KR20110031469A - 항시스템 ａｓｃ 아미노산 트랜스포터 2(ａｓｃｔ2) 항체 - Google Patents

항시스템 ａｓｃ 아미노산 트랜스포터 2(ａｓｃｔ2) 항체 Download PDF

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아키코 후루야
히로에 도키
히로시 안도
마사요 스즈키
츠구오 구보타
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Abstract

본 발명은 시스템 ASC 아미노산 트랜스포터 2(ASCT2)의 세포외 영역의 천연형 입체 구조를 특이적으로 인식하고 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마, 상기 항체를 코드하는 DNA, 상기 DNA를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 도입하여 얻어지는 형질전환체, 상기 하이브리도마 또는 상기 형질전환체를 이용하는 항체 또는 그 항체 단편의 제조 방법, 상기 항체 또는 그 항체 단편을 이용하는 치료약, 및 상기 항체 또는 그 항체 단편을 이용하는 진단약에 관한 것이다.

Description

항시스템 ＡＳＣ 아미노산 트랜스포터 2(ＡＳＣＴ2) 항체{ANTI-SYSTEM ASC AMINO ACID TRANSPORTER 2(ASCT2) ANTIBODY}
본 발명은, 시스템 ASC 아미노산 트랜스포터 2(이하, ASCT2로 표기함)의 세포외 영역의 천연형 입체 구조를 특이적으로 인식하고 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마, 상기 항체를 코드하는 DNA, 상기 DNA를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 도입하여 얻어지는 형질전환체, 상기 하이브리도마 또는 상기 형질전환체를 이용하는 항체 또는 그 항체 단편의 제조 방법, 상기 항체 또는 그 항체 단편을 이용하는 치료약, 및 상기 항체 또는 그 항체 단편을 이용하는 진단약에 관한 것이다.
ASCT2 폴리펩티드는 전체 길이 541 아미노산으로 이루어지는 10회 막관통 단백질이고, 나트륨 이온 의존적으로 세포막을 통해 중성 아미노산을 수송하는 트랜스포터로서 기능한다. 아미노산 트랜스포터는 기질 특이성 등의 기능적 특징에 기초하여 몇 개의 "시스템"으로 분류되어 있지만, ASCT2는 시스템 ASC에 속하고, 나트륨 이온 의존성으로 L-알라닌, L-세린, L-트레오닌, L-시스테인, L-글루타민 등의 중성 아미노산의 세포내 흡수에 기능한다(비특허문헌 1).
또한, ASCT2는 타입 D 원숭이 레트로바이러스와 3개의 타입 C 바이러스[고양이 내인성 바이러스(RD114), 개코원숭이 내인성 바이러스, 조류 세망내피증 바이러스]가 공유하는 바이러스의 세포 표면 수용체이다(비특허문헌 2, 3).
ASCT2의 명칭으로서는, 나트륨 의존성 중성 아미노산 트랜스포터 타입 2(sodium-dependent neutral amino acid transporter type 2), 지방세포 아미노산 트랜스포터(adipocyte amino acid transporter: AAAT), 중성 아미노산 트랜스포터 B(neutral amino acid transporter B: ATB), 아미노산 트랜스포터 B0(amino acid transporter B0), ATB0, ATBO, 개코원숭이 M7 바이러스 수용체(baboon M7 virus receptor), M7V1, M7VS1, 인슐린 활성화 아미노산 트랜스포터(insulin-activated amino acid transporter), FLJ31068, RD114 바이러스 수용체, RD114/원숭이(simian) 타입 D 레트로바이러스 수용체, RDR, RDRC, 또는 R16이 알려져 있다(비특허문헌 1, 3).
또한, ASCT2의 다른 명칭으로서는, 용질 캐리어 패밀리 1(solute carrier family 1)(중성 아미노산 트랜스포터) 구성원 5, 용질 캐리어 패밀리 1 구성원 5, 또는 SLC1A5가 알려져 있고, SLC1 패밀리에 속한다.
암과 ASCT2 또는 SLC1A5의 발현과의 관계에 관해서는, EST(expressed sequence tag) 데이터베이스를 이용한 검토에서 SLC1A5, SLC7A5 및 SLC38A5의 3개가 암 조직에서 현저히 발현 항진하고 있는 것이 알려져 있다(비특허문헌 4). 또한, 정상 간장에 있어서 SLC1A5의 발현은 전혀 확인할 수 없는 데 대하여, 간세포암이나 간아종의 임상 조직에 있어서 SLC1A5의 발현이 확인된다(비특허문헌 5). 또한, 저분화 성상세포종이나 다형성교아종의 임상조직에서도 정상 조직과 비교하여 SLC1A5의 발현이 항진하고 있다(비특허문헌 6).
또한, 대장암과 전립선암의 임상조직에 있어서 ASCT2의 발현이 면역 조직 염색이나 웨스턴 블로팅에 의해 검출되고, ASCT2의 발현이 높은 환자는 예후가 좋지 않다(비특허문헌 7, 8).
또한, 대장암, 간암, 유방암, 성상세포종 및 신경아세포종의 몇 개의 세포주에 있어서, 글루타민의 흡수가 ASCT2에 의해 담당되고 있고(비특허문헌 9∼12), ASCT2의 기질인 알라닌-세린-트레오닌 혼합물을 이용하여 글루타민의 세포내 흡수를 경합 저해시키는 것에 의해, 세포의 증식이 억제된다(비특허문헌 9).
ASCT2에 결합하는 항체로서는, 인간 ASCT2의 세포내 N 말단이나 C 말단의 부분 펩티드에 대한 폴리클로날 항체가 알려져 있다(비특허문헌 13, 14, 15). 이들 항체는 모두 ASCT2의 세포내 부분을 인식하는 항체이기 때문에, 세포의 세포막 상에 발현되고 있는 ASCT2에 결합할 수 없다. 생체내에 있어서, 항체가 세포막 상에 발현되고 있는 항원 단백에 결합하면, 항체 의존성 세포 상해 활성(이하, ADCC 활성으로 표기함)이나 보체 의존성 세포 상해 활성(이하, CDC 활성으로 표기함) 등의 항체가 갖는 이펙터 활성에 의한 세포 상해가 유도되는 것이 알려져 있다(비특허문헌 16). 그러나, 이들 항체는 세포의 세포막 상에 발현되고 있는 ASCT2에 결합할 수 없기 때문에, 이들 이펙터 활성에 의한 세포 상해는 기대할 수 없다. 또한, 이들 항체는 모두 ASCT2의 세포내 부분을 인식하는 항체이기 때문에, 살아있는 세포에서 발현되고 있는 ASCT2에 의한 아미노산의 세포내 흡수를 저해할 수 없다.
또한, 인간 ASCT2를 인식하는 폴리클로날 항체가, 라이프스팬 바이오사이언스사(카탈로그 번호: LS-C16840 및 LC-C31887), 아비아시스템즈 바이올로지사(카탈로그 번호: ARP42247_T100), 산타크루즈 바이오테크놀로지사(카탈로그 번호: sc-50698 및 sc-50701), 또는 밀리포어사(카탈로그 번호: AB5468)에서 시판되고 있다.
그러나, ASCT2의 세포외 영역의 천연형 입체 구조를 특이적으로 인식하여 결합하고, 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체는 알려져 있지 않다.
[비특허문헌]
비특허문헌 1: J. Biol. Chemistry, 271, 18657 (1996)
비특허문헌 2: Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 96, 2129 (1999)
비특허문헌 3: J. Virology, 73, 4470 (1999)
비특허문헌 4: Seminars in Cancer Biology, 15, 254 (2005)
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본 발명의 과제는, ASCT2의 세포외 영역의 천연형 입체 구조를 특이적으로 인식하고 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편, 상기항체를 생산하는 하이브리도마, 상기 항체를 코드하는 DNA, 상기 DNA를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 도입하여 얻어지는 형질전환체, 상기 하이브리도마 또는 상기 형질전환체를 이용하는 항체 또는 그 항체 단편의 제조 방법, 상기 항체 또는 그 항체 단편을 이용하는 치료약, 및 상기 항체 또는 그 항체 단편을 이용하는 진단약을 제공하는 것에 있다.
본 발명은, 이하의 (1)∼(44)에 관한 것이다.
(1) 시스템 ASC 아미노산 트랜스포터 2(system ASC amino acid transpoter 2, 이하, ASCT2로 표기함)의 세포외 영역의 천연형 입체 구조를 특이적으로 인식하고 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
(2) ASCT2를 통한 아미노산의 세포내 흡수를 저해하는 (1)에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
(3) 세포 상해 활성을 갖는 (1) 또는 (2)에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
(4) 세포 상해 활성이 항체 의존성 상해(ADCC) 활성 또는 보체 의존성 상해(CDC) 활성인 (3)에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
(5) 인간 ASCT2에 결합하고 마우스 ASCT2에 결합하지 않는 (1)∼(4) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
(6) 인간 ASCT2의 세포외 영역 중 적어도 EL2 영역에 결합하는 (5)에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
(7) 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중, 154번째, 159∼160번째, 163∼171번째, 173∼174번째, 177번째, 188번째, 204∼205번째, 207번째, 210∼212번째 및 214∼223번째 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산에 결합하는 (6)에 기재된 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
(8) 모노클로날 항체가 하이브리도마 KM4008(FERM BP-10962) 또는 하이브리도마 KM4012(FERM BP-10963) 중 어느 하나의 하이브리도마로부터 생산되는 모노클로날 항체가 인식하는 에피토프와 결합하는 모노클로날 항체인 (1)∼(7) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체 단편.
(9) 모노클로날 항체가 하이브리도마 KM4008(FERM BP-10962) 또는 하이브리도마 KM4012(FERM BP-10963) 중 어느 하나의 하이브리도마로부터 생산되는 모노클로날 항체인 (1)∼(8) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체 단편.
(10) 항체 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, 단일쇄 항체(scFv), 이량체화 V 영역(디아바디), 디설파이드 안정화 V 영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드로부터 선택되는 항체 단편인 (1)∼(9) 중 어느 하나에 기재된 항체 단편.
(11) 모노클로날 항체가 유전자 재조합 항체인 (1)∼(10) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체 단편.
(12) 유전자 재조합 항체가 인간형 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로부터 선택되는 유전자 재조합 항체인 (11)에 기재된 유전자 재조합 항체 또는 그 항체 단편.
(13) (1)∼(9) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역(이하, VH로 표기함) 및 경쇄 가변 영역(이하, VL로 표기함)의 상보성 결정 영역(Complementarity Determining Region; 이하, CDR로 표기함)을 포함하는 (11)에 기재된 유전자 재조합 항체 또는 그 항체 단편.
(14) 항체의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 26, 27 및 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 (13)에 기재된 유전자 재조합 항체 또는 그 항체 단편.
(15) 항체의 VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 29, 30 및 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 (13)에 기재된 유전자 재조합 항체 또는 그 항체 단편.
(16) 항체의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 26, 27 및 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 29, 30 및 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 (13)에 기재된 유전자 재조합 항체 또는 그 항체 단편.
(17) 항체의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 32, 33 및 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 (13)에 기재된 유전자 재조합 항체 또는 그 항체 단편.
(18) 항체의 VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 35, 36 및 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 (13)에 기재된 유전자 재조합 항체 또는 그 항체 단편.
(19) 항체의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 32, 33 및 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 35, 36 및 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 (13)에 기재된 유전자 재조합 항체 또는 그 항체 단편.
(20) 항체의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 49, 50 및 51로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 (13)에 기재된 유전자 재조합 항체 또는 그 항체 단편.
(21) 항체의 VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 52, 53 및 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 (13)에 기재된 유전자 재조합 항체 또는 그 항체 단편.
(22) 항체의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 49, 50 및 51로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 52, 53 및 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 (13)에 기재된 유전자 재조합 항체 또는 그 항체 단편.
(23) (1)∼(8) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 포함하는 (12)에 기재된 인간형 키메라 항체 또는 그 항체 단편.
(24) 항체의 VH가 서열 번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 항체의 VL이 서열 번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체, 항체의 VH가 서열 번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 항체의 VL이 서열 번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체, 및 항체의 VH가 서열 번호 46으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 항체의 VL이 서열 번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체로부터 선택되는 (23)에 기재된 인간형 키메라 항체 또는 그 항체 단편.
(25) 항체의 VH가 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 중 2번째의 Val, 9번째의 Ser, 20번째의 Val, 30번째의 Ser, 38번째의 Arg, 46번째의 Glu, 86번째의 Leu, 93번째의 Val, 95번째의 Tyr 및 116번째의 Val으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 항체의 VL이 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열 중 8번째의 Pro, 15번째의 Val, 38번째의 Gln, 43번째의 Ala, 44번째의 Pro, 71번째의 Phe 및 87번째의 Tyr으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 (12)에 기재된 인간화 항체 또는 그 항체 단편.
(26) 항체의 VH가 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 중 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환하는 개변으로부터 선택되는 하나 이상의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VL이 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열 중 8번째의 Pro을 Thr으로, 15번째의 Val을 Leu으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환하는 개변으로부터 선택되는 하나 이상의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하는 (25)에 기재된 인간화 항체 또는 그 항체 단편.
(27) 항체의 VH가 서열 번호 76 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VH가 서열 번호 78 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VH가 서열 번호 80 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VH가 서열 번호 82 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VH가 서열 번호 71 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 84로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VH가 서열 번호 76 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 84로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VH가 서열 번호 78 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 84로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VH가 서열 번호 80 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 84로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 및 항체의 VH가 서열 번호 82 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 84로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체로부터 선택되는 (25)에 기재된 인간화 항체 또는 그 항체 단편.
(28) (1)∼(27) 중 어느 하나에 기재된 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마.
(29) 하이브리도마가 하이브리도마 KM4008(FERM BP-10962) 또는 하이브리도마 KM4012(FERM BP-10963)인 (28)에 기재된 하이브리도마.
(30) (1)∼(29) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체 단편을 코드하는 DNA.
(31) (30)에 기재된 DNA를 함유하는 재조합체 벡터.
(32) (31)에 기재된 재조합체 벡터를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질전환주.
(33) (28) 또는 (29)에 기재된 하이브리도마, 또는 (32)에 기재된 형질전환주를 배지에서 배양하고, 배양물 중에 (1)∼(27) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체 단편을 생성 축적시켜, 배양물로부터 항체 또는 그 항체 단편을 채취하는 것을 특징으로 하는 (1)∼(27) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체 단편의 제조 방법.
(34) (1)∼(27) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는 ASCT2가 관여하는 질환의 치료약.
(35) ASCT2가 관여하는 질환이 암인 (34)에 기재된 치료약.
(36) 암이 혈액암, 식도암, 위암, 대장암, 간암 또는 전립선암인 (35)에 기재된 치료약.
(37) (1)∼(27) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체 단편을 이용하는 ASCT2의 면역학적 검출 또는 측정 방법.
(38) 면역학적 측정 방법이 면역침강법인 (37)에 기재된 검출 또는 측정 방법.
(39) (1)∼(27) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체 단편을 이용하는 ASCT2가 발현되는 세포의 면역학적 검출 또는 측정 방법.
(40) 면역학적 검출 방법이 형광 세포 염색법인 (39)에 기재된 검출 또는 측정 방법.
(41) (1)∼(27) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체 단편을 이용하는 ASCT2의 면역학적 검출용 또는 측정용 시약.
(42) (1)∼(27) 중 어느 하나에 기재된 항체 또는 그 항체 단편을 이용하는 ASCT2가 관여하는 질환의 진단약.
(43) ASCT2가 관여하는 질환의 진단약이 암인 (42)에 기재된 진단약.
(44) 암이 혈액암, 식도암, 위암, 대장암, 간암 또는 전립선암인 (43)에 기재된 진단약.
본 발명에 의해, ASCT2의 세포외 영역의 천연형 입체 구조를 특이적으로 인식하고 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마, 상기 항체를 코드하는 DNA, 상기 DNA를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 도입하여 얻어지는 형질전환체, 상기 하이브리도마 또는 상기 형질전환체를 이용하는 항체 또는 그 항체 단편의 제조 방법, 상기 항체 또는 그 항체 단편을 이용하는 치료약, 및 상기 항체 또는 그 항체 단편을 이용하는 진단약을 제공할 수 있다.
도 1a는 NM_005628과 HCHON2001712의 정렬을 도시한다. 염기 서열이 일치한 개소를 *표로 나타낸다.
도 1b는 NM_005628과 HCHON2001712의 정렬을 도시한다. 염기 서열이 일치한 지점를 *표로 나타낸다.
도 1c는 NM_005628과 HCHON2001712의 정렬을 도시한다. 염기 서열이 일치한 지점를 *표로 나타낸다. Q-PCR에서 이용한 증폭용 프라이머의 설계 위치(Fw#1은 NM_005628의 염기 번호 2281부터 2301, HCHON2001712의 염기 번호 1689부터 1709, Rv#1은 NM_005628의 염기 번호 2739부터 2719의 역쇄, HCHON2001712의 2139부터 2119의 역쇄)를 밑줄로 나타낸다.
도 1d는 NM_005628과 HCHON2001712의 정렬을 도시한다. 염기 서열이 일치한 지점를 *표로 나타낸다. Q-PCR에서 이용한 증폭용 프라이머의 설계 위치(Fw#1은 NM_005628의 염기 번호 2281부터 2301, HCHON2001712의 염기 번호 1689부터 1709, Rv#1은 NM_005628의 염기 번호 2739부터 2719의 역쇄, HCHON2001712의 2139부터 2119의 역쇄)를 밑줄로 나타낸다.
도 2a는 암 세포주, 이종이식편(제노그라프트), 정상 조직 및 임상암 조직에서의 ACST2 유전자의 mRNA의 발현량을 도시한다.
도 2b는 암 세포주, 이종이식편, 정상 조직 및 임상암 조직에서의 ACST2 유전자의 mRNA의 발현량을 도시한다.
도 3은 고정화한 인간 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포(ASCT2/CHO) 및 벡터 도입 CHO 세포(벡터/CHO)에 대한 항myc 항체(항Myc)와 항His 항체(항His)의 반응성을 유세포 분석기에 의해 측정한 결과를 도시한다. 횡축은 형광 강도, 종축은 세포수를 나타낸다. 항체를 검정색으로, 버퍼를 흰색 곡선으로 각각 나타낸다.
도 4는 ASCT2의 N 말단 펩티드에 대한 모노클로날 항체 KM3842의 결합 ELISA에서의 ASCT2의 N 말단 펩티드에 대한 반응성을 도시한다. 횡축은 항체 농도(㎍/mL), 종축은 흡광도비(OD415/490)를 나타낸다. 인간 ASCT2의 N 말단 펩티드-THY 컨쥬게이트를 이용한 경우의 흡광도비를 ▲ 표시로, 컨트롤 펩티드-THY 컨쥬게이트를 이용한 경우의 흡광도비를 ■ 표시로 각각 나타낸다.
도 5는 항ASCT2 모노클로날 항체 KM3998의 형광 세포 염색(유세포 분석법)에서의 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포(ASCT2/CHO), 벡터 도입 CHO 세포(벡터/CHO), 및 KMS-11에 대한 반응성을 도시한다. 횡축은 형광 강도, 종축은 세포수를 나타낸다. KM3998을 검정색으로, 래트 IgG2a-UNLB를 흰색 곡선으로 각각 나타낸다.
도 6은 항ASCT2 모노클로날 항체 KM4000, KM4001, KM4008, KM4012 및 KM4018의 형광 세포 염색(유세포 분석법)에 있어서의 인간 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포(ASCT2/CHO), 벡터 도입 CHO 세포(벡터/CHO) 및 KMS-11에 대한 반응성을 도시한다. 횡축은 항체 농도(㎍/mL), 종축은 평균 형광 강도를 나타낸다. KM511의 평균 형광 강도를 ● 표시와 실선으로, KM4000의 평균 형광 강도를 ■ 표시와 굵은 실선으로, KM4001의 평균 형광 강도를 ▲ 표시와 점선으로, KM4008의 평균 형광 강도를 ○ 표시와 점선으로, KM4012의 평균 형광 강도를 □ 표시와 점선으로, 래트 IgG2a-UNLB의 평균 형광 강도를 □ 표시와 실선으로, KM4018의 평균 형광 강도를 ▲ 표시와 굵은 실선으로 각각 나타낸다.
도 7은 항ASCT2 모노클로날 항체 KM3998의 인간 대장암 세포주 WiDr의 글루타민 의존성 증식에 대한 억제 활성을 도시한다. 횡축은 KM3998의 최종 농도(㎍/mL), 종축은 항체 미처리 세포에서의 증식을 100%로 했을 때의 상대값(%)을 나타낸다. KM3998의 상대 증식률을 ◆ 표시와 실선으로, 래트 IgG2a-UNLB의 상대 증식률을 × 표시와 실선으로, AST 혼합액의 상대 증식률을 점선으로 각각 나타낸다.
도 8은 항ASCT2 모노클로날 항체 KM4000, KM4001, KM4008, KM4012 및 KM4018의 인간 대장암 세포주 WiDr의 글루타민 의존성 증식에 대한 억제 활성을 도시한다. 횡축은 각 항체의 최종 농도(㎍/mL), 종축은 항체 미처리 세포에서의 증식을 100%로 했을 때의 상대값(%)을 나타낸다. KM4000의 상대 증식률을 ◆ 표시와 실선으로, KM4001의 상대 증식률을 ■ 표시와 실선으로, KM4008의 상대 증식률을 △ 표시와 실선으로, KM4012의 상대 증식률을 ○ 표시와 실선으로, KM511의 상대 증식률을 × 표시와 실선으로, KM4018의 상대 증식률을 ■ 표시와 실선으로, 래트 IgG2a-UNLB의 상대 증식률을 × 표시와 실선으로, AST 혼합액의 상대 증식률을 점선으로 각각 나타낸다.
도 9는 항ASCT2 인간형 키메라 항체의 형광 세포 염색(유세포 분석법)에 있어서의 인간 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포(ASCT2/CHO) 및 인간 다발성 골수종 세포주 OPM-2에 대한 반응성을 도시한다. 횡축은 항체 농도(㎍/mL), 종축은 평균 형광 강도를 나타낸다. cKM4008의 평균 형광 강도를 ○ 표시와 실선으로, cKM4012의 평균 형광 강도를 △ 표시와 실선으로, cKM4018의 평균 형광 강도를 ■ 표시와 실선으로 각각 나타낸다.
도 10은 항ASCT2 인간형 키메라 항체의 인간 다발성 골수종 세포주 KMS-11에 대한 ADCC 활성을 도시한다. 횡축은 항체 농도(ng/mL), 종축은 ADCC 활성을 나타낸다. cKM4008의 ADCC 활성을 ○ 표시와 실선으로, cKM4012의 ADCC 활성을 △ 표시와 실선으로, cKM4018의 ADCC 활성을 ■ 표시와 실선으로 각각 나타낸다.
도 11은 항ASCT2 인간형 키메라 항체의 인간 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포(ASCT2/CHO) 및 인간 대장암 세포주 Colo205에 대한 CDC 활성을 도시한다. 횡축은 항체 농도(㎍/mL), 종축은 CDC 활성을 나타낸다. cKM4008의 CDC 활성을 ○ 표시와 실선으로, cKM4012의 CDC 활성을 △ 표시와 실선으로, cKM4018의 CDC 활성을 ■ 표시와 실선으로 각각 나타낸다.
도 12는 항ASCT2 인간형 키메라 항체의 인간 대장암 세포주 WiDr의 글루타민 의존성 증식에 대한 억제 활성을 도시한다. 횡축은 각 항체의 최종 농도(㎍/mL), 종축은 항체 미처리 세포에서의 증식을 100%로 했을 때의 상대값(%)을 나타낸다. cKM4008의 상대 증식률을 ○ 표시와 실선으로, KM4012의 상대 증식률을 △ 표시와 실선으로, KM4018의 상대 증식률을 ■ 표시와 실선으로, KM511의 상대 증식률을 + 표시와 실선으로, AST 혼합액의 상대 증식률을 점선으로 각각 나타낸다.
도 13은 인간 ASCT2 단백 및 마우스 ASCT2 단백의 모식도를 도시한다. 추정 세포외 영역(EL1, EL2, EL3, EL4 및 EL5)에 있어서 인간과 마우스에서 상이한 아미노산을 흑색으로 나타낸다.
본 발명은, ASCT2의 세포외 영역의 천연형 입체 구조를 특이적으로 인식하고 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편에 관한 것이다.
본 발명에서의 ASCT2로서는, 특히 종을 한정하는 것은 아니지만, 바람직하게는 포유동물을 들 수 있고, 구체적으로는 인간을 들 수 있다.
ASCT2의 아미노산 서열 정보는 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 등의 공지의 데이터베이스로부터 취득할 수 있고, 예컨대 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 인간 ASCT2(NCBI 수탁 번호: NP_005619), 또는 서열 번호 86으로 표시되는 마우스 ASCT2(NCBI 수탁 번호: NP_033227) 등을 들 수 있다.
본 발명에서의 ASCT2로서는, 예컨대 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열로 이루어지고, ASCT2의 기능을 갖는 폴리펩티드를 들 수 있다. 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열과 60% 이상, 바람직하게는 80% 이상, 더 바람직하게는 90% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드, 가장 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열로 이루어지고, ASCT2의 기능을 갖는 폴리펩티드도 본 발명의 ASCT2에 포함된다.
서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열에 있어서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환, 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는 부위 특이적 변이 도입법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 488 (1985)] 등을 이용하여, 예컨대 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA에 부위 특이적 변이를 도입하는 것에 의해 얻을 수 있다. 결실, 치환 또는 부가되는 아미노산의 수는 특별히 한정되지 않지만, 바람직하게는 1개∼수십개, 예컨대 1∼20개, 보다 바람직하게는 1개∼수개, 예컨대 1∼5개의 아미노산이다.
ASCT2를 코드하는 유전자로서는, 예컨대 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열을 들 수 있다. 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열에 있어서 하나 이상의 염기가 결실, 치환 또는 부가된 염기 서열로 이루어지고, ASCT2의 기능을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 포함하는 유전자, 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열과 적어도 60% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열, 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열, 더 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 염기 서열로 이루어지며, ASCT2의 기능을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 포함하는 유전자, 및 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA와 엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 DNA로 이루어지고, ASCT2의 기능을 갖는 폴리펩티드를 코드하는 DNA를 포함하는 유전자 등도 본 발명의 ASCT2를 코드하는 유전자에 포함된다.
엄격한 조건 하에서 하이브리드화하는 DNA로서는, 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열을 갖는 DNA를 프로브에 이용한, 콜로니 하이브리다이제이션법, 플라크 하이브리다이제이션법, 서던 블롯 하이브리다이제이션법, 또는 DNA 마이크로어레이법 등에 의해 얻어지는 하이드리드화 가능한 DNA를 의미하고, 구체적으로는 하이드리드화한 콜로니 또는 플라크 유래의 DNA, 또는 상기 서열을 갖는 PCR 산물 또는 올리고 DNA를 고정화한 필터 또는 슬라이드 글라스를 이용하여, 0.7∼1.0 mol/L의 염화나트륨 존재 하, 65℃에서 하이브리다이제이션[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), DNA Cloning 1: Core Techniques, A Practical Approach, Second Edition, Oxford University, (1995)]을 행한 후, 0.1∼2배 농도의 SSC 용액(1배 농도의 SSC 용액의 조성은 150 ㎜ol/L 염화나트륨, 15 ㎜ol/L 시트르산나트륨으로 이루어짐)을 이용하여, 65℃ 조건 하에서 필터 또는 슬라이드 글라스를 세정하는 것에 의해 확인할 수 있는 DNA를 들 수 있다. 하이드리드화 가능한 DNA로서는, 서열 번호 1로 표시되는 염기 서열과 적어도 60% 이상의 상동성을 갖는 DNA, 바람직하게는 80% 이상의 상동성을 갖는 DNA, 더 바람직하게는 95% 이상의 상동성을 갖는 DNA를 들 수 있다.
진핵생물의 단백질을 코드하는 유전자의 염기 서열에는, 종종 유전자의 다형이 확인된다. 본 발명에서 이용되는 유전자에, 이와 같은 다형에 의해 염기 서열에 소규모 변이를 발생시킨 유전자도, 본 발명의 ASCT2를 코드하는 유전자에 포함된다.
본 발명에서의 상동성의 수치는, 특별히 명시한 경우를 제외하고, 당업자에게 공지의 상동성 검색 프로그램을 이용하여 산출되는 수치여도 좋지만, 염기 서열에 대해서는, BLAST[J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)]에 있어서 디폴트의 파라미터를 이용하여 산출되는 수치 등, 아미노산 서열에 대해서는, BLAST2[Nucleic Acids Res., 25, 3389 (1997), Genome Res., 7, 649 (1997), http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Education/BLASTinfo/information3.html]에서 디폴트의 파라미터를 이용하여 산출되는 수치 등을 들 수 있다.
디폴트의 파라미터로서는, G(Cost to open gap)가 염기 서열인 경우는 5, 아미노산 서열인 경우는 11, -E(Cost to extend gap)가 염기 서열인 경우는 2, 아미노산 서열인 경우는 1, -q(Penalty for nucleotide mismatch)가 -3, -r(reward for nucleotide match)이 1, -e(expect value)가 10, -W(wordsize)가 염기 서열인 경우는 11 잔기, 아미노산 서열인 경우는 3 잔기, -y[Dropoff(X) for blast extensions in bits]가 blastn인 경우는 20, blastn 이외의 프로그램에서는 7, -X(X dropoff value for gapped alig㎚ent in bits)가 15 및 -Z(final X dropoff value for gapped alig㎚ent in bits)가 blastn인 경우는 50, blastn 이외의 프로그램에서는 25이다(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/html/blastcgihelp.html).
서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 부분 서열로 이루어지는 폴리펩티드는 당업자에게 공지된 방법에 의해 제작할 수 있고, 예컨대 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 코드하는 DNA의 일부를 결실시켜, 이것을 포함하는 발현 벡터를 도입한 형질전환체를 배양하는 것에 의해 제작할 수 있다. 또한, 상기한 방법으로 제작되는 폴리펩티드 또는 DNA에 기초하여, 상기와 같은 방법에 의해, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 부분 서열에 있어서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 얻을 수 있다. 또한, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 부분 서열로 이루어지는 폴리펩티드, 또는 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열의 부분 서열에 있어서 하나 이상의 아미노산이 결실, 치환 또는 부가된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드는, 플루오레닐메틸옥시카보닐(Fmoc)법, t-부틸옥시카보닐(tBoc)법 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있다.
본 발명에서의 ASCT2의 세포외 영역으로서는, 예컨대 서열 번호 2로 표시되는 상기 폴리펩티드의 아미노산 서열을 공지의 막관통 영역 예측 프로그램 SOSUI(http://sosui.proteome.bio.tuat.ac.jp/sosuiframe0.html), TMHMM ver.2(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM-2.0/) 또는 ExPASy Proteomics Server(http://Ca.expasy.org/) 등을 이용하여 예측된 영역 등을 들 수 있다. 구체적으로는 ExPASy Proteomics Serve에서 예측되는 세포외 도메인인 74∼98번째, 154∼224번째, 287∼305번째, 357∼376번째, 및 420∼425번째의 5개의 영역을 들 수 있다. 또는 문헌[J. Biol. Chemistry, 271, 18657 (1996)] 또는 [J. Virology, 73, 4470 (1999)]로 예측되어 있는 세포외 도메인인 65∼88번째, 152∼224번째, 288∼306번째, 361∼380번째, 및 447∼451번째의 5개 영역을 들 수 있다. 본 발명에 있어서, 5개의 세포외 영역을 N 말단측으로부터 순서대로 EL1 영역, EL2 영역, EL3 영역, EL4 영역 및 EL5 영역으로 나타낸다. 예컨대 서열 번호 2로 표시되는 ASCT2 폴리펩티드의 아미노산 서열에서의 EL2 영역은 154∼224번째 또는 152∼224번째이다.
본 발명의 모노클로날 항체는, ASCT2의 세포외 영역에 결합하지만, 바람직하게는 ASCT2의 세포외 영역 중, EL1∼EL5 영역에서 선택되는 하나 이상의 영역에 결합하고, 보다 바람직하게는 ASCT2의 세포외 영역 중, 적어도 EL2 영역에 결합한다.
본 발명에서의 ASCT2의 세포외 영역의 천연형 입체 구조로서는, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 ASCT2의 세포외 영역이 천연 상태로 취할 수 있는 입체 구조와 동등한 입체 구조를 갖고 있으면 어느 구조라도 좋다.
본 발명의 항체 또는 그 항체 단편이, ASCT2의 세포외 영역의 천연형 입체 구조를 특이적으로 인식하고 상기 세포외 영역에 결합하는 것은, 고상 샌드위치법 등을 이용한 방사 면역 측정법, 또는 효소 면역 측정법(ELISA) 등을 이용한 ASCT2를 발현한 세포에 대한 공지의 면역학적 검출법, 바람직하게는 형광 세포 염색법 등의 특정한 항원을 발현한 세포와 특정 항원에 대한 항체의 결합성을 조사할 수 있는 방법에 의해 확인할 수 있다. 예컨대 FMAT8100HTS 시스템(어플라이드바이오시스템사 제조) 등을 이용하는 형광 항체 염색법[Cancer I㎜unol. I㎜unother., 36, 373 (1993)], 유세포 분석법을 이용하는 형광 세포 염색법, 또는 Biacore 시스템(DE 헬스케어사 제조) 등을 이용한 표면 플라즈몬 공명 등의 방법을 들 수 있다. 또한, 공지의 면역학적 검출법[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), 단클론항체 실험메뉴얼, 고단사 사이언티픽(1987)] 등을 조합시켜 확인할 수도 있다.
ASCT2를 발현한 세포로서는, 상기 ASCT2를 발현하고 있으면 어느 세포라도 좋고, 예컨대 인간 체내에 천연으로 존재하는 세포, 인간 체내에 천연으로 존재하는 세포로부터 수립된 세포주, 또는 유전자 재조합 기술에 의해 얻어진 세포 등을 들 수 있다.
인간 체내에 천연으로 존재하는 세포로서는, 암환자 체내에 있어서 상기 폴리펩티드가 발현되고 있는 세포를 들 수 있고, 예컨대 바이옵시 등으로 얻어진 종양 세포 중에 상기 ASCT2가 발현되고 있는 세포 등을 들 수 있다.
인간 체내에 천연으로 존재하는 세포로부터 수립된 세포주로서는, 상기한 암 환자로부터 얻어진 상기 ASCT2가 발현되고 있는 세포를 주화하여 얻어진 세포주 중, 상기 ASCT2를 발현하고 있는 세포주를 들 수 있고, 예컨대 인간으로부터 수립된 세포주인 다발성 골수종 세포주 KMS-11[휴먼사이언스 연구자원뱅크(HSRRB) 번호: JCRB1179] 또는 RPMI8226(HSRRB 번호: JCRB0034) 등을 들 수 있다.
유전자 재조합 기술에 의해 얻어진 세포로서는, 구체적으로는 상기 ASCT2를 코드하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터를 곤충 세포 또는 동물 세포 등에 도입하는 것에 의해 얻어지는, 상기 ASCT2가 발현된 세포 등을 들 수 있다.
본 발명에서의 모노클로날 항체로서는, 하이브리도마에 의해 생산되는 항체, 또는 항체 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환한 형질전환체에 의해 생산되는 유전자 재조합 항체를 들 수 있다.
하이브리도마는, 예컨대 상기한 ASCT2를 발현한 세포 등을 항원으로서 조제하고, 상기 항원으로 면역화한 동물로부터 항원 특이성을 갖는 항체 생산 세포를 유도하며, 또한, 상기 항체 생산 세포와 골수종 세포를 융합시키는 것에 의해, 조제할 수 있다. 상기 하이브리도마를 배양하거나, 또는 상기 하이브리도마 세포를 동물에게 투여하여 상기 동물을 복수암화시켜, 배양액 또는 복수(腹水)를 분리, 정제하는 것에 의해 항ASCT2 항체를 취득할 수 있다.
항원으로 면역화하는 동물로서는 하이브리도마를 제작하는 것이 가능하면, 어떠한 것도 이용할 수 있지만, 바람직하게는 마우스, 래트, 햄스터, 또는 토끼 등이 이용된다. 또한, 이러한 동물로부터 항체 생산능을 갖는 세포를 취득하고, 상기 세포에 시험관내(in vitro)에서 면역화를 실시한 후에, 골수종 세포와 융합하여 제작한 하이브리도마가 생산하는 항체 등도 본 발명의 항체에 포함된다.
