JPH0646861A - スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコードするｄｎａのクローニング及び発現 - Google Patents
スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコードするｄｎａのクローニング及び発現Info
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- C12N9/0051—Oxidoreductases (1.) acting on a sulfur group of donors (1.8)
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Abstract
(57)【要約】
【目的】 特定の起源からスルフヒドリルオキシダーゼ
をコードする遺伝子を同定・単離して、組換えＤＮＡ技
術を利用して高スルフヒドリルオキシダーゼ産生能を有
する細胞を得、かかる細胞の生産するスルフヒドリルオ
キシダーゼをＳＨ基の酸化を要する種々のプロセスに使
用する 【構成】 スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有するポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する組
換えＤＮＡ、上記組換えＤＮＡの発現により得られるポ
リペプチド、上記組換えＤＮＡを含んでなる細胞、上記
細胞によるスルフヒドリルオキシダーゼの生産方法、並
びに上記ポリペプチドの用途
をコードする遺伝子を同定・単離して、組換えＤＮＡ技
術を利用して高スルフヒドリルオキシダーゼ産生能を有
する細胞を得、かかる細胞の生産するスルフヒドリルオ
キシダーゼをＳＨ基の酸化を要する種々のプロセスに使
用する 【構成】 スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有するポ
リペプチドをコードするヌクレオチド配列を含有する組
換えＤＮＡ、上記組換えＤＮＡの発現により得られるポ
リペプチド、上記組換えＤＮＡを含んでなる細胞、上記
細胞によるスルフヒドリルオキシダーゼの生産方法、並
びに上記ポリペプチドの用途
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は組換えＤＮＡの技術分野
に関するものであり、特にスルフヒドリルオキシダーゼ
活性を有するポリペプチドの生物工学的生産における組
換えＤＮＡ法の使用に関するものである。
に関するものであり、特にスルフヒドリルオキシダーゼ
活性を有するポリペプチドの生物工学的生産における組
換えＤＮＡ法の使用に関するものである。
【０００２】スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する
ポリペプチドは、例えばベイカリイ製品の製造或いは牛
乳やビールからの異臭の除去のように、遊離のスルフヒ
ドリル（ＳＨ）基を酸化してジスルフィド結合を生じさ
せることが望まれる状況下で使用することのできるポリ
ペプチドである。
ポリペプチドは、例えばベイカリイ製品の製造或いは牛
乳やビールからの異臭の除去のように、遊離のスルフヒ
ドリル（ＳＨ）基を酸化してジスルフィド結合を生じさ
せることが望まれる状況下で使用することのできるポリ
ペプチドである。
【０００３】
【従来の技術】スルフヒドリルオキシダーゼ（ＳＯＸ）
は次の反応式： ２Ｒ−ＳＨ ＋ Ｏ2 → Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ ＋ Ｈ2
Ｏ2 に従って、チオ−ル化合物の対応ジスルフィド化合物へ
の変換を触媒することが知られている酵素である。従っ
て、ＳＯＸは、遊離ＳＨ基のジスルフィド結合への酸化
が求められる用途に重要性を有する。
は次の反応式： ２Ｒ−ＳＨ ＋ Ｏ2 → Ｒ−Ｓ−Ｓ−Ｒ ＋ Ｈ2
Ｏ2 に従って、チオ−ル化合物の対応ジスルフィド化合物へ
の変換を触媒することが知られている酵素である。従っ
て、ＳＯＸは、遊離ＳＨ基のジスルフィド結合への酸化
が求められる用途に重要性を有する。
【０００４】ジスルフィド結合の形成をもたらすために
従来用いられてきた過酸化水素、過酸、ホウ酸塩、臭化
物などの非特異的な酸化剤は、望ましくない副反応を起
こす危険性があるという欠点を有する。これに対して、
ＳＯＸ酵素による遊離ＳＨ基の酸化のような酸素によっ
て触媒される反応は、副反応を起こさずに、所望の選択
性を与える。例えば、食品内の別の成分が非特異的酸化
剤の作用によって酸化されることに起因する風味の問題
は、酵素触媒反応の特異性のために解消することができ
る。ＳＯＸのその他の利点は、ＳＯＸによる酸化作用が
非特異的酸化剤よりも温和な条件下で起こることである
が、このことは食品系において有用であり、ＳＯＸ活性
を生じせしめるために食品系を強酸性、強塩基性或いは
高温条件におく必要がない。反対に、非特異的酸化剤を
用いる場合にはかかる条件が必要とされるが、かかる条
件は食品系の官能的性質に悪影響を与える。さらに、酵
素触媒酸化反応は、非特異的酸化剤の触媒する酸化反応
よりも一般に反応速度が高い。
従来用いられてきた過酸化水素、過酸、ホウ酸塩、臭化
物などの非特異的な酸化剤は、望ましくない副反応を起
こす危険性があるという欠点を有する。これに対して、
ＳＯＸ酵素による遊離ＳＨ基の酸化のような酸素によっ
て触媒される反応は、副反応を起こさずに、所望の選択
性を与える。例えば、食品内の別の成分が非特異的酸化
剤の作用によって酸化されることに起因する風味の問題
は、酵素触媒反応の特異性のために解消することができ
る。ＳＯＸのその他の利点は、ＳＯＸによる酸化作用が
非特異的酸化剤よりも温和な条件下で起こることである
が、このことは食品系において有用であり、ＳＯＸ活性
を生じせしめるために食品系を強酸性、強塩基性或いは
高温条件におく必要がない。反対に、非特異的酸化剤を
用いる場合にはかかる条件が必要とされるが、かかる条
件は食品系の官能的性質に悪影響を与える。さらに、酵
素触媒酸化反応は、非特異的酸化剤の触媒する酸化反応
よりも一般に反応速度が高い。
【０００５】スルフヒドリルオキシダーゼ処理が重要性
をもつプロセスの具体例として、超高温（ＵＨＴ）殺菌
した牛乳から焦げ臭さを除去するためのプロセスを挙げ
ることができる。ＳＯＸのかかる用途に関する詳細は、
米国特許第４０８７３２８号及び同第４０５３６４４号
に記載されている。
をもつプロセスの具体例として、超高温（ＵＨＴ）殺菌
した牛乳から焦げ臭さを除去するためのプロセスを挙げ
ることができる。ＳＯＸのかかる用途に関する詳細は、
米国特許第４０８７３２８号及び同第４０５３６４４号
に記載されている。
【０００６】非特異的酸化剤よりもスルフヒドリルオキ
シダーゼ処理によるほうが有利となるようなプロセスの
もう一つの具体例として、遊離ＳＨ基に作用する生地調
整剤としてＳＯＸを用いるプロセスがある。米国特許第
４８９４３４０号には、アスペルギルス・ニガー（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のＳＯＸで生地
のレオロジー特性を改良することができ、ベイク品の形
態とテクスチャーに改善がみられることが示唆されてい
る。
シダーゼ処理によるほうが有利となるようなプロセスの
もう一つの具体例として、遊離ＳＨ基に作用する生地調
整剤としてＳＯＸを用いるプロセスがある。米国特許第
４８９４３４０号には、アスペルギルス・ニガー（Ａｓ
ｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）由来のＳＯＸで生地
のレオロジー特性を改良することができ、ベイク品の形
態とテクスチャーに改善がみられることが示唆されてい
る。
【０００７】哺乳類（ウシ）由来のＳＯＸは、牛乳から
焦げ臭さを除去するプロセスには使用できるが、小麦粉
生地には有益な効果を示さない［Ｋａｕｆｍａｎ他，Ｃ
ｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍ．６４（３）：１７２−１７
６］。これに対し、微生物由来のＳＯＸはいずれのプロ
セスにも使用できる。
焦げ臭さを除去するプロセスには使用できるが、小麦粉
生地には有益な効果を示さない［Ｋａｕｆｍａｎ他，Ｃ
ｅｒｅａｌ Ｃｈｅｍ．６４（３）：１７２−１７
６］。これに対し、微生物由来のＳＯＸはいずれのプロ
セスにも使用できる。
【０００８】反応式：２Ｒ−ＳＨ＋Ｏ2 →Ｒ−Ｓ−Ｓ−
Ｒ＋Ｈ2 Ｏ2 によるチオール化合物の対応ジスルフィ
ドへの変換を触媒することのできる哺乳類及び微生物由
来の数種類の酵素が科学雑誌に報告されている。
Ｒ＋Ｈ2 Ｏ2 によるチオール化合物の対応ジスルフィ
ドへの変換を触媒することのできる哺乳類及び微生物由
来の数種類の酵素が科学雑誌に報告されている。
【０００９】１９７５年にＪａｎｏｌｉｎｏとＳｗａｉ
ｓｇｏｏｄは、牛乳から鉄依存性スルフヒドリルオキシ
ダーゼを精製した。このオキシダーゼはＧＳＨ、システ
イン、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール
及び還元型リボヌクレアーゼＡに対して活性を示した。
その他の起源の乳抽出物も、ヒト由来のもの［Ｉｓａａ
ｃｓ他，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．１８：５３２（１９
８４）］を含め、スルフヒドリルオキシダーゼ活性を示
すことが報告されている。
ｓｇｏｏｄは、牛乳から鉄依存性スルフヒドリルオキシ
ダーゼを精製した。このオキシダーゼはＧＳＨ、システ
イン、ジチオスレイトール、２−メルカプトエタノール
及び還元型リボヌクレアーゼＡに対して活性を示した。
その他の起源の乳抽出物も、ヒト由来のもの［Ｉｓａａ
ｃｓ他，Ｐｅｄｉａｔｒ．Ｒｅｓ．１８：５３２（１９
８４）］を含め、スルフヒドリルオキシダーゼ活性を示
すことが報告されている。
【００１０】報告されているその他のスルフヒドリルオ
キシダーゼの起源として、腎臓ホモジネートや哺乳類の
膵臓組織がある［Ｃｌａｒｅ他，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２３０：１３８（１９８
４）］。
キシダーゼの起源として、腎臓ホモジネートや哺乳類の
膵臓組織がある［Ｃｌａｒｅ他，Ａｒｃｈ．Ｂｉｏｃｈ
ｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙｓ．２３０：１３８（１９８
４）］。
【００１１】スルフヒドリルオキシダーゼ活性は、ま
た、ラット精巣上体液にも見出だされている［Ｃｈａｎ
ｇ及びＭｏｒｔｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．６６：３０９（１９７
５）］。このスルフヒドリルオキシダーゼに対する最高
の基質はジチオスレイトール、ＧＳＨ及びシステインで
あると報告されている。このラット由来の酵素も、皮膚
及びウシ乳由来の酵素と同様、還元型リボヌクレアーゼ
Ａを再活性化することができた。
た、ラット精巣上体液にも見出だされている［Ｃｈａｎ
ｇ及びＭｏｒｔｏｎ，Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｂｉｏｐｈｙ
ｓ．Ｒｅｓ．Ｃｏｍｍｕｎ．６６：３０９（１９７
５）］。このスルフヒドリルオキシダーゼに対する最高
の基質はジチオスレイトール、ＧＳＨ及びシステインで
あると報告されている。このラット由来の酵素も、皮膚
及びウシ乳由来の酵素と同様、還元型リボヌクレアーゼ
Ａを再活性化することができた。
【００１２】哺乳類由来のＳＯＸ、例えば米国特許第４
０８７３２８号及び同第４０５３６４４号に記載されて
いるＳＯＸは、経済的な価格で大量に入手することがで
きないという欠点があり、しかも生地改良プロセスには
使用することができない。
０８７３２８号及び同第４０５３６４４号に記載されて
いるＳＯＸは、経済的な価格で大量に入手することがで
きないという欠点があり、しかも生地改良プロセスには
使用することができない。
【００１３】従って、研究の関心は、入手容易な経済的
魅力のあるＳＯＸ供給源とすることのできるような微生
物源の発見に向けられてきた。スルフヒドリルオキシダ
ーゼ源として種々の微生物が知られている。
魅力のあるＳＯＸ供給源とすることのできるような微生
物源の発見に向けられてきた。スルフヒドリルオキシダ
ーゼ源として種々の微生物が知られている。
【００１４】１９５６年にＭａｎｄｅｌｓは、菌類のミ
クロセシウム・バルカリア（Ｍｉｒｏｔｈｅｃｉｕｍ
ｖａｒｒｕｃａｒｉａ）の胞子がスルフヒドリルオキシ
ダーゼを含んでおり、この酵素の触媒する還元型グルタ
チオン（ＧＳＨ）、システイン及びホモシステインの酸
化がＨ2 Ｏ2 の還元を伴っていることを報告している
［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．５２：２３０（１９５
６）］。
クロセシウム・バルカリア（Ｍｉｒｏｔｈｅｃｉｕｍ
ｖａｒｒｕｃａｒｉａ）の胞子がスルフヒドリルオキシ
ダーゼを含んでおり、この酵素の触媒する還元型グルタ
チオン（ＧＳＨ）、システイン及びホモシステインの酸
化がＨ2 Ｏ2 の還元を伴っていることを報告している
［Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．５２：２３０（１９５
６）］。
【００１５】１９７５年にＯｌｓｏｎは、ダクチリウム
・デンドロイデス（Ｄａｃｔｙｌｉｕｍ ｄｅｎｄｒｏ
ｉｄｅｓ）とみられる生物の培養液からスルフヒドリル
オキシダーゼを単離した［Ｊ．Ａ．Ｏｌｓｏｎ，博士論
文，アイオワ大学（１９７６）］。この銅を含んだ金属
酵素は菌糸抽出液中で発見されたが、この抽出液中には
ガラクトースオキシダーゼ活性も含まれていた。Ｏｌｓ
ｏｎは、精製したスルフヒドリルオキシダーゼが、還元
により変性したガラクトースオキシダーゼを再活性化す
る能力を有していたと報告している。
・デンドロイデス（Ｄａｃｔｙｌｉｕｍ ｄｅｎｄｒｏ
ｉｄｅｓ）とみられる生物の培養液からスルフヒドリル
オキシダーゼを単離した［Ｊ．Ａ．Ｏｌｓｏｎ，博士論
文，アイオワ大学（１９７６）］。この銅を含んだ金属
酵素は菌糸抽出液中で発見されたが、この抽出液中には
ガラクトースオキシダーゼ活性も含まれていた。Ｏｌｓ
ｏｎは、精製したスルフヒドリルオキシダーゼが、還元
により変性したガラクトースオキシダーゼを再活性化す
る能力を有していたと報告している。
【００１６】微生物由来のＳＯＸは、ＳＯＸを産生する
ことの知られている微生物から得た市販の酵素標品でＳ
ＯＸを副産物もしくは夾雑物として含んでいるようなも
のから単離することができる。かかる市販の酵素標品の
具体例として、Ｆｕｎｇａｍｙｌ（登録商標）、Ｐｅｃ
ｔｉｎｅｘ（登録商標）並びに幾つかのアミログルコシ
ダーゼ標品がある。しかし、ＳＯＸの精製及び／又は濃
縮の際の分離費用及び収率の低下の損失のために、これ
らを原料としたＳＯＸ製品は極めて高価なものになって
しまう。
ことの知られている微生物から得た市販の酵素標品でＳ
ＯＸを副産物もしくは夾雑物として含んでいるようなも
のから単離することができる。かかる市販の酵素標品の
具体例として、Ｆｕｎｇａｍｙｌ（登録商標）、Ｐｅｃ
ｔｉｎｅｘ（登録商標）並びに幾つかのアミログルコシ
ダーゼ標品がある。しかし、ＳＯＸの精製及び／又は濃
縮の際の分離費用及び収率の低下の損失のために、これ
らを原料としたＳＯＸ製品は極めて高価なものになって
しまう。
【００１７】用いた微生物のＳＯＸ産生量が余り高くな
い場合に、微生物培養液又は微生物自体から回収したＳ
ＯＸの精製及び／又は濃縮の際の分離費用及び収率低下
が経済的に見合わなくなることは明らかである。
い場合に、微生物培養液又は微生物自体から回収したＳ
ＯＸの精製及び／又は濃縮の際の分離費用及び収率低下
が経済的に見合わなくなることは明らかである。
【００１８】Ｓｔａｒｎｅｓ他の米国特許第４６３２９
０５号には、アスペルギルス・ソヤエ（Ａ．ｓｏｊａ
ｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、ア
スペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、バシルス
・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
及びペニシリウム・リラシヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕ
ｍ ｌｉｌａｃｉｎｕｍ）に属する微生物がＳＯＸの回
収に十分な量のＳＯＸを産生する旨記載されている。Ｓ
ｔａｒｎｅｓ他は、極微量のＳＯＸ産生がバシルス・リ
ヘニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バ
シルス・コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、
バシルス・アシドプルリティクス（Ｂ．ａｃｉｄｏｐｕ
ｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ）、バシルス・ステアロサーモフ
ィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）
並びにトリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍ
ａ ｒｅｅｓｅｉ）で検出されたとも報告している。彼
等は、さらに、高活性のＳＯＸが特にアスペルギルス・
ソヤエの培養によって回収できたと記載している。
０５号には、アスペルギルス・ソヤエ（Ａ．ｓｏｊａ
ｅ）、アスペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、ア
スペルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、バシルス
・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔｉｌｉｓ）
及びペニシリウム・リラシヌム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕ
ｍ ｌｉｌａｃｉｎｕｍ）に属する微生物がＳＯＸの回
収に十分な量のＳＯＸを産生する旨記載されている。Ｓ
ｔａｒｎｅｓ他は、極微量のＳＯＸ産生がバシルス・リ
ヘニホルミス（Ｂ．ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）、バ
シルス・コアギュランス（Ｂ．ｃｏａｇｕｌａｎｓ）、
バシルス・アシドプルリティクス（Ｂ．ａｃｉｄｏｐｕ
ｌｌｕｌｙｔｉｃｕｓ）、バシルス・ステアロサーモフ
ィルス（Ｂ．ｓｔｅａｒｏｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕ
ｓ）、ムコール・ミエヘイ（Ｍｕｃｏｒｍｉｅｈｅｉ）
並びにトリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍ
ａ ｒｅｅｓｅｉ）で検出されたとも報告している。彼
等は、さらに、高活性のＳＯＸが特にアスペルギルス・
ソヤエの培養によって回収できたと記載している。
【００１９】上記明細書には、微生物培養時に、回収可
能な量のスルフヒドリルオキシダーゼが菌体内及び菌体
外に産出されていたと記載されている。この明細書によ
れば、菌体は培地から容易に除去することができ（遠心
分離法などの常法による）、この無細胞培地を瀘過し
て、通常はダイアフィルトレーション法で濃縮すれば、
最終的収率は約４０％となる。高圧破砕、超音波処理、
酵素消化もしくは単なる自己消化などによって微生物の
細胞を破壊した後、同様の回収方法を用いて、ＳＯＸ酵
素を菌体から同様の最終的収率で回収することもでき
る。一般に、各種のアスペルギルス種から細胞内の別の
酵素の抽出溶液を得るために従来使われてきた方法と同
じ方法が用いられている。
能な量のスルフヒドリルオキシダーゼが菌体内及び菌体
外に産出されていたと記載されている。この明細書によ
れば、菌体は培地から容易に除去することができ（遠心
分離法などの常法による）、この無細胞培地を瀘過し
て、通常はダイアフィルトレーション法で濃縮すれば、
最終的収率は約４０％となる。高圧破砕、超音波処理、
酵素消化もしくは単なる自己消化などによって微生物の
細胞を破壊した後、同様の回収方法を用いて、ＳＯＸ酵
素を菌体から同様の最終的収率で回収することもでき
る。一般に、各種のアスペルギルス種から細胞内の別の
酵素の抽出溶液を得るために従来使われてきた方法と同
じ方法が用いられている。
【００２０】Ｈａｍｍｅｒ他のの米国特許第４８９４３
４０号には、アスペルギルス・ニガー由来の単離スルフ
ヒドリルオキシダーゼについて記載されている。この微
生物起源のＳＯＸは至適ｐＨが約５．５であるという特
徴をもつ。このアスペルギルス・ニガーＳＯＸの回収方
法は、前掲のＳｔａｒｎｅｓの米国特許明細書に記載の
方法と同様のものであり、ＳＯＸ産生菌株の培養、菌体
からのＳＯＸの回収、及び回収したＳＯＸの精製からな
る。ＳＯＸの回収は、酵素消化その他の適当な方法によ
って細胞を破壊して得られたタンパク質を沈澱させる
か、或いはアスペルギルス・ニガーを十分な塩強度の塩
水中に懸濁して酵素を塩水中に分離させることによって
行われる。
４０号には、アスペルギルス・ニガー由来の単離スルフ
ヒドリルオキシダーゼについて記載されている。この微
生物起源のＳＯＸは至適ｐＨが約５．５であるという特
徴をもつ。このアスペルギルス・ニガーＳＯＸの回収方
法は、前掲のＳｔａｒｎｅｓの米国特許明細書に記載の
方法と同様のものであり、ＳＯＸ産生菌株の培養、菌体
からのＳＯＸの回収、及び回収したＳＯＸの精製からな
る。ＳＯＸの回収は、酵素消化その他の適当な方法によ
って細胞を破壊して得られたタンパク質を沈澱させる
か、或いはアスペルギルス・ニガーを十分な塩強度の塩
水中に懸濁して酵素を塩水中に分離させることによって
行われる。
【００２１】
【発明が解決しようとする課題】哺乳類由来のスルフヒ
ドリルオキシダーゼを得るための現在の方法は、時間が
かかり、複雑で、しかも費用がかかり過ぎるので、酵素
の経済的生産には向かない。
ドリルオキシダーゼを得るための現在の方法は、時間が
かかり、複雑で、しかも費用がかかり過ぎるので、酵素
の経済的生産には向かない。
【００２２】経済的に見合う微生物のスルフヒドリルオ
キシダーゼの供給源は文献からするとアスペルギルス・
ソヤエ及びアスペルギルス・ニガーだけである。ただ
し、実際には、純粋なスルフヒドリルオキシダーゼの市
販標品はない。この製品の生産及び精製はいまだに複雑
すぎて費用がかかり過ぎる。
キシダーゼの供給源は文献からするとアスペルギルス・
ソヤエ及びアスペルギルス・ニガーだけである。ただ
し、実際には、純粋なスルフヒドリルオキシダーゼの市
販標品はない。この製品の生産及び精製はいまだに複雑
すぎて費用がかかり過ぎる。
【００２３】本発明の目的は、上記課題を解決すること
であり、哺乳類型又は微生物型のスルフヒドリルオキシ
ダーゼを、経済的でしかも所望酵素の精製形を簡単に生
産することのできる方法で生産することである。さら
に、本発明の方法によれば、従前は生産することのでき
なかった多種多様な型のスルフヒドリルオキシダーゼを
大量に産生することができる。また、アスペルギルス・
ニガー及びアスペルギルス・ソヤエから、前掲の米国特
許に記載のものより精製の必要性も少ないスルフヒドリ
ルオキシダーゼをより大量に得ることができる。
であり、哺乳類型又は微生物型のスルフヒドリルオキシ
ダーゼを、経済的でしかも所望酵素の精製形を簡単に生
産することのできる方法で生産することである。さら
に、本発明の方法によれば、従前は生産することのでき
なかった多種多様な型のスルフヒドリルオキシダーゼを
大量に産生することができる。また、アスペルギルス・
ニガー及びアスペルギルス・ソヤエから、前掲の米国特
許に記載のものより精製の必要性も少ないスルフヒドリ
ルオキシダーゼをより大量に得ることができる。
【００２４】
【課題を解決するための手段】本発明は、スルフヒドリ
ルオキシダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を含むＤ
ＮＡを含んでなる組換えＤＮＡ材料を供することに関す
る。
ルオキシダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を含むＤ
ＮＡを含んでなる組換えＤＮＡ材料を供することに関す
る。
【００２５】組換えＤＮＡ材料にコードされたスルフヒ
ドリル活性を有する成熟過程型ポリペプチドを発現、好
ましくは過剰発現する能力を有する細胞を供すること
も、本発明の目的の一つである。
ドリル活性を有する成熟過程型ポリペプチドを発現、好
ましくは過剰発現する能力を有する細胞を供すること
も、本発明の目的の一つである。
【００２６】スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する
成熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
を含んでなる組換えＤＮＡ材料は、上記ヌクレオチド配
列の組込まれる発現宿主細胞と同類の生物から得られる
ヌクレオチド配列を含んでいてもよいが、このヌクレオ
チド配列は発現宿主細胞と異種のものであってもよい。
成熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
を含んでなる組換えＤＮＡ材料は、上記ヌクレオチド配
列の組込まれる発現宿主細胞と同類の生物から得られる
ヌクレオチド配列を含んでいてもよいが、このヌクレオ
チド配列は発現宿主細胞と異種のものであってもよい。
【００２７】スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する
成熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
の発現は、上記ヌクレオチド配列の起源となった生物本
来の遺伝子を制御する調節配列を作動可能な状態で上記
ヌクレオチド配列に連結することによって調節すること
ができる。調節配列は外来のもの、即ち、スルフヒドリ
ル活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列の起源となった生物とは異なる株、種、属又は群に
属する生物に由来するものであってもよい。かかる調節
領域は、スルフヒドリルオキシダーゼ遺伝子の調節領域
でもよいし、或いはその他の遺伝子の調節領域であって
ももよい。
成熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
の発現は、上記ヌクレオチド配列の起源となった生物本
来の遺伝子を制御する調節配列を作動可能な状態で上記
ヌクレオチド配列に連結することによって調節すること
ができる。調節配列は外来のもの、即ち、スルフヒドリ
ル活性を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド
配列の起源となった生物とは異なる株、種、属又は群に
属する生物に由来するものであってもよい。かかる調節
領域は、スルフヒドリルオキシダーゼ遺伝子の調節領域
でもよいし、或いはその他の遺伝子の調節領域であって
ももよい。
【００２８】本発明の別の好ましい実施態様は、スルフ
ヒドリルオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの成熟
過程型（好ましくは成熟型）を過剰発現し、分泌する能
力を有する細胞である。
ヒドリルオキシダーゼ活性を有するポリペプチドの成熟
過程型（好ましくは成熟型）を過剰発現し、分泌する能
力を有する細胞である。
【００２９】後でベイカリイ製品の製造或いは食品（特
に牛乳又はビール）からの異臭の除去のような産業プロ
セスに都合よく使用することのできる、スルフヒドリル
オキシダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドの生
産方法を供することも、本発明の目的の一つである。本
発明は、かかるプロセスへの使用に好適なスルフヒドリ
ルオキシダーゼ含有産物にも関する。
に牛乳又はビール）からの異臭の除去のような産業プロ
セスに都合よく使用することのできる、スルフヒドリル
オキシダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドの生
産方法を供することも、本発明の目的の一つである。本
発明は、かかるプロセスへの使用に好適なスルフヒドリ
ルオキシダーゼ含有産物にも関する。
【００３０】本発明に係るスルフヒドリルオキシダーゼ
活性を有するポリペプチドは、その他の製品、即ち、遊
離ＳＨ基を酸化してジスルフィド結合を形成することの
できる成分が求められるような個人用品にも使用でき
る。本発明に係るスルフヒドリルオキシダーゼ活性を有
するポリペプチドは、一般に、タンパク質又はタンパク
様構造体の構造を強化するための製品、特に、例えば鐘
紡（株）の特願平２−２８７８１５号に記載されている
ように、パーマ液、シャンプー又はコンディショナーの
ようなヘアートリートメント用の各種製品にも使用でき
る。
活性を有するポリペプチドは、その他の製品、即ち、遊
離ＳＨ基を酸化してジスルフィド結合を形成することの
できる成分が求められるような個人用品にも使用でき
る。本発明に係るスルフヒドリルオキシダーゼ活性を有
するポリペプチドは、一般に、タンパク質又はタンパク
様構造体の構造を強化するための製品、特に、例えば鐘
紡（株）の特願平２−２８７８１５号に記載されている
ように、パーマ液、シャンプー又はコンディショナーの
