KR20100100908A - 혈소판 측정용 시약, 혈소판 측정용 시약 키트 및 혈소판 측정 방법 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 나일 블루 황산수소염 또는 나일 블루와 산을 포함하는 혈소판 측정용 시약, 이 혈소판 측정용 시약을 포함하는 시약 키트 및 이것을 이용하는 혈소판 측정 방법을 제공한다.

Description

혈소판 측정용 시약, 혈소판 측정용 시약 키트 및 혈소판 측정 방법{PLATELET MEASUREMENT REAGENT, PLATELET MEASUREMENT REAGENT KIT, AND PLATELET MEASUREMENT METHOD}
본 발명은 혈소판 측정용 시약, 혈소판 측정용 시약 키트 및 그것들을 이용하는 혈소판 측정 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로는, 본 발명은 혈소판을 측정하기 위한 색소로서 나일 블루, 특히 나일 블루 황산수소염을 포함하는 혈소판 측정용 시약에 관한 것이다.
혈액 중의 세포, 즉 백혈구, 망상 적혈구, 적혈구 등의 혈구를 플로우 사이토메트리(flow cytometry) 원리를 이용하여 신속히 측정하는 방법이 종래 알려져 있다.
이와 같은 측정 방법으로서 예를 들면, 미국 특허 제6114173호 공보(특허문헌 1)에는 전혈 시료 중의 망상 적혈구, 적혈구 및 혈소판의 계수(計數) 및 동정(同定) 방법, 및 그 방법에 이용하는 시약 조성물이 개시되어 있다. 구체적으로는 양이온성 색소, 특히 옥사진 750을 포함하는 시약 혼합물로 망상 적혈구를 염색하고, 플로우 사이토메트리를 이용하여 산란광 신호 및 광흡수 신호를 측정한다. 그리고, 혈액 시료 중의 적혈구와 망상 적혈구를 흡수 신호의 다름에 따라, 적혈구 및 망상 적혈구로 이루어진 군과 혈소판을 산란광 신호의 다름에 따라 분류해, 각각의 총수를 결정한다는 것이다.
미국특허제6114173호
혈소판을 측정함에 있어서는 혈액 중에 출현하는 파쇄 적혈구나 지질 등이, 그 사이즈가 혈소판과 유사하기 때문에 측정상의 협잡물로서 영향을 주는 것이 알려져 있다. 특히, 수혈의 필요성이 있는 것과 같은 혈소판이 적은 검체를 측정할 때에는 이러한 협잡물의 영향이 보다 커진다. 이와 같은 문제는 미국 특허 제 6114173호 공보에 기재된 방법에 따라서도 생기는 문제이지만, 협잡물의 영향을 억제해 혈소판을 측정하는 것에 대하여 미국 특허 제6114173호에는 어떠한 기재도 되어 있지 않다.
또, 혈소판을 염색할 수 있는 색소는 용액 중에서 시간의 경과와 함께 분해되는 경우가 있다. 플로우 사이토메트리에 의한 혈소판의 측정은 시료 중의 색소에 의해 염색된 세포에 빛을 조사하여 얻어지는 산란광 및 형광을 검출함으로써 행해진다. 그러나, 함유되는 혈소판 염색용 색소의 양이 저하한 색소 용액을 이용한 것으로는 정확하게 산란광 및 형광을 얻지 못하며, 따라서 정확한 측정 결과를 얻을 수 없다.
본 발명은 상기와 같은 과제를 감안해 이루어진 것으로, 혈소판의 검출을 방해할 수 있는 협잡물을 포함하는 검체이더라도 이와 같은 협잡물의 영향을 억제해 혈소판을 보다 높은 정밀도로 측정하는 것을 가능하게 하고, 또한 보존 안정성이 높은 혈소판 측정용 시약 및 혈소판 측정용 시약 키트를 제공하는 것을 목적으로 하며, 나아가 혈소판을 보다 높은 정밀도로 측정하는 것을 가능하게 하는 혈소판 측정 방법을 제공하는 것을 목적으로 하는 것이다.
따라서, 본 발명은 혈소판을 염색하기 위한 색소로서 반대 이온(counter ion)이 황산수소 이온인 나일 블루를 포함하는 혈소판 측정용 시약을 제공한다.
또, 본 발명은 혈소판을 염색하기 위한 색소로서 반대 이온이 황산수소 이온인 나일 블루를 포함하는 제 1 시약과, 완충제를 함유하는 제 2 시약을 포함하는 혈소판 측정용 시약 키트를 제공한다.
나아가 본 발명은 혈소판을 염색하기 위한 색소로서 반대 이온이 황산수소 이온인 나일 블루를 포함하는 제 1 시약과 검체를, 완충제를 함유하는 제 2 시약을 가하든지 또는 가하지 않고 혼합하여 측정용 시료를 조제하는 단계와,
얻어진 측정용 시료 중의 세포에 빛을 조사하여, 이 세포로부터 발해지는 산란광 및 형광을 검출하는 단계와,
검출된 산란광 및 형광에 근거하여 측정용 시료에 포함되는 혈소판을 검출하는 단계를 포함하는 혈소판 측정 방법을 제공한다.
또, 다른 태양에 있어서, 본 발명은 혈소판을 염색하기 위한 색소로서 반대 이온이 무기산 이온인 나일 블루와 산을 함유하는 혈소판 측정용 시약을 제공한다.
본 발명은 또한 혈소판을 염색하기 위한 색소로서의 나일 블루와 산을 함유하는 제 1 시약과, 완충제를 함유하는 제 2 시약을 포함하는 혈소판 측정용 시약 키트를 제공한다.
나아가 본 발명은 나일 블루와 산을 함유하는 혈소판 측정용 시약과 검체를, 완충제를 함유하는 제 2 시약을 가하거나 또는 가하지 않고 혼합하여 측정용 시료를 조제하는 단계와,
얻어진 측정용 시료 중의 세포에 빛을 조사하여, 이 세포로부터 발해지는 산란광 및 형광을 검출하는 단계와,
검출된 산란광 및 형광에 근거하여 측정용 시료에 포함되는 혈소판을 검출하는 단계를 포함하는 혈소판 측정 방법도 제공한다.
본 명세서에 있어서, 「나일 블루」란, 예를 들면 이하의 식 (Ⅱ):
Figure pct00001
(식 중, X-는 음이온이다)
로 나타내고, X-로 나타내는 반대 이온과 염을 형성한 상태의 화합물로 이루어진 색소를 말한다. 본 명세서에서는 X-로 나타내는 반대 이온을 특별히 한정하지 않는 경우에는 식 (Ⅱ)로 나타내는 색소를 단순히 「나일 블루」라고 호칭하고, 반대 이온이 특정 이온을 나타내는 경우에는 식 (Ⅱ)로 나타내는 색소를 「나일 블루(특정 이온명)염」이라고 호칭한다. 예를 들면, 반대 이온이 황산 이온(1/2S04 2 -)인 나일 블루를 「나일 블루 황산염」이라고 호칭하고, 반대 이온이 황산수소 이온(HSO4 2 -)인 나일 블루를 「나일 블루 황산수소염」이라고 호칭한다.
도 1은 본 발명의 혈소판 측정용 시약 키트를 수용할 수 있는 용기의 외관을 나타내는 도면이다.
도 2는 시료 분석 장치의 개략 구성을 나타내는 정면도이다.
도 3은 시료 분석 장치의 개략 구성을 나타내는 블럭도이다.
도 4는 검출부의 구성을 나타내는 개략 평면도이다.
도 5는 실험예 9의 혈소판 측정용 시약을 이용한 혈소판 측정에 의해 얻어진 스캐터그램(scatter gram)이다.
도 6은 실험예 10의 혈소판 측정용 시약을 이용한 혈소판 측정에 의해 얻어진 스캐터그램이다.
도 7은 실험예 11의 혈소판 측정용 시약을 이용한 혈소판 측정에 의해 얻어진 스캐터그램이다.
도 8은 실험예 12의 혈소판 측정용 시약을 이용한 혈소판 측정에 의해 얻어진 스캐터그램이다.
도 9는 실험예 13의 색소 시약을 이용한 혈소판 측정에 의해 얻어진 스캐터그램이다.
도 10은 실험예 9의 혈소판 측정용 시약을 이용한 파쇄 적혈구 함유 혈액의 측정에 의해 얻어진 스캐터그램이다.
도 11은 실험예 9의 혈소판 측정용 시약을 이용한 지질 입자 함유 혈액의 측정에 의해 얻어진 스캐터그램이다.
도 12는 실험예 10의 혈소판 측정용 시약을 이용한 파쇄 적혈구 함유 혈액의 측정에 의해 얻어진 스캐터그램이다.
도 13은 실험예 10의 혈소판 측정용 시약을 이용한 지질 입자 함유 혈액의 측정에 의해 얻어진 스캐터그램이다.
도 14는 실험예 14~24의 혈소판 측정용 시약을 이용한 검체의 측정에 의해 얻어진 스캐터그램이다.
도 15는 실험예 25의 혈소판 측정용 시약을 이용한 검체의 측정에 의해 얻어진 스캐터그램이다.
도 16은 실험예 45의 혈소판 측정용 시약을 이용한 혈소판 측정에 의해 얻어진 스캐터그램이다.
도 17은 실험예 46의 혈소판 측정용 시약을 이용한 혈소판 측정에 의해 얻어진 스캐터그램이다.
도 18은 실험예 47의 혈소판 측정용 시약을 이용한 혈소판 측정에 의해 얻어진 스캐터그램이다.
도 19는 실험예 48의 혈소판 측정용 시약을 이용한 혈소판 측정에 의해 얻어진 스캐터그램이다.
도 20은 실험예 45의 혈소판 측정용 시약을 이용한 파쇄 적혈구 함유 혈액의 측정에 의해 얻어진 스캐터그램이다.
도 21은 실험예 45의 혈소판 측정용 시약을 이용한 지질 입자 함유 혈액의 측정에 의해 얻어진 스캐터그램이다.
<혈소판 측정용 시약>
본 발명자들은 플로우 사이토메트리를 이용하는 혈소판 측정 방법에 있어서, 나일 블루를 혈소판 염색용 색소로서 이용함으로써 혈소판을 다른 혈구 성분이나 지질 입자 등의 혈액 중의 협잡물로부터 명확하게 구별할 수 있다는 것을 알아냈다.
