KR20100124749A

KR20100124749A - 트리코데르마에서의 카탈라아제 발현

Info

Publication number: KR20100124749A
Application number: KR1020107019892A
Authority: KR
Inventors: 티모시 씨 닷지; 케서린 마리 호프만; 안드레이 미아스니코브; 마이클 워드
Original assignee: 다니스코 유에스 인크.
Priority date: 2008-03-07
Filing date: 2009-03-05
Publication date: 2010-11-29
Also published as: CN101960006A; JP2011515079A; AU2009223508A8; AU2009223508B2; US20140024098A1; MX2010009490A; CA2717799A1; JP5435812B2; US20110136197A1; AU2009223508A1; CN101960006B; BRPI0910252A2; EP2250257A1; WO2009114380A1; KR101768225B1

Abstract

본 발명은 트리코데르마 숙주 세포에서 카탈라아제 효소를 발현시키기 위한 방법을 제공한다. 한 구현예에서는, 아스퍼질루스 니게르로부터의 catR 유전자가 트리코데르마 레에세이에서 발현되어, A. 니게르에서의 catR 의 발현과 비교하여 향상된 수율의 카탈라아제 효소를 야기한다.

Description

트리코데르마에서의 카탈라아제 발현 {EXPRESSION OF CATALASE IN TRICHODERMA}

관련 출헌의 전후 참조

본 출원은 그 전문이 참고문헌으로 본원에 포함되는, 2008년 3월 7일에 출원한 미국 가출원 제 61/034,788 호에 대한 이득을 주장한다.

기술 분야

본 발명은 트리코데르마 숙주 세포에서의 카탈라아제 효소의 발현, 특히 트리코데르마 레에세이 (Trichoderma reesei) 에서의 아스퍼질루스 니게르 (Aspergillus niger) 로부터의 catR 유전자의 발현에 관한 것이다.

카탈라아제 [과산화수소:과산화수소 산화환원효소 (EC 1.11.1.6)] 는 하기와 같이 과산화수소 (H₂O₂) 를 산소 (O₂) 및 물 (H₂O) 로 전환시키는 것을 촉진하는 효소이다:

2 H₂O₂ → 2 H₂O + O₂

카탈라아제는 많은 동물 조직, 식물 및 미생물로부터 정제된다 (Chance and Maehly (1955) Methods in Enzymology 2:764-791; Jones and Wilson (1978) in H. Sigel (ed.), Metal Ions in Biological Systems, Vol. 7, Marcel Dekker Inc., New York). 분석된 대부분의 카탈라아제 효소는 네 가지 폴리펩티드 서브유닛을 함유하며, 각각은 50,000 내지 60,000 의 분자량을 가지고, 서브유닛 당 한 포로토헤민 보결기를 갖는다 (Wasserman and Hultin (1981) Arch. Biochem. Biophys. 212:385-392; Hartig and Ruis (1986) Eur. J. Biochem. 160:487-490). 소 간에서의 카탈라아제는 가장 광범위하게 연구된 효소이다 (Schonbaum and Chance (1976) in The Enzymes, P.D. Boyer, ed., 3rd edition, Vol. 13, pp. 363-408, Academic Press, New York). 소 간 카탈라아제의 완전한 아미노산 서열 및 3차원적 구조가 알려져 있다 (Schroeder et al. (1983) Arch. Biochem. Biophys. 214:397-412; Murphy et al. (1981) J. Mol. Biol. 152:465-499).

생화학 및 생물리학적 관점에서 덜 널리 연구되었음에도 불구하고, 사상균 (filamentous fungi) 으로부터의 카탈라아제는 구별적인 특징을 가지며 이의 포유류 상대물에 대한 이점을 제공한다. 서브유닛 수 및 헴 (heme) 함량에서 유사하지만, 진균 카탈라아제는 80,000 내지 97,000 의 서브유닛 분자량을 갖는 다른 유기체로부터의 카탈라아제보다 실질적으로 더 큰 분자이다 (Vainshtein et al. (1986) J. Mol. Biol. 188:63-72; Jacob and Orme-Johnson (1979) Biochem. 18:2967-2975; Jones et al. (1987) Biochim. Biophys. Acta 913:395-398). 보다 중요하게는, 아스퍼질루스 니게르와 같은 진균 종으로부터의 카탈라아제는 단백질분해, 및 글루타르알데히드 또는 SDS 에 의한 불활성화에 대해 소 간 카탈라아제보다 더 안정하며, 시아니드, 아자이드 및 플루오라이드와 같은 카탈라아제 저해제에 대해 낮은 친화성을 갖는다 (상기 Wasserman and Hultin). 또한, A. 니게르 카탈라아제는 극한의 pH, 과산화수소 농도 및 온도가 가해지는 경우 소 간 카탈라아제보다 더 유의하게 안정하다 (Scott and Hammer (1960) Enzymologia 22:229-237). 진균 카탈라아제가 안정성 이점을 제공하지만, 소 간 카탈라아제와 같은 상응하는 포유류 효소가 더 높은 촉매 활성을 갖는 것으로 나타난다 (Graft et al. (1978) Can. J. Biochem. 56(9):916-919; Kikuchi-Torii et al. (1982) J. Biochem. (Tokyo) 92(5): 1449-1456). 그러나, 효소 안정성이 효소의 생물공학적 이용에 있어서 중요한 인자이기 때문에, 특히 높은 농도의 과산화수소의 중화를 포함하는 적용에 대해 진균 카탈라아제를 사용하는 것에 대한 고려할만한 관심이 존재해왔다. H₂O₂ 에서의 불활성화 속도가 소 간 카탈라아제에서보다 A. 니게르 카탈라아제에 대해 적어도 더 낮은 정도의 크기라는 것이 관찰되었다 (Vasudevan and Weiland (1990) Biotechnol. Bioeng. 36:783-789). 두 효소 사이의 안정성에서의 차이는 단백질의 구조적 특징 및 조성에서의 차이에 기인할 수 있다 (상기 Vasudevan and Weiland).

전통적으로는, 소 간 카탈라아제는 진단 목적 및 약학-관련 적용 (예를 들어 렌즈 세정, 살균, H₂0₂ 중화) 을 위한 바람직한 효소이다. 그러나, 유럽 소류에서의 광우병에 대한 염려 및 인간이 상기 질환이 걸릴 수 있다는 공포 (Dealler and Lacey (1991) Neutr. Health (Bicester) 7:117-134; Dealler and Lacey (1990) Food Microbiol. 7:253-280) 로 인해 대안적인 카탈라아제 공급원에 대한 관심이 발생하였다.

A. 니게르로부터의 카탈라아제 제제는 진단 효소 키트, 글루코오스로부터의 나트륨 글루코네이트의 효소적 생성, H₂0₂ 폐기물의 중화, 및 H₂0₂의 제거 및/또는 0₂ 의 생성 (음식 및 음료에서) 을 위해 시판된다. 두 가지 카탈라아제 유전자가 A. 니게르에서 단리된다. A. 니게르 catA 유전자는 지방산에서의 성장 동안 주로 유도되며 퍼옥시좀 내에 위치하는 것으로 생각되는 카탈라아제 효소를 인코딩한다. catR 로 지정되는 두 번째 유전자는, 시판되는 A. 니게르 카탈라아제 제제에서 주요 활성을 나타내는 가용성 세포질 효소를 인코딩한다.

A. 니게르 글루코아밀라아제 (glaA) 유전자의 프로모터 및 터미네이터 요소가 결합하는 A. 니게르 catR 유전자의 재조합 발현은 글루코오스 산화효소 (goxA) 발현이 제거되도록 조작된 A. 니게르 균주에서 이미 기재된 바 있다 (미국 특허 제 5,360,901 호). 그러나 발현된 카탈라아제 효소의 일부가 A. 니게르 숙주 세포의 세포벽 내에서 격리되어 효소 수율 및 회수를 감소시키기 때문에, 효소의 수율은 최적이 아니다. 그러므로, 분비된 가용성 효소의 더 큰 수율을 제공할, 최종 카탈라아제에 대한 향상된 숙주 발현 시스템이 필요하다.

발명의 요약

한 양상에서는, 본 발명은 트리코데르마 숙주 세포에서 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하는, 과산화수소를 산소 및 물로 효소적으로 전환시키는 것을 촉진할 수 있는 폴리펩티드의 제조 방법을 제공한다. 한 구현예에서는, 상기 폴리펩티드는 아스퍼질루스 니게르 (A. 니게르) 로부터의 카탈라아제 효소이다. 한 구현예에서는, 상기 폴리뉴클레오티드는 A. 니게르 catR 유전자를 포함한다. 한 구현예에서는, 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1 에서 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 한 구현예에서는, 트리코데르마 숙주 세포는 트리코데르마 레에세이 (T. 레에세이) 세포이다. 일부 구현예에서는, T. 레에세이에서의 폴리펩티드의 발현은 A. 니게르에서의 동일한 폴리펩티드의 발현보다 임의로는 적어도 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100% 더 크다. 일부 구현예에서는, T. 레에세이 숙주 세포로부터 성장 배지로 분비되는 폴리펩티드의 양은 A. 니게르 숙주 세포에 대한 성장 배지로 분비되는 폴리펩티드 양보다 임의로는 적어도 약 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80, 90 또는 100% 더 높다.

한 구현예에서는, 상기 방법은 (a) 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 트리코데르마 숙주 세포를 형질전환시키고; (b) 상기 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 성장 배지에서 상기 트리코데르마 숙주 세포를 성장시키고; (c) 상기 성장 배지에서 상기 폴리펩티드를 단리하는 것을 포함한다.

또 다른 양상에서는, 본 발명은 과산화수소를 산소 및 물로 효소적으로 전환시키는 것을 촉진할 수 있는 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 트리코데르마 숙주 세포를 제공한다. 한 구현예에서는, 상기 폴리펩티드는 A. 니게르로부터의 카탈라아제 효소이다. 한 구현예에서는, 상기 폴리뉴클레오티드는 A. 니게르 catR 유전자를 포함한다. 또 다른 구현예에서는, 상기 폴리뉴클레오티드는 SEQ ID NO:1 에서 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩한다. 한 구현예에서는, 상기 숙주 세포는 T. 레에세이 세포이다. 일부 구현예에서는, 트리코데르마 숙주 세포는 엔도-T 유전자의 결실을 포함한다. 한 구현예에서는, 숙주 세포는 엔도-T 유전자가 결실된 T. 레에세이 세포이다.

또 다른 양상에서는, 본 발명은 과산화수소를 산소 및 물로 효소적으로 전환시키는 것을 촉진할 수 있는 폴리펩티드 (상기 폴리펩티드는 본원에서 기재된 바와 같이 트리코데르마 숙주 세포에서 발현됨) 를 제공한다.

또 다른 양상에서는, 본 발명은 과산화수소를 산소 및 물로 효소적으로 전환시키는 것을 촉진할 수 있는 폴리펩티드와 과산화수소를 접촉시키는 것을 포함하는 (상기 폴리펩티드는 본원에서 기재된 바와 같이 트리코데르마 숙주 세포에서 발현됨), 과산화수소를 산소 및 물로 전환하는 방법을 제공한다.

또 다른 양상에서는, 본 발명은 과산화수소를 산소 및 물로 효소적으로 전환시키는 것을 촉진할 수 있는 폴리펩티드 (상기 폴리펩티드는 본원에서 기재된 바와 같이 트리코데르마 숙주 세포에서 발현됨) 를 포함하는, 과산화수소를 산소 및 물로 전환하기 위한 조성물을 제공한다.

또 다른 양상에서는, 본 발명은 과산화수소를 산소 및 물로 효소적으로 전환시키는 것을 촉진할 수 있는 폴리펩티드 (상기 폴리펩티드는 본원에서 기재된 바와 같이 트리코데르마 숙주 세포에서 발현됨) 를 포함하는 키트를 제공한다.

