KR102117297B1

KR102117297B1 - 엘라그산 배당체 및 이의 제조방법

Info

Publication number: KR102117297B1
Application number: KR1020180149803A
Authority: KR
Inventors: 남승희; 이방희; 양광열; 김수현
Original assignee: 전남대학교산학협력단
Priority date: 2018-11-28
Filing date: 2018-11-28
Publication date: 2020-06-01

Abstract

본 발명은 엘라그산 배당체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 엘라그산 및 수크로스 혼합액에 당전이 효소를 첨가하여 형성된 엘라그산 배당체는 엘라그산에 비해 수용성이 개선되고, 글루타메이트(glutamate) 자극에 의한 신경아세포종인 SH-SY5Y 세포의 세포 독성을 엘라그산에 비해 감소시키는 효과, 글루타메이트(glutamate) 자극에 의해 증가된 코티졸(cortisol)의 발현을 엘라그산에 비해 감소시키는 효과 및 글루타메이트(glutamate) 자극에 의해 증가된 아세틸콜린 분해효소(acetylcholineesterase)의 활성을 감소시키는 효과가 있으므로, 스트레스성 질환 및 퇴행성 뇌질환의 치료제 또는 스트레스성 질환 및 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품으로 유용하게 사용할 수 있다.

Description

엘라그산 배당체 및 이의 제조방법{Ellagic acid glycoside and manufacturing method thereof}

본 발명은 스트레스 질환 및 퇴행성 뇌질환의 예방, 개선 또는 치료효과를 가지는 엘라그산 배당체 및 이의 제조방법에 관한 것이다.

엘라그산(Ellagic acid)은 폴리페놀 4개의 링으로 구성되어 있으며, 식물체 내에서는 전구물질인 엘라기탄닌(ellagitannin) 형태로 존재하며, 포도, 딸기, 석류, 나무딸기, 땅콩류 및 녹차 등에 존재하는 식물성 페놀물질이다.

엘라그산은 강력한 항산화제로 피부 미백과 주름 생성 억제에 효과가 있다고 보고되어 있는데, 이 물질은 멜라닌 생성효소인 티로시나아제(tyrosinase) 활성의 중요한 요소인 구리에 강력히 부착하여 멜라닌 생성을 억제한다고 한다. 또한, 사람 피부 세포와 생쥐를 이용한 실험을 통해 엘라그산이 콜라겐 파괴를 일으키는 효소(MMP)가 생산되는 것을 막고, 염증반응 관련 물질(ICAM)의 발현을 감소시킴으로써 피부를 보호한다는 사실이 알려져 있으며, 엘라그산 또는 엘라그산 함유 석류 추출물을 피부에 바르거나, 섭취할 시에도 자외선(UV)에 의한 피부 주름 방지 및 색소침착을 막아준다는 사실이 보고되고 있다.

엘라그산은 피부보호 효과 외에도, 항산화, 항바이러스, 항돌연변이, 항암기능을 가지고 있다고 알려져 있다. 엘라그산은 암세포의 세포자연사를 유도하며, 특히 유방, 식도, 피부, 결장, 전립선과 췌장에서의 암세포 활동을 억제한다고 알려져 있으며, 결장 내의 비정상 세포의 성장을 감소시키고, 자궁경부암을 유발하는 HPV 바이러스에 감염된 세포의 성장을 저지하는 것이 확인되었다.

또한, 엘라그산의 효능 중 스트레스에 대한 뇌세포 보호 및 인지능력 개선, 알츠하이머 예방 및 치료에 대한 연구도 진행되고 있으며, 뇌에 발생되는 외상성 뇌손상(traumatic brain injury, TBI)과 이에 따른 인지능력 손상, 기억력감퇴에 대해 보호 효과 및 치유효과가 보고되어 있다.

한편, 글루칸수크라제(Glucansucrases)는 mono-, di-, 또는 그 이상의 슈크로오스 단위를 다른 탄수화물 수여체(carbohydrate acceptors)에 글리코시드 결합(glycosidic linkages)을 통해 전달하는 효소로, 효소에 의한 배당체의 전달이 몇몇 바이오 활성 물질에 작용하여 그 기능적 특성을 변화시키려는 시도가 되어 왔다.

엘라그산은 물에 전혀 녹지 않는 특성이 있어, 산업적 활용이 제한되고 있다. 현재까지 글루칸수크라제를 이용하여 엘라그산의 물리적 특성을 변화시키고 개선시킨 종래기술은 없는 실정이다. 따라서, 엘라그산의 생물학적 전환을 통해 생합성된 엘라그산 배당체를 통해 엘라그산의 물성을 개선하고, 효능을 증대시켜, 식품, 화장품 및 약학분야를 포함하는 다양한 분야에서 사용을 증대시키고자 하는 노력이 필요하다.

