KR100873222B1 - 담마레인 트리테르펜 화합물을 함유하는 동맥경화증, 암 및 산화적 스트레스의 예방, 개선 및 치료용 조성물 - Google Patents

담마레인 트리테르펜 화합물을 함유하는 동맥경화증, 암 및 산화적 스트레스의 예방, 개선 및 치료용 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 붉나무로부터 분리한 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물을 함유하는 항산화, 항치매, 동맥경화 억제 및 항암 효과를 가지는 조성물에 관한 것이다. 붉나무 줄기를 추출하여 분리한 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물인 20-하이드록시-24-담마렌-3-온 (20-hydroxy-24-dammaren-3-one), 3-옥소담마르-20,24E-다이엔-26-오익 엑시드 (3-oxodammar-20,24E-dien-26-oic acid), 3-하이드록시-3,19-에폭시담마르-20,24-다이엔-22,26-올라이드 (3-hydroxy-3,19-epoxydammar-20,24-dien-22,26-olide)은 활성산소 저해활성, ACAT 저해활성, 항암 활성을 가지고 있다. 따라서 상기 화합물은 동맥경화증, 치매, 암 및 산화적 스트레스성 질환의 예방, 개선 및 치료에 유용하게 사용될 수 있다.
붉나무, 담마레인 트리테르펜, 동맥경화, 치매, 항산화, 항암, 산화적 스트레스, 건강기능성 식의약품

Description

담마레인 트리테르펜 화합물을 함유하는 동맥경화증, 암 및 산화적 스트레스의 예방, 개선 및 치료용 조성물{Composition for preventing or treating atherosclerosis, cancer and oxidative stress comprising dammarane triterpenes}
도 1은 붉나무의 줄기로부터 추출하여 분리한 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물인 20-하이드록시-24-담마렌-3-온 (20-hydroxy-24-dammaren-3-one)에 대한 질량분석스펙트럼도이고,
도 2는 붉나무의 줄기로부터 추출하여 분리한 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물인 20-하이드록시-24-담마렌-3-온 (20-hydroxy-24-dammaren-3-one)에 대한 핵자기공명 (NMR) 스펙트럼도이고,
도 3은 붉나무의 줄기로부터 추출하여 분리한 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물인 3-옥소담마르-20,24E-다이엔-26-오익 엑시드 (3-oxodammar-20,24E-dien-26-oic acid)에 대한 질량분석스펙트럼도이고,
도 4는 붉나무의 줄기로부터 추출하여 분리한 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물인 3-옥소담마르-20,24E-다이엔-26-오익 엑시드 (3-oxodammar-20,24E-dien-26-oic acid)에 대한 핵자기공명 (NMR) 스펙트럼도이고,
도 5는 붉나무의 줄기로부터 추출하여 분리한 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물인 3-하이드록시-3,19-에폭시담마르-20,24-다이엔-22,26-올라이드 (3-hydroxy-3,19-epoxydammar-20,24-dien-22,26-olide)에 대한 질량분석스펙트럼도이고,
도 6은 붉나무의 줄기로부터 추출하여 분리한 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물인 3-하이드록시-3,19-에폭시담마르-20,24-다이엔-22,26-올라이드 (3-hydroxy-3,19-epoxydammar-20,24-dien-22,26-olide)에 대한 핵자기공명 (NMR) 스펙트럼도이고,
도 7a는 붉나무의 줄기로부터 추출하여 분리한 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물인 3-하이드록시-3,19-에폭시담마르-20,24-다이엔-22,26-올라이드 (3-hydroxy-3,19-epoxydammar-20,24-dien-22,26-olide)의 과산화수소 소거효과에 의한 세포생존율을 나타낸 도이고,
도 7b는 비타민 C의 과산화수소 소거효과에 의한 세포생존율을 나타낸 도이고,
도 8은 붉나무의 줄기로부터 추출하여 분리한 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물인 3-하이드록시-3,19-에폭시담마르-20,24-다이엔-22,26-올라이드 (3-hydroxy-3,19-epoxydammar-20,24-dien-22,26-olide)의 산화질소 (NO) 생성 억제도이고,
도 9는 붉나무의 줄기로부터 추출하여 분리한 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물인 3-옥소담마르-20,24E-다이엔-26-오익 엑시드 (3-oxodammar-20,24E-dien-26-oic acid)의 쥐의 혈관내피세포 (YPEN-1 cell)에서의 활성산소 (ROS) 소거 활성도이다.
본 발명은 항암활성, 콜레스테롤 저하 또는 항산화 활성을 갖는 붉나무 추출물을 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 암, 고지혈증 또는 산화적 스트레스로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물 및 식품 조성물에 관한 것이다.
관상동맥성 심혈관 질환은 일반적으로 과다한 혈중 콜레스테롤 (cholesterol) 농도에 의해 유발되는데, 혈중 콜레스테롤 (cholesterol) 양이 높을 경우 혈관벽에 지방과 더불어 대식세포 (macrophage), 포말세포 (foam cell) 등이 생성 침착되고 플라크 (plaque)를 형성하여 혈액순환을 저해하는 동맥경화증세가 오기 쉽다 (Ross R. Nature, 1993, 362:801-809).
동맥경화의 주요 원인이 되고 있는 혈중 콜레스테롤 (cholesterol) 양을 감소시킬 수 있는 약물을 개발하기 위해 주로 콜레스테롤 (cholesterol)을 콜레스테릴 에스테르 (cholesteryl ester)로 전환시켜 주는 효소인 아실 코에이: 콜레스테롤-o-아실트랜스퍼레이즈 (acyl-coenzyme A: cholesterol-o-acyltransferase, ACAT)의 활성을 저해하거나 지단백질간에 콜레스테롤 (cholesterol) 전이를 매개하는 콜레스테롤 에스테르 전달 단백질 (cholesterol ester transfer protein, CETP)의 작용을 억제하거나, 또는 콜레스테롤 (cholesterol) 생합성에 관여하는 3-하이드록시-3 메틸글루타릴 조효소 A (3-hydroxy-3-methylglutary CoA, HMG-CoA) 환원효소 (reductase)의 작용을 억제하는 물질 탐색이 이루어지고 있다 (Brown et al., 1990, N. Engl. J. Med. 323:1289-1298). 최근에 ACAT는 사람 ACAT1 (hACAT1), 사람 ACAT2 (hACAT2)를 대상으로 연구가 활발하다. hACAT 효소의 활성을 억제하는 물질은 장내 콜레스테롤의 흡수를 억제하여 체내로 유입되는 콜레스테롤의 양을 감소시킬 수 있고 간에서 혈관내로 콜레스테롤이 방출되는 것을 억제하여 혈중 콜레스테롤 농도를 떨어뜨릴 수 있다. 또 혈관벽 세포에 콜레스테롤이 축적되는 것을 방지하여 직접적으로 동맥경화를 예방할 수 있을 것으로 기대되기 때문에 ACAT 저해제 개발은 비교적 부작용이 없는 고지혈증이나 동맥경화증 치료제 개발의 주요한 표적으로 활용되고 있다 (Buhman et al., 2000, Nat. Med. 6:1341-1347).
한편, 최근 상당한 역학적 연구 결과에서 동맥경화증 치료를 위한 3-하이드록시-3 메틸글루타릴 조효소 A 환원효소 (HMG-CoA reductase) 저해제인 스타틴류 (statins) 약제를 복용하는 사람들의 경우, 알츠하이머형 치매 발병율이 감소하고 (Jick et al.,, 2000, Lancet 356:1627-1631), 중추신경계의 콜레스테롤 (cholestrol) 항상성에 영향을 주는 것으로 보고되고 있다 (Fassbender et al., 2002, Neurology 59(8):1257-1258). 또한 최근에는 ACAT 저해제가 강력한 알츠하이머형 치매의 원인물질로 알려진 베타아밀로이드 (β-amyloid)의 생성 조절제로서 알츠하이머형 치매의 치료에 사용될 수 있음이 제안되고 있다 (Puglielli et al., 2001, Nat. Cell Biol. 3(10):905-91; Puglielli et al., 2003, Nat. Neurosci. 6(4):345-351). 특히 베타아밀로이드가 침착되기 전에 ACAT 저해제인 CP-113,818를 단독 또는 스타틴류 (statins) 내지 스타틴 유사 약물과 병용 투여하게 되면 확실히 치매를 유발하는 베타아밀로이드의 병리적 독성을 감소시킬 수 있음이 확인되어 ACAT 저해제와 동맥경화증 치료제인 스타틴류 (statins) 약물이 알츠하이머형 치매 환자에 있어서 상승 치료 (synergy) 효과를 나타낸다고 하였다 (Hutter-Paier et al., 2004, Neuron 44(2):227-238).