도 1 은 A. 니게르 catR 카탈라아제 효소의 아미노산 서열을 나타낸다 (SEQ ID NO:1). 분비를 지시하는 신호 서열을 이탤릭체로 나타낸다.
도 2 는 인트론을 포함하는, A. 니게르 catR 카탈라아제 효소를 인코딩하는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다 (SEQ ID NO:2).
도 3 은 pTrex3gM 발현 벡터의 구조를 나타낸다.
도 4 는 pTrex3gM (CATE) 발현 벡터의 구조를 나타낸다.
도 5 는 A. 니게르 또는 T. 레에세이에서 발현된 카탈라아제 효소의 용융점에 대한 pH 의 효과를 나타낸다.
도 6 은 A. 니게르 또는 T. 레에세이에서 발현된 카탈라아제 효소의 용융점에 대한 H₂O₂ 의 효과를 나타낸다.
도 7 은 실시예 6 에서 기재된 바와 같은 SDS-PAGE 겔이다.
도 8 은 실시예 7 에서 기재된 바와 같은 카탈라아제 샘플의 활성을 나타낸다.

상세한 설명

다르게 나타내지 않는 한, 본 발명의 실행은 당해 기술 분야 내에 있는 분자 생물학 (재조합 기술 포함), 미생물학, 세포 생물학 및 생화학의 통상적인 기술을 이용할 것이다. 이러한 기술은, 예를 들어 [Molecular Cloning : A Laboratory Manual, second edition (Sambrook et al., 1989); Oligonucleotide Synthesis (M. J. Gait, ed., 1984; Current Protocols in Molecular Biology (F. M. Ausubel et al., eds., 1994); PCR : The Polymerase Chain Reaction (Mullis et al., eds., 1994); 및 Gene Transfer and Expression : A Laboratory Manual (Kriegler, 1990)] 의 문헌에서 충분히 설명된다.

본원에서 다르게 정의되지 않는 한, 본원에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어는 본 발명이 속하는 당업계의 통상의 지식 중 하나에 의해 흔히 이해되는 바와 동일한 의미를 갖는다. [Singleton, et al., Dictionary of Microbiology and Molecular Biology, second ed., John Wiley and Sons, New York (1994), 및 Hale & Markham, The Harper Collins Dictionary of Biology, Harper Perennial, NY (1991)] 은 본 발명에서 사용되는 많은 용어의 일반적인 사전적 의미와 함께 기술 중 하나를 제공한다. 본원에서 기재된 것과 유사 또는 동등한 임의의 방법 및 물질이 본 발명의 실행 또는 시험에서 사용될 수 있다.

본원에서 제공되는 수치 범위는 범위를 한정하는 수치를 포함한다.

다르게 나타내지 않는 한, 핵산은 5' 에서 3' 방향으로 좌측에서 우측으로 표기하며; 아미노산 서열은 아미노에서 카르복시 방향으로 좌측에서 우측으로 각각 표기한다.

정의

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "폴리뉴클레오티드" 는 데옥시리보뉴클레오티드, 리보뉴클레오티드 및/또는 데옥시리보뉴클레오티드 또는 리보뉴클레오티드의 유사체 또는 개질된 형태 (개질된 뉴클레오티드 또는 염기 또는 이의 유사체 포함) 를 포함하는 임의의 길이 및 임의의 3차원적 구조 및 단일 가닥 또는 다중 가닥 (예를 들어 단일 가닥, 이중 가닥, 삼중 나선 등) 의 뉴클레오티드의 중합체 형태를 나타낸다. 유전적 코드가 퇴화되기 때문에, 하나 초과의 코돈이 특정 아미노산을 인코딩하는데 사용될 수 있으며, 본 발명은 특정 아미노산 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함한다. 폴리뉴클레오티드가 뉴클레아제 내성을 증가시키는 개질 (예를 들어, 데옥시, 2'-O--Me, 포스포로티오에이트 등) 을 포함하는 사용 조건 하에 바람직한 기능성을 보유하는 것이면, 임의 유형의 개질된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드 유사체가 사용될 수 있다. 또한, 검출 또는 포획의 목적을 위해 표지가 혼입될 수 있다 (예를 들어, 방사성 또는 비방사성 표지 또는 앵커, 예를 들어 바이오틴). 용어 폴리뉴클레오티드는 또한 펩티드 핵산 (PNA) 을 포함한다. 폴리뉴클레오티드는 자연 발생적 또는 비-자연 발생적인 것일 수 있다. 용어 "폴리뉴클레오티드" 및 "핵산" 및 "올리고뉴클레오티드" 는 본원에서 상호교환적으로 사용된다. 본 발명의 폴리뉴클레오티드는 RNA, DNA, 또는 둘 모두, 및/또는 이의 개질된 형태 및/또는 유사체를 포함할 수 있다. 뉴클레오티드의 서열은 비-뉴클레오티드 성분에 의해 방해될 수 있다. 하나 이상의 포스포디에스테르 결합은 대안적 연결기에 의해 대체될 수 있다. 이들 대안적인 연결기에는 비제한적으로, 포스페이트가 P(O)S ("티오에이트"), P(S)S ("디티오에이트"), (O)NR₂ ("아미데이트"), P(O)R, P(O)OR', CO 또는 CH₂ ("포르마세탈") (식 중, 각각의 R 또는 R' 는 독립적으로 H, 또는 임의로는 에테르 (-O-) 결합, 아릴, 알케닐, 시클로알킬, 시클로알케닐 또는 아르알딜을 포함하는 치환 또는 비치환된 알킬 (1-20 C) 임) 에 의해 대체되는 구현예가 포함된다. 폴리뉴클레오티드 내에 있는 모든 결합이 동일할 필요는 없다. 폴리뉴클레오티드는 선형 또는 환형일 수 있거나, 선형 또는 환형 부분의 조합을 포함할 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "폴리펩티드" 는 아미노산을 포함하는 임의의 조성물을 나타내며 당업자에 의해 단백질로서 인지된다. 아미노산 잔기에 대한 통상적인 한 글자 또는 세 글자 코드가 본원에서 사용된다. 용어 "폴리펩티드" 및 "단백질" 은 본원에서 임의 길이의 아미노산의 중합체를 나타내도록 상호교환적으로 사용된다. 중합체는 선형 또는 분지형일 수 있고, 이는 개질된 아미노산을 포함할 수 있으며, 비-아미노산에 의해 방해될 수 있다. 상기 용어는 또한 자연적으로 개질되거나 개입에 의해 개질된 (예를 들어 디설파이드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 기타 조작 또는 개질, 예컨대 표지 성분과의 접합) 아미노산 중합체를 포함한다. 예를 들어, 아미노산 (예를 들어 비자연적 아미노산 등 포함) 의 하나 이상의 유사체를 포함하는 폴리펩티드 뿐 아니라 당업계에 알려진 기타 개질이 또한 상기 정의 내에 포함된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "벡터" 는 하나 이상의 세포 유형에 핵산이 도입되도록 설계된 폴리뉴클레오티드 서열을 나타낸다. 벡터에는 클로닝 벡터, 발현 벡터, 셔틀 벡터, 플라스미드, 파지 입자, 카세트 등이 포함된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "발현" 은 폴리펩티드가 유전자의 핵산 서열을 기초로 생성되는 과정을 나타낸다. 상기 과정에는 전사 및 번역 모두가 포함된다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "발현 벡터" 는 숙주 내의 코딩 서열의 발현에 영향을 줄 수 있는 하나 이상의 적합한 조절 서열(들) 에 작동가능하게 연결되는 DNA 코딩 서열 (예를 들어 유전자 서열) 을 포함하는 DNA 구성물을 나타낸다. 이러한 조절 서열은 전사에 영향을 주는 프로모터, 이러한 전사를 조절하기 위한 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합 위치를 인코딩하는 서열, 및 전사 및 번역의 종결을 조절하는 서열을 포함한다. 벡터는 플라스미드, 파지입자, 또는 간단히 잠재적 게놈 삽입물일 수 있다. 적합한 숙주 내로 형질전환되고 나면, 벡터는 숙주 게놈과 독립적으로 복제 및 기능할 수 있거나, 일부 경우에서는 게놈 자체에 통합될 수 있다. 플라스미드는 발현 벡터의 형태로 가장 흔히 사용된다. 그러나, 본 발명은 동등한 기능을 역할하고, 당업계에 알려지거나 알려지게 되는 발현 벡터의 이러한 다른 형태를 포함하는 것으로 의도된다.

"프로모터" 는 유전자의 전사가 개시되도록 하는 RNA 폴리머라아제 결합에 포함되는 조절 서열을 나타낸다. 프로모터는 유도가능 프로모터 또는 구성 프로모터일 수 있다. 본 발명에서 사용될 수 있는 유도가능 프로모터의 비제한적 예는, 유도가능 프로모터인 트리코데르마 레에세이 cbh1 이다.

용어 "작동가능하게 연결되는" 은 요소가 기능적으로 연결되게 하는 배열로 있는 병렬배치 (juxtaposition) 를 나타낸다. 예를 들어, 코딩 서열의 전사를 조절한다면, 프로모터는 코딩 서열에 작동가능하게 연결된다.

"전사 조절 하" 는 전사의 개시에 기여하거나 전사를 촉진시키는 요소에 작동가능하게 연결되는지에 따라 폴리뉴클레오티드 서열의 전사를 나타내는, 당업계에서 널리 이해되는 용어이다.

"번역 조절 하" 는 mRNA 가 형성된 후 발생하는 조절적 과정을 나타내는, 당업계에서 널리 이해되는 용어이다.

"유전자" 는 폴리펩티드를 생성하는데 포함되는 DNA 조각을 나타내며, 코딩 부위의 선행 및 후속 부위 뿐 아니라 개별적 코딩 조각 (엑손) 사이의 개입 서열 (인트론) 을 포함한다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "숙주 세포" 는 폴리펩티드 제조용 재조합 발현 벡터가 폴리펩티드의 발현을 위해 트랜스펙션될 수 있는 세포 또는 세포주를 나타낸다. 숙주 세포는 단일 숙주 세포의 자손을 포함하며, 자연적, 우발적, 또는 고의적 돌연변이로 인해 자손은 본래의 모 세포에 대해 반드시 완전히 동일하지 않을 수 있다 (형태 또는 총 게놈 DNA 보체에 있어서). 숙주 세포는 발현 벡터로 생체 내 형질전환 또는 트랜스펙션된 세포를 포함한다. "숙주 세포" 는 사상균주 및 특히 트리코데르마 종 균주의 세포로부터 생성된 원형질체 및 세포 모두를 나타낸다.

세포, 핵산, 단백질 또는 벡터에 관련하여 사용되는 경우 용어 "재조합" 은, 세포, 핵산, 단백질 또는 벡터가 이종 핵산 또는 단백질의 도입에 의해, 또는 자연적 핵산 또는 단백질의 변경에 의해 개질된 것을 나타내거나, 세포가 이렇게 개질된 세포로부터 유래하는 것을 나타낸다. 따라서 예를 들어, 재조합 세포는 세포의 자연적 (비-재조합) 형태 내에서 발견되지 않는 유전자를 발현하거나, 다르게는 비정상적으로 발현, 저발현 또는 전혀 발현되지 않는 자연적 유전자를 발현한다.

"신호 서열" (또한 "예비서열," "신호 펩티드," "리더 서열," 또는 "리더 펩티드" 로 지칭됨) 은 세포로부터 성숙 형태 단백질의 분비를 촉진하는 단백질의 N-말단 부분에 결합하는 아미노산의 서열을 나타낸다. 신호 서열은 분비 통로에 대한 폴리펩티드를 표적으로 하며, 소포체 막에서 위치이동되고 나면 초기 폴리펩티드로부터 절단된다. 성숙 형태의 세포외 단백질에는 분비 과정 동안 절단되는 신호 서열이 없다.

용어 "선택 마커" 또는 "선택가능 마커" 는 도입된 핵산 또는 벡터를 포함하는 숙주의 선별을 용이하게 하는, 숙주 세포에서 발현될 수 있는 유전자를 나타낸다. 선택가능 마커의 예에는 비제한적으로, 살균성 물질 (예를 들어 하이그로마이신, 블레오마이신 또는 클로람페니콜) 및/또는 영양 이점과 같은 대사작용 이점을 숙주 세포에게 부여하는 유전자가 포함된다.

용어 "~에서 유래하는" 은 용어 "~에서 기원하는", "~에서 수득되는", "~에서 수득가능한", "~에서 단리되는" 및 "~에서 생성되는" 을 포함한다.