나아가 본 발명자들은 나일 블루를 이용하는 혈소판의 측정 조건에 대해 열심히 연구를 거듭한 결과, 혈소판 측정용 시약이 (Ⅰ) 나일 블루 황산수소염을 함유하든지, 또는 (2) 나일 블루와 산을 함유하는 경우에 보존 안정성이 뛰어나는 것을 알아내어 본 발명을 완성하기에 이른 것이다.
상기 식 (Ⅱ) 중, X-인 음이온(반대 이온)으로는 황산 이온(1/2SO4 2 -), 염소 이온(Cl-), 황산수소 이온(HSO4 2 -), 과염소산 이온(ClO4 -) 등의 무기산 이온을 들 수 있다.
이와 같은 나일 블루는 시장에서 입수 가능하고, 예를 들면 시그마 알드리치사, 도쿄화성, 나카라이테스크사, 와코우순약공업, 키시다 화학사 등으로부터 입수할 수 있다.
특히, 나일 블루 황산수소염은 와코우순약공업, 키시다 화학사 등에서 입수할 수 있다.
본 발명의 혈소판 측정용 시약 중에 포함되는 나일 블루(예를 들면, 나일 블루 황산수소염)는 혈소판 측정용 시약을 검체와 혼합했을 때에 0.05~5.0ppm, 바람직하게는 0.1~0.6ppm, 더욱 바람직하게는 0.2~0.5ppm의 농도가 되는 농도 범위에서 색소 시약 중에 포함되는 것이 바람직하다. 예를 들면, 검체와 혼합할 때에 혈소판 측정용 시약이 50배로 희석되는 경우이면, 혈소판 측정용 시약 중 나일 블루의 농도는 2.5~250ppm이 바람직하다.
이와 같은 농도 범위이면, 혈소판과 다른 혈구 성분 및 협잡물의 구별이 보다 양호하게 된다.
본 발명의 혈소판 측정용 시약의 나일 블루와 산을 포함하는 태양에 있어서, 산으로는 유기산 및 무기산 중 어느 것이어도 되지만, 무기산이 바람직하다. 무기산으로는, 황산, 인산, 과염소산 등의 옥소산, 및 염산, 불화수소산, 요오드화 수소산, 브롬화 수소산, 시안화 수소산, 이소시안화 수소산, 황화 수소, 아지화 수소 등의 수소산을 들 수 있다.
본 발명의 혈소판 측정용 시약의 이러한 태양에 있어서, 산은 그 몰 농도가 혈소판 측정용 시약에 포함되는 나일 블루의 몰 농도 이하가 되도록 혈소판 측정용 시약에 포함되는 것이 바람직하다. 구체적으로는, 혈소판 측정용 시약에서의 나일 블루와 산의 몰 농도비가 10:1 ~ 1:1인 것이 바람직하다. 특히 산으로서 염산을 이용하는 경우에는 나일 블루와 염산의 몰 농도비가 3:1 ~ 1:1인 것이 바람직하고, 산으로서 황산을 이용하는 경우에는 나일 블루와 황산의 몰 농도비가 4:1 ~ 1:1인 것이 바람직하다. 이와 같은 농도로 산을 함유시킴으로써, 시간 경과에 수반하는 혈소판 측정용 시약 중 나일 블루의 유효 색소 성분 농도의 저하를 보다 효과적으로 억제할 수 있어 혈소판 측정용 시약의 보존 안정성을 향상시킬 수 있다.
본 발명의 혈소판 측정용 시약의 이러한 태양에 있어서, 나일 블루와 산의 조합은 어떠한 나일 블루 및 산으로도 조합할 수 있다. 그러나,
(A) 나일 블루 황산염과 옥소산 또는 수소산;
(B) 나일 블루 클로라이드와 황산; 및
(C) 나일 블루 황산수소염과 옥소산 또는 수소산
의 조합이 보다 바람직하다.
본 발명의 혈소판 측정용 시약의 다른 태양에 있어서, 나일 블루가 나일 블루 황산수소염인 경우, 상기 혈소판 측정용 시약은 산을 포함하지 않는 것도 가능하다. 나일 블루로서 나일 블루 황산수소염을 이용하는 경우, 산을 가하지 않아도 시간 경과에 수반하는 혈소판 측정용 시약 중 나일 블루의 유효 색소 성분 농도의 저하를 보다 효과적으로 억제할 수 있어 혈소판 측정용 시약의 보존 안정성을 향상시킬 수 있다.
상기 2개 태양의 본 발명의 혈소판 측정용 시약에 있어서, 보존 안정성을 향상시킬 수 있는 요인으로는, 다음과 같은 2개의 가설이 생각된다.
(1) 나일 블루는 황산수소염의 형태인 경우에 안정성이 높다고 생각된다.
나일 블루 황산염의 경우는 산을 첨가함으로써, 산이 해리하여 생기는 프로톤(H+)이 나일 블루 황산염의 SO4 2 -와 HSO4 -를 형성하여 HSO4 -와 나일 블루의 밸런스가 1:1이 되어 안정화될 수 있다.
나일 블루가 상기 이외의 염인 경우는, 황산을 첨가함으로써 황산으로부터 생기는 HSO4 -가 나일 블루를 안정화시킬 수 있다고 생각된다.
따라서, 본 발명의 혈소판 측정용 시약은 황산수소 이온이 존재하게 되도록 나일 블루와 필요에 따라 산을 포함하는 혈소판 측정용 시약으로도 있을 수 있다.
(2) 나일 블루의 구조는 디에틸아미노기, 아미노기 및 페녹사진 구조 중의 질소의 3개소에 질소 원자를 가진다. 이들 질소 원자 가운데, 상기 X-로 나타내는 반대 음이온과 염을 형성하는 질소 원자 이외의 질소 원자가 산 부가염을 형성함으로써, 질소 원자의 안정성이 향상하고, 색소의 용해성이 보다 향상하여, 혈소판 측정용 시약의 안정성이 향상한다고 생각된다.
즉, 나일 블루 황산수소염의 경우는 반대 음이온인 황산수소 이온(HSO4 -)이 해리하여 프로톤(H+)과 황산 이온(SO4 2-)을 생기게 할 수 있다. 이 프로톤이 나일 블루의 몇 개의 질소 원자와 결합하여 프로톤성 질소 원자를 생기게 할 수 있다. 이 프로톤성 질소 원자가 황산 이온을 통하여 분자간 염을 형성함으로써, 색소의 용해성이 향상되고, 안정성이 향상될 수 있다고 생각된다.
또, 황산수소염 이외의 나일 블루에 산을 첨가하면, 산이 해리하여 생기는 프로톤 및 음이온이 나일 블루의 분자간 염의 형성에 기여할 수 있어, 색소의 용해성 및 안정성을 향상시킬 수 있다고 생각된다.
따라서, 본 발명의 혈소판 측정용 시약은 나일 블루가 분자간 염을 형성할 수 있도록 나일 블루와 필요에 따라 산을 포함하는 혈소판 측정용 시약으로도 있을 수 있다.
본 발명의 혈소판 측정용 시약은 수용성 유기용매를 더 포함하는 것이 바람직하다. 수용성 유기용매로는, 상기 나일 블루를 용해할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고, 에틸렌글리콜, 디에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜 등의 프로톤성 용매를 들 수 있다.
본 발명의 혈소판 측정용 시약은 상기 나일 블루 및 경우에 따라 산을 상기의 원하는 농도가 되도록 상기 수용성 유기용매에 용해함으로써 제조할 수 있다.
<혈소판 측정용 시약 키트>
상기 혈소판 측정용 시약은 색소를 포함하는 혈소판 측정용 시약을 희석하기 위한 완충제를 함유하는 시약과 조합하여 시약 키트로 할 수 있다.
즉, 나일 블루 황산수소염, 또는 나일 블루 및 산을 포함하는 제 1 시약(이하, 「색소 시약」이라고 하는 경우가 있음)과, 완충제를 포함하는 제 2 시약(이하, 「희석 시약」이라고 하는 경우가 있음)을 포함하는 혈소판 측정용 시약 키트도 본 발명의 하나이다.
상기 제 1 시약에 대해서는 상기 혈소판 측정용 시약에 대해 말한 것과 동일하다.
제 2 시약에 포함되는 완충제는 제 2 시약의 pH를 원하는 범위로 유지할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않지만, 카르복시산염류, 인산염, 굿 버퍼, 타우린, 트리에탄올아민 등을 원하는 pH에 따라 이용할 수 있다. 완충제는 희석 시약의 pH가 6.0~11.0의 범위가 되도록 희석 시약 중에 포함되어 있는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 7.0~10.0, 더욱 바람직하게는 8.0~9.5이다. 희석 시약의 pH를 6.0 이상으로 함으로써, 희석 시약과 검체가 혼합되었을 때에 적혈구가 용혈하기 어려워져 협잡물인 파쇄 적혈구를 저감시키는 것이 가능해지고, 또 pH를 11.0 이하로 함으로써, 파쇄 적혈구의 비특이적 염색을 저감시키는 것이 가능해진다.
상기 제 2 시약은, 따라서 pH 6.0~11.0의 완충액인 것이 바람직하다.
상기 희석 시약은 상기 완충제 외에, 침투압 보상제, 나일 블루에 의한 혈소판의 염색을 촉진시키기 위한 염색 촉진제 등의 성분을 더 포함할 수 있다.
침투압 보상제는 희석 시약의 침투압을 적절한 범위로 유지시키기 위한 화합물이면 되고, 예를 들면 프로피온산 등의 유기산의 알칼리 금속염, 글루코오스, 만노오스 등의 당류를 들 수 있다. 또, NaCl과 같은 알칼리 금속 할로겐화물이나 알칼리 토류 금속 할로겐화물도 이용할 수 있다. 상기 침투압 보상제는 1종 또는 2종 이상을 이용할 수 있다.