지금까지 많은 사람들이 받아들이는 뇌허혈에 의한 신경세포사 기전으로는 2 가지가 있다. 하나는 뇌허혈에 의해서 세포 바깥에 과도한 글루타메이트가 축적되게 되며, 이러한 글루타메이트가 세포내로 유입되어 결국 과도한 세포내 칼슘의 축적으로 신경세포사가 유발된다는 흥분성 신경세포사 기전 (Kang et al., 2001, J. Neurocytol. 30:945-955)과 허혈-재관류시에 갑작스러운 산소 공급으로 인해 생체내 라디칼의 증가로 인해 DNA 및 세포질에 손상을 입어 유발된다는 산화성 신경세포사 2가지 기전이 있다(Won et al., 1999, Brain Res. 836:70-78; Sun & Chen, 1998, J. Biomed. Sci., 5:401-414; Flowers & Zimmerman, 1998, New Horiz, 6:169-180). 슈퍼옥사이드 (superoxide), 하이드록시 라디칼 (hydroxy radical), 과산화수소 (hydrogen peroxide) 등의 활성 산소 (reactive oxygen species, ROS) 와 산화질소 (nitric oxide, NO), 과산화질소 (peroxynitrite, ONOO-)와 같은 활성질소 (Reactive Nitrogen Species, RNS)는 대식세포 (macrophages)나 중성구 (neutrophils)를 포함한 여러 다양한 세포에서 호기성 에너지 대사의 부산물로서 끊임없이 생성된다. 이들의 높은 반응성으로 인해 단백질, 세포막지질 등이 산화, 변성되면서 노화와 관련된 인체의 여러 질병들이 발생될 수 있는 것으로 보고되고 있다. 반면 인체에는 수퍼옥사이드 디스무테이즈 (superoxide dismutase, SOD)를 비롯한 카탈라이제 (catalase), 글루타치온 퍼옥사이드 (glutathione peroxidase) 등과 같은 항산화 효소가 있어 세포손상을 방어하도록 항산화 시스템이 구축되어 있다. 그러나 세포자체의 항산화 시스템으로 방어할 수 없는 정도의 활성산소/활성질소 (ROS/RNS)가 생산되는 경우에는 세포에 스트레스를 주게 되는데 이것을 "산화적 스트레스 (oxidative stress)"라고 한다. 이러한 산화적 스트레스와 그로 인한 세포의 산화적 손상은 많은 질환의 발병 기전에 관련되어 있는 것으로 알려져 있으며, 특히 파킨슨병, 헌팅턴병 또는 치매 등과 같은 퇴행성 뇌질환에 중요한 역할을 하고 있는 것으로 알려져 있다 (Behl et al., 1994, Cell 77:817-827; Coly & Puttfarcken, 1993, Science 262:689-695; Makkesbery, 1997, Free Radical Bio. Med. 23:134-147; Simonian & Coly, 1996, Ann. Rev. Pharmacol., 36:83-106; Benzi et al., 1995, Neurobiol. Aging. 16(4):661-674; Halliwell et al., 2001, Drug Aging. 18(9):685-716). 활성산소에 의한 세포의 산화적 스트레스가 알츠하이머형 치매를 촉진할 수 있어 알츠하이머형 치매 치료를 위해 병인이 되는 베타아밀로이드 (Aβ) 기전에 관여하는 활성산소를 세포내에서 제거하는 항산화제 물질 개발연구가 활발하다. 또 과산화수소 (H2O2) 유도형 독성, 지질과산화 정도 및 항산화 효소 활성에 대한 심황 물추출물의 영향를 연구한 보고에서는 150 μM 농도의 과산화수소 (H2O2)에 30분간 노출된 세포들이 현저한 세포사멸과 카탈라아제 (catalase), 글루타치온 퍼옥사이드 (glutathione peroxidase) 효소 활성 감소를 가져오는 반면, 과산화수소 (H2O2) 노출전에 세포에 심황 물추출물을 처리한 구에서는 유의성 있게 세포생존율이 높아지고, 항산화 효소 활성도 높아졌음이 보고된 바 있다 (Koo et al., 2004, Life Sci. 75(19):2363-2375). 따라서 활성산소와 활성질소를 효과적으로 소거할 수 있는 화합물은 일반적인 항산화제의 기능과 더불어 특히 산화적 스트레스에 대하여 뇌신경세포를 보호하고 베타아밀로이드에 기인한 치매의 예방과 치료에도 효과적인 조성물이 될 수 있다.
한편, 중추신경계의 신경교세포는 아스트로사이트 (astrocyte), 올리고덴드로사이트 (oligodendrocyte) 그리고 마이크로글라이아 (microglia)로 구분되며, 이중 마이크로글라이아 세포는 전체 뇌세포의 5-10%를 차지하는 신경계의 염증세포로서 정상상태의 뇌에서의 기능은 잘 밝혀져 있지 않으나 외상, 퇴행성 뇌질환 등의 원인에 의해 뇌 손상이 발생하면 활성화되어 대식세포 (macrophage)와 유사한 면역작용을 담당하는 것으로 보고되어 있다 (Minghetti et al., 1998, Prog. Neurobiol. 54(1):99-125). 활성화된 마이크로글라이아 세포는 정상상태와 달리 포식작용 (phagocytosis)이 활발해지고 세포증식을 하며 각종 사이토카인(cytokine), 유도형 산화질소 생성효소 (inducible nitric oxide synthase, iNOS) 및 사이클로옥시게나제-2 (cyloocygenase-2, COX-2) 등의 유전자를 발현시켜 각종 염증매개 물질을 생산한다 (Dawson et al., 1993, J. Neurosci. 13:2651-2661). 이와 같은 경로로 생산된 염증매개 물질이 알츠하이머형 치매, 파킨슨병, 뇌졸중 같은 퇴행성 뇌질환이 원인이 된다고 보고되어 있다 (Wood et al., 1995, Neurol. Res. 17:242-248). 유도형 산화질소 생성효소 (iNOS)는 칼슘에 비의존적이며 평소에는 활성화되지 않으나 일단 지질다당체 (lipopolysaccharide, LPS)의 자극에 의해 그 발현이 유도되면 장시간 동안 다량의 산화질소를 생성하고, 인터페론-gamma (Interferon-gamma, INF-gamma), 인터루킨-1beta (Interleukin-1beta), 암세포사멸인자-alpha (Tumor necrosis factor-alpha, TNF-alpha) 등의 염증성 사이토카인을 생성한다 (Mayer et al., 1991, FEBS Lett. 288:187-191). 유도형 산화질소 생성효소에 의해 생성된 과도한 산화질소와 염증성 사이토카인의 생성은 프로스타글란딘 (prostaglandins)과 같은 염증매개체의 생합성을 촉진하게 되어 염증을 심화시키거나 신경세포사멸 등을 유도하므로 뇌질환의 발병에 깊이 관여하게 된다.
한편 암은 점차 발병율이 증가 되고 있는 질환으로서 일반적으로 항암 치료제는 화학요법제와 생물요법제로 분류된다. 화학용법제는 약물요법제이고, 생물요법제는 면역요법제나 유전자치료제 등을 말하는데 아직은 암세포주에 세포독성을 보이는 항암물질을 투여하는 화학요법에 의한 항암제가 주류를 이루고 있다. 그런데 현재 미국에서 상용화된 90여종의 항암제 중에서 약 62%가 식물체 또는 미생물 대사산물 등에서 유래한 천연물로부터 개발되었다. 따라서 아직 미개발된 식물자원 유래의 암세포주에 대한 세포독성 물질은 효과적으로 암을 예방하거나 개선 또는 치료에 효과적인 조성물로서 이용할 수 있을 것이다.
붉나무 (Rhus chinensis Mill.)는 옻나무과 (Anacardiaceae)의 낙엽소교목으로 오배자나무라고도 한다. 잎자루 날개에 진딧물의 1종이 기생하여 벌레혹 (충영)을 만들며 이것을 오배자 (五倍子, Galla rhois)라고 한다. 오배자는 타닌이 많이 들어 있어 약으로 이용하거나 잉크의 원료로 이용한다. 벌레혹 안에는 날개가 달린 암벌레 1만 마리 내외가 들어 있으며, 근처의 이끼 틈에서 겨울을 지낸다. 한국·일본·중국·인도 등지에 주로 분포하고 있다. 민간에서는 지혈과 피부병, 충독, 설사를 다스리는 약재로 쓰이며, 강한 쓴맛으로 탄닌을 다량 함유하여 강력한 수렴작용을 한다. 매염재를 섞어 천연염료로도 사용된다. 최근에는 오배자 추출물이 가축질병 균주에 대한 항균활성 (최 일, 2003, 한국식품영양과학회지, 32(8):1214-1220), 식후 장에서의 탄수화물 흡수를 저해함으로써 혈당상승을 억제하는 효과 (Shim et. al., 2003, J. Ethnopharmacol. 85:283-287) 및 타이로신네이즈 저해제(tyrosinase inhibitor)로서 미백효과가 있는 것으로 보고되었고 (Kim et al., 1997, J. Food Sci. Nutr. 2(4):285-290) 붉나무의 수피 추출물의 항산화 효과 (이연재 등, 1993, 한국식품과학회지 25(6):677-682) 등도 보고되었다. 항산화, 항암효과는 주로 갈릭 엑시드 (gallic acid), 메틸갈레이트(metyl gallate) 등 페놀성 화합물의 작용에 기인하는 것으로 알려져 있다. 붉나무 수피의 성분으로는 그 외 엘라직 엑시드 (ellagic acid), 시키믹 엑시드 (sikimic acid), 퀘시트린 (quercitrin), 마이리시트린 (myricitrin), 갈로타닌 (gallotannin), 스코폴레틴 (scopoletin), 스코폴린 (scopolin), 오시놀 (orcinol), 오시놀 배당체 (orcinol-β-D-glucoside) 등이 보고되었다 (정선채 등, 1999, 한국생약학회지 30(3):295-300; Matsuda, 1966, Chem. Pharm. Bull. 14(8):877-883). 한편 최근에는 역시 붉나무 수피로부터 세미아라틱 엑시드 (semialactic acid)를 비롯하여 세미아락톤 (semialactone), 아이소포퀴에론 펄옥사이드 (isofouquierone peroxide)와 포퀴에론 (fouquierone) 등의 신물질이 보고되기도 하였다 (Lee et al., 2001, Chem. Pharm. Bull. 49(8):1024-1026). 또한, 본 발명자들은 최근에 3-옥소담마르-20,24E-다이엔-26-오익 엑시드 (3-oxodammar-20,24E-dien-26-oic acid)를 분리하고 이 화합물의 파네실전달 효소 (Farnesyl-protein transferase, FPTase) 저해활성과 폐암세포 등 5종의 인체 유해 암세포주에 대한 세포독성을 구명하여 특허출원한 바 있다(대한민국 특허출원 제 10-2005-0002007호). 그러나 붉나무로부터 최근에 분리, 보고된 트리테르펜 화합물에 대해서는 생리활성에 대한 연구 보고는 미흡한 편이다.