ようなヘアートリートメント用の各種製品にも使用でき
る。
【００３１】本発明は、スルフヒドリルオキシダーゼ活
性を有する成熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列の少なくとも一部又はその遺伝的変異体を含
んでなる組換えＤＮＡ材料に関する。
性を有する成熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列の少なくとも一部又はその遺伝的変異体を含
んでなる組換えＤＮＡ材料に関する。
【００３２】「組換えＤＮＡ材料」という用語は、ＤＮ
Ａ分子のみならず、各種のＤＮＡ断片／分子の混合物を
包含する。
Ａ分子のみならず、各種のＤＮＡ断片／分子の混合物を
包含する。
【００３３】本明細書中で用いる「遺伝的変異体」とい
う用語は、スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する成
熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の
少なくとも一部を含んでなり、所望により、かかるヌク
レオチド配列が同種又は異種生物に由来する調節領域
（プロモーター、分泌シグナル、終結シグナルなど）に
結合したハイブリッドＤＮＡ配列を包含する。「遺伝的
変異体」という用語は、さらに、変異型スルフヒドリル
オキシダーゼポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、並
びにスルフヒドリルオキシダーゼ活性を保ったまま複数
のポリペプチドをコードする縮重ＤＮＡ配列をも包含す
る。
う用語は、スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する成
熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の
少なくとも一部を含んでなり、所望により、かかるヌク
レオチド配列が同種又は異種生物に由来する調節領域
（プロモーター、分泌シグナル、終結シグナルなど）に
結合したハイブリッドＤＮＡ配列を包含する。「遺伝的
変異体」という用語は、さらに、変異型スルフヒドリル
オキシダーゼポリペプチドをコードするＤＮＡ配列、並
びにスルフヒドリルオキシダーゼ活性を保ったまま複数
のポリペプチドをコードする縮重ＤＮＡ配列をも包含す
る。
【００３４】本発明は、また、スルフヒドリルオキシダ
ーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列の少なくとも一部とハイブリド形成し
得るヌクレオチド配列の少なくとも一部を含んでなる組
換えＤＮＡ材料、並びに遺伝コードの縮重又は異種間変
異のためにコドン配列の異なっているような遺伝的変異
体にも関する。
ーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列の少なくとも一部とハイブリド形成し
得るヌクレオチド配列の少なくとも一部を含んでなる組
換えＤＮＡ材料、並びに遺伝コードの縮重又は異種間変
異のためにコドン配列の異なっているような遺伝的変異
体にも関する。
【００３５】「成熟過程型」という用語は、関連遺伝子
の発現後に上記酵素が取り得る様々な形態を意味するも
のである。より詳細には、この用語は、天然に存在する
ものと天然には存在しないものとを問わず、「リーダ
ー」ペプチド切断後に得られる酵素の成熟型のみなら
ず、「リーダー」ペプチドを何らかの形態で依然として
含んでいる酵素を意味する。「リーダーペプチド」は、
一般に、「プレプロ」ペプチド、「プレ」ペプチド又は
「プロ」ペプチドである。
の発現後に上記酵素が取り得る様々な形態を意味するも
のである。より詳細には、この用語は、天然に存在する
ものと天然には存在しないものとを問わず、「リーダ
ー」ペプチド切断後に得られる酵素の成熟型のみなら
ず、「リーダー」ペプチドを何らかの形態で依然として
含んでいる酵素を意味する。「リーダーペプチド」は、
一般に、「プレプロ」ペプチド、「プレ」ペプチド又は
「プロ」ペプチドである。
【００３６】本発明に係る組換えＤＮＡ材料は、スルフ
ヒドリルオキシダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を
含み得るが、かかるヌクレオチド配列は哺乳類から微生
物に至るあらゆる生物を起源とすることが可能である。
ヌクレオチド配列の起源は、本発明に係る組換えＤＮＡ
材料によって産生されるポリペプチドの用途に応じて選
択される。冒頭で述べたように、ウシのスルフヒドリル
オキシダーゼはＵＨＴ殺菌乳からの異臭の除去には使用
できるが、小麦粉生地に有益な効果を与えるためには使
用できない。
ヒドリルオキシダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列の少なくとも一部を
含み得るが、かかるヌクレオチド配列は哺乳類から微生
物に至るあらゆる生物を起源とすることが可能である。
ヌクレオチド配列の起源は、本発明に係る組換えＤＮＡ
材料によって産生されるポリペプチドの用途に応じて選
択される。冒頭で述べたように、ウシのスルフヒドリル
オキシダーゼはＵＨＴ殺菌乳からの異臭の除去には使用
できるが、小麦粉生地に有益な効果を与えるためには使
用できない。
【００３７】食料生産のためのプロセスに応用する場合
には、本発明に係る組換えＤＮＡ材料に含まれるスルフ
ヒドリルオキシダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列は、好ましくは食品
級（ｆｏｏｄ ｇｒａｄｅ）の生物を起源とする。
には、本発明に係る組換えＤＮＡ材料に含まれるスルフ
ヒドリルオキシダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプ
チドをコードするヌクレオチド配列は、好ましくは食品
級（ｆｏｏｄ ｇｒａｄｅ）の生物を起源とする。
【００３８】既に述べた通り、スルフヒドリルオキシダ
ーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列は、微生物を起源とするものであって
もよい。かかる配列は菌類や細菌などの微生物から得る
ことができるが、好ましくは食品級の菌類又は細菌から
得る。好適な菌類は糸状菌、例えば、アスペルギルス
属、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ニュ
ーロスポーラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウ
ム属及びムコール属からなる群である。アスペルギルス
属の中では、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス
・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・
オリゼ、アスペルギルス・ソヤエ、アスペルギルス・ツ
ビゲンシス（Ａ．ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）、アスペルギ
ルス・アクレアツス（Ａ．ａｃｕｌｅａｔｕｓ）及びア
スペルギルス・ジャポニクス（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕ
ｓ）に属する種が、スルフヒドリルオキシダーゼ活性を
有する成熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列を得ることのできる生物として著しく適してい
る。
ーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列は、微生物を起源とするものであって
もよい。かかる配列は菌類や細菌などの微生物から得る
ことができるが、好ましくは食品級の菌類又は細菌から
得る。好適な菌類は糸状菌、例えば、アスペルギルス
属、トリコデルマ属（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、ニュ
ーロスポーラ属（Ｎｅｕｒｏｓｐｏｒａ）、ペニシリウ
ム属及びムコール属からなる群である。アスペルギルス
属の中では、アスペルギルス・ニガー、アスペルギルス
・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・
オリゼ、アスペルギルス・ソヤエ、アスペルギルス・ツ
ビゲンシス（Ａ．ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）、アスペルギ
ルス・アクレアツス（Ａ．ａｃｕｌｅａｔｕｓ）及びア
スペルギルス・ジャポニクス（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕ
ｓ）に属する種が、スルフヒドリルオキシダーゼ活性を
有する成熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列を得ることのできる生物として著しく適してい
る。
【００３９】好適な細菌はバシルス属の細菌で、例えば
バシルス・スブチリス、バシルス・コアギュランス、バ
シルス・アシドプルリティクス、バシルス・ステアロサ
ーモフィルス、バシルス・リヘニホルミス及びバシルス
・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）に属する細菌である。
細菌は好ましくは食品級のグラム陽性細菌である。
バシルス・スブチリス、バシルス・コアギュランス、バ
シルス・アシドプルリティクス、バシルス・ステアロサ
ーモフィルス、バシルス・リヘニホルミス及びバシルス
・ブレビス（Ｂ．ｂｒｅｖｉｓ）に属する細菌である。
細菌は好ましくは食品級のグラム陽性細菌である。
【００４０】スルフヒドリルオキシダーゼ活性は、アス
ペルギルス属の多数の菌株及び派生株、例えばアスペル
ギルス・ニガーＮ４００株（ＣＢＳ１２０．４９）、ア
スペルギルス・ニガー変種アワモリ（Ａ．ｎｉｇｅｒ
ｖａｒ．ａｗａｍｏｒｉ）（ＣＢＳ１１５．５２）、ア
スペルギルス・オリゼ（ＡＴＣＣ９１００２）、アスペ
ルギルス・ソヤエ（ＡＴＣＣ２０３８８）、アスペルギ
ルス・ソヤエ（ＡＴＣＣ２０２３５）、アスペルギルス
・ツビゲンシス（ＣＢＳ１１５２９）、アスペルギルス
・ツビゲンシス（ＣＢＳ１６１７９）、アスペルギルス
・ジャポニクス変種アクレアツス（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃ
ｕｓ ｖａｒ．ａｃｕｌｅａｔｕｓ）（ＣＢＳ１１５．
８０）、アスペルギルス・ジャポニクス変種アクレアツ
ス（ＣＢＳ１７２６６）で見出だされている。図６に示
した通り、アスペルギルス・ニガーから単離したＤＮＡ
と様々な生物のＤＮＡとのハイブリット形成が多くの菌
株でみられた。
ペルギルス属の多数の菌株及び派生株、例えばアスペル
ギルス・ニガーＮ４００株（ＣＢＳ１２０．４９）、ア
スペルギルス・ニガー変種アワモリ（Ａ．ｎｉｇｅｒ
ｖａｒ．ａｗａｍｏｒｉ）（ＣＢＳ１１５．５２）、ア
スペルギルス・オリゼ（ＡＴＣＣ９１００２）、アスペ
ルギルス・ソヤエ（ＡＴＣＣ２０３８８）、アスペルギ
ルス・ソヤエ（ＡＴＣＣ２０２３５）、アスペルギルス
・ツビゲンシス（ＣＢＳ１１５２９）、アスペルギルス
・ツビゲンシス（ＣＢＳ１６１７９）、アスペルギルス
・ジャポニクス変種アクレアツス（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃ
ｕｓ ｖａｒ．ａｃｕｌｅａｔｕｓ）（ＣＢＳ１１５．
８０）、アスペルギルス・ジャポニクス変種アクレアツ
ス（ＣＢＳ１７２６６）で見出だされている。図６に示
した通り、アスペルギルス・ニガーから単離したＤＮＡ
と様々な生物のＤＮＡとのハイブリット形成が多くの菌
株でみられた。
【００４１】本発明のこの態様のさらに具体的な実施態
様は、スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する成熟過
程型ポリペプチドで図８〜図１０に示すアミノ酸配列を
もつポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の少な
くとも一部を含んでなる組換えＤＮＡ材料であり、もっ
と具体的には、スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有す
る成熟過程型ポリペプチドをコードする図８〜図１０に
示すヌクレオチドの少なくとも一部を含んでなるＤＮＡ
材料である。図８〜図１０のヌクレオチド配列の遺伝的
変異体（スルフヒドリルオキシダーゼポリペプチドの突
然変異体をコードする配列並びにスルフヒドリルオキシ
ダーゼ活性を保ったまま複数のポリペプチドをコードす
る縮重ヌクレオチド配列を包含する）も、スルフヒドリ
ルオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする
図８〜図１０に示すヌクレオチド配列の少なくとも一部
とハイブリッド形成し得るヌクレオチド配列並びにそれ
らの変異体（上述の通り定義される）で遺伝コードの縮
重又は異種間変異のためにコドン配列の異なっているよ
うな変異体と同様、本発明の一態様である。スルフヒド
リルオキシダーゼ活性を有するアスペルギルス・ニガー
由来のポリペプチドを用いて、図８〜図１０に示すヌク
レオチド配列及びアミノ酸配列を得た。
様は、スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する成熟過
程型ポリペプチドで図８〜図１０に示すアミノ酸配列を
もつポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の少な
くとも一部を含んでなる組換えＤＮＡ材料であり、もっ
と具体的には、スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有す
る成熟過程型ポリペプチドをコードする図８〜図１０に
示すヌクレオチドの少なくとも一部を含んでなるＤＮＡ
材料である。図８〜図１０のヌクレオチド配列の遺伝的
変異体（スルフヒドリルオキシダーゼポリペプチドの突
然変異体をコードする配列並びにスルフヒドリルオキシ
ダーゼ活性を保ったまま複数のポリペプチドをコードす
る縮重ヌクレオチド配列を包含する）も、スルフヒドリ
ルオキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードする
図８〜図１０に示すヌクレオチド配列の少なくとも一部
とハイブリッド形成し得るヌクレオチド配列並びにそれ
らの変異体（上述の通り定義される）で遺伝コードの縮
重又は異種間変異のためにコドン配列の異なっているよ
うな変異体と同様、本発明の一態様である。スルフヒド
リルオキシダーゼ活性を有するアスペルギルス・ニガー
由来のポリペプチドを用いて、図８〜図１０に示すヌク
レオチド配列及びアミノ酸配列を得た。
【００４２】図６に示す分析結果から明らかな通り、図
８〜図１０に示すアスペルギルス由来のスルフヒドリル
オキシダーゼのヌクレオチド配列との高い相同性を示す
ＤＮＡ配列が、その他の生物中にも存在している。従っ
て、スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する成熟過程
型ポリペプチドの図８〜図１０に示すヌクレオチド配列
の一部は、スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつアス
ペルギルス・ニガー起源のポリペプチドの一部をコード
するばかりでなく、その他の生物から得られるスルフヒ
ドリルオキシダーゼ活性をもつポリペプチドの少なくと
も一部をもコードしている。
８〜図１０に示すアスペルギルス由来のスルフヒドリル
オキシダーゼのヌクレオチド配列との高い相同性を示す
ＤＮＡ配列が、その他の生物中にも存在している。従っ
て、スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する成熟過程
型ポリペプチドの図８〜図１０に示すヌクレオチド配列
の一部は、スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつアス
ペルギルス・ニガー起源のポリペプチドの一部をコード
するばかりでなく、その他の生物から得られるスルフヒ
ドリルオキシダーゼ活性をもつポリペプチドの少なくと
も一部をもコードしている。
【００４３】他の生物に由来するこのようなヌクレオチ
ド配列は、アスペルギルス・ニガーＮ４００株から得た
図８〜図１０に示すヌクレオチド配列の少なくとも一部
又は図８〜図１０に示すアミノ酸配列もしくはそれと均
等なアミノ酸配列から導出される縮重ＤＮＡ配列の少な
くとも一部と当該他の生物の遺伝物質とがハイブリッド
形成し得ることで選択できる。他の生物の遺伝物質との
ハイブリッド形成部位は、スルフヒドリルオキシダーゼ
活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列の少なくとも一部を含んでいる。これらの
配列及び実施例１に例示するヌクレオチド配列の回収方
法を用いれば、スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつ
成熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
を他の生物から得ることは当業者が容易に行い得る。
ド配列は、アスペルギルス・ニガーＮ４００株から得た
図８〜図１０に示すヌクレオチド配列の少なくとも一部
又は図８〜図１０に示すアミノ酸配列もしくはそれと均
等なアミノ酸配列から導出される縮重ＤＮＡ配列の少な
くとも一部と当該他の生物の遺伝物質とがハイブリッド
形成し得ることで選択できる。他の生物の遺伝物質との
ハイブリッド形成部位は、スルフヒドリルオキシダーゼ
活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列の少なくとも一部を含んでいる。これらの
配列及び実施例１に例示するヌクレオチド配列の回収方
法を用いれば、スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつ
成熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列
を他の生物から得ることは当業者が容易に行い得る。
【００４４】本発明に係る組換えＤＮＡ材料は、スルフ
ヒドリルオキシダーゼ活性をもつ成熟過程型ポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列の発現に使用すること
ができるし、スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつ成
熟過程型ポリペプチドの少なくとも一部をコードする遺
伝物質の検出用プローブ又はかかる遺伝子生産用のプラ
イマーとして使用することもできる。
ヒドリルオキシダーゼ活性をもつ成熟過程型ポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列の発現に使用すること
ができるし、スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつ成
熟過程型ポリペプチドの少なくとも一部をコードする遺
伝物質の検出用プローブ又はかかる遺伝子生産用のプラ
イマーとして使用することもできる。
【００４５】本発明に係る組換えＤＮＡ材料は、スルフ
ヒドリルオキシダーゼ活性をもつポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列の起源となった生物本来の調節領
域で、上記ヌクレオチド配列と作動可能な状態で連結し
た調節領域を含んでいてもよい。かかる本来の調節領域
は、上記ポリペプチドの起源となった生物中でのスルフ
ヒドリルオキシダーゼ遺伝子の発現を制御する調節領域
でもよいし、その起源となった生物中での別の遺伝子の
発現を制御する調節領域であってもよい。上記遺伝子の
起源となった生物中でのスルフヒドリルオキシダーゼの
発現を制御する本来の調節領域以外の調節領域として
は、より効率の高いものを選択するのが一般的である。
その他の望ましい性質、例えば熱誘導性などに基づい
て、プロモーターなどの調節領域を選択することも可能
である。望ましい調節領域の選択は当業者には自明であ
る。
ヒドリルオキシダーゼ活性をもつポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列の起源となった生物本来の調節領
域で、上記ヌクレオチド配列と作動可能な状態で連結し
た調節領域を含んでいてもよい。かかる本来の調節領域
は、上記ポリペプチドの起源となった生物中でのスルフ
ヒドリルオキシダーゼ遺伝子の発現を制御する調節領域
でもよいし、その起源となった生物中での別の遺伝子の
発現を制御する調節領域であってもよい。上記遺伝子の
起源となった生物中でのスルフヒドリルオキシダーゼの
発現を制御する本来の調節領域以外の調節領域として
は、より効率の高いものを選択するのが一般的である。
その他の望ましい性質、例えば熱誘導性などに基づい
て、プロモーターなどの調節領域を選択することも可能
である。望ましい調節領域の選択は当業者には自明であ
る。
【００４６】別の実施態様では、本発明に係る組換えＤ
ＮＡ材料は、スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつペ
プチドをコードするヌクレオチド配列の起源となった生
物とは異なる生物に由来する調節領域で、上記ヌクレオ
チド配列に作動可能な状態で連結しているような調節領
域を含んでいてもよい。この場合、その調節領域は、当
該調節領域の起源となった異種生物中でのスルフヒドリ
ルオキシダーゼ遺伝子の発現を制御する調節領域であっ
てもよいし、当該異種生物中でのスルフヒドリルオキシ
ダーゼ遺伝子以外の遺伝子の発現を制御する調節領域で
あってもよい。望ましい調節領域の選択は当業者には自
明であり、例えば本発明に係る組換えＤＮＡ材料を導入
する宿主細胞にも依存する。仮に、異種発現宿主を所望
する場合、換言すれば、スルフヒドリルオキシダーゼ活
性をもつポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の
起源となった生物株が宿主細胞とは異なる（例えば、
株、変種、種、属、科、目、綱、門又は界などが異な
る）ことを所望する場合には、調節領域は発現宿主と同
類又は同じ生物に由来するものであることが好ましい。
例えば、仮にヌクレオチド配列が菌類に由来するもの
で、発現宿主が酵母菌であるような場合には、調節領域
は酵母菌を起源とすることが好ましい。ただし、調節領
域は必ずしも宿主細胞（上記の事例では酵母）と同一の
株又は属である必要はない。上記の事例では、ヌクレオ
チド配列の発現を可能とするために、酵母細胞プロモー
ターを選択する必要がある。
ＮＡ材料は、スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつペ
プチドをコードするヌクレオチド配列の起源となった生
物とは異なる生物に由来する調節領域で、上記ヌクレオ
チド配列に作動可能な状態で連結しているような調節領
域を含んでいてもよい。この場合、その調節領域は、当
該調節領域の起源となった異種生物中でのスルフヒドリ
ルオキシダーゼ遺伝子の発現を制御する調節領域であっ
てもよいし、当該異種生物中でのスルフヒドリルオキシ
ダーゼ遺伝子以外の遺伝子の発現を制御する調節領域で
あってもよい。望ましい調節領域の選択は当業者には自
明であり、例えば本発明に係る組換えＤＮＡ材料を導入
する宿主細胞にも依存する。仮に、異種発現宿主を所望
する場合、換言すれば、スルフヒドリルオキシダーゼ活
性をもつポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の
起源となった生物株が宿主細胞とは異なる（例えば、
株、変種、種、属、科、目、綱、門又は界などが異な
る）ことを所望する場合には、調節領域は発現宿主と同
類又は同じ生物に由来するものであることが好ましい。
例えば、仮にヌクレオチド配列が菌類に由来するもの
で、発現宿主が酵母菌であるような場合には、調節領域
は酵母菌を起源とすることが好ましい。ただし、調節領
域は必ずしも宿主細胞（上記の事例では酵母）と同一の
株又は属である必要はない。上記の事例では、ヌクレオ
チド配列の発現を可能とするために、酵母細胞プロモー
ターを選択する必要がある。
【００４７】本発明に係る組換えＤＮＡ材料中の、スル
フヒドリルオキシダーゼ活性をもつポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列と作動可能な状態で連結してい
る調節領域は、例えば構成プロモーターでもよいし、或
いは誘導プロモーターであってよい。特に好適なもの
は、解糖系に関与する酵素群をコードする遺伝子群から
得られる構成プロモーターである。
フヒドリルオキシダーゼ活性をもつポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列と作動可能な状態で連結してい
る調節領域は、例えば構成プロモーターでもよいし、或
いは誘導プロモーターであってよい。特に好適なもの
は、解糖系に関与する酵素群をコードする遺伝子群から
得られる構成プロモーターである。
【００４８】スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつ成
熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と
作動可能な状態で連結した強力な構成プロモーターを含
んでなる本発明の組換えＤＮＡ材料の具体例として、上
記のプロモーターがグリセルアルデヒド−３−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ（ｇｐｄＡ）プロモーターであるような
組換えＤＮＡ材料を挙げることができる。このプロモー
ターは、本発明の組換えＤＮＡ材料を菌類の中で発現さ
せる場合の構成性発現に適している。その他の具体例
は、ｐｇｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼプロモータ
ー）、ｐｋｉ（ピルビン酸キナーゼプロモーター）、Ｔ
ＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼプロモーター）、
ＡＴＰ合成酵素サブユニットｇ（ｏｌｉＣ）プロモータ
ー及びアセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）プロモーターであ
る。
熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と
作動可能な状態で連結した強力な構成プロモーターを含
んでなる本発明の組換えＤＮＡ材料の具体例として、上
記のプロモーターがグリセルアルデヒド−３−リン酸デ
ヒドロゲナーゼ（ｇｐｄＡ）プロモーターであるような
組換えＤＮＡ材料を挙げることができる。このプロモー
ターは、本発明の組換えＤＮＡ材料を菌類の中で発現さ
せる場合の構成性発現に適している。その他の具体例
は、ｐｇｋ（ホスホグリセリン酸キナーゼプロモータ
ー）、ｐｋｉ（ピルビン酸キナーゼプロモーター）、Ｔ
ＰＩ（トリオースリン酸イソメラーゼプロモーター）、
ＡＴＰ合成酵素サブユニットｇ（ｏｌｉＣ）プロモータ
ー及びアセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）プロモーターであ
る。
【００４９】スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつ成
熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と
作動可能な状態で連結した誘導プロモーターを含んでな
る本発明の組換えＤＮＡ材料の具体例は、この誘導可能
なプロモーターが次に挙げる遺伝子のプロモーターから
選択された組換えＤＮＡ材料である。即ち、エンドキシ
ラナーゼIIＡ（ｅｘｌＡ）、グルコアミラーゼＡ（ｇｌ
ａＡ）、セロビオヒドラーゼ（ｃｂｈ）、アミラーゼ
（ａｍｙ）、インベルターゼ（ｓｕｃ）、並びにアルコ
ールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃＡ）、ＴＡＫＡアミラー
ゼ及びアミログルコシダーゼ（ＡＧＴ）。好ましくは、
誘導性エンドキシラーゼIIＡプロモーターを選択する。
熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と
作動可能な状態で連結した誘導プロモーターを含んでな
る本発明の組換えＤＮＡ材料の具体例は、この誘導可能
なプロモーターが次に挙げる遺伝子のプロモーターから
選択された組換えＤＮＡ材料である。即ち、エンドキシ
ラナーゼIIＡ（ｅｘｌＡ）、グルコアミラーゼＡ（ｇｌ
ａＡ）、セロビオヒドラーゼ（ｃｂｈ）、アミラーゼ
（ａｍｙ）、インベルターゼ（ｓｕｃ）、並びにアルコ
ールデヒドロゲナーゼ（ａｌｃＡ）、ＴＡＫＡアミラー
ゼ及びアミログルコシダーゼ（ＡＧＴ）。好ましくは、
誘導性エンドキシラーゼIIＡプロモーターを選択する。
【００５０】スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつ成
熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と
作動可能な状態で連結した強力な酵母プロモーターを含
んでなる本発明の組換えＤＮＡ材料の具体例は、このプ
ロモーターが次に挙げる遺伝子のプロモーターから選択
された組換えＤＮＡ材料である。即ち、アルコールデヒ
