KR20100110046A

KR20100110046A - 효소 처리에 의하여 항염증 활성이 증가된 치자추출물의 제조 방법

Info

Publication number: KR20100110046A
Application number: KR1020090028413A
Authority: KR
Inventors: 손동화; 김현구; 김선아; 하태열; 안지윤; 박민희; 주민정; 김미혜
Original assignee: 한국식품연구원
Priority date: 2009-04-02
Filing date: 2009-04-02
Publication date: 2010-10-12
Also published as: KR101089637B1

Abstract

본 발명은 치자추출물에 β-글루코시다제를 처리하는 단계를 포함하는 항염증 활성이 증가된 치자추출물의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 치자 추출물을 유효 성분으로 함유하는 항염증 약학 조성물 및 상기 방법에 의해 제조된 치자 추출물을 유효 성분으로 함유하는 염증의 예방 및 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

치자추출물, β-글루코시다제, 항염증 활성, 약학 조성물, 건강기능식품

Description

효소 처리에 의하여 항염증 활성이 증가된 치자추출물의 제조 방법{Method for producing gardenia fruit extract with improved anti-inflammatory activity by enzyme treatment}

본 발명은 효소 처리에 의하여 항염증 활성이 증가된 치자추출물의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 치자추출물에 β-글루코시다제를 처리하는 단계를 포함하는 항염증 활성이 증가된 치자추출물의 제조 방법, 상기 방법에 의해 제조된 치자 추출물을 유효 성분으로 함유하는 항염증 약학 조성물 및 상기 방법에 의해 제조된 치자 추출물을 유효 성분으로 함유하는 염증의 예방 및 개선용 건강기능식품에 관한 것이다.

근년에 날로 증가하고 있는 각종 생활습관병(암, 동맥경화, 당뇨, 치매, 관절염, 알레르기 등)과 노화의 원인은 체내에서 생성되는 산화성 물질에 의한 것이어서 과일과 채소 등을 많이 섭취하면 이들에 함유되어 있는 항산화물질이 체내에서 작용하여 생활 습관병과 노화를 예방하거나 억제할 수 있다고 생각하게 되었다.

하지만 최근 몇 년 사이에 관점이 변했는데, 식이성분에 의한 항염증반응이 더 깊이 관여하고 있음이 밝혀지고 있다. 식품에는 항염증물질들이 함유되어 있고 그런 것들이 공동으로 작용하여 염증성 질병으로 발전하는 위험을 감소시키고 있다는 것이다. 또한, 염증반응과 밀접한 관련이 있는 세포 내 신호전달체계의 활성화는 노화와 여러가지 생활 습관병의 발전에 폭넓게 관여하고 있다 [Kumar et al. Takada Y, Boriek AM, Aggarwal BB. 2004. Nuclear factor-kappaB: its role in health and disease. J Mol Med. 82: 434-48; Sarkar D, Fisher PB. 2006. Molecular mechanisms of aging-associated inflammation. Cancer Lett. 236; 13-23; Youn HS. 2007. Anti-inflammatory effects of resveratrol, (-)-epigallocatechin-3-gallate and curcumin by the modulation of Toll-like receptor signaling pathway. Kor J Food Sci Technol. 39: 481-487].

생활 습관병과 염증의 관계를 잘 보여주는 대표적인 예로서 죽상형동맥경화(atherogenesis)를 들 수 있는데, 이는 심혈관계 질환(CVD)과 관상동맥심질환(CHD)을 유발하게 됨으로써 생명을 위협하는 원인이 되고 있다. 이러한 죽상형동맥경화가 발생하는데 관여하는 인자들 중에서도 특히 염증은 가장 중요한 요인 중의 하나로 거론되고 있다[de Winther MPJ, Kanters E, Kraal G, Hofker MH. 2005. Nuclear factro kB signaling in atherogenesis. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25: 904-914].

항염증 활성을 나타내는 천연물 소재로는 녹차, 고추, 프로폴리스, 석류, 고추, 로즈마리, 계피, 알로에, 생강, 브로콜리, 마늘, 강황, 포도주, 대황, 치자 등이 보고되고 있다. 특히, 이 중에서 치자는 치매의 개선에도 매우 좋은 활성을 나타내어 항치매 소재 생산에 활용가능함이 보고된 바 있다.