"사상균" 은 유마이코티나 아문 (subdivision Eumycotina) 의 모든 섬유성 형태를 나타낸다 (Alexopoulos, C. J. (1962), Introductory Mycology, Wiley, New York 참조). 이들 진균은 키틴, 셀룰루오스, 및 기타 복합 다당류로 이루어지는 세포벽을 갖는 영양 균사체를 특징으로 한다. 본 발명의 사상균은 효모와 형태학적, 생리학적 및 유전적으로 구별된다. 사상균에 의한 영양 성장은 균사 연장에 의한 것이며, 탄소 이화 작용은 절대 호기성이다. 본 발명에서는, 사상균 모세포는 트리코데르마 종, 예를 들어 트리코데르마 레에세이 (이전에 T. 이온기브라키아툼 (T. Iongibrachiatum) 으로 분류되었고 현재 또한 하이포크레아 제코리나 (Hypocrea jecorina) 로 알려짐), 트리코데르마 비리데 (Trichoderma viride), 트리코데르마 코닌지 (Trichoderma koningii), 또는 트리코데르마 하르지아눔 (Trichoderma harzianum) 의 세포일 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "트리코데르마" 또는 "트리코데르마 종" 은 이전에, 또는 현재 트리코데르마로 분류된 임의의 진균 속을 나타낸다.

용어 "배양하는" 은 액체 또는 고체 배지 내 성장을 위한 적합한 조건 하에 미생물 세포 집단을 성장시키는 것을 나타낸다.

폴리뉴클레오티드 또는 단백질에 관련되는 용어 "이종" 은 숙주 세포에서 자연적으로 발생하지 않는 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을 나타낸다. 일부 구현예에서는, 단백질은 상업적으로 중요한 산업적 단백질이다. 상기 용어는, 자연 발생적 유전자, 돌연변이화된 유전자 및/또는 합성 유전자에 의해 인코딩되는 단백질을 포함하는 것으로 의도된다. 폴리뉴클레오티드 또는 단백질에 관련되는 용어 "상동" 은 숙주 세포에서 자연적으로 발생하는 폴리뉴클레오티드 또는 단백질을 나타낸다.

핵산 서열을 세포에 삽입하는 맥락에서의 용어 "도입된" 은 "트랜스펙션", "형질전환", 또는 "형질도입" 을 포함하며, 진핵 또는 원핵 세포에 핵산 서열이 혼입되는 것을 나타내고, 상기 핵산 서열은 세포의 게놈 (예를 들어 염색체, 플라스미드, 플라스티드 또는 미토콘드리아 DNA) 에 혼입되어, 자동 리플리콘으로 전환되거나, 일시적으로 발현될 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "형질전환된", "안정적으로 형질전환된" 및 "유전자도입" 은 다세대를 통해 유지되는 에피솜 플라스미드로서 또는 게놈에 통합된 비-자연적 (예를 들어 이종) 핵산 서열을 갖는 세포를 나타낸다.

본원에서 사용되는 바와 같은 용어 "회수되는", "단리되는", "정제되는" 및 "분리되는" 은 자연적으로 연관되는 하나 이상의 성분으로부터 제거되는 물질 (예를 들어 단백질, 핵산 또는 세포) 를 나타낸다. 예를 들어, 이들 용어는 예를 들어 완전한 생물계과 같은 자연적 상태에서 발견되는 바와 같이 정상적으로 이를 수반하는 성분으로부터 실질적으로 또는 본질적으로 유리되는 물질을 나타낼 수 있다.

본원에서 사용되는 바와 같은 "카탈라아제" 는 과산화수소가 수소 및 산소로 분해되는 것을 촉진하는 효소 (즉, 촉매적 활성을 갖는 폴리펩티드) 를 나타낸다.

"ATCC" 는 메너서스, Va. 20108 에 위치한 미국 미생물 보존 센터 (American Type Culture Collection) 를 나타낸다 (www.atcc.org).

"NRRL" 은 페오리아 I11 의 미국 농무성 균주 보관 센터, 국립 농업 이용 연구 센터 (Agricultural Research Service Culture Collection, National Center for Agricultural Utilization Research (이전에 USDA 북부 지역 연구 실험실 (USDA Northern Regional Research Laboratory) 로 알려짐)를 나타낸다.

단수 표현은 문맥에서 다르게 명백히 나타내지 않는 한 복수 표현을 포함한다.

트리코데르마 숙주 세포

본 발명은 카탈라아제 효소를 인코딩하는 이종 폴리뉴클레오티드를 발현할 수 있는 숙주 세포를 제공한다. 숙주 세포는 트리코데르마 종, 예를 들어 트리코데르마 레에세이, 트리코데르마 비리데, 트리코데르마 코닌지 또는 트리코데르마 하르지아눔의 사상균 세포이다. 일부 구현예에서는, 숙주 세포는 트리코데르마 레에세이 균주이다. T. 레에세이의 균주는 알려져 있다; 비제한적 예에는 ATCC 번호 13631, ATCC 번호 26921, ATCC 번호 56764, ATCC 번호 56765, ATCC 번호 56767, 및 NRRL 번호 15709 가 포함된다. 일부 구현예에서는, 숙주 세포는 RL-P37 T. 레에세이 균주에서 유래한다 (Sheir-Neiss et al. (1984) Appl. Microbiol. Biotechnology 20:46-53 에 기재됨). 한 구현예에서는, 숙주 세포는 Morph 1.1 (pyr+) T. 레에세이 균주, 쿼드-결실된 RL-P37 트리코데르마 레에세이 균주의 자연적 pyr4 복귀돌연변이체 (PCT 출원 번호 WO 05/001036 에서 기재됨) 이다.

숙주 균주는 이전에 유전 공학을 통해 조작될 수 있었다. 일부 구현예에서는, 진균 숙주 세포의 다양한 자연적 유전자가 불활성화된다. 유전자는, 예를 들어 셀룰로오스 가수분해 효소, 예컨대 엔도글루카나아제 (EG) 및 엑소셀로바이오하이드롤라아제 (CBH) 를 인코딩하는 유전자를 포함한다 (예를 들어 cbh1, cbh2, egl1, 및 egl3). 미국 특허 제 5,650,322 호는 cbh1 유전자 및 cbh2 유전자에 있어서의 결실을 갖는 RL-P37 의 유도체 균주를 개시한다. 일부 구현예에서는, 트리코데르마 숙주 세포는 발현된 카탈라아제 효소의 탈글리코실화를 감소 또는 방지시키기 위해 엔도-T 유전자의 결실을 포함한다. 한 구현예에서는, 숙주 세포는 엔도-T 유전자가 결실된 트리코데르마 레에세이이다.

본 발명의 폴리펩티드를 인코딩하는 발현 벡터는 표준 기술을 사용하여 숙주 세포에 트랜스펙션될 수 있다. "트랜스펙션" 또는 "형질전환" 은 외생 폴리뉴클레오티드를 숙주 세포에 삽입하는 것을 나타낸다. 외생 폴리뉴클레오티드는 비-통합된 벡터, 예를 들어 플라스미드로서 유지될 수 있거나, 대안적으로는 숙주 세포 게놈 내로 통합될 수 있다. 용어 "트랜스펙션시키는" 또는 "트랜스펙션" 은 핵산을 숙주 세포에 도입하기 위한 모든 통상적인 기술을 포함하는 것으로 의도된다. 트랜스펙션 기술의 예에는 비제한적으로, 인산칼슘 침전, DEAE-덱스트란-매개 트랜스펙션, 리포펙션, 전기천공 및 미량주사가 포함된다. 숙주 세포를 트랜스펙션시키기에 적합한 방법은 [Sambrook et al. (1989) Molecular Cloning : A Laboratory Manual, 2nd Edition, Cold Spring Harbor Laboratory press], 및 다른 실험실 교재에서 발견할 수 있다. 핵산은 또한, 핵산을 세포에 생체내 도입하기에 적합한 전달 메커니즘, 예컨대 레트로바이러스 벡터 (예를 들어, Ferry et al. (1991) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 88: 8377-8381; 및 Kay et al. (1992) Human Gene Therapy 3: 641-647 참조), 아데노바이러스 벡터 (예를 들어, Rosenfeld (1992) Cell 68: 143-155; 및 Herz and Gerard (1993) Proc. Natl. Acad. Sci, USA, 90:2812-2816 참조), 수용체-매개 DNA 흡수 (예를 들어, Wu, and Wu (1988) J. Biol. Chem. 263: 14621; Wilson et al. (1992) J. Biol. Chem. 267: 963-967; 및 미국 특허 제 5,166,320 호 참조), DNA 직접 주입 (예를 들어, Acsadi et al. (1991) Nature 332: 815-818; 및 Wolff et al. (1990) Science 247:1465-1468 참조) 또는 입자 유전자총 (bombardment) (biolistics) (예를 들어, Cheng et al. (1993) Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:4455-4459; 및 Zelenin et al. (1993) FEBS Letts. 315: 29-32 참조) 을 통해 세포에 전달될 수 있다.

특정 벡터는 낮은 빈도로 숙주 세포에 통합된다. 이들 통합물을 확인하기 위해서, 일부 구현예에서는 선택가능 마커 (예를 들어, 약물 내성) 를 함유하는 유전자가 관심 핵산과 함께 숙주 세포에 도입된다. 선택가능 마커의 예에는 G418 및 하이그로마이신과 같은 특정 약물에 내성을 부여하는 것이 포함된다. 선택가능 마커는 관심 핵산으로부터의 개별적 벡터 상에 도입되거나 동일한 벡터 상에 도입될 수 있다. 트랜스펙션된 숙주 세포는 이후 선택가능 마커를 사용하여 세포에 대해 선별함으로써 확인될 수 있다. 예를 들어, 선택가능 마커가 네오마이신 내성을 부여하는 유전자를 인코딩하는 경우, 핵산을 받아들이는 숙주 세포는 G418 의 존재 하의 성장에 의해 확인될 수 있다. 선택가능 마커가 도입된 세포는 다른 세포가 사멸하는 동안 생존할 것이다.

발현되고 나면, 본 발명의 폴리펩티드는 친화성 정제, 황산암모늄 침전, 이온 교환 크로마토그래피, 또는 겔 전기영동을 비제한적으로 포함하는 당업계의 표준 방법에 따라 정제될 수 있다 (일반적으로는, R. Scopes (1982) Protein Purification, Springer-Verlag, N. Y.; Deutscher (1990) Methods in Enzymology Vol. 182: Guide to Protein Purification, Academic Press, Inc. N.Y. 참조).

카탈라아제 효소

본 발명의 문맥에서, 카탈라아제는 과산화수소를 산소 및 물로 전환시키는 것을 촉진하는 효소이다. 본원에서 기재된 바와 같은 트리코데르마 숙주 세포에서 발현된 카탈라아제 효소는 숙주 종에 대해 이종이며, 즉 이들은 이들을 발현시키는 트리코데르마 종과 상이한 종에서 유래한다.

한 구현예에서는, 카탈라아제는 A. 니게르의 catR 카탈라아제이다. 일부 구현예에서는, 카탈라아제는 SEQ ID NO:1 에서 나타내는 아미노산 서열을 포함하고, 이로 구성되거나, 이루어진다. 일부 구현예에서는, 카탈라아제는 SEQ ID NO:1 에서 나타내는 서열과 임의의 약 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 또는 99.5% 동일성을 갖는 아미노산을 포함하고, 이로 구성되거나, 이루어지며, 상기 효소는 과산화수소를 산소 및 물로 전환시키는 것을 촉진할 수 있다.

일부 구현예에서는, 카탈라아제는 SEQ ID NO:1 에서 나타내는 아미노산 서열에서 유래하는 성숙 가공된 서열이다. 일부 구현예에서는, SEQ ID NO:1 에서 나타내는 아미노산 서열에서 유래하는 성숙 가공된 서열은 SEQ ID NO:1 의 N-말단으로부터의 1 내지 약 25개 아미노산 잔기의 결실 (예를 들어 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24 또는 25개 N-말단 아미노산의 결실) 을 갖는다.

한 구현예에서는, 카탈라아제는 A. 니게르의 catR 유전자에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서는, 카탈라아제는 SEQ ID NO:2 에서 나타내는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하고, 이로 구성되거나, 이루어지는 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩된다. 일부 구현예에서는, 카탈라아제는 SEQ ID NO:2 에서 나타내는 폴리뉴클레오티드 서열과 임의의 약 70, 75, 80, 85, 90, 95, 97, 98, 99 또는 99.5% 동일성을 갖는 폴리뉴클레오티드 서열에 의해 인코딩되며, 폴리뉴클레오티드에 의해 인코딩되는 상기 효소는 과산화수소를 산소 및 물로 전환시키는 것을 촉진할 수 있다.

