KR20100094614A - 흑마늘 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름개선용 화장료 조성물 - Google Patents

Abstract

본 발명은 흑마늘 추출물을 유효성분으로 함유하는 조성물에 관한 것으로, 상세하게는 본 발명의 흑마늘 추출물은 멜라닌 생성 억제 효과, 티로시나제 활성 억제 효과 및 멜라닌 생성관련 유전자의 발현 억제 효과를 나타내므로 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

흑마늘 추출물, 미백, 주름, 화장료 조성물

Description

흑마늘 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물 {Cosmetic composition comprising an extract of black garlic having skin whitening and wrinkle improving activity}

본 발명은 흑마늘 추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물에 관한 것이다.

[문헌 1] Tobin DJ, et al., Melanin pigmentation in mammalian skin and its hormonal regulation, J. Physiol Rev, 84(4), pp.1155-1228, 2004

[문헌 2] 전희정, 전희정 교수의 마늘이야기, 지구문화사, p.11-12, 2002

[문헌 3] Mosmann T., Rapid colorimetric assay for the cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxic assay, J. Immun., Methods 65, pp.55, 1983

[문헌 4] Hosoi J, et al., Regulation of melanin synthesis of B16 mouse melanoma cells by α-25-dehydroxyvitamin D3 and retinoic acid, Cancer Res. 45, pp.1474-78, 1985

[문헌 5] Matinez Esparza M., et al., Mechanisms and melanogenesis inhibition by tumor necrosis factor-α in B16/F10 mouse melanoma cells, Eur. J. Biochem, 225, pp.139, 1998

최근 의료 및 약학 분야의 비약적인 발전으로 인한 평균수명의 증가는 사회생활 기간연장을 필연적으로 가져오게 되었으며, 이에 따라 좀더 젊고 아름다운 피부를 유지하는 것은 인간의 단순한 욕망을 넘어 사회생활을 원활하게 하는 필수적 항목으로 여겨지고 있다. 인간의 피부는 연령이 증가함에 따라 호르몬 분비의 저하 및 면역세포 기능저하로 인해 피부 단백질의 합성 저하가 유발되며 이는 자연적인 피부노화로 이어지게 된다. 또한, 환경의 파괴로 인한 자외선 증가 및 각종 산화성 물질의 증가는 피부 각질세포(keratinocyte)의 이상증식이나 세포상해를 유발한다. 이러한 피부 세포의 손상이나 기능 저하는 피부 두께를 얇아지게 하며, 탄력의 감소와 피부 주름살의 증가, 기미와 주근깨 등 피부 미용에 치명적인 현상들을 유발한다. 외부환경물질에 의한 세포기능의 변화는 피부 각질세포와 피부 진피세포로부터 다양한 세포조절물질들인 사이토카인(cytokine)을 분비하게 되는데, TGF-beta(transforming growth factor), TNF-alpha(tumor necrosis factor), PGE2(prostaglandin E2), alpha-MSH(melanocyte stimulating hormone), GSF(granulocyte stimulating factor), IL-1(interleukin-1), IL-6, IL-8, IL-10 등은 각질세포(keratinocyte)에서 분비되는 물질이다. α-MSH는 UV와 같은 외부 스트레스를 받으면 피부 각질세포로부터 유리되며 멜라노사이트에 존재하는 수용체에 결합하여 기능을 나타내는 성장 호르몬의 일종이다. 각질세포(keratinocyte)에서 분비된 TGF-beta, PGE2, α-MSH는 멜라닌을 합성하는 멜라노사이트의 세포활성화를 자극하여 외부 스트레스로부터 피부를 방어하는 기전의 일환으로 멜라닌을 합성하며, 분비된 멜라닌은 수지상세포(dendrite)등을 통하여 각질세포(keratinocyte) 등에 전해져서 스트레스에 의한 세포상해를 억제하는 작용을 나타내게 한다. 그러나, 멜라노사이트에서 생성된 갈색 색소와 흑색 색소는 피부미용뿐 만아니라 피부질환에도 부정적 영향을 주기 때문에 향장품 산업분야에서는 피부질환 백색 피부를 얻기 위한 연구의 일환으로 멜라닌 합성을 차단하기 위한 다양한 시도가 있었다 (Tobin DJ, et al., Melanin pigmentation in mammalian skin and its hormonal regulation, J. Physiol Rev, 84(4), pp.1155-1228, 2004).

멜라닌 합성은 멜라노좀 내에 존재하는 티로시나아제의 작용을 통해 이루어진다. 이 티로시나아제는 L-타이로신을 산화시켜 L-DOPA를 만드는 타이로신 하이드록실레이즈로 작용하며 또한, DOPA를 산화시켜 DOPA 퀴논을 만드는 DOPA 산화제로 작용하여 멜라닌을 합성하는 중요한 효소로 알려져 있다. 따라서, 멜라닌 생성을 억제하는 피부 미백제 개발에는 티로시나아제의 활성을 억제하는 것이 필수적이다.

TRP-1(tyrosinase related protein-1)은 TRP-2에 의해 생성된 DHICA (5,6-dihydroxy indole-2-carboxylic acid)를 산화시켜 IQCA(indole-2-carboxylic acid)를 생성하는데, IQCA는 흑갈색을 나타낸다. 따라서, TRP-1 발현을 억제하면 미백효과를 기대할 수 있다.