한편, 천연물 소재의 변형기술을 이용하면 생리활성을 효과적으로 개선할 수 있다. 특히 천연물 중에 흔하게 존재하는 배당체(glycoside)들의 당쇄를 효소로 절단하여 비배당체(aglycone)을 많이 생성시키면, 체내에 그 생리활성이 증가할 뿐만 아니라 이를 섭취 시 소장에서의 흡수가 좋아지기 때문에 전체적인 유용성이 상당히 개선됨이 보고되었다.

그 대표적인 예로서 "귀리 유래의 베타-글루코시다제 및 그를 이용한 제니스테인 또는 다이드제인의 제조 방법", "인삼사포닌의 저분자화 방법과 인삼사포닌 분해물을 이용한 기능성식품 제조방법", "β-글루코시다제를 생산하는 비피도박테리움 락티스 및 이를 이용하여 이소플라본을 이소플라본 비배당체로 전환하는 방법", "칡으로부터 비배당체 형태의 이소플라본을 제조하는 방법" 등이 있다.

이러한 종래 기술은 β-글루코시다제나 그 활성을 이용하여 주로 대두나 칡 등에서 유래한 이소플라본의 변형이나 인삼에서 유래한 사포닌의 변형을 통한 생리활성의 개선에 국한된 것이었다. 하지만, 치자추출물에 이 효소를 처리하여 항염증 활성을 획기적으로 개선하는데 활용한 예는 없었다.

한국특허등록 제10-0661481호에는 치자에서 추출한 당단백질 및 이를 함유하는 간보호,저지혈 및 항염증 약학 조성물이 개시되어 있다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 치자열매 추출물은 치매나 동맥경화 예방에 우수한 효과가 있어 양질의 항염증 활성이 보고되고 있으나, 추출물의 비활성은 높은 편이 아니므로, 천연물 유래 치자의 경제적인 효용성을 극대화할 수 있는 소재변형 기술의 개발이 필요하였다. 따라서, 본 발명은 소재변형을 통한 치자추출물의 항염증 활성 증가에 목적을 두고 곰팡이 유래 베타-글루코시다제를 처리하여 배당체의 분해를 유도함으로써 치자추출물의 항염증 활성 증가를 확인하고자 하였다.

상기 과제를 해결하기 위해, 본 발명은 치자추출물에 β-글루코시다제를 처리하는 단계를 포함하는 항염증 활성이 증가된 치자추출물의 제조 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 치자 추출물을 유효 성분으로 함유하는 항염증 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 방법에 의해 제조된 치자 추출물을 유효 성분으로 함유하는 염증의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

본 발명에 따르면, 치자추출물에 β-글루코시다제를 이용한 효소반응으로 소재변형을 유도함으로써 항염증 활성이 획기적으로 향상되었다. 이를 건강기능식품 의 소재로 활용하여 경구섭취하면 각종 생활습관병과 노화의 요인이 되는 체내 염증반응을 억제함으로써 건강증진의 효과가 기대된다.

본 발명의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 치자추출물에 β-글루코시다제를 처리하는 단계를 포함하는 항염증 활성이 증가된 치자추출물의 제조 방법을 제공한다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 치자추출물은 치자 열매에 용매를 첨가하고, 마이크로파를 처리함으로써 추출할 수 있다. 상기 용매는 물, 에탄올 또는 이의 혼합 용매일 수 있으며, 바람직하게는 물-에탄올 혼합 용매이다. 상기 마이크로파는 예를 들면, 90W에서 5분간 처리할 수 있다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 β-글루코시다제는 아스퍼질러스 (Aspergillus) 속 곰팡이 유래의 효소일 수 있다. 상기 아스퍼질러스 속 곰팡이는 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger), 아스퍼질러스 푸미가투스 (Aspergillus fumigatus), 아스퍼질러스 니둘란스 (Aspergillus nidulans), 아스퍼질러스 테레우스 (Aspergillus terreus), 아스퍼질러스 플라부스 (Aspergillus flavus) 등일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 β-글루코시다제의 처리 시간은 12시간 이상일 수 있으며, 바람직하게는 12시간 내지 24시간이다. 처리 시간이 12시간 미만이면 항염증 활성이 충분하지 않으며, 24시간을 초과하면 처리 시간 대비 항염증 활성의 증가가 뚜렷하지 않기 때문이다.

