KR20110035668A

KR20110035668A - 생존율이 우수한 신규 바실러스 서브틸리스 ５―ｂ 균주 및 이를 포함하는 사료용 첨가제 조성물

Info

Publication number: KR20110035668A
Application number: KR1020090093481A
Authority: KR
Inventors: 황부해; 윤기홍; 남창진; 홍승국; 김진원; 조봉래; 이미성
Original assignee: 예천군(농업기술센터 장); 윤기홍
Priority date: 2009-09-30
Filing date: 2009-09-30
Publication date: 2011-04-06
Also published as: KR101155158B1

Abstract

본 발명은 섬유질계 및 반섬유질계 물질의 가수분해 효소 생산능이 뛰어난 동시에 장기간 생존율이 우수한 신균주 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 5-B 균주(KCTC 11550BP)에 관한 것이다. 본 발명의 바실러스 서브틸리스 신균주는 가축의 장내에서도 활성이 크게 감소되지 않는 셀룰라아제, 자일라나아제 및 만나아제를 생성하여 가축 사료의 주성분인 섬유질계 및 반섬유질계 물질의 분해능이 우수하고, 실온의 건조한 조건에서도 장기간 생존율이 유지되어 보관성이 매우 뛰어나다. 따라서, 본 발명의 균주는 사료용 첨가제 조성물의 유효성분으로서 유용하게 사용될 수 있다.

바실러스 서브틸리스 5-B, 생존율, 포자화 효율, 섬유질계 물질, 반섬유계 물질, 가수분해효소

Description

생존율이 우수한 신규 바실러스 서브틸리스 ５―Ｂ 균주 및 이를 포함하는 사료용 첨가제 조성물{Novel Bacillus Subtilis 5-B Strain and Composition for Forage Additive Comprising the Same}

본 발명은 섬유질계 및 반섬유질계 물질의 가수분해 효소 생산능이 뛰어난 동시에 장기 생존율이 우수한 신규 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 5-B 균주(KCTC 11550BP)에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 신균주의 대량 배양 방법 및 이 균주 또는 이의 배양물을 포함하는 사료 첨가용 조성물에 관한 것이다.

국내외적으로 식품에 대한 공중위생 및 안전성에 대한 관심이 높아지는 현실에서 가축의 성장촉진과 사료효율 향상을 목적으로 첨가되는 항균성 사료첨가물의 잔류성 및 내성균 문제가 지속적인 논란의 대상이 되고 있다. 이 때문에 이러한 항균성 사료 첨가물을 대체할 수 있는 유용한 자원의 개발이 시급하며 이를 위하여 생균제, 프리바이오틱스, 효소제 등에 대한 연구가 활발히 진행되고 있다.

가축의 장내세균총은 가축의 생산성과 밀접한 관련성을 지니고 있는데, 장내 균총을 정상적으로 유지하는 것은 가축의 질병예방, 항생제 사용의 감소 및 생산성 향상과 직접적으로 연관되어 있으며 이러한 점 때문에 생균제 개발에 대한 연구가 지속적으로 이루어지고 있다.

생균제란 가축의 소화관내에서 유용하게 작용하는 미생물제제를 의미하며 광의의 개념에서는 사일리지 첨가 및 발효사료용 첨가제와 같이 가축에 급여전에 사용되는 미생물도 포함하지만 이러한 미생물들은 주로 체외에서 작용하기 점에서 볼때 일반적으로 가축용 생균제라고 하는 경우에 실질적으로 가축에 직접 급여하는 미생물제를 의미한다. 생균제를 의미하는 용어 프로바이오틱스(probiotics)는 1965년에 릴리(Lilly)와 스틸웰(Stilwell)에 의해 제창되었으며 1975년 이후에 일반화되어 세계적으로 사용되어 오고 있다. 프로바이오틱스는 그리스어의 공생의 의미에서 유래하고 있으며 항생제(antibiotics)와는 달리 생물 상호간에 생명 활동유지에 유익한 관계를 의미한다. 지금까지 개발되어 상용되고 있는 생균제용 균주로는 바실러스, 유산균, 효모, 비피더스균, 장구균과 진균 등을 들 수 있다. 이들 생균제용 균주 중 바실러스균은 가축의 장내와 배양액에서 사료의 난분해성 성분을 분해할 수 있는 효소들을 생산한다. 특히, 바실러스 서브틸리스균은 사료에 다량 포함되어 있는 섬유질계와 반섬유질계 물질의 분해효소를 생산하는데, 알곡을 감싸고 있는 셀룰로즈와 헤미셀룰로즈 층을 가수분해함으로써 가축이 알곡내에 있는 영양분을 용이하게 이용할 수 있게 할 뿐만 아니라 가축의 장내 소화물의 상태를 개선시킬 수 있는 효과를 갖는다. 헤미셀룰로즈 함량이 높은 사료를 사용할 경우 가축에 연변이나 적리 현상이 일어나기 쉬운데 자일라나아제, 만나아제와 셀룰라아제 를 생산하는 바실러스 서브틸리스 생균제는 이러한 현상을 예방할 수 있고, 사료의 가치를 올려줄 뿐만 아니라 소맥제품의 품질의 편차를 개선하여 소맥제품을 안정적인 사료원료로 사용할 수 있게 함으로써 사료 첨가용 효소로 그 가치가 높다. 또한, 이러한 바실러스 서브틸리스 생균제는 가축의 사료효율 개선 및 증체율 향상, 장관내 미생물총 정상화, 연유기산 생성을 통한 유해균의 소화기성 질병 발생 억제와 항생제 일부 대체 효과 등을 갖기도 한다.