마늘은 식물분류학적으로 백합목 백합과 알리움속 (ALLium sativum for peiinense Makino, Alium scorodoprassum L.)에 속하는 다년생 구근 식물로 인류의 역사에 최초로 등장한 것은 기원전 4,500년경 나일강을 중심으로 한 고대 이집트로 고대 문명의 발전과 더불어 아라비아, 아프카니스탄을 거쳐 인도, 중국으로 전해지며 세계로 보급되어 현재는 각지에서 재배되고 있다.

마늘은 주로 56~68% 정도의 수분, 26~30% 탄수화물로 구성되어 있으며, 2.3% 유기황화합물, 2% 단백질(주로 allinase), 1.5% 섬유소 등으로 이루어져 있으며, 마늘의 독특한 맛과 향은 마늘의 유기황화합물 중의 하나인 알리신(allicin)에 의한 것으로 알려져 있는데, 상기 알리신은 물에 대한 용해도가 매우 낮은 화합물로서, 마늘내에서는 알린(alliin)으로 존재한다. 마늘의 구조상 알린(alliin)이란 성분은 단백질로서 자체로는 고약한 냄새가 나지 않으나, 마늘 표면에 상처를 내거나 식칼로 도려내거나 갈거나 하는 등의 외부적 변화가 생기면 순식간에 특유한 냄새가 나게 되는데 이것은 마늘내의 알리나아제(allinase) 효소가 산소와의 접촉으로 인해 냄새와 매운맛이 강한 알리신(allicin)으로 변화하게 된다(전희정, 전희정 교수의 마늘이야기, 지구문화사, p.11-12, 2002).

그러나, 마늘의 항암, 항균, 해독 효과 등의 잘 알려져 있는 유익한 효과에도 불구하고 자극성이 심하여 빈속에 날것으로 먹을 경우 위장에 손상을 주는 등의 어려움으로 인하여 그대로 섭취하기가 쉽지 않고, 주로 향신료로 국한되어 사용되어 왔으나, 이마저도 일정시간이 경과하면 쉽게 변질되는 문제점이 있어, 단지 소량만을 섭취하는데 그치게 되어 마늘의 유용한 성분이 인체에 영향을 미치는데 한계가 있어왔다.

피부 미백 및 주름살은 멜라닌 생성과 밀접한 관계를 갖고 있다는 사실은 매우 잘 알려져 있다. 따라서, 멜라닌 생성을 억제하거나 멜라닌 생성에 관여하는 인 자들을 평가하는 것은 피부미백 및 주름 개선용 물질의 개발에 매우 중요한 일이라고 판단된다. 이와 함께 피부미용제는 장기간 피부 적용 또는 복용해야 한다는 점을 고려하면, 유효성과 더불어 안전성이 높은 마늘에 대한 연구는 매우 유익한 결과를 나타낼 것이다.

이에 본 발명자들은 자극성이 강한 마늘을 오랜 기간 숙성시켜서 만든 흑마늘 추출물이 멜라닌 생성 억제 효과, 티로시나아제 활성 억제 효과 및 멜라닌 생성관련 유전자의 발현 억제 효과를 확인함으로써 본 발명을 완성하게 되었다.

상기한 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 흑마늘 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 흑마늘 추출물은 생마늘을 숙성, 건조, 숙성의 단계를 거쳐 흑마늘로 가공하여 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매, 바람직하게는 물, 메탄올 또는 에탄올에 가용한 추출물을 포함한다.

본원에서 정의되는 생마늘은 국내산 남해마을, 국내산 의성마늘 또는 국내산 무안마늘등이며, 바람직하게는 국내산 남해마늘임을 특징으로 한다.

이하, 본 발명의 흑마늘 추출물을 수득하는 방법을 상세히 설명한다.

본 발명의 흑마늘 추출물은 국내산 남해마을, 국내산 의성마늘 또는 국내산 무안마늘 등이며, 바람직하게는 국내 경상남도 남해군에서 재배된 생마늘을 10 내지 120℃, 바람직하게는 40 내지 90℃에서 150 내지 500시간, 바람직하게는 280 내 지 320시간 동안 열풍으로 1차 숙성하는 제 1단계; 상기 단계에서 숙성된 마늘을 10 내지 60시간, 바람직하게는 38 내지 42시간 동안 자연 건조하는 제 2단계; 상기 건조 마늘을 다시 10 내지 50℃, 바람직하게는 20 내지 30℃의 온도의 열풍으로 10 내지 100시간, 바람직하게는 30 내지 50시간 동안 숙성하는 2차 숙성 단계를 포함하는 제 3단계: 상기 제 3단계에서 수득한 흑마늘을 동결건조하고 이를 분쇄한 후, 시료중량의 1 내지 30배, 바람직하게는 5 내지 15배 부피의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물, 메탄올 또는 에탄올로부터 선택된 용매, 더욱 바람직하게는 60-100% 메탄올에 가용한 추출물을 1 내지 48시간, 바람직하게는 5 내지 12시간 동안 실온에서 열수추출, 냉침추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출, 가열추출 등의 추출방법, 바람직하게는 냉침추출법으로 추출하는 제 4단계: 상기 제 4단계에서 수득한 추출물을 감압여과하여 수득한 제 1차 추출액과 잔사를 분리하는 제 5단계: 상기 5단계에서 수득한 잔사에 추출 시작 당시의 흑마늘 시료중량의 1 내지 20배, 바람직하게는 5 내지 10배 부피(w/v)의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매, 바람직하게는 물과 메탄올의 혼합용매, 더욱 바람직하게는 60-100% 메탄올에 가용한 추출물을 실온에서 1 내지 10시간, 바람직하게는 1 내지 5시간 동안 열수추출, 냉침추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출, 가열추출 등의 추출방법, 바람직하게는 냉침추출법으로 추출하여 감압여과하고 제 1차 추출액과 합쳐 농축 및 건조하는 제 6단계의 제조공정을 통하여 본 발명의 흑마늘 추출물을 수득할 수 있다.