본 발명의 하이브리도마에 의해 생산되는 모노클로날 항체의 구체예로서는, 하이브리도마 KM3998에 의해 생산된 항체 KM3998, 하이브리도마 KM4000에 의해 생산된 항체 KM4000, 하이브리도마 KM4001에 의해 생산된 항체 KM4001, 하이브리도마 KM4008에 의해 생산된 항체 KM4008, 하이브리도마 KM4012에 의해 생산된 항체 KM4012, 또는 하이브리도마 KM4018에 의해 생산된 항체 KM4018 등을 들 수 있다. 하이브리도마 KM4008 및 KM4012는 2008년 5월 1일자로 부다페스트 조약에 기초하여 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터에 FERM BP-10962 및 FERM BP-10963으로서 기탁되어 있다.
또한, 전술한 하이브리도마로부터 생산된 항체가 결합하는 에피토프에 결합하는 모노클로날 항체도 본 발명의 모노클로날 항체에 포함된다.
본 발명에 있어서 유전자 재조합 항체로서는, 인간형 키메라 항체, 인간화 항체, 인간 항체 또는 각각의 항체 단편 등, 유전자 재조합에 의해 제조되는 항체를 포함한다. 유전자 재조합 항체에 있어서, 모노클로날 항체의 특징을 가지며, 항원성이 낮고, 혈중 반감기가 연장된 것은, 치료약으로서 바람직하다. 유전자 재조합 항체는, 예컨대 상기 본 발명의 모노클로날 항체를 유전자 재조합 기술을 이용하여 개변한 것을 들 수 있다.
본 발명의 유전자 재조합 항체로서는, 구체적으로는 항체의 중쇄 가변 영역(이하, VH로 표기함)의 상보성 결정 영역(Complementarity Determining Region;이하, CDR로 표기함) 1, CDR2 및 CDR3이 서열 번호 26, 27 및 28로 표시되는 아미노산 서열이고/이거나, 항체의 경쇄 가변 영역(이하, VL로 표기함)의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 서열 번호 29, 30, 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 유전자 재조합 항체, 항체의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 서열 번호 32, 33 및 34로 표시되는 아미노산 서열이고/이거나, 항체의 VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 서열 번호 35, 36 및 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 유전자 재조합 항체, 또는 항체의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 서열 번호 49, 50 및 51로 표시되는 아미노산 서열이고/이거나, 항체의 VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 서열 번호 52, 53 및 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 유전자 재조합 항체 등을 들 수 있다.
인간형 키메라 항체는, 인간 이외의 동물 항체의 VH 및 VL과 인간 항체의 중쇄 정상 영역(이하, CH로 표기함) 및 경쇄 정상 영역(이하, CL로 표기함)으로 이루어지는 항체를 말한다. 본 발명의 인간형 키메라 항체는 ASCT2의 세포외 영역의 입체 구조를 특이적으로 인식하고 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마로부터, VH 및 VL을 코드하는 cDNA를 취득하며, 인간 항체의 CH 및 CL을 코드하는 유전자를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입하여 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축하고, 동물 세포에 도입하는 것에 의해 발현시켜 제조할 수 있다.
인간형 키메라 항체의 CH로서는, 인간 면역글로불린(이하, hIg로 표기함)에 속하면 어떠한 것이어도 좋지만, 바람직하게는 hIgG 클래스의 것이 이용되고, hIgG 클래스에 속하는 hIgG1, hIgG2, hIgG3, hIgG4라는 서브클래스 모두 더 이용할 수 있다. 또한, 인간형 키메라 항체의 CL로서는, hIg에 속하면 어느 것이어도 좋고, κ 클래스 또는 λ 클래스의 것을 이용할 수 있다.
본 발명의 인간형 키메라 항체로서는, 구체적으로는 항체의 VH가 서열 번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VL이 서열 번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체, 항체의 VH가 서열 번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하며, 항체의 VL이 서열 번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체, 또는 항체의 VH가 서열 번호 46으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VL이 서열 번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체 등을 들 수 있으며, 예컨대 인간형 키메라 항체 cKM4008, cKM4012 또는 cKM4018 등을 들 수 있다.
인간화 항체는, 인간 이외의 동물 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열을 인간 항체의 VH 및 VL의 적절한 위치에 이식한 항체를 말하고, 인간형 CDR 이식 항체, 재구성 항체(reshaped-antibody) 등이라고도 한다. 본 발명의 인간화 항체는, ASCT2의 세포외 영역의 입체 구조를 특이적으로 인식하고 상기 세포외 영역에 결합하는 인간 이외의 동물의 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마로부터 생산되는 인간 이외의 동물의 항체의 VH 및 VL의 CDR의 아미노산 서열을 임의의 인간 항체의 VH 및 VL의 프레임워크(이하, FR로 표기함)에 이식한 가변 영역(이하, V 영역으로 표기함)을 코드하는 cDNA를 구축하고, 인간 항체의 CH 및 CL을 코드하는 유전자를 갖는 동물 세포용 발현 벡터에 각각 삽입하여 인간화 항체 발현 벡터를 구축하며, 동물 세포에 도입하는 것에 의해 발현시켜 제조할 수 있다.
인간화 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열은, 인간 항체 유래의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열이면 어떠한 것이어도 이용할 수 있다. 예컨대 Protein Data Bank 등의 데이터베이스에 등록되어 있는 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열, 또는 문헌[Sequences of Proteins of I㎜unological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)] 등에 기재된, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 각 서브그룹의 공통 아미노산 서열 등이 이용된다.
인간화 항체의 CH로서는, hIg에 속하면 어떠한 것이어도 좋지만, 바람직하게는 hIgG 클래스의 것이 이용되고, hIgG 클래스에 속하는 hIgG1, hIgG2, hIgG3, 또는 hIgG4라는 서브클래스 모두를 더 이용할 수 있다. 또한, 인간형 CDR 이식 항체의 CL로서는, hIg에 속하면 어느 것이어도 좋고, κ 클래스 또는 λ 클래스의 것을 이용할 수 있다.
본 발명의 인간화 항체로서는, 구체적으로는 항체의 VH가 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 중 2번째의 Val, 9번째의 Ser, 20번째의 Val, 30번째의 Ser, 38번째의 Arg, 46번째의 Glu, 86번째의 Leu, 93번째의 Val, 95번째의 Tyr 및 116번째의 Val으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 항체의 VL이 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열 중 8번째의 Pro, 15번째의 Val, 38번째의 Gln, 43번째의 Ala, 44번째의 Pro, 71번째의 Phe 및 87번째의 Tyr으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체 등을 들 수 있지만, 도입되는 개변의 수에 제한은 없다.
항체의 VH의 아미노산 서열에 대해서는, 바람직하게는, 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 중 9번째의 Ser, 20번째의 Val, 38번째의 Arg, 46번째의 Glu, 93번째의 Val, 95번째의 Tyr 및 116번째의 Val이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 중 20번째의 Val, 46번째의 Glu, 95번째의 Tyr 및 116번째의 Val이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 또는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 중 46번째의 Glu 및 95번째의 Tyr이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체을 들 수 있다.
상기한 아미노산 개변의 결과, 얻어지는 항체의 VH의 아미노산 서열로서는, 예컨대 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 중 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환하는 개변으로부터 선택되는 하나 이상의 개변이 도입된 아미노산 서열을 들 수 있다.
10개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 중 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열을 들 수 있다.
9개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 중 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 또는 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열을 들 수 있다.
8개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 중 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 또는 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로 치환한 아미노산 서열을 들 수 있다.
7개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 중 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 또는 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열 등을 들 수 있다.
6개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 중 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 또는 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열 등을 들 수 있다.
5개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 중 2번째의 Val을 Ile으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 또는 20번째의 Val을 Ile으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열 등을 들 수 있다.
4개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 중 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 또는 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열 등을 들 수 있다.
3개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 중 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 46번째의 Glu를 Lys으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 93번째의 Val을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 38번째의 Arg을 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 38번째의 Arg을 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 38번째의 Arg을 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 46번째의 Glu를 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 또는 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열 등을 들 수 있다.
2개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 중 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 20번째의 Val을 Ile으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 46번째의 Glu를 Lys으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 86번째의 Leu을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 93번째의 Val을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 2번째의 Val을 Ile으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 30번째의 Ser을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 38번째의 Arg을 Lys으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 46번째의 Glu를 Lys으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 86번째의 Leu을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 93번째의 Val을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 38번째의 Arg을 Lys으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 46번째의 Glu를 Lys으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 86번째의 Leu을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 93번째의 Val을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로 치환한 아미노산 서열, 30번째의 Ser을 Thr으로, 46번째의 Glu를 Lys으로 치환한 아미노산 서열, 30번째의 Ser을 Thr으로, 86번째의 Leu을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 30번째의 Ser을 Thr으로, 93번째의 Val을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 30번째의 Ser을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 30번째의 Ser을 Thr으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로 치환한 아미노산 서열, 38번째의 Arg을 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 38번째의 Arg을 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 38번째의 Arg을 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 38번째의 Arg을 Lys으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 46번째의 Glu를 Lys으로, 93번째의 Val을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 46번째의 Glu를 Lys으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 46번째의 Glu를 Lys으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 86번째의 Leu을 Val으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 86번째의 Leu을 Val으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 93번째의 Val을 Thr으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 또는 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열을 들 수 있다.
1개의 개변이 도입된 VH의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 중 2번째의 Val을 Ile으로 치환한 아미노산 서열, 9번째의 Ser을 Pro으로 치환한 아미노산 서열, 20번째의 Val을 Ile으로 치환한 아미노산 서열, 30번째의 Ser을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 38번째의 Arg을 Lys으로 치환한 아미노산 서열, 46번째의 Glu를 Lys으로 치환한 아미노산 서열, 86번째의 Leu을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 93번째의 Val을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 95번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 또는 116번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열을 들 수 있다.
항체의 VL에 대해서는, 바람직하게는 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열 중 15번째의 Val, 43번째의 Ala, 44번째의 Pro, 71번째의 Phe 및 87번째의 Tyr이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 또는 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열 중 15번째의 Val, 71번째의 Phe 및 87번째의 Tyr이 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체 등을 들 수 있다.
상기한 아미노산 개변의 결과, 얻어지는 항체의 VL의 아미노산 서열로서는, 예컨대 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열 중 8번째의 Pro을 Thr으로, 15번째의 Val을 Leu으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환하는 개변으로부터 선택되는 하나 이상의 개변이 도입된 아미노산 서열을 들 수 있다.
7개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열 중 8번째의 Pro을 Thr으로, 15번째의 Val을 Leu으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열을 들 수 있다.
6개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열 중 15번째의 Val을 Leu으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 15번째의 Val을 Leu으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 15번째의 Val을 Leu으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 15번째의 Val을 Leu으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 15번째의 Val을 Leu으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 또는 8번째의 Pro을 Thr으로, 15번째의 Val을 Leu으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로 치환한 아미노산 서열을 들 수 있다.
5개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열 중 38번째의 Gln을 Arg으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Val을 Leu으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Val을 Leu으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Val을 Leu으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Val을 Leu으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Val을 Leu으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 15번째의 Val을 Leu으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 15번째의 Val을 Leu으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 15번째의 Val을 Leu으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 15번째의 Val을 Leu으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 15번째의 Val을 Leu으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 15번째의 Val을 Leu으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 15번째의 Val을 Leu으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 15번째의 Val을 Leu으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 15번째의 Val을 Leu으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로 치환한 아미노산 서열, 또는 8번째의 Pro을 Thr으로, 15번째의 Val을 Leu으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 44번째의 Pro을 Val으로 치환한 아미노산 서열을 들 수 있다.
4개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열 중 15번째의 Val을 Leu으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Val을 Leu으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Val을 Leu으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 또는 8번째의 Pro을 Thr으로, 15번째의 Val을 Leu으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열 등을 들 수 있다.
3개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열 중 8번째의 Pro을 Thr으로, 15번째의 Val을 Leu으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 15번째의 Val을 Leu으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Val을 Leu으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Val을 Leu으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Val을 Leu으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Val을 Leu으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Val을 Leu으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Val을 Leu으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Val을 Leu으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 38번째의 Gln을 Arg으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 43번째의 Ala을 Thr으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 또는 44번째의 Pro을 Val으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열 등을 들 수 있다.
2개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열 중 8번째의 Pro을 Thr으로, 15번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 38번째의 Gln을 Arg으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 43번째의 Ala을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 44번째의 Pro을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로 치환한 아미노산 서열, 8번째의 Pro을 Thr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Val을 Leu으로, 38번째의 Gln을 Arg으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Val을 Leu으로, 43번째의 Ala을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Val을 Leu으로, 44번째의 Pro을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Val을 Leu으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Val을 Leu으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 38번째의 Gln을 Arg으로, 43번째의 Ala을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 38번째의 Gln을 Arg으로, 44번째의 Pro을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 38번째의 Gln을 Arg으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로 치환한 아미노산 서열, 38번째의 Gln을 Arg으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 43번째의 Ala을 Thr으로, 44번째의 Pro을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 43번째의 Ala을 Thr으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로 치환한 아미노산 서열, 43번째의 Ala을 Thr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 44번째의 Pro을 Val으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로 치환한 아미노산 서열, 44번째의 Pro을 Val으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열, 또는 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열을 들 수 있다.
1개의 개변이 도입된 VL의 아미노산 서열로서는, 구체적으로는 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열 중 8번째의 Pro을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 15번째의 Val을 Leu으로 치환한 아미노산 서열, 38번째의 Gln을 Arg으로 치환한 아미노산 서열, 43번째의 Ala을 Thr으로 치환한 아미노산 서열, 44번째의 Pro을 Val으로 치환한 아미노산 서열, 71번째의 Phe을 Tyr으로 치환한 아미노산 서열, 또는 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환한 아미노산 서열을 들 수 있다.
또한, 본 발명의 인간화 항체의 구체예로서는, 항체의 VH가 서열 번호 71 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VH가 서열 번호 76 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VH가 서열 번호 78 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VH가 서열 번호 80 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VH가 서열 번호 82 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VH가 서열 번호 71 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 84로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VH가 서열 번호 76 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 84로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VH가 서열 번호 78 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 84로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VH가 서열 번호 80 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 84로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 또는 항체의 VH가 서열 번호 82 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 84로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체 등을 들 수 있다.
인간 항체는, 원래 인간 체내에 천연으로 존재하는 항체를 말하지만, 최근의 유전자공학적, 세포공학적, 발생공학적인 기술의 진보에 의해 제작된 인간 항체 파지 라이브러리 및 인간 항체 생산 트랜스제닉 동물로부터 얻어지는 항체 등도 본 발명의 인간 항체에 포함된다.
인간 체내에 천연으로 존재하는 항체는, 예컨대 인간 말초혈 림프구를 단리하고, EB 바이러스 등을 감염시켜 불사화하여, 클로닝하는 것에 의해, 상기 항체를 생산하는 림프구를 배양할 수 있고, 배양 상청 중으로부터 상기 항체를 정제할 수 있다.
인간 항체 파지 라이브러리는, 인간 B 세포로부터 조제한 항체 유전자를 파지 유전자에 삽입하는 것에 의해 Fab, scFv 등의 항체 단편을 파지 표면에 발현시킨 라이브러리이다. 상기 라이브러리로부터, 항원을 고정화한 기질에 대한 결합 활성을 지표로 하여 원하는 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편을 표면에 발현하고 있는 파지를 회수할 수 있다. 상기 항체 단편은, 또한, 유전자공학적 방법에 의해 2개의 완전한 H쇄 및 2개의 완전한 L쇄로 이루어지는 인간 항체 분자로도 변환할 수 있다.
인간 항체 생산 트랜스제닉 동물은, 인간 항체 유전자가 세포내에 재조합된 동물을 의미한다. 구체적으로는, 예컨대 마우스 ES 세포에 인간 항체 유전자를 도입하고, 이 ES 세포를 마우스의 초기 배에 이식 후, 발생시키는 것에 의해 인간 항체 생산 트랜스제닉 마우스를 제작할 수 있다. 인간 항체 생산 트랜스제닉 동물로부터의 인간 항체는, 통상의 인간 이외의 동물로 행해지고 있는 하이브리도마 제작 방법을 이용하여, 인간 항체 생산 하이브리도마를 취득하고, 배양함으로써 배양 상청 중에 인간 항체를 생산 축적시키는 것에 의해 제작할 수 있다.
전술한 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 구성하는 아미노산 서열에 있어서, 하나 이상의 아미노산이 결실, 부가, 치환 또는 삽입되고, 전술한 항체 또는 그 항체 단편과 같은 활성을 갖는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편도, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편에 포함된다.
결실, 치환, 삽입 및/또는 부가되는 아미노산의 수는 1개 이상이고 그 수는 특별히 한정되지 않지만, 부위 특이적 변이 도입법[Molecular Cloning 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997), Nucleic Acids Research, 10, 6487 (1982), Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 79, 6409 (1982), Gene, 34, 315 (1985), Nucleic Acids Research, 13, 4431 (1985), Proc. Natl. Acad. Sci USA, 82, 488 (1985)] 등의 주지의 기술에 의해, 결실, 치환 또는 부가할 수 있는 정도의 수이다. 예컨대 1∼수십개, 바람직하게는 1∼20개, 보다 바람직하게는 1∼10개, 더 바람직하게는 1∼5개이다.
상기한 항체의 아미노산 서열에 있어서 하나 이상의 아미노산 잔기가 결실, 치환, 삽입 또는 부가되었다는 것은, 다음의 것을 나타낸다. 즉, 동일 서열 중의 임의, 1 또는 복수의 아미노산 서열 중에서, 1 또는 복수의 아미노산 잔기의 결실, 치환, 삽입 또는 부가가 있는 것을 의미한다. 또한, 결실, 치환, 삽입 또는 부가가 동시에 생기는 경우도 있고, 치환, 삽입 또는 부가되는 아미노산 잔기는 천연형과 비천연형 어느 것인 경우도 있다. 천연형 아미노산 잔기로서는, L-알라닌, L-아스파라긴, L-아스파라긴산, L-글루타민, L-글루탐산, 글리신, L-히스티딘, L-이소루신, L-루신, L-리신, L-메티오닌, L-페닐알라닌, L-프롤린, L-세린, L-트레오닌, L-트립토판, L-타이로신, L-발린, 또는 L-시스테인 등을 들 수 있다.
이하에, 서로 치환 가능한 아미노산 잔기의 바람직한 예를 나타낸다. 동일 군에 포함되는 아미노산 잔기는 서로 치환 가능하다.
A군: 루신, 이소루신, 노르루신, 발린, 노르발린, 알라닌, 2-아미노부탄산, 메티오닌, O-메틸세린, t-부틸글리신, t-부틸알라닌, 시클로헥실알라닌,
B군: 아스파라긴산, 글루탐산, 이소아스파라긴산, 이소글루탐산, 2-아미노아디프산, 2-아미노수베르산,
C군: 아스파라긴, 글루타민,
D군: 리신, 아르기닌, 오르니틴, 2,4-디아미노부탄산, 2,3-디아미노프로피온산,
E군: 프롤린, 3-히드록시프롤린, 4-히드록시프롤린,
F군: 세린, 트레오닌, 호모세린,
G군: 페닐알라닌, 타이로신.
본 발명에 있어서, 항체 단편으로서는, Fab, F(ab')2, Fab', scFv, 디아바디(diabody), dsFv 및 CDR을 포함하는 펩티드 등을 들 수 있다.
Fab는, IgG를 단백질 분해 효소인 파파인으로 처리하여 얻어지는 단편 중(H쇄의 224번째 아미노산 잔기에서 절단됨), H쇄의 N 말단측 약 절반과 L쇄 전체가 디설파이드 결합으로 결합한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 본 발명의 Fab는 ASCT2의 세포외 영역의 입체 구조를 특이적으로 인식하고 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체를 파파인으로 처리하여 얻을 수 있다. 또한, 상기 항체의 Fab를 코드하는 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 상기 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하는 것에 의해 발현시켜, Fab를 제조할 수도 있다.
F(ab')2는 IgG의 힌지 영역의 2개의 디설파이드 결합의 하부를 단백질 분해 효소인 펩신으로 분해하여 얻어진, 2개의 Fab 영역이 힌지 부분으로 결합하여 구성된, 분자량 약 10만의 항원 결합 활성을 갖는 단편이다. 본 발명의 F(ab')2는 ASCT2의 세포외 영역의 입체 구조를 특이적으로 인식하고 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체를 펩신으로 처리하여 얻을 수 있다. 또한, 하기의 Fab'을 티오에테르결합 또는 디설파이드 결합시켜 제작할 수도 있다.
Fab'은 상기 F(ab')2의 힌지 영역의 디설파이드 결합을 절단한 분자량 약 5만의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 본 발명의 Fab'은, 본 발명의 ASCT2의 세포외 영역의 입체 구조를 특이적으로 인식하고 상기 세포외 영역에 결합하는 F(ab')2를 디티오트레이톨 등의 환원제로 처리하여 얻을 수 있다. 또한, 상기 항체의 Fab' 단편을 코드하는 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 상기 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하는 것에 의해 발현시켜, Fab'을 제조할 수도 있다.
scFv는, 하나의 VH와 하나의 VL을 적당한 펩티드 링커(이하, P로 표기함)를 이용하여 연결한, VH-P-VL 내지는 VL-P-VH 폴리펩티드로, 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 본 발명의 scFv는 본 발명의 ASCT2의 세포외 영역의 입체 구조를 특이적으로 인식하고 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 코드하는 cDNA를 취득하며, scFv를 코드하는 DNA를 구축하고, 상기 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하며, 상기 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하는 것에 의해 발현시켜 제조할 수 있다.
디아바디는, scFv가 이량체화한 항체 단편으로, 2가의 항원 결합 활성을 갖는 항체 단편이다. 2가의 항원 결합 활성은, 동일로 할 수도 있고, 한쪽을 다른 항원 결합 활성으로 할 수도 있다. 본 발명의 디아바디는, 본 발명의 ASCT2의 세포외 영역의 입체 구조를 특이적으로 인식하고 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 코드하는 cDNA를 취득하며, scFv를 코드하는 DNA를 펩티드 링커의 아미노산 서열의 길이가 8 잔기 이하가 되도록 구축하고, 상기 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하며, 상기 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하는 것에 의해 발현시켜 제조할 수 있다.
dsFv는, VH 및 VL 중 각각 1 아미노산 잔기를 시스테인 잔기로 치환한 폴리펩티드를 상기 시스테인 잔기 간의 디설파이드 결합을 통해 결합시킨 것을 말한다. 시스테인 잔기로 치환하는 아미노산 잔기는 기지의 방법[Protein Engineering, 7, 697 (1994)]에 따라서, 항체의 입체 구조 예측에 기초하여 선택할 수 있다. 본 발명의 dsFv는, 본 발명의 ASCT2의 세포외 영역의 입체 구조를 특이적으로 인식하고 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 코드하는 cDNA를 취득하며, dsFv를 코드하는 DNA를 구축하고, 상기 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하며, 상기 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하는 것에 의해 발현시켜 제조할 수 있다.
CDR을 포함하는 펩티드는, VH 또는 VL의 CDR 중 1 영역 이상을 포함하여 구성된다. 복수의 CDR을 포함하는 펩티드는, 직접 또는 적당한 펩티드 링커를 통해 결합시킬 수 있다. 본 발명의 CDR을 포함하는 펩티드는, 본 발명의 ASCT2의 세포외 영역의 입체 구조를 특이적으로 인식하고 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체의 VH 및 VL의 CDR을 코드하는 DNA를 구축하며, 상기 DNA를 원핵생물용 발현 벡터 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하고, 상기 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하는 것에 의해 발현시켜 제조할 수 있다. 또한, CDR을 포함하는 펩티드는, Fmoc법 또는 tBoc법 등의 화학 합성법에 의해 제조할 수도 있다.
본 발명의 모노클로날 항체에는, 본 발명의 ASCT2의 세포외 영역의 천연형 입체 구조를 특이적으로 인식하고 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편에 방사성 동위 원소, 저분자 약제, 고분자 약제, 단백질, 또는 항체 의약 등을 화학적 또는 유전자공학적으로 결합시킨 항체의 유도체를 포함한다.
본 발명에 있어서의, 항체의 유도체는, 본 발명의 ASCT2의 세포외 영역의 천연형 입체 구조를 특이적으로 인식하고 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편의 H쇄 또는 L쇄의 N 말단측 또는 C 말단측, 항체 또는 그 항체 단편 중 적당한 치환기 또는 측쇄, 더 나아가서는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편 중 당쇄 등에, 방사성 동위 원소, 저분자 약제, 고분자 약제, 면역부활제, 단백질 또는 항체 의약 등을 화학적 방법[항체공학입문, 치진 서관(1994)]에 의해 결합시킴으로써 제조할 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서의, 항체의 유도체는, 본 발명의 ASCT2의 세포외 영역의 천연형 입체 구조를 특이적으로 인식하고 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 코드하는 DNA와, 결합시키고 싶은 단백질 또는 항체 의약을 코드하는 DNA를 연결시켜 발현 벡터에 삽입하며, 상기 발현 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입하고, 발현시키는 유전자 공학적 방법으로부터 제조할 수 있다.
방사성 동위 원소로서는, 131I, 125I, 90Y, 64Cu, 199Tc, 77Lu, 또는 211At 등을 들 수 있다. 방사성 동위 원소는 클로라민 T법 등에 의해 항체에 직접 결합시킬 수 있다. 또한, 방사성 동위 원소를 킬레이트하는 물질을 항체에 결합시켜도 좋다. 킬레이트제로서는, 1-이소티오시아네이트벤질-3-메틸디에틸렌트리아민펜타초산(MX-DTPA) 등을 들 수 있다.
저분자 약제로서는, 알킬화제, 니트로소우레아제, 대사길항제, 항생물질, 식물 알칼로이드, 토포이소머라제 저해제, 호르몬 요법제, 호르몬 길항제, 아로마타제 저해제, P당단백 저해제, 백금 착체 유도체, M기 저해제, 또는 키나제 저해제 등의 항암제[임상종양학, 암과 화학요법사 (1996)], 또는 히드로코르티손, 프리드니손 등의 스테로이드제, 아스피린, 인도메타신 등의 비스테로이드제, 금티오말레이트, 페니실아민 등의 면역 조절제, 사이클로포스파미드, 아자티오프린 등의 면역 억제제, 말레산클로로페닐아민, 또는 클레마스틴과 같은 항히스타민제 등의 항염증제[염증과 항염증 요법, 의치약출판주식회사 (1982)] 등을 들 수 있다. 항암제로서는, 아미포스틴(에티올), 시스플라틴, 다카바진(DTIC), 닥티노마이신, 메클로로에타민(나이트로젠 머스터드), 스트렙토조신, 시클로포스파미드, 이포스파미드, 카무스틴(BCNU), 로무스틴(CCNU), 독소루비신(아드리아마이신), 에피루비신, 젬시타빈(젬자), 다우노루비신, 프로카바진, 마이토마이신, 시타라빈, 에토포시드, 메토트렉세이트, 5-플루오로우라실, 플루오로우라실, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 블레오마이신, 다우노마이신, 페프로마이신, 에스트라무스틴, 파클리탁셀(택솔), 도세탁셀(탁소티어), 알데스류킨, 아스파라기나제, 부설판, 카보플라틴, 옥살리플라틴, 네다플라틴, 클라드리빈, 캠토테신, 10-히드록시-7-에틸-캠토테신(SN38), 플록수리딘, 플루다라빈, 히드록시우레아, 이포스파미드, 이다루비신, 메스나, 이리노테칸(CPT-11), 노기테칸, 미톡산트론, 토포테칸, 류프로라이드, 메게스트롤, 멜파란, 머캅토퓨린, 히드록시카바마이드, 플리카마이신, 미토탄, 페가스파라가제, 펜토스타틴, 피포브로만, 스트렙토조신, 타목시펜, 고세렐린, 류프로레린, 플루타미드, 테니포사이드, 테스트락톤, 티오구아닌, 티오테파, 우라실 머스터드, 비노렐빈, 클로람부실, 히드로코르티손, 프레드니솔론, 메틸프레드니솔론, 빈데신, 니무스틴, 세무스틴, 카페시타빈, 토무덱스, 아자시티딘, UFT, 옥살로플라틴, 게피티닙(이레사), 이마티닙(STI571), 엘로티닙, FMS 유사 타이로신 키나제 3(FMS-like tyrosine kinase 3: Flt3) 저해제, 혈관 내피세포 성장 인자 수용체(vascular endothelial growth facotr receptor: VEGFR) 저해제, 섬유아세포 성장 인자 수용체(fibroblast growth factor receptor: FGFR) 저해제, 이레사, 타세바 등의 상피세포 성장 인자 수용체(epidermal growth factor receptor: EGFR) 저해제, 라디시콜, 17-알릴아미노-17-데메톡시겔다나마이신, 라파마이신, 암사크린, 올트랜스레티노산, 탈리도마이드, 레날리도마이드, 아나스트로졸, 파드로졸, 레트로졸, 엑세메스탄, 금티오말레이트, D-페니실아민, 부실라민, 아자티오프린, 미조리빈, 시클로스포린, 라파마이신, 히드로코르티손, 벡사로텐(타그레틴), 타목시펜, 덱사메타손, 프로게스틴류, 에스트로겐류, 아나스트로졸(아리미덱스), 류프린, 아스피린, 인도메타신, 셀레콕시브, 아자티오프린, 페니실아민, 금티오말레이트, 말레산클로로페닐아민, 클로로페닐아민, 크레마스틴, 트레티노인, 벡사로텐, 비소, 보르테조밉, 알로퓨리놀, 케리케어마이신, 이브리투모맙튜세탄, 타그레틴, 오조가민, 클라리스로마이신, 류코보린, 이파스파미드, 케토코나졸, 아미노글루테티미드, 수라민, 메토트렉세이트, 마이탄시노이드, 또는 그 유도체 등을 들 수 있다.
저분자 약제와 항체를 결합시키는 방법으로서는, 글루타르알데히드를 통해 약제와 항체의 아미노기 사이를 결합시키는 방법, 또는 수용성 카보디이미드를 통해 약제의 아미노기와 항체의 카복실기를 결합시키는 방법 등을 들 수 있다.
고분자 약제로서는, 폴리에틸렌글리콜(이하, PEG로 표기함), 알부민, 덱스트란, 폴리옥시에틸렌, 스티렌말레산코폴리머, 폴리비닐피롤리돈, 피란코폴리머, 또는 히드록시프로필메타크릴아미드 등을 들 수 있다. 이들 고분자 화합물을 항체 또는 항체 단편에 결합시킴으로써, (1) 화학적, 물리적 또는 생물적인 여러 가지 인자에 대한 안정성의 향상, (2) 혈중 반감기의 현저한 연장, (3) 면역원성의 소실 또는 항체 생산의 억제 등의 효과가 기대된다[바이오컨쥬게이트 의약품, 히로카와 서점 (1993)]. 예컨대 PEG와 항체를 결합시키는 방법으로서는, PEG화 수식 시약과 반응시키는 방법 등을 들 수 있다[바이오컨쥬게이트 의약품, 히로카와 서점 (1993)]. PEG화 수식 시약으로서는, 리신의 ε-아미노기에의 수식제(일본 특허 공개 소61-178926), 아스파라긴산 및 글루탐산의 카복실기에의 수식제(일본 특허 공개 소56-23587), 또는 아르기닌의 구아니딘기에의 수식제(일본 특허 공개 평2-117920) 등을 들 수 있다.
면역부활제로서는, 면역보강제로서 알려져 있는 천연물이어도 좋고, 구체예로서는, 면역을 항진하는 약제가, β(1→3) 글루칸(렌티난, 시조필란), 또는 α 갈락토실세라미드(KRN7000) 등을 들 수 있다.
단백질로서는, NK 세포, 대식세포, 또는 호중구 등의 면역 담당 세포를 활성화하는 사이토카인 또는 증식인자, 또는 독소 단백질 등을 들 수 있다.
사이토카인 또는 증식인자로서는, 예컨대 인터페론(이하, INF로 표기함)-α, INF-β, INF-γ, 인터루킨(이하, IL로 표기함)-2, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21, IL-23, 과립구 콜로니 자극인자(G-CSF), 과립구/대식세포 콜로니 자극인자(GM-CSF), 또는 대식세포 콜로니 자극인자(M-CSF) 등을 들 수 있다. 독소 단백질로서는, 리신, 디프테리아톡신, 또는 ONTAK 등을 들 수 있고, 독성을 조절하기 위해 단백질에 변이를 도입한 단백 독소도 포함된다.
항체 의약으로서는, 항체의 결합에 의해 아폽토시스가 유도되는 항원, 종양의 병태 형성에 관한 항원 또는 면역 기능을 조절하는 항원, 병변 부위의 혈관신생에 관여하는 항원에 대한 항체를 들 수 있다.
항체의 결합에 의해 아폽토시스가 유도되는 항원으로서는, 분화 클러스터(Cluster of Differentiation: 이하, CD로 기재함) 19, CD20, CD21, CD22, CD23, CD24, CD37, CD53, CD72, CD73, CD74, CDw75, CDw76, CD77, CDw78, CD79a, CD79b, CD80(B7.1), CD81, CD82, CD83, CDw84, CD85, CD86(B7.2), 인간 백혈구 항원(human leukocyte antigen)(HLA)-클래스 II, 또는 상피세포 성장 인자 수용체(Epidermal Growth Factor Receptor: EGFR) 등을 들 수 있다.
종양의 병태 형성에 관한 항원 또는 면역 기능을 조절하는 항체의 항원으로서는, CD4, CD40, CD40 리간드, B7 패밀리 분자(CD80, CD86, CD274, B7-DC, B7-H2, B7-H3, 또는 B7-H4), B7 패밀리 분자의 리간드(CD28, CTLA-4, ICOS, PD-1, 또는 BTLA), OX-40, OX-40 리간드, CD137, 종양 괴사 인자(tumor necrosis factor: TNF) 수용체 패밀리 분자(DR4, DR5, TNFR1, 또는 TNFR2), TNF 관련 아폽토시스 유도 리간드 수용체(TNF-related apoptosis-inducing ligand receptor: TRAIL) 패밀리 분자, TRAIL 패밀리 분자의 수용체 패밀리(TRAIL-R1, TRAIL-R2, TRAIL-R3, 또는 TRAIL-R4), 핵 인자 카파 B 리간드의 수용체 활성화제(receptor activator of nuclear factor kappa B ligand: RANK), RANK 리간드, CD25, 엽산 수용체4, 사이토카인[IL-1α, IL-1β, IL-4, IL-5, IL-6, IL-10, IL-13, 형질전환 성장 인자(TGF) β, 또는 TNF α 등], 이들 사이토카인의 수용체, 케모카인(SLC, ELC, I-309, TARC, MDC, 또는 CTACK 등), 또는 이들의 케모카인의 수용체를 들 수 있다.
병변 부위의 혈관신생을 저해하는 항체의 항원으로서는, 혈관 내피세포 성장 인자(VEGF), 안지오포이에틴(Angiopoietin), 섬유아세포 성장 인자(FGF), EGF, 혈소판 유래 성장 인자(PDGF), 인슐린 유사 성장 인자(IGF), 에리스로포이에틴(EPO), TGF β, IL-8, 에필린(Ephilin), SDF-1, 또는 이들의 수용체 등을 들 수 있다.
단백질 또는 항체 의약과의 융합 항체는, 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 코드하는 cDNA에 단백질을 코드하는 cDNA를 연결시켜, 융합 항체를 코드하는 DNA를 구축하고, 이 DNA를 원핵생물 또는 진핵생물용 발현 벡터에 삽입하며, 상기 발현 벡터를 원핵생물 또는 진핵생물에 도입하는 것에 의해 발현시켜, 융합 항체를 제조할 수 있다.
상기 항체의 유도체를 검출 방법, 정량방법, 검출용 시약, 정량용 시약 또는 진단약으로서 사용하는 경우에, 본 발명의 ASCT2의 세포외 영역의 천연형 입체 구조를 특이적으로 인식하고 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편에 결합하는 약제로서는, 통상의 면역학적 검출 또는 측정법에서 이용되는 표지체를 들 수 있다. 표지체로서는, 알칼리포스파타제, 퍼옥시다제, 또는 루시퍼라제 등의 효소, 아크리디늄에스테르, 또는 로핀 등의 발광물질, 또는 플루오레세인이소티오시아네이트(FITC), 또는 테트라메틸로다민이소티오시아네이트(RITC) 등의 형광 물질 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명에는, ASCT2에 의한 아미노산의 세포내 흡수를 저해하는 모노클로날 항체 및 그 항체 단편이 포함된다.