그러나, 바실러스 서브틸리스균을 생균제로 사용할 경우 상기와 같이 많은 유용한 점이 있음에도 불구하고 현재 생균제로서 사용되고 있는 균주의 대부분은 배양 후 생존율이 급격히 낮아지는 문제점이 있어 가축의 장내에서 바실러스 서브틸리스가 갖는 우수한 특성을 제대로 나타내지 못하고 있는 문제점이 있다.

본 명세서 전체에 걸쳐 다수의 논문 및 특허문헌이 참조되고 그 인용이 표시되어 있다. 인용된 논문 및 특허문헌의 개시 내용은 그 전체로서 본 명세서에 참조로 삽입되어 본 발명이 속하는 기술 분야의 수준 및 본 발명의 내용이 보다 명확하게 설명된다.

본 발명자들은 바실러스 균주를 가축 사료 용도의 생균제로 사용하는 경우에 발생될 수 있는 문제점들을 해결할 수 있는 새로운 바실러스 서브틸리스 균주를 동 정하고 개발하기 위해 연구 노력하였다. 그 결과 섬유질계와 반섬유질계 물질의 분해효소를 생산 능력이 우수하면서 동시에 장기간 생존능도 매우 뛰어난 신규의 바실러스 서브틸리스 균주를 분리 동정하였고, 이를 대량 배양하는 방법을 확립함으로써 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 섬유질계 및 반섬유질계 물질의 가수분해 효소 생산능이 뛰어남과 동시에 장기간 생존율이 우수한 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 5-B 균주(KCTC 11550BP)를 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 5-B 균주(KCTC 11550BP)의 대량생산을 위한 배양 방법을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 다른 목적은 상기 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 5-B 균주(KCTC 11550BP) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가용 조성물을 제공하는 것에 있다.

본 발명의 목적 및 장점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구의 범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.

본 발명의 일 양태에 따르면, 본 발명은 섬유질계 및 반섬유질계 물질의 가수분해 효소 생산능이 뛰어남과 동시에 장기간 보관시에도 생존율이 우수한 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 5-B 균주(KCTC 11550BP)를 제공한다.

본 발명의 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 5-B 균주 (KCTC 11550BP)를 트립톤, 소이톤, 덱스트로즈, 염화나트륨(NaCl) 및 인산칼륨을 포함하는 TSB(tryptic soy broth) 배지에서 진탕 배양하는 단계를 포함하는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 5-B 균주(KCTC 11550BP)의 대량생산을 위한 배양 방법을 제공한다.

본 발명의 또 다른 일 양태에 따르면, 본 발명은 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 5-B 균주(KCTC 11550BP) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가용 조성물을 제공한다.

본 발명의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 5-B 균주(KCTC 11550BP)는 한국의 전통식품인 된장에서 생존능이 우수한 균주를 분리하여 얻은 것이다.

본 발명의 균주는 형태학적, 생화학적 및 유전학적 특성을 조사하여 최종 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 5-B 균주로 동정하고, 2009년 8월 24일자로 한국생명공학연구원내 유전자은행에 기탁번호 KCTC 11550BP로 기탁되어 있다.