ドロゲナーゼ、ラクターゼ、３−ホスホグリセリン酸キ
ナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、α−Ｄ−ガラ
クトースリン酸ウリジルトランスフェラーゼ（Ｇａｌ
７）及びグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ（ＧＡＰＤＨ）。
熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と
作動可能な状態で連結した強力な酵母プロモーターを含
んでなる本発明の組換えＤＮＡ材料の具体例は、このプ
ロモーターが次に挙げる遺伝子のプロモーターから選択
された組換えＤＮＡ材料である。即ち、アルコールデヒ
ドロゲナーゼ、ラクターゼ、３−ホスホグリセリン酸キ
ナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、α−Ｄ−ガラ
クトースリン酸ウリジルトランスフェラーゼ（Ｇａｌ
７）及びグリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナ
ーゼ（ＧＡＰＤＨ）。
【００５１】スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつ成
熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と
作動可能な状態で連結した細菌プロモーターを含んでな
る本発明の組換えＤＮＡ材料の具体例は、かかる細菌プ
ロモーターが次に挙げる遺伝子のプロモーターから選択
された組換えＤＮＡ材料である。即ち、α−アミラー
ゼ、ＳＰＯ２及び細胞外プロテアーーゼ。
熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と
作動可能な状態で連結した細菌プロモーターを含んでな
る本発明の組換えＤＮＡ材料の具体例は、かかる細菌プ
ロモーターが次に挙げる遺伝子のプロモーターから選択
された組換えＤＮＡ材料である。即ち、α−アミラー
ゼ、ＳＰＯ２及び細胞外プロテアーーゼ。
【００５２】スルフヒドリルオキシダーゼ遺伝子に外来
調節領域を連結させる方法と同様の方法で、スルフヒド
リルオキシダーゼ遺伝子の調節領域をその他の遺伝子に
連結させることも可能である。従って、本発明は、さら
に、スルフヒドリルオキシダーゼの調節領域を少なくと
も含んでいるヌクレオチド配列、並びにかかるヌクレオ
チド配列の用途、例えば当該ヌクレオチド配列に連結し
た遺伝子の発現の改良のための使用にも関する。
調節領域を連結させる方法と同様の方法で、スルフヒド
リルオキシダーゼ遺伝子の調節領域をその他の遺伝子に
連結させることも可能である。従って、本発明は、さら
に、スルフヒドリルオキシダーゼの調節領域を少なくと
も含んでいるヌクレオチド配列、並びにかかるヌクレオ
チド配列の用途、例えば当該ヌクレオチド配列に連結し
た遺伝子の発現の改良のための使用にも関する。
【００５３】異種発現宿主が酵母又は細菌株である場
合、本発明の組換えＤＮＡ材料としては、スルフヒドリ
ルオキシダーゼ活性をもつ成熟過程型ポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列が分断されていないもの（イ
ントロンを含まないもの）ことが好ましい。こうする
と、組換えＤＮＡ材料上に存在するスプライシングシグ
ナルを異種宿主が認識しない危険性がなくなるからであ
る。このような連続したヌクレオチド配列は、スルフヒ
ドリルオキシダーゼ活性をもつ成熟過程型ポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列を発現するような細胞か
ら単離されたＲＮＡを基に構築されたｃＤＮＡライブラ
リーから得ることができる。別法として、上記のような
連続したヌクレオチド配列は、当業者の熟知している通
り、イントロンが正確に除去されるような適切なプライ
マーを用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型とするポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）法を１回以上行うことによって得る
こともできる。
合、本発明の組換えＤＮＡ材料としては、スルフヒドリ
ルオキシダーゼ活性をもつ成熟過程型ポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列が分断されていないもの（イ
ントロンを含まないもの）ことが好ましい。こうする
と、組換えＤＮＡ材料上に存在するスプライシングシグ
ナルを異種宿主が認識しない危険性がなくなるからであ
る。このような連続したヌクレオチド配列は、スルフヒ
ドリルオキシダーゼ活性をもつ成熟過程型ポリペプチド
をコードするヌクレオチド配列を発現するような細胞か
ら単離されたＲＮＡを基に構築されたｃＤＮＡライブラ
リーから得ることができる。別法として、上記のような
連続したヌクレオチド配列は、当業者の熟知している通
り、イントロンが正確に除去されるような適切なプライ
マーを用いて、ゲノムＤＮＡを鋳型とするポリメラーゼ
連鎖反応（ＰＣＲ）法を１回以上行うことによって得る
こともできる。
【００５４】サッカロミセス・セレビシェー（Ｓａｃｃ
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような
酵母中での発現には、イントロンが除去されているこ
と、並びに成熟ポリペプチドのプロセシング及び分泌が
適切に行われるように菌類のＳＯＸリーダー配列が酵母
に適したシグナル配列（インベルターゼ遺伝子のシグナ
ル配列など）で置換されていることが望ましい。
ｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）のような
酵母中での発現には、イントロンが除去されているこ
と、並びに成熟ポリペプチドのプロセシング及び分泌が
適切に行われるように菌類のＳＯＸリーダー配列が酵母
に適したシグナル配列（インベルターゼ遺伝子のシグナ
ル配列など）で置換されていることが望ましい。
【００５５】バシルス・スブチリスのような細菌中での
発現には、イントロンの除去が不可欠である。この場
合、シグナル配列として例えばα−アミラーゼのシグナ
ル配列を用いることができる。
発現には、イントロンの除去が不可欠である。この場
合、シグナル配列として例えばα−アミラーゼのシグナ
ル配列を用いることができる。
【００５６】好ましい実施態様においては、本発明の組
換えＤＮＡ材料は選択マーカーを含んでなる。かかる選
択マーカーは、組換えＤＮＡ材料を含まない細胞から、
組換えＤＮＡ材料の導入された宿主細胞を選別するのに
役立つ。適当な調節配列の与えられた選択マーカーは、
スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつ成熟過程型ポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んだ断片上
に位置してもよいし、或いはそれとは別の断片上に存在
していてもよい。後者の場合には、本発明の組換えＤＮ
Ａ材料の各種構成成分と共に同時形質転換を行わなけれ
ばならない。発現成分（スルフヒドリルオキシダーゼ活
性をもつ成熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列を含む）／選択成分（選択マーカーを有する）
の比は、選択成分を含んでなる選別細胞が高い割合で発
現成分をも組込んでいるように調節することができる。
従って、本明細書中で用いる「組換えＤＮＡ材料」とい
う用語は、スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつ成熟
過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と同
一の組換えＤＮＡ分子上又はそれとは異なる組換えＤＮ
Ａ断片上に選択マーカーが組込まれていているような１
又は複数の組換えＤＮＡ断片を包含する。
換えＤＮＡ材料は選択マーカーを含んでなる。かかる選
択マーカーは、組換えＤＮＡ材料を含まない細胞から、
組換えＤＮＡ材料の導入された宿主細胞を選別するのに
役立つ。適当な調節配列の与えられた選択マーカーは、
スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつ成熟過程型ポリ
ペプチドをコードするヌクレオチド配列を含んだ断片上
に位置してもよいし、或いはそれとは別の断片上に存在
していてもよい。後者の場合には、本発明の組換えＤＮ
Ａ材料の各種構成成分と共に同時形質転換を行わなけれ
ばならない。発現成分（スルフヒドリルオキシダーゼ活
性をもつ成熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオ
チド配列を含む）／選択成分（選択マーカーを有する）
の比は、選択成分を含んでなる選別細胞が高い割合で発
現成分をも組込んでいるように調節することができる。
従って、本明細書中で用いる「組換えＤＮＡ材料」とい
う用語は、スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつ成熟
過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列と同
一の組換えＤＮＡ分子上又はそれとは異なる組換えＤＮ
Ａ断片上に選択マーカーが組込まれていているような１
又は複数の組換えＤＮＡ断片を包含する。
【００５７】糸状菌については同時形質転換法で形質転
換される場合が極めて多い。例えば、宿主細胞としてｐ
ｙｒＡ- 株（ｐｙｒＡ＝オロチジン−５’−リン酸デカ
ルボキシラーゼ）を使用し、スルフヒドリルオキシダー
ゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列を含むものを本発明の組換えＤＮＡ材料
として、ｐｙｒＡ遺伝子が別のＤＮＡ分子に含まれるよ
うにしてもよい。ｐｙｒＡ- 株の形質転換後に得られた
ｐｙｒＡ+ 株が何等かの組換えＤＮＡ材料を組込んでい
ることは明らかであり、スルフヒドリルオキシダーゼ活
性を有する成熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列を含んでいる可能性が高い。かかる同時形質
転換の結果として、宿主細胞１個当りにつき、スルフヒ
ドリルオキシダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる本発明の
組換えＤＮＡ材料成分が複数コピー導入されること（ｍ
ｕｌｔｉｃｏｐｙ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が頻
繁に起こる。この方法は、一般に多コピー形質転換体を
生産するための経路として周知である。
換される場合が極めて多い。例えば、宿主細胞としてｐ
ｙｒＡ- 株（ｐｙｒＡ＝オロチジン−５’−リン酸デカ
ルボキシラーゼ）を使用し、スルフヒドリルオキシダー
ゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列を含むものを本発明の組換えＤＮＡ材料
として、ｐｙｒＡ遺伝子が別のＤＮＡ分子に含まれるよ
うにしてもよい。ｐｙｒＡ- 株の形質転換後に得られた
ｐｙｒＡ+ 株が何等かの組換えＤＮＡ材料を組込んでい
ることは明らかであり、スルフヒドリルオキシダーゼ活
性を有する成熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレ
オチド配列を含んでいる可能性が高い。かかる同時形質
転換の結果として、宿主細胞１個当りにつき、スルフヒ
ドリルオキシダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列を含んでなる本発明の
組換えＤＮＡ材料成分が複数コピー導入されること（ｍ
ｕｌｔｉｃｏｐｙ ｉｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）が頻
繁に起こる。この方法は、一般に多コピー形質転換体を
生産するための経路として周知である。
【００５８】産業用微生物のためのその他の周知の選択
系は、宿主細胞中での突然変異を要しない選択マーカー
からなる群によって形成される。菌類の選択マーカーの
具体例は、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子、ＡＴ
Ｐ合成酵素サブユニットｇ（ｏｌｉＣ）遺伝子及びベノ
ミル耐性（ｂｅｎＡ）遺伝子である。菌類の選択マーカ
ーのもう一つの具体例は、硝酸レダクターゼ系である。
菌類以外の選択マーカーの典型的な例は、ｇ４１８耐性
遺伝子（酵母）、アンピシリン耐性遺伝子（大腸菌）及
びネオマイシン耐性遺伝子（バシルス）、ハイグロマイ
シン耐性付与遺伝子（ｈｐｈ）又はブレオマイシン耐性
付与遺伝子（Ｂｌｅ）である。
系は、宿主細胞中での突然変異を要しない選択マーカー
からなる群によって形成される。菌類の選択マーカーの
具体例は、アセトアミダーゼ（ａｍｄＳ）遺伝子、ＡＴ
Ｐ合成酵素サブユニットｇ（ｏｌｉＣ）遺伝子及びベノ
ミル耐性（ｂｅｎＡ）遺伝子である。菌類の選択マーカ
ーのもう一つの具体例は、硝酸レダクターゼ系である。
菌類以外の選択マーカーの典型的な例は、ｇ４１８耐性
遺伝子（酵母）、アンピシリン耐性遺伝子（大腸菌）及
びネオマイシン耐性遺伝子（バシルス）、ハイグロマイ
シン耐性付与遺伝子（ｈｐｈ）又はブレオマイシン耐性
付与遺伝子（Ｂｌｅ）である。
【００５９】適切な形質転換法並びに適切な発現ベクタ
ー（例えば適切な転写プロモーター、適切な転写終結シ
グナル、及び形質転換細胞を選別するための適切なマー
カー遺伝子を与えたもの）に関しては、各種の細菌、酵
母、菌類及び植物を含め、数多くの生物について知られ
ている。例えば酵母についての参考文献として、Ｔａｇ
ｉｍａ他，Ｙｅａｓｔ １：６７−７７（１９８５）を
挙げることができるが、この報文には、酵母中におけ
る、ガラクトースで誘導されるｇａｌ７プロモーターの
制御下での外来遺伝子の発現について記載されている。
また、例えばバシルス・スブチリスについては、発現ベ
クターとして、ＳＰＯ２プロモーターを含むプラスミド
ｐＮＳ４８が欧州特許公開第０１５７４４１号に記載さ
れている。これらの微生物並びにその他の生物における
他の可能性については、一般書を参照されたい。
ー（例えば適切な転写プロモーター、適切な転写終結シ
グナル、及び形質転換細胞を選別するための適切なマー
カー遺伝子を与えたもの）に関しては、各種の細菌、酵
母、菌類及び植物を含め、数多くの生物について知られ
ている。例えば酵母についての参考文献として、Ｔａｇ
ｉｍａ他，Ｙｅａｓｔ １：６７−７７（１９８５）を
挙げることができるが、この報文には、酵母中におけ
る、ガラクトースで誘導されるｇａｌ７プロモーターの
制御下での外来遺伝子の発現について記載されている。
また、例えばバシルス・スブチリスについては、発現ベ
クターとして、ＳＰＯ２プロモーターを含むプラスミド
ｐＮＳ４８が欧州特許公開第０１５７４４１号に記載さ
れている。これらの微生物並びにその他の生物における
他の可能性については、一般書を参照されたい。
【００６０】スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する
成熟過程型ポリペプチドの過剰発現は、発現宿主に本発
明の組換えＤＮＡ材料を導入することによって行うこと
ができるが、かかる組換えＤＮＡ材料は、発現宿主によ
る当該ポリペプチドの発現レベルを増大させるような１
又は複数の調節領域（例えば、プロモーター及びターミ
ネーター領域から選択する）を含んでなる。所望によ
り、発現宿主から当該ポリペプチドを分泌させることも
可能である。これは、少なくとも１つのシグナル配列
（プレ又はプレプロ配列など）をさらに含んでいるよう
な本発明の組換えＤＮＡ材料を導入することによって達
成できる。
成熟過程型ポリペプチドの過剰発現は、発現宿主に本発
明の組換えＤＮＡ材料を導入することによって行うこと
ができるが、かかる組換えＤＮＡ材料は、発現宿主によ
る当該ポリペプチドの発現レベルを増大させるような１
又は複数の調節領域（例えば、プロモーター及びターミ
ネーター領域から選択する）を含んでなる。所望によ
り、発現宿主から当該ポリペプチドを分泌させることも
可能である。これは、少なくとも１つのシグナル配列
（プレ又はプレプロ配列など）をさらに含んでいるよう
な本発明の組換えＤＮＡ材料を導入することによって達
成できる。
【００６１】本発明は、前述の実施態様のいずれかに係
るスルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する成熟過程型
ポリペプチドのヌクレオチド配列の少なくとも一部を含
んでなる組換えＤＮＡ材料に関するだけでなく、かかる
組換えＤＮＡ材料の少なくとも一部を含んでいて上記ヌ
クレオチド配列を発現する能力を有する細胞にも関す
る。
るスルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する成熟過程型
ポリペプチドのヌクレオチド配列の少なくとも一部を含
んでなる組換えＤＮＡ材料に関するだけでなく、かかる
組換えＤＮＡ材料の少なくとも一部を含んでいて上記ヌ
クレオチド配列を発現する能力を有する細胞にも関す
る。
【００６２】本発明の組換えＤＮＡを含んでなる発現宿
主の子孫も本発明に包含される。
主の子孫も本発明に包含される。
【００６３】好ましくは、本発明の細胞は、スルフヒド
リルオキシダーゼ活性をもつ成熟過程型ポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列を過剰発現する能力を有す
る。本発明において、「過剰発現」とは、スルフヒドリ
ルオキシダーゼ活性をもつ成熟過程型ポリペプチドの起
源となった本来の生物中で同一条件下で通常みられるよ
りも高いレベルで上記ポリペプチドが発現されることで
あると定義される。同じく、「過剰発現」は、本発明の
組換えＤＮＡ材料に含まれるヌクレオチド配列の起源と
なった生物とは異なる生物（いわゆる異種生物）中で
の、スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつ成熟過程型
ポリペプチドの発現をも意味する。異種宿主細胞は、通
常は、スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつ成熟過程
型ポリペプチドを検出できるほど産生しないので、異種
生物がかかるポリペプチドを産生し得るのは本発明の組
換えＤＮＡ材料を導入した後に限られる。
リルオキシダーゼ活性をもつ成熟過程型ポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列を過剰発現する能力を有す
る。本発明において、「過剰発現」とは、スルフヒドリ
ルオキシダーゼ活性をもつ成熟過程型ポリペプチドの起
源となった本来の生物中で同一条件下で通常みられるよ
りも高いレベルで上記ポリペプチドが発現されることで
あると定義される。同じく、「過剰発現」は、本発明の
組換えＤＮＡ材料に含まれるヌクレオチド配列の起源と
なった生物とは異なる生物（いわゆる異種生物）中で
の、スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつ成熟過程型
ポリペプチドの発現をも意味する。異種宿主細胞は、通
常は、スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつ成熟過程
型ポリペプチドを検出できるほど産生しないので、異種
生物がかかるポリペプチドを産生し得るのは本発明の組
換えＤＮＡ材料を導入した後に限られる。
【００６４】既に述べた通り、スルフヒドリルオキシダ
ーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドの過剰発現は
本発明の組換え材料の導入によってなされる。
ーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドの過剰発現は
本発明の組換え材料の導入によってなされる。
【００６５】過剰発現を達成するために、本発明の組換
えＤＮＡ材料を同種発現宿主に導入することもできる。
「同種発現宿主」という用語は、本発明の組換えＤＮＡ
材料に含まれているような、スルフヒドリルオキシダー
ゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列の起源となった生物と同じ株又は種に属
する発現宿主で形質転換していないものを意味する。
えＤＮＡ材料を同種発現宿主に導入することもできる。
「同種発現宿主」という用語は、本発明の組換えＤＮＡ
材料に含まれているような、スルフヒドリルオキシダー
ゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコードするヌ
クレオチド配列の起源となった生物と同じ株又は種に属
する発現宿主で形質転換していないものを意味する。
【００６６】本発明の組換えＤＮＡ材料を同種発現宿主
に導入すると、発現宿主はスルフヒドリルオキシダーゼ
活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列を少なくとも２つ含んでいるような、いわ
ゆる多コピー形質転換体となる。
に導入すると、発現宿主はスルフヒドリルオキシダーゼ
活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列を少なくとも２つ含んでいるような、いわ
ゆる多コピー形質転換体となる。
【００６７】過剰発現は、さらに、スルフヒドリルオキ
シダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列を単離した株とは異なる株に属す
る宿主（いわゆる異種宿主）に本発明の組換えＤＮＡ材
料を導入することによっても行うことができ、その結
果、得られる発現宿主は、スルフヒドリルオキシダーゼ
活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列を複数の遺伝子コピーとして含んでおり、
いわゆる多コピー形質転換体となる。
シダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列を単離した株とは異なる株に属す
る宿主（いわゆる異種宿主）に本発明の組換えＤＮＡ材
料を導入することによっても行うことができ、その結
果、得られる発現宿主は、スルフヒドリルオキシダーゼ
活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列を複数の遺伝子コピーとして含んでおり、
いわゆる多コピー形質転換体となる。
【００６８】多コピー形質転換体を得るための公知の方
法を使用することができる。本発明の組換えＤＮＡ材料
は、従って、スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつ成
熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列コ
ピーを複数含んでいるような多コピー形質転換体を得る
ために必要とされる具体的態様を包含する。
法を使用することができる。本発明の組換えＤＮＡ材料
は、従って、スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつ成
熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列コ
ピーを複数含んでいるような多コピー形質転換体を得る
ために必要とされる具体的態様を包含する。
【００６９】過剰発現は、スルフヒドリルオキシダーゼ
活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列の起源となった生物中でのスルフヒドリル
オキシダーゼ遺伝子に対する本来の調節領域とは異なる
調節領域の制御下に置かれた上記ヌクレオチド配列を宿
主細胞が含むように、宿主細胞に、前述の実施態様のい
ずれかに係る本発明の組換えＤＮＡ材料を導入すること
によっても達成することができる。上記の本来の調節領
域とは異なる調節領域としては、本来の調節領域より効
率の高いものが好ましい。本発明は、前述の実施態様の
いずれかに係る組換えＤＮＡ材料で、上記ヌクレオチド
配列の起源となった生物中でのスルフヒドリルオキシダ
ーゼ遺伝子に対する本来の調節領域とは異なる調節領域
をさらに含んでいるような組換えＤＮＡ材料にも関す
る。かかる宿主細胞は同種のものでもよいし、異種のも
のであってもよい。かかる宿主細胞は、本発明の組換え
ＤＮＡ材料に含まれているようなスルフヒドリルオキシ
ダーゼ活性をもつ成熟過程型ポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列を１又は複数コピー含む。
活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコードするヌク
レオチド配列の起源となった生物中でのスルフヒドリル
オキシダーゼ遺伝子に対する本来の調節領域とは異なる
調節領域の制御下に置かれた上記ヌクレオチド配列を宿
主細胞が含むように、宿主細胞に、前述の実施態様のい
ずれかに係る本発明の組換えＤＮＡ材料を導入すること
によっても達成することができる。上記の本来の調節領
域とは異なる調節領域としては、本来の調節領域より効
率の高いものが好ましい。本発明は、前述の実施態様の
いずれかに係る組換えＤＮＡ材料で、上記ヌクレオチド
配列の起源となった生物中でのスルフヒドリルオキシダ
ーゼ遺伝子に対する本来の調節領域とは異なる調節領域
をさらに含んでいるような組換えＤＮＡ材料にも関す
る。かかる宿主細胞は同種のものでもよいし、異種のも
のであってもよい。かかる宿主細胞は、本発明の組換え
ＤＮＡ材料に含まれているようなスルフヒドリルオキシ
ダーゼ活性をもつ成熟過程型ポリペプチドをコードする
ヌクレオチド配列を１又は複数コピー含む。
【００７０】場合によっては、本発明の組換えＤＮＡ材
料が宿主細胞の染色体ＤＮＡに組込まれるように、当該
組換えＤＮＡ材料を導入するのが好ましいこともある。
菌類の細胞においては、染色体への組込みは形質転換の
成功例では常に起こっている。プラスミドＤＮＡは全く
保持されない。酵母では、プラスミド及び染色体に組込
まれたＤＮＡ共に十分に保持される。
料が宿主細胞の染色体ＤＮＡに組込まれるように、当該
組換えＤＮＡ材料を導入するのが好ましいこともある。
菌類の細胞においては、染色体への組込みは形質転換の
成功例では常に起こっている。プラスミドＤＮＡは全く
保持されない。酵母では、プラスミド及び染色体に組込
まれたＤＮＡ共に十分に保持される。
【００７１】導入される遺伝的性質が染色体外ＤＮＡ
（「プラスミド」と呼ばれる）上に位置するように、組
換えＤＮＡ材料を宿主細胞に導入することもできる。プ
ラスミドは、プラスミドが通常は細胞内に複数のコピー
数で存在するという利点をもつが、このことは、また、
かかるプラスミド上にある遺伝子が細胞内に多コピー型
で存在していることをも意味しており、その結果、かか
る遺伝子にコードされているタンパク質の発現率が高く
なるという利点をもつ。しかし、プラスミドの欠点は、
プラスミドが不安定な状態になることもあり、そのた
め、ある段階で細胞からのプラスミドが失われる可能性
もあるということである。プラスミドの損失は、形質転
換されていない宿主細胞（非形質転換宿主細胞）の染色
体ＤＮＡとハイブリッド形成し得るようなある程度の長
さのヌクレオチドを含むプラスミドを用いて形質転換後
にこのベクターが上記宿主細胞染色体中に安定に組込ま
れるようにすることによって、防止できる。ある程度の
長さの相同ＤＮＡが染色体ＤＮＡ中に既に複数コピー存
在しているようなものを用いると、複数のベクターＤＮ
Ａコピーが挿入され、その結果、スルフヒドリルオキシ
ダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列が１又は複数コピー含んでなる多重
組込みＤＮＡが得られることになる。ベクターが染色体
ＤＮＡ中の組込みＤＮＡを与えるためのもう一つ条件
は、ベクターが機能的レプリコンを含まないことであ
る。これは、ベクターが組込まれない限り、ベクターは
宿主細胞中に維持されないからである。
（「プラスミド」と呼ばれる）上に位置するように、組
換えＤＮＡ材料を宿主細胞に導入することもできる。プ
ラスミドは、プラスミドが通常は細胞内に複数のコピー
数で存在するという利点をもつが、このことは、また、
かかるプラスミド上にある遺伝子が細胞内に多コピー型
で存在していることをも意味しており、その結果、かか
る遺伝子にコードされているタンパク質の発現率が高く
なるという利点をもつ。しかし、プラスミドの欠点は、
プラスミドが不安定な状態になることもあり、そのた
め、ある段階で細胞からのプラスミドが失われる可能性
もあるということである。プラスミドの損失は、形質転
換されていない宿主細胞（非形質転換宿主細胞）の染色
体ＤＮＡとハイブリッド形成し得るようなある程度の長
さのヌクレオチドを含むプラスミドを用いて形質転換後
にこのベクターが上記宿主細胞染色体中に安定に組込ま
れるようにすることによって、防止できる。ある程度の
長さの相同ＤＮＡが染色体ＤＮＡ中に既に複数コピー存
在しているようなものを用いると、複数のベクターＤＮ
Ａコピーが挿入され、その結果、スルフヒドリルオキシ
ダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコードす
るヌクレオチド配列が１又は複数コピー含んでなる多重
組込みＤＮＡが得られることになる。ベクターが染色体