한편, 한국등록특허 제1091641호에는 석류로부터 엘라그산을 효율적으로 분리하는 방법 및 이를 함유한 미백, 주름개선 기능성 화장품 조성물이 개시되어 있지만, 본 발명의 엘라그산 배당체 및 이의 제조방법에 관해 개시된 바 없다.

본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 도출된 것으로, 엘라그산 및 수크로스 혼합액에 당전이 효소를 첨가하여 형성된 엘라그산 배당체 및 이의 제조방법을 제공하고, 상기 방법에 의해 제조된 엘라그산 배당체의 용해도, 뇌 신경세포 보호능, 글루타메이트(glutamate) 자극에 의해 증가된 코티졸(cortisol)의 발현 저해효과 및 글루타메이트(glutamate) 자극에 의해 증가된 아세틸콜린 분해효소(acetylcholineesterase)의 활성 증가효과를 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.

상기 과제를 해결하기 위하여, 본 발명은 수크로스 및 엘라그산의 혼합액에 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 유래의 글루칸수크라제를 첨가한 후 25~30℃에서 6~36시간 동안 반응하는 단계를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 엘라그산 배당체의 제조방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 화학식 1로 표시되는 엘라그산 배당체를 제공한다.

또한, 본 발명은 엘라그산 배당체 또는 약학적으로 허용 가능한 이의 염을 유효성분으로 함유하는 스트레스성 질환 및 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 엘라그산 배당체 또는 식품학적으로 허용 가능한 이의 염을 유효성분으로 함유하는 스트레스 및 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물을 제공한다.

본 발명은 엘라그산 배당체 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 엘라그산 및 수크로스 혼합액에 당전이 효소를 첨가하여 형성된 엘라그산 배당체는 엘라그산에 비해 수용성이 개선되고, 글루타메이트(glutamate) 자극으로부터 신경아세포종인 SH-SY5Y 세포의 생존율을 엘라그산에 비해 향상시키고, 글루타메이트(glutamate) 자극에 의해 증가된 코티졸(cortisol)의 발현을 엘라그산에 비해 감소시키며, 글루타메이트(glutamate) 자극에 의해 증가된 아세틸콜린 분해효소(acetylcholineesterase)의 활성을 감소시키는 효과가 있으므로, 스트레스성 질환 및 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물, 스트레스성 질환 및 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물로 사용할 수 있다.