침투압 보상제는 희석 시약의 침투압을 150~600mOsm/kg으로 조정되도록 희석 시약에 포함되어 있는 것이 바람직하고, 보다 바람직하게는 200~300mOsm/kg이다. 이와 같은 범위의 침투압으로 함으로써, 시약 키트의 각 시약과 검체가 혼합되었을 때의 침투압을 생리적 침투압에 접근시킬 수 있어 적혈구의 저장 용혈 등을 막을 수 있기 때문에, 파쇄 적혈구의 증가가 억제되어 보다 정밀도 좋게 혈소판을 측정할 수 있다. 또한, 상기 완충제를 이용하여 희석 시약의 침투압을 상기 범위로 조정할 수 있는 경우에는 침투압 보상제는 이용하지 않아도 된다.
상기 염색 촉진제는 나일 블루의 혈소판에 대한 투과성을 촉진할 수 있는 화합물이면 되고, 계면활성제, 특히 양이온 계면활성제가 바람직하다.
바람직한 양이온 계면활성제는 이하의 식 (I):
Figure pct00002
(식 중, R11은 탄소수 8~12의 알킬기이고; R12, R13 및 R14는 동일 또는 상이하고, 탄소수 1~6의 알킬기이며; Y-는 음이온이다)로 나타내는 것이다.
상기 식 (I)에 있어서, R11로서의 탄소수 8~12의 알킬기는 직쇄상 또는 분기쇄상 중 어느 것이어도 되고, 예를 들면 옥틸기, 데실기, 라우릴기, 세틸기, 미리스틸기 등을 들 수 있다.
R12, R13 또는 R14로서의 탄소수 1~6의 알킬기는 직쇄상 또는 분기쇄상 중 어느 것이어도 되고, 예를 들면 메틸, 에틸, 프로필, 부틸, 이소부틸, sec-부틸, tert-부틸, 펜틸 및 헥실기를 들 수 있다. 그 중에서도, 메틸 또는 에틸기가 바람직하다.
Y-인 음이온으로는 브롬 이온 또는 염소 이온이 바람직하다.
상기 식 (I)의 바람직한 양이온 계면활성제는 데실트리메틸암모늄브로마이드(DTAB), 옥틸트리메틸암모늄브로마이드(OTAB), 라우릴트리메틸암모늄클로라이드(LTAC), 세틸트리메틸암모늄클로라이드(CTAC), 미리스틸트리메틸암모늄브로마이드(MTAB) 등을 들 수 있다. 이들 양이온 계면활성제는 1종 또는 2종 이상을 이용해도 된다.
상기 양이온 계면활성제는 50~20000ppm의 농도로 희석 시약에 포함되어 있는 것이 바람직하고, 특히 바람직한 농도는 양이온 계면활성제의 종류에 따라 다르지만, 예를 들면 DTAB를 이용하는 경우의 농도는 500~3000ppm 정도, LTAC를 이용하는 경우의 농도는 100~500ppm 정도가 바람직하다. 양이온 계면활성제가 이와 같은 농도로 희석 시약에 포함되어 있음으로써, 혈소판 측정용 시약 키트의 각 시약과 검체를 혼합했을 때에 적혈구의 용혈을 일으키는 일 없이 매우 적합하게 혈소판의 염색을 촉진할 수 있다.
나아가 상기 희석 시약은 상기 성분 이외에, 예를 들면 2-피리딜티오-1-옥사이드나트륨, β-페네틸알코올 등의 방부제를 포함하고 있어도 된다.
상기 희석 시약에 포함되는 완충제 및 이 희석 시약에 포함될 수 있는 임의의 성분은 색소 시약에 미리 혼합할 수도 있지만, 색소 시약에 포함되는 나일 블루는 물이나 알칼리 성분에 의해서 열화하는 일이 있기 때문에 색소 시약과 희석 시약을 별도의 시약으로서 포함하는 상기의 시약 키트가 보존 안정성상 바람직하다.
본 실시 형태에 의한 혈소판 측정용 시약 키트는 도 1에 나타내는 바와 같이, 색소 시약을 수용하기 위한 제 1 용기(A)와 희석 시약을 수용하기 위한 제 2 용기(B)에 수용될 수 있다. 이와 같이, 색소 시약과 희석 시약이 다른 용기에 수용됨으로써 색소 시약에 포함되는 나일 블루가 희석 시약에 포함되는 물이나 알칼리 성분에 의해서 열화하는 일이 없어 보존 안정성이 뛰어난 혈소판 측정용 시약 키트를 제공할 수 있다.
<혈소판 측정 방법>
상기 혈소판 측정용 시약 또는 혈소판 측정용 시약 키트는 혈소판을 포함할 수 있는 검체와 혼합함으로써, 이 혈소판을 염색할 수 있다.
따라서, 본 발명은 상기 혈소판 측정용 시약 또는 혈소판 측정용 시약 키트를 이용하여 혈소판 측정 방법을 더 제공한다.
본 발명의 측정 방법은
나일 블루 황산수소염, 또는 나일 블루 및 산을 함유하는 제 1 시약과 검체를 혼합하여 측정용 시료를 조제하는 단계와,
얻어진 측정용 시료 중의 세포에 빛을 조사하여, 이 세포로부터 발해지는 산란광 및 형광을 검출하는 단계와,
검출된 산란광 및 형광에 근거하여 측정용 시료에 포함되는 혈소판을 검출하는 단계를 포함한다.
상기 측정 방법에 있어서, 제 1 시약과 검체를 혼합하는 단계에 있어서, 완충제를 포함하는 제 2 시약을 더 혼합하거나 또는 하지 않아도 되지만, 바람직하게는 제 2 시약이 더 혼합된다.
상기 제 1 시약 및 제 2 시약에 대해서는, 상기 혈소판 측정용 시약 키트에 대해 기술한 것과 동일하다.
상기 검체는 생체, 특히 사람을 포함하는 포유 동물로부터 채취한 혈액(전혈, 다혈소판 혈장(PRP) 등) 및 골수액을 포함한다. 검체는 이러한 혈액 또는 골수액을 완충액 등의 적당한 용액으로 희석한 것이어도 된다.
상기 제 1 시약과 검체는 혼합했을 때에 측정용 시료 중 나일 블루의 농도가 0.05~5.0ppm, 바람직하게는 0.1~0.6ppm, 더욱 바람직하게는 0.2~0.5ppm가 되도록 혼합하는 것이 바람직하다.
상기 제 1 시약은 검체와 혼합하여 얻어지는 측정용 시료 중 나일 블루의 농도를 상기의 것으로 하기 위해서, 제 2 시약으로 희석되어 있어도 된다.
따라서, 제 2 시약을 이용하는 경우, 상기 제 1 시약 및 제 2 시약과 검체는 제 1 시약 + 제 2 시약 : 검체 = 100:1 ~ 1000:1의 용량비로 혼합하는 것이 바람직하다.
또, 제 2 시약을 이용하는 경우, 제 1 시약과 제 2 시약의 용량비는 1:10 ~ 1:100이 바람직하고, 보다 바람직하게는 1:20 ~ 1:75이다.
상기 혼합하는 단계에 있어서, 제 2 시약을 가하는 경우 제 1 시약, 제 2 시약 및 검체의 혼합 순서는 특별히 한정되지 않는다.
상기 혼합하는 단계는 25~50℃ 정도, 보다 바람직하게는 35~45℃ 정도의 온도에서 실시하는 것이 바람직하다. 또, 혼합은 10초~5분 정도, 보다 바람직하게는 10초~2분 정도, 더욱 바람직하게는 10초~60초 정도의 시간 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명의 측정 방법에 있어서는, 그 다음에 상기와 같이 하여 얻어진 측정용 시료 중의 세포에 빛을 조사하여, 이 세포로부터 발해지는 산란광 및 형광을 검출한다.
광을 조사하기 위한 장치로는 플로우 사이토미터(flow cytometer)가 바람직하다. 플로우 사이토미터를 이용하는 경우, 이 측정용 시료는 플로우 사이토미터의 플로우 셀에 도입되어 플로우 셀 내를 흐르는 측정용 시료 중의 세포에 빛이 조사되게 된다.
이용하는 플로우 사이토미터의 광원은 특별히 한정되지 않고, 나일 블루의 여기에 적합한 파장(예를 들면 600~680㎚ 부근)의 광원을 이용할 수 있다. 광원으로는, 예를 들면 적반도체 레이저, He-Ne 레이저 등을 들 수 있다. 특히 반도체 레이저는 기체 레이저에 비해 상당히 저렴하여 매우 적합하다.
상기와 같은 플로우 사이토미터에 있어서 빛을 조사함으로써 세포로부터 발해지는 산란광은 전방 산란광(수광 각도 0~20°부근) 또는 측방 산란광(수광 각도 90°부근) 중 어느 것이어도 된다. 또, 전방 산란광으로는 전방 저각 산란광(수광 각도 1~5°부근) 또는 전방 고각 산란광(수광 각도 6~20°부근) 중 어느 것이어도 된다.
상기와 같은 플로우 사이토미터에 있어서 빛을 조사함으로써 세포로부터 발해지는 형광에 대해서는, 나일 블루에 적당한 수광 파장(630~680㎚ 정도)을 선택할 수 있다.
상기와 같이 하여 얻어진 산란광 및 형광에 근거하여 스캐터그램을 작성함으로써, 혈소판과 그 외의 혈구 성분 및 지방 입자 등의 협잡물을 구별하여 혈소판을 검출할 수 있다. 이와 같이 하여 검출된 혈소판을 계수할 수도 있다. 혈소판의 검출 및/또는 계수에는 적절한 해석용 소프트웨어를 이용하는 것이 바람직하다.
이하에, 도면을 참조하여, 플로우 사이토미터를 구비한 시료 분석 장치를 이용하는 혈소판의 측정에 대해 설명한다.
도 2는 시료 분석 장치의 개략 구성을 나타내는 정면도이다. 이 시료 분석 장치(1)는, 예를 들면 혈액 검사에 사용되는 장치이며, 도 2에 나타내는 바와 같이, 측정 유니트(2)와 데이터 처리 유니트(3)에 의해 주로 구성되어 있고, 측정 유니트(2)에 의해 혈액 검체 중에 포함되는 성분에 대해 소정의 측정을 실시해 이 측정 데이터를 데이터 처리 유니트(3)에서 수신해 분석 처리를 실시하게 되어 있다.