벡터

본 발명에 따르면, 카탈라아제 효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터가 트리코데르마 숙주 세포에 도입된다. 전형적으로는, 카탈라아제 활성을 갖는 폴리펩티드는, 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하고 카탈라아제 인코딩 서열에 작동가능하게 연결된 조절 서열(들) 을 포함하는 발현 벡터로부터 발현된다.

벡터는 트리코데르마 세포에 도입되고 상기 세포에서 복제될 수 있는 임의의 벡터일 수 있다. 적합한 벡터의 예는, 예를 들어 [상기 Sambrook et al. (1989), 상기 Ausubel (1994), van den Hondel et al. (1991) in Bennet and Lasure (Eds.), More Gene Manipulations in Fungi, Academic Press, San Diego, pp. 396-428, 및 미국 특허 제 5,874,276 호] 에서 발견할 수 있다. 유용한 벡터의 예에는 비제한적으로, pFB6, pBR322, PUC18, pUC100 및 pENTR/D 가 포함된다.

전형적으로는, 카탈라아제 효소를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드는 트리코데르마 숙주 세포에서 전사적 활성을 나타내는 적합한 프로모터에 작동가능하게 연결된다. 프로모터는 숙주 세포에 대해 상동 또는 이종인 단백질을 인코딩하는 유전자에서 유래할 수 있다. 프로모터의 적합한 비제한적 예에는 cbh1, cbh2, egl1, 및 egl2 가 포함된다. 일부 구현예에서는, 프로모터는 숙주 세포에 대해 자연적인 것이다. 예를 들어 T. 레에세이가 숙주 세포인 경우, 프로모터는 자연적 T. 레에세이 프로모터일 수 있다. 한 구현예에서는, 프로모터는 T. 레에세이 cbh1 이며, 이는 유도가능 프로모터이고 GenBank 에 취득 번호 D86235 로 기탁되어있다. "유도가능 프로모터" 는 환경적 또는 발생적 조절 조건 하에서 활성인 프로모터이다. 또 다른 구현예에서는, 프로모터는 숙주 세포에 대해 이종이다.

일부 구현예에서는, 카탈라아제 인코딩 서열은 신호 서열을 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된다. 일부 구현예에서는, 신호 서열은 발현될 카탈라아제 유전자와 자연적으로 연관되는 서열이다. 일부 구현예에서는, 신호 서열은 SEQ ID NO:1 의 잔기 1 내지 16 으로 나타내는 아미노산 서열을 포함하고, 이로 구성되거나, 본질적으로 이로 구성된다. 일부 구현예에서는, 신호 서열은 SEQ ID NO:1 의 아미노산 잔기 1 내지 16 으로 나타내는 신호 서열과 적어도 약 80, 85, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 서열 동일성을 갖는다. 일부 구현예에서는, 신호 서열은 T. 레에세이 cbh1 또는 nsp24 신호 서열이다. 한 구현예에서는, 신호 서열은 cbh1 핵산 서열 ATGTATCGGAAGTTGGCCGTCATCTCGGCCTTCTTGGCCACAGCTCGTGCT (SEQ ID NO:3) 에 의해 인코딩되는 아미노산 서열이다. 한 구현예에서는, 신호 서열은 nsp24 핵산 서열 ATGCAGACCTTTGGAGCTTTTCTCGTTTCCTTCCTCGCCGCCAGCGGCCTGGCCGCGGCC (SEQ ID NO:4) 에 의해 인코딩되는 아미노산 서열이다. 일부 구현예에서는, 트리코데르마 숙주 세포에 도입될 벡터는 동일한 근원에서 유래하는 신호 서열 및 프로모터 서열을 포함한다. 일부 구현예에서는, 신호 서열 및 프로모터 서열은 상이한 근원에서 유래한다.

일부 구현예에서는, 벡터는 또한 터미네이터 서열을 포함한다. 일부 구현예에서는, 트리코데르마 숙주 세포에 도입될 벡터는 동일한 근원에서 유래하는 터미네이터 서열 및 프로모터 서열을 포함한다. 일부 구현예에서는, 터미네이터 서열 및 프로모터 서열은 상이한 근원에서 유래한다. 적합한 터미네이터 서열의 한 비제한적 예는 트리코데르마 레에세이 균주와 같은 트리코데르마 균주에서 유래하는 cbh1 의 터미네이터 서열이다.

일부 구현예에서는, 벡터는 선택가능 마커를 포함한다. 적합한 선택가능 마커의 예에는 비제한적으로, 살균성 화합물, 예를 들어 하이그로마이신, 플레오마이신에 대해 내성을 부여하는 유전자가 포함된다. 영양성 선택가능 마커가 또한 사용될 수 있다 (예를 들어 amdS, argB, pyr4). 트리코데르마의 형질전환용 벡터 시스템에서 유용한 마커는 당업계에 알려져있다 (예를 들어, Finkelstein (1992) Biotechnology of Filamentous Fungi, Ch. 6, Finkelstein et al., eds., Butterworth-Heinemann, Boston, Mass.; Kinghorn et al. (1992) Applied Molecular Genetics of Filamentous Fungi, Blackie Academic and Professional, Chapman and Hall, London 참조). 한 구현예에서는, 선택가능 마커는 amdS 유전자인데, 이는 효소 아세트아미다아제를 인코딩하여, 형질전환된 세포가 질소 공급원으로서 아세트아미드 상에서 성장할 수 있게 한다. 선택가능 마커로서 A. 니둘란스 (A. nidulans) amdS 유전자를 사용하는 것은 [Kelley et al. (1985) EMBO J. 4:475-497 및 Penttila et al. (1987) Gene 61:155-164] 에 기재되어 있다.

카탈라아제 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 발현 벡터는 트리코데르마 숙주 세포에서 자체적으로 복제되거나 숙주 세포의 DNA 에 통합될 수 있는 임의의 벡터일 수 있다. 일부 구현예에서는, 발현 벡터는 플라스미드이다.

카탈라아제 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 및 프로모터 및 터미네이터와 같은 다른 서열을 포함하는 DNA 구성물을 제조하고, 이를 적합한 벡터에 삽입하는 방법은 당업계에 널리 알려져있다. 폴리뉴클레오티드 서열의 연결은 편리한 제한 위치에서의 라이게이션에 의해 일반적으로 달성된다. 이러한 위치가 존재하지 않는 경우, 합성 올리고뉴클레오티드 링커를 통상적인 실행에 따라 사용한다 (예를 들어, 상기 Sambrook (1989); 상기 Bennett and Lasure (1991), pp. 70-76 참조).

벡터의 숙주 세포로의 도입

카탈라아제 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드 서열을 포함하는 벡터를 트리코데르마 숙주 세포에 도입하는 것은, 당업계에 널리 알려진 많은 기술 중 임의의 기술, 예를 들어 형질전환, 전기천공, 핵 미량주사, 형질도입, 트랜스펙션 (예를 들어, 리포펙션 또는 DEAE-덱스트린 매개 트랜스펙션), 인산칼슘 DNA 침전물로의 인큐베이션, DNA-코팅된 미세입자를 사용하는 고속 유전자총 또는 원형질체 융합을 사용하여 수행될 수 있다.

일부 구현예에서는, 안정한 형질전환체가 생성됨으로써 카탈라아제 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드가 숙주 세포 염색체에 안정적으로 통합된다. 형질전환체는 이후 알려져 있는 기술에 의해 정제된다.

한 구현예에서는, amdS 마커를 포함하는 안정한 형질전환체는 빠른 성장 속도, 및 아세트아미드 함유 고체 배양 배지 상에서 울퉁불퉁하지 않고 매끈한 외형을 갖는 원형 콜로니의 형성에 의해 불안정한 형질전환체와 식별가능하다. 추가적으로 일부 경우에서는, 고체 비-선택 배지 (즉, 아세트아미드가 결핍된 배지) 상에서 형질전환체를 성장시키고, 상기 배양 배지에서 포자를 수확하고, 아세트아미드 함유 선택 배지 상에서 이후 발아하고 성장하는 이들 포자의 백분율을 측정함으로써 안정성의 추가적인 시험을 수행한다. 대안적으로는, 당업계에 알려져 있는 다른 방법을 사용하여 형질전환체를 선별할 수 있다.

한 구현예에서는, 형질전환용 트리코데르마 숙주 세포의 제조에는 진균 균사체로부터의 원형질체의 제조가 포함된다 (예를 들어, Campbell et al. (1989) Curr. Genet. 16:53-56 참조). 일부 구현예에서는, 상기 균사체는 발아된 영양 포자로부터 수득된다. 세포 벽을 소화시키는 효소로 균사체를 처리하여 원형질체를 생성시킨다. 상기 원형질체는 현탁 배지 내의 삼투 안정화제의 존재에 의해 보호된다. 이러한 안정화제에는 예를 들어, 소르비톨, 만니톨, 염화칼륨 및 황산마그네슘이 포함된다. 전형적으로는, 안정화제 농도는 약 0.8 M 내지 약 1.2 M 의 범위에 있다. 한 구현예에서는, 소르비톨은 1.2 M 의 농도로 현탁 배지 내에 존재한다.

전형적으로는, 숙주 트리코데르마 세포에 DNA 를 흡수시키는 것은 흡수 용액 중 칼슘 이온 농도에 의존적이다. 일반적으로 약 10 mM 내지 약 50 mM CaCl₂ 가 흡수 용액에 포함된다. 추가적으로는, 상기 흡수 용액은 또한 완충 시스템 (예를 들어, TE 완충액 (10 mM Tris, pH 7.4; 1 mM EDTA) 또는 10 mM 몰포린프로판설폰산 (MOPS), pH 6.0) 및 폴리에틸렌 글리콜 (PEG) 을 통상적으로 포함한다. 이론에 구속되는 것을 바라지 않으나, PEG 는 세포 막을 융합시키는 역할을 할 수 있어, 배지의 함량물이 트리코데르마 세포의 세포질에 전달되게 하고 플라스미드 DNA 를 핵에 전달시킨다. 이러한 융합은 전형적으로 멀티 카피의 플라스미드 DNA 가 숙주 염색체에 통합되게 한다.

종종, 1 ㎖ 당 약 10⁵ 내지 약 10⁷, 전형적으로 1 ㎖ 당 약 2 x 10⁶ 의 밀도로 투과성 처리된 트리코데르마 원형질체 또는 세포를 함유하는 현탁액이 형질전환에 사용된다. 적절한 용액 (예를 들어 1.2 M 소르비톨 50 mM CaCl₂ 함유 용액) 중 이들 원형질체 또는 세포 100 ㎕ 를 DNA 와 혼합한다. 일반적으로, 높은 농도의 PEG 를 흡수 용액에 첨가한다. 예를 들어, 약 0.1 내지 약 1 부피의 25% PEG 4000 을 원형질체 현탁액에 첨가할 수 있다. 한 구현예에서는, 약 0.25 부피의 25% PEG 4000 을 첨가한다. 디메틸 설폭시드, 헤파린, 스페르미딘 및 염화칼륨을 비제한적으로 포함하는 첨가제를 흡수 용액에 첨가하고 형질전환에 도움이 되게 할 수 있다.

전형적으로는, 흡수 혼합물을 이후 0℃ 에서 약 10 내지 약 30분 동안 인큐베이션한다. 이후 추가적인 PEG 를 혼합물에 첨가하여 원하는 유전자 또는 폴리뉴클레오티드 서열의 흡수를 보다 증강시킨다. 예를 들어, 약 5 내지 약 15 부피 25% PEG 4000 을 첨가할 수 있다. 그러나, 그보다 크거나 적은 부피가 적합할 수 있다. 25% PEG 4000 의 첨가량은 종종 형질전환 혼합물 부피의 약 10배이다. PEG 의 첨가 후, 형질전환 혼합물을 실온 또는 얼음 상에서 인큐베이션한 후 소르비톨 및 염화칼슘 용액을 첨가할 수 있다. 이후 원형질체 현탁액을 성장 배지 (예를 들어 형질전환체만 성장할 수 있게 하는 용융 성장 배지) 의 분취액에 첨가한다.