본 발명자들은 전통적으로 약재로서 이용되고 있는 오배자의 생산 수목인 붉나무의 줄기, 잎 추출물을 이용하여 항치매 관련 활성 물질을 발견하기 위하여 연구하던 중, 비교적 생리활성 연구가 미흡한 붉나무 줄기로부터 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물들을 분리, 정제하였고, 이 화합물들이 ACAT 저해 활성, 활성산소 (reactive oxygen species, ROS)와 펄옥시나이트라이트 (peroxynitrite, ONOO-) 소거활성, 과산화수소 (hydrogenperoxide, H2O2) 소거활성, 산화질소 (NO) 생성 억제효과 및 암세포주에 대한 항암활성 등을 갖고 있어 이 화합물들이 동맥경화증, 치매, 암 및 산화적 스트레스성 질환의 예방, 개선 및 치료에 유용하게 사용될 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 항암활성, 콜레스테롤 저하 또는 항산화 활성을 갖는 붉나무 추출물을 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 암, 고지혈증 또는 산화적 스트레스로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 항암활성, 콜레스테롤 저하 또는 항산화 활성을 갖는 붉나무 추출물을 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 암, 고지혈증 또는 산화적 스트레스로 인한 질환의 예방 및 치료용 식품 조성물을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 항암활성, 콜레스테롤 저하 또는 항산화 활성을 갖는 붉나무 추출물을 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 암, 고지혈증 또는 산화적 스트레스로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 붉나무 추출물의 유효성분인 하기 화학식 1의 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물인 20-하이드록시-24-담마렌-3-온 (20-hydroxy-24-dammaren-3-one) 및 하기 화학식 3의 3-하이드록시-3,19-에폭시담마르-20,24-다이엔-22,26-올라이드 (3-hydroxy-3,19-epoxydammar-20,24-dien-22,26-olide)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 고지혈증, 동맥경화증, 알츠하이머형 치매 및 심근경색증으로 이루어진 그룹에서 선택되는 산화적 스트레스로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 붉나무 추출물의 유효성분인 하기 화학식 2의 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물인 3-옥소담마르-20,24E-다이엔-26-오익 엑시드 (3-oxodammar-20,24E-dien-26-oic acid) 및 하기 화학식 3의 3-하이드록시-3,19-에폭시담마르-20,24-다이엔-22,26-올라이드 (3-hydroxy-3,19-epoxydammar-20,24-dien-22,26-olide)으로 이루어지 군에서 선택된 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병 뇌졸중 및 치매로 이루어진 그룹에서 선택되는 산화적스트레스로 인한 질환의 예방 및 치료용 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 붉나무 추출물의 유효성분인 하기 화학식 1의 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물인 20-하이드록시-24-담마렌-3-온 (20-hydroxy-24-dammaren-3-one) 및 하기 화학식 3의 3-하이드록시-3,19-에폭시담마르-20,24-다이엔-22,26-올라이드 (3-hydroxy-3,19-epoxydammar-20,24-dien-22,26-olide)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 화합물을 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 폐암, 난소암, 피부암, 중추신경암, 또는 결장암의 예방, 개선 및 치료용 건강기능식품 및 약학적 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명은 항암활성, 콜레스테롤 저하 또는 항산화 활성을 갖는 붉나무 추출물을 유효성분으로 함유하고, 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 건강기능식품을 제공한다. 상기 붉나무 추출물의 유효성분은 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3으로 이루어진 그룹에서 선택된다.
< 화학식 1 >
Figure 112006034432310-pat00001
< 화학식 2 >
Figure 112006034432310-pat00002
< 화학식 3 >
Figure 112006034432310-pat00003
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에서는 붉나무 추출물의 유효성분인 상기 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물인 화학식 1의 20-하이드록시-24-담마렌-3-온 (20-hydroxy-24-dammaren-3-one), 화학식 2의 3-옥소담마르-20,24E-다이엔-26-오익 엑시드 (3-oxodammar-20,24E-dien-26-oic acid) 및 화학식 3의 3-하이드록시-3,19-에폭시담마르-20,24-다이엔-22,26-올라이드 (3-hydroxy-3,19-epoxydammar-20,24-dien-22,26-olide)가 붉나무의 줄기로부터 당업계에 공지된 통상적인 방법에 따라 추출될 수 있으나, 바람직하게는 붉나무의 줄기를 저급 알코올로 추출하여 얻을 수 있다. 구체적으로는 붉나무 줄기를 메탄올로 추출한 후, 에틸아세테이트, 물을 이용하여 분배추출하고 감압 농축하여 얻은 분획물에 대하여 실리카겔 컬럼 크로마토그래피 (silica gel column chromatography)를 실시하여 얻었다. 이때 사용한 전개용매는 공지된 다양한 유기용매가 사용될 수 있으나, 바람직하게는 n-헥산과 에틸아세테이트 혼합용매가 사용될 수 있다.
본 발명에서는 상기 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물인 20-하이드록시-24-담마렌-3-온 (20-hydroxy-24-dammaren-3-one) 및 3-하이드록시-3,19-에폭시담마르-20,24-다이엔-22,26-올라이드 (3-hydroxy-3,19-epoxydammar-20,24-dien-22,26-olide)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 화합물을 함유하는 동맥경화증 및 치매의 예방, 개선 및 치료용 건강기능식품 소재 및 약학적 조성물을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물이 동맥경화증의 예방, 개선 및 치료용으로 사용될 수 있는지 확인하기 위하여 ACAT 활성 저해 측정방법을 이용하였다. ACAT는 작용기전이 확실하고 부작용이 없는 새로운 심혈관 질환 치료제의 주요 타켓 효소로서 간접적으로 베타아밀로이드의 생성을 조절하면서 또 콜레스테릴 에스테르 (cholesteryl ester) 생성을 감소시키기 때문에 동맥경화증 및 알츠하이머형 치매 예방과 치료의 두 가지 목적에 동시에 적용할 수 있는 조성물로서 사용할 수 있다. 본 발명의 화학식 1의 화합물 1과 화학식 3의 화합물 3은 사람 ACAT1과 사람 ACAT2에 대한 효소 저해활성이 우수하였다. 따라서 본 발명의 화합물 1과 3은 콜레스테롤 에스테르의 합성 및 축적으로 유발되는 고지혈증, 관상동맥 심장병, 동맥경화증 및 심근경색증과 같은 심장순환계 질환과 알츠하이머형 치매의 예방 및 개선, 치료용 건강기능식품 소재 및 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
한편, 본 발명에서는 상기 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물이 뇌신경세포의 산화적 스트레스에 대한 독성을 억제하여 뇌신경세포의 보호효과가 있는지를 확인하기 위하여 신경세포의 일종인 흰쥐의 갈색세포종 (pheochromocytoma-12; PC12)을 배양하여 활성산소종의 하나인 과산화수소 (H2O2) 소거능을 측정하여 상기 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물들의 과산화수소 유도 독성에 대한 정도를 조사하였다. 그 결과, 화학식 3의 화합물 3은 10, 100 μM 농도 처리에서 모두 대조구 (control)보다 세포생존율이 증가하고, 천연 항산화제로 인정되는 비타민 C보다도 과산화수소 소거활성이 우수한 것으로 확인되었다.
또한, 본 발명에서는 상기 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물이 뇌에 존재하는 대식세포인 마이크로글라이아 (microglia) 세포의 활성화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 지질다당체로 활성화시킨 1차 마이크로글라이아 세포에 화합물을 처리하여 산화질소의 생성량을 측정하였다. 그 결과 산화질소의 화학식 3의 화합물 3이 10 ㎍/㎖ 처리군에서 산화질소 생성을 억제하는 효과를 나타내었다. 따라서 화학식 3의 화합물 3은 독성물질로부터 뇌신경세포를 보호하는 효능이 우수하여 퇴행성 뇌질환 등에서 신경세포를 효과적으로 보호하는 건강기능식품 소재 및 약학적 조성물로서 유용하게 이용할 수 있다.