ＤＮＡ中の組込みＤＮＡを与えるためのもう一つ条件
は、ベクターが機能的レプリコンを含まないことであ
る。これは、ベクターが組込まれない限り、ベクターは
宿主細胞中に維持されないからである。
【００７２】組込みを可能にするヌクレオチド配列は、
好ましくは、非形質転換細胞染色体の非必須領域の少な
くとも一部からなるＤＮＡに由来する（この場合、「由
来」という用語は、本発明のベクター中のある程度の鎖
長のヌクレオチドが、染色体ＤＮＡと、組込みのための
ハイブリッドを形成するに十分な相同性を示すことを意
味する。）。従って、ベクターの組込みは上記宿主細胞
染色体の非必須領域で起こり、宿主細胞の基本的機能が
失われることはないと考えられる。組込みは、非形質転
換宿主細胞染色体の淘汰されてもよい非必須遺伝子で起
こるのが望ましい。このことを、形質転換した宿主細胞
の選択基準とすることもできる。
好ましくは、非形質転換細胞染色体の非必須領域の少な
くとも一部からなるＤＮＡに由来する（この場合、「由
来」という用語は、本発明のベクター中のある程度の鎖
長のヌクレオチドが、染色体ＤＮＡと、組込みのための
ハイブリッドを形成するに十分な相同性を示すことを意
味する。）。従って、ベクターの組込みは上記宿主細胞
染色体の非必須領域で起こり、宿主細胞の基本的機能が
失われることはないと考えられる。組込みは、非形質転
換宿主細胞染色体の淘汰されてもよい非必須遺伝子で起
こるのが望ましい。このことを、形質転換した宿主細胞
の選択基準とすることもできる。
【００７３】菌類の細胞については、その細胞内にプラ
スミドが保持されないので、染色体ＤＮＡにＤＮＡの組
込まれた形質転換細胞をうまく得るしか途はない。菌類
の細胞では、相同染色体ＤＮＡがなくても複数のコピー
の組込みが起こるので、かかる相同染色体ＤＮＡを用い
る必要なない。酵母の場合、形質転換体中の所望ＤＮＡ
はプラスミドとしてもよいし或いは組込みＤＮＡとして
もよく、その選択は任意である。酵母細胞に組込むため
には、染色体ＤＮＡに対して相同なＤＮＡが存在してい
る必要がある。
スミドが保持されないので、染色体ＤＮＡにＤＮＡの組
込まれた形質転換細胞をうまく得るしか途はない。菌類
の細胞では、相同染色体ＤＮＡがなくても複数のコピー
の組込みが起こるので、かかる相同染色体ＤＮＡを用い
る必要なない。酵母の場合、形質転換体中の所望ＤＮＡ
はプラスミドとしてもよいし或いは組込みＤＮＡとして
もよく、その選択は任意である。酵母細胞に組込むため
には、染色体ＤＮＡに対して相同なＤＮＡが存在してい
る必要がある。
【００７４】本発明の好ましい実施態様は、前述の実施
態様のいずれかに係る本発明の組換えＤＮＡ材料を含ん
でなる細胞にして、その組換えＤＮＡ材料にコードされ
ているスルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつ成熟過程
型ポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）を分泌する能
力を有する細胞に関する。スルフヒドリルオキシダーゼ
活性をもつ成熟過程型ポリペプチドは、菌体から回収す
るよりも培地から回収するほうが簡単なので、当該ポリ
ペプチドが宿主細胞から培地中に分泌されるのが望まし
い場合が多い。培地中に分泌されるスルフヒドリルオキ
シダーゼは好ましくは成熟型である。
態様のいずれかに係る本発明の組換えＤＮＡ材料を含ん
でなる細胞にして、その組換えＤＮＡ材料にコードされ
ているスルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつ成熟過程
型ポリペプチド（特に成熟ポリペプチド）を分泌する能
力を有する細胞に関する。スルフヒドリルオキシダーゼ
活性をもつ成熟過程型ポリペプチドは、菌体から回収す
るよりも培地から回収するほうが簡単なので、当該ポリ
ペプチドが宿主細胞から培地中に分泌されるのが望まし
い場合が多い。培地中に分泌されるスルフヒドリルオキ
シダーゼは好ましくは成熟型である。
【００７５】本発明において、「分泌」という用語は、
ポリペプチドが細胞壁又は細胞膜を横断することを包含
する。ポリペプチドは、細胞壁又は細胞膜を通過して培
地中に出てもよいが、細胞壁又は細胞膜に付着したまま
残っていてもよい。ポリペプチドは、また、細胞膜を通
過して細胞周辺腔に残り、培地中に出なくてもよい。ス
ルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつ成熟過程型ポリペ
プチドが辿るプロセッシング（分泌経路）は、宿主細胞
及び本発明の組換えＤＮＡ材料の組成に依存する。しか
し、ポリペプチドが培地中に分泌されるのが最も好まし
い。
ポリペプチドが細胞壁又は細胞膜を横断することを包含
する。ポリペプチドは、細胞壁又は細胞膜を通過して培
地中に出てもよいが、細胞壁又は細胞膜に付着したまま
残っていてもよい。ポリペプチドは、また、細胞膜を通
過して細胞周辺腔に残り、培地中に出なくてもよい。ス
ルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつ成熟過程型ポリペ
プチドが辿るプロセッシング（分泌経路）は、宿主細胞
及び本発明の組換えＤＮＡ材料の組成に依存する。しか
し、ポリペプチドが培地中に分泌されるのが最も好まし
い。
【００７６】本発明の細胞は、スルフヒドリルオキシダ
ーゼ活性をもつポリペプチド本来のリーダー配列（プレ
又はプレプロ）をコードするＤＮＡをさらに含んでいる
ような、前述の実施態様のいずれかに係る、組換えＤＮ
Ａ材料を含んでいてもよい。別の実施態様では、本発明
の細胞は、本来のリーダー配列の代りに外来リーダー配
列（プレ又はプレプロ）をコードするＤＮＡをさらに含
んでいるような組換えＤＮＡ材料を含んでいてもよい。
本発明は、また、スルフヒドリルオキシダーゼ活性をも
つ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡにそのポリペプ
チドにとっての外来リーダー配列をコードするＤＮＡが
連結したものからなる組換えＤＮＡ材料に関する。
ーゼ活性をもつポリペプチド本来のリーダー配列（プレ
又はプレプロ）をコードするＤＮＡをさらに含んでいる
ような、前述の実施態様のいずれかに係る、組換えＤＮ
Ａ材料を含んでいてもよい。別の実施態様では、本発明
の細胞は、本来のリーダー配列の代りに外来リーダー配
列（プレ又はプレプロ）をコードするＤＮＡをさらに含
んでいるような組換えＤＮＡ材料を含んでいてもよい。
本発明は、また、スルフヒドリルオキシダーゼ活性をも
つ成熟ポリペプチドをコードするＤＮＡにそのポリペプ
チドにとっての外来リーダー配列をコードするＤＮＡが
連結したものからなる組換えＤＮＡ材料に関する。
【００７７】スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する
ポリペプチドの発現の増大は、発現宿主の有するプロセ
シング及び分泌能力を超える程のポリペプチド産生をも
たらす可能性があり、その結果、宿主細胞内にポリペプ
チド産物が蓄積して、細胞膜又は細胞壁を通してのポリ
ペプチド輸送の進行を妨げることもある。従って、本発
明は、また、発現宿主からスルフヒドリルオキシダーゼ
を最も効率的に分泌させるような異種シグナル配列をさ
らに含んでなるような、前述の実施態様のいずれかに係
る、組換えＤＮＡ材料を含有する細胞に関する。本発明
は、さらに、かかる組換えＤＮＡ材料にも関する。
ポリペプチドの発現の増大は、発現宿主の有するプロセ
シング及び分泌能力を超える程のポリペプチド産生をも
たらす可能性があり、その結果、宿主細胞内にポリペプ
チド産物が蓄積して、細胞膜又は細胞壁を通してのポリ
ペプチド輸送の進行を妨げることもある。従って、本発
明は、また、発現宿主からスルフヒドリルオキシダーゼ
を最も効率的に分泌させるような異種シグナル配列をさ
らに含んでなるような、前述の実施態様のいずれかに係
る、組換えＤＮＡ材料を含有する細胞に関する。本発明
は、さらに、かかる組換えＤＮＡ材料にも関する。
【００７８】異種分泌シグナル配列は、スルフヒドリル
オキシダーゼ活性をもつ成熟過程型ポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列の外来調節領域の起源となった
生物と同じ菌株に当該シグナル配列が由来するように、
好ましくは同じ遺伝子に由来するように選択することが
できる。例えば、分泌能力の高いアミログルコシダーゼ
タンパク質のシグナル配列をアミログルコシダーゼプロ
モーター自体と組合せで使用してもよいし、その他のプ
ロモーターと組合せてしようしてもよい。
オキシダーゼ活性をもつ成熟過程型ポリペプチドをコー
ドするヌクレオチド配列の外来調節領域の起源となった
生物と同じ菌株に当該シグナル配列が由来するように、
好ましくは同じ遺伝子に由来するように選択することが
できる。例えば、分泌能力の高いアミログルコシダーゼ
タンパク質のシグナル配列をアミログルコシダーゼプロ
モーター自体と組合せで使用してもよいし、その他のプ
ロモーターと組合せてしようしてもよい。
【００７９】好ましい異種分泌シグナル配列の具体例と
して、菌類についてはグルコアミラーゼＡ又はエンドキ
シラーゼIIＡ遺伝子に由来するもの、酵母についてはイ
ンベルターゼ遺伝子に由来するもの、並びにバシルスに
ついてはα−アミラーゼ遺伝子に由来するものを挙げる
ことができる。
して、菌類についてはグルコアミラーゼＡ又はエンドキ
シラーゼIIＡ遺伝子に由来するもの、酵母についてはイ
ンベルターゼ遺伝子に由来するもの、並びにバシルスに
ついてはα−アミラーゼ遺伝子に由来するものを挙げる
ことができる。
【００８０】本発明においては、ハイブリッド分泌配列
も都合よく使用し得る。
も都合よく使用し得る。
【００８１】一般に、転写の終結は遺伝子の過剰発現に
関してはさほど重大な因子ではない。所望により、転写
のターミネ−ターはプロモーターと同じ遺伝子から選ん
でもよいし、同種ターミネーターを使用してもよい。実
際に、如何なるターミネーターを使用することもでき
る。
関してはさほど重大な因子ではない。所望により、転写
のターミネ−ターはプロモーターと同じ遺伝子から選ん
でもよいし、同種ターミネーターを使用してもよい。実
際に、如何なるターミネーターを使用することもでき
る。
【００８２】スルフヒドリルオキシダーゼの大きさ（分
子量）、糖鎖形成の潜在的必要性、或いは細胞膜上もし
くは細胞壁上もしくは培地中への分泌の望ましさなどの
諸因子も宿主細胞の選択に重要な役割を果たす。
子量）、糖鎖形成の潜在的必要性、或いは細胞膜上もし
くは細胞壁上もしくは培地中への分泌の望ましさなどの
諸因子も宿主細胞の選択に重要な役割を果たす。
【００８３】スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、当該Ｄ
ＮＡ配列中に存在するイントロンと共に用いるか否か、
自身の又は他の遺伝子に由来するプロモーター及び／又
は転写終結シグナルと共に用いるか否か、さらには、自
身の又は他の遺伝子に由来するリーダー配列又はシグナ
ル配列と共に用いるか否かは、選択した宿主細胞によっ
てある程度左右される。
ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を、当該Ｄ
ＮＡ配列中に存在するイントロンと共に用いるか否か、
自身の又は他の遺伝子に由来するプロモーター及び／又
は転写終結シグナルと共に用いるか否か、さらには、自
身の又は他の遺伝子に由来するリーダー配列又はシグナ
ル配列と共に用いるか否かは、選択した宿主細胞によっ
てある程度左右される。
【００８４】本発明においては、本発明の組換えＤＮＡ
材料を含んでなる細胞の素性に関して、原則として、何
等特別な制限はない。本発明の細胞は、組換えＤＮＡを
増幅させるための作用因子として、或いはスルフヒドリ
ルオキシダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドを
産生するための作用因子として重要である。
材料を含んでなる細胞の素性に関して、原則として、何
等特別な制限はない。本発明の細胞は、組換えＤＮＡを
増幅させるための作用因子として、或いはスルフヒドリ
ルオキシダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドを
産生するための作用因子として重要である。
【００８５】スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつ成
熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
過剰発現する能力を有しているような発現宿主が好まし
い。スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する成熟過程
型ポリペプチドを分泌する能力を有しているような発現
宿主細胞が特に好ましい。
熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
過剰発現する能力を有しているような発現宿主が好まし
い。スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する成熟過程
型ポリペプチドを分泌する能力を有しているような発現
宿主細胞が特に好ましい。
【００８６】発現宿主は、好ましくは、細菌、菌類、酵
母及び植物の細胞からなる群から選択される。
母及び植物の細胞からなる群から選択される。
【００８７】極めて好ましい宿主細胞の具体例として、 ａ）菌類の細胞、特に糸状菌の細胞、アスペルギルス
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉ
ｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ニューロスポーラ（Ｎｅｕｒｏ
ｓｐｏｒａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕ
ｍ）属及びムコール（Ｍｕｃｏｒ）属からなる群から選
択される菌類の細胞である。宿主細胞として適する菌種
の具体例は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペ
ルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚ
ａｅ）、アスペルギルス・ソヤエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・ツビゲンシス
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）、
アスペルギルス・アクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニ
クス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕ
ｓ）、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍ
ａ ｒｅｅｓｅｉ）及びトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉ
ｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）のいずれか１種； ｂ）酵母細胞、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒ
ｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）
属及びピシア（Ｐｉｃｈｉａ）属、特にサッカロミセス
・セレビシェー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・カールベルゲンシ
ス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｂｅｒｇｅ
ｎｓｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖ
ｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス
・マルキアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒ
ｘｉａｎｕｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓ
ｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）及びピシア・パス
トリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のいずれか
１種； ｃ）例えば小麦、大麦、燕麦、トウモロコシ、エンド
ウ、ジャガイモ及びタバコからなる群から選択される属
の植物細胞、例えばソラヌム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎ
ｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）及びニコチアナ・タバック
ム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｂａｃｃｕｍ）など；並
びに ｄ）細菌の細胞、好ましくはグラム陽性菌の細胞、例え
ばバシルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）種又はバシルス・リヘニホルミス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）種のようなバ
シルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトバシルス（Ｌａ
ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属及びストレプトコックス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属するもの。
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属、トリコデルマ（Ｔｒｉ
ｃｈｏｄｅｒｍａ）属、ニューロスポーラ（Ｎｅｕｒｏ
ｓｐｏｒａ）属、ペニシリウム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕ
ｍ）属及びムコール（Ｍｕｃｏｒ）属からなる群から選
択される菌類の細胞である。宿主細胞として適する菌種
の具体例は、アスペルギルス・ニガー（Ａｓｐｅｒｇｉ
ｌｌｕｓ ｎｉｇｅｒ）、アスペルギルス・アワモリ
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ａｗａｍｏｒｉ）、アスペ
ルギルス・オリゼ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｏｒｙｚ
ａｅ）、アスペルギルス・ソヤエ（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌ
ｕｓ ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・ツビゲンシス
（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）、
アスペルギルス・アクレアツス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕ
ｓ ａｃｕｌｅａｔｕｓ）、アスペルギルス・ジャポニ
クス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ ｊａｐｏｎｉｃｕ
ｓ）、トリコデルマ・レーセイ（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍ
ａ ｒｅｅｓｅｉ）及びトリコデルマ・ビリデ（Ｔｒｉ
ｃｈｏｄｅｒｍａ ｖｉｒｉｄｅ）のいずれか１種； ｂ）酵母細胞、例えばサッカロミセス（Ｓａｃｃｈａｒ
ｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖｅｒ
ｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌａ）
属及びピシア（Ｐｉｃｈｉａ）属、特にサッカロミセス
・セレビシェー（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒ
ｅｖｉｓｉａｅ）、サッカロミセス・カールベルゲンシ
ス（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃａｒｌｂｅｒｇｅ
ｎｓｉｓ）、クルイベロミセス・ラクチス（Ｋｌｕｙｖ
ｅｒｏｍｙｃｅｓ ｌａｃｔｉｓ）、クルイベロミセス
・マルキアヌス（Ｋｌｕｙｖｅｒｏｍｙｃｅｓ ｍａｒ
ｘｉａｎｕｓ）、ハンゼヌラ・ポリモルファ（Ｈａｎｓ
ｅｎｕｌａ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈａ）及びピシア・パス
トリス（Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ）のいずれか
１種； ｃ）例えば小麦、大麦、燕麦、トウモロコシ、エンド
ウ、ジャガイモ及びタバコからなる群から選択される属
の植物細胞、例えばソラヌム・ツベロスム（Ｓｏｌａｎ
ｕｍ ｔｕｂｅｒｏｓｕｍ）及びニコチアナ・タバック
ム（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ ｔｏｂａｃｃｕｍ）など；並
びに ｄ）細菌の細胞、好ましくはグラム陽性菌の細胞、例え
ばバシルス・スブチリス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ ｓｕｂｔ
ｉｌｉｓ）種又はバシルス・リヘニホルミス（Ｂａｃｉ
ｌｌｕｓ ｌｉｃｈｅｎｉｆｏｒｍｉｓ）種のようなバ
シルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトバシルス（Ｌａ
ｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属及びストレプトコックス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属に属するもの。
【００８８】本発明の組換えＤＮＡ材料について選択す
べき宿主細胞は、特に、スルフヒドリルオキシダーゼ活
性をもつポリペプチドの最終的な用途によって大きく左
右される。
べき宿主細胞は、特に、スルフヒドリルオキシダーゼ活
性をもつポリペプチドの最終的な用途によって大きく左
右される。
【００８９】本発明の好ましい細胞は食品級（ｆｏｏｄ
ｇｒａｄｅ）の細胞である。これは、かかる食品級の
細胞が食品の製造プロセスに使用できるからである。バ
シルス属の細菌は、タンパク質を培地中に分泌する能力
を有しているので、発現宿主細胞として極めて適してい
る。別に、酵母又は菌類からなる群から選択さえれる宿
主が好ましい場合もある。場合によっては、酵母細胞の
ほうが菌類細胞よりも取扱いが容易なこともある。しか
し、タンパク質によっては、酵母細胞からほとんど分泌
されなかったり、正確なプロセッシングを受けなかった
りすることもある（例えば酵母における高糖鎖形成）。
このような場合に限らず、菌類を宿主として選択するこ
とができる。菌類宿主は、ＧＲＡＳ階級（ＧＲＡＳ＝ｇ
ｅｎｅｒａｌｌｙ ｒｅｇａｒｄｅｄ ａｓ ｓａｆ
ｅ，一般に安全と認めらるもの）であるのが好ましい場
合が多い。一般に、真核生物宿主は分泌型活性ポリペプ
チドの産生能力が高いことが判明している。実際、菌類
宿主は産業上のプロセスに頻繁に使用されている。特に
適した宿主の具体例は、アスペルギルス・ニガー及びア
スペルギルス・ニガー変種アワモリである。これらの特
定のアスペルギルス属の菌種は、従来から、酵素を工業
的に生産するための優れた宿主細胞であることが実証さ
れている。当業者はこれらの種の多コピー形質転換株を
得ることが可能である。
ｇｒａｄｅ）の細胞である。これは、かかる食品級の
細胞が食品の製造プロセスに使用できるからである。バ
シルス属の細菌は、タンパク質を培地中に分泌する能力
を有しているので、発現宿主細胞として極めて適してい
る。別に、酵母又は菌類からなる群から選択さえれる宿
主が好ましい場合もある。場合によっては、酵母細胞の
ほうが菌類細胞よりも取扱いが容易なこともある。しか
し、タンパク質によっては、酵母細胞からほとんど分泌
されなかったり、正確なプロセッシングを受けなかった
りすることもある（例えば酵母における高糖鎖形成）。
このような場合に限らず、菌類を宿主として選択するこ
とができる。菌類宿主は、ＧＲＡＳ階級（ＧＲＡＳ＝ｇ
ｅｎｅｒａｌｌｙ ｒｅｇａｒｄｅｄ ａｓ ｓａｆ
ｅ，一般に安全と認めらるもの）であるのが好ましい場
合が多い。一般に、真核生物宿主は分泌型活性ポリペプ
チドの産生能力が高いことが判明している。実際、菌類
宿主は産業上のプロセスに頻繁に使用されている。特に
適した宿主の具体例は、アスペルギルス・ニガー及びア
スペルギルス・ニガー変種アワモリである。これらの特
定のアスペルギルス属の菌種は、従来から、酵素を工業
的に生産するための優れた宿主細胞であることが実証さ
れている。当業者はこれらの種の多コピー形質転換株を
得ることが可能である。
【００９０】ポリペプチドを生産する場合、発現宿主細
胞を用いてポリペプチドを生産し、その後、培地からポ
リペプチドを単離することもできるし、或いは細胞を除
いたポリペプチド含有培地をそのまま使用することもで
きる。スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつポリペプ
チドが必要とされるプロセスのその場（ｉｎ ｓｉｔ
ｕ）でのポリペプチドの生産に細胞そのものを使用する
こともできる。食品の製造において、このように直接使
用することのできる宿主細胞は、それが食品級の宿主株
の場合に限られる。例えば製パンに関しては、本発明に
従って遺伝子操作した酵母株を直接使用することができ
る。
胞を用いてポリペプチドを生産し、その後、培地からポ
リペプチドを単離することもできるし、或いは細胞を除
いたポリペプチド含有培地をそのまま使用することもで
きる。スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつポリペプ
チドが必要とされるプロセスのその場（ｉｎ ｓｉｔ
ｕ）でのポリペプチドの生産に細胞そのものを使用する
こともできる。食品の製造において、このように直接使
用することのできる宿主細胞は、それが食品級の宿主株
の場合に限られる。例えば製パンに関しては、本発明に
従って遺伝子操作した酵母株を直接使用することができ
る。
【００９１】ポリペプチドが極めて純粋な状態で必要と
される場合、或いはある夾雑物のために得られたポリペ
プチドの使用が妨げられるような場合には、このような
問題が解消できるような発現宿主細胞を選択することが
できる。例えば、スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有
するポリペプチドの夾雑物としてのグルコースオキシダ
ーゼの存在は、グルコースオキシダーゼ陰性宿主細胞を
選択すればなくすことができる。天然にＳＯＸを産生す
る微生物の多くはＳＯＸよりもはるかに多量のグルコー
スオキシダーゼを産生することが知られている。本発明
の細胞においてはＳＯＸを過剰発現させることができ
る。ただし、このことは、必ずしもＳＯＸ産生量がＧＯ
Ｘ産生量以上となることを意味しない。ＧＯＸによるＳ
ＯＸの汚染を防止したり、ＳＯＸをＧＯＸから精製しな
くても済むようにするために、ＧＯＸ- の宿主細胞を用
いて、スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつ成熟過程
型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる
組換えＤＮＡを発現させることもできる。かかる宿主細
胞は、例えばアスペルギルス・ニガーＮ４００株（ＣＢ
Ｓ１２０．４９）又はアスペルギルス・ニガー変種アワ
モリ（ＣＢＳ１１５．５２）由来の菌株とすることがで
きる。
される場合、或いはある夾雑物のために得られたポリペ
プチドの使用が妨げられるような場合には、このような
問題が解消できるような発現宿主細胞を選択することが
できる。例えば、スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有
するポリペプチドの夾雑物としてのグルコースオキシダ
ーゼの存在は、グルコースオキシダーゼ陰性宿主細胞を
選択すればなくすことができる。天然にＳＯＸを産生す
る微生物の多くはＳＯＸよりもはるかに多量のグルコー
スオキシダーゼを産生することが知られている。本発明
の細胞においてはＳＯＸを過剰発現させることができ
る。ただし、このことは、必ずしもＳＯＸ産生量がＧＯ
Ｘ産生量以上となることを意味しない。ＧＯＸによるＳ
ＯＸの汚染を防止したり、ＳＯＸをＧＯＸから精製しな
くても済むようにするために、ＧＯＸ- の宿主細胞を用
いて、スルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつ成熟過程
型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列からなる
組換えＤＮＡを発現させることもできる。かかる宿主細
胞は、例えばアスペルギルス・ニガーＮ４００株（ＣＢ
Ｓ１２０．４９）又はアスペルギルス・ニガー変種アワ
モリ（ＣＢＳ１１５．５２）由来の菌株とすることがで
きる。