도 3은 시료 분석 장치(1)의 개략 구성을 나타내는 블럭도이다. 도 3에 나타내는 바와 같이, 측정 유니트(2)는 각 부의 동작을 제어하기 위한 제어부(4)와 시료 중의 피검 입자를 검출하기 위한 플로우 사이토미터를 구비한 검출부(5)와 측정용 시료를 조제해, 조제된 측정용 시료를 검출부(5)에 공급하기 위한 시료 조제부(6)와 데이터 처리 유니트(3)와 데이터 송수신을 행하기 위한 인터페이스(7)를 구비하고 있다. 데이터 처리 유니트(3)는 각 부의 동작을 제어하기 위한 제어부(8)와 측정 유니트(2)로부터 수신한 검출 데이터를 분석하기 위한 데이터 분석부(9)와 데이터 분석부(9)에 의한 분석 결과를 스캐터그램으로서 표시하는 표시부(10)와 오퍼레이터로부터의 조작을 받아들이는 조작부(11)와 측정 유니트(2)와 데이터 송수신을 행하기 위한 인터페이스(12)를 구비하고 있다.
다음에, 플로우 사이토미터를 구비한 검출부(5)의 구성에 대해서, 도 4를 참조해 설명한다. 도 4는 검출부의 구성을 나타내는 개략 평면도이다. 검출부(5)에는 반도체 레이저 광원(52)이 플로우 셀(51)을 향하여 레이저 광을 출사하도록 배치되어 있다. 반도체 레이저 광원(52)과 플로우 셀(51)의 사이에는 복수의 렌즈로 이루어진 조사 렌즈계(53)가 배치되어 있다. 반도체 레이저 광원(52)으로부터 직선적으로 늘어난 광축 상에는 플로우 셀(51)을 사이에 두고 조사 렌즈계(53)에 대향하도록 빔 스토퍼(54a)가 설치되어 있어 반도체 레이저 광원(52)로부터의 직접광은 빔 스토퍼(54a)에 의해서 차광된다. 또, 빔 스토퍼(54a)의 더욱 광축 하류축에는 포토다이오드(54)가 배치되어 있다.
플로우 셀(51)에 측정용 시료가 흐르면, 레이저 광에 의해 산란광 및 형광의 광 신호가 발생한다. 이중 전방의 신호 광이 상기 포토다이오드(54)를 향하여 조사된다. 반도체 레이저 광원(52)으로부터 직선적으로 늘어난 광축을 따라 진행하는 빛 가운데, 반도체 레이저 광원(52)의 직접광은 빔 스토퍼(54a)에 의해 차단되어 포토다이오드(54)에는 대체로 상기 광축 방향을 따라 진행하는 산란광(이하, 전방 산란광이라 함)만이 입사한다. 플로우 셀(51)로부터 발하여진 전방 산란광은 포토다이오드(54)에서 광전 변환되어 이것에 의해서 생긴 전기 신호(이하, 전방 산란광 신호라고 함)가 앰프(54b)에 의해서 증폭된다. 그리고, 전방 산란광 신호는 제어부(4)에 출력된 후, 인터페이스(7)를 통하여 데이터 처리 유니트(3)에 출력되고, 데이터 처리 유니트(3)의 데이터 분석부(9)에서 신호 처리된다.
이러한 전방 산란광 신호는 피검 입자의 크기를 반영하고 있어, 데이터 분석부(9)가 이 전방 산란광 신호를 신호 처리함으로써, 피검 입자의 크기 등을 얻게 되어 있다.
또, 반도체 레이저 광원(52)으로부터 포토다이오드(54)로 직선적으로 늘어나는 광축으로 대해 직교하는 방향에는 측방 집광 렌즈(55)가 배치되어 있어, 플로우 셀(51) 내를 통과하는 피검 입자에 반도체 레이저를 조사했을 때에 발생하는 측방 광(상기 광축에 대해 교차하는 방향으로 출사되는 빛)이 이 측방 집광 렌즈(55)에서 모아지게 되어 있다. 측방 집광 렌즈(55)의 측방 광의 진행 방향에 대해 하류 측에는 다이크로익 미러(dichroic mirror)(56)가 설치되어 있어 측방 집광 렌즈(55)로부터 보내진 신호 광은 다이크로익 미러(56)에서 산란광 성분과 형광 성분으로 나뉠 수 있다. 다이크로익 미러(56)의 측방(측방 집광 렌즈(55)와 다이크로익 미러(56)를 묶는 광축 방향에 교차하는 방향)에는 측방 산란광 수광용 포토다이오드(57)가 설치되어 있어 다이크로익 미러(56)의 상기 광축 하류 측에는 광학 필터(58a) 및 포토멀티플라이어(photo multiplier)(58)가 설치되어 있다. 그리고, 다이크로익 미러(56)로 나뉘어진 측방 산란광 성분은 포토다이오드(57)로 광전 변환되어 이것에 의해 생긴 전기 신호(이하, 측방 산란광 신호라고 함)가 앰프(57a)에 의해서 증폭된다. 측방 산란광 신호는 제어부(4)에 출력된 후, 인터페이스(7)를 통하여 데이터 처리 유니트(3)에 출력되어 데이터 처리 유니트(3)의 데이터 분석부(9)에서 신호 처리된다.
이 측방 산란광 신호는 피검 입자의 내부 정보(예를 들면, 백혈구의 핵의 크기 등)를 반영하고 있어, 데이터 분석부(9)가 이 측방 산란광 신호를 신호 처리함으로써 백혈구의 핵의 크기 등을 얻게 되어 있다.
또, 다이크로익 미러(56)로부터 발해진 측방 형광 성분은 광학 필터(58a)에 의해서 파장 선택된 후, 포토멀티플라이어(58)에서 광전 변환되어 이것에 의해 생겼던 전기 신호(측방 형광 신호)가 앰프(58b)에 의해 증폭된다. 측방 형광 신호는 제어부(4)에 출력된 후, 인터페이스를 통하여 데이터 처리 유니트(3)에 출력되어 데이터 처리 유니트(3)의 데이터 분석부(9)에서 신호 처리된다.
이 측방 형광 신호는 피검 입자의 염색 정도에 관한 정보를 반영하고 있어, 데이터 분석부(9)가 이 측방 형광 신호를 신호 처리함으로써, 피검 입자의 염색성 등을 얻도록 되어 있다.
데이터 처리 유니트(3)의 데이터 분석부(9)는 상기와 같이 하여 얻어진 전방 산란광 신호, 측방 산란광 신호 및 형광 신호를 분석해 피검 입자를 검출하고, 나아가 검출된 피검 입자의 계수를 실시할 수 있다. 더욱이 데이터 분석부(9)는 전방 산란광 신호, 측방 산란광 신호 및 형광 신호의 분석 결과에 근거하여 스캐터그램을 작성한다. 작성된 스캐터그램은 표시부(10)에 표시된다.
이와 같은 시료 분석 장치를 이용하여 혈소판을 측정할 수 있다.
우선, 시료 조제부(6)에 있어서, 검체와 혈소판 측정용 시약, 혹은 검체와 혈소판 측정용 시약 키트에 포함되는 각 시약이 혼합되어, 측정용 시료가 조제된다. 여기서 사용되는 혈소판 측정용 시약 또는 혈소판 측정용 시약 키트로서 상기 혈소판 측정용 시약 또는 혈소판 측정용 시약 키트를 사용할 수 있다. 상기 혈소판 측정용 시약 또는 혈소판 측정용 시약 키트의 색소 시약에는 나일 블루가 포함되어 있어 이 나일 블루가 검체에 포함되는 혈소판을 염색한다.
시료 조제부(6)는 측정용 시료 중 나일 블루의 농도가 0.05~5.0ppm (0.00014~0.014mmol/L), 바람직하게는 0.1~0.6ppm, 더욱 바람직하게는 0.2~0.5ppm가 되도록 검체와 상기 혈소판 측정용 시약 또는 상기 혈소판 측정용 시약 키트에 포함되는 각 시약을 혼합하여 측정용 시료를 조제하는 것이 바람직하다. 측정용 시료를 조제할 때의 반응 온도 및 반응 시간은 혈소판 측정용 시약의 설명에서 기재한 반응 온도 및 반응 시간이 바람직하다.
다음에, 시료 조제부(6)에서 조제된 측정용 시료는 시료 조제부(6)로부터 검출부(5)에 공급된다. 검출부(5)에서 측정용 시료는 플로우 사이토미터의 플로우 셀(51)에 도입되고, 반도체 레이저 광원(52)에 의해서 측정용 시료 중의 피검 입자에 레이저 광이 조사된다. 레이저 광을 조사하여 얻어진 피검 입자의 전방 산란광 신호, 측방 산란광 신호 및 형광 신호는 데이터 처리 유니트(3)의 데이터 분석부(9)에서 신호 처리된다.
데이터 분석부(9)는 측정용 시료 중의 혈소판을 검체에 포함되는 파쇄 적혈구나 지방 입자와 같은 다른 성분으로부터, 전방 산란광 신호 및 형광 신호에 근거하여 명확하게 구별하여 검출할 수 있다. 데이터 분석부(9)는 이와 같이 하여 검출된 혈소판을 계수할 수도 있다. 이와 같이 전방 산란광 신호 및 형광 신호에 근거하여 혈소판을 검출 및 계수하기 위해서, 데이터 분석부(9)의 신호 처리에 적절한 해석용 소프트웨어를 사용하는 것이 바람직하다.
또한, 여기서는 전방 산란광 신호와 형광 신호에 근거하여 혈소판을 검출하는 구성을 나타냈지만, 이와 같은 구성으로 한정하지 않고, 예를 들면 측방 산란광 신호와 형광 신호에 근거하여 혈소판을 검출하는 구성이어도 된다.
실시예
본 발명을 이하의 실시예에 따라서 보다 상세하게 설명하지만, 이들 실시예는 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.
실험예 1~8
나일 블루 황산수소염을 포함하는 혈소판 측정용 시약의 보존 안정성
여기서는, 색소 시약의 보존 안정성을 검증하기 위해, 표 1에 기재된 나일 블루를 표 1에 기재된 농도가 되도록 함유시킨 혈소판 측정용 시약(색소 시약)을 조제하고, 색소 시약 중 나일 블루의 유효 색소 성분 농도를 반영하는 파라미터인 흡광도를 측정하여, 색소 시약 중 나일 블루의 보존 안정성을 평가했다.
혈소판 측정용 시약
색소 이하에 기재된 농도
에틸렌글리콜 5mL
[표 1]
Figure pct00003