한편, 본 발명에서는 상기 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물인 20-하이드록시-24-담마렌-3-온 (20-hydroxy-24-dammaren-3-one) 및 3-하이드록시-3,19-에폭시담마르-20,24-다이엔-22,26-올라이드 (3-hydroxy-3,19-epoxydammar-20,24-dien-22,26-olide)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 화합물을 함유하는 폐암, 난소암, 피부암, 중추신경암, 결장암의 예방, 개선 및 치료용 건강기능식품 소재 및 약학적 조성물을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 화학식 1, 3으로 표시되는 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물의 항암활성을 조사하기 위하여 에스알비 법(sulforhodamine B, SRB 법, Skehan, et al., Prox. Am. Assoc. Cancer Res. 30:612)을 사용하여 폐암, 난소암, 피부암, 중추신경암, 결장암 등 5종의 세포주의 성장억제 정도를 측정하였다. 이때 인체암세포주로는 폐암세포주인 A549, 난소암세포주인 SK-OV-3, 피부암세포주인 SK-MEL-2, 중추신경암세포주인 XF498, 결장암세포주인 HCT15를 사용하였다. 그 결과 상기 화학식 1, 3의 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물들이 5종의 암세포주에 대해 성장을 강하게 억제하는 활성을 나타냄을 확인하였다. 이 때 대조군으로 합성 항암제인 독소루비신 (doxorubicin)을 사용하였는데 상기 화학식 1, 3의 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물들이 대조군보다 전체적으로 세포독성이 상대적으로 약하였지만 천연물질로서는 강한 항암활성을 보유한 것으로 인정되어 암 예방, 개선 및 치료용 건강기능식품 소재 및 약학적 조성물로서 유용하게 사용될 수 있다.
한편, 본 발명에서는 화학식 2의 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물인 3-옥소담마르-20,24E-다이엔-26-오익 엑시드 (3-oxodammar-20,24E-dien-26-oic acid)를 함유하는 항산화제로서 산화적 스트레스 관련 질환의 예방, 개선 및 치료용 건강기능식품 소재 및 약학적 조성물을 제공하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 상기 화학식 2의 화합물 2의 항산화 효과를 확인하기 하기 위하여, 동물조직의 홈모게네이트 (homogenate)를 활성산소원으로 이용한 활성산소 (ROS) 소거활성 실험, 세포배양실험을 이용한 활성산소 (ROS) 소거활성 측정 실험 및 과산화질소 (ONOO-) 소거활성 실험을 수행하였다. 즉, 활성산소 (ROS)가 다량 생성되도록 유도하는 지질다당체 (LPS)를 처리한 노화 쥐의 간의 포스트 미토콘드리아 (post mitochondria, PM) 분획을 분리하여 화합물 처리에 대한 PM 자체의 활성산소 (ROS) 소거활성을 측정하였고, 세포실험에서는 랫드 (rat)의 혈관내피세포 (YPEN-1 cell)를 사용하여 시약으로 유도된 활성산소 (ROS)의 소거활성을 측정하였다. 그 결과 상기 화학식 2의 화합물 2는 쥐의 간조직과 혈관내피세포에서 우수한 활성산소 소거능을 나타내고 또, 과산화질소 (ONOO-) 소거활성 나타냄을 확인하였다. 또한 따라서 화합물 2는 산화적 스트레스에 기인한 세포의 산화적 손상으로 유발되는 질환의 예방, 개선 및 치료용 건강기능식품 소재 및 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
상기 목적을 위하여 본 발명의 조성물은 투여를 위하여 상기 기재한 유효성분 이외에 추가로 약제학적 분야에서 통상적으로 허용되는 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토 덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올 등과 같은 담체 (carrier) 및 부형제 (forming agent)를 1종 이상 포함하여 제조할 수 있다. 또한 필요에 따라 완충액, 정균제 등 통상의 첨가제를 첨가할 수 있으며 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 부가제를 첨가하여 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에머졀, 시럽, 에어로졸과 같은 경구적 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화 할 수 있다. 이렇게 제조된 약제학적 제제는 목적하는 방법에 따라 경구적으로 투여되거나 비경구적으로 국소 적용될 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 붉나무 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 암, 고지혈증 또는 산화적 스트레스로 인한 질환의 예방 및 치료용 건강 기능 식품을 제공한다. 본 발명의 붉나무 추출물을 포함하는 조성물은 고지혈증 또는 산화적 스트레스로 인한 질환의 예방을 위한 약제, 식품 및 음료 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 발명의 추출물로부터 얻은 붉나무 추출물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 각종 식품류, 예를 들어, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강보조 식품류 등이 있으며, 환제, 분말, 과립, 침제, 정제, 캡슐 또는 음료인 형태로 사용할 수 있다. 이때, 식품 또는 음료 중의 상기 추출물로부터 얻은 붉나무 추출물의 양은, 일반적으로 본 발명의 건강식품 조성물의 경우 전체 식품 중량의 0.01 내지 15 중량%로 가할 수 있으며, 건강 음료 조성물의 경우 100㎖를 기준으로 0.02 내지 10g, 바람직하게는 0.3 내지 1g의 비율로 가할 수 있다. 본 발명의 건강 음료 조성물은 지시된 비율로 필수 성분으로서 상기 추출물로부터 얻은 붉나무 추출물을 함유하는 외에는 액체성분에는 특별한 제한점은 없으며 통상의 음료와 같이 여러 가지 향미제 또는 천연 탄수화물 등을 추가 성분으로서 함유할 수 있다. 상술한 천연 탄수화물의 예로는 모노사카라이드, 예를 들어, 포도당, 과당 등 디사카라이드, 예를 들어 말토스, 슈크로스 등 폴리사카라이드, 예를 들어 덱스트린, 시클로덱스트린 등과 같은 통상적인 당 및 자일리톨, 소르비톨, 에리트리톨 등의 당알콜이다. 상술한 것 이외의 향미제로서 천연 향미제 (타우마틴, 스테비아 추출물 (예를 들어 레바우디오시드 A, 글리시르히진 등)) 및 합성 향미제 (사카린, 아스파르탐 등)를 유리하게 사용할 수 있다. 상기 천연 탄수화물의 비율은 본 발명의 조성물 100 ㎖당 일반적으로 약 1 내지 20g, 바람직하게는 약 5 내지 12g이다. 상기 외에 본 발명의 조성물은 여러 가지 영양제, 비타민, 광물 (전해질), 합성 풍미제 및천연 풍미제 등의 풍미제, 착색제 및 중진제 (치즈, 초콜릿 등), 펙트산 및 그의 염, 알긴산 및 그의 염, 유기산, 보호성 콜로이드 증점제, pH 조절제, 안정화제, 방부제, 글리세린, 알콜, 탄산 음료에 사용되는 탄산화제 등을 함유할 수 있다. 그밖에 본 발명의조성물들은 천연 과일 쥬스 및 과일 쥬스 음료 및 야채 음료의 제조를 위한 과육을 함유할 수 있다. 이러한 성분은 독립적으로 또는 조합하여 사용할 수 있다. 이러한 첨가제의 비율은 그렇게 중요하진 않지만 본 발명의 조성물 100 중량부 당 0 내지 약 20 중량부의 범위에서 선택되는 것이 일반적이다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명의 예시일 뿐이므로 본 발명이 하기의 실시예에 의하여 한정되는 것으로 간주되어서는 아니 된다.
(실시예 1) 붉나무로부터 화학식 1, 2, 3의 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene)화합물의 분리 및 정제
붉나무로부터 화학식 1, 2, 3의 화합물을 분리하는 방법에 관하여 하기에서 상세히 설명한다.
붉나무 (Rhus chinensis)의 줄기는 2003년 6월 초에 경기도 수원시 서둔동에 위치한 여기산에서 채집하였다. 세척 후 줄기는 10 cm 정도 잘라서 음건한 후 분쇄 직전 60℃에서 1일 정도 열풍 건조한 다음 분쇄하여 시료로 사용하였다. 채집 후 세척한 붉나무 줄기는 잘게 세절하여 60℃에서 건조한 후 분쇄하였다. 건조 후 분쇄한 붉나무 줄기 (6 kg)를 실온에서 메탄올 (20 L)을 사용하여 5회 추출하고 여과액을 모아 감압 농축하여 365.2 g의 메탄올 추출물을 얻었다. 이 메탄올 추출물을 물/에틸아세테이트 (1:1, 4 L) 혼합용매로 5회 용매 분배한 후 에틸아세테이트층을 감압 농축하여 165 g의 에틸아세테이트 분획을 얻었다.
