JP3837006B2 - 細菌の染色方法及び検出方法 - Google Patents
細菌の染色方法及び検出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP3837006B2 JP3837006B2 JP2000080998A JP2000080998A JP3837006B2 JP 3837006 B2 JP3837006 B2 JP 3837006B2 JP 2000080998 A JP2000080998 A JP 2000080998A JP 2000080998 A JP2000080998 A JP 2000080998A JP 3837006 B2 JP3837006 B2 JP 3837006B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- bacteria
- carbon atoms
- alkyl group
- group
- staining
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Lifetime
Links
- 238000001514 detection method Methods 0.000 title claims description 11
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 title claims description 9
- 238000007447 staining method Methods 0.000 title description 7
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 claims abstract description 90
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 25
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims abstract description 25
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 claims abstract description 13
- 239000003093 cationic surfactant Substances 0.000 claims abstract description 13
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 36
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 30
- 239000000975 dye Substances 0.000 claims description 19
- 125000004435 hydrogen atom Chemical group [H]* 0.000 claims description 19
- 238000005259 measurement Methods 0.000 claims description 17
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 claims description 15
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 claims description 9
- 238000004043 dyeing Methods 0.000 claims description 7
- VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N Fumaric acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-OWOJBTEDSA-N 0.000 claims description 6
- DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N Glycine Chemical compound NCC(O)=O DHMQDGOQFOQNFH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 125000002252 acyl group Chemical group 0.000 claims description 6
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 6
- UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N beta-alanine Chemical compound NCCC(O)=O UCMIRNVEIXFBKS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 6
- 229910017053 inorganic salt Inorganic materials 0.000 claims description 6
- JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N lactic acid Chemical compound CC(O)C(O)=O JVTAAEKCZFNVCJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 229910052717 sulfur Inorganic materials 0.000 claims description 6
- ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M thiazole orange Chemical compound CC1=CC=C(S([O-])(=O)=O)C=C1.C1=CC=C2C(C=C3N(C4=CC=CC=C4S3)C)=CC=[N+](C)C2=C1 ACOJCCLIDPZYJC-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 6
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 claims description 5
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 5
- 150000003242 quaternary ammonium salts Chemical class 0.000 claims description 5
- 239000000243 solution Substances 0.000 claims description 5
- SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 6-aminohexanoic acid Chemical compound NCCCCCC(O)=O SLXKOJJOQWFEFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical compound [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K Citrate Chemical compound [O-]C(=O)CC(O)(CC([O-])=O)C([O-])=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000004471 Glycine Substances 0.000 claims description 3
- 229910002651 NO3 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N Nitrate Chemical compound [O-][N+]([O-])=O NHNBFGGVMKEFGY-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 claims description 3
- KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N Succinic acid Natural products OC(=O)CCC(O)=O KDYFGRWQOYBRFD-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L Sulfate Chemical compound [O-]S([O-])(=O)=O QAOWNCQODCNURD-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N Sulfur Chemical compound [S] NINIDFKCEFEMDL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 229960002684 aminocaproic acid Drugs 0.000 claims description 3
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 3
- 229940000635 beta-alanine Drugs 0.000 claims description 3
- KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N butanedioic acid Chemical compound O[14C](=O)CC[14C](O)=O KDYFGRWQOYBRFD-NUQCWPJISA-N 0.000 claims description 3