카탈라아제의 생성

트리코데르마에서의 이종 단백질의 발현은 예를 들어 [미국 특허 제 6,022,725 호 및 제 6,268,328 호, Harkki et al. (1991) Enzyme Microb. Technol. 13:227-233, Harrki et al. (1989) Bio Technol. 7:596-603, EP 244,234, EP 215,594, 및 Nevalainen et al. (1992) "The Molecular Biology of Trichoderma and its Application to the Expression of Both Homologous and Heterologous Genes," in Molecular Industrial Mycology, Leong and Berka, eds., Marcel Dekker Inc., NY, pp. 129-148] 에 기재되어 있다.

일반적으로, 트리코데르마 숙주 세포는 생리학적 염 및 영양분을 함유하는 표준 배지에서 배양된다. 흔히 시판되는 제조 배지 (예를 들어, 효모 몰트 추출물 (YM) 브로쓰; 루리아 베르타니 (Luria Bertani, LB) 브로쓰; 사부로드 덱스트로오스 (Sabouraud Dextrose, SD) 브로쓰) 가 사용될 수 있다. 전형적으로는, 세포는 원하는 수준의 카탈라아제 발현이 달성될 때까지 발효기 또는 진탕 배양에서 약 28℃ 에서 배양된다. 종종, 락토오스 또는 글루코오스-소포로오스와 같은 유도 당이 배지 내에 포함된다.

카탈라아제가 A. 니게르에서 생성되는 경우, 부산물로서 옥살산이 약 30 g/ℓ 의 수준으로 생성된다. 카탈라아제 생성물 내의 비조절된 침전을 피하기 위해 대부분의 옥살산을 제거하는 것이 필요하다. 그러므로, 옥살산은 CaCl₂ 와 함께 칼슘 옥살레이트로서 A. 니게르 발효 배지로부터 침전된다. T. 레에세이에서의 카탈라아제 생성은 매우 낮은 수준의 옥살산을 야기한다. 네 가지 상이한 T. 레에세이 발효 후 평균 옥살산 농도는 단지 1.24 ± 0.15 g/ℓ 였다. 유리하게는, 이는 옥살레이트 침전에 대한 필요성을 배제시킨다.

사용 방법

본 발명은 과산화수소를 본원에서 기재되는 바와 같은 트리코데르마 숙주 세포에서 생성된 카탈라아제 효소와 접촉시키는 것을 포함하는, 과산화수소를 산소 및 물로 전환시키는 방법을 제공한다. 본 발명의 방법이 사용될 수 있는 적용에는 비제한적으로, 직물 표백, 펄프 또는 종이 표백 후 과산화수소의 제거, 또는 바이오사이드 (biocide) 로서의 사용이 포함된다. 본원에 기재된 카탈라아제 효소에 대해 적합한 가공 조건의 비제한적인 예에는 pH 3-9, 20-8O℃, 및 5000 ppm 이하 과산화수소가 포함된다.

조성물

본 발명은 또한 본원에서 기재된 바와 같은 트리코데르마 숙주 세포에서 생성된 카탈라아제 효소를 포함하는 조성물을 제공한다. 이러한 조성물은 과산화수소를 산소 및 물로 전환시키는 방법에 사용될 수 있다.

다양한 구현예에서는, 카탈라아제 효소는 액체, 고체, 전체 브로쓰 액체, 또는 전체 브로쓰 고체 제형으로 제공될 수 있다.

일부 구현예에서는, 깨끗이 된 카탈라아제가 약 800 내지 20,000 U/g 범위의 활성 농도로, pH 약 3-9에서 제공될 수 있다. 액체 제형은 폴리올, 예컨대 5-40% 소르비톨 또는 글리세롤, 염, 예컨대 5-20% 염화나트륨, 완충액 (시트레이트, 포스페이트, 또는 아세테이트 포함), 및 기타 성분, 예컨대 0.01-2% 포르메이트 및/또는 0.01-2% 나트륨 니트리트 및/또는 살균제, 예컨대 칼륨 소르베이트, 나트륨 벤조에이트, 및/또는 프록셀 (Proxel) (1,2-벤즈이소티아졸린-3-온) 을 포함할 수 있다.

키트

본 발명은 또한 키트를 제공한다. 한 구현예에서 키트는 임의로는, 예를 들어 직물 표백, 펄프 또는 종이 표백 후 과산화수소의 제거, 및/또는 바이오사이드로서의 사용과 같은 적용 또는 방법에서 카탈라아제 효소를 사용하기 위한 지시사항과 함께, 본원에 기재된 바와 같은 트리코데르마 숙주 세포에서 생성된 카탈라아제 효소를 제공한다. 적합한 포장이 제공된다. 본원에서 사용되는 바와 같은 "포장" 은 시스템에서 관습적으로 사용되는 고체 매트릭스 또는 물질을 나타내며, 본원에서 기재된 바와 같은 키트의 성분 (예를 들어 카탈라아제 효소) 을 고정된 경계 내에 지탱시킬 수 있다.

지시사항은 인쇄된 형태, 또는 플로피 디스크, CD 또는 DVD 와 같은 전자적 매체의 형태, 또는 이러한 지시사항을 얻을 수 있는 웹사이트 주소의 형태로 제공될 수 있다.

하기의 실시예는 발명을 제한하는 것이 아니라 설명하는 것으로 의도된다.

실시예

실시예 1. pTrex3gM ( CATE ) 발현 벡터의 구성

pTrex3g 보다 크기가 작은 플라스미드 pTrex3gM 을 개질에 의해 제조하였다 (PCT 출원 번호 WO 05/001036 에 기재됨). pTrex3gM 은 세균에서의 플라스미드 복제를 담당하는 서열에 있어서 주로 pTrex3g 와 상이하다. 하기 두 쌍의 프라이머를 사용하는 중합효소 연쇄 반응 (PCR) 에 의해 pUC19 로부터 암피실린 내성 유전자 및 복제 기원을 증폭시켜, pTrex3gM 을 구성하였다:

oMOB5 (GGTTCTAGAGGCCTAAATGGCCATGAGACAATAACCCTGATAAATGC) (SEQ ID NO:5) +

oMOB31 (AAGGCCTGCAGGGCCGATTTTGGTCATGAGATTATC) (SEQ ID NO:6); 및

oMOB51(TCGGCCCTGCAGGCCTTAACGTGAGTTTTCGTTCC) (SEQ ID NO:7) +

oMOB3 (GGTTCTAGAGGCCATTTAGGCCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGG) (SEQ ID NO:8).

두 가지 생성된 PCR 생성물을 PstI 및 XbaI 으로 소화시키고 pTrex3g 의 6.17 kb XbaI-XbaI 절편과 라이게이션시켜 Trex3gM 발현 벡터를 제조하였다. pTrex3gM 의 구조를 도 3 에서 설명하였다.

A. 니게르 균주 FS 1 (GICC 20047) 로부터의 catR 유전자의 전체 코딩 부위 (인트론 포함) (SEQ ID NO:2) 를, 하기의 프라이머 쌍과 함께 고-충실도 DNA 중합효소 PfuUltra II (Stratagene) 를 사용하여 증폭하였다:

oCAT 51 (CACCAAACAATAACAACAACAACAAACAACAACAACAACAACAACATGCGTCATTTCTGGCTTTTGCCAG) (SEQ ID NO:9) 및

oCAT 3 (CGTGATACCCTTACTCATCCAGCGC) (SEQ ID NO:10).

catR 유전자의 완전한 코딩 부위에 추가로, 생성된 PCR 생성물은 미코바이러스 PcV 에서 유래된 AC-풍부 5'-미번역 부위를 포함하였다. "번역 인핸서" 로서의 상기 부위의 가능한 기능이 제안된 바 있다 (Jiang et al. (2004) J. Gen. Virol. 85:2111-2121]. PCR 생성물을 pENTR 벡터 (Stratagene) 내로 클로닝한 후, Invitrogen 사제 Gateway® 클로닝 시스템을 사용하여 pTrex3gM 벡터 내로 이동시켜, 도 4 에서 설명한 바와 같이 벡터 pTrex3gM(CATE) 를 생성시켰다.

실시예 2. 트리코데르마 레에세이의 형질전환 및 형질전환된 균주의 스크리닝

트리코데르마 레에세이 균주 Morph 1.1 (pyr+) 은 쿼드-결실된 RL-P37 균주의 자연적 pyr4 복귀돌연변이체이다 (PCT 출원 번호 WO 05/001036 에 기재됨). 상기 균주로부터 새로이 수확된 포자를 얼음 냉각된 1.2 M 소르비톨에 현탁하고, 동일 용액으로 2회 세척하고, pTrex3gM(CATE) 플라스미드로부터의 정제된 7.04 kb catR-함유 SfiI-SfiI 절편으로 전기천공하였다. 전기천공 매개변수는 하기와 같았다: 전압: -16kV/cm; 전기용량: -25 μF; 저항: -50 Ω.

전기천공 후, 포자를 1 M 소르비톨, 0.3% 글루코오스, 0.3% 박토 펩톤 및 0.15% 효모 추출물 함유 배지에서 회전 진탕기에서 밤새 인큐베이션하였다 (3O℃; 200 rpm). 발아 포자를, 유일한 질소 공급원으로서 아세트아미드를 함유하는 선택 배지 (아세트아미드 0.6 g/ℓ; 염화세슘 1.68 g/ℓ; 글루코오스 20 g/ℓ; 칼륨 디하이드로겐 포스페이트 15 g/ℓ; 마그네슘 설페이트 헵타하이드레이트 0.6 g/ℓ; 염화칼슘 탈수물 0.6 g/ℓ; 철 (II) 황산염 5 mg/ℓ; 황산아연 1.4 mg/ℓ; 코발트 (II) 염화물 1 mg/ℓ; 망간 (II) 황산염 1.6 mg/ℓ; 한천 20 g/ℓ; pH 4.25) 상에 플레이팅하였다. 형질전환된 콜로니가 약 1주 내에 출현하였다. 개별적 형질전환체를 새로운 아세트아미드 선택 플레이트에 옮기고 2-4일 동안 성장시켰다.

선택 배지에서 안정적인 성장을 나타내는 단리물을, 웰의 바닥에 마이크로 필터가 장착된 마이크로타이터 플레이트 (Millipore MultiScreen-GV™) 의 웰 내에 락토오스 규정 배지 0.17 ㎖ 를 접종하는데 사용하였다 (WO 2005/001036, p.60) ((NH₄)₂SO₄ 5 g/ℓ; PIPPS 완충액 33 g/ℓ; 박토 카사미노산 9 g/ℓ; KH₂PO₄ 4.5 g/ℓ; CaCl₂*2H₂O 1.32 g/ℓ; MgSO₄*7H₂O 1 g/ℓ; 마주 (Mazu) DF204 5 ㎖/ℓ; 400X 미량 원소 2.5 ㎖/ℓ; pH 5.5; 락토오스 (별도로 멸균) 16 g/ℓ, 400X 미량 원소 용액: 시트르산 (무수물) 175 g/ℓ; FeSO₄*7H₂O 200 g/ℓ; ZnSO₄*7H₂O 16 g/ℓ; CuSO₄*5H₂O 3.2 g/ℓ; MnSO₄*4H₂O 1.4 g/ℓ; H₃BO₃ 0.8 g/ℓ). 상기 플레이트를 순수 산소 분위기에서 25-28℃ 에서 4-5일 동안 인큐베이션하였다. 배양 배지를 여과로 분리하고, 나트륨 도데실설페이트의 존재 하에 폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분석하였다 (SDS-PAGE). 새로운 단백질 밴드가 성숙 카탈라아제 폴리펩티드의 계산된 분자량보다 약간 더 높게 관찰되었다. 이러한 불일치는 글리코실화로 인한 것일 수 있다. 카탈라아제 밴드 내의 단백질 양은 강한 클론 변이를 나타내었다. 가장 높은 카탈라아제 발현을 갖는 클론을 선별하고, 포테이토-덱스트로오스 한천 상에서 포자 형성시키고, 단일 포자 서브클론의 단리를 통해 정제하였다.

