부분씩 30분에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물을 <0℃에서 40분 동안 교반한 다음 DCM (20ml) 중의 피란 에폭시드 (7.7g)의 용액을 10분에 걸쳐 첨가하였다. 얼음 냉각시키며 5시간 동안 교반을 지속하고, 반응물이 15시간에 걸쳐 가온되게 하였다. 혼합물을 얼음에서 2.5℃로 냉각하고, 소듐 플루오라이드 (5g)에 이어 물 (3.2ml)을 첨가함으로써 온도가 28℃로 상승한 후 15분이 지나 5℃로 떨어지게 하였다. 빙조를 제거하고, 1시간 동안 계속 교반하였다. 혼합물을 셀라이트 패드를 통해 여과하고, 셀라이트를 DCM (3 x ~30ml)으로 세척하였다. 3번째 세척물을 버리고, 나머지 여액을 농축시켜 무색 오일 (6.05g)을 수득하였으며, 이것을 왁시 고형물로 결정화하였다. 왁시 고형물 (5.94g)을 에테르 (10ml)로 분말화하고, 1시간 동안 방치하였다. 생성된 백색 고형물을 여과하고, 40-60 페트롤로 세척하고, 잔류물을 40-60 페트롤로 추가로 분말화하였다. 여액을 증발시켜 검 (3.04g)을 수득하였고, 여기에 40-60 페트롤 (25ml)을 첨가하고, 혼합물을 주위로 와동시키고 1시간 동안 방치하였다. 페트롤을 디캔팅하여 따로 두었다. 결정이 형성되었고 이것을 3일 후에 여과시켜 1,5-안히드로-2,4-디데옥시-2-{[(1R)-1-페닐에틸]아미노}-L-트레오-펜티톨 (104mg)을 수득하였다.
Figure pct00029
2-아미노-1,5- 안히드로 -2,4- 디데옥시 -L- 트레오 - 펜티톨
Figure pct00030
방법 1
차콜 (20% w/w, 약 50% 물로 습윤, 35g)상 수산화팔라듐 및 1,5-안히드로-2,4-디데옥시-2-{[(1S)-1-페닐에틸]아미노}-L-트레오-펜티톨 (348.6g)의 혼합물을 에탄올 (5230ml)에 현탁시켰다. 반응 용기를 수소 (15psi)로 충전하고 통기시킨 다음 (x2), 혼합물을 15psi의 수소하에 약 25℃에서 밤새 수소화시켰다. 용기를 질소로 퍼징한 다음 (x8), 수소(x1)로 퍼징하고, 15psi의 수소하에 ~5시간 동안 계속 수소화하였다. 용기를 질소 (x5)에 이어 수소 (x1)로 퍼징하고, 15psi의 수소하에 ~15시간 동안 계속 수소화하였다. 반응물을 셀라이트를 통해 여과한 다음, 1 미크론 도미니크 헌터(Dominick Hunter)를 통해 여과한 후, 용매를 진공에서 증발시켰다. 잔류물을 가온시키며 메탄올에 용해시키고, 셀라이트를 통해 여과한 다음, 0.2 미크론 도미니크 헌터를 통해 여과한 후, 용매를 진공에서 증발시켜 표제 화합물을 남겼다. 이 물질을 추가 정제없이 이용하였다.
Figure pct00031
방법 2
에탄올 (500ml) 중의 1,5-안히드로-2,4-디데옥시-2-{[(1S)-1-페닐에틸]아미노}-L-트레오-펜티톨 (25.5g)의 용액을 20% 탄소상 수산화팔라듐 (2.5g) 상에서 18시간 동안 실온에서 수소화시켰다 (1Atm). 촉매를 셀라이트 카트리지 (10g)를 통해 여과하고, 여액을 진공하에 농축 건조시켜 표제 화합물 (13.26g)을 수득하였다.
Figure pct00032
방법 3
1,5-안히드로-2,4-디데옥시-2-{[(1R)-1-페닐에틸]아미노}-L-트레오-펜티톨 (80mg)을 메탄올 (8ml)에 용해시켰다. 반응물을 탄소상 수산화팔라듐 (20%, CatCart 30) 상에서 H-큐브™ 플로우 수소화 (설정: 50℃, 50 bar, 1 ml/분 유속)를 이용하여 수소화시켰다. 생성된 용액을 질소 스트림하에 농축 건조시키고, 생성된 백색 고형물을 진공에서 건조시켜 2-아미노-1,5-안히드로-2,4-디데옥시-L-트레오-펜티톨 (21 mg)을 수득하였다.