도 1은 용매에 따른 엘라그산의 용해도를 확인한 결과이다.
도 2는 본 발명의 제조방법에 의해 엘라그산으로부터 당전이 반응 물질이 생성되는 기작을 도식화한 것이다.
도 3은 엘라그산을 12~24시간 동안 당전이 반응시킨 반응물의 TLC 분석결과이다. 화살표는 당전이 반응 물질(엘라그산 배당체)을 표시한다. EA는 엘라그산, S는 수크로스, G는 글루코오스, F는 프룩토오스, -E는 수크로스 및 효소만 첨가된 반응물, 12h는 엘라그산, 수크로스 및 효소가 첨가된 12시간 반응물 및 24h는 엘라그산, 수크로스 및 효소가 첨가된 24시간 반응물을 로딩한 것으로, 황산발색을 통해서 확인한 것이다. 좌측 EA는 UV 245nm 파장에서 확인한 것이다.
도 4는 엘라그산, 수크로스 및 효소가 첨가된 반응물로부터 엘라그산 배당체를 분리하여 TLC 분석한 결과(A) 및 HPLC로 분리한 크로마토그램(B)이다. (A)의 상단은 UV 245nm 파장에서 엘라그산(EA)을 확인한 것이고, 하단은 황산발색을 통해 엘라그산 배당체(EAG)를 확인한 결과이다. 반응물은 엘라그산, 수크로스 및 효소 첨가 후 24시간 동안 반응시킨 것이다.
도 5는 ESI(-)-MS/MS 분석에 의해 엘라그산 배당체의 분자량을 동정한 결과이다. 엘라그산 배당체의 분자량은 485.1이다. 분자량 531.1은 엘라그산 배당체에 Na 이온 3개가 붙은 [M+3Na]-물질이다.
도 6은 중심합성계획법에 의해 반응한 엘라그산 배당체 생성물의 반응표면분석 3차원 모식도이다. A는 효소(glucanase) 및 수크로스(sucrose)의 양과 엘라그산 배당체 생성물의 관계를 나타낸 것이고, B는 엘라그산(ellagic acid) 및 수크로스(sucrose)의 양과 엘라그산 배당체 생성물의 관계를 나타낸 것이며, C는 효소(glucanase) 및 엘라그산(ellagic acid)의 양과 엘라그산 배당체 생성물의 관계를 나타낸 것이다.
도 7은 엘라그산 및 엘라그산 배당체의 물에 대한 용해도를 확인한 결과이다.
도 8은 본 발명의 엘라그산 배당체에 의한 뇌신경 세포 보호효과를 MTT 분석(A) 및 현미경(B)으로 확인한 결과이다. 글루타메이트는 세포 스트레스 유발 물질이다. Buffer는 화합물의 용매만 처리한 군이고, 테아닌(theanine)은 양성 대조군이고, EA는 엘라그산 농도별 처리군이며, EAG는 엘라그산 배당체의 농도별 처리군이다. *, **은 엘라그산에 비해 엘라그산 배당체의 세포 생존율이 유의미하게 증가하는 것을 의미하며, *은 p<0.05, **은 p<0.01이다.
도 9는 본 발명의 엘라그산 배당체에 의한 코티졸 분비 억제효과를 확인한 것으로, 글루타메이트는 코티졸 분비 유도 물질이다. Buffer는 화합물의 용매만 처리한 군이고, 테아닌(theanine)은 양성 대조군이고, EA는 엘라그산 농도별 처리군이고, EAG는 엘라그산 배당체의 농도별 처리군이다. **은 엘라그산에 비해 엘라그산 배당체의 코티졸 분비량이 유의미하게 감소하는 것을 의미하며, p<0.01이다.
도 10은 본 발명의 엘라그산 배당체에 의한 아세틸콜린에스테라아제 활성 억제효과를 확인한 것으로, 글루타메이트는 아세틸콜린에스테라아제 활성 유도 물질이다. 타크린(tacrine)은 양성 대조군이고, EA는 엘라그산 농도별 처리군이고, EAG는 엘라그산 배당체의 농도별 처리군이다. ***은 엘라그산에 비해 엘라그산 배당체의 아세틸콜린에스테라아제 저해 활성이 유의미하게 증가하는 것을 의미하며, p<0.001이다.

본 발명은 수크로스 및 엘라그산의 혼합액에 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 유래의 글루칸수크라제를 첨가한 후 25~30℃에서 6~36시간 동안 반응하는 단계를 포함하는 하기 화학식 1로 표시되는 엘라그산 배당체의 제조방법에 관한 것이다.

[화학식 1]

상기 방법은 바람직하게는 140~160mM 수크로스 및 4~6mM 엘라그산의 혼합액에 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 유래의 글루칸수크라제 280~320mU/mL를 첨가한 후 소듐 아세테이트 버퍼에서 26~30℃에서 20~28시간 동안 반응하는 단계를 포함할 수 있으며, 더욱 바람직하게는 150mM 수크로스 및 5mM 엘라그산의 혼합액에 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 유래의 글루칸수크라제 300mU/mL를 첨가한 후 20mM 소듐 아세테이트 버퍼에서 28℃에서 24시간 동안 반응하는 단계를 포함할 수 있다.

상기 당전이 효소는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 유래의 글루칸수크라제를 사용할 수 있으며, 바람직하게는 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 512 FMCM 유래의 글루칸수크라제를 사용하는 것이지만, 이에 한정하는 것은 아니다.

또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 화학식 1로 표시되는 엘라그산 배당체에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 상기 엘라그산 배당체 또는 약학적으로 허용 가능한 이의 염을 유효성분으로 함유하는 스트레스성 질환 및 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 치료용 약학 조성물에 관한 것이다.

상기 퇴행성 뇌질환은 아세틸콜린 분해에 의해 유발되는 것으로, 치매(dementia), 알츠하이머 질환(Alzheimer's disease) 및 파킨슨 질환(Parkinson disease)으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것일 수 있고, 바람직하게는 치매 또는 알츠하이머 질환일 수 있지만, 이에 한정하는 것은 아니다.

상기 스트레스성 질환은 코티졸 분비의 증가에 의해 발생하는 우울증(depressive disorder), 수면장애(sleep disturbance) 및 불안장애(anxiety disorder)로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상인 것일 수 있으나. 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 엘라그산 배당체는 글루타메이트(glutamate) 자극으로부터 뇌신경 세포를 보호하며, 글루타메이트(glutamate) 자극에 의해 증가된 코티졸(cortisol)의 분비량을 감소시키며, 글루타메이트(glutamate) 자극에 의해 증가된 아세틸콜린 분해효소(acetylcholineesterase)의 활성을 저해한다.