본 발명은 상기의 제조공정으로 얻어진 흑마늘 추출물을 유효성분으로 함유 하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물을 제공한다.

본 발명의 흑마늘 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 추출물을 0.1 ~ 50 중량% 포함한다.

또한, 마늘은 오랫동안 식용으로 사용되어 오던 약재로서 이로부터 추출된 본 발명의 흑마늘 추출물 역시 독성 및 부작용 등의 문제가 없으며, 피부 자극 시험에서 무자극 시료임이 입증되었으므로 장기간 사용 시에도 안심하고 사용할 수 있다.

본 발명의 흑마늘 추출물을 포함하는 조성물은 피부 미백 및 주름개선 효과를 위한 화장품 및 샴푸 등에 다양하게 이용될 수 있다. 본 조성물을 첨가할 수 있는 제품으로는, 예를들어, 각종 크림, 로션, 스킨, 에센스 등과 같은 화장품류와 샴푸, 린스, 클렌징, 세안제, 비누, 트리트먼트, 팩, 미용액 등이 있다.

본 발명의 화장료는 수용성 비타민, 유용성 비타민, 고분자 펩티드, 고분자 다당, 스핑고 지질 및 해초 엑기스로 이루어진 군에서 선택된 조성물을 포함한다.

수용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 B1, 비타민 B2, 비타민 B6, 피리독신, 염산피리독신, 비타민 B12, 판토텐산, 니코틴산, 니코틴산아미드, 엽산, 비타민 C, 비타민 H 등을 들 수 있으며, 그들의 염 (티아민염산염, 아스코르빈산나트륨염 등)이나 유도체 (아스코르빈산-2-인산나트륨염, 아스코르빈산-2-인산마그네슘염 등)도 본 발명에서 사용할 수 있는 수용성 비타민에 포함된다. 수용성 비타민은 미생물 변환법, 미생 물의 배양물로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 수득할 수 있다.

유용성 비타민으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 비타민 A, 카로틴, 비타민 D2, 비타민 D3, 비타민 E(d1-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤, d-알파 토코페롤) 등을 들 수 있으며, 그들의 유도체 (팔미틴산아스코르빈, 스테아르산아스코르빈, 디팔미틴산아스코르빈, 아세트산 dl-알파 토코페롤, 니코틴산dl-알파 토코페롤비타민 E, DL-판토테닐알코올, D-판토테닐알코올, 판토테닐에틸에테르 등) 등도 본 발명에서 사용되는 유용성 비타민에 포함된다. 유용성 비타민은 미생물 변환법, 미생물의 배양물로부터의 정제법, 효소 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 취득할 수 있다.

고분자 펩티드로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 콜라겐, 가수 분해 콜라겐, 젤라틴, 엘라스틴, 가수 분해 엘라스틴, 케라틴 등을 들 수 있다. 고분자 펩티드는 미생물의 배양액으로부터의 정제법, 효소법 또는 화학 합성법 등의 통상의 방법에 의해 정제 취득할 수 있으며, 또는 통상 돼지나 소 등의 진피, 누에의 견섬유 등의 천연물로부터 정제하여 사용할 수 있다.

고분자 다당으로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 히드록시에틸셀룰로오스, 크산탄검, 히알루론산나트륨, 콘드로이틴 황산 또는 그 염(나트륨염 등) 등을 들 수 있다. 예를 들어, 콘드로이틴 황산 또는 그 염 등은 통상 포유 동물이나 어류로부터 정제하여 사용할 수 있다.

스핑고 지질로서는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 세라미드, 피토스핑고신, 스핑고당지질 등을 들 수 있다. 스핑고 지질은 통상 포유류, 어류, 패류, 효모 또는 식물 등으로부터 통상의 방법에 의해 정제하거나 화학 합성법에 의해 취득할 수 있다.

해초 엑기스로는 화장품에 배합 가능한 것이라면 어떠한 것이라도 되지만, 바람직하게는 갈조 엑기스, 홍조 엑기스, 녹조 엑기스 등을 들 수 있으며, 또, 이들의 해초 엑기스로부터 정제된 칼라기난, 아르긴산, 아르긴산나트륨, 아르긴산칼륨 등도 본 발명에서 사용되는 해초 엑기스에 포함된다. 해초 엑기스는 해초로부터 통상의 방법에 의해 정제하여 취득할 수 있다.

본 발명의 화장료에는 상기 필수 성분과 더불어 필요에 따라 통상 화장료에 배합되는 다른 성분을 배합해도 된다.