얻어진 색소 시약을 에탄올로 10배로 희석하고, 분광 광도계를 이용하여 색소의 흡광 스펙트럼이 최대가 되는 630㎚에서의 각 색소 시약의 흡광도를 측정했다. 또한, 흡광도 측정은 에탄올을 대조로 하여 실시했다. 또한, 이 희석한 시약을 45℃에서 보존하고, 희석 후 2개월째, 4개월째 및 7개월째에서의 흡광도를 측정해 그 변화율을 구했다. 흡광도 측정의 결과를 표 2-1에, 흡광도 변화율을 표 2-2에 나타낸다.
또한, 「흡광도 변화율」이란, 해당 실험예로부터 얻어진 복수의 흡광도 측정값 가운데 가장 측정값이 높은 것을 기준값으로 하여 흡광도의 변화 비율을 백분율로 나타낸 것이다.
[표 2-1]
Figure pct00004

[표 2-2]
Figure pct00005

표 2-2에 나타나는 대로, 색소로서 나일 블루 황산수소염을 이용한 실험예 1의 색소 시약의 흡광도 저하는 2개월째에서 2.5%, 4개월째에서 5.0%, 7개월째에서 6.9%였다. 동일한 색소로서 나일 블루 황산수소염을 이용한 실험예 2의 색소 시약의 흡광도 저하는 2개월째에서 3.5%, 4개월째에서 6.9%, 7개월째에서 16.9%였다.
한편, 반대 이온이 황산수소 이온이 아닌 나일 블루를 이용한 실험예 3~8의 색소 시약은 2개월째에서 10% 이상, 4개월째에서 20% 이상, 7개월째에서 30% 이상이나 흡광도가 저하하고 있었다.
이들 실험예 3~8과의 대비에 의해서도 분명한 바와 같이, 반대 이온이 황산수소 이온인 나일 블루를 이용한 실험예 1 및 2의 색소 시약은 반대 이온이 황산수소 이온이 아닌 나일 블루를 이용한 색소 시약에 비해 시간 경과에 수반하는 흡광도의 저하가 작아, 보존 안정성이 뛰어난 것을 알 수 있다.
실험예 9~13
나일 블루 황산수소염을 함유하는 혈소판 측정용 시약의 혈소판 염색성
여기서는, 나일 블루 황산수소염을 함유하는 혈소판 측정용 시약에 의한 혈소판의 염색성을 검증하기 위해서, 이하의 실험을 실시했다.
우선, 다음의 조성으로 이루어진 색소 시약과 희석 시약으로 이루어진 시약 키트를 제조했다.
(1) 색소 시약
혈소판을 염색하기 위한 색소 이하에 기재된 농도
에틸렌글리콜 1L
(2) 희석 시약
트리신(완충제) 1.8g
라우릴트리메틸암모늄클로라이드(LTAC) 0.15g
정제수 1L
(pH 9.0, 침투압 200mOsm/kg·H2O로 조정)
상기 혈소판을 측정하기 위한 색소로서 표 3에 나타낸 색소를 각각 표 3에 나타낸 농도로 이용했다. 또한, 괄호 안에는 시약과 검체가 혼합되었을 때의 최종 농도를 나타냈다.
이들 색소의 화학식은 표 3에 나타내는 대로이다.
상기 희석 시약 1mL를 튜브에 분주하여 40℃의 수조에서 가온하고, 이 희석 시약에 얻어진 색소 시약 20μL 및 검체로서 건강한 사람의 전혈 5μL를 추가로 첨가하고, 40℃에서 25초간 반응시켜 측정용 시료를 조제했다. 이 측정용 시료를 633㎚ 파장의 빛을 발하는 광원을 가지는 플로우 사이토미터의 검출부에 도입하고, 측정용 시료 중의 세포에 여기 광을 조사하여, 이 세포로부터 발해지는 산란광 신호 및 형광 신호를 검출하여, 얻어진 신호를 해석해 측정용 시료 중의 혈소판을 측정했다. 이들 측정용 시료의 조제 및 플로우 사이토미터에 의한 혈소판 측정에는 혈액 분석 장치 XE-2100(시스멕스사제)를 이용했다. 또한, 상기 혈액 분석 장치는 광원의 출력을 통상의 3W에서 9W로 변경한 개조기를 이용했다.
[표 3]
Figure pct00006