본 발명의 일 구현예에 따른 방법에서, 상기 β-글루코시다제의 처리 조건은 20 unit/ml, pH 4.6, 45℃, 24시간인 것이 더욱 바람직하나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명은 또한, 상기 항염증 활성이 증가된 치자추출물의 제조 방법에 의해 제조된 치자 추출물을 유효 성분으로 함유하는 항염증 약학 조성물을 제공한다.

치자 열매는 오랫동안 생약으로 사용되어 오던 약재로서 이로부터 추출된 본 발명의 추출물들 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없다.

본 발명의 항염증 약학 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.02 내지 50 중량%로 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물을 포함하는 약학조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 추출물의 약학적 투여 형태는 이들의 약학적 허용 가능한 염의 형태로도 사용될 수 있고, 또한 단독으로 또는 타 약학적 활성 화합물과 결합뿐만 아니라 적당한 집합으로 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 추출물을 포함하는 약학조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히 드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트 (calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈 (tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 추출물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나, 바람직한 효과를 위해서, 본 발명의 추출물은 1일 0.0001 내지 100 mg/kg으로, 바람직하게는 0.001 내지 100 mg/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위을 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 추출물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 (intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

본 발명은 또한, 상기 항염증 활성이 증가된 치자추출물의 제조 방법에 의해 제조된 치자 추출물을 유효 성분으로 함유하는 염증의 예방 및 개선용 건강기능식품을 제공한다.

상기 치자 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다.

또한, 항염증의 예방 및 개선 효과를 목적으로 식품 또는 음료에 첨가될 수 있다. 이 때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물의 양은 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물은 100 ㎖를 기준으로 0.02 내지 5 g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다.

본 발명의 건강 기능성 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물을 함유하는 외에는 다른 성분에는 특별한 제한이 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등; 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등; 및 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트 린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당, 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제(타우마틴, 스테비아 추출물, 예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등) 및 합성 향미제(사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20 g, 바람직하게는 약 5 내지 12 g이다.

상기 외에 본 발명의 추출물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물(전해질), 합성 풍미제 및 천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제(치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그 밖에 본 발명의 추출물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있으며, 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 추출물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 한정되는 것은 아니다.

본 발명자는 치자열매 추출물 중의 배당체에 대하여 당쇄 분해를 효과적으로 유도할 목적으로 Aspergillus 속 유래의 β-글루코시다제를 처리하였다. 이후, 효 소처리한 치자추출물의 항염증 활성을 평가하기 위하여 생쥐 대식세포주인 RAW264.7을 이용한 몇 가지 항염증시험 등을 아래와 같이 실시하고 그 지표를 평가하였다.

실험예 1

치자추출물을 준비하고자 치자열매 분쇄물에 용매 (3종: 물, 에탄올, 에탄올-물 1:1 혼합물)를 가하여 추출하였다. 이때 효과적인 유용성분의 추출을 위해 상압형 마이크로파 추출장치를 사용하였다. 추출조건은 시료 10g에 대하여 3종의 용매 200mL을 각각 첨가하고, 90W, 5분간 마이크로파를 처리하였다. 이를 여과지로 거른 후 회전 감압농축기로 농축한 다음, 증류수를 첨가하여 50mL로 조절하였다.