【００９２】同様の理由が、ＵＨＴ処理乳の異臭の除去
にＳＯＸを用いる場合にも通じる。この場合、夾雑物と
してのプロテアーゼの存在は望ましくない。特に、ＳＯ
Ｘ処理したＵＨＴ乳を長期間貯蔵する予定がある場合に
は、プロテアーゼの存在は避ける必要がある。ＢｉｏＧ
ｅｌ Ｐ１００（ＢｉｏＲａｄ社製）でサイズ排除クロ
マトグラフィーを行えば、プロテアーゼ含有量を８０〜
９０％減少させることができる。サイズ排除クロマトグ
ラフィー以外にも、イオン交換クロマトグラフィー、ベ
ントナイト処理、又はｐＨ／温度不活性化などの周知の
方法によって、プロテアーゼ活性を除去することができ
る。しかし、このような経費のかかる複雑な工程を避け
るために、宿主細胞としてｐｒｔ- 株を選ぶのが好まし
い。
にＳＯＸを用いる場合にも通じる。この場合、夾雑物と
してのプロテアーゼの存在は望ましくない。特に、ＳＯ
Ｘ処理したＵＨＴ乳を長期間貯蔵する予定がある場合に
は、プロテアーゼの存在は避ける必要がある。ＢｉｏＧ
ｅｌ Ｐ１００（ＢｉｏＲａｄ社製）でサイズ排除クロ
マトグラフィーを行えば、プロテアーゼ含有量を８０〜
９０％減少させることができる。サイズ排除クロマトグ
ラフィー以外にも、イオン交換クロマトグラフィー、ベ
ントナイト処理、又はｐＨ／温度不活性化などの周知の
方法によって、プロテアーゼ活性を除去することができ
る。しかし、このような経費のかかる複雑な工程を避け
るために、宿主細胞としてｐｒｔ- 株を選ぶのが好まし
い。
【００９３】本発明は、本発明の組換えＤＮＡ材料の発
現によって得ることのできる、スルフヒドリルオキシダ
ーゼ活性をもつ成熟過程型ポリペプチドに関する。ＵＨ
Ｔ乳からの異臭の除去並びにベイカリイ製品の改良のい
ずれにも効果的なことが知られているので、微生物由来
のスルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつポリペプチド
が好ましい。特に、本発明のスルフヒドリルオキシダー
ゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドの起源として
は、アスペルギルス属に属する微生物が好ましい。本発
明は、好ましくは、スルフヒドリルオキシダーゼ活性を
もつ成熟ポリペプチドに関する。かかる成熟ポリペプチ
ドは、所望プロセスに使用する際にそれ以上何の予備処
理も必要としない。本発明は、特に、図８〜図１０に示
すＤＮＡ配列の一部にコードされた成熟過程型ポリペプ
チドに関する。スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有す
る成熟過程型ポリペプチドにして、均等な３次構造のス
ルフヒドリル活性を有するポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列の一部にコードされているような成熟過程型ポ
リペプチドも、本発明の一部をなす。
現によって得ることのできる、スルフヒドリルオキシダ
ーゼ活性をもつ成熟過程型ポリペプチドに関する。ＵＨ
Ｔ乳からの異臭の除去並びにベイカリイ製品の改良のい
ずれにも効果的なことが知られているので、微生物由来
のスルフヒドリルオキシダーゼ活性をもつポリペプチド
が好ましい。特に、本発明のスルフヒドリルオキシダー
ゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドの起源として
は、アスペルギルス属に属する微生物が好ましい。本発
明は、好ましくは、スルフヒドリルオキシダーゼ活性を
もつ成熟ポリペプチドに関する。かかる成熟ポリペプチ
ドは、所望プロセスに使用する際にそれ以上何の予備処
理も必要としない。本発明は、特に、図８〜図１０に示
すＤＮＡ配列の一部にコードされた成熟過程型ポリペプ
チドに関する。スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有す
る成熟過程型ポリペプチドにして、均等な３次構造のス
ルフヒドリル活性を有するポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列の一部にコードされているような成熟過程型ポ
リペプチドも、本発明の一部をなす。
【００９４】本発明は、前述の細胞を培養し、所望によ
り、得られたスルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する
成熟過程型ポリペプチドを単離することからなる、スル
フヒドリルオキシダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペ
プチドの生産方法にも関する。スルフヒドリルオキシダ
ーゼ活性を有するポリペプチドの発現は、スルフヒドリ
ルオキシダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ材料で
形質転換された発現宿主細胞を、通常の栄養培地中で培
養することによって、達成することができる。
り、得られたスルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する
成熟過程型ポリペプチドを単離することからなる、スル
フヒドリルオキシダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペ
プチドの生産方法にも関する。スルフヒドリルオキシダ
ーゼ活性を有するポリペプチドの発現は、スルフヒドリ
ルオキシダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドを
コードするヌクレオチド配列を含む組換えＤＮＡ材料で
形質転換された発現宿主細胞を、通常の栄養培地中で培
養することによって、達成することができる。
【００９５】培地は炭素源、窒素源、有機窒素源及び無
機栄養源を含む通常の培地である。適当な培地の選択
は、発現宿主の選択に基づくこともあり、しかも／或い
は、組換えＤＮＡ材料の調節のための要件に基づくこと
もある。このような培地は当業者には周知である。必要
に応じて、汚染する可能性のある他の微生物よりも形質
転換発現宿主に有利な成分を培地に加えてもよい。食品
加工処理用に、スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有す
るポリペプチドを生産する場合、かかる追加成分も食品
級でなければならない。
機栄養源を含む通常の培地である。適当な培地の選択
は、発現宿主の選択に基づくこともあり、しかも／或い
は、組換えＤＮＡ材料の調節のための要件に基づくこと
もある。このような培地は当業者には周知である。必要
に応じて、汚染する可能性のある他の微生物よりも形質
転換発現宿主に有利な成分を培地に加えてもよい。食品
加工処理用に、スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有す
るポリペプチドを生産する場合、かかる追加成分も食品
級でなければならない。
【００９６】培養後、細胞は遠心分離又は瀘過によって
培地から除去する。宿主細胞がスルフヒドリルオキシダ
ーゼ活性を有するポリペプチドを培地中に分泌したか、
或いは上記ポリペプチドが細胞質内もしくは細胞周辺腔
内に止まっていたり細胞膜上又は細胞壁中に付着してい
たりして何らかの形で細胞と結合しているかに応じて、
ポリペプチドを得るために細胞をさらに処理してもよ
い。
培地から除去する。宿主細胞がスルフヒドリルオキシダ
ーゼ活性を有するポリペプチドを培地中に分泌したか、
或いは上記ポリペプチドが細胞質内もしくは細胞周辺腔
内に止まっていたり細胞膜上又は細胞壁中に付着してい
たりして何らかの形で細胞と結合しているかに応じて、
ポリペプチドを得るために細胞をさらに処理してもよ
い。
【００９７】ポリペプチドが何らかの形で依然として細
胞に結合しているような後者の場合、ポリペプチドの回
収は、例えば米国特許第４８９４３４０号又は同第４６
３２９０５号に記載のように、細胞を、例えば高圧破
砕、超音波処理、酵素分解又は単なる自己消化によって
破砕した後、所望の物質を単離することによって、達成
される。ポリペプチドは、様々な方法で菌体から分離で
きる。その一つの方法では、プロテアーゼのフィシンで
細胞を破砕して、限外瀘過に付す。次いで、ポリペプチ
ドをメタノールやアセトンなどの有機溶媒で沈澱させ
る。ポリペプチドは、また、菌体からポリペプチドが放
出されるような十分な強度の塩水（２０％（ｗ／ｖ）Ｎ
ａＣｌ）中に微生物を懸濁することによっても分離でき
る。塩水は、塩水中へポリペプチドが放出されるのに十
分な浸透圧を生ずるといわれている。一般に、従来、他
の細胞内酵素を遊離して溶液を作るために使われていた
のと同じ方法を用いることができる。
胞に結合しているような後者の場合、ポリペプチドの回
収は、例えば米国特許第４８９４３４０号又は同第４６
３２９０５号に記載のように、細胞を、例えば高圧破
砕、超音波処理、酵素分解又は単なる自己消化によって
破砕した後、所望の物質を単離することによって、達成
される。ポリペプチドは、様々な方法で菌体から分離で
きる。その一つの方法では、プロテアーゼのフィシンで
細胞を破砕して、限外瀘過に付す。次いで、ポリペプチ
ドをメタノールやアセトンなどの有機溶媒で沈澱させ
る。ポリペプチドは、また、菌体からポリペプチドが放
出されるような十分な強度の塩水（２０％（ｗ／ｖ）Ｎ
ａＣｌ）中に微生物を懸濁することによっても分離でき
る。塩水は、塩水中へポリペプチドが放出されるのに十
分な浸透圧を生ずるといわれている。一般に、従来、他
の細胞内酵素を遊離して溶液を作るために使われていた
のと同じ方法を用いることができる。
【００９８】微生物から単離されたポリペプチドは、一
般に、従来の沈澱法及びクロマトグラフィー法で精製さ
れる。かかる方法として、メタノール、エタノール、ア
セトン及び硫安による沈澱、並びにイオン交換及びヒド
ロキアパタイトクロマトグラフィーなどがある。ポリペ
プチドの精製には、抽出液中の他のタンパク質成分に比
して著しく高い水／アセトン混合液中での溶解溶解性及
び安定性を有するこのポリペプチドの特質を利用した、
アセトン沈澱法とヒドロキアパタイトクロマトグラフィ
ーが特に有効である。
般に、従来の沈澱法及びクロマトグラフィー法で精製さ
れる。かかる方法として、メタノール、エタノール、ア
セトン及び硫安による沈澱、並びにイオン交換及びヒド
ロキアパタイトクロマトグラフィーなどがある。ポリペ
プチドの精製には、抽出液中の他のタンパク質成分に比
して著しく高い水／アセトン混合液中での溶解溶解性及
び安定性を有するこのポリペプチドの特質を利用した、
アセトン沈澱法とヒドロキアパタイトクロマトグラフィ
ーが特に有効である。
【００９９】遊離ＳＨ基を酸化してジスルフィド結合を
形成する必要があって、同時に過酸化水素が発生するよ
うなプロセスに、本明細書に記載の細胞又は本発明の微
生物由来のスルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する成
熟過程型ポリペプチドを使用することも、本発明の一部
をなす。このような使用方法は、生地（特に冷凍生地）
の性質を改良するプロセスに関連していても、乳製品
（ＵＨＴ殺菌処理したもの）やビールのような食品から
異臭を除去するプロセスに関連していてもよい。本発明
のスルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する成熟過程型
ポリペプチド又は本発明の細胞からもしくは本発明の方
法で得られるスルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する
成熟過程型ポリペプチドもしくはかかるポリペプチド産
生細胞を含んでいるようなパン改良剤、生地改良剤、小
麦粉のような組成物も、本発明の一部である。かかる組
成物を使用するベイカリイ製品の製造方法も、本発明の
一部をなす。
形成する必要があって、同時に過酸化水素が発生するよ
うなプロセスに、本明細書に記載の細胞又は本発明の微
生物由来のスルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する成
熟過程型ポリペプチドを使用することも、本発明の一部
をなす。このような使用方法は、生地（特に冷凍生地）
の性質を改良するプロセスに関連していても、乳製品
（ＵＨＴ殺菌処理したもの）やビールのような食品から
異臭を除去するプロセスに関連していてもよい。本発明
のスルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する成熟過程型
ポリペプチド又は本発明の細胞からもしくは本発明の方
法で得られるスルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する
成熟過程型ポリペプチドもしくはかかるポリペプチド産
生細胞を含んでいるようなパン改良剤、生地改良剤、小
麦粉のような組成物も、本発明の一部である。かかる組
成物を使用するベイカリイ製品の製造方法も、本発明の
一部をなす。
【０１００】本明細書に記載のスルフヒドリルオキシダ
ーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチド、又は本明細
書に記載の細胞からもしくは方法で得られるスルフヒド
リルオキシダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチド
は、いずれも、個人用品に使用のための組成物としての
用途も有する。かかる組成物は、タンパク質又はタンパ
ク様構造体の構造を補強するのにも使用することがで
き、異臭や悪臭を除くための組成物に対しても使用でき
る。
ーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチド、又は本明細
書に記載の細胞からもしくは方法で得られるスルフヒド
リルオキシダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチド
は、いずれも、個人用品に使用のための組成物としての
用途も有する。かかる組成物は、タンパク質又はタンパ
ク様構造体の構造を補強するのにも使用することがで
き、異臭や悪臭を除くための組成物に対しても使用でき
る。
【０１０１】本明細書に記載の、スルフヒドリルオキシ
ダーゼ活性をもつポリペプチドの成熟過程型ポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列の一部を含む組換えＤ
ＮＡ材料の一部を、スルフヒドリルオキシダーゼ活性を
もつポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の検
出、単離又は生産のための、プローブ又はプライマーと
して使用することも、本発明の一部をなす。
ダーゼ活性をもつポリペプチドの成熟過程型ポリペプチ
ドをコードするヌクレオチド配列の一部を含む組換えＤ
ＮＡ材料の一部を、スルフヒドリルオキシダーゼ活性を
もつポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の検
出、単離又は生産のための、プローブ又はプライマーと
して使用することも、本発明の一部をなす。
【０１０２】
【実施例】実施例１ アスペルギルス・ニガーのスルフヒドリルオキシダーゼ
遺伝子（ｓｏｘ）のクローニング及び特徴付け １．１ ： アスペルギルス・ニガーＳＯＸのＮ末端
アミノ酸配列（配列番号：３）の確認 １．１．１ ： 市販ＧＯＸ標品からのＳＯＸの単離 Ｆｉｎｎｓｕｇａｒ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社から入
手したアスペルギルス・ニガー由来の市販グルコースオ
キシダーゼ（ＧＯＸ）標品（製品番号Ｐ１１０，グルコ
ースオキシダーゼＬＣ５０００）から、スルフヒドリル
オキシダーゼ（ＳＯＸ）タンパク質を精製した。
遺伝子（ｓｏｘ）のクローニング及び特徴付け １．１ ： アスペルギルス・ニガーＳＯＸのＮ末端
アミノ酸配列（配列番号：３）の確認 １．１．１ ： 市販ＧＯＸ標品からのＳＯＸの単離 Ｆｉｎｎｓｕｇａｒ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔｓ社から入
手したアスペルギルス・ニガー由来の市販グルコースオ
キシダーゼ（ＧＯＸ）標品（製品番号Ｐ１１０，グルコ
ースオキシダーゼＬＣ５０００）から、スルフヒドリル
オキシダーゼ（ＳＯＸ）タンパク質を精製した。
【０１０３】分別精製は、基本的にはＤｅ ｌａ Ｍｏ
ｔｔｅ他の報文（１９８７）記載の方法に従って、アセ
トンによる選択沈殿、各種のイオン交換クロマトグラフ
ィー、疎水性クロマトグラフィー及びゲル濾過などのタ
ンパク質精製の常法を用いて行った。オキシダーゼ活性
の濃縮された画分は、上記報文（Ｄｅ ｌａ Ｍｏｔｔ
ｅ他（１９８７））記載のアッセイ法によって同定し
た。ＳＯＸタンパク質の濃縮された画分を常法によりさ
らに電気泳動的均一にまで（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単一
のバンドが得られるまで）精製した。精製した酵素の酵
素活性、至適ｐＨその他の性質は、アスペルギルス・ニ
ガーのＳＯＸについて報告されているもの（上記Ｄｅ
ｌａ Ｍｏｔｔｅ他の報文）と一致した。１．１．２ ： アスペルギルス・ニガーＳＯＸのＮ末端
アミノ酸配列（配列番号：３）の決定 精製ＳＯＸ画分を用いて、アスペルギルス・ニガーのＳ
ＯＸのＮ末端アミノ酸配列（配列番号：３）を、エドマ
ン分解法、並びにＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ社製の１２０Ａ型オンラインＰＴＨ分析装置接続４７
５型自動配列決定装置で決定した（図１の配列番号：
３）。１．１．３ ： アスペルギルス・ニガーＳＯＸの内部領
域のアミノ酸配列の決定 精製ＳＯＸ画分を用いて、ＳＯＸをＣＮＢｒ分解してポ
リペプチド断片を得た。ＣＮＢｒ分解は、Ｇｒｏｓｓ及
びＷｉｔｋｏｐの方法（Ｗｏｒｋ及びＢｕｒｄｏｎ編の
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに掲載されたＡｌｌｅｎの「Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ」に記載）に従った。各断片を、Ｂａｋ
ｅｒｂｏｎｄ社製のＣ４大孔径カラム（５ミクロン，
４．６×２５０ｍｍ）を用いたＨＰＬＣで分離した（図
２）。図２のピーク９に対応する画分をＣＮＢｒ断片＃
９と名付け、エドマン法によるアミノ酸配列分析に付し
た（図３、配列番号：４）。１．２ ： ＳＯＸを分泌する糸状菌の菌株の同定 異なる種に属する各種の糸状菌株を標準化した条件下で
培養して、かかる条件下でのこれらの菌株が天然に産生
するＳＯＸ活性レベルを比較した。培養は、磁気駆動の
８枚羽根を装備したＣｈｅｍｏｆｅｒｍ社製のガラス製
１０リットル培養器中で行った。溶存酸素濃度はＩｎｇ
ｏｌｄ社製酸素プローブで測定し、ｐＨはＩｎｇｏｌｄ
社製ｐＨ電極で測定し、温度はＰＴ１００センサーを用
いて測定した。培養器の稼働容量は８リットルであり、
次の組成の培地を含んでいた。即ち、培地１リットル当
り、スクロース２０ｇ、硝酸ナトリウム１２ｇ、リン酸
水素二カリウム５ｇ、硫酸マグネシウム（７水塩）２
ｇ、酵母エキス０．５ｇ、及び２０ｍｌの微量元素溶液
（Ｖｉｓｎｉａｃ他（１９５７））。ｐＨ、温度、酸素
分圧、及び気体導入口（毎分１．５ｌの空気，毎分１．
５ｌの酸素）並びに撹拌機速度（６００〜１０００ｒｐ
ｍ）を制御するために、Ａｐｐｌｉｋｏｎ社製のＡＤＩ
１０２０型コントロールユニットを使用した。培養中、
ｐＨは１２．５％水酸化アンモニウムの添加によって
５．５に維持し、温度は３０℃に維持し、酸素分圧は撹
拌機速度の手動調節によって３０％以上に保った。培養
器に予備培養液（５％）を接種した。この予備培養液
（各々２００ｍｌの培地の入った円錐形の５００ｍｌバ
ッフル付振盪フラスコ２つ）は、菌類の胞子（１０6 〜
１０7胞子／ｍｌ）を接種して、２５０ｒｐｍの振盪培
養機内で２５℃で一晩培養したものである。本培養は８
０時間もしくはそれ以上行い、その後、基本的には上記
Ｄｅ ｌａ Ｍｏｔｔｅ他（１９８７）の方法に従って
ＳＯＸを単離した。試験した微生物のうち、アスペルギ
ルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）とペニシリウム・リ
ナリクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｎａｌｉｃｕ
ｍ）を除くほとんどの糸状菌株がＳＯＸ活性産生能力を
有していることが判明したが、これから、これらの微生
物がＳＯＸ活性をもつタンパク質をコードする遺伝子を
有していると考えられ、従って、これらの微生物をかか
る遺伝子の単離に使用することができ、さらに、原則的
にＳＯＸ活性をもつタンパク質の過剰生産にも使用する
ことができると考えられる。標準化条件下で産生される
ＳＯＸの絶対量は比較的低く（図４）、増殖休止／減速
期に移行するまで生産されない。ほとんどの場合、ＳＯ
Ｘ活性は主として細胞にみられたが、唯一の例外はアス
ペルギルス・ニガーＮ４００株であった。従って、この
菌株から単離したＤＮＡを、アスペルギルス・ニガーｓ
ｏｘ遺伝子単離用の出発材料とした。 １．３： アスペルギルス・ニガーのｓｏｘ遺伝子
のクローニング 核酸の操作及び分析に用いた技術は、特記しない限り、
基本的にＭａｎｉａｔｉｓ他の方法（１９８２）に従っ
た。１．３．１ ： アスペルギルス・ニガーのｓｏｘ遺伝子
の一部を含有するＤＮＡ断片の単離 アスペルギルス・ニガーＳＯＸのＮ末端について同定し
たアミノ酸配列から推理して、合成ＤＮＡオリゴヌクレ
オチド縮重混合物を得たが、この混合物はアスペルギル
ス・ニガーのｓｏｘ遺伝子のコード鎖とハイブリッド形
成し得るオリゴヌクレオチド群を含んでいる（図１）。
また、アスペルギルス・ニガーＳＯＸのＣＮＢｒ断片＃
９について同定したアミノ酸配列から推理して、合成Ｄ
ＮＡオリゴヌクレオチド縮重混合物を得たが、この混合
物はアスペルギルス・ニガーのｓｏｘ遺伝子の非コード
鎖とハイブリッド形成し得るオリゴヌクレオチド群を含
んでいる（図３、配列番号：５及び配列番号：６）。Ｐ
ＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅反応のプライマーと
して、上記オリゴヌクレオチド混合物を使用した。上記
オリゴヌクレオチド混合物のうちのＮ末端アミノ酸配列
（配列番号：３）から導出したものを１００ｐｍｏｌ
ｅ、並びに上記オリゴヌクレオチド混合物のうちのＣＮ
Ｂｒ断片＃９から導出したものを１００ｐｍｏｌｅ使用
した。ＰＣＲ反応は、各々２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰ、２．５単位のＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ社製）、１．５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．
３）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2 、５０ｍＭのＫＣｌ並び
に０．１ｍｇ／ｍｌゼラチンの存在下（全容積１００μ
ｌ）で、鋳型としてアスペルギルス・ニガーＮ４００株
（ＣＢＳ１２０．４９）又はアスペルギルス・ツビゲン
シス（Ａ．ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）ＣＢＳ１１５．２９
株のいずれかの染色体ＤＮＡ１μｇを用いて行った。こ
れらの染色体ＤＮＡは、Ｄｅ Ｇｒａｆｆ他の方法（１
９８８）に従って単離した。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
社製のＣｅｔｕｓ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｅｒの中
で、２０サイクル（１サイクルは、９５℃で１分；４８
℃で１分；及び７２℃で２分である。ただし、一番最初
は９５℃で４分であり、締括りは７２℃で５分インキュ
ベートする）の温度管理プログラムに従って反応混合物
をインキュベートした。反応生成物のアガロースゲル上
でのゲル電気泳動分析から、鋳型としてアスペルギルス
・ニガーＮ４００株又はアスペルギルス・ツビゲンシス
ＣＢＳ１１５．２９株のいずれの染色体ＤＮＡを用いた
場合にも、プライマーとしてＳＯＸ０４ＷＭ（配列番
号：１０）の混合物及びＳＯＸ０６ＷＭ（配列番号：１
２）の混合物を用いたときに約９５０ｂｐのＤＮＡ断片
が選択的に増幅されていることが判明した。アスペルギ
ルス・ニガーＮ４００株のＤＮＡから得られた９５０ｂ
ｐのＰＣＲ断片の制限酵素消化物を、ＳＯＸ０５ＷＭ
（配列番号：１１）をプローブとするサザンブロット法
で分析したところ、このＰＣＲ断片がアスペルギルス・
ニガーｓｏｘ遺伝子の一部を含んでいて、このＰＣＲ断
片中でＫｐｎＩ及びＳａｌＩ部位のマッピングができる
ことが確認された。１．３．２ ： アスペルギルス・ニガー中のｓｏｘ・ｍ
ＲＮＡのノザン分析 アスペルギルス・ニガーＮ４００株のｃｐｓＡ１，ｇｏ
ｘＣ１７，ｐａｂＡ１派生株であるアスペルギルス・ニ
ガーＮＷ１０１株（Ｗｉｔｔｅｖｅｅｎ他（１９９
０））を標準型の２リットル培養器中で増殖させた。培
地（１／２ＰＭ培地）は、１リットル当り、フルクトー
ス２０ｇ、硝酸ナトリウム０．６ｇ、リン酸二水素カリ
ウム０．２５ｇ、硫酸マグネシウム（７水塩）０．１
ｇ、酵母エキス０．５ｇ、微量元素溶液（Ｖｉｓｎｉａ
ｃ他（１９５７））２０ｍｌ、及びｐ−アミノ安息香酸
１．４ｍｇを含有していた。培養中、ｐＨは５Ｍ水酸化
ナトリウムの添加によって５．５に維持し、温度は３０
℃に保った。酸素分圧は、必要に応じて気体導入口を空
気から酸素へ切替えることによって３０％以上に保っ
た。１．５ｌの培地を含む培養器に、菌類の胞子の予備
培養液（２０％）を接種した。この予備培養液（３００
ｍｌの培地の入った円錐形の１０００ｍｌバッフル付振
盪フラスコ）は、１０8 個の胞子を接種して、２５０ｒ
ｐｍの振盪培養機内で３０℃で６時間培養したものであ
る。本培養は８０時間以上行った。培養後２４時間、３
０時間、４７時間、５５時間、７７時間及び８１時間目
に、菌糸体試料を採取した。培養器に接種して約５０時
間後に増殖は定常期／減速期に達した。基本的に上記Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ他（１９８２）の記載に従い、グアニジ
ウムチオシアネート法を用いて、各試料から全ＲＮＡを
調製した。上記の各時点において、全ＲＮＡの５μｇを
グリオキシル化して、前記９５０ｂｐのＰＣＲ断片をプ
ローブとして用いたノザン法によるｓｏｘ・ｍＲＮＡの
存在についての分析を行った（図５）。各試料につい
て、約１５００塩基の鎖長に相当する位置に、ハイブリ
ッド形成バンドが一本だけ検出された。このバンドの強
度は、培養器への接種後２４時間から５５時間にかけて
徐々に増大し、５５時間目で最大となり、その後は徐々
に薄くなる。これから、ｓｏｘ・ｍＲＮＡは長さが約１
５００塩基で、増殖の後期の菌体中に存在するものと考
えられる。１．３．３ ： アスペルギルス・ニガー及びその他の糸
状菌におけるｓｏｘとその関連遺伝子の数 アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子のＰＣＲ断片をサ
ザンブロット分析のプローブとして用いて、アスペルギ
ルス・ニガーのゲノムに存在するｓｏｘ（又は関連）遺
伝子の数を調べるとともに、その他のアスペルギルス種
における相同性の高い遺伝子の出現頻度を調べた。標準
的な方法及び条件で異種ハイブリッド形成及びブロット
洗浄を行った。アスペルギルス・ニガーのゲノムＤＮＡ
の各種制限酵素消化物のハイブリッド形成パターン（図
６）から、アスペルギルス・ニガーＮ４００（ＣＢＳ１
２０．４９）ゲノムがｓｏｘ遺伝子のコピーをたった１
つしか含んでいないことが判明した。さらに、アスペル
ギルス・ニガー変種アワモリ（ＣＢＳ１１５．２９）、
アスペルギルス・ソヤエ（ＡＴＣＣ２０２３５）、アス
ペルギルス・ツビゲンシス（ＣＢＳ１１５．２９）及び
アスペルギルス・ニジュランスＷＧ０９６（Ｇｌａｓｇ
ｏｗ株ＦＧＳＣ４，Ｂａｒｒａｔｔ他（１９６５））の
ゲノム中に、アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子と高
い相同性を示す遺伝子が少なくとも１つ存在しているこ
とが実証できた。この結果は、アスペルギルス・ニガー
ｓｏｘ遺伝子のヌクレオチド配列が本明細書中に今回開
示された（図８〜図１０）ことから、本実施例に概略を
示した方法を用いて、アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺
伝子と非常に近い類縁性を示す遺伝子を他の糸状菌から
単離することも当業者にとっては自明事項に過ぎなくな
ったことを示している。１．３．４ ： アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子を
含むλクローンの単離 標準的なランダムプライマー標識法で標識したアスペル
ギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子のＰＣＲ断片をプローブと
して、λ−ＥＭＢＬ４中のアスペルギルス・ニガーＮ４
００ゲノムＤＮＡライブラリー（Ｈｒｍｓｅｎ他（１９
９０））をスクリーニングした。平板培養菌として大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＥ３９２株を用いて、常法（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ他（１９８２））に従って約２４×１０3