상기 엘라그산 배당체는 엘라그산에 비해 수용성이 증가한다.

본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 각각 통상의 방법에 따라 캡슐제, 산제, 과립제, 정제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다.

본 발명에 따른 상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명의 약학 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등을 포함한 다양한 화합물 혹은 혼합물을 들 수 있다.

제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구 투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 약학 조성물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한, 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당하는데 흔히 사용되는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔, 마크로골, 트윈 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로젤라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물의 적합한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

본 발명의 약학 조성물은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있으며, 비경구 투여의 경우, 피부에 국소적으로 도포, 정맥 내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 경피 투여 등으로 투여할 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 엘라그산 배당체 또는 식품학적으로 허용 가능한 이의 염을 유효성분으로 함유하는 스트레스 및 퇴행성 뇌질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품 조성물에 관한 것이다.

본 발명의 건강기능식품 조성물을 식품첨가물로 사용하는 경우, 상기 건강기능식품 조성물을 그대로 첨가하거나 다른 식품 또는 식품성분과 함께 사용될 수 있고, 통상적인 방법에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 유효성분의 양은 그의 사용 목적(예방 또는 개선)에 따라 적절하게 사용될 수 있다. 일반적으로, 식품 또는 음료의 제조시 본 발명의 건강기능식품 조성물은 총 원료에 대하여 15 중량부 이하, 바람직하게는 10 중량부 이하의 양으로 첨가된다. 그러나 건강을 목적으로 하는 장기간의 섭취인 경우에는 상기 양은 상기 범위 이하일 수 있으며, 안전성 면에서 아무런 문제가 없기 때문에 유효성분은 상기 범위 이상의 양으로 사용될 수 있다.

상기 건강기능식품의 종류에 특별한 제한은 없다. 상기 건강기능식품 조성물을 첨가할 수 있는 식품의 예로는 육류, 소시지, 빵, 초콜릿, 캔디류, 스낵류, 과자류, 피자, 라면, 기타 면류, 껌류, 아이스크림류를 포함한 낙농제품, 각종 스프, 음료수, 차 드링크제, 알콜 음료 및 비타민 복합제 등이 있으며, 통상적인 의미에서의 건강식품을 모두 포함한다.

또한, 본 발명의 건강기능식품 조성물은 식품, 특히 기능성 식품으로 제조될 수 있다. 본 발명의 기능성 식품은 식품 제조 시에 통상적으로 첨가되는 성분을 포함하며, 예를 들어, 단백질, 탄수화물, 지방, 영양소 및 조미제를 포함한다. 예컨대, 드링크제로 제조되는 경우에는 유효성분 이외에 천연 탄수화물 또는 향미제를 추가 성분으로서 포함할 수 있다. 상기 천연 탄수화물은 모노사카라이드(예컨대, 글루코오스, 프럭토오스 등), 디사카라이드(예컨대, 말토스, 수크로스 등), 올리고당, 폴리사카라이드(예컨대, 덱스트린, 시클로덱스트린 등) 또는 당알코올(예컨대, 자일리톨, 소르비톨, 에리쓰리톨 등)인 것이 바람직하다. 상기 향미제는 천연 향미제(예컨대, 타우마틴, 스테비아 추출물 등)와 합성 향미제(예컨대, 사카린, 아스파르탐 등)를 이용할 수 있다.

상기 건강기능식품 조성물 이외에 여러 가지 영양제, 비타민, 전해질, 풍미제, 착색제, 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알코올, 탄산음료에 사용되는 탄산화제 등을 더 함유할 수 있다. 이러한 상기 첨가되는 성분의 비율은 크게 중요하진 않지만 본 발명의 건강기능식품 조성물 100 중량부에 대하여, 0.01 내지 0.1 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.

이하, 실시예를 이용하여 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들에 의해 제한되지 않는다는 것은 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어 자명한 것이다.

재료 및 방법

1. 실험재료

엘라그산(ellagic acid), 실리카겔(silica gel), 수크로스(sucrose), 글루코오스(glucose), 말토오스(maltose), 나프틸에틸렌-디아민 디하이드로클로라이드(naphthylethylene-diamine dihydrochloride), MTT[3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolimbromide], DPPH(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl) 시약은 시그마(Sigma)에서 구입하였다.