- RLGQACBPNDBWTB-UHFFFAOYSA-N cetyltrimethylammonium ion Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C RLGQACBPNDBWTB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- RKMJXTWHATWGNX-UHFFFAOYSA-N decyltrimethylammonium ion Chemical class CCCCCCCCCC[N+](C)(C)C RKMJXTWHATWGNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- VICYBMUVWHJEFT-UHFFFAOYSA-N dodecyltrimethylammonium ion Chemical class CCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C VICYBMUVWHJEFT-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000001530 fumaric acid Substances 0.000 claims description 3
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- -1 halogen ion Chemical class 0.000 claims description 3
- 239000004310 lactic acid Substances 0.000 claims description 3
- 235000014655 lactic acid Nutrition 0.000 claims description 3
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 3
- 125000004430 oxygen atom Chemical group O* 0.000 claims description 3
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 claims description 3
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 claims description 3
- XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L phthalate(2-) Chemical compound [O-]C(=O)C1=CC=CC=C1C([O-])=O XNGIFLGASWRNHJ-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 125000000547 substituted alkyl group Chemical group 0.000 claims description 3
- 239000011593 sulfur Substances 0.000 claims description 3
- 125000004434 sulfur atom Chemical group 0.000 claims description 3
- VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N trans-butenedioic acid Natural products OC(=O)C=CC(O)=O VZCYOOQTPOCHFL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- PDSVZUAJOIQXRK-UHFFFAOYSA-N trimethyl(octadecyl)azanium Chemical class CCCCCCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C PDSVZUAJOIQXRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- GLFDLEXFOHUASB-UHFFFAOYSA-N trimethyl(tetradecyl)azanium Chemical class CCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C GLFDLEXFOHUASB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 2
- 150000002823 nitrates Chemical class 0.000 claims 1
- 230000001568 sexual effect Effects 0.000 claims 1
- 239000012128 staining reagent Substances 0.000 claims 1
- 150000003467 sulfuric acid derivatives Chemical class 0.000 claims 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 abstract description 3
- 230000001678 irradiating effect Effects 0.000 abstract 1
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 16
- 210000002700 urine Anatomy 0.000 description 12
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- CXRFDZFCGOPDTD-UHFFFAOYSA-M Cetrimide Chemical compound [Br-].CCCCCCCCCCCCCC[N+](C)(C)C CXRFDZFCGOPDTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 7
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N Ethylene glycol Chemical compound OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 0 C=[*+][*+][n+]1c(*=C)[s]c2c1cccc2 Chemical compound C=[*+][*+][n+]1c(*=C)[s]c2c1cccc2 0.000 description 5
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 5
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 5
- 239000000049 pigment Substances 0.000 description 5
- 238000003794 Gram staining Methods 0.000 description 4
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 210000003097 mucus Anatomy 0.000 description 4
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 4
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 3
- 244000052616 bacterial pathogen Species 0.000 description 3
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 3
- 239000012192 staining solution Substances 0.000 description 3
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 3
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000589774 Pseudomonas sp. Species 0.000 description 2
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 2
- 125000004429 atom Chemical group 0.000 description 2
- 230000003385 bacteriostatic effect Effects 0.000 description 2
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 2
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 2
- 238000009640 blood culture Methods 0.000 description 2
- 239000013078 crystal Substances 0.000 description 2
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 2
- 230000014670 detection of bacterium Effects 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 2
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 2
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 2
- 238000000684 flow cytometry Methods 0.000 description 2
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 2