본 발명의 항체 또는 그 항체 단편의, ASCT2에 의한 아미노산의 세포내 흡수를 저해하는 활성을 평가하는 방법으로서는, ASCT2를 발현하고 있는 정상 세포나 암 세포에서, 항체 또는 그 항체 단편을 반응시켜, 글루타민 의존적인 증식이 저해되는 것을, 생세포수 측정 시약 등을 이용하여 평가하는 방법[J. Surgical Research, 90, 149 (2000)], 또는 ASCT2를 발현하고 있는 정상 세포나 암 세포에서, 항체 또는 그 항체 단편을 반응시켜, 방사성 물질로 표지한 알라닌 등의 아미노산의 흡수가 저해되는 것을, 신틸레이션카운터 등의 기기를 이용하여 평가하는 방법[J. Biol. Chem., 271, 14883 (1996)] 등을 들 수 있다.
또한, 본 발명에는, 보체 결합 세포 상해(CDC) 활성, 또는 항체 의존성 세포 상해(ADCC) 활성 등의 세포 상해 활성을 갖는 모노클로날 항체 및 그 항체 단편이 포함된다.
본 발명의 항체 또는 그 항체 단편의 항원 양성 배양 세포주에 대한 CDC 활성, 또는 ADCC 활성은 공지의 측정 방법[Cancer I㎜unol. I㎜unother., 36, 373 (1993)]에 의해 평가할 수 있다.
또한, 본 발명에는, 아폽토시스 유도 활성을 갖는 모노클로날 항체 및 그 항체 단편이 포함된다.
또한, 본 발명에는, 마우스 ASCT2에 결합하지 않고 인간 ASCT2에 결합하는 모노클로날 항체 및 그 항체 단편이 포함된다.
또한, 본 발명에는, 인간 ASCT2의 세포외 영역 중 적어도 EL2 영역에 결합하는 모노클로날 항체 및 그 항체 단편이 포함되고, 예컨대 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중 154번째, 159∼160번째, 163∼171번째, 173∼174번째, 177번째, 188번째, 204∼205번째, 207번째, 210∼212번째, 또는 214∼223번째 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산에 결합하는 모노클로날 항체 및 그 항체 단편이 포함된다.
본 발명의 항체 또는 그 항체 단편의 결합 특이성을 평가하는 방법으로서는, 공지의 에피토프 해석법을 이용할 수 있고, 예컨대 아미노산 서열 정보에 따라, 적당한 개소를 마우스 ASCT2의 서열로 치환한, 인간/마우스 키메라 ASCT2에 대한 결합 활성을 측정함으로써 평가할 수 있다.
또한, 본 발명은 ASCT2의 세포외 영역의 천연형 입체 구조를 특이적으로 인식하고 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는 ASCT2가 관여하는 질환의 치료약에 관한 것이다.
ASCT2가 관여하는 질환으로서는, ASCT2가 발현되고 있는 세포가 관여하는 질환이면 어떠한 것이어도 좋고, 예컨대 암을 들 수 있다.
암으로서는, 혈액암, 유방암, 자궁암, 대장암, 식도암, 위암, 난소암, 폐암, 신장암, 직장암, 갑상선암, 자궁경부암, 소장암, 전립선암 또는 췌장암 등을 들 수 있고, 바람직하게는 혈액암, 식도암, 위암, 대장암, 간암 또는 전립선암을 들 수 있다. 혈액암으로서는, 골수성 백혈병, 림프성 백혈병, 다발성 골수종, 호지킨 림프종, 또는 비호지킨 림프종 등을 들 수 있다.
본 발명의 치료제로서는, 전술한 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 유효 성분으로서 함유한다.
본 발명의 항체 또는 그 항체 단편, 또는 이들의 유도체를 함유하는 치료제는, 유효 성분으로서의 상기 항체 또는 그 항체 단편, 또는 이들의 유도체만을 포함하는 것이어도 좋지만, 통상은 약리학적으로 허용되는 하나 이상의 담체와 함께 혼합하고, 제제학의 기술분야에서 공지된 임의의 방법에 의해 제조한 의약 제제로서 제공하는 것이 바람직하다.
투여 경로는, 치료에 있어서 가장 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하고, 경구 투여, 또는 구강내, 기도내, 직장내, 피하, 근육내 또는 정맥내 등의 비경구 투여를 들 수 있고, 바람직하게는 정맥내 투여를 들 수 있다.
투여 형태로서는, 분무제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제, 시럽제, 유제, 좌제, 주사제, 연고, 또는 테이프제 등을 들 수 있다.
투여량 또는 투여 횟수는, 원하는 치료 효과, 투여 방법, 치료 기간, 연령, 및 체중 등에 따라 상이하지만, 통상 성인 1일당 10 ㎍/㎏∼8 ㎎/㎏이다.
또한, 본 발명은, ASCT2의 세포외 영역의 천연형 입체 구조를 특이적으로 인식하고 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는, ASCT2의 면역학적 검출 또는 측정 방법, ASCT2의 면역학적 검출용 또는 측정용 시약, ASCT2가 발현되는 세포의 면역학적 검출 또는 측정 방법, 및 ASCT2가 관여하는 질환의 진단약에 관한 것이다.
본 발명에 있어서 ASCT2의 양을 검출 또는 측정하는 방법으로서는, 임의의 공지된 방법을 들 수 있다. 예컨대 면역학적 검출 또는 측정 방법 등을 들 수 있다.
면역학적 검출 또는 측정 방법이란, 표지를 실시한 항원 또는 항체를 이용하여, 항체량 또는 항원량을 검출 또는 측정하는 방법이다. 면역학적 검출 또는 측정 방법으로서는, 방사성 물질 표지 면역 항체법(RIA), 효소 면역 측정법(EIA 또는 ELISA), 형광 면역 측정법(FIA), 발광 면역 측정법(luminescent i㎜unoassay), 웨스턴 블롯법 또는 물리화학적 방법 등을 들 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 이용하여 ASCT2가 발현된 세포를 검출 또는 측정함으로써, 상기한 ASCT2가 관련되는 질환을 진단할 수 있다.
ASCT2가 발현되고 있는 세포의 검출에는, 공지의 면역학적 검출법을 이용할 수 있지만, 면역침강법, 형광 세포 염색법, 면역 조직 염색법, 또는 면역 조직 염색법 등이 바람직하게 이용된다. 또한, FMAT8100HTS 시스템(어플라이드바이오시스템사 제조) 등의 형광 항체 염색법 등도 이용할 수 있다.
본 발명에 있어서 ASCT2를 검출 또는 측정하는 대상이 되는 생체 시료로서는, 조직세포, 혈액, 혈장, 혈청, 췌액, 뇨, 분변, 조직액, 또는 배양액 등, ASCT2가 발현된 세포를 포함할 가능성이 있는 것이면 특별히 한정되지 않는다.
본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편, 또는 이들의 유도체를 함유하는 진단약은, 원하는 진단법에 따라서, 항원 항체 반응을 행하기 위한 시약, 상기 반응의 검출용 시약을 포함하여도 좋다. 항원 항체 반응을 행하기 위한 시약으로서는, 완충제, 염 등을 들 수 있다. 검출용 시약으로서는, 상기 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편, 또는 이들의 유도체를 인식하는 표지된 2차 항체, 또는 표지에 대응한 기질 등의 통상의 면역학적 검출 또는 측정법에 이용되는 시약을 들 수 있다.
이하에, 본 발명의 항체의 제조 방법, 질환의 치료 방법, 및 질환의 진단 방법에 대해서 구체적으로 설명한다.
1. 모노클로날 항체의 제조 방법
(1) 항원의 조제
항원이 되는 ASCT2 또는 ASCT2를 발현시킨 세포는, ASCT2 전체 길이 또는 그 부분 길이를 코드하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터를, 대장균, 효모, 곤충 세포 또는 동물 세포 등에 도입하는 것에 의해 얻을 수 있다. 또한, ASCT2를 다량으로 발현하고 있는 각종 인간 종양 배양 세포, 인간 조직 등으로부터 ASCT2를 정제하여 얻을 수 있다. 또한, 상기 종양 배양 세포, 또는 상기 조직 등을 그대로 항원으로서 이용할 수도 있다. 또한, Fmoc법, 또는 tBoc법 등의 화학 합성법에 의해 ASCT2의 부분 서열을 갖는 합성 펩티드를 조제하여 항원에 이용할 수도 있다.
본 발명으로 이용되는 ASCT2는, 문헌[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] 또는 문헌[Current Protocols In Molecular Biology, John Wiley & Sons (1987-1997)] 등에 기재된 방법 등을 이용하여, 예컨대 이하의 방법에 의해, 상기 ASCT2를 코드하는 DNA를 숙주 세포 중에서 발현시켜 제조할 수 있다.
우선, ASCT2를 코드하는 부분을 포함하는 완전 길이 cDNA를 적당한 발현 벡터의 프로모터의 하류에 삽입함으로써, 재조합 벡터를 제작한다. 상기 완전 길이 cDNA 대신에, 완전 길이 cDNA를 기초로 하여 조제된, 폴리펩티드를 코드하는 부분을 포함하는 적당한 길이의 DNA 단편을 이용하여도 좋다. 다음에, 얻어진 상기 재조합 벡터를, 상기 발현 벡터에 적합한 숙주 세포에 도입하는 것에 의해, ASCT2를 생산하는 형질전환체를 얻을 수 있다.
발현 벡터로서는, 사용하는 숙주 세포에서의 자율 복제 또는 염색체 중에의 편입이 가능하고, ASCT2를 코드하는 DNA를 전사할 수 있는 위치에, 적당한 프로모터를 함유하고 있는 것이면 모두 이용할 수 있다.
숙주 세포로서는, 대장균 등의 에스케리키아속 등에 속하는 미생물, 효모, 곤충 세포, 또는 동물 세포 등, 원하는 유전자를 발현할 수 있는 것이면 모두 이용할 수 있다.
대장균 등의 원핵생물을 숙주 세포로서 이용하는 경우, 재조합 벡터는, 원핵생물 중에서 자율 복제가 가능한 동시에, 프로모터, 리보솜 결합 서열, ASCT2를 코드하는 부분을 포함하는 DNA, 및 전사 종결 서열을 포함하는 벡터인 것이 바람직하다. 또한, 상기 재조합 벡터에는, 전사 종결 서열은 반드시 필요하지 않지만, 구조유전자의 바로 아래에 전사 종결 서열을 배치하는 것이 바람직하다. 또한, 상기 재조합 벡터에는, 프로모터를 제어하는 유전자를 포함하고 있어도 좋다.
상기 재조합 벡터로서는, 리보솜 결합 서열인 샤인-달가노 서열과 개시 코돈 사이를 적당한 거리(예컨대 6∼18 염기)로 조절한 플라스미드를 이용하는 것이 바람직하다.
또한, 상기 ASCT2를 코드하는 DNA의 염기 서열로서는, 숙주 내에서의 발현에 최적의 코돈이 되도록 염기를 치환할 수 있고, 이것에 의해 목적으로 하는 ASCT2의 생산율을 향상시킬 수 있다.
발현 벡터로서는, 사용하는 숙주 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 모두 이용할 수 있고, 예컨대 pBTrp2, pBTac1, pBTac2(이상, 로슈 다이아그노스틱스사 제조), pKK233-2(파마시아사 제조), pSE280(인비트로젠사 제조), pGEMEX-1(프로메가사 제조), pQE-8(퀴아젠사 제조), pKYP10(일본 특허 공개 소58-110600), pKYP200[Agricultural Biological Chemistry, 48, 669 (1984)], pLSA1[Agric. Biol. Chem., 53, 277 (1989)], pGEL1[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 82, 4306 (1985)], pBluescript II SK(-)(스트라타진사 제조), pTrs30[대장균 JM109/pTrS30(FERM BP-5407)로부터 조제], pTrs32[대장균 JM109/pTrS32(FERM BP-5408)로부터 조제], pGHA2[대장균 IGHA2(FERM BP-400)로부터 조제, 일본 특허 공개 소60-221091], pGKA2[대장균 IGKA2(FERM BP-6798)로부터 조제, 일본 특허 공개 소60-221091], pTerm2(US4686191, US4939094, US5160735), pSupex, pUB110, pTP5, pC194, pEG400[J. Bacteriol., 172, 2392 (1990)], pGEX(파마시아사 제조), pET 시스템(노바젠사 제조), 또는 pME18SFL3 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 사용하는 숙주 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 어떠한 것이어도 좋다. 예컨대 trp 프로모터(Ptrp), lac 프로모터, PL 프로모터, PR 프로모터, 또는 T7 프로모터 등의, 대장균이나 파지 등에서 유래하는 프로모터를 들 수 있다. 또한, Ptrp를 2개 직렬시킨 탠덤 프로모터, tac 프로모터, lacT7 프로모터, 또는 letI 프로모터 등의 인위적으로 설계 개변된 프로모터 등도 이용할 수 있다.
숙주 세포로서는, 예컨대 대장균 XL1-Blue, 대장균 XL2-Blue, 대장균 DH1, 대장균 MC1000, 대장균 KY3276, 대장균 W1485, 대장균 JM109, 대장균 HB101, 대장균 No.49, 대장균 W3110, 대장균 NY49, 또는 대장균 DH5α 등을 들 수 있다.
숙주 세포에의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 사용하는 숙주 세포에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 이용할 수 있고, 예컨대 칼슘이온을 이용하는 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972), Gene, 17, 107 (1982), Molecular & General Genetics, 168, 111 (1979)]을 들 수 있다.
동물 세포를 숙주로서 이용하는 경우, 발현 벡터로서는, 동물 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 모두 이용할 수 있고, 예컨대 pcDNAI, pcDM8(후나코시사 제조), pAGE107[일본 특허 공개 평3-22979; Cytotechnology, 3, 133 (1990)], pAS3-3(일본 특허 공개 평2-227075), pCDM8[Nature, 329, 840 (1987)], pcDNAI/Amp(인비트로젠사 제조), pcDNA3.1(인비트로젠사 제조), pREP4(인비트로젠사 제조), pAGE103[J. Biochemistry, 101, 1307 (1987)], pAGE210, pME18SFL3, 또는 pKANTEX93(WO97/10354) 등을 들 수 있다.
프로모터로서는, 동물 세포 중에서 기능을 발휘할 수 있는 것이면 모두 이용할 수 있고, 예컨대 사이토메갈로바이러스(CMV)의 즉시 초기(i㎜ediate early: IE) 유전자의 프로모터, SV40의 초기 프로모터, 레트로바이러스의 프로모터, 메탈로티오네인 프로모터, 히트 쇼크 프로모터, SRα 프로모터, 또는 몰로니 마우스 백혈병 바이러스의 프로모터 또는 인핸서를 들 수 있다. 또한, 인간 CMV의 IE 유전자의 인핸서를 프로모터와 함께 이용하여도 좋다.
숙주 세포로서는, 인간의 세포인 Namalwa 세포, 원숭이의 세포인 COS 세포, 차이니즈 햄스터의 세포인 CHO 세포, 또는 HBT5637(일본 특허 공개 소63-000299) 등을 들 수 있다.
숙주 세포에의 재조합 벡터의 도입 방법으로서는, 동물 세포에 DNA를 도입하는 방법이면 모두 이용할 수 있고, 예컨대 전기천공법[Cytotechnology, 3, 133 (1990)], 인산칼슘법(일본 특허 공개 평2-227075), 또는 리포펙션법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] 등을 들 수 있다.
이상과 같이 하여 얻어지는 ASCT2를 코드하는 DNA를 편입한 재조합 벡터를 보유하는 미생물, 또는 동물 세포 등의 유래의 형질전환체를 배지에서 배양하고, 배양물 중에 상기 ASCT2를 생성 축적시켜, 상기 배양물로부터 채취함으로써 ASCT2를 제조할 수 있다. 상기 형질전환체를 배지에서 배양하는 방법은, 숙주의 배양에 이용되는 통상의 방법에 따라서 행할 수 있다.
진핵생물 유래의 세포에서 발현시킨 경우에는, 당 또는 당쇄가 부가된 ASCT2를 얻을 수 있다.
유도성의 프로모터를 이용한 재조합 벡터로 형질전환한 미생물을 배양할 때에는, 필요에 따라 인듀서를 배지에 첨가하여도 좋다. 예컨대 lac 프로모터를 이용한 재조합 벡터로 형질전환한 미생물을 배양하는 경우에는 이소프로필-β-D-티오갈락토피라노시드 등을, trp 프로모터를 이용한 재조합 벡터로 형질전환한 미생물을 배양하는 경우에는 인돌아크릴산 등을 배지에 첨가하여도 좋다.
동물 세포를 숙주로 하여 얻어진 형질전환체를 배양하는 배지로서는, 일반적으로 사용되고 있는 RPMI 1640 배지[The Journal of the American Medical Association, 199, 519 (1967)], Eagle의 MEM 배지[Science, 122, 501 (1952)], 둘베코 개변 MEM 배지[Virology, 8, 396 (1959)], 199 배지[Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 73, 1 (1950)], 이스코브 개변 둘베코 배지(Iscove's Modified Dulbecco's Medium: IMDM)배지, 또는 이들 배지에 소태아 혈청(FBS) 등을 첨가한 배지 등을 들 수 있다. 배양은, 통상 pH 6∼8, 30℃∼40℃, 5% CO2 존재 하 등의 조건 하에서 1∼7일 동안 행한다. 또한, 배 양중 필요에 따라, 카나마이신, 페니실린 등의 항생 물질을 배지에 첨가하여도 좋다.
ASCT2를 코드하는 유전자의 발현 방법으로서는, 직접 발현 이외에, 분비 생산 또는 융합 단백질 발현 등의 방법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)]을 이용할 수 있다.
ASCT2의 생산 방법으로서는, 숙주 세포내에 생산시키는 방법, 숙주 세포외로 분비시키는 방법, 또는 숙주 세포외 막 상에 생산시키는 방법이 있고, 사용하는 숙주 세포나, 생산시키는 ASCT2의 구조를 바꾸는 것에 의해, 적절한 방법을 선택할 수 있다.
ASCT2가 숙주 세포내 또는 숙주 세포외 막상에 생산되는 경우, Poulson 등의 방법[J. Biol. Chem., 264, 17619 (1989)], 로우 등의 방법[Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 86, 8227 (1989), Genes Develop., 4, 1288 (1990)], 일본 특허 공개 평 05-336963, 또는 WO94/23021 등에 기재된 방법을 이용하는 것에 의해, ASCT2를 숙주 세포외로 적극적으로 분비시킬 수 있다.
또한, 디히드로엽산 환원 효소 유전자 등을 이용한 유전자 증폭계(일본 특허 공개 평2-227075)를 이용하여 ASCT2의 생산량을 상승시킬 수도 있다.
얻어진 ASCT2는, 예컨대 이하와 같이 하여 단리, 정제할 수 있다.
ASCT2가 세포내에 용해 상태로 발현된 경우에는, 배양 종료 후에 세포를 원심분리에 의해 회수하고, 수계 완충액에 현탁 후, 초음파 파쇄기, 프렌치프레스, 맨튼 가우린 호모게나이저, 또는 다이노밀 등을 이용하여 세포를 파쇄하여 무세포 추출액을 얻는다. 상기 무세포 추출액을 원심분리함으로써 얻어지는 상청으로부터, 통상의 단백질의 단리 정제법, 즉 용매 추출법, 황산암모늄 등에 의한 염석법, 탈염법, 유기 용매에 의한 침전법, 디에틸아미노에틸(DEAE)-세파로스, DIAION HPA-75(미쓰비시화학사 제조) 등의 레진을 이용한 음이온 교환 크로마토그래피법, S-세파로스 FF(파마시아사 제조) 등의 레진을 이용한 양이온 교환 크로마토그래피법, 부틸 세파로스, 페닐 세파로스 등의 레진을 이용한 소수성 크로마토그래피법, 분자체를 이용한 겔 여과법, 친화성 크로마토그래피법, 크로마토포커싱법, 또는 등전점 전기영동 등의 전기영동법 등의 방법을 단독 또는 조합하여 이용하여 정제 표본을 얻을 수 있다.
ASCT2가 세포내에 불용체를 형성하여 발현한 경우는, 상기와 마찬가지로 세포를 회수 후 파쇄하고, 원심분리를 행하는 것에 의해, 침전 분획으로서 상기 ASCT2의 불용체를 회수한다. 회수한 상기 ASCT2의 불용체를 단백질 변성제로 가용화한다. 상기 가용화액을 희석 또는 투석함으로써, 상기 ASCT2를 정상적인 입체 구조에 복귀시킨 후, 상기와 같은 단리 정제법에 의해 폴리펩티드의 정제 표본을 얻을 수 있다.
ASCT2 또는 그 당 수식체 등의 유도체가 세포외로 분비된 경우에는, 배양 상청에 있어서 상기 ASCT2 또는 그 당수식체 등의 유도체를 회수할 수 있다. 상기 배양물을 상기와 같이 원심분리 등의 방법에 의해 처리함으로써 가용성 분획을 취득하고, 상기 가용성 분획으로부터, 상기와 같은 단리 정제법을 이용하는 것에 의해 정제 표본을 얻을 수 있다.
또한, 본 발명에 있어서 이용되는 ASCT2는 Fmoc법, 또는 tBoc법 등의 화학 합성법에 의해서도 제조할 수 있다. 또한, 어드밴스드켐텍사 제조, 퍼킨 엘머사 제조, 파마시아사 제조, 프로테인테크놀로지인스트루먼트사 제조, 신세셀베가사 제조, 퍼셉티브사 제조, 또는 시마즈제작소사 제조 등의 펩티드 합성기를 이용하여 화학 합성할 수도 있다.
(2) 동물의 면역과 융합용 항체 생산 세포의 조제
3∼20주령의 마우스, 래트 또는 햄스터 등의 동물에게, (1)에서 얻어지는 항원으로 면역화하여, 그 동물의 폐, 림프절, 말초혈 중의 항체 생산 세포를 채취한다. 또한, 면역원성이 낮고 상기한 동물에서 충분한 항체가의 상승이 확인되지 않는 경우에는, ASCT2 녹아웃 마우스를 피면역 동물로서 이용할 수도 있다.
면역은, 동물의 피하 또는 정맥내 또는 복강내에, 예컨대 프로인드의 완전 어쥬번트, 또는 수산화알루미늄 겔과 백일해균 백신 등의 적당한 어쥬번트와 함께 항원을 투여함으로써 행한다. 항원이 부분 펩티드인 경우에는, BSA(소혈청 알부민), 또는 KLH(Keyhole Limpet hemocyanin) 등의 캐리어 단백질과 컨쥬게이트를 제작하고, 이것을 면역원으로서 이용한다.
항원의 투여는, 1회째의 투여 후, 1∼2주간 걸러 5∼10회 행한다. 각 투여 후 3∼7일째에 안저 정맥총로부터 채혈하고, 그 혈청의 항체가를 효소 면역 측정법[Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988)] 등을 이용하여 측정한다. 면역에 이용한 항원에 대하여, 그 혈청이 충분한 항체가를 나타낸 동물을 융합용 항체 생산 세포의 공급원으로 한다.
항원의 최종 투여 후 3∼7일째에, 면역화한 동물로부터 비장 등의 항체 생산 세포를 포함하는 조직을 적출하고, 항체 생산 세포를 채취한다. 비장 세포를 이용하는 경우에는, 비장을 세단(細斷)하고, 현탁시킨 후, 원심분리하며, 추가로 적혈구를 제거하여 융합용 항체 생산 세포를 취득한다.
(3) 골수종 세포의 조제
골수종 세포로서는, 마우스로부터 얻어진 주화 세포를 이용하고, 예컨대 8-아자구아닌 내성 마우스(BALB/c 유래) 골수종 세포주 P3-X63Ag8-U1(P3-U1)[Current Topics in Microbiology and I㎜unology, 18, 1 (1978)], P3-NS1/1-Ag41(NS-1)[European J. I㎜unology, 6, 511 (1976)], SP2/0-Ag14(SP-2)[Nature, 276, 269 (1978)], P3-X63-Ag8653(653)[J. I㎜unology, 123, 1548 (1979)], 또는 P3-X63-Ag8(X63)[Nature, 256, 495 (1975)] 등이 이용된다.
상기 골수종 세포는, 정상 배지[글루타민, 2-머캅토에탄올, 젠타마이신, FBS, 및 8-아자구아닌을 가한 RPMI 1640 배지]에서 계대하고, 세포 융합의 3∼4일 전에 정상 배지에 계대하여, 융합 당일 2×107개 이상의 세포수를 확보한다.
(4) 세포 융합과 모노클로날 항체 생산 하이브리도마의 조제
(2)에서 얻어지는 융합용 항체 생산 세포(3)로 얻어지는 골수종 세포를 최소 필수 배지(Minimum Essential Medium: MEM) 배지 또는 PBS(인산이나트륨 1.83 g, 인산일칼륨 0.21 g, 식염 7.65 g, 증류수 1 리터, pH 7.2)로 잘 세정하고, 세포수가, 융합용 항체 생산 세포:골수종 세포=5∼10:1이 되도록 혼합하고, 원심분리한 후, 상청을 제거한다. 침전한 세포군을 느슨하게 푼 후, 폴리에틸렌글리콜-1000(PEG-1000), MEM 배지 및 디메틸설폭시드의 혼액을 37℃에서 교반하면서 가한다. 또한, 1∼2분간마다 MEM 배지 1∼2 mL를 수회 가한 후, MEM 배지를 가하여 전량이 50 mL가 되도록 한다. 원심분리 후, 상청을 제거한다. 침전한 세포군을 느슨하게 푼 후, 융합용 항체 생산 세포에 HAT 배지[하이포크산틴, 티미딘, 및 아미노프테린을 가한 정상 배지] 중에 느슨하게 세포를 현탁한다. 이 현탁액을 5% CO2 인큐베이터 중 37℃에서 7∼14일 동안 배양한다.
배양 후, 배양 상청의 일부를 추출하고, 후술하는 결합 어세이 등의 하이브리도마의 선택 방법에 의해, ASCT2를 포함하는 항원에 반응하고, ASCT2를 포함하지 않는 항원에 반응하지 않는 세포군을 선택한다. 다음에, 한계 희석법에 의해 클로닝을 2회 반복하여[1회째는 HT 배지(HAT 배지로부터 아미노프테린을 제외한 배지), 2회째는 정상 배지를 사용함], 안정되고 강한 항체가가 확인된 것을 모노클로날 항체 생산 하이브리도마로서 선택한다.
(5) 정제 모노클로날 항체의 조제
프리스탄 처리[2,6,10,14-테트라메틸펜타데칸(Pristane) 0.5 ml를 복강내 투여하고, 2주간 사육함]한 8∼10주령의 마우스 또는 누드 마우스에, (4)에서 얻어지는 모노클로날 항체 생산 하이브리도마를 복강내에 주사한다. 10∼21일에 하이브리도마는 복수암화한다. 이 마우스로부터 복수를 채취하고, 원심분리하여 고형분을 제거한 후, 40%∼50% 황산암모늄으로 염석하고, 카프릴산 침전법, DEAE-세파로스 컬럼, 프로테인 A-컬럼 또는 겔 여과 컬럼에 의한 정제를 행하며, IgG 또는 IgM 분획을 모아, 정제 모노클로날 항체로 한다.
또한, (4)에서 얻어지는 모노클로날 항체 생산 하이브리도마를, 10% FBS를 첨가한 RPMI 1640 배지 등에서 배양한 후, 원심분리에 의해 상청을 제거하고, 5% 다이고 GF21을 첨가한 Hybridoma SFM 배지에 현탁하여 3∼7일 동안 배양한다. 얻어진 세포 현탁액을 원심분리하고, 얻어진 상청으로부터 프로테인 A-컬럼 또는 프로테인 G-컬럼에 의한 정제를 행하며, IgG 분획을 모아, 정제 모노클로날 항체를 얻을 수도 있다.
항체의 서브클래스의 결정은, 서브클래스 타이핑 키트를 이용하여 효소 면역 측정법에 의해 행한다. 단백량의 정량은, 로리법 및 280 ㎚에서의 흡광도로부터 산출한다.
(6) 모노클로날 항체의 선택
모노클로날 항체의 선택은 이하에 나타내는 효소 면역 측정법에 의한 결합 어세이, 및 아미노산의 세포내 흡수 저해 어세이에 의해 행한다.
(6-a) 결합 어세이
항원으로서는, (1)에서 얻어지는 ASCT2를 코드하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터를 대장균, 효모, 곤충 세포, 또는 동물 세포 등에 도입하여 얻어진 유전자 도입 세포, 재조합 단백질, 또는 인간 조직으로부터 얻은 정제 폴리펩티드 또는 부분 펩티드 등을 이용한다. 항원이 부분 펩티드인 경우에는, BSA 또는 KLH 등의 캐리어 단백질과 컨쥬게이트를 제작하여, 이것을 이용한다.
항원을 96웰 플레이트 등의 플레이트에 분주하여, 고상화한 후, 제1 항체로서 혈청, 하이브리도마의 배양 상청 또는 정제 모노클로날 항체 등의 피검 물질을 분주하여 반응시킨다. PBS 또는 PBS-Tween 등으로 잘 세정한 후, 제2 항체로서 비오틴, 효소, 화학 발광 물질 또는 방사선 화합물 등으로 표지한 항면역글로불린 항체를 분주하여 반응시킨다. PBS-Tween으로 잘 세정한 후, 제2 항체의 표지 물질에 따른 반응을 행하고, 면역원에 대하여 특이적으로 반응하는 모노클로날 항체를 선택한다.
(6-b) 아미노산의 세포내 흡수 저해 어세이
평가 세포로서, (1)에서 얻어진, ASCT2를 코드하는 cDNA를 포함하는 발현 벡터를 동물 세포 등에 도입한 유전자 도입 세포, 또는 ASCT2를 발현하고 있는 정상 세포 또는 암 세포를 이용한다.
본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편의 ASCT2에 의한 아미노산의 세포내 흡수를 저해하는 활성은, ASCT2를 발현하고 있는 정상 세포나 암 세포에 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 반응시켜, 글루타민 의존적인 증식이 저해되는 것을, 생세포수 측정 시약 등을 이용하여 평가하는 방법[J. Surgical Research, 90, 149 (2000)], 또는 ASCT2를 발현하고 있는 정상 세포나 암 세포에 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 반응시켜, 방사성 물질로 표지한 알라닌 등의 아미노산의 흡수가 저해되는 것을, 신틸레이션 카운터 등의 기기를 이용하여 평가하는 방법[J. Biol. Chem., 271, 14883 (1996)] 등을 이용하여 행한다.
2. 유전자 재조합 항체의 제작
유전자 재조합 항체의 제작예로서, 이하에 인간형 키메라 항체 및 인간화 항체의 제작 방법을 나타낸다.
(1) 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 구축
유전자 재조합 항체 발현용 벡터는, 인간 항체의 CH 및 CL을 코드하는 DNA가 편입된 동물 세포용 발현 벡터이며, 동물 세포용 발현 벡터에 인간 항체의 CH 및 CL을 코드하는 DNA를 각각 클로닝함으로써 구축할 수 있다.
인간 항체의 C 영역은 임의의 인간 항체의 CH 및 CL을 이용할 수 있다. 예컨대, 인간 항체의 γ1 서브클래스의 CH 및 κ 클래스의 CL 등을 이용한다. 인간 항체의 CH 및 CL을 코드하는 DNA에는, cDNA를 이용하지만, 엑손과 인트론으로 이루어지는 염색체 DNA를 이용할 수도 있다. 동물 세포용 발현 벡터에는, 인간 항체의 C 영역을 코드하는 유전자를 조립하여 발현할 수 있는 것이면 어떠한 것이어도 이용할 수 있다. 예컨대 pAGE107[Cytotechnol., 3, 133 (1990)], pAGE103[J. Biochem., 101, 1307 (1987)], pHSG274[Gene, 27, 223 (1984)], pKCR[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 78, 1527 (1981)], pSG1bd2-4[Cytotechnol., 4, 173 (1990)], 또는 pSE1UK1Sed1-3[Cytotechnol., 13, 79 (1993)] 등을 이용한다. 동물 세포용 발현 벡터 중 프로모터와 인핸서에는, SV40의 초기 프로모터[J. Biochem., 101, 1307 (1987)], 몰로니 마우스 백혈병 바이러스 LTR[Biochem. Biophys. Res. Co㎜un., 149, 960 (1987)], 또는 면역 글로불린 H쇄의 프로모터[Cell, 41, 479 (1985)]와 인핸서[Cell, 33, 717 (1983)] 등을 이용한다.
유전자 재조합 항체 발현용 벡터에는, 유전자 재조합 항체 발현 벡터의 구축의 용이함, 동물 세포에의 도입의 용이함, 동물 세포내에서의 항체 H쇄 및 L쇄의 발현량의 밸런스의 균형 등의 점에서, 항체 H쇄 및 L쇄가 동일한 벡터 상에 존재하는 타입(탠덤형)의 유전자 재조합 항체 발현용 벡터[J. I㎜unol. Methods, 167, 271 (1994)]를 이용하지만, 항체 H쇄 및 L쇄가 별개의 벡터 상에 존재하는 타입을 이용할 수도 있다. 탠덤형의 유전자 재조합 항체 발현용 벡터에는, pKANTEX93(WO97/10354), pEE18[Hybridoma, 17, 559 (1998)] 등을 이용한다.
(2) 인간 이외의 동물 유래의 항체의 V 영역을 코드하는 cDNA의 취득 및 아미노산 서열의 해석
비인간 항체의 VH 및 VL을 코드하는 cDNA의 취득 및 아미노산 서열의 해석은 이하와 같이 하여 행할 수 있다.
비인간 항체를 생산하는 하이브리도마 세포로부터 mRNA를 추출하고, cDNA를 합성한다. 합성한 cDNA를 파지 또는 플라스미드 등의 벡터에 클로닝하여 cDNA 라이브러리를 제작한다. 상기 라이브러리로부터, 마우스 항체의 C 영역 부분 또는 V 영역 부분을 코드하는 DNA를 프로브로서 이용하여, VH 또는 VL을 코드하는 cDNA를 갖는 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드를 각각 단리한다. 재조합 파지 또는 재조합 플라스미드 상의 목적으로 하는 마우스 항체의 VH 또는 VL의 전체 염기 서열을 각각 결정하고, 염기 서열로부터 VH 또는 VL의 전체 아미노산 서열을 각각 추정한다.
비인간 항체를 생산하는 하이브리도마 세포를 제작하는 인간 이외의 동물에는, 마우스, 래트, 햄스터, 또는 토끼 등을 이용하지만, 하이브리도마 세포를 제작하는 것이 가능하면, 어떠한 동물도 이용할 수 있다.
하이브리도마 세포로부터의 전체 RNA의 조제에는, 티오시안산구아니딘-트리플루오로초산세슘법[Methods in Enzymol., 154, 3 (1987)], 또는 RNeasy kit(퀴아젠사 제조) 등의 키트 등을 이용한다.
전체 RNA로부터의 mRNA의 조제에는, 올리고(dT) 고정화 셀룰로스 컬럼법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)], 또는 Oligo-dT30<Super> mRNA Purification Kit(다카라바이오사 제조) 등의 키트 등을 이용한다. 또한, Fast Track mRNA Isolation Kit(인비트로젠사 제조), 또는 QuickPrep mRNA Purification Kit(파마시아사 제조) 등의 키트를 이용하여 하이브리도마 세포로부터 mRNA를 조제할 수도 있다.
cDNA의 합성 및 cDNA 라이브러리의 제작에는, 공지의 방법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons (1987-1997)], 또는 SuperScript Plasmid System for cDNA Synthesis and Plasmid Cloning(인비트로젠사 제조), 또는 ZAP-cDNA Synthesis Kit(스트라타진사 제조) 등의 키트 등을 이용한다.
cDNA 라이브러리의 제작 시, 하이브리도마 세포로부터 추출한 mRNA를 주형으로 하여 합성한 cDNA를 편입한 벡터에는, 상기 cDNA를 편입할 수 있는 벡터이면 어떠한 것이어도 이용할 수 있다. 예컨대 ZAP Express[Strategies, 5, 58 (1992)], pBluescript II SK(+)[Nucleic Acids Research, 17, 9494 (1989)], λZAPII(Stratagene사 제조), λgt10, λgt11[DNA Cloning:A Practical Approach, I, 49 (1985)], Lambda BlueMid(클론테크사 제조), λExCell, pT7T3-18 U(파마시아사 제조), pcD2[Mol. Cell. Biol., 3, 280 (1983)], 또는 pUC18[Gene, 33, 103 (1985)] 등을 이용한다.