본 발명의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 5-B 균주(KCTC 11550BP)의 특징은 섬유질계 및 반섬유질계 물질의 분해능이 우수한 셀룰라아제, 자일라나아제 및 만나아제의 생성 및 분비능이 우수하다는 것에 있다. 본 발명의 균주에 의해 생성되는 셀룰라아제, 자일라나아제 및 만나아제는 가축의 장내 환경에서도 활성이 크게 감소되지 않는다. 본 발명의 균주의 배양물에 포함되어 있는 상기 효소는 사료의 주성분으로서 가축의 체내에서 분해되기 어려운 성분인 섬유질계 및 반섬유질계 물질을 효율적으로 분해하여 가축 동물의 사료 이용 효율을 높여주며 가축의 장내균총을 정상적으로 유지시키고 소화기성 질병을 예방하는데 적합하다.

본 발명의 신균주 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 5-B 균주 (KCTC 11550BP)의 다른 특징은 건조한 조건에서 보관시 장기간 생존율이 우수하다는 점에 있다.

본 발명의 균주는 가축 사료용 부형제와 혼합한 후 건조한 상태로 실온에서 장기간 보관하는 경우에도 매우 우수한 생존율을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 균주는 배양후 이를 사료용 첨가제로 제형화하여 보관하여도 생균제로서 장기간 유지가 가능하여 사료용 생균제로서 활용도가 매우 높다.

본 발명의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 5-B 균주(KCTC 11550BP)는 공지된 바실러스 서브틸리스 균주의 배양방법을 통해 배양할 수 있다. 배지로는 천연배지 또는 합성배지를 사용할 수 있다. 배지의 탄소원으로는 예를 들어, 글루코오스, 수크로오스, 덱스트린, 글리세롤, 녹말 등이 사용될 수 있고, 질소원으로는 펩톤, 육류 추출물, 효모 추출물, 건조된 효모, 대두 케이크, 우레아, 티오우레아, 암모늄염, 나이트레이트 및 기타 유기 또는 무기 질소-함유 화합물이 사용될 수 있으나, 이러한 성분에 한정되는 것은 아니다. 배지에 포함되는 무기염으로는 마그네슘, 망간, 포타슘, 칼슘, 철 등의 포스페이트, 나이트레이트, 카보네이트, 클로라이드 등이 사용될 수 있으나, 이들에 한정되는 것은 아니다. 상기 탄소원, 질소원 및 무기염의 성분 이외에 아미노산, 비타민, 핵산 및 그와 관련된 화합물들이 배지에 첨가될 수 있다.

본 발명의 균주는 공지되어 있는 바실러스 서브틸리스 균주의 배양조건에 따라 배양될 수 있다. 예를 들어, 20-50℃의 온도 범위에서 12시간 - 5일 동안 배양할 수 있다.

본 발명은 본 발명의 신균주의 대량 생산을 위한 배양 방법을 제공한다. 본 발명의 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 5-B 균주(KCTC 11550BP)를 트립톤, 소이톤, 덱스트로즈, 염화나트륨(NaCl) 및 인산칼륨을 포함하는 TSB(tryptic soy broth) 배지에서 진탕 배양하면 균주의 포자화가 유도되어 생존능이 우수한 균을 대량 배양이 가능하다. 균주의 포자화를 유도하여 생존능을 최대화하기 위해서는 바람직하게는 30-40℃의 온도 범위, pH 6.0-8.0의 범위에서 20 시간 이상, 보다 바람직하게는 24 시간 이상 배양한다.