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 2
- 230000035699 permeability Effects 0.000 description 2
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 2
- 208000019206 urinary tract infection Diseases 0.000 description 2
- NAWXUBYGYWOOIX-SFHVURJKSA-N (2s)-2-[[4-[2-(2,4-diaminoquinazolin-6-yl)ethyl]benzoyl]amino]-4-methylidenepentanedioic acid Chemical compound C1=CC2=NC(N)=NC(N)=C2C=C1CCC1=CC=C(C(=O)N[C@@H](CC(=C)C(O)=O)C(O)=O)C=C1 NAWXUBYGYWOOIX-SFHVURJKSA-N 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 241000588919 Citrobacter freundii Species 0.000 description 1
- 241000873310 Citrobacter sp. Species 0.000 description 1
- 241000147019 Enterobacter sp. Species 0.000 description 1
- 241000495778 Escherichia faecalis Species 0.000 description 1
- 241000588754 Klebsiella sp. Species 0.000 description 1
- 241000607714 Serratia sp. Species 0.000 description 1
- 235000003434 Sesamum indicum Nutrition 0.000 description 1
- 244000000231 Sesamum indicum Species 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 210000001175 cerebrospinal fluid Anatomy 0.000 description 1
- 238000003759 clinical diagnosis Methods 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 238000012258 culturing Methods 0.000 description 1
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 1
- 238000012757 fluorescence staining Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 238000010191 image analysis Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000000386 microscopy Methods 0.000 description 1
- 239000003068 molecular probe Substances 0.000 description 1
- 230000007935 neutral effect Effects 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- 238000013102 re-test Methods 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 1
- 239000004065 semiconductor Substances 0.000 description 1
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 1
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 1
- 230000002485 urinary effect Effects 0.000 description 1
- 230000000007 visual effect Effects 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
- G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
- G01N1/30—Staining; Impregnating ; Fixation; Dehydration; Multistep processes for preparing samples of tissue, cell or nucleic acid material and the like for analysis
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/02—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving viable microorganisms
- C12Q1/04—Determining presence or kind of microorganism; Use of selective media for testing antibiotics or bacteriocides; Compositions containing a chemical indicator therefor
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2304/00—Chemical means of detecting microorganisms
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Zoology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Immunology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Pathology (AREA)
- General Physics & Mathematics (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
【０００１】
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床試料中の細菌、とくに好適には尿試料中に存在する細菌の染色方法および検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
尿中細菌数は感染の有無を判定する上で臨床診断上、重要なパラメーターである。一般的に、***症(Urinary Tract Infection)の判定基準として、尿中細菌数が105個/ml以上出現した場合を陽性とする。また103個/ml以下では汚染尿(常在菌)であるとして陰性としている。104個/ml程度の場合は判定保留域であるが、再検領域とする場合が多い。
【０００３】
従来から行われている尿中細菌の確認方法としては、グラム染色した後顕微鏡下で確認する、無染色で顕微鏡下で確認する、蛍光染色した後顕微鏡下で確認する、といった方法などが挙げられる。
【０００４】
尿中には夾雑物と言われる臨床上有用ではない粘液糸、結晶、無晶性塩類、細胞の断片がしばしばみられこれらが重要な測定粒子(特に細菌）の妨害となり、細菌数を正確に計数することは困難であった。現実的には104個/ml程度の菌数を精度良く計数する方法は存在しなかった。
【０００５】
例えば、グラム染色は、細菌と夾雑物が同時に染色されるため、顕微鏡下において数の少ない細菌の見落としが多い。また染色工程が複数あり、染色に時間を要する(約15分)ため、作業効率が悪かった。
【０００６】
また、無染色鏡検は、方法としては迅速であるが、特に球菌状の夾雑物が出現した場合には菌との弁別が不可能である。
【０００７】
蛍光染色鏡検については、細菌検出性能は上記二つの方法よりも高いが、細菌以外の夾雑物が混入した場合に、それらを効果的に除去し、さらに細菌を迅速に染色する方法については開示されていない。
【０００８】
なお、標準法である寒天培地法の場合は、菌数の測定に１６時間以上要し、迅速とは言い難い。
【０００９】
また、米国特許第４，６２２，２９８号、特開平９−１１９９２６号には蛍光染色された尿試料をフローサイトメータで測定し細菌を検出する方法が提案されているが、いずれも夾雑物を含んだ試料を測定してはいない。さらに、特開平９−３２９５９６号には、尿中の有形成分の分析において、互いに弁別の困難な成分の分析方法として、尿試料を界面活性剤を含む水溶液で処理し、フローサイトメータで測定する方法が記載されているが、細菌と夾雑物を弁別する方法を開示してはいない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、試料中に夾雑物が存在しても、培養することなしに細菌を迅速に効率よく検出できるような染色方法ならびに、検出方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の細菌染色方法は、ｐＨ2.0〜4.5において、細菌を含む試料に、カチオン性界面活性剤を作用させて細菌の色素透過性を亢進させ、さらに、色素を作用させて細菌を染色することからなる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、上記のｐＨにおいては、（１）細菌が中性やアルカリ性よりも良く染色されること、（２）粘液糸の非特異染色を抑え、かつ粘液糸をある程度溶解させることができること、を見出した。