2. 엘라그산 배당체 생성

당전이를 위한 글루칸수크라제 효소는 L. mesenteroides B-512 FMCM을 발효 배양한 후, 30K 차단중공사형(cutoff hollow fiber)을 이용하여 정제한 후, Q-세파로오스 컬럼(sepharose column)을 이용하여 정제된 것을 사용하였다. 효소 활성은 28℃에서 기질로 100mM 수크로스와 20mM 소듐 아세테이트(pH 5.2) 완충액을 이용해 다양한 반응시간을 두고 측정하였다. 글루칸수크라제 활성 단위인 1unit은 20mM 소듐 아세테이트 완충용액(pH 5.2)을 사용하였을 때, 28℃에서 분당 1μmol의 프락토스를 분해하는 효소의 활성을 말한다.

엘라그산 배당체 생성조건은 총 250mL에 10mM 엘라그산(75.3mg), 355mM 수크로스(15.9g) 및 상기 분리 정제한 글루칸수크라제(0.65units/mL)를 혼합하고, 반응액을 28℃에서 2~24시간 동안, 설탕이 없어질 때까지 반응시켰다. 그 후 효소를 불활성화시키기 위해 반응액을 5분 동안 100℃에서 끓였다.

TLC(Thin-Layer Chromatography)는 실리카 겔 60 F254 TLC 플레이트(Merck Co.)를 이용해 분석하였다. 각 반응액을 실온에서 1㎕씩 실리카 겔 플레이트에 점적한 후 전개 용매 에틸아세테이트/아세트산/물(ethyl acetate/acetic acid/water (3:1:1, v/v/v))을 이용하여 TLC 챔버에서 전개한 후, UV 254nm에서 검출하거나, 황산 발색 용매(0.3%(v/v) N-1-나프틸-에틸렌디아민 및 5%(v/v) 황산이 함유된 메탄올)에 5초 동안 담근후, 110℃ 건조 오븐에서 10분 동안 발색하였다.

3. 엘라그산 배당체의 용매 추출 및 분리

반응액에 존재하는 당(dextran, fructose 및 glucose) 및 효소 등을 없애기 위해, 비극성 용매인 초산에틸을 사용해 상기 배당체 형성 반응액과 1 대 1로 혼합한 후 200×g에서 30분 동안 쉐이킹(shaking)한 후, 원심분리(10,000×g, 20분, 4℃)한 다음 상등액을 취하였다. 상기 상등액은 47℃ 회전증발농축기를 이용하여 용매를 증발시킨 후 50%(v/v) 메탄올에 용해한 후 C18 컬럼(50×500mm)에 로딩하였다. 그 후 컬럼을 1ml/min의 유속으로 총 300ml의 증류수를 이용하여 1차 세척한 다음, 총 200ml 증류수를 이용하여 2차 세척하였다. 그 후 10~100%(v/v) 메탄올을 이용하여 농도구배하여 용출하였고, 50~60%(v/v) 메탄올을 사용하여 엘라그산 배당체가 포함된 추출액을 획득하였다.

배당체 포함 여부를 확인하기 위해 엘라그산 배당체를 함유하고 있는 추출액을 47℃ 회전증발농축기를 이용하여 농축한 후, PDA-MD2015 장비의 HPLC(JASCO, Kyoto, Japan)를 이용하여 배당체를 분리하였다. HPLC 분석에 사용된 컬럼은 u-Bondapak C18 역상 컬럼(300×19mm i.d., Waters)이고, A 용매(0.1%(v/v) 포름산이 함유된 물)와 B 용매(0.1%(v/v) 포름산이 함유된 메탄올)를 사용하여 B 용매 대비 A 용매를 초기 5분 동안은 5%~20%(v/v)까지, 그 후 10분 동안 20%~50%(v/v)까지, 그 후 10분 동안 50%~10%(v/v)까지의 농도로 흘려보냈고, 유속은 0.9ml/min, 컬럼 오븐 온도는 40℃였다. 회수된 추출액은 254nm에서 MD2015 모델 PDA 검출기(JASCO)를 사용해서 분석하였다.

4. 엘라그산 배당체 구조 동정

본 발명의 엘라그산 배당체는 LC/MS/MS 분석을 통해 분자량 및 분자식을 확인하였다. 배당체는 ESI-MS/MS(electrospray ionization tandem mass spectrometry)를 사용하여 분석하였으며, Positive ESI-MS 분석은 Synapt HDMS system(Waters)을 사용하여 로크 스프레이 인터페에스가 있는 전기 스프레이 이온화 소스(electrospray ionization source with lock spray interface)로 분석하였다.