본 발명의 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 5-B 균주 (KCTC 11550BP)는 섬유질계 및 반섬유질계 물질의 분해능이 우수한 효소를 생성하는 동시에 실온에서의 장기간 보관시에도 생존능이 뛰어나므로 가축 사료 첨가용 조성물에 유효성분으로 포함될 수 있다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물에는 구연산, 후말산, 아디픽산, 젖산, 사과산 등의 유기산이나 인산나트륨, 인산칼륨, 산성피로인산염, 폴리인산염(중합인산염) 등의 인산염이나 폴리페놀, 카테킨(catechin), 알파-토코페롤, 로즈메리 추출물(rosemary extract), 비타민 C, 녹차 추출물, 감초 추출물, 키토산, 탄닌산, 피틴산 등의 천연 항산화제 중 어느 하나 또는 하나 이상을 추가로 포함할 수 있다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물에는 아미노산, 무기염류, 비타민, 항생물질, 항균물질, 항산화, 항곰팡이 효소, 다른 생균 형태의 미생물 제제 등과 같은 보조제 성분; 곡물, 예를 들면 분쇄 또는 파쇄된 밀, 귀리, 보리, 옥수수 및 쌀; 식물성 단백질 사료, 예를 들면 평지, 콩 및 해바라기를 주성분으로 하는 것; 동물성 단백질 사료, 예를 들면 혈분, 육분, 골분 및 생선분; 당분 및 유제품, 예를 들면 각종 분유 및 유장 분말로 이루어지는 건조성분; 지질, 예를 들면 가열에 의해 임의로 액화시킨 동물성 지방 및 식물성 지방 등과 같은 주성분; 영양보충제, 소화 및 흡수향상제, 성장촉진제, 질병예방제와 같은 첨가제가 포함될 수 있다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물은 건조 또는 액체 상태의 제제 형태일 수 있으며, 사료 첨가용 부형제를 포함할 수 있다. 사료 첨가용 부형제로는 예를 들어, 제올라이트, 옥분 또는 미강 등을 들 수 있으나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물은 하나 이상의 효소 제제를 추가로 포함할 수 있다. 예를 들어 리파제와 같은 지방 분해효소, 피틴산(phytic acid)을 분해하여 인산염과 이노시톨인산염을 만드는 파이타제(phytase), 녹말과 글리코겐 등에 포함되어 있는 알파-1,4-글리코시드 결합(α-1,4-glycoside bond)을 가수분해하는 효소인 아밀라제, 유기인산에스테르를 가수분해하는 효소인 포스파타제(phosphatase), 셀룰로스를 분해하는 카르복시메틸셀룰라제, 자일로스를 분해하는 자일라나제, 말토오스를 두 분자의 글루코스로 가수분해하는 말타제 및 사카로스를 가수분해하여 글루코스-프룩토스 혼합물을 만드는 전환효소 등을 포함할 수 있다.

본 발명의 가축 사료 첨가용 조성물은 동물에게 단독으로 투여되거나 식용 담체 중에서 다른 사료 첨가제와 조합되어 투여될 수 있다. 또한, 상기 가축 사료 첨가용 조성물에는 탑 드레싱으로서 또는 이들을 가축 사료에 직접 혼합하거나 또는 사료와 별도로, 별도의 경구 제형으로, 또는 다른 성분과 조합하여 쉽게 투여할 수 있다. 통상적으로, 당업계에 잘 알려진 바와 같이 단독 일일 섭취량 또는 분할 일일 섭취량을 사용할 수 있다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물이 사용될 수 있는 동물은 예를 들어 식용우, 젖소, 송아지, 돼지, 돼지새끼, 양, 염소, 말, 토끼, 개, 고양이 등과 같은 가축, 병아리, 알닭, 가정용 닭, 수탉, 오리, 거위, 칠면조, 메추라기, 작은새 등과 같은 가금류를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

본 발명의 사료 첨가용 조성물에 포함되는 본 발명의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 5-B 균주의 양은 특별히 한정되지 않으나, 가축의 소화관에서 장기간 생존하면서 섬유질계 및 반섬유질계 물질을 분해하기에 적합한 양으로 포함된다. 바람직하게는 사료 첨가용 조성물은 사료 1 ㎏ 당 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 5-B 균주 (KCTC 11550BP) 10²- 10¹⁵세포, 보다 바람직하게는 10⁴- 10¹²세포, 보다 더 바람직하게는 10⁷-10¹¹세포를 포함한다.

이상에서 상세히 설명된 바와 같이 본 발명은 신 균주인 바실러스 서브틸리스 5-B (Bacillus subtilis 5-B) (KCTC 11550BP) 균주에 관한 것이다. 본 발명의 바실러스 서브틸리스 신균주는 가축의 장내에서도 활성이 크게 감소되지 않는 셀룰 라아제, 자일라나아제 및 만나아제를 생성 분비함으로써 가축 사료의 주성분인 섬유질계 및 반섬유질계 물질의 분해능이 우수한 특성이 있고, 실온의 건조한 조건에서 장기간 생존율이 유지되어 보관성이 매우 뛰어나다. 본 발명의 균주 및 이의 배양물을 사료용 첨가제 조성물에 사용하면 사료의 주성분으로서 가축의 체내에서 분해되기 어려운 성분인 섬유질계 및 반섬유질계 성분을 효율적으로 분해하여 가축 동물의 사료 이용 효율을 높여주며 가축의 장내균총을 정상적으로 유지시키고 소화기성 질병을 예방하는 효과를 얻을 수 있다. 또한, 사료용 첨가제로 장기간 보관하여도 생존능이 유지되어 사료용 생균제로서 활용도가 매우 높다.