상기 에틸아세테이트 분획 60 g을 대상으로 실리카겔 (silica gel, Merck 70-230mesh) 1000 g을 충진 시킨 지름 7 cm의 칼럼에서 전개용매로서 헥산/에틸아세테이트 혼합용매를 사용하여 비율을 15:1에서 1:20까지 변화시키거나 에틸아세테이트/메탄올 혼합용매를 사용하여 비율을 20:1에서 5:1로 변화시키면서 용출을 하여 칼럼 크로마토그래피하여 500 ㎖씩 총 614개의 분획을 분취한 후 TLC (Thin layer chromatography) 분석으로 유사한 성분패턴의 분취액은 서로 합쳐 농축하여 최종 49개의 소분획을 얻었다. 이 중 9번 소분획을 메탄올로 재결정하여 무색 침상결정의 화합물 1을 110 mg, 18번 소분획을 메탄올로 재결정하여 백색의 분말상의 화합물 2를 25 mg, 29번 소분획을 메탄올로 재결정하여 백색의 분말상 화합물 3을 240 mg 씩 각각 얻었다.
(실시예 2) 붉나무로부터 분리, 정제한 화합물 1, 2, 3의 이화학 특성 분석
2-1) 화합물 1의 이화학적 특성
상기 화합물 1의 이화학적 특성은 하기와 같다.
(1) 물질의 성상 : 무색침상결정
(2) 분자량 : 442 ( CIMS (m/z) [M + H]+ = 443 )
화합물 1의 질량분석은 질량분석기 (mass spectrometer, JEOL JMS-AX505WA, HP 5890 Series I)에서 측정하였으며 질량분석 스펙트럼은 도 1에 제시하였다.
(3) 분자식 : C30H50O2
(4) 핵자기공명스펙트럼
상기 화합물 1은 완전히 건조하여 클로르포름-d(CDCl3)을 용매로 하여 녹인 후 핵자기공명분광기 (Varian 400 MHz NMR spectromete)에서 핵자기공명스펙트럼을 측정하였다. 수소핵자기공명스펙트럼, 탄소핵자기공명스펙트럼, 무변조증강극성전달스펙트럼(DEPT)의 결과는 표 1과 도 2에서 나타내었다.
이상의 분석 결과, 화합물 1은 상기 화학식 1과 같이 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물의 일종인 20-하이드록시-24-담마렌-3-온 (20-hydroxy-24-dammaren-3-one)인 것으로 결정할 수 있었다.
2-2) 화합물 2의 이화학적 특성
상기 화합물 2의 이화학적 특성은 하기와 같다.
(1) 물질의 성상 : 백색 분말상
(2) 분자량 : 454 ( CIMS (m/z) [M + H]+ = 455 )
화합물 2의 질량분석은 질량분석기 (mass spectrometer, JEOL JMS-AX505WA, HP 5890 Series I)에서 측정하였으며 질량분석 스펙트럼은 도 3에 제시하였다.
(3) 분자식 : C30H46O3
(4) 핵자기공명스펙트럼
상기 화합물 2는 완전히 건조하여 클로르포름-d (CDCl3)을 용매로 하여 녹인 후 핵자기공명분광기 (Bruker AVANCE-600 NMR spectromete)에서 핵자기공명스펙트럼을 측정하였다. 수소핵자기공명스펙트럼, 탄소핵자기공명스펙트럼, 무변조증강극성전달스펙트럼(DEPT)의 결과는 표 2와 도 4에 나타내었다.
이상의 분석 결과, 화합물 2는 상기 화학식 2와 같이 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물의 일종으로서 3-옥소담마르-20,24E-다이엔-26-오익 엑시드 (3-oxodammar-20,24E-dien-26-oic acid)인 것으로 결정할 수 있었다.
2-3) 화합물 3의 이화학적 특성
상기 화합물 3의 이화학적 특성은 하기와 같다.
(1) 물질의 성상 : 백색 분말상
(2) 분자량 : 468 ( EIMS (m/z) [M]+ = 468)
화합물 3의 질량분석은 질량분석기 (mass spectrometer, JEOL JMS-AX505WA, HP 5890 Series I)에서 측정하였으며 질량분석 스펙트럼은 도 5에 제시하였다.
(3) 분자식 : C30H44O4
(4) 핵자기공명스펙트럼
상기 화합물 3은 완전히 건조하여 클로르포름-d(CDCl3)을 용매로 하여 녹인 후 핵자기공명분광기 (Bruker AVANCE-600 NMR spectromete)에서 핵자기공명스펙트럼을 측정하였다. 수소핵자기공명스펙트럼, 탄소핵자기공명스펙트럼, 무변조증강극성전달스펙트럼(DEPT)의 결과는 표 3과 도 6에 나타내었다.
이상의 분석 결과, 화합물 3은 상기 화학식 3과 같이 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물의 일종으로서 3-하이드록시-3,19-에폭시담마르-20,24-다이엔-22,26-올라이드 (3-hydroxy-3,19-epoxydammar-20,24-dien-22,26-olide)인 것으로 결정할 수 있었다.
[표 1] 화합물 1의 핵자기공명스펙트럼 데이터
Figure 112006034432310-pat00004
[표 2] 화합물 2의 핵자기공명스펙트럼 데이터
Figure 112006034432310-pat00005
[표 3] 화합물 3의 핵자기공명스펙트럼 데이터
Figure 112006034432310-pat00006
(실시예 3) 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물들의 ACAT 효소 저해 활성 측정
상기 실시예 1에서 붉나무 줄기로부터 분리, 정제한 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물이 동맥경화증, 고지혈증 등 심장순환계 질환을 예방, 개선 및 치료용 조성물로 이용될 수 있는지 확인하기 위하여 ACAT 효소 저해 활성을 측정하였다.
3-1) hACAT1과 hACAT2 효소원 제조
hACAT1과 hACAT2 효소원 제조는 조 등의 방법으로 하였는데 (Cho et al., 2003, Biochem. Bioph. Res. Co. 309(4):864-872), hACAT1과 hACAT2 효소원은 베큘로바이러스 발현체제를 이용하여 사람 ACAT-1과 ACAT-2 단백질을 얻었다. 사람 간 cDNA 라이브러리 스크리닝을 통하여 얻어진 hACAT1과 hACAT2의 cDNA를 베큘로바이러스 전달 벡터 (baculoviruses transfer vector)에 삽입하고, 곤충세포인 sf9 세포에 도입하여 바이러스를 제조하였다. 그 후, 플라크 정제 (plaque purification) 방법으로 hACAT1과 hACAT2의 재조합 바이러스를 분리한 후 3 차례의 증폭과정을 거쳐 바이러스 배양액의 역가를 높였다. 단백질 발현효율이 좋은 Hi5 곤충세포에 재조합 바이러스를 감염다중도 (Mutiplicity of Infection)가 1이 되도록 감염시킨 후 27℃에서 하루 동안 진탕 배양하였다. 이렇게 hACAT1과 hACAT2가 각각 과량 발현된 Hi5 세포들로부터 마이크로좀 분획 (microsomal fraction)을 분리하기 위하여 500 ×g에서 15 분간 원심분리하여 세포들을 모으고 저삼투압 완충액에서 급냉동/급해동 (freezing & thawing) 방법으로 세포막을 부수어 단백질을 노출시키고 100,000 ×g에서 한 시간 동안 초원심 분리하였다. 얻어진 마이크로좀 분획 (microsomal fraction)들은 단백질 농도가 8 mg/㎖이 되도록 저장완충액으로 현탁하여 사용 전까지 70℃의 저온 냉동고에 보관하였다.
3-2) ACAT 저해 활성 측정
ACAT 저해 활성 측정은 브레철와 창의 방법과 (Brecher & Chan, 1980, Biochimica et Biophysica Acta (BBA) - Lipids and Lipid Metabolism 617(3):458-471) 이를 약간 변형한 조 등의 방법으로 하였다 (Cho et al., 2003, Bioch. Bioph. Res. Co. 309(4):864-872). 즉, 아세톤에 1 mg/㎖의 농도로 용해된 콜레스테롤 용액 6.67 ㎕를 아세톤 중의 10 % 트리톤 (triton) WR-1339 6 ㎕와 혼합하고, 질소가스를 이용하여 아세톤을 증발시켜 제거하였다. 얻어진 혼합물에 증류수를 가하여 콜레스테롤의 농도가 30 mg/㎖가 되도록 조절하면서 콜레스테롤 수용액을 제조하였다. 10 ㎕의 콜레스테롤 수용액에 10 ㎕의 0.5 M KH2PO4 buffer (pH 7.4), 5 ㎕의 0.6 mM 우혈청알부민 (bovine serum albumin, BSA), 상기 3-1) 과정에서 얻은 마이크로좀 분획 (microsomal fraction) 10 ㎕, 활성검정용 시료액 (담마레인 트리테르펜 화합물 1, 3) 10 ㎕ 및 45 ㎕의 증류수를 가하여 총 90 ㎕인 혼합물을 제조하였다. 혼합물을 37℃ 수욕에서 30 분 동안 예비 반응시켰다. 10 ㎕의 [1-14C] 올레일-CoA 용액 (0.05 μCi, 최종 농도: 10 μM)을 예비 반응된 혼합물에 가하고, 생성된 혼합물을 37℃ 수욕에서 다시 30 분 동안 반응시켰다. 혼합물에 500 ㎕의 이소프로판올:헵탄 혼합물 (isopropanol : heptane) (4:1, v/v), 300 ㎕의 헵탄 및 200 ㎕의 0.1 M KH2PO4 (pH 7.4)을 가하고, 혼합물을 볼텍스 (vortex)로 격렬하게 혼합한 후, 상온에서 2분 동안 방치하였다. 200 ㎕의 생성된 상층액을 신틸레이션 병 (scintillation vial)에 넣고, 신틸레이션 용액 (Lumac) 4 ㎖를 첨가하였다. 이 혼합물의 방사선량을 1450 마이크로베타 액체 신틸레이션 계수기 (Microbeta liquid scintillation counter, Wallac, Finland)로 측정하였다. 양성 대조군으로는 oleic acid anilide를 사용하였으며, 다음과 같은 방법으로 저해율을 계산하였다. 그 결과는 하기 표 4, 5에 나타내었다.