個のプラークを二重（各プレートについてトランスファ
ー用フィルターを２枚使用）に検査した。分析したプラ
ークに含まれる挿入体の鎖長は、アスペルギルス・ニガ
ーのゲノムサイズのおよそ１２倍であった。ハイブリッ
ド形成は、６×ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳ，５×Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ溶液、１００μｇの一本鎖ニシン***ＤＮＡ中
において、６５℃で行った。フィルターの洗浄は、１×
ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中で６５℃で行った。２枚のフ
ィルターのいずれにおいてもプローブとハイブリッド形
成陽性となった８個のプラークを常法に従って精製し、
４個の陽性プラークのＤＮＡを常法に従って単離した。１．４ ： アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子の
特徴付け １．４．１ ： アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子を
含有する４つの重複λクローンの物理的地図の作製 上記４つの陽性クローンの挿入体について、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄIII 、Ｂｇｌ
II、ＮｓｉＩ及びＮｃｏＩのいずれか１種又はこれらを
組合せたもので消化したものを、オリゴヌクレオチドＳ
ＯＸ０５ＷＭ（配列番号：１１）又は前記ＰＣＲ断片の
いずれかをプローブするサザンブロット法で解析した。
得られたデータを、前記ＰＣＲ断片に含まれる遺伝子部
分内のＳａｌＩ及びＫｐｎＩ部位の位置について既に得
られている情報並びに項目１．３．２で同定したｓｏｘ
・ｍＲＮＡの鎖長と総合的に検討することによって、
２．５ｋｂ・ＥｃｏＲＩ断片並びに６．４ｋｂ・Ｎｓｉ
Ｉ断片にアスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子全体が含
まれていることが判明した（図７）。１．４．２ ： アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子の
配列決定 陽性λクローンから得ることのできたアスペルギルス・
ニガーｓｏｘ遺伝子全体を含む６．４ｋｂ・ＮｓｉＩ断
片をｐＥＭＢＬ１９のＰｓｔＩ部位にサブクローニング
して、ｐＵＲ７５００（図１５）を得た。このプラスミ
ドを含む大腸菌ＪＭ１０９株は、１９９２年４月９日付
けで、オランダ国バーン（Ｂａａｒｎ）のＣｅｎｔｒａ
ａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕ
ｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）に受託番号ＣＢＳ１９６．９２
として寄託されている。陽性λクローンから得ることの
できたアスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子全体を含む
２．５ｋｂ・ＥｃｏＲＩ断片を、Ｍ１３ｍｐ１９（Ｙａ
ｎｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ他（１９８５））のＥｃｏＲ
Ｉ部位にサブクローニングするとともに、ｐＵＣ１９
（Ｙａｎｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ他（１９８５））のＥ
ｃｏＲＩ部位にもサブクローニングしてｐＵＲ７５０１
（図１６）を得た。プラスミドｐＵＲ７５０１を含む大
腸菌ＪＭ１０９株は、１９９２年４月９日付けで、ＣＢ
Ｓに受託番号ＣＢＳ１９７．９２として寄託されてい
る。サンガー法に従って、２．５ｋｂ・ＥｃｏＲＩ断片
の配列を専用の合成プライマーを用いて両方向から断片
全体について決定した。ｓｏｘ構造遺伝子の上流領域の
配列についての付加的情報は、ｐＵＲ７５００のＮｓｉ
Ｉ断片の部分的配列決定から得た（図８〜図１０、配列
番号：１）。１．４．３ ： アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子の
読取り枠の同定 アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子の正確なサイズと
イントロンの位置を同定するために、５５時間培養した
アスペルギルス・ニガーＮＷ１０１株の全ＲＮＡ単離物
（項目１．３．２参照）を用いてｃＤＮＡを作製した。
この際、Ｚａｐ−ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ社製）及びｍＲＮＡのポリＡテール部位から始ま
る一本鎖ｃＤＮＡ合成用の専用合成プライマーＳＯＸＴ
ＴＴ（配列番号：７）：5'-GAGGATCCGTCGACTACTGACTTTT
TTTTTTTTTTTTTT-3' を用いた。得られた一本鎖ｃＤＮＡ
標品を鋳型として用いて、項目１．３．１と同様のＰＣ
Ｒ法でｓｏｘ遺伝子の特定部分をインビボ（ｉｎ ｖｉ
ｖｏ）増幅した。プライマーとしてＳＯＸ０４ＷＭ（配
列番号：１０）とＳＯＸ０６ＷＭ（配列番号：１２）の
組合せを使って約８７０ｂｐの断片を選択的に増幅し、
また、ＳＯＸ２４ＷＭ（配列番号：９，5'-CCATTGCATCC
ATTGAG-3' ）とＳＯＸＡＡＡ（配列番号：８，5'-GAGGA
TCCGTCGACTACTGA-3'；上記ＳＯＸＴＴＴの一部と相補
的）の組合せをプライマーとして用いて約６３０ｂｐの
断片を選択的に増幅した。部分的に重複するこれら２つ
のｃＤＮＡ断片を総合すると、成熟ＳＯＸをコードする
配列全体がカバーされる。これら２つの断片をゲル電気
泳動で精製して、標準的な二本鎖ＤＮＡ配列決定法で全
配列を決定した。これらの配列をアスペルギルス・ニガ
ーのゲノムＤＮＡの配列（項目１．４．２）と比較する
ことによって、２つのイントロンの位置とサイズが明確
に同定された（図８〜図１０，配列番号：１）。実施例２ アスペルギルス・ニガー中におけるアスペルギルス・ニ
ガーｓｏｘ遺伝子の 調節因子制御下でのアスペルギルス
・ニガーＳＯＸの過剰生産 ２．１ ： 過剰産生株の構築 アスペルギルス・ニガーＳＯＸを過剰生産する能力を有
するアスペルギルス・ニガー株を作り出すために、適当
な受容株中に複数のアスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝
子コピーをアスペルギルス・ニガーｐｙｒＡ遺伝子との
同時形質転換によって導入した。２．１．１ ： 好適宿主株の構築 形質転換実験における受容株として、アスペルギルス・
ニガーＮＷ１２８株（ｃｓｐＡ１，ｇｏｘＣ１７，ｐｙ
ｒＡ６，ｎｉｃＡ１）を使用した。ｃｓｐＡ１変異（分
生子柄の短い）は平板上でのこの菌株の取扱いに都合が
よく、上記ｇｏｘ変異（グルコースオキシダーゼ産生能
を欠く）は培養実験におけるＳＯＸ産生量の評価並びに
純粋なＳＯＸ標品を得るのに都合がよく、ｐｙｒＡ６変
異（ウリジン要求性）は複数のｓｏｘ遺伝子コピーの導
入に利用でき、ｎｉｃＡ１変異（ニコチンアミド要求
性）はこの菌株の菌株の生物学的取扱いに都合がよい。
アスペルギルス・ニガーＮＷ１２８株を構築するため、
まず最初に、Ｂｏｓ他（１９８８）の方法に従って、ア
スペルギルス・ニガーＮＷ１０１株（ｃｐｓＡ１，ｇｏ
ｘＣ１７，ｐａｂＡ１；Ｗｉｔｔｅｖｅｅｎ他（１９９
０）の報告通り野生型アスペルギルス・ニガーＮ４００
株から得られる）を、アスペルギルス・ニガーＮ６１３
株（ｆｗｎＡ１，ｈｉｓＤ４，ｌｙｓＡ７，ｂｉｏＡ
１，ｌｅｕＡ１，ｎｉｃＡ１；Ｂｏｓ他（１９８８）の
報告通りアスペルギルス・ニガーＮ５９９株とアスペル
ギルス・ニガーＮ６００株との交雑によって得られる）
と交雑して、得られた雑種の中から、アスペルギルス・
ニガーＮ１３０（ｆｗｎＡ１，ｃｓｐＡ１，ｇｏｘＣ１
７，ｎｉｃＡ１）を得た。このＮ１３０株をアスペルギ
ルスＮ５９３株（ｃｓｐＡ１，ｐｙｒＡ６；Ｇｏｏｓｅ
ｎ他（１９８７））と基本的にはＢｏｓ他（１９８８）
の方法に従って交雑した。ただし、単離したヘテロ接合
型二倍体コロニーから、少量の胞子を２００ｍｇ／ｌヒ
スチジン添加ＣＭ−ベノミル平板培地上に直接画線培養
した点で異なる。得られた菌株の中から、アスペルギル
ス・ニガーＮＷ１２８株（ｃｓｐＡ１，ｇｏｘＣ１７，
ｐｙｒＡ６，ｎｉｃＡ１）を得た。２．１．２ ： 同時形質転換 常法（Ｇｏｏｓｅｎ他（１９８７））により、アスペル
ギルス・ニガーＮ１２８株を各種比率の２種類のＤＮＡ
断片混合物と共に同時形質転換した。使用した２種類の
ＤＮＡ断片は、アスペルギルス・ニガーｐｙｒＡ遺伝子
全体と機能的プロモーター（Ｇｏｏｓｅｎ他（１９８
７））とを含有するアスペルギルス・ニガーＮ４００の
３．８ｋｂ・ＸｂａＩ断片と、ｓｏｘ遺伝子とそのフラ
ンキング配列とを含有するアスペルギルス・ニガーＮ４
００の２．５ｋｂ・ＥｃｏＲＩ断片（実施例１の項目
１．４、図８〜図１０参照）であった。できるだけ多く
のｓｏｘ遺伝子コピーを含むｐｙｒ形質転換株が得られ
るように、２種類の断片のモル比を変えた（ｐｙｒＡ：
ｓｏｘ比は１：１から１：２０まで変化させた）。２．１．３ ： 多コピー形質転換株の同定 形質転換株（ウリジンの非存在下での増殖能力に基づい
て判断）をバッフル付振盪フラスコ中の１００ｍｌ強化
培地中で増殖させ、常法によりＤＮＡを単離した。制限
酵素ＨｉｎｄIII 消化物の分析を、アスペルギルス・ニ
ガーｓｏｘ遺伝子を含有する２．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断
片（実施例１の項目１．４、図８〜図１０参照）をプロ
ーブとして用い、アスペルギルス・ニガーＮ４００株の
ＤＮＡ単離物を対照として用いて、サザンブロット法で
行った（図１１）。６個のｐｙｒＡ陽性形質転換株につ
いて詳細に分析したところ、４株については、アスペル
ギルス・ニガーＮ４００対照株と比較してプローブとハ
イブリッド形成するバンドが増えていることにみられる
ように、アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子のコピー
がさらに１又はそれ以上追加して組込まれていることが
判明した。レーンａ（ＮＷ１２８．４１６＃４）の内在
性ｓｏｘ遺伝子に対応するハイブリッド形成シグナルの
強度と、レーンｂ（ＮＷ１２８．４１６＃４）の追加導
入されたｓｏｘ遺伝子コピーに対応するハイブリッド形
成シグナルの強度との比較から、形質転換株アスペルギ
ルス・ニガーＮＷ１２８．４１６＃４においては５〜１
０個のコピーが導入されているものと考えられる。２．２ ： 培養によるＳＯＸの過剰生産 多コピー形質転換株であるアスペルギルス・ニガーＮＷ
１２８．４１６＃４から常法（Ｐｏｎｔｅｃｏｒｖｏ他
（１９５３））に従って胞子を単離した。これらの胞子
の培養を、アスペルギルス・ニガーＮ１０１の培養と平
行して行った。培養は１．５ｌの培地の入った標準的な
２リットル培養器中で行った。１リットル当りの培地の
組成は、フルクトース４０ｇ、硝酸ナトリウム０．６
ｇ、リン酸二水素カリウム０．２５ｇ、硫酸マグネシウ
ム（７水塩）０．１ｇ、酵母エキス０．５ｇ、及び微量
元素溶液（Ｖｉｓｎｉａｃ他（１９５７））２０ｍｌで
あった。ただし、アスペルギルス・ニガーＮ１２８株か
ら得た形質転換株については１ｍｇ／ｌのニコチンアミ
ドを添加し、他方アスペルギルス・ニガーＮＷ１０１株
については１．４ｍｇ／ｌのｐ−アミノ安息香酸を添加
した。培養中のｐＨは５Ｍ水酸化ナトリウムの添加によ
って５．５に維持し、温度は３０℃に維持した。酸素分
圧は、必要に応じて気体導入口を空気から酸素へ切替え
ることによって３０％以上に保った。培養器に、菌類の
胞子の予備培養液（２０％）を接種した。この予備培養
液（各々１５０ｍｌの培地の入った円錐形の３００ｍｌ
バッフル付振盪フラスコ）は、菌類の胞子（３×１０5
／ｍｌ）を接種して、２５０ｒｐｍの振盪培養機内で３
０℃で６時間培養したものである。本培養は５０時間以
上行った。培養して５０時間後に、ＳＯＸの産生量を測
定した。アスペルギルス・ニガー本来のｓｏｘ遺伝子１
個を含む菌株であるＮＷ１０１についてのＳＯＸ産生量
が３４Ｕ／ｌであったのに対して、アスペルギルス・ニ
ガーｓｏｘ遺伝子の追加コピーを含む菌株であるＮＷ１
２８．４１６＃４では、１５０Ｕ／ｌが産生された。こ
のように、アスペルギルス・ニガーのゲノム中にアスペ
ルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子の追加コピーを導入する
ことによって、アスペルギルス・ニガーＳＯＸを過剰生
産することができる。実施例３ アスペルギルス・ニガー中におけるアスペルギルス・ニ
ガーｓｏｘ遺伝子の調節因子とは異なる調節因子制御下
でのアスペルギルス・ニガーＳＯＸの過剰生産 アスペルギルス・ニガー中でのＳＯＸの産生の調節は、
増殖の比較的後期になってやっとある程度のＳＯＸ活性
が検出できるというものである。ＳＯＸ産生レベルをさ
らに増大させるために、別の調節シグナルを用いること
もできる。その一つの具体例として、ｓｏｘ遺伝子のコ
ード領域を上流調節領域（プロモーターなどを含む）か
ら分離して、ＡＴＧ翻訳開始シグナルでの融合により、
アスペルギルス・ニガー変種アワモリＣＢＳ１１５．５
２株のエンドキシラナーゼII遺伝子（ｅｘｌＡ）由来の
プロモーターの制御下に置いた。アスペルギルス属の菌
株から得られるその他のプロモーターを使用することも
でき、アスペルギルス・ニガーＣＢＳ１２０．４９株の
グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）遺伝子由来のプロモータ
ー並びにアスペルギルス・ニジュランス由来のグルタル
アルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄＡ）
遺伝子のプロモーター（ｇｐｄＡプロモーター）を用い
る構築法についてもその概略を示す。３．１ ： ｅｘｌＡプロモーター ｐＡＷ１４Ｂ（図１２）の３．０ｋｂ・ＫｐｎＩ断片
（ｖａｎ Ｇｏｒｃｏｍ他（１９９１））をｐＴＺ１９
ＲのＫｐｎＩ部位に挿入して、ｐＵＲ２９３０を得た
（図１３）。ｐＵＲ２９３０の１．９ｋｂ・ＨｉｎｄII
I −ＸｈｏＩ断片及び２００ｂｐＸｈｏＩ−ＢｓｐＨＩ
断片を、ｐＵＲ７５０１の４．８ｋｂ・ＮｃｏＩ−Ｈｉ
ｎｄIII 断片と連結して、ｐＵＲ７５０２を得た（図１
４）。このプラスミドは、ＢｓｐＨＩ部位とＮｃｏＩ部
位との融合によるＡＴＧ翻訳開始シグナルで融合したア
スペルギルス・ニガー変種アワモリｅｘｌＡプロモータ
ーとアスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子を含んでいる
（図１４）。このプラスミド及びその適当な断片は、実
施例２の項目２．１．２と同様の方法によって、アスペ
ルギルス・ニガーｐｙｒＡ遺伝子の３．８ｋｂのＸｂａ
Ｉ断片と共に、アスペルギルス・ニガーＮＷ１２８株の
同時形質転換に使用することができる。表現型ＰＹＲ+
の形質転換株を、実施例２の項目２．１．３と同様の方
法で、複数のｓｏｘ遺伝子コピーの存在についてスクリ
ーニングすればよいが、これは、ｓｏｘ遺伝子の内在性
コピーと新たに導入されたｅｘｌＡプロモーターの後に
あるコピーについて、適当な制限酵素で消化したときに
それぞれのコピーから生ずる断片の鎖長の違いによって
簡単になる。別法として、アスペルギルス・ニジュラン
スのａｍｄＳ遺伝子をｐＵＲ７５０２に挿入して、形質
転換実験における多コピー型ｓｏｘ遺伝子含有形質転換
株の選択に用いることもできる。アスペルギルス・ニガ
ー変種アワモリ由来のプロモーターの後に導入されたア
スペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子コピーを複数含む形
質転換株は、ｅｘｌＡプロモーターからの転写レベルを
高めるような培地中で増殖させることができる。例え
ば、宿主株としてアスペルギルス・ニガーＮＷ１２８株
を用いるときには、国際公開ＷＯ９１／１９７８２号に
記載されているような小麦フスマ又はキシラン添加培地
を用いて、これらの培地に１ｍｇ／ｌのニコチンアミド
を添加すればよい。
ｔｔｅ他の報文（１９８７）記載の方法に従って、アセ
トンによる選択沈殿、各種のイオン交換クロマトグラフ
ィー、疎水性クロマトグラフィー及びゲル濾過などのタ
ンパク質精製の常法を用いて行った。オキシダーゼ活性
の濃縮された画分は、上記報文（Ｄｅ ｌａ Ｍｏｔｔ
ｅ他（１９８７））記載のアッセイ法によって同定し
た。ＳＯＸタンパク質の濃縮された画分を常法によりさ
らに電気泳動的均一にまで（ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上で単一
のバンドが得られるまで）精製した。精製した酵素の酵
素活性、至適ｐＨその他の性質は、アスペルギルス・ニ
ガーのＳＯＸについて報告されているもの（上記Ｄｅ
ｌａ Ｍｏｔｔｅ他の報文）と一致した。１．１．２ ： アスペルギルス・ニガーＳＯＸのＮ末端
アミノ酸配列（配列番号：３）の決定 精製ＳＯＸ画分を用いて、アスペルギルス・ニガーのＳ
ＯＸのＮ末端アミノ酸配列（配列番号：３）を、エドマ
ン分解法、並びにＡｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍ
ｓ社製の１２０Ａ型オンラインＰＴＨ分析装置接続４７
５型自動配列決定装置で決定した（図１の配列番号：
３）。１．１．３ ： アスペルギルス・ニガーＳＯＸの内部領
域のアミノ酸配列の決定 精製ＳＯＸ画分を用いて、ＳＯＸをＣＮＢｒ分解してポ
リペプチド断片を得た。ＣＮＢｒ分解は、Ｇｒｏｓｓ及
びＷｉｔｋｏｐの方法（Ｗｏｒｋ及びＢｕｒｄｏｎ編の
Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ｉｎ
Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ａｎｄ Ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ Ｂｉｏｌｏｇｙに掲載されたＡｌｌｅｎの「Ｓｅｑ
ｕｅｎｃｉｎｇ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ａｎｄ Ｐ
ｅｐｔｉｄｅｓ」に記載）に従った。各断片を、Ｂａｋ
ｅｒｂｏｎｄ社製のＣ４大孔径カラム（５ミクロン，
４．６×２５０ｍｍ）を用いたＨＰＬＣで分離した（図
２）。図２のピーク９に対応する画分をＣＮＢｒ断片＃
９と名付け、エドマン法によるアミノ酸配列分析に付し
た（図３、配列番号：４）。１．２ ： ＳＯＸを分泌する糸状菌の菌株の同定 異なる種に属する各種の糸状菌株を標準化した条件下で
培養して、かかる条件下でのこれらの菌株が天然に産生
するＳＯＸ活性レベルを比較した。培養は、磁気駆動の
８枚羽根を装備したＣｈｅｍｏｆｅｒｍ社製のガラス製
１０リットル培養器中で行った。溶存酸素濃度はＩｎｇ
ｏｌｄ社製酸素プローブで測定し、ｐＨはＩｎｇｏｌｄ
社製ｐＨ電極で測定し、温度はＰＴ１００センサーを用
いて測定した。培養器の稼働容量は８リットルであり、
次の組成の培地を含んでいた。即ち、培地１リットル当
り、スクロース２０ｇ、硝酸ナトリウム１２ｇ、リン酸
水素二カリウム５ｇ、硫酸マグネシウム（７水塩）２
ｇ、酵母エキス０．５ｇ、及び２０ｍｌの微量元素溶液
（Ｖｉｓｎｉａｃ他（１９５７））。ｐＨ、温度、酸素
分圧、及び気体導入口（毎分１．５ｌの空気，毎分１．
５ｌの酸素）並びに撹拌機速度（６００〜１０００ｒｐ
ｍ）を制御するために、Ａｐｐｌｉｋｏｎ社製のＡＤＩ
１０２０型コントロールユニットを使用した。培養中、
ｐＨは１２．５％水酸化アンモニウムの添加によって
５．５に維持し、温度は３０℃に維持し、酸素分圧は撹
拌機速度の手動調節によって３０％以上に保った。培養
器に予備培養液（５％）を接種した。この予備培養液
（各々２００ｍｌの培地の入った円錐形の５００ｍｌバ
ッフル付振盪フラスコ２つ）は、菌類の胞子（１０6 〜
１０7胞子／ｍｌ）を接種して、２５０ｒｐｍの振盪培
養機内で２５℃で一晩培養したものである。本培養は８
０時間もしくはそれ以上行い、その後、基本的には上記
Ｄｅ ｌａ Ｍｏｔｔｅ他（１９８７）の方法に従って
ＳＯＸを単離した。試験した微生物のうち、アスペルギ
ルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）とペニシリウム・リ
ナリクム（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ ｌｉｎａｌｉｃｕ
ｍ）を除くほとんどの糸状菌株がＳＯＸ活性産生能力を
有していることが判明したが、これから、これらの微生
物がＳＯＸ活性をもつタンパク質をコードする遺伝子を
有していると考えられ、従って、これらの微生物をかか
る遺伝子の単離に使用することができ、さらに、原則的
にＳＯＸ活性をもつタンパク質の過剰生産にも使用する
ことができると考えられる。標準化条件下で産生される
ＳＯＸの絶対量は比較的低く（図４）、増殖休止／減速
期に移行するまで生産されない。ほとんどの場合、ＳＯ
Ｘ活性は主として細胞にみられたが、唯一の例外はアス
ペルギルス・ニガーＮ４００株であった。従って、この
菌株から単離したＤＮＡを、アスペルギルス・ニガーｓ
ｏｘ遺伝子単離用の出発材料とした。 １．３： アスペルギルス・ニガーのｓｏｘ遺伝子
のクローニング 核酸の操作及び分析に用いた技術は、特記しない限り、
基本的にＭａｎｉａｔｉｓ他の方法（１９８２）に従っ
た。１．３．１ ： アスペルギルス・ニガーのｓｏｘ遺伝子
の一部を含有するＤＮＡ断片の単離 アスペルギルス・ニガーＳＯＸのＮ末端について同定し
たアミノ酸配列から推理して、合成ＤＮＡオリゴヌクレ
オチド縮重混合物を得たが、この混合物はアスペルギル
ス・ニガーのｓｏｘ遺伝子のコード鎖とハイブリッド形
成し得るオリゴヌクレオチド群を含んでいる（図１）。
また、アスペルギルス・ニガーＳＯＸのＣＮＢｒ断片＃
９について同定したアミノ酸配列から推理して、合成Ｄ
ＮＡオリゴヌクレオチド縮重混合物を得たが、この混合
物はアスペルギルス・ニガーのｓｏｘ遺伝子の非コード
鎖とハイブリッド形成し得るオリゴヌクレオチド群を含
んでいる（図３、配列番号：５及び配列番号：６）。Ｐ
ＣＲ（ポリメラーゼ連鎖反応）増幅反応のプライマーと
して、上記オリゴヌクレオチド混合物を使用した。上記
オリゴヌクレオチド混合物のうちのＮ末端アミノ酸配列
（配列番号：３）から導出したものを１００ｐｍｏｌ
ｅ、並びに上記オリゴヌクレオチド混合物のうちのＣＮ
Ｂｒ断片＃９から導出したものを１００ｐｍｏｌｅ使用
した。ＰＣＲ反応は、各々２００μＭのｄＡＴＰ、ｄＣ
ＴＰ、ｄＴＴＰ及びｄＧＴＰ、２．５単位のＴａｑＤＮ
Ａポリメラーゼ（Ｂｏｅｈｒｉｎｇｅｒ Ｍａｎｎｈｅ
ｉｍ社製）、１．５ｍＭのＴｒｉｓ／ＨＣｌ（ｐＨ８．
３）、１．５ｍＭのＭｇＣｌ2 、５０ｍＭのＫＣｌ並び
に０．１ｍｇ／ｍｌゼラチンの存在下（全容積１００μ
ｌ）で、鋳型としてアスペルギルス・ニガーＮ４００株
（ＣＢＳ１２０．４９）又はアスペルギルス・ツビゲン
シス（Ａ．ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）ＣＢＳ１１５．２９
株のいずれかの染色体ＤＮＡ１μｇを用いて行った。こ
れらの染色体ＤＮＡは、Ｄｅ Ｇｒａｆｆ他の方法（１
９８８）に従って単離した。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ
社製のＣｅｔｕｓ Ｔｈｅｒｍａｌ Ｃｙｃｅｒの中
で、２０サイクル（１サイクルは、９５℃で１分；４８
℃で１分；及び７２℃で２分である。ただし、一番最初
は９５℃で４分であり、締括りは７２℃で５分インキュ
ベートする）の温度管理プログラムに従って反応混合物
をインキュベートした。反応生成物のアガロースゲル上
でのゲル電気泳動分析から、鋳型としてアスペルギルス
・ニガーＮ４００株又はアスペルギルス・ツビゲンシス
ＣＢＳ１１５．２９株のいずれの染色体ＤＮＡを用いた
場合にも、プライマーとしてＳＯＸ０４ＷＭ（配列番
号：１０）の混合物及びＳＯＸ０６ＷＭ（配列番号：１
２）の混合物を用いたときに約９５０ｂｐのＤＮＡ断片
が選択的に増幅されていることが判明した。アスペルギ
ルス・ニガーＮ４００株のＤＮＡから得られた９５０ｂ
ｐのＰＣＲ断片の制限酵素消化物を、ＳＯＸ０５ＷＭ
（配列番号：１１）をプローブとするサザンブロット法
で分析したところ、このＰＣＲ断片がアスペルギルス・
ニガーｓｏｘ遺伝子の一部を含んでいて、このＰＣＲ断
片中でＫｐｎＩ及びＳａｌＩ部位のマッピングができる
ことが確認された。１．３．２ ： アスペルギルス・ニガー中のｓｏｘ・ｍ
ＲＮＡのノザン分析 アスペルギルス・ニガーＮ４００株のｃｐｓＡ１，ｇｏ
ｘＣ１７，ｐａｂＡ１派生株であるアスペルギルス・ニ
ガーＮＷ１０１株（Ｗｉｔｔｅｖｅｅｎ他（１９９
０））を標準型の２リットル培養器中で増殖させた。培
地（１／２ＰＭ培地）は、１リットル当り、フルクトー
ス２０ｇ、硝酸ナトリウム０．６ｇ、リン酸二水素カリ
ウム０．２５ｇ、硫酸マグネシウム（７水塩）０．１
ｇ、酵母エキス０．５ｇ、微量元素溶液（Ｖｉｓｎｉａ
ｃ他（１９５７））２０ｍｌ、及びｐ−アミノ安息香酸
１．４ｍｇを含有していた。培養中、ｐＨは５Ｍ水酸化
ナトリウムの添加によって５．５に維持し、温度は３０
℃に保った。酸素分圧は、必要に応じて気体導入口を空
気から酸素へ切替えることによって３０％以上に保っ
た。１．５ｌの培地を含む培養器に、菌類の胞子の予備
培養液（２０％）を接種した。この予備培養液（３００
ｍｌの培地の入った円錐形の１０００ｍｌバッフル付振
盪フラスコ）は、１０8 個の胞子を接種して、２５０ｒ
ｐｍの振盪培養機内で３０℃で６時間培養したものであ
る。本培養は８０時間以上行った。培養後２４時間、３
０時間、４７時間、５５時間、７７時間及び８１時間目
に、菌糸体試料を採取した。培養器に接種して約５０時
間後に増殖は定常期／減速期に達した。基本的に上記Ｍ
ａｎｉａｔｉｓ他（１９８２）の記載に従い、グアニジ
ウムチオシアネート法を用いて、各試料から全ＲＮＡを
調製した。上記の各時点において、全ＲＮＡの５μｇを
グリオキシル化して、前記９５０ｂｐのＰＣＲ断片をプ
ローブとして用いたノザン法によるｓｏｘ・ｍＲＮＡの
存在についての分析を行った（図５）。各試料につい
て、約１５００塩基の鎖長に相当する位置に、ハイブリ
ッド形成バンドが一本だけ検出された。このバンドの強
度は、培養器への接種後２４時間から５５時間にかけて
徐々に増大し、５５時間目で最大となり、その後は徐々
に薄くなる。これから、ｓｏｘ・ｍＲＮＡは長さが約１
５００塩基で、増殖の後期の菌体中に存在するものと考
えられる。１．３．３ ： アスペルギルス・ニガー及びその他の糸
状菌におけるｓｏｘとその関連遺伝子の数 アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子のＰＣＲ断片をサ
ザンブロット分析のプローブとして用いて、アスペルギ
ルス・ニガーのゲノムに存在するｓｏｘ（又は関連）遺
伝子の数を調べるとともに、その他のアスペルギルス種
における相同性の高い遺伝子の出現頻度を調べた。標準
的な方法及び条件で異種ハイブリッド形成及びブロット
洗浄を行った。アスペルギルス・ニガーのゲノムＤＮＡ
の各種制限酵素消化物のハイブリッド形成パターン（図
６）から、アスペルギルス・ニガーＮ４００（ＣＢＳ１
２０．４９）ゲノムがｓｏｘ遺伝子のコピーをたった１
つしか含んでいないことが判明した。さらに、アスペル
ギルス・ニガー変種アワモリ（ＣＢＳ１１５．２９）、
アスペルギルス・ソヤエ（ＡＴＣＣ２０２３５）、アス
ペルギルス・ツビゲンシス（ＣＢＳ１１５．２９）及び
アスペルギルス・ニジュランスＷＧ０９６（Ｇｌａｓｇ
ｏｗ株ＦＧＳＣ４，Ｂａｒｒａｔｔ他（１９６５））の
ゲノム中に、アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子と高
い相同性を示す遺伝子が少なくとも１つ存在しているこ
とが実証できた。この結果は、アスペルギルス・ニガー
ｓｏｘ遺伝子のヌクレオチド配列が本明細書中に今回開
示された（図８〜図１０）ことから、本実施例に概略を
示した方法を用いて、アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺
伝子と非常に近い類縁性を示す遺伝子を他の糸状菌から
単離することも当業者にとっては自明事項に過ぎなくな
ったことを示している。１．３．４ ： アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子を
含むλクローンの単離 標準的なランダムプライマー標識法で標識したアスペル
ギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子のＰＣＲ断片をプローブと
して、λ−ＥＭＢＬ４中のアスペルギルス・ニガーＮ４
００ゲノムＤＮＡライブラリー（Ｈｒｍｓｅｎ他（１９
９０））をスクリーニングした。平板培養菌として大腸
菌（Ｅ．ｃｏｌｉ）ＬＥ３９２株を用いて、常法（Ｍａ
ｎｉａｔｉｓ他（１９８２））に従って約２４×１０3
個のプラークを二重（各プレートについてトランスファ
ー用フィルターを２枚使用）に検査した。分析したプラ
ークに含まれる挿入体の鎖長は、アスペルギルス・ニガ
ーのゲノムサイズのおよそ１２倍であった。ハイブリッ
ド形成は、６×ＳＳＣ，０．５％ＳＤＳ，５×Ｄｅｎｈ
ａｒｄｔ溶液、１００μｇの一本鎖ニシン***ＤＮＡ中
において、６５℃で行った。フィルターの洗浄は、１×
ＳＳＣ，０．１％ＳＤＳ中で６５℃で行った。２枚のフ
ィルターのいずれにおいてもプローブとハイブリッド形
成陽性となった８個のプラークを常法に従って精製し、