실험예 9~13으로부터 얻어진 스캐터그램을 각각 도 5~도 9에 나타낸다. 또한, 각 도 (a)는 세로축에 전방 산란광 강도, 가로축에 형광 강도를 취한 스캐터그램이고, 각 도 (b)는 각 도 (a)에 나타내는 스캐터그램의 세로축을 log로 변환한 것이다. 각 도 (b)에 있어서, 혈소판이 출현하는 영역을 실선으로 나타냈다. 각 실험예의 측정 결과는 표 3에 나타낸 대로이다.
도 5~도 9로부터도 분명한 바와 같이, 혈소판을 염색하기 위한 색소로서 나일 블루 황산수소염을 이용한 실험예 9 및 10은 나일 블루가 없는 다른 색소를 이용한 실험예 11~13에 비해, 혈소판이 잘 염색되므로 형광 강도가 강한 범위에서 혈소판을 검출할 수 있다는 것을 알 수 있다.
따라서, 혈소판을 염색하기 위한 색소로서 나일 블루 황산수소염을 이용함으로써, 다른 혈구 성분과 보다 양호하게 구별하여 혈소판을 측정할 수 있다.
다음에, 혈액 중에 지질 입자 등의 협잡물이 존재하는 경우라도 나일 블루 황산수소염을 이용한 실험예 9 및 10의 색소 시약을 이용함으로써, 혈소판을 특이적으로 염색할 수 있는지 아닌지를 검증했다.
실험예 9 및 10의 색소 시약을 사용하여, 파쇄 적혈구 함유 혈액 및 지질 입자 함유 혈액의 혈소판 측정을 실시했다. 또한, 실험 방법은 건강한 사람의 전혈 대신에 파쇄 적혈구 함유 혈액 및 지질 입자 함유 혈액을 사용한 점을 제외하고는 상기와 동일하기 때문에, 상세한 설명은 생략한다.
실험예 9의 색소를 이용하여 파쇄 적혈구 함유 혈액, 지질 입자 함유 혈액을 측정하여 얻어진 스캐터그램을 각각 도 10, 도 11에 나타낸다. 실험예 10의 색소를 이용하여 파쇄 적혈구 함유 혈액, 지질 입자 함유 혈액을 측정하여 얻어진 각각 스캐터그램을 도 12, 도 13에 나타낸다. 또한, 각 도 (a)는 세로축에 전방 산란광 강도, 가로축에 형광 강도를 취한 스캐터그램이고, 각 도 (b)는 각 도 (a)에 나타내는 스캐터그램의 세로축을 log로 변환한 것이며, 각 도 (c)는 각 도 (b)의 혈소판 출현 영역의 주변을 확대한 것이다. 각 도 (c)에 있어서, 혈소판이 출현하는 영역을 실선으로 나타냈다.
도 10~도 13의 결과로부터, 실험예 9 및 10의 색소 시약은 혈액 중의 파쇄 적혈구나 지질 입자 등의 협잡물과 명확하게 구별하여 혈소판을 특이적으로 염색할 수 있다는 것을 알 수 있다. 따라서, 혈소판을 염색하기 위한 색소로서 나일 블루 황산수소염 혈소판을 이용함으로써, 혈액 중에 파쇄 적혈구나 지질 입자 등의 협잡물이 존재하는 경우라도 다른 혈구 성분과 보다 양호하게 구별하여 혈소판을 측정할 수 있다.
실험예 1 및 2로부터, 나일 블루 황산수소염을 이용한 색소 시약은 시간의 경과에 따른 흡광도의 저하가 작아, 보존 안정성이 뛰어난 것을 말할 수 있다. 또, 실험예 9 및 10으로부터, 혈소판을 염색하기 위한 색소로서의 나일 블루 황산수소염은 혈액 중의 혈소판을 특이적으로 염색할 수 있어 파쇄 적혈구나 지질 입자 등의 협잡물이 존재하는 혈액이더라도 정확한 혈소판 측정을 가능하게 하는 색소인 것을 말할 수 있다.
실험예 14~24
여러 가지 농도의 나일 블루 황산수소염을 포함하는 혈소판 측정용 시약의 혈소판 염색성
나일 블루 황산수소염(머크사제)의 색소 시약을 이하의 표 4에 기재하는 농도로 에틸렌글리콜 중에 조제했다.
얻어진 색소 시약을 실험예 9~13에 기재한 바와 같은 희석 시약과 조합하여 이용하고, 건강한 사람의 전혈, 파쇄 적혈구 함유 혈액 및 지질 입자 함유 혈액을 검체로서 이용하여 실험예 9~13와 마찬가지로 하여 혈소판을 측정했다.
[표 4]
Figure pct00007

얻어진 스캐터그램을 도 14에 나타낸다.
도 14의 결과로부터, 시험한 모든 농도 범위에 있어서, 나일 블루 황산수소염을 이용하여 양호하게 혈소판 측정을 실시할 수 있었다는 것을 알 수 있다.
그 중에서도, 파쇄 적혈구 함유 혈액을 검체로서 이용했을 경우에, 실험예 17~22의 혈소판 측정용 시약(나일 블루 황산수소염의 최종 농도: 0.24~0.44㎎/L)를 이용하여 측정하면, 혈소판과 다른 혈구 성분 및 협잡물의 분리가 보다 명확하다는 것을 알 수 있다.
실험예 25
나일 블루 황산수소염을 포함하는 혈소판 측정용 시약의 보존 안정성
나일 블루 황산수소염(머크사제)의 색소 시약을 14.4ppm 농도가 되도록 에틸렌글리콜 중에 조제했다. 이 색소 시약을 45℃의 온도 조건하에서 16주간 보존해, 보존 후의 색소 시약을 사용해 검체를 측정했다.
검체는 건상인(健常人)으로부터 채취된 혈액, 낮은 값의 혈소판 혈액, 인공 지질 함유 혈액 및 파쇄 적혈구 함유 혈액을 이용하여 실험예 9~13에 기재한 바와 같이 하여 혈소판을 측정했다.
얻어진 스캐터그램을 도 15에 나타낸다.
도 15의 스캐터그램으로부터 분명한 바와 같이, 어느 검체에 있어서도 협잡물과 명확하게 구별하여 혈소판을 염색할 수 있다는 것을 알 수 있다.
이 결과로부터, 혈소판을 염색하기 위한 색소로서 나일 블루 황산수소염을 이용함으로써, 색소에 있어 불리한 조건 하에서 장기간 보존했을 경우라도 협잡물의 영향을 억제해 혈소판을 정밀도 좋게 측정할 수 있다는 것이 나타났다.
상기 조건 하에서의 보존에 의한 색소 농도의 변화를 검토하기 위해, 다음의 실험을 실시했다.
색소 시약의 조제 직후 및 보존 후 16주째에서의 색소 시약을 에탄올로 10배로 희석하여 628㎚에서의 흡광도를 측정한 것 이외에는 실험예 1~8과 마찬가지로 하여 흡광도를 측정했다. 또한, 측정된 흡광도의 저하율에 근거하여, 보존 후 16주째에서의 색소 시약 중의 색소 농도를 구했다. 이들 결과를 이하의 표 5에 나타낸다.
[표 5]
Figure pct00008

표 5에 나타냈던 대로, 보존 후 16주째에서의 색소 원액의 색소 농도는 13.1ppm으로 환산되었다. 따라서, 상기 조건 하에서 보존한 후이어도 혈소판을 측정하기 위한 바람직한 색소 농도를 유지할 수 있다는 것을 알 수 있다.
실험예 26~29
나일 블루와 산을 함유하는 혈소판 측정용 시약의 보존 안정성
여기서는, 나일 블루를 용해한 용액(나일 블루 용액)에 염산 또는 수산화나트륨을 함유시켰을 경우의 나일 블루 용액의 보존 안정성을 조사하는 실험을 실시했다. 나일 블루 용액의 보존 안정성은 용액 중 나일 블루의 유효 색소 성분 농도를 반영하는 파라미터인 흡광도를 측정함으로써 평가했다.
또한, 이하의 설명에 있어서 「흡광도 변화율」이란, 해당 실험예로부터 얻어진 복수의 흡광도 측정값 가운데 가장 측정값이 높은 것을 기준값으로 하여 흡광도 변화의 비율을 백분율로 나타낸 것이다.「초기 흡광도」란, 해당 실험예와 관련되는 색소 시약의 조제 직후의 흡광도 측정값이다.
본 실험예에 있어서는, 반대 이온이 황산 이온인 나일 블루(나일 블루 A, 시그마사제)를 사용했다. 이 나일 블루를 0.02mmol/L의 농도가 되도록 에틸렌글리콜에 용해시켜 나일 블루 용액을 조제했다(비교예 1).
더욱이, 이 나일 블루 용액 5mL에 이하에 기재된 물질을 이하에 기재된 농도가 되도록 함유시켜 실험예 26~29로 했다.
실험예
26 염산 2mmol/L
27 염산 0.02mmol/L
28 수산화나트륨 2mmol/L
29 수산화나트륨 0.02mmol/L
각 용액을 에탄올로 5배로 희석하고, 분광 광도계를 이용하여 색소의 흡광 스펙트럼이 최대가 되는 630㎚에서의 각 용액의 흡광도를 측정했다. 또한, 이 희석 용액을 60℃의 온도 부하 조건 하에서 보존하고, 희석 후 2주째 및 4주째에서의 흡광도를 측정해 그 흡광도 변화율을 구했다. 또한, 흡광도 측정은 에탄올을 대조로 했다. 흡광도 측정의 결과를 표 6-1에, 흡광도 변화율을 표 6-2에 나타낸다.
[표 6-1]
Figure pct00009
[표 6-2]
Figure pct00010