【００１３】
前記ｐＨを維持するために、酸あるいはｐＫａ １〜５の緩衝剤を使用することができる。前記ｐＨ範囲、好ましくはpH2.0〜3.0を維持できるものであれば緩衝剤としては特に限定されないが、好適には、クエン酸塩、リン酸塩、フタル酸塩、グリシン、コハク酸、乳酸、β−アラニン、ε−アミノカプロン酸及びフマル酸などが使用できる。使用量は、前記ｐＨ範囲を維持できる量で使用でき、１０〜５００ｍＭの範囲で使用できる。
【００１４】
カチオン性界面活性剤はとくに限定されないが、好適には以下の式で示される四級アンモニウム塩；
【化１２】
（式中、Ｒ1は炭素数８〜１８のアルキル基；Ｒ2、Ｒ3及びＲ4は同一又は異なって、炭素数１〜３のアルキル基またはベンジル基；Ｙ-はハロゲンイオンである）が使用できる。
【００１５】
例えば、デシルトリメチルアンモニウム塩、ドデシルトリメチルアンモニウム塩、テトラデシルトリメチルアンモニウム塩、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム塩及びオクタデシルトリメチルアンモニウム塩が好適に使用される。使用量については、10〜30000mg/l、好ましくは100〜3000mg/lが好適である。
【００１６】
細菌を含む試料に、カチオン性界面活性剤を添加することにより、細菌の細胞膜が傷害され、色素が入り込みやすくなる。その結果、細菌の細胞内の物質と色素とが効率よく結合して細菌がよく染色され、夾雑物と弁別しやすくなる。一方、粘液糸や赤血球や細胞の破片などは、溶解あるいは収縮し、細菌の検出への影響が低減されることとなる。
【００１７】
色素については、前記ｐＨ域で細菌を染色できるものであれば特に制限されない。濃度については、色素ごとに好適な濃度は異なるが、例えば、0.1〜100ppm（最終濃度）の範囲で使用できる。なお、細菌の検出能力の点から、使用する色素は、少なくとも細菌を構成する成分の一つと結合し、蛍光を発する蛍光色素を使うのが有利である。例えば、以下の（１）〜（１１）の色素が使用できる。
【００１８】
（１）チアゾールオレンジ
【００１９】
（２）
【化１３】
【００２０】
（３）
【化１４】
【００２１】
（４）
【化１５】
【００２２】
（５）
【化１６】
【００２３】
（６）
【化１７】
【００２４】
（７）
【化１８】
【００２５】
（８）
【化１９】
【００２６】
（９）
【化２０】
【００２７】
（１０）以下の一般式で表される化合物：
【化２１】
（式中、Ｒ1は水素原子又は炭素数１〜３のアルキル基；Ｒ2及びＲ3は水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又は炭素数１〜３のアルコキシ基；Ｒ4は水素原子、アシル基又は炭素数１〜３のアルキル基；Ｒ5は水素原子、置換されていてもよい炭素数１〜３のアルキル基；Ｚは硫黄原子、酸素原子又は炭素数１〜３のアルキル基で置換された炭素原子；ｎは１又は２；Ｘ-はアニオンである）
【００２８】
（１１）以下の一般式で表される化合物：
【化２２】
（式中、Ｒ1は水素原子又は炭素数１〜１８のアルキル基；Ｒ2及びＲ3は水素原子、炭素数１〜３のアルキル基又は炭素数１〜３のアルコキシ基；Ｒ4は水素原子、アシル基、又は炭素数１〜１８のアルキル基；Ｚは硫黄、酸素、あるいは炭素数１〜３のアルキル基を有する炭素であり；ｎは０,1又は２であり；Ｘ-はアニオンである）。
【００２９】
これらの色素のうち、（１）は市販品を入手できる。（２）、（３）は日本感光色素研究所（株）より入手できる。（５）〜（９）は、Molecular Probes,Inc.より入手できる。
【００３０】
また、（１０）は、特開平９−１０４６８３号に、（１１）は、特開平１０−３１９０１０号に製造方法が記載されている。
【００３１】
なお、（１０）の一般式で示される色素のうち、特に、次の色素；
【化２３】
【００３２】
また、（１１）の一般式で示される色素のうち、特に次の色素；
【化２４】
が好適である。
【００３３】
さらに、硫酸塩または硝酸塩のうちいずれかの無機塩の共存下で染色を行うことで、細菌の蛍光染色性を増大させ、夾雑物の非特異染色を抑制することができるので好ましい。使用量としては、10〜500mM、好ましくは50〜200mMの濃度範囲で使用できる。
【００３４】
本発明の染色法では、尿試料で確認される細菌、例えば、E.coli, Staphyrococcus sp., Pseudomonas sp., Klebsiella sp., Serratia sp., Enterobacter sp., Enterococcus sp., Streptpococcus sp.及びCitrobacter sp.などが好適に染色される。また、尿試料に限らず、血液、髄液など他の臨床試料にも適用できる。
【００３５】
本発明の染色法は、試料、カチオン性界面活性剤を含む水溶液、色素を含む溶液を混合することで実施できる。なお、色素はカチオン性界面活性剤を含む水溶液中に含有させてもよいが、使用する色素が水溶液中では不安定な場合には、色素をメタノール、エタノールやエチレングリコールなどの水溶性有機溶媒中に溶解しておき、使用時にカチオン性界面活性剤を含む水溶液と混合するようにしておけば、色素の保存安定性を向上させることができる。
【００３６】
反応温度・時間は特に限定されないが、温度は、１５〜５０℃、時間は、混合直後から１５分間で実施できる。
【００３７】
本発明の染色法により染色された試料は、顕微鏡や画像認識装置で観察して細菌を検出することもできるが、フローサイトメトリによって細菌を高精度で検出・計数することができる。
【００３８】
すなわち本発明の細菌の検出方法は、▲１▼細菌を含む試料を、カチオン性界面活性剤を含むpH2.0〜4.5の水溶液で希釈し、細菌の色素透過性を亢進させ、
▲２▼該試料を蛍光色素を用いて一定時間染色反応させ、
▲３▼前記工程で処理された試料をフローサイトメータの検出部に導入し、染色された細菌の細胞一つ一つに光を照射し、該細胞から発せられる散乱光及び蛍光を測定し、
▲４▼測定した散乱光及び蛍光の信号強度または、粒子の長さを反映するパルス幅に基づいて細菌と他の成分を分離・計数する工程を含む。
【００３９】
細菌と他の成分を分離・計数するには、測定によって得られた信号を組み合わせて行うことができる。信号の組み合わせとして例えば、前方散乱光強度と前方散乱光パルス幅、前方散乱光強度と蛍光強度、前方散乱光パルス幅と蛍光強度の組み合わせが挙げられる。好適には、例えばまず前方散乱光強度と前方散乱光パルス幅の組み合わせで２次元分布図（スキャッタグラム）を作成し、分布図上で細菌を含む集団を特定してゲーティングを行い、主に粘液糸を分離し、さらに、ゲーティングされた集団に対して、前方散乱光強度と蛍光強度の組み合わせで、さらに２次元分布図を作成し、蛍光強度の違いから細菌と他の成分（結晶や細胞の破片など）を分離する。概念図を図７に示す。
【００４０】
【実施例】
以下に好適な実施例を示すが、本発明はこれに限定されない。
実施例１
試薬組成
（希釈液）
クエン酸 100mM
NaOH pH4.1になる量
テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド 0.1%(w/v)
（染色液）
色素Ａ（以下の構造式） 40ppm（エチレングリコール溶液）
【化２５】
【００４１】
培養大腸菌を含む試料100μlに、上記組成の希釈液1000μl及び染色液を色素Ａの最終濃度が1ppmになるように添加し、40℃、30秒間反応させ、赤色半導体レーザーを光源とするフローサイトメータで散乱光及び蛍光の測定を行った（分析容量7.8μl）。対照として、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイドを含まない試薬を用いて測定を行った。結果を図１に示す。
【００４２】
テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイドを含まない試薬を用いた場合（図中左）は、蛍光強度が30ch以下で、大腸菌はほとんど染色されていなかった。一方、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイドを0.1%(w/v)を含む場合は（図中右）、大腸菌の集団が蛍光強度で50ch以上に分布し、染色性が増大していることが確認された。
【００４３】
実施例２
試薬組成
（希釈液）
クエン酸 100mM(pH2.5)
テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド 0.1%(w/v)
硫酸ナトリウム 90mM
（染色液）
実施例１と同じ
【００４４】
上記組成の試薬を用いて、各培養細菌（E.coli, S.aureus, K.pneumoniae, C.freundii, E.faecalis）を含む試料を実施例１と同様に測定した。結果を図２に示す。
【００４５】
各細菌とも、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイドを含まない場合は、蛍光強度が低く、ほとんど染色されていないが、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイドを添加することによって、蛍光強度が増大し、よく染色されていることが確認された。また、大腸菌測定において、硫酸ナトリウムをさらに添加している場合（本実施例）と、硫酸ナトリウムを含まない場合（実施例１）と比べて、本実施例においては、蛍光強度がより増大しており、硫酸ナトリウムの添加による効果が認められた。
【００４６】
実施例３
希釈直線性
大腸菌を培養し、希釈係数1,10,100,1000,10000,100000の希釈試料を作成し、実施例２と同じ試薬を用いて同様に測定を行った。結果を図３に示す。なお、菌数は、前方散乱光強度と蛍光強度の組み合わせで２次元分布図を作成し、分布図上で細菌を含む集団を特定してゲーティングを行うことにより求めた。
図３に示したように、菌数約103〜107個/mlの範囲で良好な直線性が得られた。
【００４７】
実施例４
尿試料の測定
実施例２と同じ試薬を用いて尿検体６２検体について測定を行い、対照としたCLED培地による培養法での測定結果との相関について検討した。