４個の陽性プラークのＤＮＡを常法に従って単離した。１．４ ： アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子の
特徴付け １．４．１ ： アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子を
含有する４つの重複λクローンの物理的地図の作製 上記４つの陽性クローンの挿入体について、制限酵素Ｅ
ｃｏＲＩ、ＳａｌＩ、ＫｐｎＩ、ＨｉｎｄIII 、Ｂｇｌ
II、ＮｓｉＩ及びＮｃｏＩのいずれか１種又はこれらを
組合せたもので消化したものを、オリゴヌクレオチドＳ
ＯＸ０５ＷＭ（配列番号：１１）又は前記ＰＣＲ断片の
いずれかをプローブするサザンブロット法で解析した。
得られたデータを、前記ＰＣＲ断片に含まれる遺伝子部
分内のＳａｌＩ及びＫｐｎＩ部位の位置について既に得
られている情報並びに項目１．３．２で同定したｓｏｘ
・ｍＲＮＡの鎖長と総合的に検討することによって、
２．５ｋｂ・ＥｃｏＲＩ断片並びに６．４ｋｂ・Ｎｓｉ
Ｉ断片にアスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子全体が含
まれていることが判明した（図７）。１．４．２ ： アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子の
配列決定 陽性λクローンから得ることのできたアスペルギルス・
ニガーｓｏｘ遺伝子全体を含む６．４ｋｂ・ＮｓｉＩ断
片をｐＥＭＢＬ１９のＰｓｔＩ部位にサブクローニング
して、ｐＵＲ７５００（図１５）を得た。このプラスミ
ドを含む大腸菌ＪＭ１０９株は、１９９２年４月９日付
けで、オランダ国バーン（Ｂａａｒｎ）のＣｅｎｔｒａ
ａｌ Ｂｕｒｅａｕ ｖｏｏｒ Ｓｃｈｉｍｍｅｌｃｕ
ｌｔｕｒｅｓ（ＣＢＳ）に受託番号ＣＢＳ１９６．９２
として寄託されている。陽性λクローンから得ることの
できたアスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子全体を含む
２．５ｋｂ・ＥｃｏＲＩ断片を、Ｍ１３ｍｐ１９（Ｙａ
ｎｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ他（１９８５））のＥｃｏＲ
Ｉ部位にサブクローニングするとともに、ｐＵＣ１９
（Ｙａｎｎｉｓｈ−Ｐｅｒｒｏｎ他（１９８５））のＥ
ｃｏＲＩ部位にもサブクローニングしてｐＵＲ７５０１
（図１６）を得た。プラスミドｐＵＲ７５０１を含む大
腸菌ＪＭ１０９株は、１９９２年４月９日付けで、ＣＢ
Ｓに受託番号ＣＢＳ１９７．９２として寄託されてい
る。サンガー法に従って、２．５ｋｂ・ＥｃｏＲＩ断片
の配列を専用の合成プライマーを用いて両方向から断片
全体について決定した。ｓｏｘ構造遺伝子の上流領域の
配列についての付加的情報は、ｐＵＲ７５００のＮｓｉ
Ｉ断片の部分的配列決定から得た（図８〜図１０、配列
番号：１）。１．４．３ ： アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子の
読取り枠の同定 アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子の正確なサイズと
イントロンの位置を同定するために、５５時間培養した
アスペルギルス・ニガーＮＷ１０１株の全ＲＮＡ単離物
（項目１．３．２参照）を用いてｃＤＮＡを作製した。
この際、Ｚａｐ−ｃＤＮＡ合成キット（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ社製）及びｍＲＮＡのポリＡテール部位から始ま
る一本鎖ｃＤＮＡ合成用の専用合成プライマーＳＯＸＴ
ＴＴ（配列番号：７）：5'-GAGGATCCGTCGACTACTGACTTTT
TTTTTTTTTTTTTT-3' を用いた。得られた一本鎖ｃＤＮＡ
標品を鋳型として用いて、項目１．３．１と同様のＰＣ
Ｒ法でｓｏｘ遺伝子の特定部分をインビボ（ｉｎ ｖｉ
ｖｏ）増幅した。プライマーとしてＳＯＸ０４ＷＭ（配
列番号：１０）とＳＯＸ０６ＷＭ（配列番号：１２）の
組合せを使って約８７０ｂｐの断片を選択的に増幅し、
また、ＳＯＸ２４ＷＭ（配列番号：９，5'-CCATTGCATCC
ATTGAG-3' ）とＳＯＸＡＡＡ（配列番号：８，5'-GAGGA
TCCGTCGACTACTGA-3'；上記ＳＯＸＴＴＴの一部と相補
的）の組合せをプライマーとして用いて約６３０ｂｐの
断片を選択的に増幅した。部分的に重複するこれら２つ
のｃＤＮＡ断片を総合すると、成熟ＳＯＸをコードする
配列全体がカバーされる。これら２つの断片をゲル電気
泳動で精製して、標準的な二本鎖ＤＮＡ配列決定法で全
配列を決定した。これらの配列をアスペルギルス・ニガ
ーのゲノムＤＮＡの配列（項目１．４．２）と比較する
ことによって、２つのイントロンの位置とサイズが明確
に同定された（図８〜図１０，配列番号：１）。実施例２ アスペルギルス・ニガー中におけるアスペルギルス・ニ
ガーｓｏｘ遺伝子の 調節因子制御下でのアスペルギルス
・ニガーＳＯＸの過剰生産 ２．１ ： 過剰産生株の構築 アスペルギルス・ニガーＳＯＸを過剰生産する能力を有
するアスペルギルス・ニガー株を作り出すために、適当
な受容株中に複数のアスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝
子コピーをアスペルギルス・ニガーｐｙｒＡ遺伝子との
同時形質転換によって導入した。２．１．１ ： 好適宿主株の構築 形質転換実験における受容株として、アスペルギルス・
ニガーＮＷ１２８株（ｃｓｐＡ１，ｇｏｘＣ１７，ｐｙ
ｒＡ６，ｎｉｃＡ１）を使用した。ｃｓｐＡ１変異（分
生子柄の短い）は平板上でのこの菌株の取扱いに都合が
よく、上記ｇｏｘ変異（グルコースオキシダーゼ産生能
を欠く）は培養実験におけるＳＯＸ産生量の評価並びに
純粋なＳＯＸ標品を得るのに都合がよく、ｐｙｒＡ６変
異（ウリジン要求性）は複数のｓｏｘ遺伝子コピーの導
入に利用でき、ｎｉｃＡ１変異（ニコチンアミド要求
性）はこの菌株の菌株の生物学的取扱いに都合がよい。
アスペルギルス・ニガーＮＷ１２８株を構築するため、
まず最初に、Ｂｏｓ他（１９８８）の方法に従って、ア
スペルギルス・ニガーＮＷ１０１株（ｃｐｓＡ１，ｇｏ
ｘＣ１７，ｐａｂＡ１；Ｗｉｔｔｅｖｅｅｎ他（１９９
０）の報告通り野生型アスペルギルス・ニガーＮ４００
株から得られる）を、アスペルギルス・ニガーＮ６１３
株（ｆｗｎＡ１，ｈｉｓＤ４，ｌｙｓＡ７，ｂｉｏＡ
１，ｌｅｕＡ１，ｎｉｃＡ１；Ｂｏｓ他（１９８８）の
報告通りアスペルギルス・ニガーＮ５９９株とアスペル
ギルス・ニガーＮ６００株との交雑によって得られる）
と交雑して、得られた雑種の中から、アスペルギルス・
ニガーＮ１３０（ｆｗｎＡ１，ｃｓｐＡ１，ｇｏｘＣ１
７，ｎｉｃＡ１）を得た。このＮ１３０株をアスペルギ
ルスＮ５９３株（ｃｓｐＡ１，ｐｙｒＡ６；Ｇｏｏｓｅ
ｎ他（１９８７））と基本的にはＢｏｓ他（１９８８）
の方法に従って交雑した。ただし、単離したヘテロ接合
型二倍体コロニーから、少量の胞子を２００ｍｇ／ｌヒ
スチジン添加ＣＭ−ベノミル平板培地上に直接画線培養
した点で異なる。得られた菌株の中から、アスペルギル
ス・ニガーＮＷ１２８株（ｃｓｐＡ１，ｇｏｘＣ１７，
ｐｙｒＡ６，ｎｉｃＡ１）を得た。２．１．２ ： 同時形質転換 常法（Ｇｏｏｓｅｎ他（１９８７））により、アスペル
ギルス・ニガーＮ１２８株を各種比率の２種類のＤＮＡ
断片混合物と共に同時形質転換した。使用した２種類の
ＤＮＡ断片は、アスペルギルス・ニガーｐｙｒＡ遺伝子
全体と機能的プロモーター（Ｇｏｏｓｅｎ他（１９８
７））とを含有するアスペルギルス・ニガーＮ４００の
３．８ｋｂ・ＸｂａＩ断片と、ｓｏｘ遺伝子とそのフラ
ンキング配列とを含有するアスペルギルス・ニガーＮ４
００の２．５ｋｂ・ＥｃｏＲＩ断片（実施例１の項目
１．４、図８〜図１０参照）であった。できるだけ多く
のｓｏｘ遺伝子コピーを含むｐｙｒ形質転換株が得られ
るように、２種類の断片のモル比を変えた（ｐｙｒＡ：
ｓｏｘ比は１：１から１：２０まで変化させた）。２．１．３ ： 多コピー形質転換株の同定 形質転換株（ウリジンの非存在下での増殖能力に基づい
て判断）をバッフル付振盪フラスコ中の１００ｍｌ強化
培地中で増殖させ、常法によりＤＮＡを単離した。制限
酵素ＨｉｎｄIII 消化物の分析を、アスペルギルス・ニ
ガーｓｏｘ遺伝子を含有する２．５ｋｂのＥｃｏＲＩ断
片（実施例１の項目１．４、図８〜図１０参照）をプロ
ーブとして用い、アスペルギルス・ニガーＮ４００株の
ＤＮＡ単離物を対照として用いて、サザンブロット法で
行った（図１１）。６個のｐｙｒＡ陽性形質転換株につ
いて詳細に分析したところ、４株については、アスペル
ギルス・ニガーＮ４００対照株と比較してプローブとハ
イブリッド形成するバンドが増えていることにみられる
ように、アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子のコピー
がさらに１又はそれ以上追加して組込まれていることが
判明した。レーンａ（ＮＷ１２８．４１６＃４）の内在
性ｓｏｘ遺伝子に対応するハイブリッド形成シグナルの
強度と、レーンｂ（ＮＷ１２８．４１６＃４）の追加導
入されたｓｏｘ遺伝子コピーに対応するハイブリッド形
成シグナルの強度との比較から、形質転換株アスペルギ
ルス・ニガーＮＷ１２８．４１６＃４においては５〜１
０個のコピーが導入されているものと考えられる。２．２ ： 培養によるＳＯＸの過剰生産 多コピー形質転換株であるアスペルギルス・ニガーＮＷ
１２８．４１６＃４から常法（Ｐｏｎｔｅｃｏｒｖｏ他
（１９５３））に従って胞子を単離した。これらの胞子
の培養を、アスペルギルス・ニガーＮ１０１の培養と平
行して行った。培養は１．５ｌの培地の入った標準的な
２リットル培養器中で行った。１リットル当りの培地の
組成は、フルクトース４０ｇ、硝酸ナトリウム０．６
ｇ、リン酸二水素カリウム０．２５ｇ、硫酸マグネシウ
ム（７水塩）０．１ｇ、酵母エキス０．５ｇ、及び微量
元素溶液（Ｖｉｓｎｉａｃ他（１９５７））２０ｍｌで
あった。ただし、アスペルギルス・ニガーＮ１２８株か
ら得た形質転換株については１ｍｇ／ｌのニコチンアミ
ドを添加し、他方アスペルギルス・ニガーＮＷ１０１株
については１．４ｍｇ／ｌのｐ−アミノ安息香酸を添加
した。培養中のｐＨは５Ｍ水酸化ナトリウムの添加によ
って５．５に維持し、温度は３０℃に維持した。酸素分
圧は、必要に応じて気体導入口を空気から酸素へ切替え
ることによって３０％以上に保った。培養器に、菌類の
胞子の予備培養液（２０％）を接種した。この予備培養
液（各々１５０ｍｌの培地の入った円錐形の３００ｍｌ
バッフル付振盪フラスコ）は、菌類の胞子（３×１０5
／ｍｌ）を接種して、２５０ｒｐｍの振盪培養機内で３
０℃で６時間培養したものである。本培養は５０時間以
上行った。培養して５０時間後に、ＳＯＸの産生量を測
定した。アスペルギルス・ニガー本来のｓｏｘ遺伝子１
個を含む菌株であるＮＷ１０１についてのＳＯＸ産生量
が３４Ｕ／ｌであったのに対して、アスペルギルス・ニ
ガーｓｏｘ遺伝子の追加コピーを含む菌株であるＮＷ１
２８．４１６＃４では、１５０Ｕ／ｌが産生された。こ
のように、アスペルギルス・ニガーのゲノム中にアスペ
ルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子の追加コピーを導入する
ことによって、アスペルギルス・ニガーＳＯＸを過剰生
産することができる。実施例３ アスペルギルス・ニガー中におけるアスペルギルス・ニ
ガーｓｏｘ遺伝子の調節因子とは異なる調節因子制御下
でのアスペルギルス・ニガーＳＯＸの過剰生産 アスペルギルス・ニガー中でのＳＯＸの産生の調節は、
増殖の比較的後期になってやっとある程度のＳＯＸ活性
が検出できるというものである。ＳＯＸ産生レベルをさ
らに増大させるために、別の調節シグナルを用いること
もできる。その一つの具体例として、ｓｏｘ遺伝子のコ
ード領域を上流調節領域（プロモーターなどを含む）か
ら分離して、ＡＴＧ翻訳開始シグナルでの融合により、
アスペルギルス・ニガー変種アワモリＣＢＳ１１５．５
２株のエンドキシラナーゼII遺伝子（ｅｘｌＡ）由来の
プロモーターの制御下に置いた。アスペルギルス属の菌
株から得られるその他のプロモーターを使用することも
でき、アスペルギルス・ニガーＣＢＳ１２０．４９株の
グルコアミラーゼ（ｇｌａＡ）遺伝子由来のプロモータ
ー並びにアスペルギルス・ニジュランス由来のグルタル
アルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（ｇｐｄＡ）
遺伝子のプロモーター（ｇｐｄＡプロモーター）を用い
る構築法についてもその概略を示す。３．１ ： ｅｘｌＡプロモーター ｐＡＷ１４Ｂ（図１２）の３．０ｋｂ・ＫｐｎＩ断片
（ｖａｎ Ｇｏｒｃｏｍ他（１９９１））をｐＴＺ１９
ＲのＫｐｎＩ部位に挿入して、ｐＵＲ２９３０を得た
（図１３）。ｐＵＲ２９３０の１．９ｋｂ・ＨｉｎｄII
I −ＸｈｏＩ断片及び２００ｂｐＸｈｏＩ−ＢｓｐＨＩ
断片を、ｐＵＲ７５０１の４．８ｋｂ・ＮｃｏＩ−Ｈｉ
ｎｄIII 断片と連結して、ｐＵＲ７５０２を得た（図１
４）。このプラスミドは、ＢｓｐＨＩ部位とＮｃｏＩ部
位との融合によるＡＴＧ翻訳開始シグナルで融合したア
スペルギルス・ニガー変種アワモリｅｘｌＡプロモータ
ーとアスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子を含んでいる
（図１４）。このプラスミド及びその適当な断片は、実
施例２の項目２．１．２と同様の方法によって、アスペ
ルギルス・ニガーｐｙｒＡ遺伝子の３．８ｋｂのＸｂａ
Ｉ断片と共に、アスペルギルス・ニガーＮＷ１２８株の
同時形質転換に使用することができる。表現型ＰＹＲ+
の形質転換株を、実施例２の項目２．１．３と同様の方
法で、複数のｓｏｘ遺伝子コピーの存在についてスクリ
ーニングすればよいが、これは、ｓｏｘ遺伝子の内在性
コピーと新たに導入されたｅｘｌＡプロモーターの後に
あるコピーについて、適当な制限酵素で消化したときに
それぞれのコピーから生ずる断片の鎖長の違いによって
簡単になる。別法として、アスペルギルス・ニジュラン
スのａｍｄＳ遺伝子をｐＵＲ７５０２に挿入して、形質
転換実験における多コピー型ｓｏｘ遺伝子含有形質転換
株の選択に用いることもできる。アスペルギルス・ニガ
ー変種アワモリ由来のプロモーターの後に導入されたア
スペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子コピーを複数含む形
質転換株は、ｅｘｌＡプロモーターからの転写レベルを
高めるような培地中で増殖させることができる。例え
ば、宿主株としてアスペルギルス・ニガーＮＷ１２８株
を用いるときには、国際公開ＷＯ９１／１９７８２号に
記載されているような小麦フスマ又はキシラン添加培地
を用いて、これらの培地に１ｍｇ／ｌのニコチンアミド
を添加すればよい。
【０１０４】プラスミドｐＵＲ７５０２及びその適当な
断片をアスペルギルス・ニガー変種アワモリＣＢＳ１１
５．５２株に導入した。このため、まず、紫外線突然変
異及びフルオロオロト酸プレート上でのスクリーニング
を利用して（６×１０6 個の胞子に対して９０秒間２０
ｅｒｇ／ｍｍ2 ／ｓの紫外線照射を行った。生存率４４
％）、アスペルギルス・ニガー変種アワモリＣＢＳ１１
５．５２のｐｙｒ- 変異株を構築した。得られたｐｙｒ
- 変異株の集団の中から、アスペルギルス・ニガーｐｙ
ｒＡ遺伝子全体と機能的プロモーターを含有するアスペ
ルギルス・ニガーＮ４００の３．８ｋｂ・ＸｂａＩ断片
（Ｇｏｏｓｅｎ他（１９８７））による形質転換によっ
て、２つの相補性群を同定することができた。アスペル
ギルス・ニガーｐｙｒＡ遺伝子によって相補うことので
きるアスペルギルス・ニガー変種アワモリＣＢＳ１１
５．５２のｐｙｒ- 変異株が同定され、ＮＷ２０８株と
名付けられた。実施例２の項目２．１．２と同様の方法
で、ｓｏｘ遺伝子を含有するｐＵＲ７５０２の３．３ｋ
ｂ・ＥｃｏＲＩ断片とアスペルギルス・ニガーｐｙｒＡ
遺伝子の３．８ｋｂ・ＸｂａＩ断片との同時形質転換に
よって、このＮＷ２０８株にｅｘｌＡプロモーターの制
御下に置かれたアスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子を
含む多コピー融合構築体を導入した。表現型ＰＹＲ+ の
形質転換株を、実施例２の項目２．１．３と同様の方法
で、複数のｓｏｘ遺伝子コピーの存在についてスクリー
ニングした。この操作で形質転換株ＡＷ４９８−９が同
定されたが、この菌株はｅｘｌＡプロモーターの制御下
に置かれたアスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子コピー
を複数含んでいる。アスペルギルス・ニガー変種アワモ
リＣＢＳ１１５．５２（ＡＷ）及び形質転換株ＡＷ４９
８−９を次の条件下で増殖させた。２００ｍｌの合成培
地（ＫＯＨでｐＨ６．５に調製）の入った５００ｍｌバ
ッフル付振盪フラスコ中に、胞子（最終濃度：１０6 個
／ｍｌ）を接種した。培地の組成は以下の通りであった
（ＡＷ培地）。
断片をアスペルギルス・ニガー変種アワモリＣＢＳ１１
５．５２株に導入した。このため、まず、紫外線突然変
異及びフルオロオロト酸プレート上でのスクリーニング
を利用して（６×１０6 個の胞子に対して９０秒間２０
ｅｒｇ／ｍｍ2 ／ｓの紫外線照射を行った。生存率４４
％）、アスペルギルス・ニガー変種アワモリＣＢＳ１１
５．５２のｐｙｒ- 変異株を構築した。得られたｐｙｒ
- 変異株の集団の中から、アスペルギルス・ニガーｐｙ
ｒＡ遺伝子全体と機能的プロモーターを含有するアスペ
ルギルス・ニガーＮ４００の３．８ｋｂ・ＸｂａＩ断片
（Ｇｏｏｓｅｎ他（１９８７））による形質転換によっ
て、２つの相補性群を同定することができた。アスペル
ギルス・ニガーｐｙｒＡ遺伝子によって相補うことので
きるアスペルギルス・ニガー変種アワモリＣＢＳ１１
５．５２のｐｙｒ- 変異株が同定され、ＮＷ２０８株と
名付けられた。実施例２の項目２．１．２と同様の方法
で、ｓｏｘ遺伝子を含有するｐＵＲ７５０２の３．３ｋ
ｂ・ＥｃｏＲＩ断片とアスペルギルス・ニガーｐｙｒＡ
遺伝子の３．８ｋｂ・ＸｂａＩ断片との同時形質転換に
よって、このＮＷ２０８株にｅｘｌＡプロモーターの制
御下に置かれたアスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子を
含む多コピー融合構築体を導入した。表現型ＰＹＲ+ の
形質転換株を、実施例２の項目２．１．３と同様の方法
で、複数のｓｏｘ遺伝子コピーの存在についてスクリー
ニングした。この操作で形質転換株ＡＷ４９８−９が同
定されたが、この菌株はｅｘｌＡプロモーターの制御下
に置かれたアスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子コピー
を複数含んでいる。アスペルギルス・ニガー変種アワモ
リＣＢＳ１１５．５２（ＡＷ）及び形質転換株ＡＷ４９
８−９を次の条件下で増殖させた。２００ｍｌの合成培
地（ＫＯＨでｐＨ６．５に調製）の入った５００ｍｌバ
ッフル付振盪フラスコ中に、胞子（最終濃度：１０6 個
／ｍｌ）を接種した。培地の組成は以下の通りであった
（ＡＷ培地）。
【０１０５】
【表１】 培養は、２５０ｒｐｍのＭｋＸ型振盪培養機内で、３０
℃で２４時間行った。増殖後、濾過（０．４５μｍ濾
紙）によって菌体を回収し、スクロース及び酵母エキス
抜きのＡＷ培地（塩溶液）で２度洗浄し、５００ｍｌの
振盪フラスコに移して、終濃度１０ｇ／ｌのキシロース
を添加した塩溶液（誘導培地）１００ｍｌに再懸濁し
た。再懸濁した時点を「ｔ＝０」（誘導開始点）とし、
培養液を１５０ｒｐｍのＭｋＸ型振盪培養機内におい
て、３０℃で培養した。誘導後１５時間、２３時間及び
４６時間目に、試料を採取した。ミラクロース（ｍｉｒ
ａｃｌｏｔｈ）で濾過して菌体を回収し、実施例１と同
様の方法で上清中のＳＯＸ活性を測定した（表１参
照）。
℃で２４時間行った。増殖後、濾過（０．４５μｍ濾
紙）によって菌体を回収し、スクロース及び酵母エキス
抜きのＡＷ培地（塩溶液）で２度洗浄し、５００ｍｌの
振盪フラスコに移して、終濃度１０ｇ／ｌのキシロース
を添加した塩溶液（誘導培地）１００ｍｌに再懸濁し
た。再懸濁した時点を「ｔ＝０」（誘導開始点）とし、
培養液を１５０ｒｐｍのＭｋＸ型振盪培養機内におい
て、３０℃で培養した。誘導後１５時間、２３時間及び
４６時間目に、試料を採取した。ミラクロース（ｍｉｒ
ａｃｌｏｔｈ）で濾過して菌体を回収し、実施例１と同
様の方法で上清中のＳＯＸ活性を測定した（表１参
照）。
【０１０６】
【表２】 表１の結果から明らかな通り、キシロース存在下で特異
的に誘導されるｅｘｌＡプロモーターを用いることによ
って、アスペルギルス・ニガー変種アワモリにおいてＳ
ＯＸを効率的に生産することができた。かかる条件の下
で、この菌株の産生するグルコースオキシダーゼ活性は
非常に低く、また、形質転換株中でのＳＯＸの産生は非
常に高く、しかも誘導後の非常に早い時期に産生が始ま
った。
的に誘導されるｅｘｌＡプロモーターを用いることによ
って、アスペルギルス・ニガー変種アワモリにおいてＳ
ＯＸを効率的に生産することができた。かかる条件の下
で、この菌株の産生するグルコースオキシダーゼ活性は
非常に低く、また、形質転換株中でのＳＯＸの産生は非
常に高く、しかも誘導後の非常に早い時期に産生が始ま
った。
【０１０７】さらに、上述の方法に従い、プラスミドｐ
ＵＲ７５０２及びその適当な断片もしくは派生プラスミ
ドを使って、ｅｘｌＡプロモーターの制御下に置かれた
複数のアスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子コピーを、
アスペルギルス属の他の菌種、例えばアスペルギルス・
オリゼ、アスペルギルス・ソヤエ、アスペルギルス・ツ
ビゲンシス、アスペルギルス・ジャポニクス、アスペル
ギルス・アクレアツス、アスペルギルス・アワモリ、ア
スペルギルス・ニジュランスなど、に導入することもで
きる。 ３．２： ｇｌａＡプロモーター 項目３．１にその概略を示した方法と同様の方法で、ア
スペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子がアスペルギルス・
ニガーのｇｌａＡプロモーターとＡＴＧ翻訳開始シグナ
ルで融合しているようなプラスミドを構築することがで
きる。この場合、ｐＡＮ５２−６の７．３５ｋｂ・Ｂｓ
ｓＨII−ＸｍｎＩ断片（Ｖａｎ ｄｅｎＨｏｎｄｅｌ他
（１９９０））又は機能的ｇｌａＡプロモーターを含有
するその他の断片を、国際公開ＷＯ９１／１９７８２号
記載のものと同様の方法で、ｐＵＲ７５０１の４．８ｋ
ｂ・ＨｉｎｄIII −ＮｃｏＩ断片と適正な方向で結合さ
せることができる。得られるプラスミド又はその適当な
断片を用いれば、本実施例の項目３．１で述べたような
方法により、遺伝子マーカーを有すようなアスペルギル
ス属に属する菌種株に、アスペルギルス・ニガーｇｌａ
Ａプロモーターの制御下に置かれた複数のアスペルギル
ス・ニガーｓｏｘ遺伝子コピーを含有する形質転換株を
生じさせることができる。 ３．３： ｇｐｄＡプロモーター 項目３．１にその概略を示した方法と同様の方法は、国
際公開ＷＯ９１／１９７８２号記載のように、アスペル
ギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子がアスペルギルス・ニジュ
ランスｇｐｄＡ遺伝子のプロモーターとＡＴＧ翻訳開始
シグナルで融合しているようなプラスミドの構築にも用
いることができる。この目的には、ＡＴＧ翻訳開始シグ
ナルまでのｇｐｄＡプロモーター配列を含有しているｐ
ＡＮ５２−１の１．８ｋｂ・ＳｔｕＩ−ＮｃｏＩ断片
（Ｐｕｎｔ他（１９８７））を、ｐＵＲ７５０１の４．
８ｋｂ・ＳｍａＩ−ＮｃｏＩ断片と連結すればよい。得
られるプラスミド又はその適当な断片を用いれば、本実
施例の項目３．１で述べたような方法により、遺伝子マ
ーカーを有すようなアスペルギルス属に属する菌種株
に、アスペルギルス・ニジュランスｇｐｄＡプロモータ
ーの制御下に置かれた複数のアスペルギルス・ニガーｓ
ｏｘ遺伝子コピーを含有する形質転換株を生じさせるこ
とができる。実施例４ アスペルギルス・ニガーＳＯＸの酵母中での生産 酵母中でアスペルギルス・ニガーＳＯＸを生産するに
は、アスペルギルス・ニガーのＳＯＸ成熟タンパク質を
コードする配列が公知の酵母プロモーターの制御下に置
かれているようなベクターを構築すればよい。アスペル
ギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子の一次転写産物からイント
ロンを正確に除去する能力を酵母が有していないことも
あるので、これらの構築体からはイントロンを除いてお
くべきである。イントロンの除去は、実施例１の項目
１．４．３で述べたアスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝
子の重複ｃＤＮＡ断片を用いることによって達成でき
る。これらの２つの断片から、成熟タンパク質のＮ末端
をコードする部分からポリＡテールまでのアスペルギル
ス・ニガーｓｏｘ・ｍＲＮＡ全体をカバーするｃＤＮＡ
をＰＣＲ反応で合成することができる。このようにして
得られた断片は、ＰＣＲ法又は合成オリゴヌクレオチド
を利用することにより、上記アスペルギルス・ニガーｓ
ｏｘ・ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーの、酵母プロモーター
及び機能的配列（例えば翻訳開始シグナル、また、アス
ペルギルス・ニガーＳＯＸタンパク質を分泌させたい場
合には、効率的に酵母から分泌されるようなタンパク質
をコードする酵母遺伝子から得たシグナル配列）との機
能的融合に使用できる。かかる構築体は、自律複製し得
る酵母ベクター或いは酵母ゲノム中への単コピーもしく
は多コピー型での組込みが可能な酵母ベクターのいずれ
にも導入することができる。かかる構築体によって支配
されるアスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子の発現レベ
ルは、アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子で使われて
いるコドンを酵母について知られているコドンの優先順
位に合わせることによって、さらに向上させることがで
きる。実施例５ 小麦生地製造時の過剰混捏を防止するためのＳＯＸの使
用 取扱い性に優れた生地並びに良好なベイク品を得るに
は、混捏によって生地を「十分に展開」させることが不
可欠である。このような生地においては、穀粉粒子は十
分に水分を吸っていて遊離の水はほとんどなく、生地は
最小の移動度と最大の耐伸展性を示すようになる。それ
以上混捏するのは得策ではなく、混捏を続けてしまう
と、生地の物理的性質並びに最終的に得られるベイク品
の品質に悪影響がみられるようになる。混捏過程の間、
グルテンタンパク質（グルテニンとグリアジン）は脱会
合もしくは脱重合し、再び会合もしくは重合する。グル
テン連続マトリックスの形成には、還元又はチオール基
の生成による特に高分子グルテニンサブユニット間のジ
スルフィド架橋の開裂と、その後の崩壊又は酸化による
ジスルフィド架橋の再形成が重要な役割を果たしている
と考えられている。システインやグルタチオン（穀粉中
にも天然に存在する）のような低分子チオール化合物は
グルテンマトリックスの形成に作用することが知られて
おり、混捏時間を短縮化するために広く用いられてい
る。この種の化合物の添加に伴う欠点は、その添加によ
って、生地が過剰混捏もしくは展開し過ぎてしまう危険
性がより高くなることである。この種のチオール化合物
と共にスルフヒドリルオキシダーゼを生地に添加すれ
ば、混捏時間を十分に短縮したまま、過剰混捏を防止す
ることができる。この効果を次の実験で実証した。ミキ
ソグラフ（Ｍｉｘｏｇｒａｐｈ、米国ネブラスカ州のＮ
ａｔｉｏｎａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ社製）中
で、１０ｇのＣｏｌｕｍｂｕｓ小麦粉（オランダ国ロッ
テルダムのＭｅｎｅｂａＭｉｌｌｓ社製）を、６ｍｌの
水、０．２ｇのパン酵母（オランダ国Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏ
ｃａｄｅｓ社製のｋｏｎｉｎｇｓｇｉｓｔ）及び０．２
ｇの塩化ナトリウムと共に混捏して、抵抗の増加を測定
することによって生地の展開度を追跡した。図１７のＡ
は、添加剤を全く加えない生地の抵抗チャートを示した
ものであり、約４分で完全な展開がみられる。生地に５
０ｍｇ／ｋｇのβ−メルカプトエタノールを添加した図
１７のＢでは、生地の展開が約２分に短縮された。ただ
し、それ以上混捏を続けると、典型的な抵抗トレースに
みられる通り、生地の過剰混捏が起きる。図１７のＣで
は、生地は５０ｍｇ／ｋｇのβ−メルカプトエタノール
と０．１ｍｇの精製スルフヒドリルオキシダーゼ（２０
０Ｕ／ｍｇ）を含んでいた。過剰混捏は大幅に減少し
た。グルタチオン、システイン、チオグルコースその他
の低分子チオール化合物を添加した場合にも、同じ効果
がみられた。最終的な成果は（過剰）混捏に対する耐性
である。実施例６ 小麦生地を強化するためのスルフヒドリルオキシダーゼ
の使用 小麦粉生地の混捏後に形成されるグルテンマトリックス
が、かかる生地の示す粘弾性挙動の原因である。このよ
うな生地の中に添加パン酵母によって発生する二酸化炭
素が保留され、膨脹効果が生ずる。気体保留性はグルテ
ンマトリックスの強度によってかなりの影響を受ける
が、このグルテンマトリックスの強度はグルテン含有量
にも幾分関連するものの、グルテニン分子間のジスルフ
ィド架橋にも関連している。グルタチオンその他の低分
子チオール化合物は、前述の実施例に記載した通り、こ