이외에 첨가해도 되는 배합 성분으로서는 유지 성분, 보습제, 에몰리엔트제, 계면 활성제, 유기 및 무기 안료, 유기 분체, 자외선 흡수제, 방부제, 살균제, 산화 방지제, 식물 추출물, pH 조정제, 알콜, 색소, 향료, 혈행 촉진제, 냉감제, 제한(制汗)제, 정제수 등을 들 수 있다.

유지 성분으로서는 에스테르계 유지, 탄화수소계 유지, 실리콘계 유지, 불소계 유지, 동물 유지, 식물 유지 등을 들 수 있다.

에스테르계 유지로서는 트리2-에틸헥산산글리세릴, 2-에틸헥산산세틸, 미리스틴산이소프로필, 미리스틴산부틸, 팔미틴산이소프로필, 스테아르산에틸, 팔미틴산옥틸, 이소스테아르산이소세틸, 스테아르산부틸, 리놀레산에틸, 리놀레산이소프 로필, 올레인산에틸, 미리스틴산이소세틸, 미리스틴산이소스테아릴, 팔미틴산이소스테아릴, 미리스틴산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 세바신산디에틸, 아디핀산디이소프로필, 네오펜탄산이소알킬, 트리(카프릴, 카프린산)글리세릴, 트리2-에틸헥산산트리메틸롤프로판, 트리이소스테아르산트리메틸롤프로판, 테트라2-에틸헥산산펜타엘리슬리톨, 카프릴산세틸, 라우린산데실, 라우린산헥실, 미리스틴산데실, 미리스틴산미리스틸, 미리스틴산세틸, 스테아르산스테아릴, 올레인산데실, 리시노올레인산세틸, 라우린산이소스테아릴, 미리스틴산이소트리데실, 팔미틴산이소세틸, 스테아르산옥틸, 스테아르산이소세틸, 올레인산이소데실, 올레인산옥틸도데실, 리놀레산옥틸도데실, 이소스테아르산이소프로필, 2-에틸헥산산세토스테아릴, 2-에틸헥산산스테아릴, 이소스테아르산헥실, 디옥탄산에틸렌글리콜, 디올레인산에틸렌글리콜, 디카프린산프로필렌글리콜, 디(카프릴,카프린산)프로필렌글리콜, 디카프릴산프로필렌글리콜, 디카프린산네오펜틸글리콜, 디옥탄산네오펜틸글리콜, 트리카프릴산글리세릴, 트리운데실산글리세릴, 트리이소팔미틴산글리세릴, 트리이소스테아르산글리세릴, 네오펜탄산옥틸도데실, 옥탄산이소스테아릴, 이소노난산옥틸, 네오데칸산헥실데실, 네오데칸산옥틸도데실, 이소스테아르산이소세틸, 이소스테아르산이소스테아릴, 이소스테아르산옥틸데실, 폴리글리세린올레인산에스테르, 폴리글리세린이소스테아르산에스테르, 시트르산트리이소세틸, 시트르산트리이소알킬, 시트르산트리이소옥틸, 락트산라우릴, 락트산미리스틸, 락트산세틸, 락트산옥틸데실, 시트르산트리에틸, 시트르산아세틸트리에틸, 시트르산아세틸트리부틸, 시트르산트리옥틸, 말산디이소스테아릴, 히드록시스테아르산 2-에틸헥실, 숙신산디2-에틸 헥실, 아디핀산디이소부틸, 세바신산디이소프로필, 세바신산디옥틸, 스테아르산콜레스테릴, 이소스테아르산콜레스테릴, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 올레인산콜레스테릴, 올레인산디히드로콜레스테릴, 이소스테아르산피트스테릴, 올레인산피트스테릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소세틸, 12-스테알로일히드록시스테아르산스테아릴, 12-스테알로일히드록시스테아르산이소스테아릴 등의 에스테르계 등을 들 수 있다.

탄화 수소계 유지로서는 스쿠알렌, 유동 파라핀, 알파-올레핀올리고머, 이소파라핀, 세레신, 파라핀, 유동 이소파라핀, 폴리부덴, 마이크로크리스탈린왁스, 와셀린 등의 탄화 수소계 유지 등을 들 수 있다.

실리콘계 유지로서는 폴리메틸실리콘, 메틸페닐실리콘, 메틸시클로폴리실록산, 옥타메틸폴리실록산, 데카메틸폴리실록산, 도데카메틸시클로실록산, 디메틸실록산ㆍ메틸세틸옥시실록산 공중합체, 디메틸실록산ㆍ메틸스테알록시실록산 공중합체, 알킬 변성 실리콘유, 아미노 변성 실리콘유 등을 들 수 있다.

불소계 유지로서는 퍼플루오로폴리에테르 등을 들 수 있다.

동물 또는 식물 유지로서는 아보카도유, 아르몬드유, 올리브유, 참깨유, 쌀겨유, 새플라워유, 대두유, 옥수수유, 유채유, 행인(杏仁)유, 팜핵유, 팜유, 피마자유, 해바라기유, 포도종자유, 면실유, 야자유, 쿠쿠이너트유, 소맥배아유, 쌀 배아유, 시아버터, 월견초유, 마커데이미아너트유, 메도홈유, 난황유, 우지(牛脂), 마유, 밍크유, 오렌지라피유, 호호바유, 캔데리러왁스, 카르나바왁스, 액상 라놀린, 경화피마자유 등의 동물 또는 식물 유지를 들 수 있다.