【００４８】
菌数の測定は、まず前方散乱光強度と前方散乱光パルス幅の組み合わせで２次元分布図を作成し、分布図上で細菌を含む集団を特定してゲーティングを行い、さらに、ゲーティングされた集団について、前方散乱光強度と蛍光強度の組み合わせで、さらに２次元分布図を作成し、蛍光強度の違いから細菌の領域を特定し、特定された領域内の数を求めた。結果を図４に示す。
【００４９】
CLED培地による培養法での結果と良好な相関が得られた。なお、図４において、縦軸にいくつか点が見られるが、これはCLED培地による培養法では、生きた細菌のみ検出するのに対し、本発明では、培地では生えにくい菌（静菌；薬剤などの影響により生育しにくくなっている菌）及び死菌も検出しているためと考えられる。
【００５０】
実施例５
血液培養試料の測定
細菌を含む血液試料を血液培養ボトルを用いて培養し、培養液を測定した。グラム陰性桿菌（Pseudomonas sp.）の結果を図５に、グラム陽性球菌（Staphyrococcus sp.）の結果を図６に示す。なお、菌数は、前方散乱光強度と蛍光強度の組み合わせで２次元分布図を作成し、分布図上で細菌を含む集団を特定してゲーティングを行うことにより求めた。対照は、KOBA 10グリッド（HYCOR BIOMEDICAL INC.）を用いて目視で確認した。グラム陰性桿菌は、本発明では、5.2×105/mlに対し、目視法では、2.9×105/ml、また、グラム陽性球菌では、本発明では2.3×104/mlに対し、目視法では、8.8×103/mlであった。
【００５１】
【発明の効果】
本発明の染色方法によれば、水系で染色されるため、グラム染色のような乾燥固定は必ずしも必要としない。このため、染色工程を含めて短時間で測定用試料が調製でき、染色時間の大幅な短縮が可能である。
【００５２】
また、検体と試薬を混合するだけの簡単な操作で実施でき、グラム染色のような熟練は必要でない。さらに、染色工程が簡単であるため、染色から測定（フローサイトメトリや画像解析など）までの自動化が容易である。
【００５３】
さらに、本発明の細菌検出方法によれば、夾雑物の影響を受けることなく、精度よく細菌を計数することが可能である。具体的には、１０4個/ml程度の菌数を計数可能である。
【００５４】
また、培地では生えにくい菌（静菌作用のある検体など）についても確実に捉えることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例１において、培養大腸菌を測定したときの蛍光強度−前方散乱光強度のスキャッタグラムである。
【図２】本発明の実施例２において、培養した各種細菌を測定したときの蛍光強度−前方散乱光強度のスキャッタグラムである。
【図３】本発明の実施例３において、希釈直線性試験の結果を示したグラフである。
【図４】本発明の実施例４において、本発明の方法とCLED培地での測定結果との相関図である。
【図５】本発明の実施例５において、グラム陰性桿菌の測定結果を示したスキャッタグラムである。
【図６】本発明の実施例６において、グラム陽性球菌の測定結果を示したスキャッタグラムである。
【図７】本発明における細菌の検出方法の概念図である。
【発明の属する技術分野】
本発明は、臨床試料中の細菌、とくに好適には尿試料中に存在する細菌の染色方法および検出方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】
尿中細菌数は感染の有無を判定する上で臨床診断上、重要なパラメーターである。一般的に、***症(Urinary Tract Infection)の判定基準として、尿中細菌数が105個/ml以上出現した場合を陽性とする。また103個/ml以下では汚染尿(常在菌)であるとして陰性としている。104個/ml程度の場合は判定保留域であるが、再検領域とする場合が多い。
【０００３】
従来から行われている尿中細菌の確認方法としては、グラム染色した後顕微鏡下で確認する、無染色で顕微鏡下で確認する、蛍光染色した後顕微鏡下で確認する、といった方法などが挙げられる。
【０００４】
尿中には夾雑物と言われる臨床上有用ではない粘液糸、結晶、無晶性塩類、細胞の断片がしばしばみられこれらが重要な測定粒子(特に細菌）の妨害となり、細菌数を正確に計数することは困難であった。現実的には104個/ml程度の菌数を精度良く計数する方法は存在しなかった。
【０００５】
例えば、グラム染色は、細菌と夾雑物が同時に染色されるため、顕微鏡下において数の少ない細菌の見落としが多い。また染色工程が複数あり、染色に時間を要する(約15分)ため、作業効率が悪かった。
【０００６】
また、無染色鏡検は、方法としては迅速であるが、特に球菌状の夾雑物が出現した場合には菌との弁別が不可能である。
【０００７】
蛍光染色鏡検については、細菌検出性能は上記二つの方法よりも高いが、細菌以外の夾雑物が混入した場合に、それらを効果的に除去し、さらに細菌を迅速に染色する方法については開示されていない。
【０００８】
なお、標準法である寒天培地法の場合は、菌数の測定に１６時間以上要し、迅速とは言い難い。
【０００９】
また、米国特許第４，６２２，２９８号、特開平９−１１９９２６号には蛍光染色された尿試料をフローサイトメータで測定し細菌を検出する方法が提案されているが、いずれも夾雑物を含んだ試料を測定してはいない。さらに、特開平９−３２９５９６号には、尿中の有形成分の分析において、互いに弁別の困難な成分の分析方法として、尿試料を界面活性剤を含む水溶液で処理し、フローサイトメータで測定する方法が記載されているが、細菌と夾雑物を弁別する方法を開示してはいない。
【００１０】
【発明が解決しようとする課題】
本発明は、試料中に夾雑物が存在しても、培養することなしに細菌を迅速に効率よく検出できるような染色方法ならびに、検出方法を提供することを目的とする。
【００１１】
【課題を解決するための手段】
本発明の細菌染色方法は、ｐＨ2.0〜4.5において、細菌を含む試料に、カチオン性界面活性剤を作用させて細菌の色素透過性を亢進させ、さらに、色素を作用させて細菌を染色することからなる。
【００１２】
【発明の実施の形態】
本発明者らは、上記のｐＨにおいては、（１）細菌が中性やアルカリ性よりも良く染色されること、（２）粘液糸の非特異染色を抑え、かつ粘液糸をある程度溶解させることができること、を見出した。
【００１３】
前記ｐＨを維持するために、酸あるいはｐＫａ １〜５の緩衝剤を使用することができる。前記ｐＨ範囲、好ましくはpH2.0〜3.0を維持できるものであれば緩衝剤としては特に限定されないが、好適には、クエン酸塩、リン酸塩、フタル酸塩、グリシン、コハク酸、乳酸、β−アラニン、ε−アミノカプロン酸及びフマル酸などが使用できる。使用量は、前記ｐＨ範囲を維持できる量で使用でき、１０〜５００ｍＭの範囲で使用できる。
【００１４】
カチオン性界面活性剤はとくに限定されないが、好適には以下の式で示される四級アンモニウム塩；
【化１２】
【００１５】
例えば、デシルトリメチルアンモニウム塩、ドデシルトリメチルアンモニウム塩、テトラデシルトリメチルアンモニウム塩、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム塩及びオクタデシルトリメチルアンモニウム塩が好適に使用される。使用量については、10〜30000mg/l、好ましくは100〜3000mg/lが好適である。
【００１６】
細菌を含む試料に、カチオン性界面活性剤を添加することにより、細菌の細胞膜が傷害され、色素が入り込みやすくなる。その結果、細菌の細胞内の物質と色素とが効率よく結合して細菌がよく染色され、夾雑物と弁別しやすくなる。一方、粘液糸や赤血球や細胞の破片などは、溶解あるいは収縮し、細菌の検出への影響が低減されることとなる。
【００１７】
色素については、前記ｐＨ域で細菌を染色できるものであれば特に制限されない。濃度については、色素ごとに好適な濃度は異なるが、例えば、0.1〜100ppm（最終濃度）の範囲で使用できる。なお、細菌の検出能力の点から、使用する色素は、少なくとも細菌を構成する成分の一つと結合し、蛍光を発する蛍光色素を使うのが有利である。例えば、以下の（１）〜（１１）の色素が使用できる。
【００１８】
（１）チアゾールオレンジ
【００１９】
（２）
【化１３】
（３）
【化１４】
（４）
【化１５】
（５）
【化１６】
（６）
【化１７】
（７）
【化１８】
（８）
【化１９】
（９）
【化２０】
（１０）以下の一般式で表される化合物：
【化２１】
【００２８】
（１１）以下の一般式で表される化合物：
【化２２】
【００２９】
これらの色素のうち、（１）は市販品を入手できる。（２）、（３）は日本感光色素研究所（株）より入手できる。（５）〜（９）は、Molecular Probes,Inc.より入手できる。
【００３０】
また、（１０）は、特開平９−１０４６８３号に、（１１）は、特開平１０−３１９０１０号に製造方法が記載されている。
【００３１】
なお、（１０）の一般式で示される色素のうち、特に、次の色素；
【化２３】
また、（１１）の一般式で示される色素のうち、特に次の色素；
【化２４】
【００３３】
さらに、硫酸塩または硝酸塩のうちいずれかの無機塩の共存下で染色を行うことで、細菌の蛍光染色性を増大させ、夾雑物の非特異染色を抑制することができるので好ましい。使用量としては、10〜500mM、好ましくは50〜200mMの濃度範囲で使用できる。
【００３４】
本発明の染色法では、尿試料で確認される細菌、例えば、E.coli, Staphyrococcus sp., Pseudomonas sp., Klebsiella sp., Serratia sp., Enterobacter sp., Enterococcus sp., Streptpococcus sp.及びCitrobacter sp.などが好適に染色される。また、尿試料に限らず、血液、髄液など他の臨床試料にも適用できる。
【００３５】
本発明の染色法は、試料、カチオン性界面活性剤を含む水溶液、色素を含む溶液を混合することで実施できる。なお、色素はカチオン性界面活性剤を含む水溶液中に含有させてもよいが、使用する色素が水溶液中では不安定な場合には、色素をメタノール、エタノールやエチレングリコールなどの水溶性有機溶媒中に溶解しておき、使用時にカチオン性界面活性剤を含む水溶液と混合するようにしておけば、色素の保存安定性を向上させることができる。