の架橋に悪影響を与える。本発明のスルフヒドリルオキ
シダーゼの有益な効果を説明するため、次のような具体
例を挙げる。１０ｇのＣｏｌｕｍｂｕｓ小麦粉（Ｍｅｎ
ｅｂａ Ｍｉｌｌｓ社製）、６ｍｌの水、０．２ｇのパ
ン酵母（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ社製のｋｏｎｉｎ
ｇｓｇｉｓｔ）及び０．２ｇの塩化ナトリウムを用い
て、小さなパンを幾つか製造した。生地をミキソグラフ
（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ社
製）を用いて２５℃で４分間混捏し、３０℃で合計１５
５分間寝かした。ただし、４０分後と８０分後に気体を
分配し直した。パンの容積をパン種排除法で測定した。
５ｍｇ／ｋｇ（２００Ｕ／ｍｇ）のスルフヒドリルオキ
シダーゼを補充した場合と補充しなかった場合のそれぞ
れについて、グルタチオン添加量を変えたときに以下に
示す比容積（ｍｌ／ｇ）が得られた。
ＵＲ７５０２及びその適当な断片もしくは派生プラスミ
ドを使って、ｅｘｌＡプロモーターの制御下に置かれた
複数のアスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子コピーを、
アスペルギルス属の他の菌種、例えばアスペルギルス・
オリゼ、アスペルギルス・ソヤエ、アスペルギルス・ツ
ビゲンシス、アスペルギルス・ジャポニクス、アスペル
ギルス・アクレアツス、アスペルギルス・アワモリ、ア
スペルギルス・ニジュランスなど、に導入することもで
きる。 ３．２： ｇｌａＡプロモーター 項目３．１にその概略を示した方法と同様の方法で、ア
スペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子がアスペルギルス・
ニガーのｇｌａＡプロモーターとＡＴＧ翻訳開始シグナ
ルで融合しているようなプラスミドを構築することがで
きる。この場合、ｐＡＮ５２−６の７．３５ｋｂ・Ｂｓ
ｓＨII−ＸｍｎＩ断片（Ｖａｎ ｄｅｎＨｏｎｄｅｌ他
（１９９０））又は機能的ｇｌａＡプロモーターを含有
するその他の断片を、国際公開ＷＯ９１／１９７８２号
記載のものと同様の方法で、ｐＵＲ７５０１の４．８ｋ
ｂ・ＨｉｎｄIII −ＮｃｏＩ断片と適正な方向で結合さ
せることができる。得られるプラスミド又はその適当な
断片を用いれば、本実施例の項目３．１で述べたような
方法により、遺伝子マーカーを有すようなアスペルギル
ス属に属する菌種株に、アスペルギルス・ニガーｇｌａ
Ａプロモーターの制御下に置かれた複数のアスペルギル
ス・ニガーｓｏｘ遺伝子コピーを含有する形質転換株を
生じさせることができる。 ３．３： ｇｐｄＡプロモーター 項目３．１にその概略を示した方法と同様の方法は、国
際公開ＷＯ９１／１９７８２号記載のように、アスペル
ギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子がアスペルギルス・ニジュ
ランスｇｐｄＡ遺伝子のプロモーターとＡＴＧ翻訳開始
シグナルで融合しているようなプラスミドの構築にも用
いることができる。この目的には、ＡＴＧ翻訳開始シグ
ナルまでのｇｐｄＡプロモーター配列を含有しているｐ
ＡＮ５２−１の１．８ｋｂ・ＳｔｕＩ−ＮｃｏＩ断片
（Ｐｕｎｔ他（１９８７））を、ｐＵＲ７５０１の４．
８ｋｂ・ＳｍａＩ−ＮｃｏＩ断片と連結すればよい。得
られるプラスミド又はその適当な断片を用いれば、本実
施例の項目３．１で述べたような方法により、遺伝子マ
ーカーを有すようなアスペルギルス属に属する菌種株
に、アスペルギルス・ニジュランスｇｐｄＡプロモータ
ーの制御下に置かれた複数のアスペルギルス・ニガーｓ
ｏｘ遺伝子コピーを含有する形質転換株を生じさせるこ
とができる。実施例４ アスペルギルス・ニガーＳＯＸの酵母中での生産 酵母中でアスペルギルス・ニガーＳＯＸを生産するに
は、アスペルギルス・ニガーのＳＯＸ成熟タンパク質を
コードする配列が公知の酵母プロモーターの制御下に置
かれているようなベクターを構築すればよい。アスペル
ギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子の一次転写産物からイント
ロンを正確に除去する能力を酵母が有していないことも
あるので、これらの構築体からはイントロンを除いてお
くべきである。イントロンの除去は、実施例１の項目
１．４．３で述べたアスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝
子の重複ｃＤＮＡ断片を用いることによって達成でき
る。これらの２つの断片から、成熟タンパク質のＮ末端
をコードする部分からポリＡテールまでのアスペルギル
ス・ニガーｓｏｘ・ｍＲＮＡ全体をカバーするｃＤＮＡ
をＰＣＲ反応で合成することができる。このようにして
得られた断片は、ＰＣＲ法又は合成オリゴヌクレオチド
を利用することにより、上記アスペルギルス・ニガーｓ
ｏｘ・ｍＲＮＡのｃＤＮＡコピーの、酵母プロモーター
及び機能的配列（例えば翻訳開始シグナル、また、アス
ペルギルス・ニガーＳＯＸタンパク質を分泌させたい場
合には、効率的に酵母から分泌されるようなタンパク質
をコードする酵母遺伝子から得たシグナル配列）との機
能的融合に使用できる。かかる構築体は、自律複製し得
る酵母ベクター或いは酵母ゲノム中への単コピーもしく
は多コピー型での組込みが可能な酵母ベクターのいずれ
にも導入することができる。かかる構築体によって支配
されるアスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子の発現レベ
ルは、アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子で使われて
いるコドンを酵母について知られているコドンの優先順
位に合わせることによって、さらに向上させることがで
きる。実施例５ 小麦生地製造時の過剰混捏を防止するためのＳＯＸの使
用 取扱い性に優れた生地並びに良好なベイク品を得るに
は、混捏によって生地を「十分に展開」させることが不
可欠である。このような生地においては、穀粉粒子は十
分に水分を吸っていて遊離の水はほとんどなく、生地は
最小の移動度と最大の耐伸展性を示すようになる。それ
以上混捏するのは得策ではなく、混捏を続けてしまう
と、生地の物理的性質並びに最終的に得られるベイク品
の品質に悪影響がみられるようになる。混捏過程の間、
グルテンタンパク質（グルテニンとグリアジン）は脱会
合もしくは脱重合し、再び会合もしくは重合する。グル
テン連続マトリックスの形成には、還元又はチオール基
の生成による特に高分子グルテニンサブユニット間のジ
スルフィド架橋の開裂と、その後の崩壊又は酸化による
ジスルフィド架橋の再形成が重要な役割を果たしている
と考えられている。システインやグルタチオン（穀粉中
にも天然に存在する）のような低分子チオール化合物は
グルテンマトリックスの形成に作用することが知られて
おり、混捏時間を短縮化するために広く用いられてい
る。この種の化合物の添加に伴う欠点は、その添加によ
って、生地が過剰混捏もしくは展開し過ぎてしまう危険
性がより高くなることである。この種のチオール化合物
と共にスルフヒドリルオキシダーゼを生地に添加すれ
ば、混捏時間を十分に短縮したまま、過剰混捏を防止す
ることができる。この効果を次の実験で実証した。ミキ
ソグラフ（Ｍｉｘｏｇｒａｐｈ、米国ネブラスカ州のＮ
ａｔｉｏｎａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ社製）中
で、１０ｇのＣｏｌｕｍｂｕｓ小麦粉（オランダ国ロッ
テルダムのＭｅｎｅｂａＭｉｌｌｓ社製）を、６ｍｌの
水、０．２ｇのパン酵母（オランダ国Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏ
ｃａｄｅｓ社製のｋｏｎｉｎｇｓｇｉｓｔ）及び０．２
ｇの塩化ナトリウムと共に混捏して、抵抗の増加を測定
することによって生地の展開度を追跡した。図１７のＡ
は、添加剤を全く加えない生地の抵抗チャートを示した
ものであり、約４分で完全な展開がみられる。生地に５
０ｍｇ／ｋｇのβ−メルカプトエタノールを添加した図
１７のＢでは、生地の展開が約２分に短縮された。ただ
し、それ以上混捏を続けると、典型的な抵抗トレースに
みられる通り、生地の過剰混捏が起きる。図１７のＣで
は、生地は５０ｍｇ／ｋｇのβ−メルカプトエタノール
と０．１ｍｇの精製スルフヒドリルオキシダーゼ（２０
０Ｕ／ｍｇ）を含んでいた。過剰混捏は大幅に減少し
た。グルタチオン、システイン、チオグルコースその他
の低分子チオール化合物を添加した場合にも、同じ効果
がみられた。最終的な成果は（過剰）混捏に対する耐性
である。実施例６ 小麦生地を強化するためのスルフヒドリルオキシダーゼ
の使用 小麦粉生地の混捏後に形成されるグルテンマトリックス
が、かかる生地の示す粘弾性挙動の原因である。このよ
うな生地の中に添加パン酵母によって発生する二酸化炭
素が保留され、膨脹効果が生ずる。気体保留性はグルテ
ンマトリックスの強度によってかなりの影響を受ける
が、このグルテンマトリックスの強度はグルテン含有量
にも幾分関連するものの、グルテニン分子間のジスルフ
ィド架橋にも関連している。グルタチオンその他の低分
子チオール化合物は、前述の実施例に記載した通り、こ
の架橋に悪影響を与える。本発明のスルフヒドリルオキ
シダーゼの有益な効果を説明するため、次のような具体
例を挙げる。１０ｇのＣｏｌｕｍｂｕｓ小麦粉（Ｍｅｎ
ｅｂａ Ｍｉｌｌｓ社製）、６ｍｌの水、０．２ｇのパ
ン酵母（Ｇｉｓｔ−Ｂｒｏｃａｄｅｓ社製のｋｏｎｉｎ
ｇｓｇｉｓｔ）及び０．２ｇの塩化ナトリウムを用い
て、小さなパンを幾つか製造した。生地をミキソグラフ
（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｍａｎｕｆａｃｔｕｒｉｎｇ社
製）を用いて２５℃で４分間混捏し、３０℃で合計１５
５分間寝かした。ただし、４０分後と８０分後に気体を
分配し直した。パンの容積をパン種排除法で測定した。
５ｍｇ／ｋｇ（２００Ｕ／ｍｇ）のスルフヒドリルオキ
シダーゼを補充した場合と補充しなかった場合のそれぞ
れについて、グルタチオン添加量を変えたときに以下に
示す比容積（ｍｌ／ｇ）が得られた。
【０１０８】 グルタチオン 比容積 比容積 添加量(mg/kg) ＳＯＸなし ＳＯＸ添加 ０ ３．８ ３．８ ５０ ３．２ ４．２ １００ ２．８ ３．９ １５０ ２．５ ３．９ ２００ ＮＤ ３．５ ３００ ＮＤ ３．５ 記号「ＮＤ」は、これらの生地の取扱いが不可能な状態
であったので、測定しなかったことを示す。この結果か
ら明らかな通り、生地にスルフヒドリルオキシダーゼを
添加すると生地の気体保留力を維持することができる。
であったので、測定しなかったことを示す。この結果か
ら明らかな通り、生地にスルフヒドリルオキシダーゼを
添加すると生地の気体保留力を維持することができる。
【０１０９】本願実施例中で引用した文献の一覧を以下
に示す。
に示す。
【０１１０】
【表３】
【図１】 アスペルギルス・ニガー成熟スルフヒドリル
オキシダーゼのＮ末端アミノ酸配列の一部、並びに合成
オリゴヌクレオチド縮重混合物の配列
オキシダーゼのＮ末端アミノ酸配列の一部、並びに合成
オリゴヌクレオチド縮重混合物の配列
【図２】 ＳＯＸのＣＮＢｒ断片のＨＰＬＣ分離の際の
溶出パターン
溶出パターン
【図３】 臭化シアン分解したアスペルギルス・ニガー
ＳＯＸ断片の部分的アミノ酸配列、並びに合成オリゴヌ
クレオチド縮重混合物の配列
ＳＯＸ断片の部分的アミノ酸配列、並びに合成オリゴヌ
クレオチド縮重混合物の配列
【図４】 標準条件下での、各種糸状菌株によるＳＯＸ
活性の産生レベル
活性の産生レベル
【図５】 標記時間の培養後に単離したアスペルギルス
・ニガーＮＷ１０１株の全ＲＮＡの、ｓｏｘ・ｍＲＮＡ
の存在に関するノーザンブロット分析
・ニガーＮＷ１０１株の全ＲＮＡの、ｓｏｘ・ｍＲＮＡ
の存在に関するノーザンブロット分析
【図６】 アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子の関連
遺伝子の存在に関する各種糸状菌株のサザンブロット分
析。
遺伝子の存在に関する各種糸状菌株のサザンブロット分
析。
【図７】 アスペルギルス・ニガーゲノムＤＮＡのｓｏ
ｘ遺伝子含有領域の制限地図。
ｘ遺伝子含有領域の制限地図。
【図８】 アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子のヌク
レオチド配列（塩基１〜塩基７６９）、並びに派生アミ
ノ酸配列（アミノ酸−１９〜アミノ酸５６）
レオチド配列（塩基１〜塩基７６９）、並びに派生アミ
ノ酸配列（アミノ酸−１９〜アミノ酸５６）
【図９】 アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子のヌク
レオチド配列（塩基７７０〜塩基１５７３）、並びに派
生アミノ酸配列（アミノ酸５７〜アミノ酸３２４）
レオチド配列（塩基７７０〜塩基１５７３）、並びに派
生アミノ酸配列（アミノ酸５７〜アミノ酸３２４）
【図１０】 アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子のヌ
クレオチド配列（塩基１５７４〜塩基２６５３）、並び
に派生アミノ酸配列（アミノ酸３２５〜アミノ酸３７
４）
クレオチド配列（塩基１５７４〜塩基２６５３）、並び
に派生アミノ酸配列（アミノ酸３２５〜アミノ酸３７
４）
【図１１】 アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子によ
るアスペルギルス・ニガー形質転換株体のサザンブロッ
ト分析
るアスペルギルス・ニガー形質転換株体のサザンブロッ
ト分析
【図１２】 アスペルギルス・ニガー変種アワモリｅｘ
ｌＡ遺伝子を含むプラスミドｐＡＷ１４Ｂの地図
ｌＡ遺伝子を含むプラスミドｐＡＷ１４Ｂの地図
【図１３】 アスペルギルス・ニガー変種アワモリｅｘ
ｌＡ遺伝子プロモーター領域を含むプラスミドｐＵＲ２
９３０の地図
ｌＡ遺伝子プロモーター領域を含むプラスミドｐＵＲ２
９３０の地図
【図１４】 ｅｘｌＡプロモーターの制御下に置かれた
アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子を含むプラスミド
ｐＵＲ７５０２の地図
アスペルギルス・ニガーｓｏｘ遺伝子を含むプラスミド
ｐＵＲ７５０２の地図
【図１５】 アスペルギルス・ニガーのｓｏｘ遺伝子を
含むプラスミドｐＵＲ７５００の地図
含むプラスミドｐＵＲ７５００の地図
【図１６】 アスペルギルス・ニガーのｓｏｘ遺伝子を
含むプラスミドｐＵＲ７５０１の地図
含むプラスミドｐＵＲ７５０１の地図
【図１７】 ＳＯＸ存在下又は非存在下におけるミクソ
グラフ実験
グラフ実験
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成５年５月１９日
【手続補正１】
【補正対象書類名】図面
【補正対象項目名】全図
【補正方法】変更
【補正内容】
【図１】
【図２】
【図４】
【図３】
【図５】
【図６】
【図７】
【図８】
【図９】
【図１０】
【図１１】
【図１２】
【図１３】
【図１５】
【図１６】
【図１４】
【図１７】
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 Ｃ１２Ｎ 5/10 9/02 9359−4Ｂ Ｃ１２Ｑ 1/68 Ａ 7823−4Ｂ //(Ｃ１２Ｎ 15/53 Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 15/53 Ｃ１２Ｒ 1:665） (Ｃ１２Ｎ 15/53 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 1/19 Ｃ１２Ｒ 1:665） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｎ 1/21 Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｎ 5/10 Ｃ１２Ｒ 1:07） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:685） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:66） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:85） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:78） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:645） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:84） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:665） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:225） (Ｃ１２Ｎ 9/02 Ｃ１２Ｒ 1:46） (Ｃ１２Ｎ 9/02 − (72)発明者 ウーター・マスタース オランダ国、3141・アールディー・マース ルイス、ワイパースパーク 138 (72)発明者 ヘイン・スタム オランダ国、1112・エルジー・ディーメ ン、グリエンド 72 (72)発明者 ピーター・ヨハネス・シャープ オランダ国、1625・イーピー・ホーン、カ ーベール 30 (72)発明者 ピーター・ヨゼフ・アイ・バン・デ・ボン ダーブール オランダ国、6708・エヌケイ・ワーゲニン ゲン、モンドリアンラーン 47 (72)発明者 ヤコブ・ビセール オランダ国、6703・シーケイ・ワーゲニン ゲン、ヒンケルールスウェグ ５ (72)発明者 ヨハネス・マリア・エイ・バーベイキー オランダ国、3155・ジーシー・マースラン ド、インゲランド ９
Claims (35)
- 【請求項１】 スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有す
る成熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配
列の少なくとも一部を含んでなる組換えＤＮＡ材料にし
て、上記ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が
下記の（ａ）、（ｂ）及び（ｃ）からなる群から選択さ
れることを特徴とする組換えＤＮＡ材料。 （ａ）スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する成熟過
程型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の少な
くとも一部、 （ｂ）上記（ａ）のヌクレオチド配列の遺伝子変異体、 （ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）のいずれかのヌクレオチド
配列とハイブリッド形成し得るヌクレオチド配列。 - 【請求項２】 請求項１記載の組換えＤＮＡ材料にし
て、前記スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有する成熟
過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、
食品級（ｆｏｏｄ ｇｒａｄｅ）の生物を起源とするこ
とを特徴とする組換えＤＮＡ材料。 - 【請求項３】 請求項１又は請求項２記載の組換えＤＮ
Ａ材料にして、前記スルフヒドリルオキシダーゼ活性を
有する成熟過程型ポリペプチドをコードするヌクレオチ
ド配列が、菌類又は細菌のような微生物を起源とするこ
とを特徴とする組換えＤＮＡ材料。 - 【請求項４】 請求項１乃至請求項３のいずれか１項記
載の組換えＤＮＡ材料にして、前記スルフヒドリルオキ
シダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列が、糸状菌、好ましくはアスペル
ギルス（Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓ）属の糸状菌、例えば
アスペルギルス・アワモリ（Ａ．ａｗａｍｏｒｉ）、ア
スペルギルス・ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）、アスペルギ
ルス・ニジュランス（Ａ．ｎｉｄｕｌａｎｓ）、アスペ
ルギルス・オリゼ（Ａ．ｏｒｙｚａｅ）、アスペルギル
ス・ソヤエ（Ａ．ｓｏｊａｅ）、アスペルギルス・ツビ
ゲンシス（Ａ．ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）、アスペルギル
ス・アクレアツス（Ａ．ａｃｕｌｅａｔｕｓ）及びアス
ペルギルス・ジャポニカス（Ａ．ｊａｐｏｎｉｃｕｓ）
からなる群から選択されるを起源とすることを特徴とす
る組換えＤＮＡ材料。 - 【請求項５】 請求項１乃至請求項４のいずれか１項記
載の組換えＤＮＡ材料にして、前記スルフヒドリルオキ
シダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列が、下記の（ａ）、（ｂ）及び
（ｃ）からなる群から選択されることを特徴とする組換
えＤＮＡ材料。 （ａ）図８〜図１０に示すヌクレオチド配列（配列番
号：１）の少なくとも一部であって、当該部分がスルフ
ヒドリルオキシダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプ
チドをコードするもの、 （ｂ）上記（ａ）のヌクレオチド配列の遺伝子変異体、 （ｃ）上記（ａ）又は（ｂ）のいずれかのヌクレオチド
配列の一部とハイブリッド形成し得るヌクレオチド配
列。 - 【請求項６】 請求項１乃至請求項５のいずれか１項記
載の組換えＤＮＡ材料にして、前記スルフヒドリルオキ
シダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコード
するヌクレオチド配列が、当該ヌクレオチド配列の発現
を支配し得る少なくとも１つの調節領域と連結している
ことを特徴とする組換えＤＮＡ材料。 - 【請求項７】 請求項６記載の組換えＤＮＡ材料にし
て、前記調節領域が、前記ヌクレオチドの起源となった
生物とは、異なる生物株から得たものであることを特徴
とする組換えＤＮＡ材料。 - 【請求項８】 請求項６又は請求項７記載の組換えＤＮ
Ａ材料にして、前記調節領域が、スルフヒドリルオキシ
ダーゼ遺伝子以外の遺伝子から得たものであることを特
徴とする組換えＤＮＡ材料。 - 【請求項９】 請求項６又は請求項７記載の組換えＤＮ
Ａ材料にして、前記調節領域が、スルフヒドリルオキシ
ダーゼ遺伝子の調節領域であることを特徴とする組換え
ＤＮＡ材料。 - 【請求項１０】 請求項１乃至請求項９のいずれか１項
記載の組換えＤＮＡ材料にして、当該組換えＤＮＡ材料
が少なくとも１つのマーカー遺伝子を含んでいることを
特徴とする組換えＤＮＡ材料。 - 【請求項１１】 請求項１乃至請求項１０のいずれか１
項記載の組換えＤＮＡ材料を含んでなる細胞にして、前
記組換えＤＮＡ材料にコードされているスルフヒドリル
オキシダーゼ活性を有する成熟過程型ポリペプチドをコ
ードするヌクレオチド配列を発現、好ましくは過剰発現
する能力を有する細胞。 - 【請求項１２】 請求項１１記載の細胞にして、前記組
換えＤＮＡ材料の少なくとも一部が当該細胞の染色体Ｄ
ＮＡ中に組込まれていることを特徴とする細胞。 - 【請求項１３】 請求項１１又は請求項１２記載の細胞
にして、当該細胞が、スルフヒドリルオキシダーゼ活性
を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列を
２つ以上含んでいることを特徴とする細胞。 - 【請求項１４】 請求項１１乃至請求項１３のいずれか
１項記載の細胞にして、当該細胞が、前記組換えＤＮＡ
材料にコードされているスルフヒドリルオキシダーゼ活
性を有する成熟過程型ポリペプチド、好ましくは成熟型
ポリペプチドを分泌する能力を有することを特徴とする
細胞。 - 【請求項１５】 請求項１１乃至請求項１４のいずれか
１項記載の細胞にして、当該細胞が、下記の（１）〜
（４）のいずれかを起源とすることを特徴とする細胞。 （１）菌類細胞、好ましくは糸状菌、特にアスペルギル
ス属の細胞、 （２）酵母細胞、例えば、サッカロミセス（Ｓａｃｃｈ
ａｒｏｍｙｃｅｓ）属、クルイベロミセス（Ｋｌｕｙｖ
ｅｒｏｍｙｃｅｓ）属、ハンゼヌラ（Ｈａｎｓｅｎｕｌ
ａ）属及びピシア（Ｐｉｃｈｉａ）属からなる群から選
択される酵母細胞、 （３）細菌細胞、好ましくはグラム陽性細菌で、例えば
バシルス（Ｂａｃｉｌｌｕｓ）属、ラクトバシルス（Ｌ
ａｃｔｏｂａｃｉｌｌｕｓ）属及びストレプトコックス
（Ｓｔｒｅｐｔｏｃｏｃｃｕｓ）属のいずれか１種、 （４）植物細胞、例えば小麦、大麦、燕麦、トウモロコ
シ、エンドウ、ジャガイモ及びタバコからなる群から選
択される植物細胞。 - 【請求項１６】 請求項１５記載の細胞にして、当該細
胞が、アスペルギルス・ニガー変種アワモリ（Ａ．ｎｉ
ｇｅｒ ｖａｒ．ａｗａｍｏｒｉ）、アスペルギルス・
ニガー（Ａ．ｎｉｇｅｒ）及びアスペルギルス・ツビゲ
ンシス（Ａ．ｔｕｂｉｇｅｎｓｉｓ）のいずれかから選
択される細胞を起源とすることを特徴とする細胞。 - 【請求項１７】 請求項１１乃至請求項１６のいずれか
１項記載の細胞にして、当該細胞が、食品級の細胞であ
ることを特徴とする細胞。 - 【請求項１８】 請求項１１乃至請求項１７のいずれか
１項記載の細胞にして、当該細胞が、前記ヌクレオチド
の起源となった生物と同じ属に属する生物を起源とする
ことを特徴とする細胞。 - 【請求項１９】 請求項１１乃至請求項１８のいずれか
１項記載の細胞にして、当該細胞がグルコースオキシダ
ーゼ欠損（ＧＯＸ- ）株であることを特徴とする細胞。 - 【請求項２０】 請求項１１乃至請求項１９のいずれか
１項記載の細胞にして、当該細胞がプロテアーゼ欠損
（ｐｒｔ- ）株であることを特徴とする細胞。 - 【請求項２１】 スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有
する好ましくは微生物起源の成熟過程型ポリペプチドに
して、当該成熟過程型ポリペプチドが、請求項１乃至請
求項１０のいずれか１項記載の組換えＤＮＡ材料の発現
によって得られたものであることを特徴とする成熟過程
型ポリペプチド。 - 【請求項２２】 請求項２１記載の成熟過程型ポリペプ
チドにして、当該成熟過程型ポリペプチドが、図８〜図
１０のＤＮＡ配列又は均等な３次構造のスルフヒドリル
オキシダーゼ活性を有するポリペプチドをコードするＤ
ＮＡ配列の一部にコードされていることを特徴とする成
熟過程型ポリペプチド。 - 【請求項２３】 スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有
する成熟過程型ポリペプチドの生産方法にして、請求項
１１乃至請求項２０のいずれか１項記載の細胞を培養
し、所望により、スルフヒドリルオキシダーゼ活性を有
する成熟過程型ポリペプチドを単離することからなる方
法。 - 【請求項２４】 遊離ＳＨ基のジスルフィド結合への酸
化と過酸化水素の発生を要する方法に、請求項２１又は
請求項２２記載の成熟過程型ポリペプチドを使用する方
法。 - 【請求項２５】 請求項２４記載の方法において、生地
又は冷凍生地の性質が改良されることを特徴とする方
法。 - 【請求項２６】 請求項２４記載の方法において、乳製
品（超高温（ＵＨＴ）殺菌に付したもの）やビールなど
の食品の異臭が除去されることを特徴とする方法。 - 【請求項２７】 生地又は生地から製造したベイク品の
性質を改良するための組成物にして、請求項２１又は請
求項２２記載の成熟過程型ポリペプチドを含んでなるこ
とを特徴とする組成物。 - 【請求項２８】 生地又は生地から製造したベイク品の
性質を改良するための組成物にして、請求項１１乃至請
求項２０のいずれか１項記載の細胞を含んでなることを
特徴とする組成物。 - 【請求項２９】 ベイカリイ製品の製造方法にして、請
求項２７又は請求項２８記載の組成物を使用することか
らなる方法。 - 【請求項３０】 個人用品の性質を改良するための組成
物にして、請求項２１又は請求項２２記載の成熟過程型
ポリペプチドを含んでなることを特徴とする組成物。 - 【請求項３１】 タンパク質又はタンパク様構造体の構
造強化用製品の性質を改良するための組成物にして、請
求項２１又は請求項２２記載の成熟過程型ポリペプチド
を含んでなることを特徴とする組成物。 - 【請求項３２】 異臭又は悪臭を除去するための組成物
にして、請求項２１又は請求項２２記載の成熟過程型ポ
リペプチドを含んでなることを特徴とする組成物。 - 【請求項３３】 請求項１乃至請求項１０のいずれか１
項記載の組換えＤＮＡ材料を使用する方法にして、当該
組換えＤＮＡ材料を、スルフヒドリルオキシダーゼ活性
を有するポリペプチドをコードするヌクレオチド配列の
検出、単離又は生産のためのプローブ又はプライマーと
して使用することを特徴とする方法。 - 【請求項３４】 スルフヒドリルオキシダーゼ酵素をコ
ードする遺伝子の少なくとも調節領域を含んでなるヌク
レオチド配列。 - 【請求項３５】 異種遺伝子と作動可能な状態で結合し
ていて異種遺伝子の発現を制御する、請求項３４記載の
ヌクレオチドを含んでなる組換えＤＮＡ配列。
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|---|---|---|---|
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