보습제로서는 수용성 저분자 보습제, 지용성 분자 보습제, 수용성 고분자, 지용성 고분자 등을 들 수 있다.

수용성 저분자 보습제로서는 세린, 글루타민, 솔비톨, 만니톨, 피롤리돈-카르복실산나트륨, 글리세린, 프로필렌글리콜, 1,3-부틸렌글리콜, 에틸렌글리콜, 폴리에틸렌글리콜B(중합도 n = 2 이상), 폴리프로필렌글리콜(중합도 n = 2 이상), 폴리글리세린B(중합도 n = 2 이상), 락트산, 락트산염 등을 들 수 있다.

지용성 저분자 보습제로서는 콜레스테롤, 콜레스테롤에스테르 등을 들 수 있다.

수용성 고분자로서는 카르복시비닐폴리머, 폴리아스파라긴산염, 트라가칸트, 크산탄검, 메틸셀룰로오스, 히드록시메틸셀룰로오스, 히드록시에틸셀룰로오스, 히드록시프로필셀룰로오스, 카르복시메틸셀룰로오스, 수용성 키틴, 키토산, 덱스트린 등을 들 수 있다.

지용성 고분자로서는 폴리비닐피롤리돈ㆍ에이코센 공중합체, 폴리비닐피롤리돈ㆍ헥사데센 공중합체, 니트로셀룰로오스, 덱스트린지방산에스테르, 고분자 실리콘 등을 들 수 있다.

에몰리엔트제로서는 장쇄아실글루타민산콜레스테릴에스테르, 히드록시스테아르산콜레스테릴, 12-히드록시스테아르산, 스테아르산, 로진산, 라놀린지방산콜레스테릴에스테르 등을 들 수 있다.

계면 활성제로서는 비이온성 계면 활성제, 음이온성 계면 활성제, 양이온성 계면 활성제, 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

비이온성 계면 활성제로서는 자기 유화형 모노스테아르산글리세린, 프로필렌글리콜지방산에스테르, 글리세린지방산에스테르, 폴리글리세린지방산에스테르, 솔비탄지방산에스테르, POE (폴리옥시에틸렌)솔비탄지방산에스테르, POE 솔비트지방산에스테르, POE 글리세린지방산에스테르, POE 알킬에테르, POE 지방산에스테르, POE 경화피마자유, POE 피마자유, POEㆍPOP (폴리옥시에틸렌ㆍ폴리옥시프로필렌) 공중합체, POEㆍPOP 알킬에테르, 폴리에테르변성실리콘, 라우린산알카놀아미드, 알킬아민옥시드, 수소첨가대두인지질 등을 들 수 있다.

음이온성 계면 활성제로서는 지방산비누, 알파-아실술폰산염, 알킬술폰산염, 알킬알릴술폰산염, 알킬나프탈렌술폰산염, 알킬황산염, POE 알킬에테르황산염, 알킬아미드황산염, 알킬인산염, POE 알킬인산염, 알킬아미드인산염, 알킬로일알킬타우린염, N-아실아미노산염, POE 알킬에테르카르복실산염, 알킬술포숙신산염, 알킬술포아세트산나트륨, 아실화 가수분해 콜라겐펩티드염, 퍼플루오로알킬인산에스테르 등을 들 수 있다.

양이온성 계면 활성제로서는 염화알킬트리메틸암모늄, 염화스테아릴트리메틸암모늄, 브롬화스테아릴트리메틸암모늄, 염화세토스테아릴트리메틸암모늄, 염화디스테아릴디메틸암모늄, 염화스테아릴디메틸벤질암모늄, 브롬화베헤닐트리메틸암모늄, 염화벤잘코늄, 스테아르산디에틸아미노에틸아미드, 스테아르산디메틸아미노프로필아미드, 라놀린 유도체 제 4급 암모늄염 등을 들 수 있다.

양성 계면 활성제로서는 카르복시베타인형, 아미드베타인형, 술포베타인형, 히드록시술포베타인형, 아미드술포베타인형, 포스포베타인형, 아미노카르복실산염 형, 이미다졸린 유도체형, 아미드아민형 등의 양성 계면 활성제 등을 들 수 있다.

유기 및 무기 안료로서는 규산, 무수규산, 규산마그네슘, 탤크, 세리사이트, 마이카, 카올린, 벵갈라, 클레이, 벤토나이트, 티탄피막운모, 옥시염화비스무트, 산화지르코늄, 산화마그네슘, 산화아연, 산화티탄, 산화알루미늄, 황산칼슘, 황산바륨, 황산마그네슘, 탄산칼슘, 탄산마그네슘, 산화철, 군청, 산화크롬, 수산화크롬, 칼라민 및 이들의 복합체등의 무기 안료 ; 폴리아미드, 폴리에스테르, 폴리프로필렌, 폴리스티렌, 폴리우레탄, 비닐수지, 요소수지, 페놀수지, 불소수지, 규소수지, 아크릴수지, 멜라민수지, 에폭시수지, 폴리카보네이트수지, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 실크파우더, 셀룰로오스, CI 피그먼트옐로우, CI 피그먼트오렌지 등의 유기 안료 및 이들의 무기 안료와 유기 안료의 복합 안료 등을 들 수 있다.