이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 요지에 따라 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에 있어서 자명할 것이다.

실시예

실시예 1: 된장으로부터 생존능이 높은 바실러스 균주의 분리

전통식품인 된장시료 1g을 생리식염수 10 ㎖에 현탁하고, 현탁액의 적당량을 취하여 트립톤 10 g/L, 효모추출물 5 g/L, 염화나트륨(NaCl) 5 g/L, 박토아 가(Bactoagar) 18 g/L을 포함하는 LB 한천배지에 도말한 후 37℃에서 배양하였다. 고체 LB 한천배지에서 형성된 콜로니 중에서 모양과 크기가 다른 균주를 분리한 후 이를 LB 액체배지에 접종하여 37℃에서 24 시간 진탕배양한 후 배양한 균액을 5％(v/w)가 되도록 옥분과 혼합하였다. 균액이 혼합된 옥분을 실온에서 일주일간 방치한 후 혼합물 1g을 생리식염수 10 ㎖에 현탁하고, 현탁액을 적당량 취하여 LB 한천배지에 도말한 후 37℃에서 배양하여 형성된 생균수를 측정하여 생존율이 가장 우수한 균주를 최종적으로 선발하였다. 선발한 균주를 바실러스 서브틸리스 5-B (Bacillus subtilis 5-B) 균주로 명명하였다.

실시예 2: 바실러스 서브틸리스 5-B 균주의 동정 및 특성조사

상기 실시예 1에서 생존율이 우수한 것으로 분리된 균주를 동정하기 위해 형태학적 및 생화학적 특성과 16S 리보좀 RNA(16S rRNA)의 염기서열을 조사하였다.

상기 실시예 1에서 분리한 균주의 형태적 특성 및 생화학적 특성은 하기 표 1 및 표 2에 각각 나타내었다. 분리 균주의 형태학적 특성 및 생화학적 특성과 버기의 매뉴얼(Bergy's manuals of determinative bacteriology)에 기재된 균주 특성과 비교하여 바실러스 속 균주로 동정하였다.

추가적으로 분리 균주의 당 발효에 관한 생화학적 특성을 조사한 결과 바실러스 속 균주 중 바실러스 서브틸리스 균과 유사도가 가장 높았으며, 16S 리보좀 RNA의 염기서열을 분석한 결과(도 1 참조, 서열목록 제 1 서열)에 의해 바실러스 서브틸리스와 100 ％의 상동성을 보였다. 따라서, 본 발명에서 분리한 균주를 바 실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 5-B 균주로 최종적으로 동정하였다. 분리 및 동정한 신규 바실러스 서브틸리스 5-B 균주는 한국생명공학연구원내 유전자 은행(Korean Collection for Type Cultures)에 2009년 8월 24일에 기탁번호 KCTC 11550BP로 기탁하였다.

구분	반응
세포형태 (Shape)	간균
포자형성능(Endospore)	+
포자 형태(Spore shape)	타원형
포자 위치(Spore position)	중앙
운동성(Motility)	+
그람염색(Gram staining)	+
카탈라아제(Catalase) 활성	+
자일란 가수분해 (Xylan hydrolysis)	+
갈락토만난 가수분해 (Galactomannan hydrolysis)	+
셀룰로즈 가수분해 (Cellulose hydrolysis)	+
탈지유 가수분해 (Skim milk hydrolysis)	+
전분 가수분해 (Starch hydrolysis)	+