【００３６】
反応温度・時間は特に限定されないが、温度は、１５〜５０℃、時間は、混合直後から１５分間で実施できる。
【００３７】
本発明の染色法により染色された試料は、顕微鏡や画像認識装置で観察して細菌を検出することもできるが、フローサイトメトリによって細菌を高精度で検出・計数することができる。
【００３８】
すなわち本発明の細菌の検出方法は、▲１▼細菌を含む試料を、カチオン性界面活性剤を含むpH2.0〜4.5の水溶液で希釈し、細菌の色素透過性を亢進させ、
▲２▼該試料を蛍光色素を用いて一定時間染色反応させ、
▲３▼前記工程で処理された試料をフローサイトメータの検出部に導入し、染色された細菌の細胞一つ一つに光を照射し、該細胞から発せられる散乱光及び蛍光を測定し、
▲４▼測定した散乱光及び蛍光の信号強度または、粒子の長さを反映するパルス幅に基づいて細菌と他の成分を分離・計数する工程を含む。
【００３９】
細菌と他の成分を分離・計数するには、測定によって得られた信号を組み合わせて行うことができる。信号の組み合わせとして例えば、前方散乱光強度と前方散乱光パルス幅、前方散乱光強度と蛍光強度、前方散乱光パルス幅と蛍光強度の組み合わせが挙げられる。好適には、例えばまず前方散乱光強度と前方散乱光パルス幅の組み合わせで２次元分布図（スキャッタグラム）を作成し、分布図上で細菌を含む集団を特定してゲーティングを行い、主に粘液糸を分離し、さらに、ゲーティングされた集団に対して、前方散乱光強度と蛍光強度の組み合わせで、さらに２次元分布図を作成し、蛍光強度の違いから細菌と他の成分（結晶や細胞の破片など）を分離する。概念図を図７に示す。
【００４０】
【実施例】
以下に好適な実施例を示すが、本発明はこれに限定されない。
実施例１
試薬組成
（希釈液）
クエン酸 100mM
NaOH pH4.1になる量
テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド 0.1%(w/v)
（染色液）
色素Ａ（以下の構造式） 40ppm（エチレングリコール溶液）
【化２５】
培養大腸菌を含む試料100μlに、上記組成の希釈液1000μl及び染色液を色素Ａの最終濃度が1ppmになるように添加し、40℃、30秒間反応させ、赤色半導体レーザーを光源とするフローサイトメータで散乱光及び蛍光の測定を行った（分析容量7.8μl）。対照として、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイドを含まない試薬を用いて測定を行った。結果を図１に示す。
【００４２】
テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイドを含まない試薬を用いた場合（図中左）は、蛍光強度が30ch以下で、大腸菌はほとんど染色されていなかった。一方、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイドを0.1%(w/v)を含む場合は（図中右）、大腸菌の集団が蛍光強度で50ch以上に分布し、染色性が増大していることが確認された。
【００４３】
実施例２
試薬組成
（希釈液）
クエン酸 100mM(pH2.5)
テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイド 0.1%(w/v)
硫酸ナトリウム 90mM
（染色液）
実施例１と同じ
【００４４】
上記組成の試薬を用いて、各培養細菌（E.coli, S.aureus, K.pneumoniae, C.freundii, E.faecalis）を含む試料を実施例１と同様に測定した。結果を図２に示す。
【００４５】
各細菌とも、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイドを含まない場合は、蛍光強度が低く、ほとんど染色されていないが、テトラデシルトリメチルアンモニウムブロマイドを添加することによって、蛍光強度が増大し、よく染色されていることが確認された。また、大腸菌測定において、硫酸ナトリウムをさらに添加している場合（本実施例）と、硫酸ナトリウムを含まない場合（実施例１）と比べて、本実施例においては、蛍光強度がより増大しており、硫酸ナトリウムの添加による効果が認められた。
【００４６】
実施例３
希釈直線性
大腸菌を培養し、希釈係数1,10,100,1000,10000,100000の希釈試料を作成し、実施例２と同じ試薬を用いて同様に測定を行った。結果を図３に示す。なお、菌数は、前方散乱光強度と蛍光強度の組み合わせで２次元分布図を作成し、分布図上で細菌を含む集団を特定してゲーティングを行うことにより求めた。
図３に示したように、菌数約103〜107個/mlの範囲で良好な直線性が得られた。
【００４７】
実施例４
尿試料の測定
実施例２と同じ試薬を用いて尿検体６２検体について測定を行い、対照としたCLED培地による培養法での測定結果との相関について検討した。
【００４８】
菌数の測定は、まず前方散乱光強度と前方散乱光パルス幅の組み合わせで２次元分布図を作成し、分布図上で細菌を含む集団を特定してゲーティングを行い、さらに、ゲーティングされた集団について、前方散乱光強度と蛍光強度の組み合わせで、さらに２次元分布図を作成し、蛍光強度の違いから細菌の領域を特定し、特定された領域内の数を求めた。結果を図４に示す。
【００４９】
CLED培地による培養法での結果と良好な相関が得られた。なお、図４において、縦軸にいくつか点が見られるが、これはCLED培地による培養法では、生きた細菌のみ検出するのに対し、本発明では、培地では生えにくい菌（静菌；薬剤などの影響により生育しにくくなっている菌）及び死菌も検出しているためと考えられる。
【００５０】
実施例５
血液培養試料の測定
細菌を含む血液試料を血液培養ボトルを用いて培養し、培養液を測定した。グラム陰性桿菌（Pseudomonas sp.）の結果を図５に、グラム陽性球菌（Staphyrococcus sp.）の結果を図６に示す。なお、菌数は、前方散乱光強度と蛍光強度の組み合わせで２次元分布図を作成し、分布図上で細菌を含む集団を特定してゲーティングを行うことにより求めた。対照は、KOBA 10グリッド（HYCOR BIOMEDICAL INC.）を用いて目視で確認した。グラム陰性桿菌は、本発明では、5.2×105/mlに対し、目視法では、2.9×105/ml、また、グラム陽性球菌では、本発明では2.3×104/mlに対し、目視法では、8.8×103/mlであった。
【００５１】
【発明の効果】
本発明の染色方法によれば、水系で染色されるため、グラム染色のような乾燥固定は必ずしも必要としない。このため、染色工程を含めて短時間で測定用試料が調製でき、染色時間の大幅な短縮が可能である。
【００５２】
また、検体と試薬を混合するだけの簡単な操作で実施でき、グラム染色のような熟練は必要でない。さらに、染色工程が簡単であるため、染色から測定（フローサイトメトリや画像解析など）までの自動化が容易である。
【００５３】
さらに、本発明の細菌検出方法によれば、夾雑物の影響を受けることなく、精度よく細菌を計数することが可能である。具体的には、１０4個/ml程度の菌数を計数可能である。
【００５４】
また、培地では生えにくい菌（静菌作用のある検体など）についても確実に捉えることができる。
【図面の簡単な説明】
【図１】本発明の実施例１において、培養大腸菌を測定したときの蛍光強度−前方散乱光強度のスキャッタグラムである。
【図２】本発明の実施例２において、培養した各種細菌を測定したときの蛍光強度−前方散乱光強度のスキャッタグラムである。
【図３】本発明の実施例３において、希釈直線性試験の結果を示したグラフである。
【図４】本発明の実施例４において、本発明の方法とCLED培地での測定結果との相関図である。
【図５】本発明の実施例５において、グラム陰性桿菌の測定結果を示したスキャッタグラムである。
【図６】本発明の実施例６において、グラム陽性球菌の測定結果を示したスキャッタグラムである。
【図７】本発明における細菌の検出方法の概念図である。
Claims (18)
- 硫酸塩及び硝酸塩からなる群より選択される少なくとも１つの無機塩の存在下で、且つｐＨ２．０〜４．５において、細菌を含む試料に、カチオン性界面活性剤を作用させて細菌の色素透過性を亢進させる工程、及び、
色素を作用させて細菌を染色する工程、
を含む細菌の染色方法。 - 前記色素が、少なくとも細菌を構成する成分の一つと結合し、蛍光を発する蛍光色素である請求項１記載の細菌の染色方法。
- 前記蛍光色素が、以下の群から選択される少なくとも１つである請求項２記載の細菌の染色方法。；
（１）チアゾールオレンジ
（２）
（１１）以下の一般式で表される化合物：
- 前記ｐＨを維持するためにｐＫａ １〜５の緩衝剤を使用する請求項１記載の細菌の染色方法。
- 該緩衝剤が、クエン酸塩、リン酸塩、フタル酸塩、グリシン、コハク酸、乳酸、β−アラニン、ε−アミノカプロン酸及びフマル酸からなる群より選択される少なくとも１つである請求項４記載の細菌の染色方法。
- カチオン性界面活性剤が、以下の式で示される四級アンモニウム塩；
である請求項１記載の細菌の染色方法。 - 四級アンモニウム塩が、デシルトリメチルアンモニウム塩、ドデシルトリメチルアンモニウム塩、テトラデシルトリメチルアンモニウム塩、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム塩及びオクタデシルトリメチルアンモニウム塩からなる群より選択される少なくとも１つである請求項６記載の細菌の染色方法。
- 以下の工程を含む細菌検出法：
(1)細菌を含む試料と、カチオン系界面活性剤と、硫酸塩及び硝酸塩からなる群より選択される少なくとも１つの無機塩とを含むｐＨ２．０〜４．５の水溶液とを混合して測定用試料を調製する工程；
(2) 前記測定用試料を、蛍光色素を用いて一定時間染色反応させる工程；
(3)前記工程で処理された測定用試料をフローサイトメータの検出部に導入し、染色された細菌に光を照射し、前記測定用試料中の細菌から発せられる散乱光及び蛍光を測定する工程；及び