유기 분체로서는 스테아르산칼슘 등의 금속비누 ; 세틸린산아연나트륨, 라우릴린산아연, 라우릴린산칼슘 등의 알킬인산금속염 ; N-라우로일-베타-알라닌칼슘, N-라우로일-베타-알라닌아연, N-라우로일글리신칼슘 등의 아실아미노산 다가금속염 ; N-라우로일-타우린칼슘, N-팔미토일-타우린칼슘 등의 아미드술폰산 다가금속염 ; N-엡실론-라우로일-L-리진, N-엡실론-팔미토일리진, N-알파-파리토일올니틴, N-알파-라우로일아르기닌, N-알파-경화우지지방산아실아르기닌 등의 N-아실염기성아미노산 ; N-라우로일글리실글리신 등의 N-아실폴리펩티드 ; 알파-아미노카프릴산, 알파-아미노라우린산 등의 알파-아미노지방산 ; 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 나일론, 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리스티렌, 디비닐벤젠ㆍ스티렌 공중합체, 사불화에틸렌 등을 들 수 있다.

자외선 흡수제로서는 파라아미노벤조산, 파라아미노벤조산에틸, 파라아미노벤조산아밀, 파라아미노벤조산옥틸, 살리실산에틸렌글리콜, 살리신산페닐, 살리신산옥틸, 살리신산벤질, 살리신산부틸페닐, 살리신산호모멘틸, 계피산벤질, 파라메톡시계피산-2-에톡시에틸, 파라메톡시계피산옥틸, 디파라메톡시계피산모노-2-에틸헥산글리세릴, 파라메톡시계피산이소프로필, 디이소프로필ㆍ디이소프로필계피산에스테르 혼합물, 우로카닌산, 우로카닌산에틸, 히드록시메톡시벤조페논, 히드록시메톡시벤조페논술폰산 및 그 염, 디히드록시메톡시벤조페논, 디히드록시메톡시벤조페논디술폰산나트륨, 디히드록시벤조페논, 테트라히드록시벤조페논, 4-tert-부틸-4'-메톡시디벤조일메탄, 2,4,6-트리아닐리노-p-(카르보-2'-에틸헥실-1'-옥시)-1,3,5-트리아진, 2-(2-히드록시-5-메틸페닐)벤조트리아졸 등을 들 수 있다.

살균제로서는 히노키티올, 트리클로산, 트리클로로히드록시디페닐에테르, 크로르헥시딘글루콘산염, 페녹시에탄올, 레조르신, 이소프로필메틸페놀, 아줄렌, 살리칠산, 진크필리티온, 염화벤잘코늄, 감광소 301 호, 모노니트로과이어콜나트륨, 운데시렌산 등을 들 수 있다.

산화 방지제로서는 부틸히드록시아니솔, 갈릭산프로필, 엘리소르빈산 등을 들 수 있다.

pH 조정제로서는 시트르산, 시트르산나트륨, 말산, 말산나트륨, 프말산, 프말산나트륨, 숙신산, 숙신산나트륨, 수산화나트륨, 인산일수소나트륨 등을 들 수 있다.

알코올로서는 세틸알코올 등의 고급 알코올을 들 수 있다.

또한, 이외에 첨가해도 되는 배합 성분은 이에 한정되는 것은 아니며, 또, 상기 어느 성분도 본 발명의 목적 및 효과를 손상시키지 않는 범위 내에서 배합 가능하지만, 총중량에 대하여 바람직하게는 0.01-5% 중량 백분율, 보다 바람직하게는 0.01-3% 중량 백분율로 배합된다.

본 발명의 화장료는 용액, 유화물, 점성형 혼합물 등의 형상을 취할 수 있다.

본 발명의 화장료 조성물에 포함되는 성분은 유효성분으로서 흑마늘 추출물 이외에 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함할 수 있으며, 예를 들면, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 및 담체를 포함한다.

본 발명의 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 제형으로도 제조될 수 있으며, 예를 들어 유액, 크림, 화장수, 팩, 파운데이션, 로션, 미용액 등을 들 수 있다.

구체적으로, 본 발명의 화장료 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 헤어로션, 헤어토닉, 헤어에센스, 헤어샴푸, 헤어린스, 헤어트리트먼트, 바디로션 및 바디클린저의 제형을 포함한다.

본 발명의 제형이 페이스트, 크림 또는 겔인 경우에는 담체 성분으로서 동물섬유, 식물섬유, 왁스, 파라핀, 전분, 트라칸트, 셀룰로오스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 실리카, 탈크 또는 산화아연 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 파우더 또는 스프레이인 경우에는 담체 성분으로서 락토스, 탈크, 실리카, 알루미늄 히드록시드, 칼슘 실리케이트 또는 폴리아미드 파우더가 이용될 수 있고, 특히 스프레이인 경우에는 추가적으로 클로로플루오로히드로카본, 프로판/부탄 또는 디메틸 에테르와 같은 추진체를 포함할 수 있다.

본 발명의 제형이 용액 또는 유탁액의 경우에는 담체 성분으로서 용매, 용매화제 또는 유탁화제가 이용되고, 예컨대 물, 에탄올, 이소프로판올, 에틸 카보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알코올, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸글리콜 오일, 글리세롤 지방족 에스테르, 폴리에틸렌 글리콜 또는 소르비탄의 지방산 에스테르가 있다.