당발효에 의한 산 생성

반응성

글리세롤(Glycerol), 아라비노스(L-Arabinose), 리보스(D-Ribose),
자일로스(D-Xylose), 글루코스(Glucose), 프록토스(Fructose),
만노스(Mannose), 만니톨(Mannitol), 소르비톨(Sorbitol),
메틸-α-D-글루코피라노시드(Methyl-α-D-Glucopyranoside),
아세틸글루코사민(N-Acetylglucosamine), 아미그달린(Amygdalin),
아르부틴(Arbutin), 에스쿠린(Esculin), 살리신(Salicin),
셀로비오스(Cellobiose), 말토스(Maltose), 사카로스(Saccharose),
트레할로스(Trehalose), 이눌린(Inulin), 아미돈(Amidon),
글리코겐(Glycogen), 젠티오비오스(Gentiobiose),
투라노스(D -Turanose), 타가토스(D-Tagatose), 람노스(Rhamnose),
글루코네이트(Gluconate), 갈락토스(Galactose), 이노시톨(Inositol),
에리쓰리톨(Erythritol), 아라비노스(D-Arabinose), 락토스(Lactose),
자일로스(L-Xylose), 아도니톨(adonitol), 멜리비오스(Melibiose),
메틸-β-D-자일로피라노시드(Methyl-β-D- Xylopyranoside),
소르부스(L-Sorbose), 둘시톨(Dulcitol), 라피노스(Raffinose),
메틸-α-D-만노피라노시드(Methyl-α-D-Mannopyranoside),
멜레지토스(D-Melezitose), 자일리톨(Xylitol), 리소스(D-Lyxose),
푸코스(D-Fucose), 푸코스(L-Fucose), 아라비톨(D-Arabitol),
아라비톨(L-Arabitol),
포타슘 2-케토글루코네이트(Potassium 2-ketogluconate),
포타슘 5-케토글루코네이트(Potassium 5-ketogluconate)

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실시예 3: 본 발명 바실러스 서브틸리스 5-B 균주가 생산하는 균체외 섬유질계와 반섬유질계 물질의 가수분해 효소의 반응특성

본 발명에서 분리한 균주 바실러스 서브틸리스 5-B 균주로부터 분비되는 효소중에서 가축의 사료에 주로 포함되는 섬유질계 물질과 반섬유질계 물질의 분해능이 있는 효소의 활성을 평가하였다. 효소의 활성 평가는 셀룰라아제, 자일라나아제 및 만나아제의 효소에 대해 카르복시메틸셀룰로즈, 귀리 자일란, 아카시아 열매수지 갈락토만난의 가수분해 활성을 반응온도와 pH에 따라 조사하였다.

우선, 균주의 배양상등액을 농축하고 황산암모늄염(ammonium sulfate)의 농도를 25-75％ 범위가 되도록 분획하여 침전물을 얻은 다음 20 mM 인산나트륨 (sodium phosphate) 완충용액 (pH 6.0)에 현탁하고, 동일한 완충용액으로 투석하였다. 투석한 효소액을 사용하여 반응온도와 pH를 달리하면서 셀룰라아제, 자일라나아제와 만나아제 활성을 측정하였다.

도 2에서 보여지는 바와 같이, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 5-B 균주가 생산하는 셀룰라아제는 60℃와 pH 5.0 부근에서 최고의 효소 활성을 보였으며, 동물의 장내 pH인 pH 6.5와 장내 온도인 37℃에서 최고 효소활성의 각각 80％와 50％의 활성도를 나타내었다. 따라서, 본 발명의 균주가 생산하는 셀룰라아제가 생리적 조건인 중성부근의 pH와 생체온도에서 우수한 활성을 지니는 것으로 확인하였다.

도 3의 결과에서 보여지는 바와 같이, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 5-B 균주가 생산하는 자일라나아제는 55℃와 pH 6.0 부근에서 최고의 효소 활성을 보였으며, 동물의 장내 pH인 pH 6.5와 장내 온도인 37℃에서 최고 효소활성의 각각 80％와 50％의 활성도를 나타내었다. 따라서, 본 발명의 균주가 생산하는 자일라나아제는 생리적 조건인 중성부근의 pH와 생체온도에서 우수한 활성을 지니는 것으로 확인하였다.

도 4의 결과에서 보여지는 바와 같이, 본 발명의 바실러스 서브틸리스 5-B 균주가 생산하는 만나아제는 60℃와 pH 5.5 부근에서 최고의 효소 활성을 보였으며, 동물의 장내 pH인 pH6.5와 장내 온도인 37℃에서 최고 효소활성의 80％와 50％의 반응성을 나타내어 생리적 조건인 중성부근의 pH와 생체온도에서 우수한 반응성을 지니는 것으로 확인되었다.