실험예 2

치자추출물의 효소반응물을 준비하고자 효소로는 Aspergillus 속 유래의 베타-글루코시다제를 사용하였는데, 주로 아스퍼질러스 나이거 (Aspergillus niger)(Fluka 49291, U/mL) 유래의 것을 사용하였다. 대조군으로는 아몬드 유래 β-글루코시다제 (Sigma G4511, U/mL)를 사용하였다. 추출물의 효소반응을 위하여 상기 치자추출물 농축액 5mL에 효소(최종 0, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20U/mL)를 함유한 아세트산나트륨 완충액(pH4.6) 5mL을 첨가하고, 시간(0, 1, 3, 6, 12, 18, 24h)과 온도(37℃, 45℃)를 달리하여 처리하였다.

실시예 1. 효소 및 용매처리에 따른 치차추출물의 NO 억제활성 비교

(1) 실험방법

RAW264.7 세포주를 사용하여 10%(v/v) FBS, 100 units/ml 페니실린, 100 ug/ml 스트렙토마이신을 포함하는 DMEM에 1x10⁶세포/ml의 세포밀도로 96 웰에 200uL씩 분주하여 2시간 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 그 후 위에서 처리를 달리하여 반응시킨 치자추출물을 각기 첨가량을 달리하여 넣어 준 다음(0.313, 0.625, 1.25, 2.5, 5.0uL), 1시간 배양하고 LPS(1㎍/ml)를 처리하여 24시간 배양하였다. 양성대조군으로서 resveratrol을, 실험군으로서 상기 추출물을 사용하였다. NO 분석을 위하여 세포배양 시 생성된 nitrate의 양을 측정하였다. 즉, 세포배양 상등액 50ul를 취하여 Griess 시약(50㎕)과 5분간 반응시킨 후, ELISA reader를 사용하여 540nm에서 흡광도를 측정하였다. 이때 표준품 NaNO₂를 기준으로 최종적으로 생산된 NO의 상대적인 양을 비교함으로써, 처리별 NO 억제활성을 구하고 항염증 활성의 지료로 삼았다.

(2) 실험결과

가) 베타-글루코시다제 효소 종류에 따른 항염증 활성 비교

치자추출물에 대한 처리효소로서 A. niger 유래의 효소와 아몬드 유래 효소의 활용가능성을 비교하였을 때 (pH 4.6, 37℃, 48h 진탕, 효소 25 unit/ml 처리), 후자는 전자에 비하여 그 반응물의 NO 억제활성이 높지 않았다 (도 1). 또한, A. fumigatus 유래의 베타-글루코시다제 효소를 처리한 경우에도 A. niger 유래의 효소의 경우와 매우 유사한 경향을 나타냄으로써 (데이타 생략), Aspergillus 속 유래의 효소가 치자추출물의 항염증 활성 증가에 매우 효과적임을 알 수 있었다.

나) 효소처리 농도에 따른 항염증 활성의 변화

치자추출물에 A. niger 유래 베타-글루코시다제의 농도(0, 0.5, 1, 2, 5, 10, 20 unit/ml)를 달리하여 pH 4.6, 45℃, 24시간 반응하여 얻은 치자추출물 효소반응물을 NO 억제활성시험에 적용하였다. 그 결과, 대체적인 각 효소반응물의 IC₅₀(반응물의 첨가량으로 표시함, 단위: ㎕)는 각각 ND, 4, 1.5, 0.9, 0.8, 0.75, 0.4로써 효소처리 농도에 비례하여 NO 생산이 강하게 억제되었는데 (도 2), 이 IC₅₀값을 건물량 기준으로 환산하면 각각 ND, 600, 225, 135, 120, 113, 60 ug/ml 가량에 해당하였다. 다만, 2U/ml 이상의 효소 처리구에서는 효소반응물을 배양세포에 많이 투여하면(5 ㎕), 오히려 NO 억제활성이 감소되는 현상이 관찰되었다. 하지만 전체적으로 보면, 이 효소반응에 의하여 치자추출물의 NO 억제활성은 수십 배 증가되었음을 알 수 있었다.

다) 효소처리의 시간에 따른 항염증 활성의 변화

치자추출물에 A. niger 유래 베타-글루코시다제를 20 unit/ml 첨가하고 pH 4.6, 45℃, 24시간 반응시키면서 항염증 활성의 변화를 경시적으로 조사하였다. 그 결과 12시간까지는 시간에 비례하여 NO 억제활성이 증가하였으나 (IC₅₀ 기준으로 비교한 상대적인 활성의 증가), 그 이후에는 오히려 활성이 약간 감소하는 경향을 보였다. 따라서, 이 조건에서 효소반응시간은 12시간 이상이면 충분한 것으로 나타났다 (도 3).