5. 엘라그산 배당체 생성 최적화 (중심합성계획법과 반응표면분석법)

엘라그산의 배당체는 355mM 수크로스, 650mU/ml 효소 및 10mM 엘라그산을 12시간 반응시켜 얻었다. 엘라그산의 배당체 생성 최적조건을 얻기 위해서 반응표면분석법(RSM)을 이용하였으며, 엘라그산의 배당체 생성에 대한 실험계획은 중심합성계획법을 실시하여 생성 조건에 대한 중요한 독립변수로(X_i) 고려되는 인자, 즉 기질농도 (X₁), 효소농도(X₂) 및 수용체 농도(엘라그산, X₃)에 대한 실험범위를 설정하여 각 5단계로 부호화하여(표1) 17군으로 구분하였다(표 2). 그리고 이들 독립변수에 의해 영향받는 종족변수(Yn), 즉 엘라그산의 배당체의 생성농도를 측정하여 그 값을 회귀분석에 사용하였다.

3가지 독립변수에 대한 실험계획

	-1.682	-1	0	1	1.682
기질-수크로스(mM)	10.23	150	355	560	699.8
효소-글루칸수크라제(mU/ml)	61.37	300	650	1000	1238.6
수용체-엘라그산, EA(mM)	1.5	5	10	20	25

3가지 중요 독립변수, 5단계 실험범위에 대한 중심합성계획

	Codded value			Actual value
	기질	효소	수용체	수크로스 (mM)	글루칸수크라제 (mU)	엘라그산 (mM)
1	-1	-1	-1	150	300	5.0
2	1	-1	-1	560	300	5.0
3	-1	1	-1	150	1000	5.0
4	1	1	-1	560	1000	5.0
5	-1	-1	1	150	300	20.0
6	1	-1	1	560	300	20.0
7	-1	1	1	150	1000	20.0
8	1	1	1	560	1000	20.0
9	-1.682	0	0	10	650	12.5
10	1.682	0	0	700	650	12.5
11	0	-1.682	0	355	61	12.5
12	0	1.682	0	355	1239	12.5
13	0	0	-1.682	355	650	0.1
14	0	0	1.682	355	650	25.1
15	0	0	0	355	650	12.5
16	0	0	0	355	650	12.5
17	0	0	0	355	650	12.5
18	0	0	0	355	650	12.5
19	0	0	0	355	650	12.5
20	0	0	0	355	650	12.5

최적 엘라그산 배당체의 생성조건은 반응표면분석으로 얻어진 수크로스 농도, 글루칸수크라제 농도, 엘라그산 농도 등의 등고선도(contour map)를 슈퍼이미징(superimaging) 했을 때 중복되는 부분의 범위로 예측하였다. 회귀분석 및 그래프를 얻기 위해 Design-Expert 6.0.11 통계 프로그램을 사용하였다.

6. 기능성 조사

1) 뇌신경 보호 효과 : MTT 분석

신경세포 보호 효과를 확인하기 위하여 SH-SY5Y 세포(KCLB 22266, Korean Cell Line Bank, Seoul, Korea)를 실험에 사용하였다. 세포의 생존율은 MTT(3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide) 분석을 이용하여 측정하였다.

뇌신경 세포(SH-SY5Y)(neuroblastoma, human dopaminergic neuronal cell)는 1%(v/v) 항진균제/항생제와 10%(v/v) FBS를 함유한 RPMI-1640 배지에서 배양하였고, 96-웰 플레이트에 세포수가 10⁴~10⁶cell/ml가 되도록 분주한 후, 24시간 후에 엘라그산과 엘라그산 배당체를 농도별로 처리하였다. 그 후 100mM 글루타메이트를 처리해 스트레스를 유발시킨 후 MTT 분석을 이용하여 570nm 파장으로 흡광도를 측정하여 세포독성을 확인하였다. 양성 대조군으로는 뇌 진정작용이 알려진 1~10uM 테아닌(theanine)을 사용하였다.

2) 항스트레스 효과 : 코티졸 측정( cortisol determination )

엘라그산 배당체의 항스트레스 효과를 확인하기 위해 스트레스 호르몬인 코티졸의 함량을 측정하였다.

세포배양액을 4℃, 10,000×g에서 10분 동안 원심분리한 후 상등액을 취하여 실험에 사용하였다. 상등액의 단백질 함량은 BCA 키트로 조사하였으며, 코티졸 엘라이자 키트(Calbiotech)를 제조사의 프로토콜에 따라 사용하여 코티졸 함량을 분석하였다.