파지 또는 플라스미드 벡터에 의해 구축되는 cDNA 라이브러리를 도입하는 대장균에는, 상기 cDNA 라이브러리를 도입, 발현 및 유지할 수 있는 것이면 어떠한 것이어도 이용할 수 있다. 예컨대 XL1-Blue MRF'[Strategies, 5, 81 (1992)], C 600[Genetics, 39, 440 (1954)], Y1088, Y1090[Science, 222, 778 (1983)], NM522[J. Mol. Biol., 166, 1 (1983)], K802[J. Mol. Biol., 16, 118 (1966)], 또는 JM105[Gene, 38, 275 (1985)] 등을 이용한다.
cDNA 라이브러리로부터의 비인간 항체의 VH 또는 VL을 코드하는 cDNA 클론의 선택에는, 아이소토프 또는 형광 표지한 프로브를 이용한 콜로니·하이브리다이제이션법, 또는 플라크·하이브리다이제이션법[Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989)] 등을 이용한다.
또한, 프라이머를 조제하고, mRNA로부터 합성한 cDNA 또는 cDNA 라이브러리를 주형으로 하여, 폴리머라제 연쇄 반응(Polymerase Chain Reaction)법[이하, PCR법으로 표기함, Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Second Edition , Cold Spring Harbor Laboratory Press (1989), Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1, John Wiley & Sons (1987-1997)]을 행하는 것으로부터 VH 또는 VL을 코드하는 cDNA를 조제할 수도 있다.
선택된 cDNA를, 적당한 제한 효소 등으로 절단한 후, pBluescript SK(-)(스트라타진사 제조) 등의 플라스미드에 클로닝하여, 통상 이용되는 염기 서열 해석 방법 등에 의해 해당 cDNA의 염기 서열을 결정한다. 염기 서열 해석 방법에는, 예컨대 디데옥시법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74, 5463 (1977)] 등의 반응을 행한 후, A.L.F. DNA 시퀀서(파마시아사 제조) 등의 염기 서열 자동분석장치 등을 이용한다.
결정한 염기 서열로부터 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열을 각각 추정하고, 기지의 항체의 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열[Sequences of Proteins of I㎜unological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]과 비교함으로써, 취득한 cDNA가 분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열을 코드하고 있는지를 각각 확인한다. 분비 시그널 서열을 포함하는 항체의 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열에 관해서는, 기지의 항체의 VH 및 VL의 전체 아미노산 서열[Sequences of Proteins of I㎜unological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]과 비교함으로써, 분비 시그널 서열의 길이 및 N 말단아미노산 서열을 추정할 수 있고, 더 나아가서는 이들이 속하는 서브그룹을 알 수 있다. 또한, VH 및 VL의 각 CDR의 아미노산 서열에 대해서도, 기지의 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열[Sequences of Proteins of I㎜unological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]과 비교함으로써 확인할 수 있다.
또한, 얻어진 VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열을 이용하여, 예컨대 SWISS-PROT 또는 PIR-Protein 등의 임의의 데이터베이스에 대하여 BLAST법[J. Mol. Biol., 215, 403 (1990)] 등의 상동성 검색을 행하여, VH 및 VL의 완전한 아미노산 서열이 신규한 것인지를 확인할 수 있다.
(3) 인간형 키메라 항체 발현 벡터의 구축
(1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코드하는 각각의 유전자의 상류에, 각각 비인간 항체의 VH 또는 VL을 코드하는 cDNA를 각각 클로닝함으로써, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
비인간 항체의 VH 또는 VL을 코드하는 cDNA의 3' 말단측과, 인간 항체의 CH 또는 CL의 5' 말단측을 연결하기 위해, 연결 부분의 염기 서열이 적절한 아미노산을 코드하고, 적당한 제한 효소 인식 서열이 되도록 설계한 VH 및 VL의 cDNA를 제작한다. 제작된 VH 및 VL의 cDNA를, (1)에서 얻어지는 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코드하는 각각의 유전자의 상류에 이들이 적절한 형태로 발현되도록 각각 클로닝하여, 인간형 키메라 항체 발현 벡터를 구축한다.
또한, 비인간 항체 VH 또는 VL을 코드하는 cDNA를, 적당한 제한 효소의 인식 서열을 양단에 갖는 합성 DNA를 이용하여 PCR법에 의해 각각 증폭하여, (1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터에 클로닝할 수 있다.
(4) 인간화 항체의 V 영역을 코드하는 cDNA의 구축
인간화 항체의 VH 또는 VL을 코드하는 cDNA는, 이하와 같이 하여 구축할 수 있다.
비인간 항체의 VH 또는 VL의 CDR의 아미노산 서열을 이식하는 인간 항체의 VH 또는 VL의 프레임워크 영역(이하, FR로 표기함)의 아미노산 서열을 각각 선택한다. 선택하는 FR의 아미노산 서열에는, 인간 항체 유래의 것이면 어느 것이어도 이용할 수 있다. 예컨대 Protein Data Bank 등의 데이터베이스에 등록되어 있는 인간 항체의 FR의 아미노산 서열, 또는 인간 항체의 FR의 각 서브그룹의 공통 아미노산 서열[Sequences of Proteins of I㎜unological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)] 등을 이용한다. 항체의 결합 활성의 저하를 억제하기 위해, 원래의 항체의 VH 또는 VL의 FR의 아미노산 서열과 가능한 한 높은 상동성(적어도 60% 이상)의 FR의 아미노산 서열을 선택한다.
다음에, 선택한 인간 항체의 VH 또는 VL의 FR의 아미노산 서열에, 원래의 항체의 CDR의 아미노산 서열을 각각 이식하여, 인간화 항체의 VH 또는 VL의 아미노산 서열을 각각 설계한다. 설계한 아미노산 서열을 항체의 유전자의 염기 서열에 보이는 코돈의 사용 빈도[Sequences of Proteins of I㎜unological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]를 고려하여 DNA 서열로 변환하고, 인간화 항체의 VH 또는 VL의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 각각 설계한다.
설계한 DNA 서열에 기초하여, 100 염기 전후의 길이로 이루어지는 여러 개의 합성 DNA를 합성하고, 이들을 이용하여 PCR 반응을 행한다. 이 경우, PCR 반응에서의 반응 효율 및 합성 가능한 DNA의 길이로부터, 바람직하게는 H쇄, L쇄 모두 6개의 합성 DNA를 설계한다.
또한, 양단에 위치하는 합성 DNA의 5' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, (1)에서 얻어지는 인간화 항체 발현용 벡터에 용이하게 인간화 항체의 VH 또는 VL을 코드하는 cDNA를 클로닝할 수 있다.
PCR 반응 후, 증폭 산물을 pBluescript SK(-)(스트라타진사 제조) 등의 플라스미드에 각각 클로닝하여, (2)에 기재된 방법과 같은 방법에 의해 염기 서열을 결정하고, 원하는 인간화 항체의 VH 또는 VL의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 갖는 플라스미드를 취득한다.
(5) 인간화 항체의 V 영역의 아미노산 서열의 개변
인간화 항체는, 비인간 항체의 VH 및 VL의 CDR만을 인간 항체의 VH 및 VL의 FR에 이식한 것만으로는, 그 항원 결합 활성은 원래의 비인간 항체에 비해 저하된다[BIO/TECHNOLOGY, 9, 266 (1991)]. 인간화 항체로서는, 인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열 중에서, 직접 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기, CDR의 아미노산 잔기와 상호 작용하는 아미노산 잔기, 및 항체의 입체 구조를 유지하고, 간접적으로 항원과의 결합에 관여하고 있는 아미노산 잔기를 확인하여, 이들 아미노산 잔기를 원래의 비인간 항체의 아미노산 잔기로 치환함으로써, 저하한 항원 결합 활성을 상승시킬 수 있다.
항원 결합 활성에 관여하는 FR의 아미노산 잔기를 확인하기 위해, X선 결정 해석[J. Mol. Biol., 112, 535 (1977)] 또는 컴퓨터 모델링[Protein Engineering, 7, 1501 (1994)] 등을 이용하는 것에 의해, 항체의 입체 구조의 구축 및 해석을 할 수 있다. 또한, 각각의 항체에 대해서 여러 종의 개변체를 제작하여, 각각의 항원 결합 활성과의 상관을 검토하는 것을 반복하여 시행 착오함으로써 필요한 항원 결합 활성을 갖는 개변 인간화 항체를 취득할 수 있다.
인간 항체의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 잔기는, 개변용 합성 DNA를 이용하여 (4)에 기재된 PCR 반응을 행하는 것에 의해 개변시킬 수 있다. PCR 반응 후의 증폭 산물에 대해서 (2)에 기재된 방법에 의해 염기 서열을 결정하고, 원하는 개변이 실시된 것을 확인한다.
(6) 인간화 항체 발현 벡터의 구축
(1)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코드하는 각각의 유전자의 상류에, 구축한 유전자 재조합 항체의 VH 또는 VL을 코드하는 cDNA를 각각 클로닝하여, 인간화 항체 발현 벡터를 구축할 수 있다.
예컨대, (4) 및 (5)에서 얻어지는 인간화 항체의 VH 또는 VL을 구축할 때에 이용하는 합성 DNA 중, 양단에 위치하는 합성 DNA의 5' 말단에 적당한 제한 효소의 인식 서열을 도입함으로써, (1)에서 얻어지는 인간화 항체 발현용 벡터의 인간 항체의 CH 또는 CL을 코드하는 각각의 유전자의 상류에 이들이 적절한 형태로 발현하도록 각각 클로닝한다.
(7) 유전자 재조합 항체의 일과성 발현
(3) 및 (6)에서 얻어지는 유전자 재조합 항체 발현 벡터, 또는 이들을 개변한 발현 벡터를 이용하여 유전자 재조합 항체의 일과성 발현을 행하고, 제작한 다종류의 인간화 항체의 항원 결합 활성을 효율적으로 평가할 수 있다.
발현 벡터를 도입하는 숙주 세포에는, 유전자 재조합 항체를 발현할 수 있는 숙주 세포이면 어떠한 세포라도 이용할 수 있지만, 예컨대 COS-7세포[American Type Culture Collection(ATCC) 번호: CRL1651]를 이용한다[Methods in Nucleic Acids Res., CRC press, 283 (1991)].
COS-7세포에의 발현 벡터의 도입에는, DEAE-덱스트란법[Methods in Nucleic Acids Res., CRC press (1991)], 또는 리포펙션법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 84, 7413 (1987)] 등을 이용한다.
발현 벡터의 도입 후, 배양 상청 중의 유전자 재조합 항체의 발현량 및 항원 결합 활성은 효소 면역 항체법[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press (1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1988), 단클론 항체 실험메뉴얼, 고단사 사이언티픽 (1987)] 등을 이용하여 측정한다.
(8) 유전자 재조합 항체를 안정적으로 발현하는 형질전환주의 취득과 유전자 재조합 항체의 조제
(3) 및 (6)에서 얻어진 유전자 재조합 항체 발현 벡터를 적당한 숙주 세포에 도입하는 것에 의해 유전자 재조합 항체를 안정적으로 발현하는 형질전환주를 얻을 수 있다.
숙주 세포에의 발현 벡터의 도입에는, 전기천공법[일본 특허 공개 평2-257891, Cytotechnology, 3, 133 (1990)] 등을 이용한다.
유전자 재조합 항체 발현 벡터를 도입하는 숙주 세포에는, 유전자 재조합 항체를 발현시킬 수 있는 숙주 세포이면 어떠한 세포라도 이용할 수 있다. 예컨대 마우스 SP2/0-Ag14 세포(ATCC 번호: CRL1581), 마우스 P3X63-Ag8. 653 세포(ATCC 번호: CRL1580), 디히드로엽산 환원 효소 유전자(이하, dhfr로 표기함)가 결손된 CHO 세포[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 77, 4216 (1980)], 렉틴 내성을 획득한 Lec13[Somatic Cell and Molecular genetics, 12, 55 (1986)], α1,6-푸코스 전이효소 유전자가 결손된 CHO 세포(WO2005/035586, WO02/31140), 래트 YB2/3HL. P2. G11. 16Ag. 20 세포(ATCC 번호: CRL1662) 등을 이용한다.
또한, 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코스의 합성에 관여하는 효소 등의 단백질 또는 N-글리코시드 결합 복합형 당쇄의 환원 말단의 N-아세틸글루코사민의 6위에 푸코스의 1위가 α 결합하는 당쇄 수식에 관여하는 효소 등의 단백질, 또는 세포내 당뉴클레오티드 GDP-푸코스의 골지체에의 수송에 관여하는 단백질 등의 활성이 저하 또는 결실된 숙주 세포, 예컨대 α1,6-푸코스 전이효소 유전자가 결손된 CHO 세포(WO2005/035586, WO02/31140) 등을 이용할 수 있다.
발현 벡터의 도입 후, 유전자 재조합 항체를 안정적으로 발현하는 형질전환주는, G418 황산염(이하, G418로 표기함) 등의 약제를 포함하는 동물 세포 배양용 배지에서 배양함으로써 선택한다(일본 특허 공개 평2-257891).
동물 세포 배양용 배지에는, RPMI 1640 배지(인비트로젠사 제조), GIT 배지(니혼제약사 제조), EX-CELL301 배지(JRH사 제조), IMDM 배지(인비트로젠사 제조), Hybridoma-SFM 배지(인비트로젠사 제조), 또는 이들 배지에 FBS 등의 각종 첨가물을 첨가한 배지 등을 이용한다. 얻어진 형질전환주를 배지 중에서 배양함으로써 배양 상청 중에 유전자 재조합 항체를 발현 축적시킨다. 배양 상청 중 유전자 재조합 항체의 발현량 및 항원 결합 활성은 ELISA법 등에 의해 측정할 수 있다. 또한, 형질전환주는, DHFR 증폭계(일본 특허 공개 평2-257891) 등을 이용하여 유전자 재조합 항체의 발현량을 상승시킬 수 있다.
유전자 재조합 항체는, 형질전환주의 배양 상청으로부터 프로테인 A-컬럼을 이용하여 정제한다[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]. 또한, 겔 여과, 이온 교환 크로마토그래피 및 한외여과 등의 단백질의 정제로 이용되는 방법을 조합할 수 있다.
정제한 유전자 재조합 항체의 H쇄, L쇄 또는 항체 분자 전체의 분자량은, 폴리아크릴아미드 겔 전기영동법[Nature, 227, 680(1970)], 또는 웨스턴 블로팅법[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996), Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)] 등을 이용하여 측정할 수 있다.
3. 정제 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편의 활성 평가
정제한 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편의 활성 평가는, 이하와 같이 행할 수 있다.
ASCT2 발현 세포주에 대한 결합 활성은, 전술한 1-(6a) 기재의 결합 어세이를 이용하여 측정한다. 또한, 형광항체법[Cancer I㎜unol. I㎜unother., 36, 373(1993)] 또는 Biacore 시스템 등을 이용한 표면 플라스몬 공명법 등을 이용하여 측정할 수 있다.
ASCT2에 의한 아미노산의 세포내 흡수를 저해하는 활성은, 전술한 1-(6b) 기재의 방법 등에 의해 측정한다.
또한, 항원 양성 배양 세포주에 대한 CDC 활성, 또는 ADCC 활성은 공지의 측정 방법[Cancer I㎜unol. I㎜unother., 36, 373(1993)]에 의해 측정한다.
4. 본 발명의 항ASCT2 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 이용한 질환의 치료 방법
본 발명의 ASCT2의 세포외 영역의 천연형 입체 구조를 특이적으로 인식하고 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편은, ASCT2가 관여하는 질환의 치료에 이용할 수 있다.
본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편, 또는 이들의 유도체를 함유하는 치료제는, 유효 성분으로서의 상기 항체 또는 그 항체 단편, 또는 이들의 유도체만을 포함하는 것이어도 좋지만, 통상은 약리학적으로 허용되는 하나 이상의 담체와 함께 혼합하고, 제제학의 기술분야에서 공지된 방법에 의해 제조한 의약제제로서 제공된다.
투여 경로에는 경구 투여, 또는 구강내, 기도내, 직장내, 피하, 근육내 또는 정맥내 등의 비경구 투여를 들 수 있고, 투여 형태로서는 분무제, 캡슐제, 정제, 산제, 과립제, 시럽제, 유제, 좌제, 주사제, 연고, 또는 테이프제 등을 들 수 있다.
경구 투여에 적당한 제제는 유제, 시럽제, 캡슐제, 정제, 산제, 또는 과립제 등이다.
유제 또는 시럽제와 같은 액체 조제물은, 물, 자당, 소르비톨 또는 과당 등의 당류, 폴리에틸렌글리콜 또는 프로필렌글리콜 등의 글리콜류, 참기름, 올리브유 또는 대두유 등의 오일류, p-히드록시안식향산에스테르류 등의 방부제, 또는 스트로베리 플레이버 또는 페퍼민트 등의 플레이버류 등을 첨가제로서 이용하여 제조한다.
캡슐제, 정제, 산제 또는 과립제 등은 젖당, 포도당, 자당 또는 만니톨 등의 부형제, 전분 또는 알긴산나트륨 등의 붕괴제, 스테아르산마그네슘 또는 탈크 등의 활택제, 폴리비닐알코올, 히드록시프로필셀룰로스 또는 젤라틴 등의 결합제, 지방산에스테르 등의 계면활성제 또는 글리세린 등의 가소제 등을 첨가제로서 이용하여 제조한다.
비경구 투여에 적당한 제제로서는, 주사제, 좌제 또는 분무제 등이다.
주사제는 소금 용액, 포도당 용액, 또는 그 양자의 혼합물로 이루어지는 담체 등을 이용하여 제조한다.
좌제는 카카오지, 수소화지방 또는 카복실산 등의 담체를 이용하여 제조한다.
분무제는 수용자의 구강 및 기도 점막을 자극하지 않고, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 미세한 입자로서 분산시켜, 흡수를 용이하게 하는 담체 등을 이용하여 제조한다. 담체로서는, 예컨대 젖당 또는 글리세린 등을 이용한다. 또한, 에어로졸 또는 건조 분말로서 제조할 수도 있다.
또한, 상기 비경구제에 있어서도, 경구 투여에 적당한 제제로 첨가제로서 예시한 성분을 첨가할 수도 있다.
5. 본 발명의 항ASCT2 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 이용한 질환의 진단 방법
본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 이용하여, ASCT2 또는 ASCT2가 발현된 세포를 검출 또는 측정함으로써, ASCT2가 관련되는 질환을 진단할 수 있다.
ASCT2가 관련되는 질환 중 하나인 암의 진단은, 예컨대 이하와 같이 ASCT2를 검출 또는 측정하여 행할 수 있다.
우선, 복수의 건강한 사람의 생체로부터 채취한 생체 시료에 대해서, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편, 또는 이들의 유도체를 이용하고, 하기의 면역학적 방법을 이용하여, ASCT2의 검출 또는 측정을 행하여, 건강한 사람의 생체 시료 중 ASCT2의 존재량을 조사한다. 다음에, 피험자의 생체 시료 중에 대해서도 마찬가지로 ASCT2의 존재량을 조사하여, 그 존재량을 건강한 사람의 존재량과 비교한다. 피험자의 상기 폴리펩티드의 존재량이 건강한 사람과 비교하여 증가하고 있는 경우에는, 암이 양성인 것으로 진단된다.
면역학적 방법이란, 표지를 실시한 항원 또는 항체를 이용하여, 항체량 또는 항원량을 검출 또는 측정하는 방법이다. 예컨대 방사성 물질 표지 면역 항체법, 효소 면역 측정법, 형광 면역 측정법, 발광 면역 측정법, 웨스턴 블롯법 또는 물리화학적 방법 등을 이용한다.
방사성 물질 표지 면역 항체법은, 예컨대 항원 또는 항원을 발현한 세포 등에, 본 발명의 항체 또는 그 항체 단편을 반응시키고, 방사선 표지를 실시한 항면역글로불린 항체 또는 결합 단편을 더 반응시킨 후, 신틸레이션 카운터 등으로 측정한다.
효소 면역 측정법은, 예컨대 항원 또는 항원을 발현한 세포 등에, 본 발명의 항체 또는 그 항체 단편을 반응시키고, 표지를 실시한 항면역글로불린 항체 또는 결합 단편을 더 반응시킨 후, 발색 색소를 흡광광도계로 측정한다. 예컨대 샌드위치 ELISA법 등을 이용한다. 효소 면역 측정법에서 이용하는 표지체로서는, 공지[효소 면역 측정법, 이가쿠 서원(1987)]의 효소 표지를 이용할 수 있다. 예컨대 알칼리포스파타제 표지, 퍼옥시다제 표지, 루시퍼라제 표지, 또는 비오틴 표지 등을 이용한다. 샌드위치 ELISA법은, 고상으로 항체를 결합시킨 후, 검출 또는 측정 대상인 항원을 트랩시켜, 트랩된 항원에 제2 항체를 반응시키는 방법이다. 상기 ELISA법으로서는, 검출 또는 측정하고자 하는 항원을 인식하는 항체 또는 항체 단편으로서, 항원 인식 부위의 상이한 2종류의 항체를 준비하여, 그 중, 제1 항체 또는 항체 단편을 미리 플레이트(예컨대 96웰 플레이트)에 흡착시키고, 다음에 제2 항체 또는 항체 단편을 FITC 등의 형광 물질, 퍼옥시다제 등의 효소, 또는 비오틴 등으로 표지해 둔다. 상기한 항체가 흡착된 플레이트에, 생체내에서 분리된, 세포 또는 그 파쇄액, 조직 또는 그 파쇄액, 세포 배양 상청, 혈청, 흉수, 복수, 또는 안액 등을 반응시킨 후, 표지한 모노클로날 항체 또는 항체 단편을 반응시켜, 표지 물질에 따른 검출 반응을 행한다. 농도 기지의 항원을 단계적으로 희석하여 제작한 검량선으로부터, 피검 샘플 중 항원 농도를 산출한다. 샌드위치 ELISA법에 이용하는 항체로서는, 폴리클로날 항체 또는 모노클로날 항체 중 어느 것을 이용하여도 좋고, Fab, Fab', 또는 F(ab)2 등의 항체 단편을 이용하여도 좋다. 샌드위치 ELISA법으로 이용하는 2종류의 항체의 조합으로서는, 상이한 에피토프를 인식하는 모노클로날 항체 또는 항체 단편의 조합이어도 좋고, 폴리클로날 항체와 모노클로날 항체 또는 항체 단편과의 조합이어도 좋다.
형광 면역 측정법은, 문헌[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996), 단클론항체 실험 메뉴얼, 고단사 사이언티픽(1987)] 등에 기재된 방법으로 측정한다. 형광 면역 측정법에서 이용하는 표지체로서는, 공지[형광항체법, 소프트 사이언스사(1983)]의 형광 표지를 이용할 수 있다. 예컨대 FITC, 또는 RITC 등을 이용한다.
발광 면역 측정법은 문헌[생물발광과 화학발광 임상검사42, 히로카와 서점(1998)] 등에 기재된 방법으로 측정한다. 발광 면역 측정법에서 이용하는 표지체로서는, 공지의 발광체 표지를 들 수 있고, 아크리디늄에스테르, 또는 로핀 등을 이용한다.
웨스턴 블롯법은, 항원 또는 항원을 발현한 세포 등을 SDS(도데실황산나트륨)-PAGE[Antibodies-A Laboratory Manual Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]로 분획한 후, 해당 겔을 폴리불화비닐리덴(PVDF) 막 또는 니트로셀룰로스 막에 블로팅하고, 이 막에 항원을 인식하는 항체 또는 항체 단편을 반응시키며, FITC 등의 형광 물질, 퍼옥시다제 등의 효소 표지, 또는 비오틴 표지 등을 실시한 항마우스 IgG 항체 또는 결합 단편을 더 반응시킨 후, 상기 표지를 가시화함으로써 측정한다. 일례를 이하에 나타낸다. 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 발현하고 있는 세포나 조직을 용해하고, 환원 조건 하에서 레인당 단백질량으로서 0.1 ㎍∼30 ㎍을 SDS-PAGE법에 의해 영동한다. 영동된 단백질을 PVDF 막에 트랜스퍼하여 1%∼10% BSA를 포함하는 PBS(이하, BSA-PBS로 표기함)에 실온에서 30분 동안 반응시켜 블로킹 조작을 행한다. 여기서 본 발명의 모노클로날 항체를 반응시켜, 0.05%∼0.1%의 Tween-20을 포함하는 PBS(이하, Tween-PBS로 표기함)로 세정하고, 퍼옥시다제 표지한 염소 항마우스 IgG를 실온에서 2시간 반응시킨다. Tween-PBS로 세정하고, ECL Western Blotting Detection Reagents(아머샴사 제조) 등을 이용하여 모노클로날 항체가 결합된 밴드를 검출함으로써, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드를 검출한다. 웨스턴 블로팅에서의 검출에 이용되는 항체로서는, 천연형의 입체 구조를 유지하지 않는 폴리펩티드에 결합할 수 있는 항체가 이용된다.
물리화학적 방법은, 예컨대 항원인 ASCT2와 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 결합시킴으로써 응집체를 형성시키고, 이 응집체를 검출함으로써 행한다. 이 외에 물리화학적 방법으로서 모세관법, 1차원 면역확산법, 면역비탁법 또는 라텍스 면역비탁법[임상검사법제요, 카네하라출판(1998)] 등을 이용할 수도 있다. 라텍스 면역비탁법은, 항체 또는 항원을 감작시킨 입경 0.1 ㎛∼1 ㎛ 정도의 폴리스티렌라텍스 등의 담체를 이용하여, 대응하는 항원 또는 항체에 의해 항원 항체 반응을 일으키면, 반응액중 산란광은 증가하고, 투과광은 감소한다. 이 변화를 흡광도 또는 적분구 탁도로서 검출하는 것에 의해 피검 샘플 중 항원 농도 등을 측정한다.
한편, ASCT2가 발현되고 있는 세포의 검출 또는 측정은, 공지의 면역학적 검출법을 이용할 수 있지만, 바람직하게는 면역침강법, 면역 세포 염색법, 면역 조직 염색법 또는 형광 항체 염색법 등을 이용한다.
면역침강법은, ASCT2를 발현한 세포 등을 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편과 반응시킨 후, 프로테인 G-세파로스 등의 면역글로불린에 특이적인 결합능을 갖는 담체를 가하여 항원 항체 복합체를 침강시킨다. 또는 이하와 같은 방법에 의해서도 행할 수 있다. ELISA용 96웰 플레이트에 전술한 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편을 고상화한 후, BSA-PBS에 의해 블로킹한다. 항체가, 예컨대 하이브리도마 배양 상청 등의 정제되어 있지 않은 상태인 경우에는, 항마우스 면역글로불린, 항래트 면역글로불린, 프로테인-A 또는 프로테인-G 등을 미리 ELISA용 96웰 플레이트에 고상화하고, BSA-PBS로 블로킹한 후, 하이브리도마 배양 상청을 분주하여 결합시킨다. 다음에, BSA-PBS를 버리고 PBS로 잘 세정한 후, ASCT2를 발현하고 있는 세포나 조직의 용해액을 반응시킨다. 잘 세정한 후의 플레이트로부터 면역침강물을 SDS-PAGE용 샘플 버퍼로 추출하고, 상기한 웨스턴 블로팅에 의해 검출한다.
면역 세포 염색법 또는 면역 조직 염색법은, 항원을 발현한 세포 또는 조직 등을, 경우에 따라서는 항체의 통과성을 좋게 하기 위해 계면활성제나 메탄올 등으로 처리한 후, 본 발명의 모노클로날 항체와 반응시키고, FITC 등의 형광 표지, 퍼옥시다제 등의 효소 표지 또는 비오틴 표지 등을 실시한 항면역글로불린 항체 또는 그 결합 단편과 더 반응시킨 후, 상기 표지를 가시화하여, 현미경으로 관찰하는 방법이다. 또한, 형광 표지의 항체와 세포를 반응시켜, 유세포 분석기로 해석하는 형광 항체 염색법[Monoclonal Antibodies-Principles and practice, Third edition, Academic Press(1996), 단클론항체 실험 메뉴얼, 고단사 사이언티픽(1987)]에 의해 검출을 행할 수 있다. 특히, ASCT2의 세포외 영역에 결합하는, 본 발명의 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편은, 형광 항체 염색법에 의해 천연형의 입체 구조를 유지하여 발현하고 있는 세포를 검출할 수 있다.
또한, 형광 항체 염색법 중, FMAT8100HTS 시스템(어플라이드바이오시스템사 제조) 등을 이용한 경우에는, 형성된 항체 항원 복합체와, 항체 항원 복합체의 형성에 관여하지 않는 유리 항체 또는 항원을 분리하지 않고, 항원량 또는 항체량을 측정할 수 있다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 구체적으로 설명하지만, 본 발명은 하기 실시예에 한정되는 것이 아니다.
실시예 1
각종 세포주, 이종이식편 및 정상 조직에 있어서의 ASCT2 유전자의 발현 해석
(1) SCID 마우스에게 피하 이식한 이종이식편의 제작과 종양 덩어리의 조제
이하에 나타낸 방법에 의해, 인간 암 세포주를 SCID 마우스에게 피하 이식하고, 이종이식편을 제작하였다. 얻어진 상기 이종이식편으로부터 종양 덩어리를 적출하여 조제하였다.
인간 췌장암 세포주[ASPC-1(ATCC 번호: CRL-1682), CaPan-1(ATCC 번호: HTB-79), PANC-1(ATCC 번호: CRL-1469)], 인간 대장암 세포주[Colo205(리켄 셀 뱅크 번호: RCB2127), HT-29(ATCC 번호: HTB-38), LS180(ATCC 번호: CCL-187), SW1116(ATCC 번호: CCL-233), WiDr(ATCC 번호: CCL-218)] 유래의 세포를 약 1×108개/mL의 농도가 되도록 PBS에 현탁하고, 각각의 세포 현탁액 100 μL를 Fox CHASE C.B-17/Icr-scidJcl 마우스(수컷, 5주령, 일본구레아사 제조) 4마리씩의 배 측부 피하에 이식하였다.
각 세포는 10%의 비동화 소태아 혈청(인비트로젠사 제조)을 포함하는 RPMI 1640 배지(인비트로젠사 제조)에 현탁하고 계대 배양한 것을 이용하고, 배양은 37℃ CO2 인큐베이터 내에서 행하였다.
얻어진 이종이식편은, 각각 xASPC1, xCaPan1, xPANC1, xColo205, xHT29, xLS180, xSW1116, xWiDr로 하였다.
종양 이식 후, 경일적으로 노기스에 의한 종양 직경을 측정하여, 직경이 1 ㎝ 정도에 도달한 개체를 순차 마취하에서 실혈사시킨 후에, 종양 덩어리를 적출하였다. 각 종양 덩어리는 4개로 절단한 후, 액체 질소를 이용하여 급속 동결하고, -80℃ 냉동고 내에서 보존하였다.
(2) 전체 RNA의 추출과 폴리 A(+) RNA의 정제
세포주 및 (1)에서 제작한 이종이식편의 종양 덩어리로부터, 이하에 나타낸 방법에 의해 전체 RNA를 추출하여, 폴리 A(+) RNA를 정제하였다.
세포주로서는, 혈액암 유래 세포주{KG-1(ATCC 번호: CCL-246), THP-1(ATCC 번호: TIB-202), HL-60(ATCC 번호: CCL-240)[이상, 급성 골수성 백혈병(AML) 유래 세포주], CCRF-CEM(ATCC 번호: CCL-119), CCRF-SB(ATCC 번호: CCL-120), Jurkat(ATCC 번호: TIB-152), HSB-2(ATCC 번호: CCL-120), HPB-ALL(리켄 셀 뱅크 번호: RCB1935)[이상, 급성 림프성 백혈병(ALL) 유래 세포주], K-562(ATCC 번호: CCL-243), KU812(ATCC 번호: CRL-2099)[이상, 만성 골수성 백혈병(CML) 유래 세포주], KMS-11(HSRRB 번호: JCRB1179), ARH-77(ATCC 번호: CRL-1621), IM-9(ATCC 번호: CCL-159), RPMI8226(HSRRB 번호: JCRB0034), U266B1(ATCC 번호: TIB-196), MC/CAR(ATCC 번호: CRL-8083)[이상, 다발성 골수종(MM) 유래 세포주], HS-Sultan(ATCC 번호: CRL-1484), Daudi(ATCC 번호: CCL-213), Raji(ATCC 번호: CCL-86), Ramos(ATCC 번호: CRL-1596)[이상, 버킷 림프종(BL) 유래 세포주], U-937(ATCC 번호: CRL-1593.2), ML-1(DSMZ 번호; ACC464)[이상, 조직구성 림프종(HS) 유래 세포주]}, 폐암 유래 세포주[PC-14(리켄 셀 뱅크 번호: RCB0446), PC-7(면역생물연구소사 제품번호: 37011), PC-9(면역생물연구소사 제품번호: 37012), PC-1(면역생물연구소사 제품번호: 37008)(이상, 비소세포 폐암), Lu-139(리켄 셀 뱅크 번호: RCB0469), NCI-H69(ATCC 번호: HTB-119), RERF-LC-MA(HSRRB 번호: JCRB0812), SBC-5(HSRRB 번호: JCRB0819)(이상, 소세포 폐암)], 위암 유래 세포주[Kato III(리켄 셀 뱅크 번호: RCB2088), MKN-74(HSRRB 번호: JCRB0255), NUGC-4(리켄 셀 뱅크 번호: RCB1939), AZ-521(HSRRB 번호: JCRB0061)], 대장암 유래 세포주{Colo205(리켄 셀 뱅크 번호: RCB2127), HT-29(ATCC 번호: HTB-38), LS174T[European Collection of Cell Cultures(ECACC) 번호: 87060401], LS180(ATCC 번호: CCL187), SW1116(ATCC 번호: CCL-233)}, 췌장암 유래 세포주[ASPC-1(ATCC 번호: CRL-1682), BXPC-3(ATCC 번호: CRL-1687), CaPan-1(ATCC 번호: HTB-79)], 악성 흑색종(멜라노마) 유래 세포주[G-361(ATCC 번호: CRL-1424), HMV-1(리켄 셀 뱅크 번호: RCB0004), SK-MEL-28(ATCC 번호: HTB-72)], 정상 폐 유래 섬유아세포[MRC-5(ATCC 번호: CCL-171)]를 이용하였다.
세포주로부터의 전체 RNA의 추출은 이하와 같이 하여 행하였다. 접착계 세포주의 경우에는, 흡인기를 이용하여 배지를 제거하고, 적당량의 PBS로 세정한 후, 실리콘제의 주걱을 사용하여 세포를 회수하였다. 이것에 배양 플레이트 10 ㎝2분의 세포당 1 mL의 TRIzol Reagent(인비트로젠사 제조)를 첨가하고, 충분히 현탁하여 세포를 파쇄하였다. 또한, 얻어진 세포 파쇄액을 18G 주사바늘에 10회 통과시켜, 게놈 DNA를 촌단하였다. 부유계 세포주의 경우에는, 냉각 원심기(히타치공기사 제조, Himac CF15R, 로터: T11A21)를 이용하여 1500 rpm으로 5분 동안 원심분리하고, 디캔테이션(decantation)에 의해 배지를 제거한 후, 세포를 PBS에 현탁하며, 재차 냉각 원심기(히타치공기사 제조, Himac CF15R, 로터: T11A21)를 이용하여 1500 rpm으로 5분 동안 원심분리하여 세포를 회수하였다. 얻어진 세포에, 1×107개의 세포당 1 mL의 TRIzol Reagent(인비트로젠사 제조)를 가하고, 충분히 현탁하여 세포를 파쇄하였다. 또한, 얻어진 세포 파쇄액을 18G 주사바늘에 10회 통과시켜, 게놈 DNA를 촌단하였다.