(4)測定した散乱光及び蛍光の信号強度又はパルス幅に基づいて細菌と他の成分とを分離・計数する工程。 - 前記分離・計数工程において、
前方散乱光強度と前方散乱光パルス幅、
前方散乱光強度と蛍光強度、及び
前方散乱光パルス幅と蛍光強度
のうち何れか１つに基づいて細菌と他の成分とを分離・計数する、請求項８記載の細菌検出法。 - 前記無機塩の水溶液中の濃度が、１０〜５００ｍＭである、請求項８又は９記載の細菌検出法。
- （１）カチオン性界面活性剤と、硫酸塩及び硝酸塩からなる群より選択される少なくとも１つの無機塩とを含むｐＨ２．０〜４．５の水溶液、及び（２）色素を含む溶液、を含む細菌の染色用試薬。
- 前記色素が、少なくとも細菌を構成する成分の一つと結合し、蛍光を発する蛍光色素である請求項１１記載の細菌の染色用試薬。
- 前記蛍光色素が、以下の群から選択される少なくとも１つである請求項１２記載の細菌の染色用試薬。；
（１）チアゾールオレンジ
（２）
（１１）以下の一般式で表される化合物：
- 前記ｐＨを維持するためにｐＫａ １〜５の緩衝剤を使用する請求項１１記載の細菌の染色用試薬。
- 該緩衝剤が、クエン酸塩、リン酸塩、フタル酸塩、グリシン、コハク酸、乳酸、β−アラニン、ε−アミノカプロン酸及びフマル酸からなる群より選択される少なくとも１つである請求項１４記載の細菌の染色用試薬。
- カチオン性界面活性剤が、以下の式で示される四級アンモニウム塩
である請求項１１記載の細菌の染色用試薬。 - 四級アンモニウム塩が、デシルトリメチルアンモニウム塩、ドデシルトリメチルアンモニウム塩、テトラデシルトリメチルアンモニウム塩、ヘキサデシルトリメチルアンモニウム塩及びオクタデシルトリメチルアンモニウム塩からなる群より選択される少なくとも１つである請求項１６記載の細菌の染色用試薬。
- 前記無機塩の水溶液中の濃度が、１０〜５００ｍＭである、請求項１１記載の細菌の染色用試薬。
Priority Applications (4)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000080998A JP3837006B2 (ja) | 2000-03-22 | 2000-03-22 | 細菌の染色方法及び検出方法 |
| AT01201027T ATE329051T1 (de) | 2000-03-22 | 2001-03-20 | Verfahren zur färbung, zum nachweis und zählen von bakterien |
| DE60120257T DE60120257T2 (de) | 2000-03-22 | 2001-03-20 | Verfahren zur Färbung, zum Nachweis und Zählen von Bakterien |
| EP01201027A EP1136563B1 (en) | 2000-03-22 | 2001-03-20 | Method of staining, and detecting and counting bacteria |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP2000080998A JP3837006B2 (ja) | 2000-03-22 | 2000-03-22 | 細菌の染色方法及び検出方法 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2001258590A JP2001258590A (ja) | 2001-09-25 |
| JP3837006B2 true JP3837006B2 (ja) | 2006-10-25 |
Family
ID=18597993
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2000080998A Expired - Lifetime JP3837006B2 (ja) | 2000-03-22 | 2000-03-22 | 細菌の染色方法及び検出方法 |
Country Status (4)
| Country | Link |
|---|---|
| EP (1) | EP1136563B1 (ja) |
| JP (1) | JP3837006B2 (ja) |
| AT (1) | ATE329051T1 (ja) |
| DE (1) | DE60120257T2 (ja) |
Families Citing this family (30)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US7309581B2 (en) | 2000-11-01 | 2007-12-18 | Sysmex Corporation | Method of staining, detection and counting bacteria, and a diluent for bacterial stain |
| JP4236893B2 (ja) | 2002-10-04 | 2009-03-11 | シスメックス株式会社 | 菌計数方法および菌計数装置 |
| JP3863087B2 (ja) | 2002-10-25 | 2006-12-27 | シスメックス株式会社 | 試料分析装置およびその装置に使用されるピペット洗浄用希釈液 |
| JP4484442B2 (ja) * | 2003-04-10 | 2010-06-16 | シスメックス株式会社 | 細菌測定方法と装置とプログラム |
| JP4448673B2 (ja) | 2003-08-22 | 2010-04-14 | シスメックス株式会社 | 細菌分析装置および方法 |
| JP2005102644A (ja) * | 2003-10-01 | 2005-04-21 | Sysmex Corp | 微生物の増殖段階測定方法及び微生物の増殖段階測定プログラム |
| ATE488598T1 (de) | 2004-08-16 | 2010-12-15 | Bacterioscan | Nachweis von bakterien in flüssigkeiten |
| JP4413120B2 (ja) * | 2004-09-30 | 2010-02-10 | シスメックス株式会社 | 検体中粒子分析方法及び分析装置 |
| GB2432660A (en) | 2005-11-29 | 2007-05-30 | Bacterioscan Ltd | System for counting bacteria and determining their susceptibility to antibiotics |
| EP1857805B1 (en) * | 2006-05-17 | 2017-03-01 | Sysmex Corporation | Apparatus for analyzing particles in urine and method thereof |
| JP4759438B2 (ja) * | 2006-05-17 | 2011-08-31 | シスメックス株式会社 | 尿中有形成分分析装置 |
| JP4918281B2 (ja) | 2006-05-18 | 2012-04-18 | シスメックス株式会社 | 尿中有形成分分析装置 |
| US20080102526A1 (en) | 2006-10-30 | 2008-05-01 | Sysmex Corporation | Reagent, reagent kit and analyzing method |
| JP2008187935A (ja) * | 2007-02-02 | 2008-08-21 | Matsushita Electric Ind Co Ltd | 微生物計数装置および点検用チップ |
| CN101910839B (zh) | 2008-02-18 | 2012-10-17 | 希森美康株式会社 | 血小板测定用试剂、血小板测定用试剂盒及血小板测定方法 |
| JP5127606B2 (ja) * | 2008-07-08 | 2013-01-23 | シスメックス株式会社 | 細菌分析装置 |
| JP5480559B2 (ja) | 2008-10-30 | 2014-04-23 | シスメックス株式会社 | 細菌分析装置、細菌分析方法及びコンピュータプログラム |
| JP5768319B2 (ja) * | 2010-01-22 | 2015-08-26 | 株式会社Ihi | 微生物検出方法 |
| JP5779837B2 (ja) * | 2010-02-24 | 2015-09-16 | 株式会社Ihi | 微生物検出方法 |
| ES2560311T3 (es) * | 2013-02-28 | 2016-02-18 | Sysmex Corporation | Analizador de muestras de orina, método de análisis de muestras, y programa de control de análisis de muestras |
| EP3077796A4 (en) | 2013-12-06 | 2017-08-23 | Bacterioscan Ltd. | Optical measurements of liquids having free surface |
| CN106062531B (zh) | 2013-12-06 | 2019-03-08 | 百克特瑞欧扫描有限责任公司 | 用于对液体样品内粒子的特性进行光学测量的试管组件 |
| US10233481B2 (en) | 2014-12-05 | 2019-03-19 | Bacterioscan Ltd | Multi-sample laser-scatter measurement instrument with incubation feature and systems for using the same |
| US10065184B2 (en) | 2014-12-30 | 2018-09-04 | Bacterioscan Ltd. | Pipette having integrated filtration assembly |