본 발명의 제형이 현탁액인 경우에는 담체 성분으로서 물, 에탄올 또는 프로필렌 글리콜과 같은 액상 희석제, 에톡실화 이소스테아릴 알코올, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 에스테르 및 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 같은 현탁제, 미소결정성 셀룰로오스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가 또는 트라칸트 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 제형이 계면-활성제 함유 클린징인 경우에는 담체 성분으로서 지방족 알코올 설페이트, 지방족 알코올 에테르 설페이트, 설포숙신산 모노에스테르, 이세티오네이트, 이미다졸리늄 유도체, 메틸타우레이트, 사르코시네이트, 지방산 아미드 에테르 설페이트, 알킬아미도베타인, 지방족 알코올, 지방산 글리세리드, 지방산 디에탄올아미드, 식물성 유, 리놀린 유도체 또는 에톡실화 글리세롤 지방산 에스테르 등이 이용될 수 있다.

본 발명의 흑마늘 추출물은 멜라닌 생성 억제 효과, 티로시나아제 활성 억제 효과 및 멜라닌 생성관련 유전자의 발현 억제 효과를 나타내므로 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물로 유용하게 이용될 수 있다.

이하, 본 발명을 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예, 참고예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 흑마늘 추출물의 제조

1-1. 흑마늘 열수 추출물의 제조

경상남도 남해군에서 재배된 국내산 생마늘을 남해 농협에서 구입하여 이 중 생마늘 500g을 40 ∼ 90℃에서 약 280 ∼ 320시간 열풍으로 숙성하고, 숙성한 마을을 약 38 ∼ 42시간 동안 자연 건조한 후, 다시 20 ∼ 30℃의 열풍으로 약 30 ∼ 50시간 숙성하여 흑마늘 347.5g을 수득하여, 수득한 흑마늘 중 100g을 동결 건조기(Clean-Vac 24T, 바이오트론)로 동결 건조하여 분쇄한 후, 시료 중량의 약 7배 부피의 증류수로 실온에서 10시간 동안 추출하고, 감압 여과하여 얻은 1차 추출액 및 잔사를 각각 분리하였다. 여기에서 수득한 잔사에 추출 시작 당시의 흑마늘 시 료중량의 약 6배 부피의 증류수로 실온에서 다시 3시간 동안 추출한 후, 감압여과하고 상기의 1차 추출액과 합하여 농축 및 동결건조하여 본 발명의 흑마늘 열수 추출물 58.5 g을 수득하였다.

1-2. 흑마늘 메탄올 추출물의 제조

경상남도 남해군에서 재배된 국내산 생마늘을 남해 농협에서 구입하여 이 중 생마늘 500g을 40 ∼ 90℃에서 280 ∼ 320시간 열풍으로 숙성하고, 이를 38 ∼ 42시간 동안 자연 건조한 후, 다시 20 ∼ 30℃의 열풍으로 30 ∼ 50시간 숙성하여 흑마늘 347.5g을 수득하여, 수득한 흑마늘 중 100g을 동결 건조기(Clean-Vac 24T, 바이오트론)로 동결 건조하여 분쇄한 후, 시료 중량의 약 7배 부피의 100% 메탄올로 실온에서 10시간 동안 추출하고, 감압 여과하여 얻은 1차 추출액 및 잔사를 각각 분리하였다. 여기에서 수득한 잔사에 추출 시작 당시의 흑마늘 시료중량의 약 6배 부피의 100% 메탄올로 실온에서 다시 3시간 동안 추출한 후, 감압여과하고 상기의 1차 추출액과 합하여 농축 및 동결건조하여 본 발명의 흑마늘 메탄올 추출물 30.9 g을 수득하였다.

1-3. 흑마늘 에탄올 추출물의 제조

경상남도 남해군에서 재배된 국내산 생마늘을 남해 농협에서 구입하여 이 중 생마늘 500g을 40 ∼ 90℃에서 280 ∼ 320시간 열풍으로 숙성하고, 이를 38 ∼ 42시간 동안 자연 건조한 후, 다시 20 ∼ 30℃의 열풍으로 30 ∼ 50시간 숙성하여 흑 마늘 347.5g을 수득하여, 수득한 흑마늘 중 100g을 동결 건조기(Clean-Vac 24T, 바이오트론)로 동결 건조하여 분쇄한 후, 시료 중량의 약 7배 부피의 100% 에탄올로 실온에서 10시간 동안 추출하고, 감압 여과하여 얻은 1차 추출액 및 잔사를 각각 분리하였다. 여기에서 수득한 잔사에 추출 시작 당시의 흑마늘 시료중량의 약 6배 부피의 100% 에탄올로 실온에서 다시 3시간 동안 추출한 후, 감압여과하고 상기의 1차 추출액과 합하여 농축 및 동결건조하여 본 발명의 흑마늘 에탄올 추출물 47.7 g을 수득하였다.

비교예 1. 생마늘 추출물의 제조

1-1. 생마늘 열수 추출물의 제조

경상남도 남해군에서 재배된 국내산 생마늘을 남해 농협에서 구입하여 이 중 생마늘 100g을 동결 건조기(Clean-Vac 24T, 바이오트론)로 동결건조하여 분쇄한 후, 시료 중량의 약 7배 부피의 증류수로 실온에서 10시간 동안 추출하고, 감압 여과하여 얻은 1차 추출액 및 잔사를 각각 분리하였다. 여기에서 수득한 잔사에 추출 시작 당시의 생마늘 시료중량의 약 6배 부피의 증류수로 실온에서 다시 3시간 동안 추출한 후, 감압여과하고 상기의 1차 추출액과 합하여 농축 및 동결건조하여 생마늘 열수 추출물 26.9 g을 수득하였다.