표 6-1에 나타나는 대로, 염산 또는 수산화나트륨을 첨가하고 있지 않은 비교예 1의 초기 흡광도는 0.5158이었다. 또, 비교예 1의 흡광도 변화율은 표 6-2에 나타내는 대로 조제 후 2주간에 -2.4%, 조제 후 4주간에 -16.5%였다.
염산을 함유하고 있는 실험예 26 및 27의 초기 흡광도에 대해 보면, 표 6-1에도 나타내고 있는 바와 같이, 실험예 26의 초기 흡광도는 0.5388, 실험예 27의 초기 흡광도는 0.5319로, 비교예 1의 초기 흡광도와의 사이에 큰 차이는 확인되지 않았다.
흡광도 변화율에 대해 보면, 표 6-2에 나타나는 대로 2mmol/L 농도의 염산을 함유하고 있는 실험예 26의 흡광도 변화율은 2주째에서 -85.2%, 4주째에서 -99.0%로, 비교예 1에 비해 시간의 경과에 수반하는 흡광도의 저하가 현저하게 되어 있다. 즉, 나일 블루 용액의 보존 안정성이 저하되고 있다는 것을 알 수 있다.
한편, 0.02 mmol/L 농도의 염산을 함유하고 있는 실험예 27의 흡광도 변화율은 2주째에서 -0.6%, 4주째에서 -10.9%로, 비교예 1에 비해 시간의 경과에 수반하는 흡광도의 저하가 완만하게 되어 있는 것을 알 수 있다. 즉, 나일 블루 용액의 보존 안정성이 향상하고 있다는 것을 알 수 있다.
수산화나트륨을 첨가한 실험예 28 및 29의 초기 흡광도에 대해 보면, 표 6-1에 나타내는 바와 같이, 실험예 28의 초기 흡광도는 0.0065, 실험예 29의 초기 흡광도는 0.4948로, 모두 비교예 1에 비해 초기 흡광도가 저하되고 있다.
나아가 흡광도 변화율에 대해 보면, 표 6-2에 나타내는 바와 같이 실험예 28 및 29의 흡광도 변화율은 모두 조제 후 4주째에서 -20% 이하로, 비교예 1에 비해 시간의 경과에 수반하는 흡광도의 저하가 현저하게 되어 있다는 것을 알 수 있다. 즉, 나일 블루 용액의 보존 안정성이 저하되고 있다는 것을 알 수 있다.
이들 실험 결과로부터, 나일 블루 용액에 염산을 소정의 농도로 첨가함으로써, 나일 블루 용액의 보존 안정성이 향상되는 것이 시사되었다.
실험예 30~36
혈소판 측정용 시약의 보존 안정성에 대한 나일 블루와 염산의 몰 농도비 의 영향
상기 실험예 26~29로부터 염산을 소정의 농도로 첨가함으로써, 나일 블루 용액의 보존 안정성이 향상하는 것을 알 수 있었다.
여기서, 나일 블루 용액의 보존 안정성, 즉 나일 블루의 유효 색소 성분 농도의 저하는 용액 중 나일 블루의 유효 색소 성분의 분해에 의한 것이라고 생각되기 때문에, 용액에 첨가되는 염산의 농도는 나일 블루의 분자수와의 관계로 검토되는 것이 당연하다.
따라서, 본 실험예에 있어서는 나일 블루 용액 중의 염산과 나일 블루의 비(몰 농도비)를 여러 가지로 변경해, 나일 블루와 염산의 비(몰 농도비)와 나일 블루 용액의 보존 안정성의 관계를 조사했다.
또한, 나일 블루 용액의 보존 안정성은 실험예 26~29와 마찬가지로 나일 블루 용액의 흡광도를 평가함으로써 실시했다.
상기 실험예 26~29와 마찬가지로 나일 블루 A(시그마사제)를 0.02mmol/L의 농도가 되도록 에틸렌글리콜에 용해시켜 나일 블루 용액을 조제했다(비교예 2).
더욱이, 이 나일 블루 용액 5mL에 염산을 이하에 기재된 농도가 되도록 함유시켜 실험예 30~36으로 했다. 또한, 괄호 안은 용액 중 나일 블루와 염산의 몰 농도비를 나타내고 있다.
실험예
30 염산 0.002mmol/L (10:1)
31 염산 0.006mmol/L (3:1)
32 염산 0.02mmol/L (1:1)
33 염산 0.06mmol/L (1:3)
34 염산 0.2mmol/L (1:10)
35 염산 0.6mmol/L (1:30)
36 염산 2mmol/L (1:100)
얻어진 색소 용액을 에탄올로 20배로 희석하고, 분광 광도계를 이용하여 색소의 흡광 스펙트럼이 최대가 되는 630㎚에서의 각 색소 용액의 흡광도를 측정했다. 더욱이, 이 색소 용액을 45℃의 온도 부하의 조건 하에서 보존해, 조제 후 4주째, 9주째 및 18주째에서의 흡광도를 측정해 그 흡광도 변화율을 구했다. 또한, 흡광도 측정은 에탄올을 대조로 했다.
흡광도 측정의 결과를 표 7-1에, 흡광도 변화율을 표 7-2에 나타낸다.
[표 7-1]
Figure pct00011

[표 7-2]
Figure pct00012

표 7-1에 나타내는 바와 같이, 염산을 가하지 않은 비교예 2의 초기 흡광도는 0.1342였다. 또, 비교예 2의 흡광도 변화율은 표 7-2에 나타내는 바와 같이, 조제 후 4주째에서 -10.0%, 조제 후 9주째에서 -12.5%, 조제 후 18주째에서 -26.5%였다.
실험예 30~36의 초기 흡광도에 대해 보면, 표 7-1에 나타내는 바와 같이, 실험예 30~36 모두 비교예 2와의 사이에 큰 차이는 확인되지 않았다.
다음에, 흡광도 변화율에 대해 보면, 나일 블루와 염산의 몰 농도비가 10:1인 실험예 30의 흡광도 변화율은 조제 후 4주째에서 -9.0%, 조제 후 9주째에서 -10.5%, 조제 후 18주째에서 -23.2%였다.
나일 블루와 염산의 몰 농도비가 3:1인 실험예 31의 흡광도 변화율은 조제 후 4주째에서 -6.9%, 조제 후 9주째에서 -9.3%, 조제 후 18주째에서 -20.9%였다.
나일 블루와 염산의 몰 농도비가 1:1인 실험예 32의 흡광도 변화율은 조제 후 4주째에서 -5.6%, 조제 후 9주째에서 -5.2%, 조제 후 18주째에서 -16.8%였다.
비교예 2와의 대비에 의해서도 분명한 바와 같이, 염산의 몰 농도가 나일 블루의 몰 농도 이하인 실험예 30~32의 흡광도 저하는 조제 후 4주째, 9주째, 18주째의 어느 시점에 있어서도, 염산을 함유하고 있지 않는 비교예 2에 비해 완만하게 되어 있다. 즉, 나일 블루 용액의 보존 안정성이 향상하고 있다.
특히, 나일 블루와 염산의 몰 농도비가 1:1인 실험예 32는 다른 실험예에 비해 양호한 보존 안정성이 얻어졌다.
실험예 37~44
나일 블루와 황산을 함유하는 혈소판 측정용 시약의 보존 안정성
다음에, 염산 대신해 나일 블루 용액에 황산을 함유시켜 나일 블루 용액의 보존 안정성을 검토했다.
상기 실험예 26~36와 마찬가지로 나일 블루 A(시그마사제)를 0.02mmol/L의 농도가 되도록 에틸렌글리콜에 용해시켜 나일 블루 용액을 조제했다(비교예 3).
이 나일 블루 용액 5mL에 황산을 이하에 기재된 농도로 함유시켜 실험예 37~40로 했다. 또한, 괄호 안은 용액 중 나일 블루와 황산의 몰 농도비를 나타내고 있다.
실험예
37 황산 0.005mmol/L (4:1)
38 황산 0.01mmol/L (2:1)
39 황산 0.02mmol/L (1:1)
40 황산 0.05mmol/L (1:2.5)
실험예 37~40에서 사용한 나일 블루 A(시그마사제) 대신에 반대 이온이 황산 이온인 나일 블루 A(나카라이테스크사제)를 이용하여 나일 블루 용액을 조제했다(비교예 4).
이 나일 블루 용액 5mL에 황산을 이하에 기재된 농도로 함유시켜 실험예 41~44로 했다. 또한, 괄호 안은 용액 중 나일 블루와 황산의 몰 농도비를 나타내고 있다.
실험예
41 황산 0.005mmol/L (4:1)
42 황산 0.01mmol/L (2:1)
43 황산 0.02mmol/L (1:1)
44 황산 0.05mmol/L (1:2.5)
실험예 37~44의 용액 조제 직후의 흡광도를 측정했다. 또한, 각 용액을 45℃의 온도 부하의 조건 하에서 보존하고, 조제 후 1개월째, 2개월째, 3개월째, 4개월째에서의 흡광도를 측정해 그 흡광도 변화율을 구했다.
실험예 37~40에 의해서 얻어진 흡광도 측정의 결과를 표 8-1에, 흡광도 변화율을 표 8-2에 나타낸다.
실험예 41~44에 의해서 얻어진 흡광도 측정의 결과를 표 9-1에, 흡광도 변화율을 표 9-2에 나타낸다.
[표 8-1]
Figure pct00013

[표 8-2]
Figure pct00014

[표 9-1]
Figure pct00015

[표 9-2]
Figure pct00016

표 8-2로부터도 분명한 바와 같이, 나일 블루의 몰 농도 이하의 농도로 황산을 함유하는 실험예 37~39는 황산을 함유하지 않는 비교예 3에 비해, 어느 시점에 있어서도 흡광도의 저하가 완만하게 되어 있다. 즉, 나일 블루 용액의 보존 안정성이 향상하고 있다.
또, 표 9-2로부터도 분명한 바와 같이, 나일 블루의 몰 농도 이하의 농도로 황산을 함유하는 실험예 41~43은 황산을 함유하지 않는 비교예 4에 비해, 어느 시점에 있어서도 흡광도의 저하가 완만하게 되어 있다. 즉, 나일 블루 용액의 보존 안정성이 향상하고 있다.
특히, 나일 블루와 황산의 몰 농도비가 2:1 ~ 1:1인 실험예 39 및 실험예 42에서는 4개월을 경과한 시점에서의 흡광도 변화율은 각각 0.0%와 -4.2%로, 매우 양호한 보존 안정성이 얻어졌다.
이상의 것으로부터 나일 블루 용액 중에 나일 블루의 몰 농도 이하의 농도로 산을 함유시킴으로써, 나일 블루 용액의 보존 안정성이 향상하는 것이 실증되었다.
또한, 실험예 37~40과 실험예 41~44에서는 나일 블루 용액에 포함되는 황산의 지적(至適) 농도에 차이가 보여지지만, 이것은 시판되는 나일 블루 시약에 포함되는 나일 블루의 순도 차이에 따른 것이라고 생각되어 오차 범위 내의 것이라고 생각된다.
실험예 45~48
나일 블루와 산을 함유하는 혈소판 측정용 시약의 혈소판 염색성
여기서는, 나일 블루를 함유하는 혈소판 측정용 시약에 의한 혈소판의 염색성을 검증하기 위해서 이하의 실험을 실시했다.
우선, 다음의 조성으로 이루어진 혈소판 측정용 시약과 희석 용액을 제조했다.
(1) 혈소판 측정용 시약
혈소판을 염색하기 위한 색소 이하에 기재된 농도
에틸렌글리콜 1L
(2) 희석 용액
트리신(완충제) 1.8g
라우릴트리메틸암모늄클로라이드(LTAC) 0.15g
정제수 1L
(pH 9.0, 침투압 200mOsm/kg·H2O로 조정)
상기 혈소판을 측정하기 위한 색소로서 표 10에 나타낸 색소를 각각 표에 나타낸 농도로 이용했다. 또한, 괄호 안에는 혈소판 측정용 시약과 희석 용액과 검체가 혼합되었을 때의 최종 농도를 나타냈다. 이들 색소의 화학식은 표 10에 나타내는 대로이다.
혈소판의 측정은 실험예 9~13에 대해 기재한 바와 같이 하여 실시했다.
[표 10]
Figure pct00017