| JP2018503842A (ja) | 2015-01-26 | 2018-02-08 | バクテリオスキャン エルティーディー | 回転木馬式流体サンプル配置を呈するレーザ散乱計測器具 |
| MX2020009599A (es) * | 2018-03-22 | 2020-10-07 | Idexx Lab Inc | Metodos para medir bacterias en muestras biologicas. |
| US11099121B2 (en) | 2019-02-05 | 2021-08-24 | BacterioScan Inc. | Cuvette device for determining antibacterial susceptibility |
| JP7352365B2 (ja) | 2019-03-22 | 2023-09-28 | シスメックス株式会社 | 細胞の分析方法、深層学習アルゴリズムの訓練方法、細胞分析装置、深層学習アルゴリズムの訓練装置、細胞の分析プログラム及び深層学習アルゴリズムの訓練プログラム |
| JP2022051447A (ja) | 2020-09-18 | 2022-03-31 | シスメックス株式会社 | 細胞分析方法及び細胞分析装置 |
| JP2022051448A (ja) | 2020-09-18 | 2022-03-31 | シスメックス株式会社 | 細胞分析方法及び細胞分析装置 |
Family Cites Families (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| BE419640A (ja) * | 1936-08-26 | |||
| US4693972A (en) * | 1984-01-16 | 1987-09-15 | Becton, Dickinson And Company | Composition and method for rapid detection of microorganisms in clinical samples |
| US4622298A (en) * | 1984-08-09 | 1986-11-11 | Becton, Dickinson And Company | Detection and quantitation of microorganisms, leukocytes and squamous epithelial cells in urine |
| JP3406608B2 (ja) * | 1994-03-16 | 2003-05-12 | フォス エレクトリック アクティーゼルスカブ | 液体サンプルのコンディショニングのための新しい方法 |
| EP0841403A3 (en) * | 1996-11-08 | 1998-07-29 | Idemitsu Kosan Company Limited | Coloring composition for microorganisms, filter tool for entrapping bacteria, and kit for measuring the number of bacteria |
-
2000
- 2000-03-22 JP JP2000080998A patent/JP3837006B2/ja not_active Expired - Lifetime
-
2001
- 2001-03-20 AT AT01201027T patent/ATE329051T1/de not_active IP Right Cessation
- 2001-03-20 DE DE60120257T patent/DE60120257T2/de not_active Expired - Lifetime
- 2001-03-20 EP EP01201027A patent/EP1136563B1/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| EP1136563A3 (en) | 2004-01-21 |
| ATE329051T1 (de) | 2006-06-15 |
| EP1136563A2 (en) | 2001-09-26 |
| EP1136563B1 (en) | 2006-06-07 |
| JP2001258590A (ja) | 2001-09-25 |
| DE60120257T2 (de) | 2007-03-08 |
| DE60120257D1 (de) | 2006-07-20 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP3837006B2 (ja) | 細菌の染色方法及び検出方法 | |
| US20210130866A1 (en) | Cellular Analysis of Body Fluids | |
| US4336029A (en) | Method and reagents for quantitative determination of reticulocytes and platelets in whole blood | |
| JP4236893B2 (ja) | 菌計数方法および菌計数装置 | |
| EP1203825B1 (en) | Method of staining, detecting and counting bacteria, and a diluent for bacterial stain | |
| US6803208B2 (en) | Automated epifluorescence microscopy for detection of bacterial contamination in platelets | |
| Lemarchand et al. | Comparative assessment of epifluorescence microscopy, flow cytometry and solid-phase cytometry used in the enumeration of specific bacteria in water | |
| JP3739482B2 (ja) | 尿中の有形成分分析方法および試薬 | |
| JP3673137B2 (ja) | ***計数方法及び試薬 | |
| JP3888876B2 (ja) | 細菌の染色方法、細菌の分類・計数方法及び細菌染色用希釈液 | |
| JP6316934B2 (ja) | 尿試料分析方法、尿試料分析用試薬及び尿試料分析用試薬キット | |
| KR20160126065A (ko) | 소변 시료 분석 방법, 소변 시료 분석용 시약 및 소변 시료 분석용 시약 키트 | |
| JPWO2002052034A1 (ja) | 生死判別方法及び核酸増幅方法 | |
| US20090035758A1 (en) | Method of Measurement of Micronucleated Erythrocyte Populations | |
| Saito et al. | Feasibility of flow cytometry for the detection of bacteria from body fluid samples | |
| JP4278936B2 (ja) | 微生物計測方法 | |
| CN113433053B (zh) | 网织红细胞检测染料、检测试剂、检测试剂的制备方法、样本分析仪检测方法及样本分析仪 | |
| RU2006027C1 (ru) | Способ биоиндикации качества воды | |
| JP2000342300A (ja) | 細菌の検出方法及び検出装置 | |
| CN114252633A (zh) | 样本分析***、样本检测方法、组合物及其应用 | |
| JPH11318499A (ja) | 細菌の検出方法及び装置 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20060404 |
|
| A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20060508 |
|
| TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
| A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20060725 |
|
| A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20060728 |
|
| R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 Ref document number: 3837006 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20090804 Year of fee payment: 3 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120804 Year of fee payment: 6 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20120804 Year of fee payment: 6 |
|
| FPAY | Renewal fee payment (event date is renewal date of database) |
Free format text: PAYMENT UNTIL: 20150804 Year of fee payment: 9 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| R250 | Receipt of annual fees |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R250 |
|
| EXPY | Cancellation because of completion of term |