ACAT 저해도 (%) = [1 - {CPM(T) - CPM(C2)} / {CPM(C1) - CPM(B)}] × 100
CPM(T): 시료와 효소를 넣었을 때의 CPM 값
CPM(C1): 시료를 넣지 않고, 효소는 넣었을 때의 CPM 값
CPM(C2): 시료는 넣고, 효소는 넣지 않았을 때의 CPM 값
CPM(B): 효소와 시료를 넣지 않았을 때의 CPM 값
* CPM: Count per minute
[표 4] 화합물 1의 ACAT 효소 저해 활성
효소원 IC50 (μM)
hACAT1 12.4
hACAT2 30.5
[표 5] 화합물 3의 ACAT 효소 저해 활성
효소원 IC50 (μM)
hACAT1 79.1
hACAT2 76.9
표 4와 표 5에 나타난 바와 같이, 본 발명의 화합물 1의 사람 ACAT1과 사람 ACAT2에 대한 IC50 값은 각각 12.4 μM, 30.5 μM 이고, 화합물 3의 사람 ACAT1과 사람 ACAT2에 대한 IC50 값은 각각 79.1 μM, 76.9 μM로 나타났다. 특히 화합물 1은 반묘 추출물에서 분리, 정제한 화합물로서 ACAT 저해효과가 우수하여 특허출원된 (출원번호 : 10-2003-0090408) 마이라센 2와 마이라센 3의 ACAT 저해효과 (hACAT의 IC50 = 54 ~ 85 μM) 보다 더 우수한 ACAT 효소 저해 효과를 나타내었다.
따라서 본 발명의 20-하이드록시-24-담마렌-3-온 (20-hydroxy-24-dammaren-3-one) 및 3-하이드록시-3,19-에폭시담마르-20,24-다이엔-22,26-올라이드 (3-hydroxy-3,19-epoxydammar-20,24-dien-22,26-olide)은 ACAT 활성을 효과적으로 억제함을 알 수 있고, 콜레스테롤 에스테르의 합성 및 축적으로 유발되는 고지혈증, 관상동맥 심장병, 동맥경화증 및 심근경색증과 같은 심장순환계 질환의 예방 및 개선, 치료용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 또한 간접적으로 베타아밀로이드의 생성을 억제함을 기대할 수 있어 알츠하이머성 치매의 예방 및 개선, 치료용 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
(실시예 4) 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물들의 과산화수소 독성 억제도 측정
상기 실시예 1에서 붉나무 줄기로부터 분리, 정제한 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물이 산화적 스트레스에 의한 뇌신경세포 독성의 억제 효과를 확인하기 위하여 과산화수소를 처리하여 뇌신경세포 독성을 유발하였으며 화합물의 처리에 의한 독성 억제 정도를 세포생존율로서 조사하였다. 화합물의 과산화수소 독성 억제 효과에 의한 세포생존율 조사방법을 보다 상세히 설명하면 하기와 같다.
신경세포의 일종인 흰쥐의 갈색세포종 (pheochromocytoma-12; PC12) 세포주는 미국 표준 균주 (ATCC, American Type Culture Collection, USA)에서 구입하여 사용하였다. PC12 세포는 RPMI-1640 배지에 10% 말혈청 (horse serum), 5% 우태혈청 (FBS, fetal bovine serum, Gibco-BRL, 영국), 1% 페니실린/스트렙토마이신 (penicillin/streptomycin, Gibco-BRL, 영국)이 들어간 배지를 사용하여 37℃, 5% 이산화탄소 조건에서 배양하였다. 실험 하루 전날 세포를 96 well에 2 × 104 /well/200 ㎕의 밀도로 분주하였으며 실험 당일 날, 배지를 혈청이 들어있지 않은 RPMI 배지로 바꾸어 주었다.
처리할 시료는 최종 농도 대비 40배 농도액으로 만들어 96 well의 경우 1시간 전에 각 well 당 5 ㎕ 씩 첨가하였다. 시료의 반응액 중 최종농도는 1, 10, 100 μM 등 3종으로 준비하였다. 과산산화수소 (H2O2)는 최종 농도가 150 μM이 되게 처리한 후 24시간 동안 반응시켰으며 이때 과산화수소는 사용직전에 냉장고에서 꺼내어 인산완충용액 (PBS, phosphate buffer saline, pH 7.4)으로 희석하여 사용하였다. 과산화수소는 먼저 400 mM의 용액으로 희석하여 만든 후 이를 차례로 또 희석하여 150 μM의 40배인 6 mM의 용액을 만든 후 96 well에 well 당 5 ㎕ 씩 넣어주었으며, 24시간 후 세포 손상 정도를 엠티티 검색법 (MTT assay)로 평가하였다. 즉, 원래의 96 well plate에 0.5 mg/㎖의 MTT (Thiazolyl Blue Tetrazolium Bromide) 200 ㎕를 넣고 1시간 동안 37℃에서 반응시킨 후 여기에 DMSO (Dimethyl sulfoxide) 100 ㎕를 넣고 진탕 프레이트 (shaking plate)에서 진탕하여 완전히 용해시킨 후 마이크로프레이트 판독기 (microplate reader, Synergy HT TRF, Bio-Tek Co., USA)를 이용하여 570 nm에서의 UV 흡광도를 측정하였으며 세포생존율 (%)은 측정 흡광도 값을 과산화수소를 처리하지 않은 정상군에 대한 백분율로 나타내었다. 실험은 3반복으로 행하였으며 평균한 값으로 세포생존율 (cell viability)를 계산하였다. 그 결과는 도 7에 나타내었다.
시료처리구의 세포생존율 (%) = Asample / Anormal × 100
시료무처리 대조구의 세포생존율 (%) = Acontrol / Anormal × 100
대조구 (Control): 화합물 시료 무첨가, 과산화수소 (H2O2) 처리
정상군 (Normal): 화합물 시료 무첨가, 과산화수소 (H2O2) 무처리
Asample : 화합물 시료 처리 및 과산화수소 처리구의 흡광도
Acontrol : 화합물 시료 무첨가 및 과산화수소 처리구의 흡광도
Anormal : 화합물 시료 무첨가 및 과산화수소 무처리구의 흡광도
활성유무는 과산화수소를 단독 처리한 대조구 (control) 대비하여 화합물 시료 처리구의 세포생존율이 더 높을 경우 활성을 인정하였는데, 도 7a에 나타난 것처럼, 화합물 3은 10, 100 μM 농도 처리에서 모두 대조구보다 각각 6%, 19% 정도씩 세포생존율이 증가하였다. 한편, 도 7b에 나타난 것처럼 천연 항산화제로 인정되는 비타민 C는 10, 50, 100 μM 고농도 처리구에서도 과산화수소를 단독 처리한 대조구에 대비하여 각각 세포생존율이 증가하지 않아, 이 농도구간에서는 과산화수소 소거활성이 없는 것으로 판단되었다. 따라서 화합물 3은 천연 항산화제인 비타민 C보다 더 우수한 과산화수소 소거능을 나타내었고, 특히 신경세포의 일종인 PC12 세포주에서 과산화수소의 독성을 효과적으로 억제하였기 때문에 뇌신경세포 보호 효능을 가지는 약학적 조성물로서 유용하게 이용할 수 있다.
(실시예 5) 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물의 산화질소 (NO) 생성억제 효과 측정
붉나무 줄기에서 분리한 화합물들이 뇌에 존재하는 대식세포인 마이크로글라이아 (microglia) 세포의 활성화에 미치는 영향을 알아보기 위하여 지질다당체로 활성화시킨 1차 마이크로글라이아 세포에서 산화질소의 생성량을 측정하였다 (Kim et al., 2003, Neuroreport, 14(15):1941-1944). 1차 마이크로글라이아 세포는 생후 1일 이내의 스프라그-도올리 래트 (Sprague-Dawley rat, 타코닉, 일본)의 뇌를 적출한 후, 뇌조직 세포를 75T 플라스크에서 10% FBS (Fetal Bovine Serum, Gibco-BRL, 영국) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(Penicilline/streptomycine, Gibco-BRL, 영국)이 포함된 DMEM (Dulbecco's Modified Eagle Medium; Gibco-BRL, 영국) 배지에서 약 2주간 세포 배양하고 1차 마이크로글라이아 세포만을 취하였다. 1차 마이크로글라이아 세포는 96 well 플레이트에 4 × 104 cell/well의 농도로 분주하고 37℃, 5% 이산화탄소 조건의 세포배양기에서 하룻밤 동안 배양하였다.