Figure pct00033
1,5- 안히드로 -2,4- 디데옥시 -2-({[(1,1-디메틸에틸) 옥시 ]카르보닐}아미노)-L-트레오- 펜티톨
Figure pct00034
방법 1
메탄올 (1300ml) 중의 2-아미노-1,5-안히드로-2,4-디데옥시-L-트레오-펜티톨 (~184g)을 트리에틸아민 (22ml)으로 처리하였다. 메탄올 (530ml)에 용해된 비스(1,1-디메틸에틸)디카르보네이트 (369g)를 혼합물에 35분에 걸쳐 첨가하고, 메탄올 (30ml)로 세척하였다. 반응물을 20℃에서 ~21.5시간 동안 교반하고, 감압하에 농축하였다. TBME (280ml) 및 시클로헥산 (2520ml)을 잔류물에 첨가하고, 혼합물을 20℃에서 ~2.5시간 동안 교반하였다. 생성된 고형물을 여과에 의해 분리하고, 시클로헥산 (2 x 780ml)으로 세척하였다. 고형물을 30-35℃에서 감압하에 건조시켜 표제 화합물을 백색 고형물 (325.76g)로서 수득하였다.
Figure pct00035
방법 2
2-아미노-1,5-안히드로-2,4-디데옥시-L-트레오-펜티톨 (13.2g)을 TBME (220ml)에 현탁하였다. 트리에틸아민 (1.57ml) 및 비스(1,1-디메틸에틸) 디카르보네이트 (29.5g)를 첨가하고, 혼합물을 환류에서 밤새 가열하였다. 시클로헥산 (220ml)을 반응물에 첨가하고, 반응조 온도를 85℃로 상승시켜 혼합물을 환류에서 유지하였다. 반응 혼합물이 3시간에 걸쳐 서서히 실온으로 냉각되게 한 다음 냉장고에서 2시간 동안 유지하였다. 결정을 여과하고, 찬 시클로헥산/TBME (1:1, 25ml), 시클로헥산 (25ml)으로 세척하고, 감압하에 4O℃에서 건조시켜 표제 화합물 (16.44g)을 수득하였다. 두 번째 크롭의 표제 화합물을 여액으로부터 수득하였다 (0.495g).
Figure pct00036
1,5- 안히드로 -2,4- 디데옥시 -2-({[(1,1-디메틸에틸) 옥시 ]카르보닐}아미노)-3-O-(메 틸설포 닐)-L- 트레오 - 펜티톨
Figure pct00037
DCM (100ml) 중의 메탄설포닐 클로라이드 (30ml)를 DCM (900ml) 중의 1,5-안히드로-2,4-디데옥시-2-({[(1,1-디메틸에틸)옥시]카르보닐}아미노)-L-트레오-펜티톨 (75g) 및 트리에틸아민 (58ml)의 용액에 0℃에서 적가하였고, 첨가 동안 온도를 3℃ 이하로 유지하였다. 혼합물을 30분 동안 교반하고, 25℃로 가온시키고, 2시간 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물 (2x 1.4L)로 세척하고, 유기상을 건조시키고, 용매를 증발시켜 1,5-안히드로-2,4-디데옥시-2-({[(1,1-디메틸에틸)옥시]카르보닐}아미노)-3-O-(메틸설포닐)-L-트레오-펜티톨 (103.1g)을 수득하였다.
Figure pct00038
1,1-디메틸에틸[(3R,4R)-4- 아지도테트라히드로 -2H-피란-3-일]카르바메이트
Figure pct00039
소듐 아세테이트 (129g), 소듐 아지드 (102g) 및 1,5-안히드로-2,4-디데옥시-2-({[(1,1-디메틸에틸)옥시]카르보닐}아미노)-3-O-(메틸설포닐)-L-트레오-펜티톨 (232g)을 DMF (1L)에서 혼합시키고, 교반하고, 95℃에서 6시간 동안 가열하였다. 물 (2L)을 첨가하고, 혼합물을 완전히 혼합하고, 에틸 아세테이트 (1.5L)를 첨가하고, 혼합물을 5분 동안 교반하였다. 상들을 분리하고, 수성물을 에틸 아세테이트 (1L)로 추출하고, 합친 유기물을 물 (2 x 2L)로 세척하고, 건조시키고, 진공에서 농축 건조시켜 1,1-디메틸에틸 [(3R,4R)-4-아지도테트라히드로-2H-피란-3-일]카르바메이트 (153g)를 수득하였다.