(1)에서 조제한 이종이식편의 종양 덩어리의 파쇄 및 전체 RNA 추출은 이하와 같이 하여 행하였다. 동결한 종양 덩어리를 TRIzol Reagent(인비트로젠사 제조) 10 mL에 투입하고, 즉시 폴리트론 호모게나이저(키네마티카사 제조, PT2100)를 이용하여 30000 rpm으로 15초 동안 파쇄하였다. 얻어진 세포 파쇄액을, 냉각 원심기(히타치공기사 제조, Himac CF15R, 로터: T11A21)를 이용하여 11000 rpm으로 10분 동안 원심분리하여, 침전을 취하지 않도록 주의하면서, 상청을 새로운 튜브에 옮겼다. 얻어진 상청에 클로로포름 2 mL를 가하여, 15초 동안 세게 진탕하고, 실온에서 2∼3분 동안 정치 후, 냉각 원심기(히타치공기사 제조, Himac CF7D2, 로터: RT3S3)로써 4℃, 3000 rpm으로 90분 동안 원심분리하였다. 상청을 새로운 튜브에 옮기고, 이소프로판올 5 mL를 가하여, 서서히 혼합하며, 실온에서 10분 동안 정치 후, 냉각 원심기(히타치공기사 제조, Himac CF15R, 로터: T11A21)로써 11000 rpm으로 10분 동안 원심분리하고, 상청을 제거한 후, 75% 에탄올 수용액 10 mL를 가하여 혼합하며, 추가로, 냉각 원심기(히타치공기사 제조, Himac CF15R, 로터: T11A21)로써 11000 rpm으로 5분 동안 원심하여 침전을 얻었다. 얻어진 침전을 적당량의 RNase 불포함 수에 용해하여, 전체 RNA 샘플로 하였다. 전체 RNA 샘플은 흡광광도계로써 농도를 측정하고, A260/A280의 비가 1.7 이상이 되어 있는 것을 확인하였다. A260/A280의 비가 1.7 미만인 경우에는, RNeasy kit(퀴아젠사 제조)를 이용하여 정제를 더 행하였다.
얻어진 전체 RNA 샘플 400 ㎍을, MicroPoly(A) Pure Kit(암비온사 제조)를 이용하여, 첨부 설명서에 따라, 폴리 A(+) RNA를 정제하였다.
(3) cDNA의 합성
(2)에서 얻어진 폴리 A(+) RNA 또는 시판되는 조직 유래의 mRNA로부터, SuperScript First-Strand Synthesis System for RT-PCR(인비트로젠사 제조)을 이용하여, cDNA를 합성하였다.
인간의 정상 조직(간장, 폐, 전뇌, 심장, 위, 비장, 척수, 소장, 골격근, 자궁, 기도, 갑상선, 흉선, 고환, 타액선, 전립선, 태반, 림프절, 췌장, 대장, 혈액, 또는 신장) 유래의 mRNA는 시판되는 mRNA(클론테크사 제조)를 사용하였다. 또한, 인간의 임상암 조직(폐암, 위암, 대장암, 신장암, 간장암, 자궁암, 유방암, 또는 식도암) 유래의 mRNA도 시판되는 RNA(바이오체인사 제조)를 사용하였다.
(2)에서 얻어진 폴리 A(+) RNA 또는 시판되는 조직 유래의 mRNA(1 ㎍)에 대하여 dNTP 혼합 용액(10 ㎜ol/L, 1 μL), 및 Oligo(dT)12-18(0.5 ㎍/μL, 1 μL)를 첨가하고, DEPC수를 가하여 전량을 7 μL로 하였다. 65℃에서 5분 동안 가열 변성 후, 빙상에서 급냉하고, 1분 이상 정치한 후, 10×RT 버퍼(2 μL), 염화마그네슘(25 ㎜ol/L, 4 μL), DTT(0.1 mol/L, 2 μL), 및 RNaseOUT 재조합 리보뉴클레아제 억제제(1 μL)를 첨가하여, 42℃에서 2분 동안 보온하였다. 또한, SuperscriptII RT(1 μL)를 가하여, 42℃, 50분 동안의 역전사 반응을 행하고, 계속해서 70℃, 15분 동안 가열하여 효소를 실활시켰다. 이후, 반응액에 이. 콜라이 RNase H(1 μL)를 가하여, 37℃, 20분 동안 반응한 후, DEPC수를 가하여 전량을 1 mL로 하였다.
이하, 실시간 PCR의 반응계에는, 이것을 추가로 5배 희석한 용액 10 μL를 이용하였다.
(4) 실시간 PCR법(정량 PCR법, Q-PCR법)에 의한 세포주, 이종이식편의 종양 덩어리 및 정상 조직에서의 ASCT2 유전자의 mRNA 발현량의 정량
(3)에서 얻어진 cDNA 10 μL[폴리 A(+) RNA량으로서 2 ng에 상당]에, 서열 번호 1로부터 설계한 서열 번호 3으로 표시되는 서열로 이루어지는 ASCT2 유전자의 cDNA 검출용 정방향 프라이머(Fw#1) 및 서열 번호 4로 표시되는 서열로 이루어지는 ASCT2 유전자의 cDNA 검출용 역방향 프라이머(Rv#1)(모두 프롤리고사 제조)를 각각 종농도가 300 ㎚ol/L가 되도록 가하고, 10×R-PCR 버퍼(Mg2+ 불포함)(다카라바이오사 제조, 2 μL), Mg2+ 용액(250 ㎜ol/L, 0.2 μL), dNTP 혼합물(10 ㎜ol/L, 0.6 μL), Ex Taq R-PCR(이상 다카라바이오사 제조, 0.2 μL), 및 SYBR Green I(BMA사 제조, 제품 원액을 2500배 희석한 것, 1 μL)를 더 첨가하며, DEPC수를 가하여 전량을 20 μL로 하였다.
PCR 반응은, 최초에 94℃에서 5분에 걸쳐 Taq DNA 폴리머라제를 활성화 및 주형 DNA를 변성하고, 이후, 94℃에서 30초 동안의 변성 공정, 65℃에서 30초 동안의 어닐링 공정, 이어서 72℃에서 30초 동안의 DNA 신장 반응 공정의 3 공정을 1 사이클로 하고, 이것을 총 45 사이클 행하는 것에 의해 실시하였다. 증폭 산물에 개재한 SYBR Green I이 발하는 형광 강도를 PRISM7700(어플라이드바이오시스템사 제조)을 이용하여 측정하고, 상기 PRISM7700 부속의 소프트웨어인 Sequence detector ver. 1.7a에 의해 데이터 분석을 행하였다. 실시간 PCR 반응에 의해 얻어진 시그널이 원하는 증폭 단편인지의 여부는, 반응 종료 후의 반응액을 아가로스 겔 전기영동에 제공하고, 주된 증폭 단편의 사이즈에 의해 판단하였다. 또한, 상기 실시간 PCR 반응은, 96웰의 PCR 플레이트를 이용하여 행하였다. PCR 플레이트의 각 웰의 검체에는, 상기 cDNA를 포함하는 반응액 외, 음성 컨트롤(멸균수), 및 Qiagen Plasmid Midi Kit(퀴아젠사 제조)로 정제한 ASCT2의 부분 단편을 코드하는 플라스미드 HCHON2001712[Homo sapiens cDNA FLJ43232 fis, 일본 DNA 데이터 뱅크(DDBJ) 수탁 번호: AK125222]를 이용하여 제작한 검량선 제작용 표본(1×10∼1×106 카피/웰)을 배치하여 행하였다.
ASCT2의 표준 서열인 NM_005628(서열 번호 1, GenBank 수탁 번호: NM_005628)과 검량선 제작용 주형으로서 이용한 플라스미드 HCHON2001712의 전장 서열의 검출 방법을 도 1 (a)∼(d)에 도시하였다. NM_005628과 HCHON2001712의 전장 서열 사이에는 상위 개소가 있지만, ASCT2의 발현량 측정에 이용한 서열 번호 3으로 표시되는 서열로 이루어지는 cDNA 검출용 정방향 프라이머(Fw#1) 및 서열 번호 4로 표시되는 서열로 이루어지는 cDNA 검출용 역방향 프라이머(Rv#1)는, 모두 NM_005628과 HCHON2001712의 서열이 완전히 일치하는 부분을 이용하여 설계하였다.
이와 같이 하여 얻어진 세포주, 이종이식편의 종양 덩어리 및 정상 조직에 있어서의 ASCT2 유전자의 mRNA 발현량의 결과를 도 2 (a)∼(b)에 도시하였다. mRNA 발현량은, 폴리 A(+) RNA 2 ng당 ASCT2 발현 분자수, 및 정상 조직에서 가장 발현이 높았던 기도에서의 ASCT2 유전자 발현량을 1로 한 경우의 상대비로 나타내었다. 혈액암 유래 세포주의 KG-1(AML 유래 세포주), HSB-2(ALL 유래 세포주), K-562(CML 유래 세포주), KMS-11, ARH-77(이상, MM 유래 세포주)에서 정상 기도의 10배 이상, Jurkat(ALL 유래 세포주), IM-9, RPMI8226(이상, MM 유래 세포주), HS-Sultan(BL 유래 세포주), ML-1(HL 유래 세포주)에서 5배 이상, THP-1(AML 유래 세포주), CCRF-CEM(ALL 유래 세포주), KU812(CML 유래 세포주), Raji(BL 유래 세포주), U-937(HS 유래 세포주) 및 위암 조직, 식도암 조직에서 2배 이상의 발현 항진이 확인되었다.
실시예 2
인간 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포주의 조성
이하에 나타낸 방법에 의해, 서열 번호 5 기재의 유전자 서열 및 서열 번호 6 기재의 아미노산 서열을 포함하는 플라스미드 pCR4-SLC1A5-myc/His를 취득하고, 이 플라스미드를 이용하여 인간 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포주를 취득하였다.
서열 번호 7∼10의 염기 서열을 갖는 프라이머(10 ㎛ol/L, 각각 1 μL)에, 10×Ex Taq 버퍼(10 μL), dNTP 혼합액(2 ㎜ol/L, 10 μL), 및 Ex Taq 폴리머라제(이상, 다카라바이오사 제조, 1 μL)를 첨가하고, 멸균수을 더 가하여 전량 100 μL로 하였다. 실시예 1 (3) 기재의 방법과 마찬가지로 하여, 96℃에서 2분 동안 반응 후, 96℃에서 1분 동안, 60℃에서 1분 동안, 및 72℃에서 1분 동안의 3 공정을 1 사이클로서, 총 35 사이클을 행하는 PCR 반응을 행하고, 인간 ASCT2 유전자의 번역 시작점의 염기를 1로 했을 때의 1위부터 370위의 유전자 서열(이하, N-SLC1A5로 표기함)을 합성하였다. 반응 산물을 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고, 얻어진 약 0.4 kb의 증폭 단편을 QIAquick 겔 추출 키트(퀴아젠사 제조)를 이용하여 추출하며, TOPO TA 클로닝 키트(인비트로젠사 제조)를 이용하여 pCR4 TOPO 벡터에 클로닝하였다(이하, pCR4-N-SLC1A5로 표기함).
다음에, 인간 ASCT2 유전자를 포함하는 플라스미드 HCHON2001712(DDBJ 수탁 번호: AK125222) 10 ng을 주형으로 하여, 서열 번호 11 및 서열 번호 12 기재의 염기 서열을 갖는 프라이머(10 ㎛ol/L, 각각 1 μL), 10×Ex Taq 버퍼(10 μL), dNTP 혼합액(2 ㎜ol/L, 10 μL), 및 Ex Taq 폴리머라제(이상, 다카라바이오사 제조, 1 μL)를 첨가하고, 멸균수를 더 가하여 전량 100 μL로 하였다. 상기와 같은 반응 조건으로 PCR 반응을 행하고, 인간 ASCT2 유전자의 365위부터 1623위의 유전자 서열의 C 말단에 myc/His가 부가된 융합 단백질을 코드하는 유전자 서열(이하, C-SLC1A5-myc/His로 표기함)을 합성하였다. 반응 산물을 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고, 얻어진 약 1.2 kb의 증폭 단편을 QIAquick 겔 추출 키트(퀴아젠사 제조)를 이용하여 추출하였다. 얻어진 추출 단편을 주형으로 하여, 서열 번호 11 및 서열 번호 13 기재의 염기 서열을 갖는 프라이머(10 ㎛ol/L, 각각 1 μL), 10×Ex Taq 버퍼(10 μL), dNTP 혼합액(2 ㎜ol/L, 10 μL), 및 Ex Taq 폴리머라제(이상, 다카라바이오사 제조, 1 μL)를 첨가하고, 멸균수를 더 가하여 전량 100 μL로 하였다. 상기와 같은 반응 조건으로 PCR 반응을 행하고, C-SLC1A5-Myc/His의 C 말단에 NotI 및 SpeI 제한 효소 사이트를 부가하였다. 얻어진 반응 산물을 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고, 얻어진 약 1.2 kb의 증폭 단편을 QIAquick 겔 추출 키트(퀴아젠사 제조)를 이용하여 추출하며, TOPO TA 클로닝 키트(인비트로젠사 제조)를 이용하여 pCR4 TOPO 벡터에 클로닝하였다(이하, pCR4-C-SLC1A5-myc/His로 표기함). 얻어진 유전자 서열은, 서열 번호 1 기재의 서열과 번역 시작점의 염기를 1로 했을 때의 1455번째의 T가 C로 치환되어 있었지만, 아미노산 변이는 확인되지 않았다.
얻어진 pCR4-N-SLC1A5를 BssHII(다카라바이오사 제조)와 SpeI(다카라바이오사 제조)으로 소화하고, 아가로스 겔 전기영동으로 분리하며, 얻어진 약 4.4 kb의 유전자 단편을 QIAquick 겔 추출 키트(퀴아젠사 제조)를 이용하여 추출하였다. 마찬가지로, 얻어진 pCR4-C-SLC1A5-myc/His를 BssHII(다카라바이오사 제조)와 SpeI(다카라바이오사 제조)으로 소화하고, 약 1.4 kb의 유전자 단편을 추출하였다. 각각의 추출 단편을 Ligation high(도요보세키사 제조)를 이용하여 연결한 후, 코엔 등의 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110(1972)]에 의해 대장균 DH5α주(도요보세키사 제조)를 형질전환하였다. 얻어진 형질전환체로부터 자동 플라스미드 추출기 PI-50(쿠라보사 제조)를 이용하여 플라스미드를 추출하고, 서열 번호 5 기재의 유전자 서열 및 서열 번호 6 기재의 아미노산 서열을 포함하는 플라스미드 pCR4-SLC1A5-myc/His를 취득하였다.
얻어진 pCR4-SLC1A5-myc/His를 EcoRI(다카라바이오사 제조)과 KpnI(다카라바이오사 제조)으로 소화하고, 상기와 마찬가지로 유전자 단편을 추출하며, 인간 ASCT2 유전자의 C 말단에 myc/His가 부가된 융합 단백질을 코드하는 유전자 서열(이하, SLC1A5-myc/His로 표기함)을 포함하는 단편을 취득하였다.
얻어진 SLC1A5-myc/His를 포함하는 단편을, 미리 EcoRI(다카라바이오사 제조)과 KpnI(다카라바이오사 제조)으로 소화한 pKANTEX93 벡터(WO97/10354)에 연결하고, 상기와 마찬가지로 하여, 대장균 DH5α주(도요보세키사 제조)를 형질전환하며, 형질전환체를 얻은 후, 플라스미드 추출 키트(퀴아젠사 제조)를 이용하여 발현 플라스미드 pKANTEX-SLC1A5-myc/His를 취득하였다.
pKANTEX-SLC1A5-myc/His는, 전기천공법[Cytotechnology, 3, 133(1990)]에 의해, 이하와 같이 하여 CHO/DG44 세포[Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 555(1986)]에 도입하였다. 세포는 10% FBS(라이프테크놀로지사 제조) 및 젠타마이신(나카라이테스크사 제조, 50 ㎍/mL)을 첨가한 IMDM 배지(인비트로젠사 제조)(이하, A3 배지로 표기함)에, 1×HT 보충제(인비트로젠사 제조)를 첨가한 배지에서 계대한 것을 이용하였다. CHO/DG44 세포를 염화칼륨(137 ㎚ol/L), 염화나트륨(2.7 ㎚ol/L), 인산일수소이나트륨(8.1 ㎜ol/L), 인산이수소일나트륨(1.5 ㎚ol/L) 및 염화마그네슘(4 ㎜ol/L)을 포함하는 완충액(이하, K-PBS로 표기함)에 현탁하여 8×106개/mL로 하고, 얻어진 세포 현탁액(200 μL, 세포수로서 1.6×106개)을 발현 플라스미드 pKANTEX-SLC1A5-myc/His(10 ㎍)와 혼화하였다. 얻어진 혼화액을 큐벳(전극간 거리 2 ㎜)에 옮기고, GenePulserII(바이오래드사 제조)를 이용하여 펄스 전압 0.35 kV, 전기 용량 250 μF의 조건으로 유전자 도입을 행하였다. 큐벳을 빙상에서 정치 후, 큐벳 중 세포 현탁액을, A3 배지를 포함하는 세포 배양용 용기에 현탁하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터 중에서 배양하였다. 4일 동안 배양 후, G418(나카라이테스크사 제조, 0.5 ㎎/mL)을 첨가한 A3 배지로 배지 교환하여, 배양을 계속하였다. 도중 배지 교환과 계대를 행하여, 유전자 도입으로부터 약 2주 후에, G418에 내성을 갖는 형질전환 세포주를 취득하였다.
얻어진 G418에 내성인 형질전환 세포를 10 mL당 5개의 세포수가 되도록 G418(나카라이테스크사 제조, 0.5 ㎎/mL)을 첨가한 A3 배지로 희석하고, 희석한 세포 현탁액을 96웰 플레이트에 100 μL씩 분주하며, 단계적으로 메토트렉세이트 농도를 상승시켜 처리함으로써, ASCT2-myc/His를 고발현하는 클론을 선택하여, 인간 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포주를 취득하였다.
얻어진 인간 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포(1×105∼5×105개)를, 70% 에탄올-PBS(1 mL)에 현탁하여 빙온 중에서 30분 동안 고정하였다. 96웰 U형 플레이트에 1×106∼5×106 세포/웰이 되도록 분주하고, 1500 rpm으로 5분 동안 원심분리한 후, 상청을 제거하여 1% BSA-PBS로 빙온 중 30분 동안 블로킹하였다. 원심분리에 의해 상청을 제거하고, 1차 항체로서 항myc 항체 PL14(의학생물학연구소 제조), 항His 항체(퀴아젠사 제조) 및 마우스 IgG1 아이소타입 컨트롤(다코사 제조)을, 최종 농도가 각각 1.0, 0.1 및 0.1 ㎍/mL가 되도록 1% BSA-PBS로 희석하고, 100 μL/웰씩 분주하며, 빙온 중에서 60분 동안 반응시켰다. 1% BSA-PBS로 1회 세정하고, 2차 항체로서 1% BSA-PBS로 50배 희석한 FITC 표지 항마우스 면역글로불린 G(H+L)(다코사 제조)를 100 μL/웰 가하여 빙온 중, 차광 하에서 30분 동안 반응시켰다. 다시 1% BSA-PBS로 1회 세정하고, PBS에 현탁하여 유세포 분석기(Cytomics FC500 MPL, 베크만 쿨터사 제조)로 형광 강도를 측정하였다. 결과를 도 3에 도시하였다. 항myc 항체 및 항His 항체에 높은 반응성이 검출되었기 때문에, 원하는 인간 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포주가 조성되어 있는 것이 확인되었다.
실시예 3
ASCT2의 N 말단 부분 펩티드에 대한 모노클로날 항체의 제작
(1) 면역원의 조제
캐리어 단백질과의 결합을 위해, 서열 번호 14 기재의 인간 ASCT2의 N 말단 부분 서열(N 말단으로부터 세어 2번째부터 16번째까지의 아미노산)의 C 말단에 Cys를 부가한 N 말단 부분 펩티드를, 자동합성기(PSSM-8, 시마즈제작소사 제조)를 이용하여 합성하였다.
면역원성을 높일 목적으로 이하의 방법으로 KLH(와코준야꾸 제조)와의 컨쥬게이트를 제작하여, 면역원으로 하였다. 즉, KLH를 PBS로 용해하여 10 ㎎/mL로 조제하고, 1/10 용량의 N-(m-말레이미드벤조일옥시)숙신이미드(MBS, 나카라이테스크사 제조, 25 ㎎/mL)를 적하한 후 30분 동안 교반하여, 반응시켰다. 반응액을 미리 PBS로 평형화한 겔 여과 컬럼(세파덱스 G-25 컬럼, DE 헬스케어사 제조)에 통과시키고, 미반응의 MBS를 제거하여, KLH-MBS를 얻었다. Cys를 부가한 인간 ASCT2의 N 말단 부분 펩티드(1 ㎎)를 인산나트륨 버퍼(0.1 mol/L, pH 7.0)에 용해하고, KLH-MBS(2.5 ㎎)를 첨가하여, 실온에서 3시간, 교반 반응시켰다. 반응 후, PBS로 투석하여, 면역원으로서의 인간 ASCT2의 N 말단 펩티드-KLH 컨쥬게이트를 얻었다.
(2) 동물의 면역과 항체 생산 세포의 조제
(1)에서 얻어진 인간 ASCT2의 N 말단 펩티드-KLH 컨쥬게이트(100 ㎍)를 알루미늄 겔(2 ㎎) 및 백일해 백신(치바현 혈청연구소 제조, 1×109 세포)과 함께 4주령 암컷 SD 래트(일본 SLC사 제조)에 투여하고, 추가로 첫회 투여 2주 후로부터 컨쥬게이트(100 ㎍)를 일주일에 1회, 총 4회 투여하였다. 꼬리 정맥으로부터 채혈하여, 인간 ASCT2 부분 펩티드에 대한 반응성을 이하에 나타내는 효소 면역 측정법으로 조사하고, 충분한 항체가를 나타낸 래트로부터 최종 면역 3일 후에 비장을 적출하였다.
비장을 MEM 배지(닛스이제약사 제조) 중에서 세단하고, 핀셋으로 풀어, 1200 rpm으로 5분 동안 원심분리(CR5B, 히타치제작소사 제조)하였다. 얻어진 침전 분획에 트리스-염화암모늄 완충액(pH 7.65)을 첨가하고, 1∼2분 동안 처리함으로써 적혈구를 제거하였다. 침전 분획으로서 얻어진 세포 분획을 MEM 배지로 3회 세정하여, 항체 생산 세포를 조제하였다.
(3) 효소 면역 측정법
어세이용의 항원으로서, 서열 번호 14 기재의 Cys을 부가한 인간 ASCT2의 N 말단 부분 펩티드를 이하의 방법으로 티로글로불린(이하, THY로 표기함)과의 컨쥬게이트를 제작하였다. 컨쥬게이트의 제작 방법은 (1)과 같지만, MBS 대신에 숙신이미딜 4-[N-말레이미드메틸]-시클로헥산-1-카복실레이트(SMCC, 시그마사)를 이용하였다.
96웰의 ELISA용 플레이트(그레이너사 제조)에, 얻어진 인간 ASCT2의 N 말단 펩티드-THY 컨쥬게이트(10 ㎍/mL, 50 μL/웰)를 분주하고, 4℃에서 밤새 방치하여 흡착시켰다. 미흡착 컨쥬게이트를 세정한 후, 1% BSA-PBS(100 μL/웰)를 가하여, 실온 1시간 반응시키고, 남아 있는 활성 기를 블로킹하였다. 미반응의 BSA-PBS를 세정한 후, 1차 항체로서 항혈청 또는 배양 상청 등의 피검 물질을 50 μL/웰 분주하여 2시간 반응시켰다. 0.05% tween-PBS로 세정 후, 2차 항체로서 희석한 퍼옥시다제 표지 항래트 면역글로불린(다코사, 50 μL/웰)을 가하여, 실온에서 1시간 반응시켰다. 0.05% tween-PBS로 세정 후, 2,2-아지노비스(3-에틸벤조티아졸린-6-술폰산)암모늄(ABTS) 기질액[ABTS(와꼬준야꾸 제조, 1 ㎜ol/L), 시트르산 버퍼(0.1 mol/L, pH 4.2), 과산화수소(0.1%)]을 가하고 발색시켜, 샘플 파장 415 ㎚, 레퍼런스 파장 490 ㎚에서의 흡광도(OD415-OD490)를 플레이트 리더(Emax microplate reader, 몰리큘러 디바이스사)를 이용하여 측정하였다.
(4) 마우스 골수종 세포의 조제
8-아자구아닌 내성 마우스 골수종 세포주 P3-U1[P3X63Ag8U.1, ATCC 번호: CRL-1597, European Journal of I㎜unology, 6, 511(1976)]을, RPMI 1640 배지(인비트로젠사 제조)에 글루타민(1.5 ㎜ol/L), 2-머캅토에탄올(5×10-5 mol/L), 젠타마이신(10 ㎍/ml) 및 FBS(10%)를 첨가한 배지(이하, 정상 배지로 표기함)에서 배양하여, 세포 융합 시에 필요한 세포수(2×107개 이상)를 확보하고, 세포 융합에 친주로서 제공하였다.
(5) 하이브리도마의 제작
(2)에서 얻어진 항체 생산 세포와 (4)에서 얻어진 골수종 세포를 10:1이 되도록 혼합하여, 1200 rpm으로 5분 동안 원심분리(CR5B, 히타치제작소사 제조)한 후, 상청을 버리고, 침전한 세포군을 잘 푼 후, 교반하면서 37℃에서 PEG-1000(1 g), MEM 배지(인비트로젠사 제조, 1 mL) 및 디메틸설폭시드(0.35 mL)의 혼액을 1×108개의 항체 생산 세포당 0.5 mL 가하며, 상기 현탁액에 1∼2분간마다 MEM 배지(1 mL)를 수회 가한 후, MEM 배지를 가하여 전량이 50 mL가 되도록 하였다. 900 rpm, 5분 동안의 원심분리(CR5B, 히타치제작소사 제조) 후, 상청을 버리고, 느슨하게 세포를 푼 후, 메스피펫에 의한 흡입, 흡출로 느슨하게 세포를, 정상 배지에 HAT 배지 보충제(인비트로젠사 제조)를 첨가한 배지(이하, HAT 배지로 표기함, 100 mL) 중에 현탁하였다.
얻어진 현탁액을 96웰 배양용 플레이트에 200 μL/웰씩 분주하여, 5% CO2 인큐베이터 중, 37℃에서 10∼14일 동안 배양하였다.
배양 후의 배양 상청을 이용하여 (3)에 기재된 효소 면역 측정을 행하고, 인간 ASCT2의 N 말단 부분 펩티드에 특이적으로 반응하는 웰을 선택하였다. 선택한 웰에 포함되는 세포로부터 한계 희석법에 의한 클로닝을 2회 반복하여, ASCT2의 N 말단 부분 펩티드에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 KM3842를 취득하였다. KM3842의 항체 클래스는 서브클래스 타이핑 키트(ABD 셀로테크사 제조)를 이용하여 행하고, 래트 IgG2a로 결정되었다.
(6) 정제 모노클로날 항체의 취득
프리스탄 처리한 8주령 누드 암컷 마우스(Balb/c, 일본 SLC사 제조)에 (5)에서 얻어진 하이브리도마(5×106∼20×106개/마리)를 각각 복강내에 주사하였다. 10∼21일 후에, 하이브리도마는 복수암화되었다. 복수가 찬 마우스로부터, 복수(1∼8 mL/마리)를 채취하고, 3000 rpm으로 5분 동안 원심분리(CR5B, 히타치제작소사 제조)하여 고형분을 제거한 후, 카프릴산 침전법[Antibodies-A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]에 의해 정제하고, KM3842 정제 항체를 취득하였다.
실시예 4
ASCT2의 N 말단 부분 펩티드에 대한 모노클로날 정제 항체의 반응성 검토
ASCT2의 N 말단 부분 펩티드에 대한 모노클로날 항체 KM3842의 반응성을 실시예 3 (3)에 기재된 효소 면역 측정법에 의해 검토하였다. 1차 항체로서, 실시예 3 (6)에서 얻어진 KM3842 정제 항체를 1% BSA-PBS로 10, 1, 0.1, 0.01, 0.001, 및 0.0001 ㎍/mL로 각각 희석한 것을 이용하였다. 측정 결과, 도 4에 도시하는 바와 같이, KM3842는 ASCT2의 N 말단 부분 펩티드에 대하여, 특이적인 반응성을 나타내었다.
실시예 5
ASCT2의 세포외 영역에 대한 모노클로날 항체의 제작
(1) 면역원의 조제
실시예 2에서 얻어진 인간 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포주를 10% FBS 함유 IMDM 배지(인비트로젠사)에서 2∼3일 배양하고, 0.02% 에틸렌디아민사초산(EDTA) 용액(나카라이테스크사 제조)을 이용하여 박리하였다. 면역 동물 1마리당 6×106∼1×107개의 세포수가 되도록 PBS에 현탁하였다.
(2) 동물의 면역과 항체 생산 세포의 조제
(1)에서 얻어진 세포 현탁액을 백일해 백신(치바현 혈청연구소 제조, 1×109 세포)과 함께, 6주령 수컷 BXSB 마우스(일본 SLC사 제조, 3마리/1군) 또는 4주령 암컷 SD 래트(일본 SLC사 제조, 3마리/1군)에 투여하였다. 투여 1주 후로부터, 매주 1회, 총 4회 투여하고, 투여 후, 상기 마우스의 안저 또는 상기 래트의 꼬리 정맥으로부터 부분 채혈하였다. 그 혈청 항체가를 이하에 나타내는 세포 기반 어세이 시스템(ABI 8200 셀룰러 디텍션 시스템, 어플라이드바이오시스템사 제조) 또는 유세포 분석기(Cytomics FC500 MPL, 베크만 쿨터사 제조)를 이용한 형광 세포 염색법에 의해 측정하고, 충분한 항체가를 나타낸 마우스 또는 래트로부터 최종 면역 3일 후에 비장을 적출하였다.
실시예 3 (2)와 마찬가지로, 얻어진 비장으로부터 항체 생산 세포를 조제하였다.
(3) 형광 세포 염색법-1(세포 기반 어세이 시스템)
어세이용 세포에는, 실시예 2에서 얻어진 ACST2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포주와 벡터 도입 CHO 세포를 이용하였다. 각각의 세포를 10% FBS 함유 IMDM 배지(인비트로젠사 제조)에서 2∼3일 배양하고, 트립신-EDTA 용액(인비트로젠사 제조)으로 박리한 세포를 IMDM 배지에 현탁하며, ABI 8200용 흑색 96웰 플레이트에 1웰당 1×104개의 세포(100 μL)를 파종하여, 밤새 배양하였다. 상기 플레이트에 1차 항체로서 항혈청 또는 배양 상청 등의 피검 물질(10 μL/웰)을 분주하고, 2차 항체로서, ALEXA647 표지 항마우스 면역글로불린 G(H+L) 또는 ALEXA647 표지 항래트 면역글로불린 G(H+L)(모두 인비트로젠사 제조, 100 μL/웰)을 가하여 차광 하에서 4시간 방치하였다. 레이저광(633 ㎚He/Ne)으로 여기된 650 ㎚∼685 ㎚의 형광을 ABI 8200 세포 검출 시스템(어플라이드바이오시스템사 제조)을 이용하여 측정하였다.
(4) 형광 세포 염색법-2(유세포 분석법)
어세이용 세포에는, 실시예 2에서 얻어진 인간 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포주와 벡터 도입 CHO 세포주를 이용하였다. 각각의 세포를 10% FBS 함유 IMDM 배지(인비트로젠사 제조)에서 2∼3일 배양하고, 0.02% EDTA 용액(나카라이테스크사 제조)으로 박리한 세포를 PBS로 세정하며, 항체의 비특이적인 흡착을 피하기 위해 1% BSA-PBS를 이용하여 빙온 중 20분 동안 더 블로킹하였다. 96웰 U형 플레이트에 1웰당 5×105개의 세포(50 μL)를 파종하고, 1800 rpm으로 2분 동안 원심분리(05PR-22, 히타치공기사 제조)한 후, 상청을 제거하였다. 1차 항체로서 항혈청 또는 배양 상청 등의 피검 물질을 50 μL/웰로 가하고, 빙온 중에서 30분 동안 반응시켰다. PBS를 이용한 원심분리법으로 3회 세정한 후, 2차 항체로서 ALEXA488 표지 항마우스 면역글로불린 G(G+L) 또는 ALEXA488 표지 항래트 면역글로불린 G(G+L)(모두 인비트로젠사 제조, 50 μL/웰)을 가하여 빙온 중, 차광 하에서 30분 동안 반응시켰다. 다시 PBS를 이용하여 원심분리법으로 3회 세정하고, PBS에 현탁하여, 레이저광(488 ㎚Ar)으로 여기되는 510 ㎚∼530 ㎚의 형광을 유세포 분석기(Cytomics FC500 MPL, 베크만 쿨터사 제조)를 이용하여 측정하였다.
(5) 하이브리도마의 제작
실시예 3 (5)와 마찬가지로, (2)에서 얻어진 항체 생산 세포와 실시예 3 (4)에서 얻어진 골수종 세포와의 세포 융합을 행하였다.
다음에, 세포 융합에 의해 얻어진 세포를 HAT 배지에 현탁하였다. 얻어진 세포 현탁액을 96웰 배양용 플레이트에 200 μL/웰로 분주하고, 5% CO2 인큐베이터 중, 37℃에서 8∼10일 동안 배양하였다.
배양 후의 배양 상청의 반응성을 (3) 및 (4)에 기재된 형광 세포 염색법에 의해 확인하고, 인간 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포주와 반응하고, 벡터 도입 CHO 세포에 반응하지 않는 웰을 선택하였다. 선택한 웰에 포함되는 세포로부터 한계 희석법에 의한 클로닝을 2회 반복하여, ASCT2의 세포외 영역에 대한 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 KM3998, KM4000, KM4001, KM4008, KM4012 및 KM4018을 취득하였다.
얻어진 하이브리도마 중, 마우스 모노클로날 항체의 서브클래스 결정은 이하의 방법에 의해 행하였다.
96웰의 EIA용 플레이트(그레이너사 제조)에, 항마우스 면역글로불린·토끼 폴리클로날 항체(다코사, 10 ㎍/mL, 50 μL/웰)를 분주하고, 4℃에서 밤새 방치하여 흡착시켰다. 미흡착 컨쥬게이트를 세정한 후, 1% BSA-PBS(100 μL/웰)를 가하여, 실온에서 1시간 반응시키고, 남아 있는 활성 기를 블로킹하였다. 미반응의 BSA-PBS를 세정한 후, 피검 물질을 50 μL/웰 분주하여 2시간 반응시켰다. 0.05% tween-PBS로 세정 후, 2차 항체로서 희석한 서브클래스 특이적 퍼옥시다제 표지 항마우스 면역글로불린(인비트로젠사, 50 μL/웰)을 가하고, 실온에서 1시간 반응시켰다. 0.05% tween-PBS로 세정 후, 실시예 3 (3)에서 이용한 ABTS 기질액을 가하고, 발색시켜, 샘플 파장 415 ㎚, 레퍼런스 파장 490 ㎚에서의 흡광도(OD415-OD490)를 플레이트 리더(Emax microplate reader, 몰리큘러 디바이스사)를 이용하여 측정하였다. 상기 방법으로 서브클래스 결정을 할 수 없었던 마우스 모노클로날 항체는, 마우스 래트 모노클로날 아이소타이핑 키트(다이니혼스미토모제약사 제조)를 이용하여 행하였다. 또한, 래트 모노클로날 항체의 서브클래스 결정은 래트 모노클로날 아이소타이핑 키트(다이니혼스미토모제약사 제조)를 이용하여 행하였다.
각 하이브리도마의 동물종과 항체 클래스 일람을 표 1에 나타낸다.
Figure pct00001
(6) 정제 모노클로날 항체의 취득-1
KM3998의 정제 항체는, 이하의 방법에 의해 취득하였다.
프리스탄 처리한 8주령 누드 암컷 마우스(Balb/c, 일본 SLC사 제조)에 (5)에서 얻어진 하이브리도마(5×106∼20×106개/마리)를 각각 복강내에 주사하였다. 10∼21일 후에, 하이브리도마는 복수암화하였다. 복수가 찬 마우스로부터, 복수(1∼8 mL/마리)를 채취하여, 여과[폴사 제조, 5 ㎛, 폴리에테르술폰(PES) 막]에 의해 고형분을 제거한 후, 카프릴산 침전법[Antibodies-A Laboratory manual, Cold Spring Harbor Laboratory(1988)]에 의해 정제하였다.
(7) 정제 모노클로날 항체의 취득-2
KM4000, KM4001, KM4008, KM4012 또는 KM4018의 정제 항체는, 각각 이하의 방법에 의해 취득하였다.
(5)에서 얻어진 각 하이브리도마를 10% FBS 첨가 RPMI 1640에서 5% CO2 인큐베이터 중, 37℃에서 배양하였다. 세포수가 5×107 세포가 되었을 때 1200 rpm으로 5분 동안 원심분리(CR5B, 히타치제작소사 제조)를 행하여, 상청을 제거하였다. 얻어진 세포를, 5% 다이고 GF21(와코준야꾸 제조)을 첨가한 하이브리도마 SFM 배지(기부코사 제조)에 현탁하여 1×105개/mL의 세포수, 500 mL가 되도록 조제하고, 5% CO2 인큐베이터 중, 37℃에서 3일 동안 배양하였다. 얻어진 세포 현탁액을 1500 rpm으로 5분 동안 원심분리하여, 얻어진 상청을 보틀탑 필터(코닝사 제조, 0.2 ㎛, PES 막)를 이용하여 여과하였다.