상기 실시예 1에서 분리, 정제한 화합물의 최종농도가 각 0.1, 1, 10 ㎍/㎖가 되도록 하고 DMSO (dimetyl sulfoxide)의 최종 농도는 0.1% 이하가 되도록 1차 마이크로글라이아 세포에 처리하였으며, 지질다당체 100 ng/㎖을 동시에 처리하여 활성화시켰다. 1차 마이크로글라이아 세포는 24시간 후에, 배양액 50 ㎕를 취하여 그리즈 반응용액 (Griess reagent) 50 ㎕과 섞어 주었고, 10분간 실온에 방치한 후 엘라이저리더 (Elyzerleader)로 570 ㎚의 흡광도에서 측정하고 아질산나트륨(sodium nitrite, NaNO2)을 표준으로 삼아 농도를 계산하였다. 그 결과는 표 7과 도 8에 나타내었다. 표 7과 도 8에서처럼, 산화질소의 생성저해 효과는 1차 마이크로글라이아 세포에서 화학식 3의 화합물 3이 농도 의존적으로 산화질소의 농도를 감소시키고 10 ㎍/㎖ 처리군에서는 정상군과 유사한 정도의 산화질소 농도로 측정되어 산화질소 생성을 억제하는 효과를 나타내었다. 따라서 화합물 3은 세포내 산화질소의 과도한 생성을 차단함으로써 신경세포를 보호하는 안전한 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
[표 7] 화합물 3의 산화질소 (NO) 생성 저해 효과
정상군 대조군 화합물 처리군 (㎍/㎖)
0.1 1 10
산화질소 (μM) 4.21759 14.8114 15.1036 12.4734 5.60578
표준편차 (SEM) 0.00418 0.05601 0.04911 0.04225 0.00647
(실시예 6) 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물들의 항암활성 측정
실시예 1에서 얻은 붉나무의 화학식 1, 3의 화합물 1, 3을 이용하여 인체 암세포주에 대한 세포독성을 에스알비 법 (sulforhodamine B, SRB 법, Skehan, et al., Prox. Am. Assoc. Cancer Research, 30:612)으로 조사하였다. 이때 인체암세포주로는 폐암세포주인 A549, 난소암세포주인 SK-OV-3, 피부암세포주인 SK-MEL-2, 중추신경암세포주인 XF498, 결장암세포주인 HCT15를 사용하였다. 항암활성 조사방법을 보다 상세히 설명하면 하기와 같다.
계대배양 중인 상기의 암세포주를 트립신-시디티에이 (trypsin-CDTA)용액으로 부착 면으로부터 분리시키고, 96 웰 프레이트 바텀 마이크로플레이트 (96 well flat bottom microplate)에 웰당 세포수가 5×10³ (A549, HCT15), 1×0⁴(SK-MEL-2, XF498), 2×10⁴(SK-OV-3)이 되도록 분주하였다. 여기서 6농도의 로그 농도(log dose)로 배양액에 희석된 시료용액들을 웰에 각각 100 ㎕ 씩 넣어주고 48시간 더 배양하였다. 배양 후 각 웰의 배양액을 제거하고 10% 트리클로로아세테이트(trichloroacetic acid, TCA)를 100 ㎕ 씩 가하여 4℃에서 1시간 방치하여 세포들을 plate 바닥 면에 고정시켰다. 세포의 고정이 끝난 후 플레이트를 물로 5∼6회 세척하여 남아있는 티시에이 (TCA)용액을 완전히 제거하고 실온에서 남은 물기가 없도록 건조시켰다. 완전히 건조된 플레이트는 웰당 100 ㎕ 1% 초산 용액에 0.4% 에스알비 (SRB)를 녹인 염색용액을 가하여 30분간 세포를 염색하고 다시 1% 초산 용액으로 5∼6회 세척하여 세포에 결합하지 않은 에스알비 (SRB)를 제거하였다. 이렇게 염색된 셀 플레이트들은 다시 실온에서 건조시킨 뒤 웰당 100 ㎕의 10 mM 트리스마베이스(trismabase) 용액을 가하여 적정용기 진탕기 (titer plate shaker)로 10분간 진탕하여 염색약을 용출시킨 후 마이크로플레이트 리더 (microplate reader)를 사용하여 520 nm에서 흡광도를 측정하였다. 암세포들에 대한 화합물의 효과를 계산하기 위하여 화합물을 가할 때의 세포수 (Tz)와 화합물이 들어있지 않은 배양액을 가하여 48시간 배양했을 때의 세포수 (C) 및 각 농도의 화합물과 함께 48시간 배양했을 때의 세포수(T) 등을 측정하여 다음의 수식에 의해 항암활성을 계산하였다. Tz〉T인 경우에는 "[(T-Tz)/(C-Tz) x 100]"으로 계산하고 Tz〈T인 경우에는 "[(T-Tz)/Tz x 100]"의 수식으로 계산하였다. 이렇게 계산된 값들로부터 자료회귀 (data regression)을 이용하여 화합물이 암세포의 성장을 50%억제하는 농도인 50% 유효농도(effective dose, ED50)를 계산하여 각 화합물의 항암활성도를 비교하였다. 대조약물로는 합성 항암제인 독소루비신(doxorubicin)을 사용하였다. 그 결과를 표 8에 나타내었다.
[표 8] 화학식 1과 3의 화합물의 인체 암세포주에 대한 세포 독성(단위 ED50 : ㎍/㎖)
화합물 폐암세포 (A549) 난소암세포 (SK-OV-3) 피부암세포 (SK-MEL-2) 중추신경암세포 (XF498) 결장암 (HCT15)
화학식 1 5.42 3.74 9.19 7.58 2.33
화학식 3 6.48 8.15 4.61 4.51 5.60
독소루비신 (Doxorubicin) 0.09 0.16 0.07 0.04 0.13
표 8에서 나타난 바와 같이, 화학식 1과 3의 화합물들이 5종의 암세포주에 대해 성장을 강하게 억제하는 활성을 나타냄을 확인하였다. 이 때 대조군으로 합성 항암제인 독소루비신(doxorubicin)을 사용하였는데 상기 화합물들이 합성 화합물인 대조군보다 전체적으로 세포독성이 상대적으로 약하였지만 천연물질로서는 강한 항암활성을 보유한 것으로 인정되었다. 따라서 이들 화합물들은 암의 예방, 개선 및 치료용 조성물로서 효과적으로 이용할 수 있다.
(실시예 7) 담마레인 트리테르펜 (dammarane triterpene) 화합물들의 항산화 활성 측정
7-1) 활성산소 (ROS) 소거 활성 측정
상기 실시에 1에서 분리, 정제한 화합물의 항산화 활성을 측정하기 위하여 노화 쥐의 간조직과 쥐 (rat)의 혈관내피 세포 (YPEN-1 cell)를 이용하여 활성산소 소거능을 조사하였다. 쥐의 혈관내피세포는 미국 표준 균주 (ATCC, American Type Culture Collection, USA)를 구입하여 사용하였다. YPEN-1 cell은 DMEM 배지 (Nissui Co., Japan)에서 5% 이산화탄소 조건에서 배양되었는데 DMEM 조성은 56℃에서 30분간 5%의 열불활성화 (heat-inactivated) 우태혈청 (FBS, fetal bovine serum, Gibco, Grand Island, NY), 233.6 mg/㎖ glutamate, 72 ㎍/㎖ 페니실린/스트렙토마이신 (penicillin/streptomycin), 0.25 ㎍/㎕ 엠포테리신 B (amphotericin B)이고 pH는 탄산수소나트륨 (NaHCO3)으로 pH 7.4-7.6 조건으로 조절하여 배양하였다. 배지는 비부착 상층 세포 (non-adherent cell) 또는 세포 파편 (cell debris)를 제거하기 위해 24시간 후에 신선한 배지로 교체하여 주었다.
쥐의 간조직을 활성산소 (ROS) 공급원으로 이용하여 활성산소 (ROS) 소거활성을 측정하기 위해 노화 쥐의 간의 포스터 미토콘드리아 (post mitochondria, PM)을 분리하여 사용하였는데, 화합물처리에 대한 PM 자체의 활성산소 소거활성은 2,7-디-클로르아이하이드로플로레세인 디아세테이트 (2,7-di-chlorodihydrofluorescein diacetate, H2DCFDA)이 산화되어 생성되는 형광 생성물인 2,7-디하이드로플로레세인 (2,7-dihydrofluorescein, DCF)를 마이크로형광 검색법 (microfluorescence assay)으로 측정하였다. PM을 50 mM 인산완충용액 (phosphate buffer, pH 7.4)에 100배 희석하여 시료와 섞은 후 H2DCFDA (최종농도. 2.5 mM)를 처리하면 H2DCFDA는 활성산소에 의해 DCF로 산화된다. DCF의 형광감도는 마이크로플레이트 형광측정기 (microplate fluorescence)를 사용하여 5분 간격으로 7회 측정하여 분당 형광도를 구하였다. 형광의 여기 (excitation)와 방출 (emission) 파장은 각각 485 nm, 535 nm로 하였다. 양성대조물질은 트로록스 (trolox, 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid)를 사용하였다. 이때 IC50 값은 분당형광도값을 50%로 감소시키는데 필요한 화합물의 양 (μM)으로 하여 하기 표 9에 나타내었다.