Figure pct00040
1,5- 안히드로 -2,4- 디데옥시 -2-({[(1,1-디메틸에틸) 옥시 ]카르보닐}아미노)-3-O-(메 틸설포 닐)-L- 트레오 - 펜티톨
Figure pct00041
산화백금 및 1,1-디메틸에틸 [(3R,4R)-4-아지도테트라히드로-2H-피란-3-일]카르바메이트 (42g)의 혼합물을 질소로 퍼징하고 (x3) 에탄올 (1L)을 첨가하였다. 용기를 퍼징하고 (x3), 수소를 충전하고, 20℃에서 냉각시키며 400rpm에서 교반하고, 3시간 동안 교반하였다. 용기를 질소로 퍼징하고 (x3), 수소를 다시 채우고, 추가로 3.5시간 동안 교반하였다. 용기를 퍼징하고 수소를 15psi로 다시 채우고, 밤새 교반하였다. 용기를 퍼징하고, 다시 채우고, 1.5시간 동안 교반하였다. 혼합물을 셀라이트를 통해 질소 분위기하에 여과하고, 필터 케익을 에탄올로 세척하고 (2x 500ml), 여액을 진공에서 농축 건조시켜 1,1-디메틸에틸 [(3R,4R)-4-아미노테트라히드로-2H-피란-3-일]카르바메이트 (38g)를 수득하였다.
Figure pct00042
1,1-디메틸에틸 [(3R,4R)-4-({5-( 아미노카르보닐 )-4-[(4- 메틸페닐 )아미노]-2-피 리미디 닐}아미노) 테트라히드로 -2H-피란-3-일] 카르바메이트
Figure pct00043
DMF (250ml) 중의 1,1-디메틸에틸 [(3R,4R)-4-아미노테트라히드로-2H-피란-3-일]카르바메이트 (38g), 2-클로로-4-[(4-메틸페닐)아미노]-5-피리미딘카르복사미드 (46.2g) 및 트리에틸아민 (49.0ml)의 혼합물을 가열하고, 90℃에서 교반하였다. 혼합물을 물 (1L)에 첨가하고, 고형 침전물을 여과에 의해 수집하였다. 침전물을 물로 세척하고 (2 x 200ml) 밤새 4O℃에서 진공으로 건조시켰다. 생성물을 에틸 아세테이트 (600ml)에 현탁시키고, 30분 동안 환류 가열하고, 얼음에서 5℃로 냉각하고, 생성물을 여과에 의해 수집하였다. 이것을 에틸 아세테이트로 세척하고 (2 x 100ml) 40℃에서 진공으로 건조시켜 1,1-디메틸에틸 [(3R,4R)-4-({5-(아미노카르보닐)-4-[(4-메틸페닐)아미노]-2-피리미디닐}아미노)테트라히드로-2H-피란-3-일]카르바메이트 (53.Og)를 수득하였다
Figure pct00044
실시예 1 - 2-{[(3R,4R)-3- 아미노테트라히드로 -2H-피란-4-일]아미노}-4-[(4- 메틸페닐)아미노]-5- 피리미딘카르복사미드
Figure pct00045
1,1-디메틸에틸 [(3R,4R)-4-({5-(아미노카르보닐)-4-[(4-메틸페닐)아미노]-2-피리미디닐}아미노)테트라히드로-2H-피란-3-일]카르바메이트 (52.2g)를 이소프로판올 (5M, 300 ml) 및 에탄올 (400ml) 중의 염화수소의 혼합물에 첨가하였다. 혼합물을 24시간 동안 교반하고 계속 가열하면서 강한 교반과 함께 환류로 가열하였다. 혼합물이 실온으로 냉각되게 하고, 여과하고, 고형물을 에탄올 (100ml)로 세척하고, 진공에서 건조하였다. 미정제 생성물을 물 (900ml)에 현탁하고, 환류로 가열시켜 투명한 용액을 수득하였다. 용액을 수산화나트륨 용액 (2M, 300ml)으로 염기화하고, 얼음에서 냉각하였다. 침전된 생성물을 여과에 의해 수집하고, 물로 세척하고 (2 x 100ml), 베이지색 고형물을 진공 오븐에서 40℃에서 2시간 동안 건조시켜 2-{[(3R,4R)-3-아미노테트라히드로-2H-피란-4-일]아미노}-4-[(4-메틸페닐)아미노]-5-피리미딘카르복사미드를 베이지색 고형물 (37.8 g)로서 수득하였다.