실시예 4 : 바실러스 서브틸리스 5-B 균주의 포자화율의 조사

액체 배양된 바실러스 서브틸리스의 생존율을 유지하기 위해서는 배양된 균체가 휴지세포인 포자로 전환되는 것이 중요하다. 따라서 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 5-B 균주 (KCTC 11550BP)를 트립톤 17g/L, 소이톤 3g/L, 덱스트로즈 2.5g/L, 염화나트륨(NaCl) 5g/L, 인산칼륨 2.5g/L을 포함하고, pH가 7.0으로 맞춘 TSB(tryptic soy broth) 배지에 접종하여 37℃에서 진탕 배양하였다. 배양중에 배양시간이 16 시간, 20 시간, 24 시간이 되었을 때 각각 일정량의 배양액을 회수한 후 이를 80℃에서 30 분간 열처리하여 영양세포는 사멸시키고 내열성이 높은 포자의 수를 측정하였다. 포자의 수는 열처리된 균액을 적정량 취해 LB 평판배지에 도말하고 37℃에 20 시간 배양한 후에 형성되는 콜로니의 수를 측정함으로써 결정하였다. 열 처리를 하지 않은 균액을 적정량 취해 동일한 방법으로 얻은 배양액의 생균수를 대조군으로 사용하였다.

실험결과 표 3 바실러스 서브틸리스 5-B 균주의 포자화 효율에 나타난 바와 같이 16 시간 배양한 균액에서는 열처리 후 생존한 균수가 1％ 이하로 나타났고, 20 시간을 배양한 경우에는 포자화된 균수는 66％로 나타났고, 24 시간을 배양한 균액에서는 열처리한 후 생균수와 열처리전의 생균수가 동일하여 대부분이 포자화된 것을 알 수 있었다. 포자는 건조나 열에 강한 특성을 지니고 있어 포자화율이 높은 본 발명의 바실러스 서브틸리스 5-B 균주는 사료첨가용 생균제로 사용시 생존율을 높게 유지할 수 있는 특성이 될 수 있다.

배양시간 (시간)	열처리 전	열처리 후	포자수율(%)
16h	3.110⁸/ml	<1.010⁶/ml	<1
20h	3.010⁸/ml	2.010⁸/ml	66.7
24h	7.010⁸/ml	7.110⁸/ml	100

실시예 5 : 본 발명의 바실러스 서브틸리스 5-B 균주의 생존율 조사

본 발명의 바실러스 서브틸리스 5-B 균주(KCTC 11550BP)를 가축 사료용 생균제로 사용할 때 직접 액상으로 급여할 수 있지만, 대개는 옥분, 제올라이트, 미강등을 부형제로 사용하여 이와 혼합하여 증량시킨 후 실온에서 보관하면서 필요시 사료와 혼합하여 급여한다. 대부분의 바실러스속 균주는 부형제와 혼합시 수분활성도가 낮아 급격히 생존율이 낮아지는 문제점이 있다. 그러므로 바실러스 서브틸리스 5-B 균주의 생균제 효능을 높이기 위해서는 부형제와 혼합시 생존율이 높게 유지되어야 한다.

상기 실시예 4에서 사용한 TSB 배지에서 24 시간 배양한 균은 포자화 정도가 100％ 정도에 이르므로, 24 시간 배양된 바실러스 서브틸리스 5-B 균주의 배양균액을 5％(v/w)가 되도록 제올라이트와 혼합하고 실온에서 건조시킨 후 밀봉하여 180일간 보관하면서 일정시간마다 혼합물내에 바실러스 서브틸리스 5-B 균주의 생균수를 측정하였다. 실험결과, 도 5에 나타난 바와 같이 제올라이트와 혼합한 직후 바실러스 서브틸리스 5-B 균주의 생균수를 기준으로 60일까지 생존율이 100 ％ 유지되었으며, 90일 보관하였을 때는 95％, 180일 보관하였을 때 75％ 정도의 생존율을 유지하여 바실러스 서브틸리스 5-B 균주는 사료첨가용 부형제와 혼합시 생존율이 매우 높은 것으로 확인되었다. 실제로 가축 사료첨가용 생균제는 3개월 이내에 소비되고 있는 것을 감안하면 부형제와 혼합상태의 바실러스 서브틸리스 5-B 균주는 유통기한 중 95％ 이상이 생존해 있으므로 가축에 급여시 생균제로서의 효능이 높다고 하겠다.

이상으로 본 발명의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적인 기술은 단지 바람직한 구현 예일 뿐이며, 이에 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백하다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항과 그의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

도 1은 본 발명 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 5-B 균주의 16S 리보좀 RNA (16S ribosomal RNA)의 염기서열을 나타낸 것이다.