[표 9]
화학식 2의 화합물 2의 활성산소 (ROS) 소거활성
화합물 트로록스 (trolox) 화학식 2
IC50 (μM) 14.08 26.76
표 9에 나타난 바와 같이 화학식 2의 화합물 2는 활성산소소거능이 양성대조구의 화합물인 트로록스보다는 떨어졌지만 천연물로서는 IC50 값이 26.76 μM로서 효과적으로 활성산소를 저해하는 것으로 확인되었다.
7-2) 세포내 활성산소 (ROS) 소거 활성 측정
활성산소 (ROS) 소거능 세포실험에서는 YPEN-1 cell을 분주하여 24시간 배양시킨 후 화합물을 처리하여 다시 1시간 배양시켰다. 세포내에서 활성산소 생성을 유도하기 위해 제 3차-부틸 디하이드로퍼옥사이드 (tert-butyl hydroperoxid, t-BHP)를 최종 농도가 20 μM이 되도록 처리하여 1시간 동안 반응을 시켰다. 1시간 후, 배지는 신선한 무혈청 배지 (fresh serum free medium)로 갈아주고 125 μM H2DCFDA를 첨가하였다. DCF의 형광감도 측정조건은 간조직을 활성산소 공급원으로 한 상기 실험에서와 동일하게 하였다. 그 결과는 도 9에 나타내었다.
도 9에서 나타난 바와 같이 화합물2는 쥐의 혈관내피세포인 (YPEN-1 cell) 배양 실험에서도 세포내 활성산소 생성에 대한 우수한 활성산소 소거능을 나타내었다. t-BHP에 의해 세포내 활성산소가 유도되었는데, t-BHP를 처리하지 않은 정상 대조구의 분당 형광도 (fluorescence/min)가 100.4±2.7로 측정되었다. 반면에 t-BHP 단독 처리구에서는 분당 형광도가 증가하여 135.7±3.5가 되었다. 이것은 세포내에 t-BHP에 의해서 활성산소가 생성되어 형광반응물인 DCF가 H2DCFDA로부터 많이 생성되고 또 어떤 활성산소 생성 억제물질도 작용하지 않았기 때문인데 화합물 2는 분당 형광도가 5, 10 μM 농도에서 각각 90.4±0.6, 86.7±3.1로 측정되었다. 즉, 화합물 2가 t-BHP에 의해 유도되어진 세포내 활성산소를 효과적으로 소거함으로써 정상구의 분당 형광도보다 낮은 수치를 나타내었다. 따라서 화합물 2는 세포내 활성산소 생성을 억제함으로써 우수한 항산화 활성을 나타내었다.
7-3) 퍼록시나이트라이트 (peroxinitrite, ONOO-)에 대한 소거 활성 측정
퍼록시나이트라이트 (peroxinitrite) 소거능은 Kooy 등의 방법을 변형하여 디하이드로로다민 123 (dihydrorhodamine 123, DHR 123)의 산화되는 정도를 측정함으로써 검정하였다 (Kooy et al., 1994, Free Radic Biol Med. 16(2):149-156). 완충액 (90 mM sodium chloride, 50 mM sodium phosphate (pH 7.4), 5 mM potassium chloride)에 5 mM 디에틸렌트리아미펜타이세트산 (diethylenetriaminepenta acetic acid, DTPA)를 첨가하고 여기에 디하이드로로다민 123 용액을 혼합한 뒤 화합물과 퍼록시나이트라이트를 첨가하고 실온에서 5분간 방치하였다. 디하이드로로다민 123 산화정도에 따른 퍼록시나이트라이트 소거능 측정을 위해 마이크로플레이트 형광측정기 (microplate fluorescence)를 이용하여 여기 파장 485 nm, 방출 파장 535 nm에서 형광도를 측정하였다. 퍼록시나이트라이트 바탕용액 (blank solution)은 0.3 N 수산화나트륨 (NaOH) 용액을 사용하였고, 양성대조구 화합물로는 페니실라민 (penicillamine)을 사용하였다. 실험은 2반복으로 행하였으며 평균한 값으로 소거율을 계산하였다. 이때 IC50 값은 퍼록시나이트라이트만 첨가한 형광도 값을 50%로 감소시키는데 필요한 화합물의 양 (μM)으로 하여 하기 표 10에 나타내었다.
[표 10]
화학식 2의 화합물 2의 활성산소 (ROS) 소거활성
화합물 페니실라민 (penicillamine) 화학식 2
IC50 (μM) 0.74 6.20
표 10에 나타난 바와 같이 화학식 2의 화합물 2는 퍼록시나이트라이트 소거능이 양성대조구의 화합물인 페니실라민보다는 떨어졌지만 천연물로서는 IC50 값이 6.20 μM로서 효과적으로 활성질소인 퍼록시나이트라이트를 저해하는 것으로 확인되었다.
따라서 화학식2의 화합물 2는 활성산소나 활성질소의 산화적 스트레스에 기인한 세포의 산화적 손상으로 유발되는 질환의 예방, 개선 및 치료를 위한 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다.
본 발명의 조성물은 ACAT 효소 저해 효과 뿐 아니라, 쥐의 신경세포내 과산화수소의 생성 억제 효과, 산화질소 억제 효과가 우수하여 효과적으로 뇌신경세포를 보호할 수 있으므로 고지혈증, 관상동맥 심장병, 동맥경화증 및 심근경색증과 같은 심장순환계 질환과 알츠하이머형 치매의 예방 및 개선, 치료용 건강기능식품 소재 및 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 뿐만 아니라 활성산소, 활성질소의 소거능과 세포에서 활성산소를 효과적으로 소거하는 항산화 활성이 우수하고, 인체 유해 암세포주에 대한 항암 활성이 우수하므로 활성산소의 산화적 스트레스에 기인한 질환 및 암의 예방 및 개선, 치료용 건강기능식품 소재 및 약학적 조성물로 유용하게 사용할 수 있다. 또한 전통 민간 생약인 붉나무의 유효성분을 분리하여 이들 화합물의 다양한 생리활성을 밝혀냄으로써 붉나무의 생약자원으로서의 가치 및 부가가치를 증진하는 효과가 있다.

Claims (10)

  1. 항암활성, 콜레스테롤 저하 또는 항산화 활성을 갖는 붉나무 추출물을 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 폐암, 난소암, 피부암, 중추신경암, 또는 결장암의 예방 및 치료용 약학 조성물.
  2. 삭제
  3. 제 1 항에 있어서, 상기 붉나무 추출물의 유효성분이 하기 화학식 1 또는 화학식 3 인 것을 특징으로 하는 폐암, 난소암, 피부암, 중추신경암, 또는 결장암의 예방 및 치료용 약학조성물.
    < 화학식 1 >
    Figure 112007085150134-pat00007
    < 화학식 3 >
    Figure 112007085150134-pat00008
  4. 항암활성, 콜레스테롤 저하 또는 항산화 활성을 갖는 붉나무 추출물을 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 고지혈증, 동맥경화증 및 심근경색증으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 고지혈증으로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
  5. 제 4 항에 있어서, 상기 붉나무 추출물의 유효성분이 하기 화학식 1 또는 화학식 3 인 것을 특징으로 하는 고지혈증, 동맥경화증 및 심근경색증으로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 고지혈증으로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
    < 화학식 1 >
    Figure 112008044198592-pat00009
    < 화학식 3 >
    Figure 112008044198592-pat00010
  6. 항암활성, 콜레스테롤 저하 또는 항산화 활성을 갖는 붉나무 추출물을 유효성분으로 함유하고, 약학적으로 허용 가능한 담체, 희석제 또는 부형제를 포함하는 것을 특징으로 하는 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중, 헌팅턴병 및 치매로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 산화적 스트레스로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
  7. 제 6 항에 있어서, 상기 붉나무 추출물의 유효성분이 하기 화학식 2 또는 화학식 3 인 것을 특징으로 하는 알츠하이머병, 파킨슨병, 뇌졸중, 헌팅턴병 및 치매로 이루어진 그룹에서 선택되는 어느 하나의 산화적 스트레스로 인한 질환의 예방 및 치료용 약학 조성물.
    < 화학식 2 >
    Figure 112007085150134-pat00011
    < 화학식 3 >
    Figure 112007085150134-pat00012
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물이 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸의 경구적 제형, 외용제, 좌제 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화 되는 것을 특징으로 하는 약학 조성물.
  9. 붉나무 추출물을 유효성분으로 함유하고, 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 암, 고콜레스테롤 또는 산화적 스트레스 개선용 건강기능식품.
  10. 제 9 항에 있어서, 상기 붉나무 추출물의 유효성분이 하기 화학식 1, 화학식 2 및 화학식 3으로 이루어진 그룹에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암, 고콜레스테롤 또는 산화적 스트레스 개선용 건강기능식품.
    < 화학식 1 >
    Figure 112008044198592-pat00013
    < 화학식 2 >
    Figure 112008044198592-pat00014
    < 화학식 3 >
    Figure 112008044198592-pat00015
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