형질전환된 T. 레에세이에서 생성된 카탈라아제는 촉매적으로 활성이었다. 예를 들어, 클론 329 로부터의 배양 브로쓰 (상기 기재된 바와 같이 성장시킨) 의 소량 (10 ㎕) 분취액을 200 ㎕ 의 1% H₂O₂ 와 혼합하여, 분자 산소의 격렬한 진전 (기포로서 보임) 에 의해 수반되는 즉각 가시적인 H₂O₂ 분해를 유발시켰다. 이러한 반응은 모체 균주 Morph 1.1 (pyr+) 로부터의 배양 브로쓰로는 관찰되지 않았다.

실시예 3. T. 레에세이 및 A. 니게르에서 발현된 카탈라아제의 분포 및 발현의 비교

샘플 제조

실시예 2 에서 기재된 바와 같이 T. 레에세이에서, 및 미국 특허 제 5,360,732 호 및 제 5,360,901 호에서 기재된 바와 같이 A. 니게르에서 카탈라아제 (A. 니게르 catR) 를 생성시켰다. 30 ㎖ 의 샘플을 4000 rpm (3210 x g) 에서 15분 동안 원심분리시켰다. 상청액을 따라내고, 펠릿을 50 ㎖ 탈이온수로 세척하였다. 세척된 세포를 이후 4000 rpm 에서 15분 동안 원심분리하고, 상청액을 따라내고, 펠릿을 50 ㎖ 탈이온수로 세척하였다. 세척된 세포를 4000 rpm 에서 15분 동안 한번 더 원심분리하고, 상청액을 따라내었다. 세포 펠릿을 드라이 아이스에서 동결시켰다. A. 니게르에 대한 평균 세포 질량 (건조 세포 중량) 은 43.3 g/kg 이고, T. 레에세이에 대한 평균 세포 질량은 43.9 g/kg 이었다.

화학적 추출

세포 펠릿을 샘플 병에 옮기고 40 ㎖ 탈이온수에 현탁하였다. 이후 이를 자석 교반기로 적당히 혼합하면서 수조에서 30℃ 에서 인큐베이션하였다. 25 ㎖ 의 추출 저장액 (50 g/ℓ NaCl; 6 g/ℓ 칼륨 소르베이트; 12 g/ℓ 나트륨 포르메이트; 12 g/ℓ 아세트산; pH 가 4.8-5.0 으로 조정되도록 첨가된 약 6 g/ℓ 수산화나트륨; 0.1 g/ℓ 프로테아제-C) 을 첨가한 후, pH 를 4.8-5.2 로 조정하였다. 샘플 병 상부를 느슨하게 닫은 후, 72-84시간 동안 인큐베이션을 지속하였다. 생성된 샘플 용액을 100 ㎖ 비커에 옮기고, 부피를 측정하였다. 이후, 베이커 (Baker) 카탈라아제 검정 방법을 사용하여 카탈라아제 활성을 측정하였다.

베이커 카탈라아제 검정

베이커 카탈라아제 검정은 과산화수소에 의한 카탈라아제의 동시 불활성, 및 카탈라아제에 의한 과산화수소의 분해를 기초로 하는 "이중 고갈 (double exhaustion)" 검정이다. 실행시, pH 7.0 및 25℃ 에서 60분 동안 카탈라아제와 함께 인큐베이션한 후 잔류 과산화수소를 반응 혼합물에서 분석하였다. 검정 조건 하에서 264 mg 의 과산화수소를 분해시킬 카탈라아제의 양으로서 1 베이커 단위를 정의하였다.

시약의 제조

0.2 M 인산염 완충액, ph 7.0: 10.76 g NaH₂PO₄ 및 17.32 g Na₂HPO₄ 를 800 ㎖ 증류수에 희석하고 잘 혼합하였다. pH 를 확인한 후, 증류수를 사용하여 최종 부피 1000 ㎖ 로 용액을 조정하였다.

완충된 기질: 500 ㎖ 의 0.2 M 인산염 완충액 (pH 7.0) 을 450 ㎖ 탈이온수와 혼합하였다. 44-46 ㎖ 의 30% 과산화수소를 첨가하였다. 상기 용액은 4℃ 에서 1주 동안 안정하였다.

M 황산: 55.6 ㎖ 농축 H₂SO₄ 를 900 ㎖ 의 증류수로 희석하고, 잘 혼합하고, 냉각시켰다. 증류수를 사용하여 최종 부피 1000 ㎖ 로 부피를 조정하였다.

40% (w/v) 요오드화칼륨 용액: 200 g 요오드화칼륨을 250 ㎖ 증류수에 첨가하고 잘 혼합하였다. 증류수를 사용하여 부피를 500 ㎖ 로 조정하였다. 용액을 냉장 (4℃) 하에 황색 (amber) 병에 보관하고, 1주 후 폐기하였다.

1% (w/v) 암모늄 몰리브데네이트 용액: 1.0 g (NH₄)₆Mo₇O₂₄ㆍ4H₂O 를 90 ㎖ 증류수에 첨가하고 잘 혼합하였다. 증류수를 사용하여 부피를 100 ㎖ 로 조정하였다.

0.25 M 나트륨 티오설페이트 용액: 62 g Na₂S₂O₃ㆍ5H₂O 를 900 ㎖ 증류수에 첨가하고 잘 혼합하였다. 증류수를 사용하여 부피를 1000 ㎖ 로 조정하였다. 상기 용액을 1주 이하로 보관하였다.

검정 절차

샘플을 3반복하여 하기와 같이 검정하였다:

1. 5 ㎖ 의 1.0 M 황산을 100 ㎖ 삼각 플라스크 (Erlenmeyer flask) 내로 피펫팅한다.

2. 4.0 ㎖ 의 완충된 기질을 황산에 피펫팅하고, 5 ㎖ 의 40% 요오드화칼륨 용액을 첨가한다. 혼합되도록 휘젓는다.

3. 1% 암모늄 몰리브데네이트 용액의 2 점적을 첨가하고, 0.25 M 나트륨 티오설페이트 용액으로 즉시 적정한다.

4. 자유 요오드 색이 완전히 사라질 때 적정 종말점에 도달된다. 색은 수 분 후에 다시 생길 수 있으며 이는 무시된다.

5. 14 내지 16 ㎖ 의 적정 부피가 수득된다. 필요시, 상기 적정 부피를 수득하기 위해서, 완충된 기질 용액 중 과산화수소의 농도를 조정한다.

6. 완충된 기질의 50 ㎖ 분취액을 마개로 살짝 막은 100 ㎖ 삼각 플라스크에 분배하고, 25℃ 로 설정된 수조에서 15분 동안 예비-인큐베이션한다.

7. 0.2 M 인산염 완충액을 사용하여 카탈라아제 샘플을 5-9 베이커 단위/㎖ 로 희석한다.

8. 200 ㎕ 의 희석된 카탈라아제 샘플을 예비-인큐베이션된 100 ㎖ 삼각 플라스크에 3분 간격으로 피펫팅하고, 즉각 휘저어 혼합한다.

9. 25℃ 에서 60분 동안 인큐베이션한다. 반응 혼합물로부터 산소를 유리시키기 위해 가끔 진탕시킨다.

10. 인큐베이션 기간 종료시, 모든 산소가 제거될 때까지 반응 혼합물을 진탕한다.

11. 상기 단계 1-4 에서 기재된 방법을 사용하여 잔류 과산화수소를 분석한다 (4.0 ㎖ 의 시험 용액을 황산에 피펫팅하고 단계 2-4 를 따름).

12. 단계 8 에서 희석된 카탈라아제 샘플 대신 200 ㎕ 의 0.2 M 인산염 완충액을 사용하는 기질 블랭크를, 유사하게 인큐베이션하고 분석한다 (블랭크에는 14-16 ㎖ 적정 부피가 필요함).

활성의 계산

베이커 단위로의 카탈라아제 활성 (U/㎖) = (B-S) x DF

(식 중,

B 는 블랭크의 적정 부피 (㎖) 이고,

S 는 샘플의 적정 부피 (㎖) 이고,

DF 는 샘플의 희석 인자임)

최고 정확도를 위해서는, 차이 (B-S) 가 5-10 ㎖ 이어야 한다.

결과

결과를 하기 표 1 에 나타내었다.

[표 1]

실시예 4. A. 니게르 및 T. 레에세이에서 발현된 카탈라아제에 대한 Tm 비교

실시예 2 에서 기재된 바와 같이 T. 레에세이에서, 및 미국 특허 제 5,360,732 호 및 제 5,360,901 호에서 기재된 바와 같이 A. 니게르에서 카탈라아제 (A. 니게르 catR) 를 생성시켰다.

용융점에 대한 pH 의 효과

A. 니게르 또는 T. 레에세이에서 발현된 카탈라아제를, 1 단위 증가로, pH 3-8 로 조정된 완충액에 약 0.5 mg/㎖ 의 농도로 현탁하였다. 완충액은 250 mM 시트르산 (pH 3), 250 mM 나트륨 아세테이트 트리하이드레이트 (pH 4), 250 mM 나트륨 시트레이트 (pH 5), 25 mM 비스 트리스 프로판 (pH 6, 7 및 8) 이었다. MicroCal VP-Capillary DSC (MicroCal, LLC Northampton, MA) 를 사용하여, 200℃/시간의 속도로 30℃ 내지 120℃ 온도 스캔으로 실행하여 시차 주사 열량계 (DSC) 로 샘플을 분석하였다. 단백질이 첨가되지 않은 동일한 완충액을 참조 용액으로서 사용하였다. 온도 대 Cp 플롯 (cal/deg C) 으로부터의 최대 피크 높이를 관찰하여, 용융점 (Tm) 을 측정하였다. 상기 측정에 대한 DSC 오류는 약 +/- 1℃ 였다. 결과를 도 5 에 나타내었다.

H ₂ O ₂ 전처리의 효과

A. 니게르 또는 T. 레에세이에서 발현된 카탈라아제를, 25℃, 5O℃ 또는 7O℃ 로 예비가온된 완충액 (50 mM 인산칼륨, pH 7) 에서 약 0.5 mg/㎖ 의 농도로 현탁하였다. 이후 H₂O₂ 를 약 3% 의 농도로 첨가하였다. 샘플을 각각의 온도에서 15분 동안 유지시킨 후, 4℃ 로 냉각하고, 상기 기재된 바와 동일한 방법을 사용하여 DSC 로 분석하였다. H₂O₂ 에 노출시키지 않았다는 것을 제외하고는 동일하게 처리된 샘플의 대응 집합이 실험 대조군으로서 역할하였다. 상기 측정에 대한 DSC 의 오류는 약 +/- 1℃ 였다. 결과를 도 6 에 나타내었다.

실시예 5. 엔도 T 결실된 T. 레에세이 숙주 세포에서의 A. 니게르 카탈라아제 발현

T. 레에세이의 엔도 T 유전자에 대한 분열 카세트의 구성

PCT 출원 번호 WO 2006/050584 에서 제공된 정보를 사용하여 T. 레에세이의 게놈 서열에서 엔도 T 유전자를 확인하였다 (http://genome.jgi-psf.org/Trire2/Trire2.home.html). 이의 5' 플랭킹 부위 (flanking region) (1.9 Kb) 를 프라이머 SK915 (5'-CTGATATCCTGGCATGGTGAATCTCCGTG-3') (SEQ ID NO:11) 및 SK916 (5'-CATGGCGCGCCGAGGCAGATAGGCGGACGAAG-3') (SEQ ID NO:12) 를 사용하여 PCR 로 증폭하였다. 3' 플랭킹 부위 (1.7 Kb) 를 프라이머 SK917 (5'-CATGGCGCGCCGTGTAAGTGCGTGGCTGCAG-3') (SEQ ID NO:13) 및 SK918 (5'-CTGATATCGATCGAGTCGAACTGTCGCTTC-3') (SEQ ID NO:14) 를 사용하여 PCR 로 증폭하였다. 모든 PCR 반응에서 PfuII Ultra (Stratagene) 를 중합효소로서 사용하였다.