도 2는 본 발명 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 5-B 균주가 생산하는 셀룰라아제의 온도와 산도(pH)에 따른 활성을 나타낸 그래프이다.

도 3는 본 발명 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 5-B 균주가 생산하는 자일라나아제의 온도와 산도(pH)에 따른 활성을 나타낸 그래프이다.

도 4는 본 발명 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 5-B 균주가 생산하는 만나아제의 온도와 산도(pH)에 따른 활성을 나타낸 그래프이다.

도 5은 본 발명 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 5-B 균주를 제올라이트와 혼합하여 실온에 방치하면서 방치시간에 따른 생존율을 나타낸 그래프이다.

<110> YOON, Ki-Hong Yecheongun agriculture technology center <120> Novel Bacillus Subtilis 5-B Strain and Composition for Forage Additive Comprising the Same <160> 1 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1422 <212> DNA <213> Bacillus subtilis <400> 1 tgcaagtcga gcggacagat gggagcttgc tccctgatgt tagcggcgga cgggtgagta 60 acacgtgggt aacctgcctg taagactggg ataactccgg gaaaccgggg ctaataccgg 120 atggttgttt gaaccgcatg gttcaaacat aaaaggtggc ttcggctacc acttacagat 180 ggacccgcgg cgcattagct agttggtgag gtaacggctc accaaggcaa cgatgcgtag 240 ccgacctgag agggtgatcg gccacactgg gactgagaca cggcccagac tcctacggga 300 ggcagcagta gggaatcttc cgcaatggac gaaagtctga cggagcaacg ccgcgtgagt 360 gatgaaggtt ttcggatcgt aaagctctgt tgttagggaa gaacaagtac cgttcgaata 420 gggcggtacc ttgacggtac ctaaccagaa agccacggct aactacgtgc cagcagccgc 480 ggtaatacgt aggtggcaag cgttgtccgg aattattggg cgtaaagggc tcgcaggcgg 540 tttcttaagt ctgatgtgaa agcccccggc tcaaccgggg agggtcattg gaaactgggg 600 aacttgagtg cagaagagga gagtggaatt ccacgtgtag cggtgaaatg cgtagagatg 660 tggaggaaca ccagtggcga aggcgactct ctggtctgta actgacgctg aggagcgaaa 720 gcgtggggag cgaacaggat tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg atgagtgcta 780 agtgttaggg ggtttccgcc ccttagtgct gcagctaacg cattaagcac tccgcctggg 840 gagtacggtc gcaagactga aactcaaagg aattgacggg ggcccgcaca agcggtggag 900 catgtggttt aattcgaagc aacgcgaaga accttaccag gtcttgacat cctctgacaa 960 tcctagagat aggacgtccc cttcgggggc agagtgacag gtggtgcatg gttgtcgtca 1020 gctcgtgtcg tgagatgttg ggttaagtcc cgcaacgagc gcaacccttg atcttagttg 1080 ccagcattca gttgggcact ctaaggtgac tgccggtgac aaaccggagg aaggtgggga 1140 tgacgtcaaa tcatcatgcc ccttatgacc tgggctacac acgtgctaca atggacagaa 1200 caaagggcag cgaaaccgcg aggttaagcc aatcccacaa atctgttctc agttcggatc 1260 gcagtctgca actcgactgc gtgaagctgg aatcgctagt aatcgcggat cagcatgccg 1320 cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca caccacgaga gtttgtaaca 1380 cccgaagtcg gtgaggtaac cttttaggag ccagccgccg aa 1422

Claims

섬유질계 및 반섬유질계 물질의 가수분해 효소 생산능이 뛰어난 동시에 장기간 생존율이 우수한 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 5-B 균주(KCTC 11550BP).
상기 제 1 항의 바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 5-B 균주 (KCTC 11550BP)를 트립톤, 소이톤, 덱스트로즈, 염화나트륨(NaCl) 및 인산칼륨을 포함하는 TSB(Tryptic Soy Broth) 배지에서 진탕 배양하는 단계를 포함하는 바실러스 서브틸리스 (Bacillus subtilis) 5-B 균주(KCTC 11550BP)의 대량생산을 위한 배양 방법.
바실러스 서브틸리스(Bacillus subtilis) 5-B 균주(KCTC 11550BP) 또는 이의 배양물을 유효성분으로 포함하는 사료 첨가용 조성물.