실험예 45에 의해 얻어진 스캐터그램을 도 16에, 실험예 46에 의해 얻어진 스캐터그램을 도 17에, 실험예 47에 의해 얻어진 스캐터그램을 도 18에, 실험예 48에 의해 얻어진 스캐터그램을 도 19에 나타낸다. 또한, 각 도에서, 도 (a)는 세로축에 전방 산란광 강도, 가로축에 형광 강도를 취한 스캐터그램이고, 도 (b)는 도 (a)에 나타내는 스캐터그램의 세로축을 log로 변환한 것이다. 각 도에서, 도 (b)의 혈소판이 출현하는 영역을 실선으로 나타냈다.
각 실험예의 측정 결과는 표 10에 나타냈던 대로이다.
도 16에 나타내는 바와 같이, 색소로서 나일 블루를 이용한 실험예 45에 있어서는 혈소판의 집단이 스캐터그램 상의 형광 강도가 높은 위치에 출현하고 있어, 나일 블루에 의해 혈소판이 양호하게 염색되어 있다는 것을 알 수 있다. 한편, 나일 블루 이외의 다른 색소를 이용한 실험예 46~48은 혈소판의 집단이 스캐터그램 상의 형광 강도가 낮은 위치에 집중하고 있어, 혈소판의 염색성이 충분하지 않다는 것을 알 수 있다.
이것으로부터, 혈소판을 측정하기 위한 색소로서 나일 블루를 이용함으로써, 다른 색소를 이용했을 경우에 비해 혈소판을 양호하게 염색할 수 있다는 것이 시사되었다. 그리고, 나일 블루를 이용하여 혈소판을 염색함으로써, 전방 산란광 강도와 형광 강도에 의해 혈소판을 정확하게 검출할 수 있다는 것이 시사되었다.
다음에, 혈액 중에 지질 입자 등의 협잡물이 존재하는 경우라도 나일 블루 및 산을 함유하는 실험예 45의 혈소판 측정용 시약을 이용함으로써, 혈소판을 협잡물과 구별하여 검출할 수 있는지 아닌지를 실시예 9~13에 기재한 것과 동일한 실험에 의해 검증했다.
실험예 45의 혈소판 측정용 시약을 이용하여 파쇄 적혈구 함유 혈액, 지질 입자 함유 혈액을 측정하여 얻어진 스캐터그램을 각각 도 20, 도 21에 나타낸다. 또한, 각 도에서, 도 (a)는 세로축에 전방 산란광 강도, 가로축에 형광 강도를 취한 스캐터그램이고, 도 (b)는 도 (a)에 나타나는 스캐터그램의 세로축을 log로 변환한 것이며, 도 (c)는 도 (b)의 혈소판 출현 영역의 주변을 확대한 것이다. 도 (c)에 있어서, 혈소판이 출현하는 영역을 실선으로 나타냈다.
도 20 및 도 21에 나타내는 바와 같이, 검체에 포함되는 혈소판의 집단은 파쇄 적혈구나 지질 입자 등의 검체 중의 다른 성분과 명확하게 구별되어 스캐터그램 상에 출현하고 있다는 것을 알 수 있다. 이 결과로부터, 본 발명에 의한 혈소판 측정용 시약을 이용함으로써, 혈액중에 파쇄 적혈구나 지질 입자 등의 협잡물이 존재해도 혈소판을 명확하게 구별하여 검출할 수 있고, 정확하게 혈소판을 측정할 수 있는 것이 실증되었다.
본 출원은 2008년 2월 18일, 3월 26일 및 9월 26일에 각각 출원된 일본 특허출원 특원 2008-36013, 2008-79785 및 2008-247484호에 관하여, 이들의 특허청구범위, 명세서, 도면 및 요약서 모두는 본 명세서 중에 참조로서 포함된다.
A 제 1 용기
B 제 2 용기
1 시료 분석 장치
2 측정 유니트
3 데이터 처리 유니트
4 제어부
5 검출부
6 시료 조제부
7 인터페이스
8 제어부
9 데이터 분석부
10 표시부
11 조작부
12 인터페이스
51 플로우 셀
52 레이저 광원
53 조사 렌즈계
54,57 포토다이오드
54a 빔 스토퍼
54b 앰프
55 측방 집광 렌즈
56 다이크로익미러
57 포토다이오드
57a,58b 앰프
58 포토멀티플라이어
58a 광학 필터

Claims (15)

  1. 혈소판을 염색하기 위한 색소로서 하기 일반식 (Ⅲ):
    Figure pct00018

    으로 나타내는 화합물을 포함하는 혈소판 측정용 시약.
  2. 혈소판을 염색하기 위한 색소로서 하기 일반식 (Ⅲ):
    Figure pct00019

    으로 나타내는 화합물을 포함하는 제 1 시약과, 완충제를 함유하는 제 2 시약을 포함하는 혈소판 측정용 시약 키트.
  3. 청구항 2에 있어서,
    상기 제 2 시약이 pH 6.0~11.0의 완충액인 혈소판 측정용 시약 키트.
  4. 청구항 2에 있어서,
    상기 제 2 시약이 150~600mOsm/㎏의 침투압을 가지는 혈소판 측정용 시약 키트.
  5. 청구항 2에 있어서,
    상기 제 2 시약이 상기 색소에 의한 혈소판의 염색을 촉진하기 위한 염색 촉진제를 추가로 포함하는 혈소판 측정용 시약 키트.
  6. 청구항 5에 있어서,
    상기 염색 촉진제가 양이온 계면활성제인 혈소판 측정용 시약 키트.
  7. 혈소판을 염색하기 위한 색소로서 하기 일반식 (Ⅲ):
    Figure pct00020

    으로 나타내는 화합물을 포함하는 제 1 시약과 검체를, 완충제를 함유하는 제 2 시약을 가하든지 또는 가하지 않고 혼합하여 측정용 시료를 조제하는 단계와,
    얻어진 측정용 시료 중의 세포에 빛을 조사하여, 이 세포로부터 발해지는 산란광 및 형광을 검출하는 단계와,
    검출된 산란광 및 형광에 근거하여 측정용 시료에 포함되는 혈소판을 검출하는 단계를 포함하는 혈소판 측정 방법.
  8. 청구항 7에 있어서,
    검출된 혈소판을 계수하는 단계를 추가로 포함하는 혈소판 측정 방법.
  9. 혈소판을 염색하기 위한 색소로서 하기 일반식 (Ⅱ):
    Figure pct00021

    (식 중, X-는 HSO4 -, 1/2S04 2-, Cl- 및 ClO4 - 로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온이다)
    로 나타내는 화합물과 산을 함유하는 혈소판 측정용 시약.
  10. 청구항 9에 있어서,
    상기 산이 무기산인 혈소판 측정용 시약.
  11. 청구항 9에 있어서,
    상기 색소와 상기 산의 몰 농도비가 10:1 ~ 1:1인 혈소판 측정용 시약.
  12. 혈소판을 염색하기 위한 색소로서 하기 일반식 (Ⅱ):
    Figure pct00022

    (식 중, X-는 HSO4 -, 1/2S04 2-, Cl- 및 ClO4 - 로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온이다)
    로 나타내는 화합물과 산을 함유하는 제 1 시약과, 완충제를 함유하는 제 2 시약을 포함하는 혈소판 측정용 시약 키트.
  13. 청구항 12에 있어서,
    상기 제 1 시약에서의 상기 색소와 상기 산의 몰 농도비가 10:1 ~ 1:1인 혈소판 측정용 시약 키트.
  14. 하기 일반식 (Ⅱ):
    Figure pct00023

    (식 중, X-는 HSO4 -, 1/2S04 2 -, Cl- 및 ClO4 - 로 이루어진 군으로부터 선택되는 음이온이다)
    로 나타내는 화합물과 산을 함유하는 제 1 시약과, 검체와 완충제를 함유하는 제 2 시약을 가하든지 또는 가하지 않고 혼합하여 측정용 시료를 조제하는 단계와,
    얻어진 측정용 시료 중의 세포에 빛을 조사하여, 이 세포로부터 발해지는 산란광 및 형광을 검출하는 단계와,
    검출된 산란광 및 형광에 근거하여 측정용 시료에 포함되는 혈소판을 검출하는 단계를 포함하는 혈소판 측정 방법.
  15. 청구항 14에 있어서,
    검출된 혈소판을 계수하는 단계를 추가로 포함하는 혈소판 측정 방법.
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