KM4000, KM4001, KM4008 및 KM4012에 대해서는, 프로테인 A 결합 레진(밀리포어사 제조)을, KM4018에 대해서는 프로테인 G 결합 레진(밀리포어사 제조)을 이용하여 정제하였다. 각각의 레진을 1 mL 미니 컬럼에 패킹하고, 10 mL의 평형화 완충액을 통과시켜 평형화하였다. 평형화 완충액으로서 프로테인 A 결합 레진은 글리신(1 mol/L)-염화나트륨(0.15 mol/L)(pH 8.6)을, 프로테인 G 결합 레진은 글리신(0.5 mol/L)-PBS(pH 7.4)을 이용하였다. 여과 처리하여 얻어진 배양 상청을, 유속 약 100 mL/시간으로 컬럼에 통과시킨 후, 평형화 완충액 10 mL로 컬럼을 세정하였다. 다음에 시트르산 버퍼(0.1 mol/L, pH 3.0)를 이용하여 컬럼에 흡착되어 있는 항체를 용출하였다. 용출된 항체는, 미리 트리스(2 mol/L, pH 8.0)를 80 μL 넣어 둔 튜브에 500 μL씩 분취하였다. 각 튜브의 OD280 ㎚를, 자외 가시 분광광도계(UV-1600, 시마즈제작소사 제조)를 이용하여 측정하고, 단백질이 검출된 분획을 회수하였다. PBS에서 4℃에서 밤새 투석한 후, 여과(폴사 제조, 0.2 ㎛, PES 막)하여, OD280 ㎚로부터 항체 농도를 산출하였다[OD280 ㎚ 측정값(A)/1.4=단백질 농도(㎎/mL)].
실시예 6
ASCT2의 세포외 영역에 대한 모노클로날 정제 항체의 반응성 검토
(1) 형광 세포 염색법(유세포 분석법)
실시예 2에서 얻어진 인간 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포, 벡터 도입 CHO 세포 및 다발성 골수종 세포주 KMS-11(HSRRB 번호: JCRB1179)을 각각 5% CO2 인큐베이터 중, 37℃에서 3∼4일 동안 배양하였다. 인간 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포와 벡터 도입 CHO 세포는, 0.02% EDTA 용액(나카라이테스크사 제조)으로 박리하고, PBS, 0.02% EDTA 및 0.05% 아지드화나트륨의 혼합 용액으로 세정하였다. 추가로, 항체의 비특이적인 흡착을 피하기 위해 인간 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포와 벡터 도입 CHO 세포는, 1% BSA-PBS를 이용하고, 또한, KMS-11은 인간 IgG(시그마사, 100 ㎍/mL)를 이용하여, 빙온 중, 30분 동안 블로킹하였다. 96웰 U형 플레이트에 1웰당 1×105∼5×105개의 세포(100 μL)를 파종하고, 1500 rpm으로 5분 동안 원심분리(05 PR-22, 히타치공기사 제조)한 후, 상청을 제거하였다. 1차 항체로서 피검 물질인 정제 항체 및 래트 IgG2a-UNLB(음성 대조, 베크만 쿨터사 제조) 또는 KM511{음성 대조, 항G-CSF 유도체 항체, [Agric. Biol. Chem., 53, 1095(1989)], 마우스 IgG1}을 최종 농도가 10 ㎍/mL가 되도록 1% BSA-PBS, 0.02% EDTA 및 0.05% 아지드화나트륨의 혼합 용액(이하, 희석용 용액 A로 표기함)으로 희석하고, 100 μL/웰에 가하여, 빙온 중에서 60분 동안 반응시켰다. 희석용 용액 A로 2회 세정한 후, 2차 항체로서 희석용 용액 A로 희석한 ALEXA488 표지 항마우스 면역글로불린 G(G+L)(인비트로젠사 제조, 100 μL/웰) 또는 ALEXA488 표지 항래트 면역글로불린 G(G+L)(인비트로젠사 제조, 100 μL/웰), 또는 FITC 표지 항마우스 카파쇄 항체(서던바이오텍사 제조, 100 μL/웰) 또는 FITC 표지 항래트 카파쇄 항체(서던바이오텍사 제조, 100 μL/웰)를 가하여 빙온 중, 차광 하에서 30분 동안 반응시켰다. 다시 희석용 용액 A로 3회 세정하고, PBS에 현탁하여 유세포 분석기(Cytomics FC500 MPL, 베크만 쿨터사 제조)로 형광 강도를 측정하였다.
측정 결과를 도 5 및 도 6에 도시한다.
도 5에 도시하는 바와 같이, KM3998은 인간 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포 및 ASCT2 mRNA를 발현하고 있는 KMS-11에 강한 결합성을 나타냈지만, 벡터 도입 CHO 세포에는 전혀 결합성을 나타내지 않있다. 음성 대조 항체 래트 IgG2a-UNLB는 어느 세포에 대해서도 결합성을 나타내지 않았다. 이 결과로부터, KM3998은 ASCT2 발현 세포에 특이적인 결합성을 갖는 것이 확인되었다.
또한, 도 6에 도시하는 바와 같이, KM4000, KM4001, KM4008, KM4012 및 KM4018은 인간 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포 및 ASCT2 mRNA를 발현하고 있는 KMS-11에 강한 결합성(평균 형광 강도)을 나타냈지만, 벡터 도입 CHO 세포에는 전혀 결합성을 나타내지 않았다. 또한, 음성 대조 항체 래트 IgG2a-UNLB 및 KM511은 어느 세포에 대해서도 결합성을 나타내지 않았다. 이 결과로부터 KM4000, KM4001, KM4008, KM4012, KM4018은 ASCT2 발현 세포에 특이적인 결합성을 갖는 것이 확인되었다.
(2) 웨스턴 블로팅
실시예 2에서 얻어진 인간 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포, 벡터 도입 CHO 세포, 다발성 골수종 세포주 KMS-11(HSRRB 번호: JCRB1179) 및 대장암 세포주 WiDr(ATCC 번호: CCL-218)에, 트리스-염산(50 ㎜ol/L, pH 7.2), 1% TritonX100, 염화나트륨(150 ㎜ol/L), 염화마그네슘(2 ㎜ol/L), 염화칼슘(2 ㎜ol/L), 0.1% 아지드화나트륨, 불화페닐메탄술포닐(PMSF, 5 ㎛ol/L), N-에틸말레이미드(50 ㎜ol/L), 류펩틴(1 ㎎/ml) 및 디티오트레이톨(0.1 ㎜ol/L)의 혼합 용액(이하, 세포 용해용 완충액 A로 표기함)을, 각각 5×107개의 세포당 1 mL 첨가하여, 4℃, 2시간 방치 후, 원심분리하여 얻어진 상청을 세포 용해액으로서 이용하였다. SDS-폴리아크릴아미드 전기영동(PAGEL, 아토사 제조)을 이용하여 1 레인당 5×104개의 세포분의 각 세포 용해액을 분획하고, PVDF 막(미리포아사 제조)에 전사하였다. 전사한 상기 PVDF 막을 10% BSA-PBS로 블로킹한 후, 1차 항체로서, 피검 물질인 정제 항체, 실시예 3에서 얻어진 KM3842(양성 대조), 래트 IgG2a-UNLB(음성 대조, 베크만 쿨터사 제조) 및 KM511(음성 대조)을, 각각 10 ㎍/mL가 되도록 1% BSA-PBS로 희석하여, 4℃에서 밤새 반응시켰다. 얻어진 PVDF 막을 0.1% Tween-PBS(이하, PBST로 표기함)로 잘 세정하고, 2차 항체로서 퍼옥시다제 표지 항마우스 면역글로불린 G(H+L)(자이메트사 제조) 또는 퍼옥시다제 표지 항래트 면역글로불린 G(H+L)(다코사 제조)을 실온에서 1시간 반응시켰다. 다시 상기 PVDF 막을 PBST로 잘 세정하고, ECL 웨스턴 블로팅 검출 시약(아머샴파마시아사 제조)을 이용하여, 항체가 결합한 밴드를 검출하였다.
KM3842는 인간 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포, ASCT2 mRNA를 발현하고 있는 KMS-11 세포 및 WiDr 세포에서 ASCT2의 분자량에 상당하는 분자량 75 kDa 부근에 밴드를 검출했지만, KM3998, KM4000, KM4001, KM4008, KM4012 및 KM4018은 ASCT2를 검출할 수 없었다. 또한, 벡터 도입 CHO 세포에서는, 어느 항체의 반응성도 확인되지 않았다.
상기, 유세포 분석법 및 웨스턴 블로팅의 결과로부터, KM3998, KM4000, KM4001, KM4008, KM4012 및 KM4018의 ASCT2에 대한 결합 활성은 ASCT2의 SDS 변성에 의해 잃은 것으로 생각되고, KM3998, KM4000, KM4001, KM4008, KM4012 및 KM4018은 ASCT2의 천연형 입체 구조를 인식하여 결합하는 항체인 것이 확인되었다.
(3) 면역침강법
실시예 2에서 얻어진 인간 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포, 및 벡터 도입 CHO 세포에, 트리스-염산(50 ㎜ol/L, pH 7.5), 1% TritonX100, 염화나트륨(150 ㎜ol/L), EDTA(5 ㎜ol/L), 0.1% SDS, 0.5% 데옥시콜산나트륨, 프로테아제 억제제 칵테일(로슈 다이아그노스틱스사 제조) 및 포스파타제 억제제 칵테일(로슈 다이아그노스틱스사 제조)의 혼합 용액(이하, 세포 용해용 완충액 B로 표기함)을, 각각 2×107개의 세포당 1 mL 첨가하고, 4℃에서 30분 동안 교반 후, 원심분리(CF15D, 히타치공기사 제조)를 하였다. 얻어진 상청의 단백 농도를 프로테인 어세이 시약(바이오래드사 제조)에 의해 측정하고, 세포 용해용 완충액 B로 단백 농도를 5 ㎎/mL로 조제하여, 세포 용해액으로서 사용하였다.
피검 물질인 정제 항체, 실시예 3에서 얻어진 KM3842(양성 대조), 래트 IgG2a-UNLB(음성 대조, 베크만 쿨터사 제조) 및 KM511(음성 대조)을 각각 2 ㎍과 얻어진 세포 용해액 1 ㎎을 4℃에서 1시간 혼화시켰다.
프로테인 G-세파로스 비드(아머샴사 제조, 30 μL) 또는 프로테인 A-세파로스 비드(아머샴사 제조, 30 μL)를 0.1% BSA-PBST(300 μL)로써 30분 이상 전처리한 후, 원심분리에 의해 상청을 제거하고, 트리스-염산(50 ㎜ol/L, pH7.5), 1% Triton X100, 염화나트륨(150 ㎜ol/L), EDTA(5 ㎜ol/L) 및 프로테아제 억제제 칵테일(로슈 다이아그노스틱스사 제조)의 혼합 용액(이하, 비드 세정용 완충액으로 표기함)(90 μL)에 현탁하였다.
비드 현탁액에, 항체와 세포 용해액과의 혼합 용액(100 μL)을 가하여, 4℃에서 2시간 혼화시킨 후, 원심분리에 의해 비드를 회수하였다. 회수한 비드는 비드 세정용 완충액으로 3∼5회 세정 후, 2% SDS, 트리스-염산(62 ㎜ol/L, pH 6.8) 및 10% 글리세롤의 혼합 용액(이하, SDS-PAGE용 샘플 버퍼로 표기함)으로 용해하고, 얻어진 용액을 이하의 면역 블롯에 의해 해석하였다.
SDS-폴리아크릴아미드 전기영동에 의해 분획하고, PVDF 막(밀리포어사 제조)에 전사하였다. 얻어진 상기 PVDF 막을 5% 탈지유-PBST로 블로킹한 후, 1차 항체로서, 실시예 3에서 얻어진 KM3842(양성 대조, 3.5 ㎍/mL)를 실온에서 2시간 반응시켰다. 얻어진 상기 PVDF 막을 PBST로 잘 세정하고, 퍼옥시다제 표지 항래트 면역글로불린 G(H+L)(다코사 제조)를 실온에서 1시간 반응시켰다. 다시 상기 PVDF 막을 PBST로 잘 세정하고, ECL 웨스턴 블로팅 검출 시약(아머샴파마시아사 제조)을 이용하여, 항체가 결합한 밴드를 검출하였다.
KM4000, KM4001, KM4008, KM4012, KM4018과 양성 대조 항체 KM3842에서 분자량 75 kDa 부근에 밴드가 검출되었다. 그 결과, KM4000, KM4001, KM4008, KM4012 및 KM4018은 면역침강 반응에 의한 ASCT2의 검출이 가능한 항체이며, ASCT2의 입체 구조를 인식하는 항체인 것이 확인되었다.
(4) ASCT2를 통한 아미노산의 세포내 흡수 저해 활성
10% 비동화 투석 소태아 혈청(이하, dFBS, 인비트로젠사 제조)을 첨가한 둘베코 개변 이글 배지(DMEM, 인비트로젠사 제조)(이하, 글루타민 불포함 배지로 표기함)에서 2×104개/mL의 세포수로 조제한 인간 대장암 세포주 WiDr(ATCC 번호: CCL-218)를 96웰 플레이트에 100 μL씩 파종하고, 5% CO2 인큐베이터 중, 37℃에서 24시간 배양하였다.
최종 농도가 31.6 ㎍/mL∼0.03 ㎍/mL가 되도록 PBS로 희석 조제한 피검 물질인 정제 항체, 래트 IgG2a-UNLB(음성 대조, 베크만 쿨터사 제조), KM511(음성 대조) 및 글루타민 경합 아미노산 혼합액[AST 혼합액, 알라닌, 세린, 트레오닌(모두 시그마사 제조, 각 3.3 ㎜ol/L)의 혼합액]을 20 μL/웰을 가하고, 또한, 최종 농도 0.2 ㎜ol/L가 되도록 글루타민 불포함 배지로 조제한 글루타민 용액(인비트로젠사 제조)을 20 μL/웰 가하였다. 컨트롤의 웰 및 블랭크 플레이트의 웰에는 PBS(20 μL/웰)와 상기 글루타민 용액(20 μL/웰)을 첨가하였다. 블랭크 플레이트 이외는, 항체 첨가 후, 5% CO2 인큐베이터 중, 37℃에서 72시간 배양하였다.
글루타민 불포함 배지로 50%로 희석한 {4-[3-(4-요오도페닐)-2-(4-니트로페닐)-2H-5-테트라졸리오]-1,3-벤젠 디술포네이트}(이하, WST-1 시약, 로슈 다이아그노스틱스사 제조)를 20 μL/웰 가하고, 또한, 37℃에서 2시간 인큐베이트하였다.
마이크로플레이트 분광광도계(Emax microplate reader, 몰리큘러 디바이스사)를 이용하여, 450 ㎚(대조 파장 650 ㎚)의 흡광도를 측정하였다. 항체 비첨가 컨트롤의 웰의 흡광도를 100%, 블랭크 플레이트의 웰의 흡광도를 0%로 하여, 항체를 첨가한 웰의 상대 증식률(%)을 산출하였다.
측정 결과를 도 7 및 도 8에 도시한다.
도 7에 도시하는 바와 같이, KM3998은 고농도에서 약간 세포 증식을 억제했지만, 그 효과는 글루타민 경합 아미노산 혼합액의 효과에 비해 낮고, KM3998의 ASCT2에 대한 중화 활성은 낮은 것이 확인되었다.
또한, 도 8에 도시하는 바와 같이, KM4000, KM4001, KM4008, KM4012 및 KM4018은 모두 항체 농도 의존적으로 세포 증식을 강력히 억제하였다. 그 결과, KM4000, KM4001, KM4008, KM4012 및 KM4018은 글루타민을 세포내에 흡수하는 ASCT2의 기능을 강력히 중화함으로써, 암 세포의 증식을 현저히 억제하는 활성을 갖는 것이 확인되었다.
실시예 7
항ASCT2 모노클로날 항체의 가변 영역을 코드하는 cDNA의 단리, 해석
(1) 항ASCT2 모노클로날 항체 생산 하이브리도마 세포부터의 mRNA의 조제
실시예 5 (5)에서 얻어진 하이브리도마 KM4008, KM4012 및 KM4018(각각 5×107개의 세포)로부터, RNeasy Maxi Kit(퀴아젠사 제조) 및 Oligotex-dT30<Super>mRNA 정제 키트(다카라바이오사 제조)를 이용하여, 첨부 설명서의 방법에 따라, 약 6 ㎍의 mRNA를 조제하였다.
(2) 항ASCT2 모노클로날 항체의 H쇄 및 L쇄 가변 영역의 유전자 클로닝
(1)에서 취득한 KM4008, KM4012 및 KM4018의 mRNA의 0.6 ㎍으로부터, BD SMART RACE cDNA 증폭 키트(BD 바이오사이언스사 제조)를 이용하여, 첨부 설명서의 방법에 따라, 각각 5'측에 키트 첨부의 BD SMART II A 올리고뉴클레오티드 서열을 갖는 cDNA를 취득하였다.
얻어진 cDNA를 주형으로 하여, 키트 첨부의 유니버셜 프라이머 Amix와, 서열 번호 15, 16으로 표시된 마우스 Ig(γ) 특이적 프라이머(mG3a2 또는 mG2ba1) 또는 서열 번호 43으로 표시된 래트 Ig(γ) 특이적 프라이머(rG2a)를 이용하여 PCR 반응을 행하고, VH의 cDNA 단편을 증폭하였다. 또한, Ig(γ) 특이적 프라이머 대신에 서열 번호 17로 표시된 마우스 Ig(κ) 특이적 프라이머(mKa1) 또는 서열 번호 44로 표시된 래트 Ig(κ) 특이적 프라이머(rKa2)를 이용하여 PCR 반응을 행하고, VL의 cDNA 단편을 증폭하였다. 래트 Ig(κ) 특이적 프라이머(rKa2)에서의 PCR 반응은, 94℃에서 5분 동안 가열 후, 94℃에서 15초 동안, 68℃에서 30초 동안, 72℃에서 3분 동안으로 이루어지는 반응 사이클을 40회 행한 후, 72℃에서 10분 동안 반응시키는 조건으로 행하고, 그 이외의 PCR 반응은 94℃에서 5분 동안 가열 후, 94℃에서 15초 동안, 72℃에서 3분 동안으로 이루어지는 반응 사이클을 5회, 94℃에서 15초 동안, 72℃에서 3분 동안 30초 동안으로 이루어지는 반응 사이클을 5회, 94℃에서 15초 동안, 68℃에서 30초 동안, 72℃에서 3분 동안으로 이루어지는 반응 사이클을 30회 각각 행한 후, 72℃에서 10분 동안 반응시키는 조건으로 행하였다. PCR 반응은 PTC-200 DNA Engine(바이오래드사 제조)을 이용하여 행하였다. 얻어진 PCR 산물은 H쇄가 약 700 bp, L쇄가 약 800 bp의 사이즈였다.
얻어진 PCR 산물의 염기 서열을 결정하기 위해, 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고, PCR 산물을 겔 추출 키트(퀴아젠사 제조)를 이용하여 추출하였다. 얻어진 추출 단편을, TOPO TA 클로닝 키트(인비트로젠사 제조)를 이용하여 pCR4 TOPO 벡터에 연결하고, 코엔 등의 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110(1972)]에 의해 대장균 DH5α주(도요보세키사 제조)를 형질전환하였다. 얻어진 형질전환체로부터 자동 플라스미드 추출기 PI-50(쿠라보사 제조)을 이용하여 플라스미드를 추출하고, BigDye Terminator Cycle Sequencing FS Ready Reaction Kit(PE 바이오시스템사 제조)를 이용하여, 첨부 설명서에 따라 반응 후, DNA 시퀀서 ABI PRISM3700(PE 바이오시스템사 제조)에 의해 염기 서열을 해석하였다.
그 결과, cDNA의 5' 말단에 개시 코돈으로 추정되는 ATG 서열이 존재하는, 완전 길이의 KM4008의 H쇄 cDNA를 포함하는 플라스미드 08H2b10, KM4008의 L쇄 cDNA를 포함하는 플라스미드 08La4, KM4012의 H쇄 cDNA를 포함하는 플라스미드 12Ha5, KM4012의 L쇄 cDNA를 포함하는 플라스미드 12La4, KM4018의 H쇄 cDNA를 포함하는 플라스미드 18rHa1 및 KM4018의 L쇄 cDNA를 포함하는 플라스미드 18Lb3을 얻을 수 있었다.
얻어진 KM4008의 H쇄 cDNA를 포함하는 플라스미드 08H2b10에 포함되어 있던 VH의 전체 염기 서열을 서열 번호 18, 상기 플라스미드 08H2b10에 포함되어 있던 VH의 전체 염기 서열로부터 추정된 시그널 서열을 포함한 분비형 VH의 전체 아미노산 서열을 서열 번호 19, KM4008의 L쇄 cDNA를 포함하는 플라스미드 08La4에 포함되어 있던 VL의 전체 염기 서열을 서열 번호 20, 상기 플라스미드 08La4에 포함되어 있던 VL의 전체 염기 서열로부터 추정된 시그널 서열을 포함한 분비형 VL의 전체 아미노산 서열을 서열 번호 21, KM4012의 H쇄 cDNA를 포함하는 플라스미드 12Ha5에 포함되어 있던 VH의 전체 염기 서열을 서열 번호 22, 상기 플라스미드 12Ha5에 포함되어 있던 VH의 전체 염기 서열로부터 추정된 시그널 서열을 포함한 분비형 VH의 전체 아미노산 서열을 서열 번호 23, KM4012의 L쇄 cDNA를 포함하는 플라스미드 12La4에 포함되어 있던 VL의 전체 염기 서열을 서열 번호 24, 및 상기 플라스미드 12La4에 포함되어 있던 VL의 전체 염기 서열로부터 추정된 시그널 서열을 포함한 분비형 VL의 전체 아미노산 서열을 서열 번호 25, KM4018의 H쇄 cDNA를 포함하는 플라스미드 18rHa1에 포함되어 있던 VH의 전체 염기 서열을 서열 번호 45, 상기 플라스미드 18rHa1에 포함되어 있던 VH의 전체 염기 서열로부터 추정된 시그널 서열을 포함한 분비형 VH의 전체 아미노산 서열을 서열 번호 46, KM4018의 L쇄 cDNA를 포함하는 플라스미드 18Lb3에 포함되어 있던 VL의 전체 염기 서열을 서열 번호 47, 상기 플라스미드 18Lb3에 포함되어 있던 VL의 전체 염기 서열로부터 추정된 시그널 서열을 포함한 분비형 VL의 전체 아미노산 서열을 서열 번호 48로서 각각 표시하였다.
(3) 항ASCT2 모노클로날 항체의 V 영역의 아미노산 서열의 해석
실시예 5 (7)에서 얻어진 KM4008, KM4012, KM4018의 정제 모노클로날 항체에 있어서의 H쇄 및 L쇄의 N 말단 아미노산 서열에 관해서, 프로테인 시퀀서(PPSQ-10, 시마즈제작소사 제조)를 이용하여 해석하고, 약 20 잔기를 결정하였다. 얻어진 결과와 (2)에서 얻어진 각 항체의 염기 서열로부터 추정된 아미노산 서열을 비교한 결과, 각 서열의 일치가 확인되고, (2)에서 얻어진 염기 서열이 목적 항체의 염기 서열인 것이 확인되었다. 또한, 기지의 마우스 항체, 또는 래트 항체의 아미노산 서열 데이터[SEQUENCES of Proteins of I㎜unological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]와의 비교로부터, 단리한 각각의 cDNA는 분비 시그널 서열을 포함하는 항ASCT2 모노클로날 항체 KM4008, KM4012 및 KM4018을 코드하는 완전 길이 cDNA이고, KM4008의 H쇄에 대해서는 서열 번호 19에 기재된 아미노산 서열의 1∼19번째, KM4008의 L쇄에 대해서는 서열 번호 21에 기재된 아미노산 서열의 1∼20번째, KM4012의 H쇄에 대해서는 서열 번호 23에 기재된 아미노산 서열의 1∼19번째, KM4012의 L쇄에 대해서는 서열 번호 25에 기재된 아미노산 서열의 1∼20번째, KM4018의 H쇄에 대해서는 서열 번호 46에 기재된 아미노산 서열의 1∼19번째, KM4018의 L쇄에 대해서는 서열 번호 48에 기재된 아미노산 서열의 1∼20번째가, 각각 분비 시그널 서열인 것이 명백해졌다.
다음에, 항ASCT2 모노클로날 항체 KM4008, KM4012, KM4018의 VH 및 VL의 아미노산 서열을 이용하여, 기존의 단백질의 아미노산 서열 데이터베이스에 대하여 blastp법[Nucleic Acids Res., 25, 3389(1997)]에 의해 검색하였다. 그 결과, VH 및 VL은 함께 완전히 일치하는 아미노산 서열은 검색되지 않고, 항ASCT2 모노클로날 항체 KM4008, KM4012, KM4018의 VH 및 VL은 모두 신규한 아미노산 서열을 갖고 있는 것이 확인되었다.
또한, 항ASCT2 모노클로날 항체 KM4008, KM4012, KM4018의 VH 및 VL의 CDR 서열을, 기지의 항체의 아미노산 서열과 비교함으로써 동정하였다. 항ASCT2 모노클로날 항체 KM4008의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 26, 서열 번호 27 및 서열 번호 28, VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 29, 서열 번호 30 및 서열 번호 31, 항ASCT2 모노클로날 항체 KM4012의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 32, 서열 번호 33 및 서열 번호 34, VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 35, 서열 번호 36 및 서열 번호 37, 항ASCT2 모노클로날 항체 KM4018의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 49, 서열 번호 50 및 서열 번호 51, VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3의 아미노산 서열을 서열 번호 52, 서열 번호 53 및 서열 번호 54에, 각각 표시하였다.
실시예 8
항ASCT2 인간형 키메라 항체의 제작
(1) 항ASCT2 인간형 키메라 항체 발현 벡터 cKM4008_93의 구축
인간화 항체 발현용 벡터 pKANTEX93(WO97/10354)과 실시예 7 (2)에서 얻어진 KM4008의 H쇄 cDNA를 포함하는 플라스미드 08H2b10 및 KM4008의 L쇄 cDNA를 포함하는 08La4를 이용하여 항ASCT2 인간형 키메라 항체 발현 벡터 cKM4008_93을 이하와 같이 하여 구축하였다.
실시예 2와 마찬가지로, PCR 반응을 행하였다. 플라스미드 08H2b10(100 ng)을 주형으로 하여, 서열 번호 38 및 서열 번호 39 기재의 염기 서열을 갖는 프라이머(10 ㎛ol/L, 각각 1 μL), 10×Ex Taq 버퍼(5 μL), dNTP 혼합액(2.5 ㎜ol/L, 4 μL), 및 Ex Taq 폴리머라제(이상, 다카라바이오사 제조, 1 μL)를 첨가하고, 멸균수를 더 가하여 전량 50 μL로 하였다. PCR 반응은 96℃에서 2분 동안 변성 처리 후, 94℃에서 1분 동안, 55℃에서 1분 동안, 72℃에서 1분 동안의 사이클을 30 사이클, 또한, 72℃에서 5분 동안의 반응 조건으로 행하여, pKANTEX93에 삽입하기 위한 제한 효소 인식 서열이 부가된 KM4008의 VH를 코드하는 유전자 단편을 증폭하였다.
또한, 플라스미드 08La4(100 ng)를 주형으로 하여, 서열 번호 40 및 서열 번호 41 기재의 염기 서열을 갖는 프라이머(10 ㎛ol/L, 각각 1 μL), 10×Ex Taq 버퍼(5 μL), dNTP 혼합액(2.5 ㎜ol/L, 4 μL), 및 Ex Taq 폴리머라제(이상, 다카라바이오사 제조, 1 μL)로부터, 전술과 같은 PCR 반응을 행하여, pKANTEX93에 삽입하기 위한 제한 효소 인식 서열이 부가된 KM4008의 VL을 코드하는 유전자 단편을 증폭하였다.
얻어진 각각의 반응 산물을 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고, 얻어진 약 0.5 kbp의 증폭 단편을 겔 추출 키트(퀴아젠사 제조)를 이용하여 추출하였다. 얻어진 유전자 단편을, TOPO TA 클로닝 키트(인비트로젠사 제조)를 이용하여 pCR4 TOPO 벡터에 연결하고, 실시예 7 (2)와 마찬가지로 하여 대장균 DH5α주(도요보세키사 제조)를 형질전환하며, KM4008의 VH를 코드하는 염기 서열을 포함하는 플라스미드 08VH3와, KM4008의 VL을 코드하는 염기 서열을 포함하는 플라스미드 08VL6을 취득하였다.
얻어진 플라스미드 08VH3을 제한 효소 Apa I(다카라바이오사 제조) 및 Not I(다카라바이오사 제조)으로, 플라스미드 08VL6을 제한 효소 EcoR I(다카라바이오사 제조) 및 BsiW I(다카라바이오사 제조)으로 각각 소화한 후, 아가로스 겔 전기영동으로 분리하였다. 얻어진 약 0.5 kbp의 유전자 단편을 겔 추출 키트(퀴아젠사 제조)를 이용하여 추출하였다.
플라스미드 08VL6을 소화하여 얻어진 단편을, 동일하게 EcoR I(다카라바이오사 제조) 및 BsiW I(다카라바이오사 제조)으로 소화한 pKANTEX93 벡터에 연결하고, 실시예 7 (2)와 마찬가지로 하여 대장균 DH5α주(도요보세키사 제조)를 형질전환하며, 플라스미드 추출 키트(퀴아젠사 제조)를 이용하여 KM4008의 VL이 삽입된 pKANTEX93 벡터를 취득하였다.
얻어진 KM4008의 VL이 삽입된 pKANTEX93 벡터를 Apa I(다카라바이오사 제조)및 Not I(다카라바이오사 제조)으로 소화한 후, 전술한 플라스미드 08VH3를 소화하여 얻어진 단편과 연결하고, 실시예 7 (2)와 마찬가지로 하여 대장균 DH5α주(도요보세키사 제조)를 형질전환하며, 플라스미드 추출 키트(퀴아젠사 제조)를 이용하여, KM4008의 VH 및 VL이 삽입된 항ASCT2 인간형 키메라 항체 발현 벡터 cKM4008_93을 취득하였다.
(2) 항ASCT2 인간형 키메라 항체 발현 벡터 cKM4012_93의 구축
(1)과 마찬가지로 하여, 인간화 항체 발현용 벡터 pKANTEX93(WO97/10354)과 실시예 7 (2)에서 얻어진 KM4012의 H쇄 cDNA를 포함하는 플라스미드 12Ha5 및 KM4012의 L쇄 cDNA를 포함하는 플라스미드 12La4로부터, 항ASCT2 인간형 키메라 항체 발현 벡터 cKM4012_93을 구축하였다.
플라스미드 12Ha5 및 플라스미드 12La4를 주형으로 하여, 서열 번호 38 및 서열 번호 42에 기재된 염기 서열을 갖는 VH 증폭용 프라이머 및 서열 번호 40 및 서열 번호 41에 기재된 염기 서열을 갖는 VL 증폭용 프라이머를 이용하여, PCR 반응을 행하고, 유전자 단편을 증폭하였다. 얻어진 각각의 반응 산물을 분리, 추출하고, pCR4 TOPO 벡터에 연결한 후, 대장균 DH5α주(도요보세키사 제조)를 형질전환하며, KM4012의 VH를 코드하는 염기 서열을 포함하는 플라스미드 12VH1과, KM4012의 VL을 코드하는 염기 서열을 포함하는 플라스미드 12VL11을 취득하였다.
얻어진 플라스미드 12VH1 및 플라스미드 12VL11을 각각 제한 효소로써 소화한 후, 분리, 추출하여, 플라스미드 12VH1 및 플라스미드 12VL11의 단편을 취득하였다. 얻어진 각각의 단편과, 제한 효소로써 소화한 pKANTEX93 벡터에 연결한 후, 대장균 DH5α주(도요보세키사 제조)를 형질전환하고, KM4012의 VH 및 VL이 삽입된 항ASCT2 인간형 키메라 항체 발현 벡터 cKM4012_93을 취득하였다.
(3) 항ASCT2 인간형 키메라 항체 발현 벡터 cKM4018_93의 구축
(1)과 마찬가지로 하여, 인간화 항체 발현용 벡터 pKANTEX93(WO97/10354)과 실시예 7 (2)에서 얻어진 KM4018의 H쇄 cDNA를 포함하는 플라스미드 18rHa1 및 KM4018의 L쇄 cDNA를 포함하는 플라스미드 18Lb3으로부터, 항ASCT2 인간형 키메라 항체 발현 벡터 cKM4018_93을 구축하였다.
플라스미드 18rHa1 및 플라스미드 18Lb3을 주형으로 하여, 서열 번호 55 및 서열 번호 56에 기재된 염기 서열을 갖는 VH 증폭용 프라이머 및 서열 번호 57 및 서열 번호 58에 기재된 염기 서열을 갖는 VL 증폭용 프라이머를 이용하여, PCR 반응을 행하고, 유전자 단편을 증폭하였다. 얻어진 각각의 반응 산물을 분리, 추출하여, pCR4 TOPO 벡터에 연결한 후, 대장균 DH5α주(도요보세키사 제조)를 형질전환하며, KM4018의 VH를 코드하는 염기 서열을 포함하는 플라스미드 18VH5와, KM4018의 VL을 코드하는 염기 서열을 포함하는 플라스미드 18V2L1을 취득하였다.
얻어진 플라스미드 18VH5 및 플라스미드 18V2L1을 각각 제한 효소로써 소화한 후, 분리, 추출하여, 플라스미드 18VH5 및 플라스미드 18V2L1의 단편을 취득하였다. 얻어진 각각의 단편과, 제한 효소로써 소화한 pKANTEX93 벡터에 연결한 후, 대장균 DH5α주(도요보세키사 제조)를 형질전환하며, KM4018의 VH 및 VL이 삽입된 항ASCT2 인간형 키메라 항체 발현 벡터 cKM4018_93을 취득하였다.
(4) 항ASCT2 인간형 키메라 항체의 동물 세포에서의 발현
상기 (1)에서 얻어진 항ASCT2 인간형 키메라 항체 발현 벡터 cKM4008_93을 이용하여 항ASCT2 인간형 키메라 항체의 동물 세포에서의 발현을, 통상법[Antibody Engineering, A Practical Guide, W. H. Freeman and Company (1992)]에 의해 행하였다. 또한, 마찬가지로 하여 항ASCT2 인간형 키메라 항체 발현 벡터 cKM4012_93, 또는 항ASCT2 인간형 키메라 항체 발현 벡터 cKM4018_93을 이용하여, 각각 항ASCT2 인간형 키메라 항체의 동물 세포에서의 발현을 행하고, 항ASCT2 인간형 키메라 항체를 생산하는 형질전환주를 취득하였다.
(5) 정제 항체의 취득
상기 (4)에서 얻어진 형질전환주를, 각각 통상의 배양법으로 배양한 후, 세포 현탁액을 회수하고, 3000 rpm, 4℃의 조건으로 15분 동안의 원심분리를 행하여 배양 상청을 회수한 후, 배양 상청은 0.22 ㎛ 구경 MillexGV 필터(밀리포어사 제조)를 이용하여 여과 멸균하였다. 얻어진 배양 상청으로부터 Protein A High-capacity 레진(밀리포어사 제조) 컬럼을 이용하여, 첨부 설명서에 따라, 항ASCT2 인간형 키메라 항체 cKM4008, cKM4012, cKM4018(이하, cKM4008, cKM4012, cKM4018로 표기함)을 정제하였다.
얻어진 cKM4008, cKM4012, cKM4018의 정제 표본의 정제도 및 발현 분자 사이즈를, 구배 겔(아토사 제조, 카탈로그 번호: E-T520L)를 이용하여, 첨부 설명서에 따라, SDS-PAGE에 의해 확인하였다. 정제한 항ASCT2 인간형 키메라 항체의 영동 패턴은, 비환원 조건 하에서는 분자량 150∼200 킬로 달톤(이하, kDa로 표기함) 부근에 하나의 밴드가, 환원 조건 하에서는 약 50 kDa과 약 25 kDa의 2개의 밴드가 확인되었다. 이러한 영동 패턴은 IgG 클래스의 항체를, 동일한 조건 하에서 SDS-PAGE를 행한 결과[Antibodies-A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Chapter 14(1988), Monoclonal Antibodies-Principles and Practice, Academic Press Limited(1996)]와 일치하고 있다. 따라서, 항ASCT2 인간형 키메라 항체 cKM4008, cKM4012 및 cKM4018이 올바른 구조의 항체 분자로서 발현되어 있는 것이 확인되었다.