PCR 반응 생성물을, 매뉴얼에 열거된 프로토콜에 따라 QIAquick PCR 정제 키트 (Qiagen) 로 정제하였다. 증폭된 DNA 절편 모두를 제한 엔도뉴클레아제 AscI 로 소화시킨 후, 소화된 DNA 를 QIAquick 키트를 사용하여 정제하였다. 두 DNA 절편을 혼합하고, 프라이머 SK915 및 SK918 과 함께 융합 PCR 반응용 주형으로서 사용하였다. 상기 반응의 생성물, 3.6 kb DNA 절편을 Zero Blunt TOPO PCR 클로닝 키트 (Invitrogen) 를 사용하여 pCR-Blunt II TOPO 벡터에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드의 구조 (pCR-BluntII-TOPO(5'-3' 플랭크)) 를 제한 분석으로 확실히 하였다.

클로리무론 에틸에 대해 내성을 부여하는 T. 레에세이 아세토락테이트 합성효소 (ALS) 유전자의 돌연변이체 형태 (WO 2008/039370) 를 PCR 프라이머 SK949 (5'-GTTTCGCATGGCGCGCCTGAGACAATGG-3') (SEQ ID NO:15) 및 SK946 (5'-CACAGGCGCGCCGATCGCCATCCCGTCGCGTC-3') (SEQ ID NO:16), 및 주형으로서 pTrex-글루코아밀라아제 벡터 (WO 2008/039370, 실시예 2) 를 사용하여 증폭하였다. PCR 반응 생성물을 QIAuick 키트로 정제하고, AscI 으로 소화시키고 다시 정제하고, 동일한 효소로 소화되고 유사하게 정제된 pCR-BluntII-TOPO (5'-3' 플랭크) 와 라이게이션시켰다. 생성된 플라스미드 pCR-BluntII-TOPO (5' 플랭크-ALS 마커-3' 플랭크) 내의 삽입물의 기원을 제한 분석에 의해 확립하였다.

T. 레에세이 염색체 서열의 추가적인 절편 ("3'-반복" 으로 나타냄) 을, 동일한 기술 및 프라이머 MC40 (5'-CTATGACATGCCCTGAGGCGATGCTGGCCAGGTACGAGCTG-3') (SEQ ID NO:17) 및 MC41 (5'-CAGCCTCGCGGTCACAGTGAGAGGAACGGGGTGAAGTCGTATAAG-3') (SEQ ID NO:18) 을 사용하여 증폭하였다. 상기 서열은 pCR-BluntII-TOPO (5'-3' 플랭크) 내에 포함되는 3'-플랭크 영역의 보다 하류인 T. 레에세이 염색체 상에 위치한다. In-Fusion Dry-Down PCR 클로닝 키트 (Clontech) 를 사용하여, 상기 PCR 의 0.46 kb 생성물 (3'-반복) 을 pCR-BluntII-TOPO (5' 플랭크-ALS 마커-3' 플랭크) 내의 ALS 유전자의 상류에 클로닝하였다. 3' 반복에서 클로닝하기 위한 벡터로 사용하기 위해서, pCR-BluntII-TOPO (5' 플랭크-ALS 마커-3' 플랭크) 를 PasI 및 BstEII 로 소화시켰다. 생성된 구성물 pCR-BluntII-TOPO (5' 플랭크-ALS 마커-3' 반복-3' 플랭크) 를, 프라이머 SK1008 (CTAGCGATCGCGTGTGCACATAGGTGAGTTCTCC) (SEQ ID NO:19) 및 SK1009 (CTAGCGATCGCGCAGACTGGCATGCCTCAATCAC) (SEQ ID NO:20) 와 함께 PCR 용 주형으로서 사용하였다.

7.5 kb DNA 생성물을 Invitrogen 사제의 상응하는 키트를 사용하여 pCR-BluntII-TOPO 벡터에 클로닝하였다. 생성된 플라스미드를 AsiSI 으로 소화시키고, 7.5 kb DNA 절편 (엔도-T 결실 카세트) 을 분취 아가로오스 겔 전기영동으로 정제하였다. 완전한 뉴클레오티드 서열을 하기에 나타내었다.

T. 레에세이에서의 엔도-T 유전자의 분열

T. 레에세이의 쿼드 결실된 균주 (△cbh1, △cbh2, △egl1, △egl2) 가 PCT 출원 번호 WO05/001036 에 기재되어 있다. [Penttila et al. (Penttila M. et al. 1987. A versatile transformation system for the cellulolytic filamentous fungus Trichoderma reesei. Gene 61: 155-164)] 에 의해 기재된 형질전환 방법을 사용하여, 상기 균주를 SEQ ID NO:21 에서와 같이 열거된 결실 카세트로 형질전환하였다. 형질전환체를 200 ppm 클로리무론 에틸 함유 개질된 보겔 배지 (Modified Vogel's medium) 상에서 선별하였다 (WO 2008/039370). 형질전환체를 액체 배지에서 배양하고, 배양 상청액을 SDS 겔 전기영동으로 분석하였다.

겔 상에서 대부분의 단백질 밴드 이동성에 있어서 상향 이동을 나타내는 2개의 클론 (#11 및 #74) 이 확인되었다. 이들 두 균주 뿐 아니라 T. 레에세이의 모체 쿼드 결실 균주로부터 염색체 DNA 를 단리하였다. 프라이머 쌍 MC 42 + MC 48 (5'-CTCGCCATCTGACAACCTACAAATC-3' (SEQ ID NO:22) 및 5'-CTAGTACCCTGAGTTGTCTCGCCTCC-3' (SEQ ID NO:23)) 및 MC 45 + MC 50 (5'-CCTCTACCATAACAGGATCCATCTG-3' (SEQ ID NO:24) 및 5'-CGTGAGCTGATGAAGGAGAGAACAAAGG-3' (SEQ ID NO:25)) 을 사용하여 이들 DNA 제조물에 대해 PCR 분석을 수행하였다.

예측된 크기의 생성물 (2.9 및 2.3 kb) 을 클론 #74 에서 단리된 DNA 로 수득하였다. 이들 클론을 2 연속 라운드 정제하였다 (단일 포자의 자손의 단리에 의해). 정제된 형질전환체 #74 로부터 DNA 를 단리하였다. PCR 분석을 반복하여 엔도-T 유전자의 성공적인 결실을 확증하였다.

카탈라아제 발현 벡터로의 T. 레에세이의 엔도-T 결실 균주의 형질전환

T. 레에세이의 엔도-T 결실 균주의 새로이 수확된 포자를 얼음 냉각된 1.2 M 소르비톨에 현탁하고, 동일한 용액으로 2회 세척하고, 플라스미드 pTrex3gM(CATE) 의 정제된 7.04 kb SfiI-SfiI 절편을 사용하여 전기천공하였다. 형질전환 및 형질전환체의 스크리닝을 본질적으로 상기 기재한 바와 같이 수행하였다. 높은 양의 카탈라아제를 발현하는 클론 #26 을 확인하고, 2 라운드의 포자 정제를 수행하였다. 상기 클론의 정제된 단리물에 의해 생성되는 카탈라아제를, 재조합 효소의 특성에 대한 엔도-T 결실의 효과에 대한 모든 연구에서 사용하였다.

실시예 6. A. 니게르 , T. 레에세이 , 및 엔도-T 결실된 T. 레에세이에서 발현된 카탈라아제의 비교

A. 니게르 카탈라아제를 A. 니게르, T. 레에세이, 및 엔도-T 유전자 결실된 T. 레에세이에서 발현시켰다. 탈글리코실화를 초래하기 위해 각각의 카탈라아제 샘플을 엔도 H 효소로 소화시켰다. 탈글리코실화를 갖거나 갖지 않는 샘플을 SDS-PAGE 겔 상에서 런닝시켰다. 결과를 도 7 에 나타내었다.

글리코실화를 제거하기 위한 엔도 H 처리 전 및 후의 분자량에 있어서의 변화는 A. 니게르 및 엔도-T 결실된 T. 레에세이로부터의 샘플에 대해 더 큰 것으로 보인다. 따라서, 이들 카탈라아제 효소가 엔도-T 결실을 갖지 않는 T. 레에세이로부터의 카탈라아제보다 더 높은 수준의 글리코실화를 포함하는 것으로 나타난다.

A. 니게르 및 엔도-T 결실된 T. 레에세이로부터의 카탈라아제 효소의 출발 분자량은 엔도-T 결실을 갖지 않는 T. 레에세이로부터의 카탈라아제의 출발 분자량보다 약간 더 높은 것으로 보인다. 따라서, 이들 카탈라아제가 엔도-T 결실을 갖지 않는 T. 레에세이로부터의 카탈라아제보다 더 높은 정도의 글리코실화를 포함하는 것으로 나타난다. 이러한 차이는 대안적 또는 추가적으로는 서열 차이로 인한 것일 수 있으나, 이는 조사된 바 없다.

실시예 7. A. 니게르 , T. 레에세이 , 및 엔도-T 결실된 T. 레에세이에서 생성된 A. 니게르 카탈라아제의 활성 비교

카탈라아제의 평가

카탈라아제의 평가는 상이한 카탈라아제가 상이한 성능을 나타낸다는 관찰을 기초로 하였다. 이러한 차이는 '스트레스 조건' (고온 및 고농도의 과산화수소) 하에서 가장 명백하였다. 각각의 카탈라아제를, 상기 평가를 위해 동일한 총량의 활성 단위로 투여하였다. 과산화수소가 약 20분 안에 분해되도록 하는 투여 총 활성을 선택하였다.

카탈라아제 활성의 측정

하기의 방법을 사용하여 효소 활성을 측정하였다.

시약

기질 용액:

- 25 ㎖ 0.2 M 인산염 완충액 (pH 7.0) 과

- 130 ㎕ 의 30% H₂O₂ 를 혼합하고,

탈염수를 사용하여 부피를 100 ㎖ 로 만든다.

기질 용액의 흡광도는 0.52 내지 0.55 여야 한다. 필요한 경우 과산화물의 양을 조정한다.

완충 용액: 25 ㎖ 의 0.2 M 인산염 완충액 (pH 7.0) 을 탈염수를 사용하여 100 ㎖ 로 희석한다.

카탈라아제 샘플 제조:

10.00 ㎖ 용량 플라스크에서 약 1 g 의 카탈라아제 생성물을 정확히 칭량 (4자리 소수점) 하여, 10.00 ㎖ 표시까지 부피를 만들고 혼합한다. 상기 용액으로부터 추가적인 희석물을 제조할 수 있다.

효소 활성의 측정:

쿼츠 큐벳에 하기를 첨가하고 혼합한다:

2.9 ㎖ 기질 용액,

100 ㎕ (희석된) 카탈라아제 샘플.

0.450 에서 0.400 으로 하강하는 240 nm 에서의 흡광도에 대한 시간을 측정한다 (초 단위). 시간은 35 내지 50초 범위에 있어야 한다. 시간이 상기 범위 밖에 있는 경우, 올바른 희석이 발견될 때까지 상이한 희석을 시험한다 (시행착오 (trial and error)).

카탈라아제 활성의 계산:

하기 화학식으로 카탈라아제 생성물의 활성을 계산할 수 있다.

F = 희석 인자

V = 용량 플라스크의 부피

t = 시간 (초)

w = 카탈라아제 생성물의 중량 (g)

카탈라아제 성능 평가

시약

기질 용액 (1000 ppm H₂O₂):

250 ㎖ - 0.2 M 인산염 완충액 (pH 7.0) 과

- 3 ㎖ 30% H₂O₂ 를 혼합하고,

탈염수를 사용하여 부피를 1 ℓ 로 만든다.

완충 용액: 250 ㎖ 의 0.2 M 인산염 완충액 (pH 7.0) 을 탈염수를 사용하여 1 ℓ 로 희석한다.

샘플 희석:

카탈라아제 희석은 완충액에서 수행될 필요가 있다. 목표는 과산화수소를 약 20분 안에 분해하는 것이다. 참조로 사용된 아스퍼질루스 니게르 카탈라아제에 대해서, 약 400 단위를 사용하였다. 다른 카탈라아제에 대해서, 동량의 단위를 투여하였다.