라) 효소처리를 위한 최적조건 검토

치자추출물 중에서 어떤 추출용매(물, 50% 에탄올, 100% 에탄올)를 사용한 경우가 항염증 활성이 좋은지, 그리고, 이들 3종의 추출물에 대하여 효소처리하면 그 효과(비활성)가 각기 어느 정도 차이가 있는지를 비교함으로써 최적조건을 검토하였다. 이때 반응의 조건은 효소첨가 20 unit/ml, pH 4.6, 45℃, 24시간이었다. 그 결과 추출용매로는 50% 에탄올 > 물 > 100% 에탄올의 순이었고, 효소처리한 모든 경우에서 비활성이 10 배 이상 증가한 것으로 나타났다 (도 4). 그러므로 추출용매로서 50% 에탄올을 이용하여 준비한 치자추물물에 Aspergillus 속 곰팡이 유래의 효소를 처리함으로써 항염증 활성이 가장 우수한 것으로 판단하였다. 이때 치자추출물 효소반응물의 IC₅₀은 0.5 ㎕이었는데, 건물량 기준으로 환산하면 약 70ug/ml으로써 매우 양호하였다.

실시예 2. 기타 항염증 지표의 평가

(1) 실험방법

치자추출물이 RAW264.7 세포주를 대상으로 한 항염증 활성 시험에서 LPS를 처리하였을 때 유도되는 NO 생산의 억제활성을 앞에서 조사하였는데, 이 경우 다른 지표들에 미치는 영향에 대하여도 조사하였다. 예를 들면, 염증성 사이토카인의 변화, 세포 내 신호전달에 관여하는 효소 발현의 변화, NF-kB 활성의 변화 등이다.

가) 염증성 사이토카인의 분석

치자추출물의 처리에 의한 사이토카인의 생성 정도를 분석하기 위해 12 웰 플레이트에 RAW 264.7 세포를 1x10⁶세포/ml (혹은 1x10⁵세포/ml; TNF-a용)의 농도로 분주하여 2시간 동안 배양한 후 각각의 시료를 농도별로 처리하여 1시간 동안 배양한 후, LPS(1㎍/ml)를 처리하여 24시간 동안 37℃, 5% CO₂ 배양기에서 배양하였다. 이때 얻어진 상등액 중에 생성된 각각의 사이토카인(IL-6, IL-1b, TNF-a)을 OptEIA^TM Mouse ELISA set(BD Sci. Co.)를 각각 사용하여 설명서에 따라 분석하였다.

나) 웨스턴 블롯 분석

세포의 단백질을 추출한 후 원심분리하여 상등액을 취하였다. 상등액을 Bradford 시약을 사용해 단백질 농도를 정량하여 40 μg의 단백질을 취했다. 추출된 단백질은 10%의 SDS-PAGE를 실시한 후 분리된 단백질을 니트로셀룰로스 막으로 옮겼다. 5% 탈지우유로 하루 밤 동안 처리한 후 1:500의 비율로 iNOS와 COX-2 항체를 4시간 동안 상온에서 방치한 후 TTBS로 15분 간격으로 2회 세척하였다. 1:1000 의 비율로 희석한 2차 항체를 1시간 동안 상온에서 방치시켰다. 다시 TTBS로 15분 간격으로 3회 세척한 후 ECL로 현상하였다.