실시예 9
항ASCT2 인간형 키메라 항체의 반응성 검토
(1) 형광 세포 염색법(유세포 분석법)
실시예 2에서 얻어진 인간 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포 및 다발성 골수종 세포주 OPM-2(DSMZ 번호: ACC50)를 각각 5% CO2 인큐베이터 중, 37℃에서 3∼4일 동안 배양하였다. 인간 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포는, 0.02% EDTA 용액(나카라이테스크사 제조)으로 박리하고, 항체의 비특이적인 흡착을 피하기 위해 1% BSA-PBS를 이용하여 빙온 중, 30분 동안 블로킹하였다. 96웰 U형 플레이트에 1웰당 1×105∼5×105개의 세포(100 μL)를 파종하고, 1500 rpm으로 5분 동안 원심분리(05 PR-22, 히타치공기사 제조)한 후, 상청을 제거하였다. 1차 항체로서 피검 물질인 정제 항체를 최종 농도가 0.01 ㎍/mL에서 10 ㎍/mL가 되도록 1% BSA-PBS로 희석하고, 100 μL/웰로 가하여, 빙온 중에서 60분 동안 반응시켰다. 1% BSA-PBS로 세정한 후, 2차 항체로서 1% BSA-PBS로 희석한 FITC 표지 항인간 면역글로불린 G(H+L)(잭슨 래버러토리사 제조)를 가하여 빙온 중, 차광 하에서 30분 동안 반응시켰다. 1% BSA-PBS로 세정하고, PBS에 현탁하여 유세포 분석기(Cytomics FC500 MPL, 베크만 쿨터사 제조)로 형광 강도를 측정하였다.
측정 결과를 도 9에 도시한다. 도 9에 도시하는 바와 같이, 항ASCT2 인간형 키메라 항체 cKM4008, cKM4012 및 cKM4018은 각각 인간 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포에 강한 결합성을 나타내었다. 또한, 다발성 골수종 세포주인 OPM-2에 강한 반응성을 나타내는 것이 명백해졌다.
(2) ADCC 활성
표적 세포에는 다발성 골수종 세포주 KMS-11(HSRRB 번호: JCRB1179)을 이용하고, FBS(인비트로젠사)를 5% 포함하는 페놀레드 불포함 RPMI 1640 배지(인비트로젠사)(이하, ADCC 활성 측정용 배지)에서 세포 농도를 2×105 세포/mL로 조제하여 표적 세포 용액으로 하였다. 이펙터 세포 용액의 조제에는 Lymphoprep(나이코메드사 제조)를 이용하여, 첨부 사용설명서에 따라, 건강한 사람의 말초혈로부터 단핵구(PBMC) 분획을 분리하였다. 분리한 PBMC 분획은 ADCC 활성 측정용 배지로 2회 원심분리하고 세정한 후, 세포 농도를 2×106 세포/mL로 조제하여 이펙터 세포 용액으로 하였다.
표적 세포 용액을, 96웰 U형 바닥 플레이트(팔콘사 제조)에 50 μL(1×104 세포/웰) 분주하고, 이어서 이펙터 세포 용액을 50 μL(이펙터 세포와 표적 세포의 비는 10:1) 첨가하였다. 또한, 항ASCT2 인간형 키메라 항체 cKM4008, cKM4012 또는 cKM4018을 ADCC 활성 측정용 배지로 희석하고, 각 최종 농도 0.01 ng/mL∼1000 ng/mL가 되도록 가하여 전량을 150 μL로 하며, 37℃에서 4시간 반응시켰다. 반응 후, 플레이트를 원심분리하고, 상청 중 젖산탈수소효소(LDH) 활성을, LDH-Cytotoxic Test(와코준야꾸사 제조)를 이용하여, 첨부 설명서에 따라, 흡광도를 측정함으로써 검출하였다. 표적 세포 자연 유리의 흡광도는, 이펙터 세포 용액 및 항체 용액 대신에 ADCC 활성 측정용 배지를 이용하고, 또한, 이펙터 세포 자연 유리의 흡광도 데이터는 표적 세포 용액 및 항체 용액 대신에 ADCC 활성 측정용 배지를 이용하여, 상기와 같은 조작을 행함으로써 취득하였다. 표적 세포 전체 유리의 흡광도는 항체 용액 및 이펙터 세포 용액 대신에 ADCC 활성 측정용 배지를 이용하여, 반응 종료 45분 전에 20 μL의 9% Triton X-100 용액을 첨가하여 반응시키고, 상기와 같은 조작을 행함으로써 취득하였다. ADCC 활성은 이하의 계산식에 의해 구하였다.
(식)
ADCC 활성(%)=[(검체의 흡광도)-(이펙터 세포·표적 세포 자연 유리의 흡광도)]/[(표적 세포 전체 유리의 흡광도)-(표적 세포 자연 유리의 흡광도)]×100
측정 결과를 도 10에 도시한다. 도 10에 도시하는 바와 같이, 항ASCT2 인간형 키메라 항체 cKM4008, cKM4012 및 cKM4018은, 항체 농도 의존적으로 ASCT2를 발현하는 세포에 대하여 ADCC 활성을 갖는 것이 명백해졌다.
(3) CDC 활성
표적 세포에는 실시예 2에서 얻어진 인간 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포 및 대장암 세포주 Colo205(ATCC 번호: CCL-222)를 이용하고, 0.02%-EDTA 용액(나카라이테스크사 제조)으로 박리하고, CDC 측정용 배지로서 제작한 1.4% BSA(인비트로젠사 제조), 50 ㎍/mL 젠타마이신(나카라이테스크사 제조)을 포함하는 RPMI 1640 배지(인비트로젠사 제조)로 세정한 후, 같은 배지에 2×105 세포/mL로 현탁하여, 표적 세포 용액으로 하였다.
인간 보체 혈청(시그마사 제조, S 2257-5 ML)을 탈이온수 5 mL로 용해하고, 등량의 CDC 측정용 배지를 가하여 2배로 희석하여, 인간 보체 용액으로 하였다.
96웰의 바닥이 평평한 플레이트(스미토모 베이클라이트사 제조)의 각 웰에 보체 용액을 50 μL 분주하였다. 이어서 표적 세포 용액을 50 μL 가하고, CDC용 배지로 희석한 각 항체 용액을 50 μL 첨가하여, 전량을 150 μL로 하여, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 2시간 반응시켰다. 각 웰에 WST-1 시약(로슈 다이아그노스틱스사 제조)을 15 μL씩 첨가하여 플레이트 믹서로 교반하고, 37℃, 5% CO2 조건 하에서 2시간 반응시켜, 마이크로플레이트 분광광도계(Emax microplate reader, 몰리큘러 디바이스사)를 이용하여, 450 ㎚(대조 파장 650 ㎚)의 흡광도를 측정하였다. 보체 용액 50 μL, CDC용 배지 100 μL를 가한 웰을 블랭크로 하고, 또한, 표적 세포, 보체 용액, CDC용 배지를 각 50 μL씩 가한 웰(항체 비첨가)의 흡광도를 측정하여, CDC 활성은 이하의 계산식에 의해 산출하였다.
(식)
CDC 활성(%)={1-[(항체 첨가 샘플 흡광도)-(블랭크 흡광도)]/[(항체 비첨가 흡광도)-(블랭크 흡광도)]×100}
측정 결과를 도 11에 도시한다. 도 11에 도시하는 바와 같이, 항ASCT2 인간형 키메라 항체 cKM4008, cKM4012 및 cKM4018은, 항체 농도 의존적으로 ASCT2 발현 세포에 대하여 CDC 활성을 갖는 것이 명백해졌다. 또한, 대장암 세포주 Colo205에 대해서도 CDC 활성을 갖는 것이 명백해졌다.
(4) ASCT2를 통한 아미노산의 세포내 흡수 저해 활성
10% dFBS(인비트로젠사 제조)를 첨가한 DMEM(인비트로젠사 제조)(이하, 글루타민 불포함 배지로 표기함)에서 1×104개/mL의 세포수로 조제한 인간 대장암 세포주 WiDr(ATCC 번호: CCL-218)을 96웰 플레이트에 100 μL씩 파종하여, 5% CO2 인큐베이터 중, 37℃에서 24시간 배양하였다.
최종 농도가 10 ㎍/mL∼0.01 ㎍/mL가 되도록 PBS로 희석 조제한 피검 물질인 항ASCT2 인간형 키메라 항체, KM511(음성 대조) 및 글루타민 경합 아미노산 혼합액[AST 혼합액, 알라닌, 세린, 트레오닌(모두 시그마사 제조, 각 3.3 ㎜ol/L)의 혼합액]을 20 μL/웰 가하고, 또한, 최종 농도 0.2 ㎜ol/L가 되도록 글루타민 불포함 배지로 조제한 글루타민 용액(인비트로젠사 제조)을 20 μL/웰 가하였다. 컨트롤의 웰 및 블랭크 플레이트의 웰에는, PBS(20 μL/웰)와 상기 글루타민 용액(20 μL/웰)을 첨가하였다. 블랭크 플레이트 이외는, 항체 첨가 후, 5% CO2 인큐베이터 중, 37℃에서 72시간 배양하였다.
글루타민 불포함 배지로 50%로 희석한 WST-1시약(로슈 다이아그노스틱스사 제조)을 20 μL/웰 가하고, 37℃에서 2시간 더 인큐베이트하였다.
마이크로플레이트 분광광도계(Emax microplate reader, 몰리큘러 디바이스사)를 이용하여, 450 ㎚(대조 파장 650 ㎚)의 흡광도를 측정하였다. 항체 비첨가의 컨트롤의 웰의 흡광도를 100%, 블랭크 플레이트의 웰의 흡광도를 0%로 하여, 항체를 첨가한 웰의 상대 증식률(%)을 산출하였다.
측정 결과를 도 12에 도시한다. 도 12에 도시하는 바와 같이, 항ASCT2 인간형 키메라 항체 cKM4008, cKM4012 및 cKM4018은 모두 항체 농도 의존적으로 세포 증식을 강력히 억제하였다. 그 결과 cKM4008, cKM4012 및 cKM4018은 글루타민을 세포내에 흡수하는 ASCT2의 기능을 강력히 중화함으로써, 암 세포의 증식을 현저히 억제하는 활성을 갖는 것이 확인되었다.
실시예 10
마우스 ASCT2-myc/His 유전자 도입 세포주(이하, 마우스 ASCT2/CHO로 표기)의 조성
이하에 나타낸 방법에 의해, 서열 번호 59 기재의 유전자 서열 및 서열 번호 60 기재의 아미노산 서열을 포함하는 플라스미드 pBluescriptII SK(-)-Mouse_ASCT2-myc/His를 취득하고, 이 플라스미드를 이용하여 마우스 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포주를 취득하였다.
마우스 ASCT2 유전자 클론(Clone ID:4192790, 오픈바이오시스템사)의 대장균액 10 μL를 암피실린 함유 LB 배지 50 mL에 식균하고, 밤새 교반 배양 후에 원심분리(CR2DGII, 히타치공기사 제조, 6000 rpm, 10분 동안)에 의해 균체를 회수하며, 플라스미드 추출 키트(퀴아젠사)를 이용하여 마우스 ASCT2 유전자를 포함하는 플라스미드를 취득하고, 이것을 주형으로 하여 100 ng, 10×KOD 완충액 I(10 μL), dNTP 혼합액(2 ㎜ol/L, 5μL), MgCl2(25 ㎜ol/L, 4 μL), 서열 번호 61 및 서열 번호 62 기재의 염기 서열을 갖는 프라이머(10 ㎛ol/L, 각각 1 μL), KOD 폴리머라제(도요보세키사 제조, 1 μL), 디메틸설폭시드(5 μL)를 포함하는 총량 100 μL로 이루어지는 용액을, 96℃에서 3분 동안 반응 후, 95℃에서 1분 동안, 50℃에서 1분 동안, 72℃에서 1.5분 동안의 3 공정을 1 사이클로 하여, 총 35 사이클, 72℃에서 7분 동안 반응시켰다. 반응 산물을 아가로스 겔 전기영동으로 분리하고, 얻어진 약 1.7 kb의 증폭 단편을 QIAquick 겔 추출 키트(퀴아젠사 제조)를 이용하여 추출하였다. 얻어진 추출 단편을 EcoRI(다카라바이오사 제조)와 KpnI(다카라바이오사 제조)으로 소화하고, QIAquick 겔 추출 키트을 이용하여 재추출하였다. EcoRI(다카라바이오사 제조)과 KpnI(다카라바이오사 제조)으로 소화한 pBluescriptII SK(-) 벡터에, Ligation high(도요보세키사 제조)를 이용하여 연결한 후, 코엔 등의 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]에 의해 대장균 DH5α주(도요보세키사 제조)를 형질전환하였다. 얻어진 형질전환체로부터 자동 플라스미드 추출기 PI-50(쿠라보사 제조)을 이용하여 플라스미드를 추출하고, 서열 번호 59 기재의 유전자 서열 및 서열 번호 60 기재의 아미노산 서열을 포함하는 플라스미드 pBluescriptII SK(-)-Mouse_ASCT2-myc/His를 취득하였다.
얻어진 pBluescriptII SK(-)-Mouse_ASCT2-myc/His를 EcoRI(다카라바이오사 제조)와 KpnI(다카라바이오사 제조)으로 소화하고, 상기와 마찬가지로 유전자 단편을 추출하며, 미리 EcoRI와 KpnI으로 소화한 pKANTEX93 벡터(WO97/10354)에 연결하고, 상기와 마찬가지로 하여, 대장균 DH5α주(도요보세키사 제조)를 형질전환하며, 형질전환체를 얻은 후, 플라스미드 추출 키트(퀴아젠사 제조)를 이용하여 발현 플라스미드 pKANTEX-Mouse_ASCT2-myc/His를 취득하였다.
pKANTEX-Mouse_ASCT2-myc/His는, 전기천공법[Cytotechnology, 3, 133(1990)]에 의해, 이하와 같이 하여 CHO/DG44 세포[Somatic Cell and Molecular Genetics, 12, 555 (1986)]에 도입하였다. 세포는 10% dFBS(인비트로젠사 제조) 및 젠타마이신(나카라이테스크사 제조, 50 ㎍/mL)을 첨가한 IMDM 배지(인비트로젠사 제조)(이하, A4 배지로 표기함)에, 1×HT 보충제(인비트로젠사 제조)를 첨가한 배지에서 계대한 것을 이용하였다. CHO/DG44 세포를 염화칼륨(137 ㎚ol/L), 염화나트륨(2.7 ㎚ol/L), 인산일수소나트륨(8.1 ㎜ol/L), 인산이수소일나트륨(1.5 ㎚ol/L) 및 염화마그네슘(4 ㎜ol/L)을 포함하는 완충액(이하, K-PBS로 표기함)에 현탁하여 8×106개/mL로 하고, 얻어진 세포 현탁액(200 μL, 세포수로서 1.6×106개)을 발현 플라스미드 pKANTEX-Mouse_ASCT2-myc/His(10 ㎍)와 혼화하였다. 얻어진 혼화액을 큐벳(전극간 거리 2 ㎜)에 옮기고, GenePulserII(바이오래드사 제조)를 이용하여 펄스 전압 0.35 kV, 전기 용량 250 μF의 조건으로 유전자 도입을 행하였다. 큐벳을 빙상에서 정치 후, 큐벳 중 세포 현탁액을, A4 배지를 포함하는 세포 배양용 용기에 현탁하고, 37℃, 5% CO2 인큐베이터 중에서 배양하였다. 4일 동안 배양 후, G418(나카라이테스크사 제조, 0.5 ㎎/mL)을 첨가한 A4 배지로 배지 교환하여, 배양을 계속하였다. 도중 배지 교환과 계대를 하여, 유전자 도입으로부터 약 2주 후에, G418에 내성을 갖는 형질전환 세포주를 취득하였다.
얻어진 G418에 내성인 형질전환 세포를 1 mL당 5개의 세포수가 되도록 G418(나카라이테스크사 제조, 0.5 ㎎/mL)을 첨가한 A4 배지로 희석하고, 희석한 세포 현탁액을 96웰 플레이트에 100 μL씩 분주하며, 단계적으로 메토트렉세이트 농도를 상승시켜 처리함으로써, 마우스 ASCT2-myc/His를 고발현하는 클론을 선택하여, 마우스 ASCT2/CHO를 취득하였다.
실시예 11
마우스/인간 키메라 ASCT2-myc/His 유전자 도입 세포주(이하, 마우스/인간 키메라 ASCT2/CHO로 표기)의 조성
인간과 마우스의 ASCT2 단백의 모식도를 도 13에 도시한다. 도 13 중 마우스 ASCT2 단백의 모식도에 있어서, 검정색으로 나타낸 부분(마우스 ASCT2의 세포외 영역에서, 인간의 74번째, 79번째, 84번째, 87번째, 90번째, 154번째, 159번째, 160번째, 163∼171번째, 173번째, 174번째, 177번째, 188번째, 204번째, 205번째, 207번째, 210∼212번째, 214∼223번째, 287번째, 293번째, 296번째, 297번째, 300번째, 301번째 및 367번째에 상당하는 아미노산)이 인간과 마우스에서 상이한 아미노산이다. ASCT2의 세포외 영역에서, 인간과 마우스에서 상이한 아미노산은 EL1에서는 5개소, EL2에서는 인간과 마우스는 크게 상이하고, EL3에서는 6개소, EL4에서는 1개소이다. EL1, EL2 및 EL3에 대해서는, 각 영역을 포함하는 도메인을 그 근방에 위치하는 제한 효소 사이트로 잘라내고, 재조합에 의해 마우스 치환체를 얻기 위해, QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit(스트라타진사 제조)를 이용한 사일런트 변이의 도입에 의해, 인간 ASCT2 유전자에 대해서는 EL3 후방의 NcoI 사이트를 소실하고, BamIII 사이트를 도입하며, 또한, 마우스 ASCT2 유전자에 대해서는 EL2 중 NcoI 사이트를 소실하였다. 1개소의 아미노산이 상위인 EL4에 대해서는, 변이 도입에 의해 인간 ASCT2 유전자를 마우스형으로 치환하였다. 각 변이체의 C 말단측에 myc/His 태그를 융합시킨 단백질의 유전자를 이하와 같이 하여 작성하여, CHO 세포에 도입하였다.
(1) 변이 인간 ASCT2 유전자의 구축
실시예 2에서 제작한 pCR4-SLC1A5-myc/His를 주형으로 하여, 서열 번호 63 및 서열 번호 64 기재의 염기 서열을 갖는 프라이머(0.1 ㎍/mL, 2.5 μL)와 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit에 첨부된 10× 반응 버퍼(5 μL), dNTP 혼합액(1 μL)을 포함하는 총량 50 μL로 이루어지는 용액에 PfuTubo DNA 폴리머라제(1 μL)를 가하고, 95℃에서 30초 동안 반응 후, 95℃에서 30초 동안, 55℃에서 1분 동안, 68℃에서 5분 동안의 3 공정을 1 사이클로 하여, 총 18 사이클로 이루어지는 PCR 반응을 행하며, 반응 종료 후에 1 μL의 DnpI을 가하여 37℃에서 1시간 반응시켰다. 반응 산물 2 μL를 이용하여 QuikChange Site-Directed Mutagenesis Kit에 첨부된 대장균 XL1-Blue주(스트라타진사 제조)를 형질전환하였다. 얻어진 형질전환체로부터 자동 플라스미드 추출기 PI-50(쿠라보사 제조)을 이용하여 플라스미드를 추출하고, 플라스미드 pCR4-hNco1KO_ASCT2-myc/His를 취득하였다. 이것을 주형으로 하여, 서열 번호 65 및 서열 번호 66 기재의 염기 서열을 갖는 프라이머(0.1 ㎍/mL, 2.5 μL)를 이용하여, 상기와 같은 방법으로 플라스미드 pCR4-hBam3KI_ASCT2-myc/His를 취득하였다. 취득한 플라스미드를 EcoRI(다카라바이오사 제조)과 KpnI(다카라바이오사 제조)으로 소화하고, QIAquick 겔 추출 키트를 이용하여 추출하며, 미리 EcoRI과 KpnI으로 소화한 pBluescriptII SK(-) 벡터(스트라타진사 제조)에, Ligation high(도요보세키사 제조)를 이용하여 연결한 후, 코엔 등의 방법[Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 69, 2110 (1972)]에 의해 대장균 DH5α주(도요보세키사 제조)를 형질전환하고, 상기와 같은 방법으로, 플라스미드 pBluescriptII SK(-)hBam3KI_ASCT2-myc/His를 취득하였다.
(2) 변이 마우스 ASCT2 유전자의 구축
실시예 10에서 제작한 pBluescriptII SK(-)-Mouse_ASCT2-myc/His를 주형으로 하고, 서열 번호 67 및 서열 번호 68 기재의 염기 서열을 갖는 프라이머를 이용하여, 실시예 11 (1)과 같은 방법으로, 플라스미드 pBluescriptII SK(-)-mNcoKO_ASCT2-myc/His를 취득하였다.
(3) 마우스/인간 키메라 ASCT2/CHO의 조성
(1) 및 (2)에서 얻은 플라스미드로 dam-의 대장균주(카탈로그 번호: C2925, 뉴잉글랜드 바이오래버러토리사 제조)를 재차 형질전환하여 취득한 플라스미드를, EcoRI(다카라바이오사 제조) 및 BclI(FbaI와 동일, 다카라바이오사 제조)으로 소화하고, 인간 ASCT2 유전자를 포함하는 플라스미드를 벡터로 하며, 마우스 ASCT2 유전자를 인서트로서 연결시켜, 대장균 DH5α주를 형질전환하고, EL1이 마우스형으로 치환된 플라스미드 pBluescriptII SK(-)-mEL1_ASCT2-myc/His를 취득하였다. 마찬가지로, BclI 및 NcoI 사이트에서의 재조합으로, EL2가 마우스형으로 치환된 플라스미드 pBluescriptII SK(-)-mEL2_ASCT2-myc/His를, NcoI 및 BamIII 사이트에서의 재조합으로, EL3가 마우스형로 치환된 플라스미드 pBluescriptII SK(-)-mEL3_ASCT2-myc/His를 취득하였다.
(1)에서 취득한 pBluescriptII SK(-) hBam3KI_ASCT2-myc/His를 주형으로 하고, 서열 번호 69 및 서열 번호 70 기재의 염기 서열을 갖는 프라이머를 이용하여, 실시예 11 (1)과 같은 방법으로, EL4가 마우스형으로 치환된 플라스미드 pBluescriptII SK(-)-mEL4_ASCT2-myc/His를 취득하였다.
얻어진 pBluescriptII SK(-)-mEL1_ASCT2-myc/His, pBluescriptII SK(-)-mEL2_ASCT2-myc/His, pBluescriptII SK(-)-mEL3_ASCT2-myc/His 및 pBluescriptII SK(-)-mEL4_ASCT2-myc/His를 EcoRI(다카라바이오사 제조)과 KpnI(다카라바이오사 제조)으로 소화하고, 상기와 마찬가지로 유전자 단편을 추출하여, 미리 EcoRI과 KpnI으로 소화한 pKANTEX93 벡터(WO97/10354)에 연결하며, 대장균 DH5α주(도요보세키사 제조)를 형질전환하여, 형질전환체를 얻은 후, 플라스미드 추출 키트(퀴아젠사 제조)를 이용하여 발현 플라스미드 pKANTEX-mEL1_ASCT2-myc/His, pKANTEX-mEL2_ASCT2-myc/His, pKANTEX-mEL3_ASCT2-myc/His 및 pKANTEX-mEL4_ASCT2-myc/His를 각각 취득하였다.
pKANTEX-mEL1_ASCT2-myc/His, pKANTEX-mEL2_ASCT2-myc/His, pKANTEX-mEL3_ASCT2-myc/His 및 pKANTEX-mEL4_ASCT2-myc/His는 전기천공법에 의해, 실시예 10과 같은 방법으로 CHO/DG44 세포에 도입하고, 마우스 EL1형 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포주(이하, mEL1/CHO로 표기), 마우스 EL2형 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포주(이하, mEL2/CHO로 표기), 마우스 EL3형 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포주(이하, mEL3/CHO로 표기) 및 마우스 EL4형 ASCT2-myc/His 유전자 도입 CHO 세포주(이하, mEL4/CHO로 표기)를 각각 취득하였다.
실시예 12
마우스 ASCT2/CHO 및 마우스/인간 키메라 ASCT2/CHO에 대한 항ASCT2 모노클로날 항체의 반응성
실시예 10 및 실시예 11에서 제작한 마우스 ASCT2/CHO 및 마우스/인간 키메라 ASCT2/CHO 세포를 이용하여, 실시예 9(1)과 같은 방법으로, 2차 항체로서 FITC 표지 항마우스 면역글로불린 G(H+L)(다코사 제조) 또는 ALEXA488 표지 항래트 면역글로불린 G(G+L)(인비트로젠사 제조)를 이용하여, 항ASCT2 모노클로날 항체 KM4008, KM4012 및 KM4018의 반응성을 측정하였다.
측정 결과를 표 2에 나타내었다. 표 2에 있어서, 반응성 있음을 + 표시로, 반응성 없음을 - 표시로, 반응성 저하를 ± 표시로 각각 나타낸다. 표 2에 나타낸 바와 같이, 항ASCT2 모노클로날 항체 KM4008, KM4012 및 KM4018은 모두 마우스 ASCT2에는 반응하지 않았다. 또한, KM4008 및 KM4012에서는, mEL2/CHO에 대하여 반응성의 저하가 확인되었다. 한편, KM4018에서는, mEL2/CHO에 대해서는 반응하지 않고, mEL1/CHO 및 mEL3/CHO에 대하여 반응성의 저하가 확인되었다.
이상의 결과로부터, 항ASCT2 모노클로날 항체 KM4008 및 KM4012는 EL2를, 항ASCT2 모노클로날 항체 KM4018은 EL1, EL2 및 EL3으로 이루어지는 입체 구조를 인식하여 결합하는 것이 명백해졌다.
Figure pct00002
실시예 13
항ASCT2 인간화 항체의 제작
(1) 항ASCT2 인간화 항체의 VH 및 VL의 아미노산 서열의 설계
항ASCT2 인간화 항체의 VH의 아미노산 서열을 이하와 같이 하여 설계하였다.
처음에, 실시예 7 (3)에서 얻어진, 서열 번호 26∼28로 각각 표시되는 KM4008VH의 CDR1∼3의 아미노산 서열을 이식하기 위한 인간 항체의 VH의 FR의 아미노산 서열을 선택하였다. 서열 해석 시스템으로서 GCG Package(제네틱 컴퓨터그룹사 제조)를 이용하여, 기존 단백질의 아미노산 데이터베이스를 BLASTP법[Nucleic Acid Res., 25, 3389 (1997)]에 의해 KM4008과 상동성이 높은 인간 항체를 검색하였다. 상동성 스코어와 실제 아미노산 서열의 상동성을 비교한 바, SWISSPROT 데이터베이스 수탁 번호: BAC01342, 면역글로불린 중쇄 VHDJ 영역(이하, BAC01342로 표기)이 77.0%를 나타내고, 가장 상동성이 높은 인간 항체이기 때문에, 이 항체의 FR의 아미노산 서열을 선택하였다.
이상과 같이 하여 결정한 인간 항체의 FR의 아미노산 서열의 적절한 위치에 서열 번호 26∼28로 표시된 KM4008의 VH의 CDR의 아미노산 서열을 이식하였다. 이와 같이 하여, 서열 번호 71로 표시되는 항ASCT2 인간화 항체의 VH의 아미노산 서열 HV0를 설계하였다.
다음에, 항ASCT2 인간화 항체의 VL의 아미노산 서열을 이하와 같이 하여 설계하였다.
실시예 7 (3)에서 얻어진, 서열 번호 29∼31로 각각 표시되는 KM4008VL의 CDR1∼3의 아미노산 서열을 이식하기 위한 인간 항체의 VL의 FR의 아미노산 서열을 선택하였다. 카밧 등은, 기지의 여러 가지 인간 항체의 VL을 그 아미노산 서열의 상동성으로부터 서브그룹(HSG I∼IV)으로 분류하고, 이들의 서브그룹마다 공통 서열을 보고하고 있다[Sequences of Proteins of I㎜unological Interest, US Dept. Health and Human Services (1991)]. 그래서, 인간 항체의 VL의 서브그룹 I∼IV의 공통 서열의 FR의 아미노산 서열과 KM4008의 VL의 FR의 아미노산 서열과의 상동성 검색을 실시하였다.
상동성을 검색한 결과, HSG I, HSG II, HSG III 및 HSG IV의 상동성은 각각 77.5%, 60.0%, 63.8%, 및 68.8%였다. 따라서 KM4008VL의 FR의 아미노산 서열은 서브그룹 I과 가장 높은 상동성을 갖고 있었다.
이상의 결과로부터, 인간 항체의 VL의 서브그룹 I의 공통서열의 FR의 아미노산 서열의 적절한 위치에 KM4008의 VL의 CDR의 아미노산 서열을 이식하였다. 그러나, 서열 번호 21로 표시되는 KM4008의 VL의 아미노산 서열 중 124번째의 Leu은, 카밧 등이 드는 인간 항체 FR의 아미노산 서열의 상당하는 부위에 있어서, 가장 사용되는 빈도가 높은 아미노산 잔기가 아니지만, 비교적 높은 빈도로 사용되는 아미노산 잔기이기 때문에, 상기한 KM4008의 아미노산 서열로 확인되는 아미노산 잔기를 이용하는 것으로 하였다. 이와 같이 하여, 서열 번호 72로 표시되는 항ASCT2 인간화 항체의 VL의 아미노산 서열 LV0을 설계하였다.
상기에서 설계한 항ASCT2 인간화 항체의 VH의 아미노산 서열 HV0 및 VL의 아미노산 서열 LV0은, 선택한 인간 항체의 FR의 아미노산 서열에 항ASCT2 마우스 모노클로날 항체 KM4008의 CDR의 아미노산 서열만을 이식한 서열이다. 그러나, 일반적으로, 인간화 항체를 제작하는 경우에는, 단순한 인간 항체의 FR에의 마우스 항체의 CDR의 아미노산 서열의 이식만으로는 결합 활성이 저하되어 버리는 경우가 많다. 이 때문에, 결합 활성의 저하를 방지하기 위해, CDR의 아미노산 서열의 이식과 함께, 인간 항체와 마우스 항체에서 상이한 FR의 아미노산 잔기 중, 결합 활성에 영향을 부여하는 것으로 생각되는 아미노산 잔기를 개변하는 것이 행해지고 있다. 그래서, 본 실시예에서도, 결합 활성에 영향을 부여하는 것으로 생각되는 FR의 아미노산 잔기를 이하와 같이 하여 확인하였다.
우선, 상기에서 설계한 항ASCT2 인간화 항체의 VH의 아미노산 서열 HV0 및 VL의 아미노산 서열 LV0으로 이루어지는 항체 V 영역(이하, HV0LV0로 나타냄)의 3차원 구조를 컴퓨터 모델링의 방법을 이용하여 구축하였다. 3차원 구조 좌표 제작 및 3차원 구조의 표시에는, Discovery Studio(액셀리스사 제조)를 첨부 사용설명서에 따라, 이용하였다. 또한, 항ASCT2 마우스 모노클로날 항체 KM4008의 V 영역의 3차원 구조의 컴퓨터 모델도 마찬가지로 하여 구축하였다. 또한, HV0LV0의 VH 및 VL의 FR의 아미노산 서열 중에서, KM4008과 상이한 아미노산 잔기를 선택하고, KM4008의 아미노산 잔기로 개변한 아미노산 서열을 제작하여, 마찬가지로 3차원 구조 모델을 구축하였다. 이들 제작한 KM4008, HV0LV0 및 개변체의 V 영역의 3차원 구조를 비교하여, 항체의 결합 활성에 영향을 부여하는 것으로 예측되는 아미노산 잔기를 동정하였다.
그 결과, HV0LV0의 FR의 아미노산 잔기 중에서 항원 결합 부위의 3차원 구조를 변화시켜, 항체의 결합 활성에 영향을 부여하는 것으로 생각되는 아미노산 잔기로서, HV0에서는 2번째의 Val, 9번째의 Ser, 20번째의 Val, 30번째의 Ser, 38번째의 Arg, 46번째의 Glu, 86번째의 Leu, 93번째의 Val, 95번째의 Tyr, 및 116번째의 Val을, LV0에서는 8번째의 Pro, 15번째의 Val, 38번째의 Gln, 43번째의 Ala, 44번째의 Pro, 71번째의 Phe 및 87번째의 Tyr을 각각 선택하였다.
이들 선택한 아미노산 잔기 중, 적어도 하나 이상의 아미노산 서열을 KM4008의 동일한 부위에 존재하는 아미노산 잔기로 개변하고, 여러 가지 개변을 갖는 인간화 항체의 VH 및 VL을 설계하였다. 구체적으로는 VH에 대해서는, 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열의 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환하는 아미노산 개변 중 하나 이상의 개변을 도입하였다. 또한, VL에 대해서는, 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열의 8번째의 Pro을 Thr으로, 15번째의 Val을 Leu으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환하는 아미노산 개변 중 하나 이상의 개변을 도입하였다.
그 결과, HV0LV0의 FR에 존재하는 하나 이상의 아미노산 잔기를 개변한 항ASCT2 인간화 항체의 항체 V 영역으로서, HV0LV3, HV2LV0, HV2LV3, HV4LV0, HV4LV3, HV7LV0, HV7LV3, HV10LV0 및 HV10LV3을 각각 설계하였다. H쇄 가변 영역 HV2, HV4, HV7, HV10 및 L쇄 가변 영역 LV3의 아미노산 서열을, 각각 서열 번호 76, 78, 80, 82 및 84로 표시하였다.
(2) 항ASCT2 인간화 항체의 제작
항ASCT2 인간화 항체의 가변 영역의 아미노산 서열을 코드하는 DNA는, KM4008의 VH 또는 VL의 아미노산 서열을 코드하는 DNA에서 이용되고 있는 코돈을 이용하여, 아미노산 개변을 행하는 경우는, 포유동물 세포에서 고빈도로 사용되는 코돈을 이용하여 제작하였다. 항ASCT2 인간화 항체의 HV0및 LV0의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 서열 번호 73, 74로 각각 표시하고 또한, 아미노산 개변을 행한 가변 영역 HV2, HV4, HV7, HV10 및 LV3의 아미노산 서열을 코드하는 DNA 서열을 서열 번호 75, 77, 79, 81 및 83로 각각 표시하였다.
이들 DNA 서열을 이용하여, 실시예 8과 같은 방법으로써 인간화 항체의 발현 벡터의 구축 및 인간화 항체의 발현을 각각 행하였다.
본 발명에 의하면, 시스템 ASC 아미노산 트랜스포터 2(ASCT2)의 세포외 영역의 천연형 입체 구조를 특이적으로 인식하고 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편, 상기 항체를 생산하는 하이브리도마, 상기 항체를 코드하는 DNA, 상기 DNA를 포함하는 벡터, 상기 벡터를 형질전환하여 얻어지는 형질전환체, 상기 하이브리도마 또는 상기 형질전환체를 이용하는 항체 또는 그 항체 단편의 제조 방법, 상기 항체 또는 그 항체 단편을 이용하는 치료약, 및 상기 항체 또는 그 항체 단편을 이용하는 진단약을 제공할 수 있다.