3) 퇴행성 뇌질환 개선효과 : 아세틸콜린에스테라제 ( Acetylcholinesterase , AChE) 억제 분석

AChE는 뇌신경 전달물질인 아세틸콜린(Acetylcholin)을 분해하며, 아밀로이드반(amyloid plaque)이나 신경세포섬유매듭(neurofibrillary tangles)의 생성을 유발한다고 알려져 있다. 따라서 뇌신경 세포(SH-SY5Y)에 100mM 글루타메이트를 처리해 스트레스가 유발된 세포에 엘라그산 또는 엘라그산 배당체를 농도별로 처리한 후 세포배양액을 10,000×g에서 10분 동안 원심분리한 다음 상등액을 취하였고, 상등액을 이용하여 AChE 억제 정도를 AChE 억제 분석 키트를 제조사의 프로토콜에 따라 측정하여 항치매 개선효과를 확인하였다.

7. 통계처리

실험에서 얻어진 결과는 SAS 프로그램(Package relwase 8.01)을 이용하여 평균+표준편차로 표시하였고, 평균값의 통계적 유의성은 p<0.05수준에서 던칸의 다중검정법(multiple range test)에 의해 검정하였다.

실시예 1. 용매별 엘라그산의 용해도

물에 전혀 녹지 않는 엘라그산을 가용화하기 위해 엘라그산의 농도 및 용매별 용해도를 확인하였다. 그 결과, 도 1에 개시된 바와 같이 25mM의 엘라그산을 50%(v/v) 아세톤을 이용하여 녹였을 때 가장 높은 용해도를 나타냈다.

따라서 이후 실험에서는 50%(v/v) 아세톤에 용해된 엘라그산을 이용하였다.

실시예 2. 엘라그산 배당체 생성, 정제 및 동정

반응액은 50%(v/v) 아세톤에 용해한 10mM의 엘라그산(ellagic acid, EA)(75.3g)에 335mM의 수크로스(15.9g) 및 글루칸수크라제(0.65units/ml)를 혼합한 후 완충용액(0.1mM MgCl₂, 40mM 소듐 아세테이트, pH 5.2)을 이용하여 총 250ml 용량으로 제조하였다. 당전이 물질 생성기작은 도 2에 도식화하였다.

상기 반응액은 28℃에서 12~24시간 동안 수크로스가 없어질 때까지 반응시켰고, 반응 후 반응액을 TLC(Thin-Layer Chromatography)에 점적하여 전개 용매 에틸아세테이트/아세트산/물(ethyl acetate/acetic acid/water, 3:1:1, v/v/v)을 이용하여 TLC 챔버에서 전개한 후, UV 254nm에서 검출하거나, 황산 발색 용매(0.3%(v/v) N-1-나프틸-에틸렌디아민 및 5%(v/v) 황산이 함유된 메탄올)에 5초 동안 담근 후, 110℃ 건조 오븐에서 10분 동안 발색하였다.

그 결과, 도 3에 개시된 바와 같이 반응 후 당전이 물질이 생성된 것을 확인하였다. 엘라그산은 UV 245nm 파장에서 확인 가능하였고, 엘라그산 배당체는 황산발색을 통해서 확인 가능하였다.

또한, 상기 엘라그산 및 엘라그산 배당체가 함유된 효소 반응물을 초산에틸을 이용해 액-액 분리하였으며, C18 칼럼으로 분리 후 TLC 분석한 결과, 도 4A에 개시된 바와 같이 엘라그산 배당체(EAG)는 50%(v/v)~60%(v/v) 메탄올을 이용하여 분리할 수 있었다. 엘라그산은 UV 245nm 파장에서 확인 가능하였고, 엘라그산 배당체는 황산발색을 통해서 확인 가능하였다.

또한, 상기 엘라그산 및 엘라그산 배당체가 함유된 효소 반응물을 초산에틸을 이용해 액-액 분리하였으며, C18 칼럼정제 후 HPLC로 분리한 크로마토그램 결과, 도 4B에 개시된 바와 같이 효소 반응물에서 엘라그산 배당체는 6.7분(70%(v/v) 메탄올), 엘라그산은 9.2분(55%(v/v) 메탄올)에서 추출되었다.

한편, 엘라그산 배당체는 LC/MS/MS 분석을 통해 분자량 및 분자식을 밝혔으며, 글루칸수크라제 효소 특성에 따라 예상 결합 구조는 α-1,6 결합된 것으로 예측되어, O-α-D-글루코실(1->6) 엘라그산으로 구조를 결정하였다.