Figure pct00046
2-{[(3R,4R)-3-아미노테트라히드로-2H-피란-4-일]아미노}-4-[(4-메틸페닐)아미노]-5-피리미딘카르복사미드 (37.8g)를 에탄올 (1.2 litres)에서 환류로 가열하였다. 고온 용액을 유리 신터(scinter) 깔때기를 통해 여과하여 용해되지 않은 앙금을 제거하고, 여액이 실온으로 서서히 냉각되게 한 다음, 얼음에서 5℃로 냉각하고, 고형 결정 생성물을 여과에 의해 수집하여 2-{[(3R,4R)-3-아미노테트라히드로-2H-피란-4-일]아미노}-4-[(4-메틸페닐)아미노]-5-피리미딘카르복사미드 (36.6g)를 옅은 베이지색 결정질 고형물로서 수득하였다.
XRPD 데이터를 엑셀러레이터(X'Celerator) 검출기가 구비된, 패낼리티컬 엑스퍼트 프로(PANalytical X'Pert Pro) 분말 회절분석계 상에서 획득하였다. 획득 조건은 다음과 같았다: 방사: Cu Kα, 발전기 전압: 40 kV, 발전기 전류: 45 mA, 시작 각: 2.0°2θ, 끝 각: 40.0°2θ, 단계 크기: 0.0167°2θ. 단계 당 시간은 31.750s였다. 수 밀리그램의 샘플을 Si 웨이퍼 (백그라운드 0) 플레이트 상에 탑재하여 분말의 얇은 막을 야기함에 의해 샘플을 제조하였다. 이에 따라, 수득된 스펙트럼을 도 1로서 도시한다.

Claims (11)

  1. 하기 화학식(I)의 화합물 또는 이의 염, 바람직하게는 이의 약제학적으로 허용되는 염:
    Figure pct00047
    .
  2. 제 1항에 있어서, 2-{[(3R,4R)-3-아미노테트라히드로-2H-피란-4-일]아미노}-4-[(4-메틸페닐)아미노]-5-피리미딘카르복사미드인 화학식(I)의 화합물 또는 이의 염, 바람직하게는 이의 약제학적으로 허용되는 염.
  3. 하기 화학식(II)의 화합물을 하기 화학식(III)의 화합물과 반응시키고, 그 후 보호기를 제거하는 것을 포함하여, 제 1항 또는 제 2항에 정의된 화학식(I)의 화합물 또는 이의 염을 제조하는 방법:
    Figure pct00048

    Figure pct00049

    상기 식에서, P는 보호기, 예를 들어 부톡시카르보닐 (Boc)이다.
  4. 제 1항 또는 제 2항에 정의된 화학식(I)의 화합물 또는 이의 염과 약제학적으로 허용되는 부형제를 포함하는 약제 조성물.
  5. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 치료에 사용되는 화학식(I)의 화합물 또는 이의 염.
  6. 비장 티로신 키나아제(Syk 키나아제)를 억제하기 위한 약제의 제조에서 제 1항 또는 제 2항에 정의된 화학식(I)의 화합물 또는 이의 염의 용도.
  7. 치료가 필요한 환자에게 제 1항 또는 제 2항에 정의된 유효량의 화학식(I)의 화합물 또는 이의 약제학적으로 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하여, 암, 특히 헴(heme) 악성종양, 특히 난포 (FL), 외투 세포, 버킷(Burkitt) 및 미만성 큰 B 세포 (DLBCL) 림프종을 포함하는 비호지킨 림프종(Non-Hodgkin's Lymphomas)을 치료하는 방법.
  8. 부적절한 비만 세포 활성화와 연관된 질병을 치료하기 위한 약제의 제조에서 제 1항 또는 제 2항에 정의된 화학식(I)의 화합물 또는 이의 염의 용도.
  9. 염증 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에서 제 1항 또는 제 2항에 정의된 화학식(I)의 화합물 또는 이의 염의 용도.
  10. 알레르기 질환을 치료하기 위한 약제의 제조에서 제 1항 내지 제 7항 중의 어느 한 항에 정의된 화학식(I)의 화합물 또는 이의 염의 용도.
  11. 비염을 치료하기 위한 약제의 제조에서 제 1항 내지 제 7항 중의 어느 한 항에 정의된 화학식(I)의 화합물 또는 이의 염의 용도.
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