서열표 프리텍스트
서열 번호 3-인공 서열의 설명: ASCT2 프라이머(Fw#1)
서열 번호 4-인공 서열의 설명: ASCT2 프라이머(Rv#1)
서열 번호 5-인공 서열의 설명: ASCT2-myc/His 서열
서열 번호 6-인공 서열의 설명: ASCT2-myc/His 서열
서열 번호 7-인공 서열의 설명: N-ASCT2 프라이머(#1) 서열
서열 번호 8-인공 서열의 설명: N-ASCT2 프라이머(#2) 서열
서열 번호 9-인공 서열의 설명: N-ASCT2 프라이머(#3) 서열
서열 번호 10-인공 서열의 설명: N-ASCT2 프라이머(#4) 서열
서열 번호 11-인공 서열의 설명: C-ASCT2-myc/His 프라이머(Fw#2) 서열
서열 번호 12-인공 서열의 설명: C-ASCT2-myc/His 프라이머(Rv#2) 서열
서열 번호 13-인공 서열의 설명: C-ASCT2-myc/His 프라이머(Rv#3) 서열
서열 번호 14-인공 서열의 설명: ASCT2 펩티드(2-16, Cys) 서열
서열 번호 15-인공 서열의 설명: 프라이머(mG3a2) 서열
서열 번호 16-인공 서열의 설명: 프라이머(mG2ba1) 서열
서열 번호 17-인공 서열의 설명: 프라이머(mKa1) 서열
서열 번호 38-인공 서열의 설명: cKM4008VH/cKW4012VH 프라이머(Fw) 서열
서열 번호 39-인공 서열의 설명: cKM4008VH 프라이머(Rv) 서열
서열 번호 40-인공 서열의 설명: cKM4008VL/cKM4012VL 프라이머(Fw) 서열
서열 번호 41-인공 서열의 설명: cKM4008VL/cKM4012VL 프라이머(Rv) 서열
서열 번호 42-인공 서열의 설명: cKM4012VH 프라이머(Rv) 서열
서열 번호 43-인공 서열의 설명: 프라이머(rG2a) 서열
서열 번호 44-인공 서열의 설명: 프라이머(rKa2) 서열
서열 번호 55-인공 서열의 설명: cKM4018VH 프라이머(Fw) 서열
서열 번호 56-인공 서열의 설명: cKM4018VH 프라이머(Rv) 서열
서열 번호 57-인공 서열의 설명: cKM4018VL 프라이머(Fw) 서열
서열 번호 58-인공 서열의 설명: cKM4018VL 프라이머(Rv) 서열
서열 번호 59-인공 서열의 설명: 마우스 ASCT2-myc/His 서열
서열 번호 60-인공 서열의 설명: 마우스 ASCT2-myc/His 서열
서열 번호 61-인공 서열의 설명: 마우스 ASCT2-myc/His 프라이머(Fw) 서열
서열 번호 62-인공 서열의 설명: 마우스 ASCT2-myc/His 프라이머(Rv) 서열
서열 번호 63-인공 서열의 설명: 인간 ASCT2 NcoI 사이트 변이 도입용 프라이머(Fw) 서열
서열 번호 64-인공 서열의 설명: 인간 ASCT2 NcoI 사이트 변이 도입용 프라이머(Rv) 서열
서열 번호 65-인공 서열의 설명: 인간 ASCT2 BamIII 사이트 도입용 프라이머(Fw) 서열
서열 번호 66-인공 서열의 설명: 인간 ASCT2 BamIII 사이트 도입용 프라이머(Rv) 서열
서열 번호 67-인공 서열의 설명: 마우스 ASCT2 NcoI 사이트 변이 도입용 프라이머(Fw) 서열
서열 번호 68-인공 서열의 설명: 마우스 ASCT2 NcoI 사이트 변이 도입용 프라이머(Rv) 서열
서열 번호 69-인공 서열의 설명: 인간 ASCT2 EL4 마우스형 치환용 프라이머(Fw) 서열
서열 번호 70-인공 서열의 설명: 인간 ASCT2 EL4 마우스형 치환용 프라이머(Rv) 서열
서열 번호 71-인공 서열의 설명: KM4008 HV0 서열
서열 번호 72-인공 서열의 설명: KM4008 LV0 서열
서열 번호 73-인공 서열의 설명: KM4008 HV0 서열
서열 번호 74-인공 서열의 설명: KM4008 LV0 서열
서열 번호 75-인공 서열의 설명: HV2 서열
서열 번호 76-인공 서열의 설명: HV2 서열
서열 번호 77-인공 서열의 설명: HV4 서열
서열 번호 78-인공 서열의 설명: HV4 서열
서열 번호 79-인공 서열의 설명: HV7 서열
서열 번호 80-인공 서열의 설명: HV7 서열
서열 번호 81-인공 서열의 설명: HV10 서열
서열 번호 82-인공 서열의 설명: HV10 서열
서열 번호 83-인공 서열의 설명: LV3 서열
서열 번호 84-인공 서열의 설명: LV3 서열
SEQUENCE LISTING <110> Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. <120> Anti system ASC amino acid transpoter 2 (ASCT2) antibody <130> 1001P11977 <150> JP 2008-185790 <151> 2008-07-17 <160> 86 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 2856 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> CDS <222> (591)..(2216) <223> ASCT2 nucleotide sequence: GenBank Accession number NM_005628 <400> 1 gtaaccgcta ctcccggaca ccagaccacc gccttccgta cacaggggcc cgcatcccac 60 cctcccggac ctaagagcct gggtcccctg tttccggagg tccgcttccc ggcccccaga 120 ttctggcatc ccagccctca gtgtccaaga cccaggcagc ccgggtcccc gcctcccgga 180 tccaggcgtc cgggatctgc gccaccagaa cctagcctcc tgcagacctc cgccatctgg 240 gggcactcaa cctcctggag ccaagggccc cacgtcccac ccagagaaac tctcgtattc 300 ccagctccta gggccaagga acccgggcgc tccgaactcc cagctttcgg acatctggca 360 cacggggcag agcagagaag ctcagcgccc agcctgggga atttaaacac tccagcttcc 420 aagagccaag gaacttcagt gctgtgaact cacaactcta aggagccctc caaagttcca 480 gtctccaggt gctgttactc aactcagtcc taggaacgtc gggtcctggg aaggagccca 540 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Artificial sequence: C-ASCT2-myc/His primer (Fw#2) sequence <400> 11 ctggaccccg gcgcgctcgg 20 <210> 12 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial sequence: C-ASCT2-myc/His primer (Rv#2) sequence <400> 12 cgatggtacc tcaatggtga tggtgatgat gaccggtatg catattcaga tcctcttctg 60 agatgagttt ttgttccatg actgattcct tctcagaggc gaccgtggca tcccctgcgg 120 <210> 13 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial sequence: C-ASCT2-myc/His primer (Rv#3) sequence <400> 13 ggactagtgc ggccgcgatg gtacctcaat ggtgatggtg 40 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial sequence: ASCT2 peptide (2-16, Cys) sequence <400> 14 Val Ala Asp Pro Pro Arg Asp Ser Lys Gly Leu Ala Ala Ala Glu Cys 1 5 10 15 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial sequence: primer (mG3a2) sequence <400> 15 ctggacaggg ctccatagtt ccatt 25 <210> 16 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial sequence: primer (mG2ba1) sequence <400> 16 ttgaccaggc atcccagagt cacggaggaa 30 <210> 17 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial sequence: primer (mKa1) sequence <400> 17 ctaacactca ttcctgttga agctcttgac aa 32 <210> 18 <211> 417 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(417) <223> KM4008VH nucleotide sequence <400> 18 atg ggt tgg ctg tgg aac ttg cta ttc ctg atg gca gct gcc caa agt 48 Met Gly Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 gcc caa gca cag atc cag ttg gta cag tct gga cct gag ctg aag aag 96 Ala Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30 cct gga gag aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct ggg tat acc ttc 144 Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 aca acc ttt gga atg agc tgg gtg aaa cag gtt cca gga aag ggt tta 192 Thr Thr Phe Gly Met Ser Trp Val Lys Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 aag tgg atg ggc tgg ata cac acc tac gct gga gtg cca ata tat ggt 240 Lys Trp Met Gly Trp Ile His Thr Tyr Ala Gly Val Pro Ile Tyr Gly 65 70 75 80 gat gac ttc aag gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct gcc agc 288 Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser 85 90 95 act gcc tat ttg cag atc aac aac gtc aaa aat gag gac acg gct aca 336 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Val Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 tat ttc tgt gca cga cgt tcg gat aat tac cgt tat ttt ttt gac tat 384 Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Ser Asp Asn Tyr Arg Tyr Phe Phe Asp Tyr 115 120 125 tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tcg 417 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 19 <211> 139 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(139) <223> KM4008VH peptide sequence <400> 19 Met Gly Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Ala Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Thr Phe Gly Met Ser Trp Val Lys Gln Val Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Lys Trp Met Gly Trp Ile His Thr Tyr Ala Gly Val Pro Ile Tyr Gly 65 70 75 80 Asp Asp Phe Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Ala Ser 85 90 95 Thr Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Val Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Ser Asp Asn Tyr Arg Tyr Phe Phe Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 20 <211> 384 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(384) <223> KM4008VL nucleotide sequence <400> 20 atg atg tcc tct gct cgg ttc ctt ggt ctc ctg ttg ctc tgc ttt caa 48 Met Met Ser Ser Ala Arg Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln 1 5 10 15 ggt acc aga tgt gat atc cag atg aca cag act aca tcc tcc ctg tct 96 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser 20 25 30 gcc tct ctg gga gac aga gtc acc atc agt tgc agg gca agt cag gac 144 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 att agg aat tat tta aac tgg tat caa cgt aaa cca cat gga act gtt 192 Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Pro His Gly Thr Val 50 55 60 aaa ctc ctg atc tac tac aca tca aga tta cac tca gga gtc ccg tca 240 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 agg ttc agt ggc agt ggg tct gga aca gat tat tct ctc acc att agc 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 85 90 95 aac ctg gaa caa gaa gat att gcc act tac ttt tgc caa cag ggt cat 336 Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His 100 105 110 acg ctt cct ccg acg ttc ggt gga ggc acc aag ttg gaa atc aaa cgg 384 Thr Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 <210> 21 <211> 128 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(128) <223> KM4008VL peptide sequence <400> 21 Met Met Ser Ser Ala Arg Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln 1 5 10 15 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Arg Lys Pro His Gly Thr Val 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly His 100 105 110 Thr Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 <210> 22 <211> 417 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(417) <223> KM4012VH nucleotide sequence <400> 22 atg ggt tgg ctg tgg aac ttg cta ttc ctg atg gca gct gcc caa agt 48 Met Gly Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 gcc caa gca cag atc cag ttg gta cag tct gga cct gag ctg aag aag 96 Ala Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30 cct gga gag aca gtc aag atc tcc tgc aag gct tct gga tat acc ttc 144 Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 acg acc tat gga atg agc tgg gtg aaa cag act cca gga aag ggt tta 192 Thr Thr Tyr Gly Met Ser Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 aag tgg atg ggc tgg ata cac acc tac tct gga gtg cca ata tat ggt 240 Lys Trp Met Gly Trp Ile His Thr Tyr Ser Gly Val Pro Ile Tyr Gly 65 70 75 80 gat gac tcc aag gga cgg ttt gcc ttc tct ttg gaa acc tct ggc agc 288 Asp Asp Ser Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Gly Ser 85 90 95 att gcc tat ttg cag atc aac aac gtc aaa aat gag gac acg gct aca 336 Ile Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Val Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 tat ttc tgt gca aga cgt tcg gat ggt tac cgt tac ttc ttt gac tat 384 Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Ser Asp Gly Tyr Arg Tyr Phe Phe Asp Tyr 115 120 125 tgg ggc caa ggc acc act ctc aca gtc tcc tca 417 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 23 <211> 139 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(139) <223> KM4012VH peptide sequence <400> 23 Met Gly Trp Leu Trp Asn Leu Leu Phe Leu Met Ala Ala Ala Gln Ser 1 5 10 15 Ala Gln Ala Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys 20 25 30 Pro Gly Glu Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe 35 40 45 Thr Thr Tyr Gly Met Ser Trp Val Lys Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu 50 55 60 Lys Trp Met Gly Trp Ile His Thr Tyr Ser Gly Val Pro Ile Tyr Gly 65 70 75 80 Asp Asp Ser Lys Gly Arg Phe Ala Phe Ser Leu Glu Thr Ser Gly Ser 85 90 95 Ile Ala Tyr Leu Gln Ile Asn Asn Val Lys Asn Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 Tyr Phe Cys Ala Arg Arg Ser Asp Gly Tyr Arg Tyr Phe Phe Asp Tyr 115 120 125 Trp Gly Gln Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser 130 135 <210> 24 <211> 384 <212> DNA <213> Mus musculus <220> <221> CDS <222> (1)..(384) <223> KM4012VL nucleotide sequence <400> 24 atg atg tcc tct gct cag ttc ctt ggt ctc ctg ttg ctc tgc ttt caa 48 Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln 1 5 10 15 ggt acc aga tgt gat atc cag atg aca cag att aca tcc tcc ctg tct 96 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ile Thr Ser Ser Leu Ser 20 25 30 gcc tct ctg gga gac aga gtc acc atc agt tgc agg gca agt cag gac 144 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 att agg aat tat tta aac tgg tat cag cag aaa cca gat gga act gtt 192 Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val 50 55 60 aaa ctc ctg atc tac tac aca tca aga tta cac tca gga gtc cca tca 240 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 agg ttc agt ggc agt ggg tct gga aca gat tat tct ctc acc att agc 288 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 85 90 95 aac ctg gaa caa gaa gat att gcc act tac ttt tgc caa cag ggt aat 336 Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn 100 105 110 acg ctt cct ccg acg ttc ggt gga ggc acc aag ttg gaa atc aaa cgg 384 Thr Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 <210> 25 <211> 128 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(128) <223> KM4012VL peptide sequence <400> 25 Met Met Ser Ser Ala Gln Phe Leu Gly Leu Leu Leu Leu Cys Phe Gln 1 5 10 15 Gly Thr Arg Cys Asp Ile Gln Met Thr Gln Ile Thr Ser Ser Leu Ser 20 25 30 Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp 35 40 45 Ile Arg Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val 50 55 60 Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser 65 70 75 80 Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser 85 90 95 Asn Leu Glu Gln Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn 100 105 110 Thr Leu Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg 115 120 125 <210> 26 <211> 5 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(5) <223> KM4008H CDR1 peptide sequence <400> 26 Thr Phe Gly Met Ser 1 5 <210> 27 <211> 17 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(17) <223> KM4008 CDR2 peptide sequence <400> 27 Trp Ile His Thr Tyr Ala Gly Val Pro Ile Tyr Gly Asp Asp Phe Lys 1 5 10 15 Gly <210> 28 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> KM4008H CDR3 peptide sequence <400> 28 Arg Ser Asp Asn Tyr Arg Tyr 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<400> 34 Arg Ser Asp Gly Tyr Arg Tyr Phe Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 35 <211> 11 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(11) <223> KM4012L CDR1 peptide sequence <400> 35 Arg Ala Ser Gln Asp Ile Arg Asn Tyr Leu Asn 1 5 10 <210> 36 <211> 7 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(7) <223> KM4012L CDR2 peptide sequence <400> 36 Tyr Thr Ser Arg Leu His Ser 1 5 <210> 37 <211> 9 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(9) <223> KM4012L CDR3 peptide sequence <400> 37 Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Pro Thr 1 5 <210> 38 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial sequence: cKM4008VH/c4012VH primer (Fw) sequence <400> 38 aaaagcggcc gcccactgag cccaagtctt agacatcatg 40 <210> 39 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial sequence: cKM4008VH primer (Rv) sequence <400> 39 cgatgggccc ttggtggaag ccgaggagac tgtgagagtg 40 <210> 40 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial sequence: cKM4008VL/cKM4012VL primer (Fw) sequence <400> 40 ccggaattca ttgaagtcaa gactcagcct ggacatgatg 40 <210> 41 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial sequence: cKM4008VL/cKM4012VL primer (Rv) sequence <400> 41 ccaccgtacg tttgatttcc aacttggtgc ctccaccgaa 40 <210> 42 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial sequence: cKM4012VH primer (Rv) sequence <400> 42 cgatgggccc ttggtggagg ctgaggagac tgtgagagtg 40 <210> 43 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial sequence: primer (rG2a) sequence <400> 43 ccacaaggat tgcattccct tggcac 26 <210> 44 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Description of Artificial sequence: primer (rKa2) sequence <400> 44 cctgttgaag ctcttgacga cgggtgagg 29 <210> 45 <211> 426 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1)..(426) <223> KM4018VH nucleotide sequence <400> 45 atg gac atc agg ctc agc ttg gct ttc ctt gtc ctt ttc ata aaa ggt 48 Met Asp Ile Arg Leu Ser Leu Ala Phe Leu Val Leu Phe Ile Lys Gly 1 5 10 15 gtc cag tgt gag gtg cag ctg gtg gag tct ggg gga ggc tta gtg cag 96 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 tct gga agg tcc ata aga ctc tcc tgt gca gcc tca gga ttc tct ttc 144 Ser Gly Arg Ser Ile Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe 35 40 45 agt aac tat tac atg gcc tgg gtc cgc cag gct cca tcg aag ggt ctg 192 Ser Asn Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Ser Lys Gly Leu 50 55 60 gag tgg gtc gca tcc att act aaa ggt ggt ggt aat act tac tat cga 240 Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Lys Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg 65 70 75 80 gac tcc gtg aag ggc cga ttc act ttc tcc aga gat aat gca aaa agc 288 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser 85 90 95 acc cta tat ttg caa atg gac agt ctg agg tct gag gac acg gcc act 336 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 tat tac tgt gca aga cag gtt act ata gca gct gta tct acc tcc tac 384 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Val Thr Ile Ala Ala Val Ser Thr Ser Tyr 115 120 125 ttt gat tcc tgg ggc caa gga gtc atg gtc aca gtc tcc tca 426 Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 46 <211> 142 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(142) <223> KM4018VH peptide sequence <400> 46 Met Asp Ile Arg Leu Ser Leu Ala Phe Leu Val Leu Phe Ile Lys Gly 1 5 10 15 Val Gln Cys Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln 20 25 30 Ser Gly Arg Ser Ile Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Ser Phe 35 40 45 Ser Asn Tyr Tyr Met Ala Trp Val Arg Gln Ala Pro Ser Lys Gly Leu 50 55 60 Glu Trp Val Ala Ser Ile Thr Lys Gly Gly Gly Asn Thr Tyr Tyr Arg 65 70 75 80 Asp Ser Val Lys Gly Arg Phe Thr Phe Ser Arg Asp Asn Ala Lys Ser 85 90 95 Thr Leu Tyr Leu Gln Met Asp Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Thr 100 105 110 Tyr Tyr Cys Ala Arg Gln Val Thr Ile Ala Ala Val Ser Thr Ser Tyr 115 120 125 Phe Asp Ser Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser 130 135 140 <210> 47 <211> 393 <212> DNA <213> Rattus norvegicus <220> <221> CDS <222> (1)..(393) <223> KM4018VL nucleotide sequence <400> 47 atg aag aca gac aca ctc ctg ctg tgg gct ctg ctg ctc tgg gtt cca 48 Met Lys Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Ala Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 ggt tgc act ggt gac att gtg ctg acc cag tct cct gct ttg gct gtg 96 Gly Cys Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val 20 25 30 tct cta ggg cag agg gcc acc atc tcc tgc aag acc aat cag aag gtc 144 Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Thr Asn Gln Lys Val 35 40 45 gat tat tat ggc aat agt tat gtg tac tgg tac caa cag aaa cca gga 192 Asp Tyr Tyr Gly Asn Ser Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 50 55 60 caa caa ccc aaa ctc ctc atc tat tta gca tcc aac tta gca tct ggg 240 Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly 65 70 75 80 atc cct gcc agg ttc agt ggt aga ggg tct ggg aca gac ttc acc ctc 288 Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 85 90 95 acc att gat cct gtg gag gct gat gat act gca acc tat tac tgt cag 336 Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 100 105 110 cag agt agg aat ctt ccg tac acg ttt gga gct ggg acc aag ctg gaa 384 Gln Ser Arg Asn Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu 115 120 125 ctg aaa cgg 393 Leu Lys Arg 130 <210> 48 <211> 131 <212> PRT <213> Rattus norvegicus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(131) <223> KM4018VL peptide sequence <400> 48 Met Lys Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Ala Leu Leu Leu Trp Val Pro 1 5 10 15 Gly Cys Thr Gly Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Leu Ala Val 20 25 30 Ser Leu Gly Gln Arg Ala Thr Ile Ser Cys Lys Thr Asn Gln Lys Val 35 40 45 Asp Tyr Tyr Gly Asn Ser Tyr Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly 50 55 60 Gln Gln Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Leu Ala Ser Asn Leu Ala Ser Gly 65 70 75 80 Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly Arg Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu 85 90 95 Thr Ile Asp Pro Val Glu Ala Asp Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln 100 105 110 Gln Ser Arg Asn Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Ala Gly Thr 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atc aat tca acc atg gtc cag ctt 1263 Pro Gln Ser Cys Ile Gln Arg Glu Ile Asn Ser Thr Met Val Gln Leu 225 230 235 ctc tgt gag gtg gag gga atg aac atc ctg ggc ctg gtg gtc ttc gct 1311 Leu Cys Glu Val Glu Gly Met Asn Ile Leu Gly Leu Val Val Phe Ala 240 245 250 atc gtc ttt ggt gtg gct ctg cgg aag ctg ggg ccc gag ggt gag ctg 1359 Ile Val Phe Gly Val Ala Leu Arg Lys Leu Gly Pro Glu Gly Glu Leu 255 260 265 ctc att cgt ttc ttc aac tcc ttc aat gat gcc acc atg gtc ctg gtc 1407 Leu Ile Arg Phe Phe Asn Ser Phe Asn Asp Ala Thr Met Val Leu Val 270 275 280 tcc tgg att atg tgg tac gca ccc gtt gga atc ctg ttc ctg gtg gcc 1455 Ser Trp Ile Met Trp Tyr Ala Pro Val Gly Ile Leu Phe Leu Val Ala 285 290 295 300 agc aag att gtg gag atg aaa gac gtc cgc cag ctc ttc atc agc ctc 1503 Ser Lys Ile Val Glu Met Lys Asp Val Arg Gln Leu Phe Ile Ser Leu 305 310 315 ggc aaa tac att ctg tgc tgc ctg ctg ggc cac gcc atc cac ggg ctc 1551 Gly Lys Tyr Ile Leu Cys Cys Leu Leu Gly His Ala Ile His Gly Leu 320 325 330 ctg gtt ctg 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Glu Ser Val Met 545 550 555 atatcaggag ggactttcta cgccctggtg acttcacgtt ggaagccggg tcttgcgagc 2283 tggagaaatg gactggatga gggctctagg ggtgggctgt ttacacactc caggaatcta 2343 ggggtcggtg tctccttcct ggagaggcta ttaggagcct tgttgctggg gtgcatatgc 2403 ttatatgtga atgtgtccac aaatcccacc ccctctccgt tctgtccccc attcaaggaa 2463 tgacattctc agtcacccag agccatctgg cctaccctct caggaaatgg gttgtcctgt 2523 agagttctct acccttttaa aggcaaaagt attgggatgc aatactatct taatgtccct 2583 atctgtggtg tgtgtgcact tgctgtgacc ttcccagtag tccctccatg acagaaaaca 2643 ctcccatgag tctcgaggga aagccaagaa taaatgtcac tccagaacac attttttttt 2703 agcaataaaa tggtgtcaaa tgtattgacc atggccctag agtctgagta atacc 2758 <210> 86 <211> 555 <212> PRT <213> Mus musculus <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(555) <223> ASCT2 peptide sequence: GenPept Accession number NP_033227 <400> 86 Met Ala Val Asp Pro Pro Lys Ala Asp Pro Lys Gly Val Val Ala Val 1 5 10 15 Asp Ser Thr Ala Asn Gly Gly Pro Ala Leu Gly Ser Arg Glu Asp Gln 20 25 30 Ser Ala Lys Ala Gly Gly Cys Cys Gly Ser Arg Asp Arg Val Arg Arg 35 40 45 Cys Ile Arg Ala Asn Leu Leu Val Leu Leu Thr Val Ala Ala Val Val 50 55 60 Ala Gly Val Gly Leu Gly Leu Gly Val Ser Ala Ala Gly Gly Ala Asp 65 70 75 80 Ala Leu Gly Pro Ala Arg Leu Thr Ala Phe Ala Phe Pro Gly Glu Leu 85 90 95 Leu Leu Arg Leu Leu Lys Met Ile Ile Leu Pro Leu Val Val Cys Ser 100 105 110 Leu Ile Gly Gly Ala Ala Ser Leu Asp Pro Ser Ala Leu Gly Arg Val 115 120 125 Gly Ala Trp Ala Leu Leu Phe Phe Leu Val Thr Thr Leu Leu Ala Ser 130 135 140 Ala Leu Gly Val Gly Leu Ala Leu Ala Leu Lys Pro Gly Ala Ala Val 145 150 155 160 Thr Ala Ile Thr Ser Ile Asn Asp Ser Val Val Asp Pro Cys Ala Arg 165 170 175 Ser Ala Pro Thr Lys Glu Val Leu Asp Ser Phe Leu Asp Leu Val Arg 180 185 190 Asn Ile Phe Pro Ser Asn Leu Val Ser Ala Ala Phe Arg Ser Phe Ala 195 200 205 Thr Ser Tyr Glu Pro Lys Asp Asn Ser Cys Lys Ile Pro Gln Ser Cys 210 215 220 Ile Gln Arg Glu Ile Asn Ser Thr Met Val Gln Leu Leu Cys Glu Val 225 230 235 240 Glu Gly Met Asn Ile Leu Gly Leu Val Val Phe Ala Ile Val Phe Gly 245 250 255 Val Ala Leu Arg Lys Leu Gly Pro Glu Gly Glu Leu Leu Ile Arg Phe 260 265 270 Phe Asn Ser Phe Asn Asp Ala Thr Met Val Leu Val Ser Trp Ile Met 275 280 285 Trp Tyr Ala Pro Val Gly Ile Leu Phe Leu Val Ala Ser Lys Ile Val 290 295 300 Glu Met Lys Asp Val Arg Gln Leu Phe Ile Ser Leu Gly Lys Tyr Ile 305 310 315 320 Leu Cys Cys Leu Leu Gly His Ala Ile His Gly Leu Leu Val Leu Pro 325 330 335 Leu Ile Tyr Phe Leu Phe Thr Arg Lys Asn Pro Tyr Arg Phe Leu Trp 340 345 350 Gly Ile Met Thr Pro Leu Ala Thr Ala Phe Gly Thr Ser Ser Ser Ser 355 360 365 Ala Thr Leu Pro Leu Met Met Lys Cys Val Glu Glu Lys Asn Gly Val 370 375 380 Ala Lys His Ile Ser Arg Phe Ile Leu Pro Ile Gly Ala Thr Val Asn 385 390 395 400 Met Asp Gly Ala Ala Leu Phe Gln Cys Val Ala Ala Val Phe Ile Ala 405 410 415 Gln Leu Asn Gly Val Ser Leu Asp Phe Val Lys Ile Ile Thr Ile Leu 420 425 430 Val Thr Ala Thr Ala Ser Ser Val Gly Ala Ala Gly Ile Pro Ala Gly 435 440 445 Gly Val Leu Thr Leu Ala Ile Ile Leu Glu Ala Val Ser Leu Pro Val 450 455 460 Lys Asp Ile Ser Leu Ile Leu Ala Val Asp Trp Leu Val Asp Arg Ser 465 470 475 480 Cys Thr Val Leu Asn Val Glu Gly Asp Ala Phe Gly Ala Gly Leu Leu 485 490 495 Gln Ser Tyr Val Asp Arg Thr Lys Met Pro Ser Ser Glu Pro Glu Leu 500 505 510 Ile Gln Val Lys Asn Glu Val Ser Leu Asn Pro Leu Pro Leu Ala Thr 515 520 525 Glu Glu Gly Asn Pro Leu Leu Lys Gln Tyr Gln Gly Pro Thr Gly Asp 530 535 540 Ser Ser Ala Thr Phe Glu Lys Glu Ser Val Met 545 550 555

Claims (44)

  1. 시스템 ASC 아미노산 트랜스포터 2(system ASC amino acid transpoter 2, 이하, ASCT2로 표기함)의 세포외 영역의 천연형 입체 구조를 특이적으로 인식하고 상기 세포외 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
  2. 제1항에 있어서, ASCT2를 통한 아미노산의 세포내 흡수를 저해하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 세포 상해 활성을 갖는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
  4. 제3항에 있어서, 세포 상해 활성이 항체 의존성 상해(ADCC) 활성 또는 보체 의존성 상해(CDC) 활성인 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 인간 ASCT2에 결합하고 마우스 ASCT2에 결합하지 않는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
  6. 제5항에 있어서, 인간 ASCT2의 세포외 영역 중 적어도 EL2 영역에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
  7. 제6항에 있어서, 서열 번호 2로 표시되는 아미노산 서열 중, 154번째, 159∼160번째, 163∼171번째, 173∼174번째, 177번째, 188번째, 204∼205번째, 207번째, 210∼212번째 및 214∼223번째 아미노산으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산에 결합하는 모노클로날 항체 또는 그 항체 단편.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체가 하이브리도마 KM4008(FERM BP-10962) 또는 하이브리도마 KM4012(FERM BP-10963) 중 어느 하나의 하이브리도마로부터 생산되는 모노클로날 항체가 인식하는 에피토프와 결합하는 모노클로날 항체인 항체 또는 그 항체 단편.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체가 하이브리도마 KM4008(FERM BP-10962) 또는 하이브리도마 KM4012(FERM BP-10963) 중 어느 하나의 하이브리도마로부터 생산되는 모노클로날 항체인 항체 또는 그 항체 단편.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 항체 단편이 Fab, Fab', F(ab')2, 단일쇄 항체(scFv), 이량체화 V 영역(디아바디), 디설파이드 안정화 V 영역(dsFv) 및 CDR을 포함하는 펩티드로부터 선택되는 항체 단편인 항체 단편.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 모노클로날 항체가 유전자 재조합 항체인 항체 또는 그 항체 단편.
  12. 제11항에 있어서, 유전자 재조합 항체가 인간형 키메라 항체, 인간화 항체 및 인간 항체로부터 선택되는 유전자 재조합 항체인 유전자 재조합 항체 또는 그 항체 단편.
  13. 제11항에 있어서, 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체의 중쇄 가변 영역(이하, VH로 표기함) 및 경쇄 가변 영역(이하, VL로 표기함)의 상보성 결정 영역(Complementarity Determining Region; 이하, CDR로 표기함)을 포함하는 유전자 재조합 항체 또는 그 항체 단편.
  14. 제13항에 있어서, 항체의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 26, 27 및 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 유전자 재조합 항체 또는 그 항체 단편.
  15. 제13항에 있어서, 항체의 VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 29, 30 및 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 유전자 재조합 항체 또는 그 항체 단편.
  16. 제13항에 있어서, 항체의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 26, 27 및 28로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 29, 30 및 31로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 유전자 재조합 항체 또는 그 항체 단편.
  17. 제13항에 있어서, 항체의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 32, 33 및 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 유전자 재조합 항체 또는 그 항체 단편.
  18. 제13항에 있어서, 항체의 VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 35, 36 및 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 유전자 재조합 항체 또는 그 항체 단편.
  19. 제13항에 있어서, 항체의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 32, 33 및 34로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 35, 36 및 37로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 유전자 재조합 항체 또는 그 항체 단편.
  20. 제13항에 있어서, 항체의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 49, 50 및 51로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 유전자 재조합 항체 또는 그 항체 단편.
  21. 제13항에 있어서, 항체의 VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 52, 53 및 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 유전자 재조합 항체 또는 그 항체 단편.
  22. 제13항에 있어서, 항체의 VH의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 49, 50 및 51로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VL의 CDR1, CDR2 및 CDR3이 각각 서열 번호 52, 53 및 54로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 것인 유전자 재조합 항체 또는 그 항체 단편.
  23. 제12항에 있어서, 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체의 VH 및 VL을 포함하는 인간형 키메라 항체 또는 그 항체 단편.
  24. 제23항에 있어서, 항체의 VH가 서열 번호 19로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 항체의 VL이 서열 번호 21로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체, 항체의 VH가 서열 번호 23으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 항체의 VL이 서열 번호 25로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체, 및 항체의 VH가 서열 번호 46으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하고 항체의 VL이 서열 번호 48로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간형 키메라 항체로부터 선택되는 인간형 키메라 항체 또는 그 항체 단편.
  25. 제12항에 있어서, 항체의 VH가 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 중 2번째의 Val, 9번째의 Ser, 20번째의 Val, 30번째의 Ser, 38번째의 Arg, 46번째의 Glu, 86번째의 Leu, 93번째의 Val, 95번째의 Tyr 및 116번째의 Val으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하고/하거나, 항체의 VL이 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열, 또는 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열 중 8번째의 Pro, 15번째의 Val, 38번째의 Gln, 43번째의 Ala, 44번째의 Pro, 71번째의 Phe 및 87번째의 Tyr으로부터 선택되는 하나 이상의 아미노산 잔기가 다른 아미노산 잔기로 치환된 아미노산 서열을 포함하는 것인 인간화 항체 또는 그 항체 단편.
  26. 제25항에 있어서, 항체의 VH가 서열 번호 71로 표시되는 아미노산 서열 중 2번째의 Val을 Ile으로, 9번째의 Ser을 Pro으로, 20번째의 Val을 Ile으로, 30번째의 Ser을 Thr으로, 38번째의 Arg을 Lys으로, 46번째의 Glu를 Lys으로, 86번째의 Leu을 Val으로, 93번째의 Val을 Thr으로, 95번째의 Tyr을 Phe으로, 116번째의 Val을 Leu으로 치환하는 개변으로부터 선택되는 하나 이상의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하고, 항체의 VL이 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열 중 8번째의 Pro을 Thr으로, 15번째의 Val을 Leu으로, 38번째의 Gln을 Arg으로, 43번째의 Ala을 Thr으로, 44번째의 Pro을 Val으로, 71번째의 Phe을 Tyr으로, 87번째의 Tyr을 Phe으로 치환하는 개변으로부터 선택되는 하나 이상의 개변이 도입된 아미노산 서열을 포함하는 것인 인간화 항체 또는 그 항체 단편.
  27. 제25항에 있어서, 항체의 VH가 서열 번호 76 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VH가 서열 번호 78 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VH가 서열 번호 80 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VH가 서열 번호 82 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 72로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VH가 서열 번호 71 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 84로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VH가 서열 번호 76 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 84로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VH가 서열 번호 78 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 84로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 항체의 VH가 서열 번호 80 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 84로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체, 및 항체의 VH가 서열 번호 82 및/또는 항체의 VL이 서열 번호 84로 표시되는 아미노산 서열을 포함하는 인간화 항체로부터 선택되는 것인 인간화 항체 또는 그 항체 단편.
  28. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 기재된 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마.
  29. 제28항에 있어서, 하이브리도마가 하이브리도마 KM4008(FERM BP-10962) 또는 하이브리도마 KM4012(FERM BP-10963)인 하이브리도마.
  30. 제1항 내지 제29항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체 단편을 코드하는 DNA.
  31. 제30항에 기재된 DNA를 함유하는 재조합체 벡터.
  32. 제31항에 기재된 재조합체 벡터를 숙주 세포에 도입하여 얻어지는 형질전환주.
  33. 제28항 또는 제29항에 기재된 하이브리도마, 또는 제32항에 기재된 형질전환주를 배지에서 배양하고, 배양물 중에 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체 단편을 생성 축적시켜, 배양물로부터 항체 또는 그 항체 단편을 채취하는 것을 특징으로 하는 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체 단편의 제조 방법.
  34. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체 단편을 유효 성분으로서 함유하는, ASCT2가 관여하는 질환의 치료약.
  35. 제34항에 있어서, ASCT2가 관여하는 질환이 암인 치료약.
  36. 제35항에 있어서, 암이 혈액암, 식도암, 위암, 대장암, 간암 또는 전립선암인 치료약.
  37. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체 단편을 이용하는, ASCT2의 면역학적 검출 또는 측정 방법.
  38. 제37항에 있어서, 면역학적 측정 방법이 면역침강법인 검출 또는 측정 방법.
  39. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체 단편을 이용하는, ASCT2가 발현되는 세포의 면역학적 검출 또는 측정 방법.
  40. 제39항에 있어서, 면역학적 검출 방법이 형광 세포 염색법인 검출 또는 측정 방법.
  41. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체 단편을 이용하는, ASCT2의 면역학적 검출용 또는 측정용 시약.
  42. 제1항 내지 제27항 중 어느 한 항에 기재된 항체 또는 그 항체 단편을 이용하는, ASCT2가 관여하는 질환의 진단약.
  43. 제42항에 있어서, ASCT2가 관여하는 질환의 진단약이 암인 진단약.
  44. 제43항에 있어서, 암이 혈액암, 식도암, 위암, 대장암, 간암 또는 전립선암인 진단약.
KR1020117001219A 2008-07-17 2009-07-17 항시스템 ａｓｃ 아미노산 트랜스포터 2(ａｓｃｔ2) 항체 KR20110031469A (ko)

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