LC/MS/MS를 통해 얻어진 엘라그산 분자량은 302.19이고 엘라그산 배당체의 분자량은 485.1로 [M+Na]- 예상구조와 일치하였다. 상기 Na 이온은 효소에서 유래된 것으로, 531.1 분자량은 엘라그산 배당체에 Na 이온 3개가 붙은 [M+3Na]-물질로 판명되었다(도 5).

실시예 3. 엘라그산 배당체 생성 최적화(중심합성계획법 및 반응표면분석법)

엘라그산 배당체 생성을 최적화하기 위해 중심합성계획법 및 반응표면분석법을 이용하였다. 중심합성계획법에 의해 수크로스 기질은 10.2~699.8mM, 글루칸수크라제 효소는 61~1238mU/ml, 엘라그산 수용체는 1.5~25mM을 첨가해 총 20가지 조합으로 분석하였다.

최적 엘라그산 배당체(EAG) 생성 조건은 글루칸수크라제 효소 300mU/mL, 수크로스 기질 150mM, 수용체 엘라그산 5mM을 첨가해 20mM 소듐 아세테이트 버퍼에서 28℃ 조건에서 24시간 반응시켰을 때, 3.47mM 엘라그산 배당체가 생성된다는 것을 확인하였다.

반응표면 분석법에 의한 3차원 그래프 3개(도 6)로부터 유출된 공식은 하기 식 1에 표시하였다.

[식 1]

Y=-4.630+0.011X₁+0.008X₂+0.443X₃+0.0000004X₁ ²-0.000008X₂ ²-0.00004X₃ ²-0.00001X₁X₂-0.000004X₁X₃-0.016X₂X₃

Y= 엘라그산 배당체 생성양(mM)

X₁ 수크로스, X₂ 글루칸수크라제, X₃ 엘라그산

실시예 4. 엘라그산 배당체의 수용성 확인

본 발명의 엘라그산 배당체를 물에 용해하여 보았다. 그 결과, 도 7에 개시된 바와 같이 엘라그산 자체는 농도에 상관없이 전혀 물에 녹지 않았으나, 엘라그산 배당체는 50uM 이하 농도에서 물에 녹는 것을 확인하였다.

실시예 5. 엘라그산 배당체의 뇌신경 세포 보호효과

본 발명의 엘라그산 배당체의 글루타메이트에 의한 뇌신경 세포 손상에서의 뇌신경 세포 보호효과를 확인하였다.

그 결과, 도 8에 개시된 바와 같이 엘라그산 배당체는 동일 농도에서 엘라그산 대비 20~30% 높은 생존율을 나타냈다. 특히 엘라그산 배당체 처리 농도가 증가할 수록 엘라그산 대비 생존율이 현저하였다.

실시예 6. 글루타메이트에 의해 증가된 코티졸의 분비 억제효과

본 발명의 엘라그산 배당체의 글루타메이트에 의한 스트레스 상황에서 코티졸 분비 억제효과를 확인하였다.

그 결과, 도 9에 개시된 바와 같이 엘라그산 배당체는 동일 농도에서 엘라그산 대비 코티졸 분비량을 감소시켰으며, 특히 엘라그산 배당체 처리 농도가 증가할 수록 엘라그산 대비 코티졸 분비량의 감소효과가 현저하였다.

실시예 7. 글루타메이트에 의해 증가된 AChE 활성 억제효과

뇌신경세포(SH-SY5Y)를 이용한 엘라그산 배당체의 퇴행성 뇌질환, 특히 치매 개선 효과는 글루타메이트 처리에 의해 증가된 뇌신경전달물질인 아세틸콜린(acetylcholin)을 분해하는 AChE 효소의 활성을 억제하는 정도로 측정하였다.

그 결과, 도 10에 개시된 바와 같이 AChE 효소억제를 통해 치매와 같은 퇴행성 뇌질환을 치료하는 치료제로 알려진 타크린 대비 엘라그산 배당체는 100uM 농도에서 50% 정도의 AChE 억제효과를 나타냈으며, 특히 100uM 농도는 엘라그산 보다 엘라그산 배당체의 AChE 억제효과가 약 3배 높게 나타났다.

Claims

140~160mM 수크로스 및 4~6mM 엘라그산의 혼합액에 류코노스톡 메센테로이드(Leuconostoc mesenteroides) 유래의 글루칸수크라제 280~320mU/㎖를 첨가한 후 26~30℃에서 20~28시간 동안 반응하는 단계를 포함하는 엘라그산에 1개의 글루코스가 결합된 엘라그산 배당체의 제조방법.

삭제