다) 루시퍼라제 분석을 이용한 NF-kB 억제활성의 분석

NF-kB 활성 억제능을 평가하기 위하여 대장균(E.coli)에 대량증식시켜 Endofree plasmid Maxi kit로 정제하여 얻은 반딧불이 루시퍼라제 플라스미드와 renilla 루시퍼라제 플라스미드 (대조군, Promega, E2231)를 각각 0.5 ㎍/웰, 0.005 ㎍/웰이 첨가되도록 RAW264.7 세포에 co-transfection시켰다. 이때 세포는 전날 1x10⁵세포/웰의 밀도로 96 웰에 분주하여 배양을 한 것을 사용하였다. 트랜스펙션 6시간 후 한 차례 완전 배지 (complete media)로 배지 교환을 하였다. 그 후 18시간 배양하여 농도별로 시료를 처리하고, 1시간 후에 LPS(1㎍/ml)를 처리하여 23시간 배양하였다. 이후 Dual-Glo 루시퍼라제 분석 시스템 (Promega, E2940)에 따라 시약을 처리하여 나타나는 발광정도를 luminometer로 측정하고 그 결과를 RRR(Relative Response ratio)로 나타내었다.

(2) 실험결과

가) 치자추출물의 효소반응물 처리에 의한 사이토카인 생산의 변화

상기 실험계에서 치자추출물의 효소반응물 처리에 의하여 염증성 사이토카인 3종(IL-1b, IL-6, 그리고 TNFa)의 생산에 미치는 영향을 조사하였다 (도 5). 그 결 과, IL-1b의 경우는 효소처리하지 않은 것의 활성(사이토카인 분비 억제)과 별로 차이가 없었으나, IL-6과 TNFa의 경우에는 효소처리한 것에서 염증성 사이토카인의 생산이 억제되었다. 따라서, 치자추출물은 효소처리에 의하여 항염증 활성이 높아짐이 여기에서도 확인되었다.

나) 추출물 처리에 의한 염증관련 효소생산의 저해

다음으로 COX-2 및 iNOS 생산 억제활성의 변화를 조사하였다. 치자와 대황의 50% 에탄올 추출물은 COX-2 생산 억제활성이 모두 농도의존적으로 강하게 나타났다. 활성의 강도는 효소처리한 치자추출물에서 훨씬 높게 나타났다 (도 6). 또한, 추출물의 처리에 의한 iNOS 생산 억제실험에서도 COX-2의 경우와 대체로 유사한 경향을 나타내었다 (데이타 생략). 따라서, 이들 염증관련효소의 생산억제 활성에서도 앞에서 조사한 NO 억제활성과 잘 일치하는 결과를 보였다.

다) 추출물 처리에 의한 전사인자 NF-kB 활성의 저해

LPS 등 TLR를 통한 외부신호가 세포내로 전달되어 NF-kB가 활성화되고 이것이 핵 내로 이동하여 전사에 관여함으로 염증성 사이토카인 등의 생산을 유도하고 궁극적으로 염증반응이 유발되는 것으로 잘 알려져 있다. 따라서, 치자추출물의 처리에 의하여 유도되는 NF-kB 활성화 억제를 관찰하고자 하였다.

루시퍼라제 유전자를 리포터 유전자로 활용하여 RAW264.7 세포에서 분석한 결과 (도 7), 치자추출물의 효소반응물은 농도 의존적으로 그 억제활성이 관찰되었 으나, 효소처리하지 않은 치자추출물에서는 억제활성이 거의 나타나지 않았다. 이 결과도 앞에서 조사한 NO 억제활성의 결과와 비교적 잘 일치하였다.

그러므로 이상의 모든 결과를 전체적으로 종합하면 다음과 같다. 통상 항염증시험을 위하여 널리 활용되고 있는 RAW264.7 세포주를 이용한 실험계에서 치자추출물은 약한 활성을 보였다. 하지만, 베타-글루코시다제를 처리한 치자추출물을 실험계에 처리하면 항염증 활성이 10배 이상 획기적으로 증가함이 확인되었다. 그러므로 이러한 방법으로 치자를 원료로 하여 생산한 건강기능성 소재는, 인체 내에서 염증에 의하여 유발될 수 있는 각종 생활 습관병 및 노화를 억제하는데 활용 가능하다.