절차

250 ㎖ 부피의 스캇 병 (Schott bottle) 에서 인큐베이션을 수행하였다. 100 ㎖ 의 기질을 병에 첨가하고, 이를 7O℃ 에서 수조 내에 두었다. 기질 온도가 7O℃ 일 때, 소량 (1 ㎖ 이하) 의 (희석된) 카탈라아제를 병에 첨가하여 반응을 시작시키고, 동시에 타이머를 시작시켰다. 용액을 때때로 혼합시켰다. 1 또는 2분 간격에서, 3 ㎖ 를 병으로부터 500 ㎕ 의 10% 황산 용액 함유 시험 튜브 내로 옮겨 반응을 중단시켰다. 15-30분 까지 샘플을 취할 때까지 샘플링을 지속하였다. t = 0 측정에 대해서는, 3 ㎖ 의 기질을 500 ㎕ 의 10% 황산 용액 함유 시험 튜브에 옮겼다. (시험 조건 하에 과산화물 용액의 안정성을 시험하기 위한) 블랭크 시험에 대해서는, 완충액 (카탈라아제로의 시험에서와 동일한 부피) 을 기질과 함께 병에 첨가하고, 동일한 절차를 따랐다. 용액의 흡광도를 240 nm 에서 측정하였다.

트리코데르마 레에세이에서 발현된 아스퍼질루스 니게르 카탈라아제 및 아스 퍼질루스 니게르 카탈라아제의 성능 평가

샘플

A. 니게르 및 T. 레에세이에서 발현된 A. 니게르 카탈라아제를 상기 기재된 활성 검정으로 시험하였다.

샘플 제조

1 g 의 카탈라아제를 100.00 ㎖ 부피의 용량 플라스크에서 칭량하고, 50 mM 인산염 완충액을 사용하여 100.00 ㎖ 가 되게 하였다. 1.2 ㎖ 를 A. 니게르 샘플에 대해 사용하고, 1.39 ㎖ 를 T. 레에세이 샘플에 대해 사용하였다. 카탈라아제 검정의 결과를 하기 표 2 에 나타내었다 (240 nm 에서의 흡광도).

[표 2. A. 니게르 및 T. 레에세이에서 발현된 A. 니게르 카탈라아제의 활성]

아스퍼질루스 니게르 , 트리코데르마 레에세이 , 및 엔도-T 결실된 트리코데르마 레에세이에서 발현된 아스퍼질루스 니게르 카탈라아제의 성능 평가

카탈라아제 활성을 하기 표 3 에 나타낸 샘플에 대해 측정하였다.

[표 3. 카탈라아제 샘플]

결과를 하기 표 4 (240 nm 에서의 흡광도) 및 도 8 에 나타내었다.

[표 4. A. 니게르, T. 레에세이, 및 엔도-T 결실된 T. 레에세이에서 발현된 A. 니게르 카탈라아제의 활성]

명확한 이해를 위해 전술한 발명을 설명 및 실시예로써 일부 상세히 기술하였지만, 본 발명의 취지 및 범주를 벗어나지 않고 특정 변화 및 변형을 실행할 수 있다는 것이 당업자에게 명백할 것이다. 그러므로, 이러한 기술은 본 발명의 범주를 제한하는 것으로 파악되어서는 안 된다.

본원에 인용된 모든 발행물, 특허 및 특허 출원은 모든 목적에 대해, 및 각각의 개별적 발행물, 특허 또는 특허 출원이 특이적 및 개별적으로 참고문헌으로 포함되는 것으로 나타내어지는 것과 동일한 정도로 그 전문이 본원에 참고문헌으로 포함된다.

<110> DANISCO US INC., GENENCOR DIVISION DODGE, Timothy HOFFMAN, Katherine Marie MIASNIKOV, Andrei WARD, Michael <120> EXPRESSION OF CATALASE IN TRICHODERMA <130> 31006WO-2 <140> PCT/US09/36146 <141> 2009-03-05 <150> US 61/034,788 <151> 2008-03-07 <160> 25 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 730 <212> PRT <213> Aspergillus niger <400> 1 Met Arg His Phe Trp Leu Leu Pro Ala Val Ala Gly Ile Ala Gly Ala 1 5 10 15 Gln Cys Pro Tyr Leu Ser Gly Glu Met Ser Phe Thr Gln Glu Gln Asp 20 25 30 Asn Ala Gly Asp Thr Ile Glu Val Thr Glu Gln Pro Ile Asp Asn Thr 35 40 45 Leu Tyr Val Asn Asp Thr Gly Ser Tyr Met Thr Thr Asp Phe Gly Thr 50 55 60 Pro Ile Ser Asp Gln Thr Ser Leu Lys Ala Gly Pro Arg Gly Pro Thr 65 70 75 80 Leu Leu Glu Asp Phe Ile Phe Arg Gln Lys Leu Gln Arg Phe Asp His 85 90 95 Glu Arg Val Pro Glu Arg Val Val His Ala Arg Gly Ala Gly Ala Tyr 100 105 110 Gly Thr Phe Lys Ser Tyr Ala Asp Trp Ser Asn Val Thr Ala Ala Asp 115 120 125 Phe Leu Ser Ala Asn Asp Lys Glu Thr Pro Met Phe Cys Arg Phe 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tggccatatg gccgagggct atgcccgtgc ctcgggcaaa 4020 cccggtgtcg tcctggtgac ttccggcccc ggtgctacca atgtcatcac gcccatgcag 4080 gatgccctgt cggacggaac gcccttggtc gtcttctgcg gccaggtccc caccacggcc 4140 atcggcagcg atgacttcca agaggccgac gtcgtgggca tctcgcgggc ctgcaccaag 4200 tggaacgtca tggtcaagag cgttgctgag ctgccgcgga gaatcaacga ggcctttgag 4260 attgccacca gcggccgccc tggccccgtc ctcgtcgacc tgcccaagga tgtcacggct 4320 ggtatcctga ggagagccat ccctacggag actgctctgc cgtctctgcc cagtgccgcc 4380 tcccgcgccg ccatggagct gagctccaag cagctcaacg cctccatcaa gcgtgccgcc 4440 gacctcatca acatcgccaa gaagcccgtc atctacgccg gtcagggtgt catccagtcc 4500 gagggcggcg ttgagctcct gaagcagctg gcggacaagg cctccatccc cgtcaccacc 4560 accctccatg gcctgggtgc ctttgatgag ctggacgaga agtcgctgca catgctgggc 4620 atgcacggct cggcgtatgc caacatggcc atgcagcagg ccgacctcat catcgccctc 4680 ggcagccgat tcgacgaccg tgttactctg aatgtctcca aatttgcgcc tgcagccagg 4740 caagctgctg ccgagggccg cggcggcatc attcactttg agatcatgcc caagaacatc 4800 aacaaggtca tccaggcgac 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gccagggcca caaacacggt gtcgtcctgg tccagcttcc 6540 gaagcctctc catggacttg atcgcctcgt ccacgtcctg gtgcatgctg gtcccgcctg 6600 gacacccgtc gaggctgagc gggcggcttc catcgagaac actgcgagcg tggcagcagt 6660 cgccgcccat gaggacccat tcgtcgaagc ccgtctgggc caatccggtg acgtggccgg 6720 ggaggtgtcc cggcgcgtcg acaatgtaga agctgccgtc gccgaagaag tcgtgagcat 6780 acgggaacgg gccgagagga atccatttgt cctcggtccg gctcagctcg gtgtaattct 6840 cgcgggtgag cagcgatctc agcatcgccg agttggggtc gacggggtat ccgggcaggg 6900 cggctgcttt tgtgcccggg ccggcgatgt aggggacgtt ggggaagaga gagggatcgc 6960 cgatgtggtc gtagtggata tggctgacga cgattgcgct cagggagtct ggggagacgg 7020 ggccctcgga gaggaggtcg cgggcgtctt tggggacttg gggttcgaag atgtggctga 7080 tggagcggaa gagcggaggg atgacgtcca ggttctggag aaatggttat ttgagattta 7140 atgtccggag atggaatttc tcgtcggtaa atggactctg cgtgagcctt gaggacactc 7200 acctttggca ggccggcgtc aaacaagatg ttcttccccg agggatggcg cacgaggaag 7260 ctgtagtcgg gaagacgctg gcgcaccttg acaatgtcgt cgtcgccgtc ttgccagatc 7320 catcggtcgg gcaggtgaac ccaccccgtg ggaagggcgt atacctggac agtgttggtc 7380 gaggcaaacg aggataggag acccatgatg aagacgggat cccaactgca acggaacgga 7440 tggggtgatt gaggcatgcc agtctgcgcg at 7472 <210> 22 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 22 ctcgccatct gacaacctac aaatc 25 <210> 23 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 23 ctagtaccct gagttgtctc gcctcc 26 <210> 24 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 24 cctctaccat aacaggatcc atctg 25 <210> 25 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic primer <400> 25 cgtgagctga tgaaggagag aacaaagg 28

Claims

과산화수소를 산소 및 물로 효소적으로 전환시키는 것을 촉진할 수 있는 폴리펩티드의 제조 방법으로서, 트리코데르마 (Trichoderma) 숙주 세포에서 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드로부터 폴리펩티드를 발현시키는 것을 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 아스퍼질루스 니게르 (A. 니게르, Aspergillus niger) 로부터의 카탈라아제 효소인 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 A. 니게르 catR 유전자를 포함하는 방법.
제 1 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:1 에서 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 방법.
제 4 항에 있어서, 상기 트리코데르마 숙주 세포가 트리코데르마 레에세이 (T. 레에세이, Trichoderma reesei) 세포인 방법.
제 5 항에 있어서, T. 레에세이에서의 상기 폴리펩티드의 발현이 A. 니게르에서의 동일한 폴리펩티드의 발현을 약 50% 이상 초과하는 방법.
제 5 항에 있어서, 상기 T. 레에세이 숙주 세포로부터 성장 배지로 분비되는 상기 폴리펩티드의 양이 A. 니게르 숙주 세포로부터 성장 배지로 분비되는 상기 폴리펩티드의 양을 약 80% 이상 초과하는 방법.
제 1 항에 있어서, 트리코데르마 숙주 세포가 엔도-T 유전자의 결실을 포함하는 방법.
하기를 포함하는, 과산화수소를 산소 및 물로 효소적으로 전환시키는 것을 촉진할 수 있는 폴리펩티드 제조 방법:
(a) 상기 폴리펩티드를 인코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터로 트리코데르마 숙주 세포를 형질전환시키고;
(b) 상기 폴리펩티드의 발현에 적합한 조건 하에 성장 배지에서 상기 트리코데르마 숙주 세포를 성장시키고;
(c) 상기 성장 배지에서 상기 폴리펩티드를 단리함.
제 9 항에 있어서, 상기 폴리펩티드가 A. 니게르로부터의 카탈라아제 효소인 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 A. 니게르 catR 유전자를 포함하는 방법.
제 9 항에 있어서, 상기 폴리뉴클레오티드가 SEQ ID NO:1 에서 나타내는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 방법.
제 12 항에 있어서, 상기 트리코데르마 숙주 세포가 T. 레에세이 세포인 방법.
제 13 항에 있어서, T. 레에세이에서의 상기 폴리펩티드의 발현이 A. 니게르에서의 동일한 폴리펩티드의 발현을 약 50% 이상 초과하는 방법.
제 14 항에 있어서, 상기 T. 레에세이 숙주 세포로부터 성장 배지로 분비되는 상기 폴리펩티드의 양이 A. 니게르 숙주 세포로부터 성장 배지로 분비되는 상기 폴리펩티드의 양을 약 80% 이상 초과하는 방법.
제 9 항에 있어서, 트리코데르마 숙주 세포가 엔도-T 유전자의 결실을 포함하는 방법.
제 1 항의 방법에 따라 제조되는, 과산화수소를 산소 및 물로 효소적으로 전환시키는 것을 촉진할 수 있는 폴리펩티드.
제 17 항에 있어서, 트리코데르마 숙주 세포가 엔도-T 유전자의 결실을 포함하는 폴리펩티드.
제 9 항의 방법에 따라 제조되는, 과산화수소를 산소 및 물로 효소적으로 전환시키는 것을 촉진할 수 있는 폴리펩티드.
제 19 항에 있어서, 트리코데르마 숙주 세포가 엔도-T 유전자의 결실을 포함하는 폴리펩티드.
제 17 항의 폴리펩티드와 과산화수소를 접촉시키는 것을 포함하는, 과산화수소를 산소 및 물로 전환시키는 방법.
제 19 항의 폴리펩티드를 포함하는, 과산화수소를 산소 및 물로 전환시키기 위한 조성물.