도 1은 25U/ml, pH 4.6, 37℃에서 48시간 동안 A. niger 및 아몬드 유래의 β-글루코시다제로 처리된 치차추출물 (50% EtOH + 마이크로파 추출)에 의한 RAW264.7 세포에서 LPS로 유도된 NO 생산 저해 결과이다. RV: resveratrol, A. nig. enz.: A. niger 유래의 β-글루코시다제, Almond enz.: 아몬드 유래의 β-글루코시다제.

도 2는 0 - 20U/ml, pH 4.6, 45℃에서 24시간 동안 A. niger 유래의 β-글루코시다제로 처리된 치차추출물 (물 + 마이크로파 추출)에 의한 RAW264.7 세포에서 LPS로 유도된 NO 생산 저해 결과이다. RV: resveratrol, A. nig. enz.: A. niger 유래의 β-글루코시다제.

도 3은 pH 4.6, 45℃에서 1, 3, 6, 12, 18, 및 24h 동안 A. niger 유래의 β-글루코시다제 20U/ml로 처리된 치차추출물 (물 + 마이크로파 추출)에 의한 RAW264.7 세포에서 LPS로 유도된 NO 생산 저해 활성 결과이다. 결과는 NO 생산의 상대적인 저해 활성으로 나타내었다.

도 4는 20U/ml, pH 4.6, 45℃에서 24시간 동안 A. niger 유래의 β-글루코시다제로 처리된 치차추출물 (물, EtOH, 50% EtOH + 마이크로파 추출)에 의한 RAW264.7 세포에서 LPS로 유도된 NO 생산 저해 결과이다. RV: resveratrol, 치자 Water: 증류수로 추출한 치자추출물, 치자 EtOH: 에탄올로 추출한 치자추출물, 치자 50% EtOH: 50% 에탄올로 추출한 치자추출물, enz 20U: A. niger 유래의 β-글루코시다제 20U/ml 처리.

도 5는 20U/ml, pH 4.6, 45℃에서 24시간 동안 A. niger 유래의 β-글루코시다제로 처리된 치차추출물에 의한 RAW264.7 세포에서 LPS로 유도된 염증성 사이토카인 생산의 저해 결과이다. 치자: 50% 에탄올로 추출한 치자추출물, 치자 A.nig. enz.: A. niger 유래의 β-글루코시다제로 처리된 치자추출물.

도 6은 β-글루코시다제로 처리 또는 무처리된 치자추출물에 의한 RAW264.7 세포에서 LPS로 유도된 염증성 효소 COX-2 생산의 저해 결과이다. Resv.: resveratrol, 치자Ext.: 50% 에탄올로 추출한 치자추출물, 치자+효소: A. niger 유래의 β-글루코시다제로 처리된 치자추출물.

도 7은 β-글루코시다제로 처리 또는 무처리된 치자추출물에 의한 RAW264.7 세포에서 LPS로 유도된 염증성 전사인자 NF-kB 활성의 저해 결과이다. 치자: 50% 에탄올로 추출한 치자추출물, 치자 A.nig. enz.: A. niger 유래의 β-글루코시다제로 처리된 치자추출물.

Claims

치자추출물에 β-글루코시다제를 처리하는 단계를 포함하는 항염증 활성이 증가된 치자추출물의 제조 방법.
제1항에 있어서, 상기 치자추출물은 치자 열매에 용매를 첨가하고, 마이크로파를 처리함으로써 추출하는 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 용매는 물-에탄올의 혼합 용매인 것을 특징으로 하는 방법.
제2항에 있어서, 상기 마이크로파는 90W에서 5분간 처리하는 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 β-글루코시다제는 아스퍼질러스 (Aspergillus) 속 곰팡이 유래의 효소인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 β-글루코시다제의 처리 시간은 12시간 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
제6항에 있어서, 상기 β-글루코시다제의 처리 시간은 12~24 시간인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항에 있어서, 상기 β-글루코시다제의 처리 조건은 20 unit/ml, pH 4.6, 45℃, 24시간인 것을 특징으로 하는 방법.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 치자 추출물을 유효 성분으로 함유하는 항염증 약학 조성물.
제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 방법에 의해 제조된 치자 추출물을 유효 성분으로 함유하는 염증의 예방 및 개선용 건강기능식품.