1-2. 생마늘 메탄올 추출물의 제조

경상남도 남해군에서 재배된 국내산 생마늘을 남해 농협에서 구입하여 이 중 생마늘 100g을 동결 건조기(Clean-Vac 24T, 바이오트론)로 동결건조하여 분쇄한 후, 시료 중량의 약 7배 부피의 100% 메탄올로 실온에서 10시간 동안 추출하고, 감압 여과하여 얻은 1차 추출액 및 잔사를 분리하였다. 여기에서 수득한 잔사에 추출 시작 당시의 생마늘 시료중량의 약 6배 부피의 100% 메탄올로 실온에서 다시 3시간 동안 추출한 후, 감압여과하고 상기의 1차 추출액과 합하여 농축 및 동결건조하여 생마늘 메탄올 추출물 6.5 g을 수득하였다.

1-3. 생마늘 에탄올 추출물의 제조

경상남도 남해군에서 재배된 국내산 생마늘을 남해 농협에서 구입하여 이 중 생마늘 100g을 동결 건조기(Clean-Vac 24T, 바이오트론)로 동결건조하여 분쇄한 후, 시료 중량의 약 7배 부피의 100% 에탄올로 실온에서 10시간 동안 추출하고, 감압 여과하여 얻은 1차 추출액 및 잔사를 분리하였다. 여기에서 수득한 잔사에 추출 시작 당시의 생마늘 시료중량의 약 6배 부피의 100% 에탄올로 실온에서 다시 3시간 동안 추출한 후, 감압여과하고 상기의 1차 추출액과 합하여 농축 및 동결건조하여 생마늘 에탄올 추출물 40.7 g을 수득하였다.

참고예 1. 시약 및 재료

1-1. 실험 준비

본 실험에 사용된 B16F10 세포는 한국 세포주 은행에서 구입하여, DMEM 배지(Gibco BRL, Grand Island, NY, USA)에 10% fetal bovine serum(FBS, Sigma), 1% 의 페니실린/스트렙토마이신을 첨가하여 기본배지로 사용하였으며, CO₂ 세포 배양기 (37℃, 5% CO₂)에서 배양한 후 실험에 이용하였다. 약 24시간 주기로 DMEM 배지를 교환하였다.

세포배양에 사용된 배지 및 시약은 따로 표시가 없으면 Invitrogen Gibco BRL 사(Grand Island, NY, USA) 제품으로 사용하였으며, 기타 α-MSH (synthetic α-melanocyte stimulating hormone), L-DOPA (dopamine hydrochloride), 코직 산 (kojic acid)등의 시약은 시그마(Sigma)사로부터 구입하여 사용 하였다.

1-2. 기기

세포실험을 위하여 CO₂ 세포 배양기, 무균실험대 (Clean bench, 수공양행), 역상현미경 (Inverted Microscope, 올림푸스, 일본), 원심분리기 (한일원심분리), 헤마토사이토미터, 셀 카운터, 초저온냉동고 (Deep freezer), 질소저장탱크, 반응수조 (water bath), 펌프 (pump)등을 사용하였고, 전기영동기(Electro phoresis apparatus, 바이오라드), pH 미터기 (ATI Orion model 370, 미국) 등을 사용하였으며, 실험에 사용한 정제수는 밀리-큐 시스템 (mili-Q system, Milipore Co., 미국)으로 제조하였다.

실험예 1. 세포독성 측정

상기 실시예 1의 흑마늘 추출물의 세포 독성률을 알아보기 위해 모스만의 방 법(Mosmann T., Rapid colorimetric assay for the cellular growth and survival:application to proliferation and cytotoxic assay, J. Immun., Methods 65, pp.55, 1983)을 변형하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

세포배양용 48 웰 플레이트(well plate)에 B16F10 희석세포를 5 × 10⁴개/200㎕/웰 농도로 분주하여 약 6 ~ 8 시간 동안 안정화시킨 다음, 50%(w/v)농도의 생마늘 추출물 및 흑마늘 추출물 희석 시료를 배지에 적절히 희석하여 각 실험 농도별((메탄올의 경우만 0.06, 0.12 추가) 0.25, 0.5, 1.0, 1.5, 2.0, 2.5, 3.0 %)로 처리하여 24 시간 배양하였다. 이 후 PBS로 두 번 수세한 다음 웰 당 200㎕의 1:100 희석 MTS 용액 (Celltiter 96^R AQueous one solution reagent, Promega)을 넣고 은박지로 포장한 후 1시간 이상 배양한 후 마이크로플레이트 리더기(microplate reader)로 490nm에서 흡광도를 측정하였다. 또한, 양성 대조군으로 코직 산(kojic acid)을 사용하였고, 측정은 세 번 이상 하였으며, 그에 대한 평균값과 표준 오차 및 그림을 시그마 플롯(Sigma Plot) 프로그램을 이용하여 측정하였다.

실험결과, 도 1에서 나타낸 바와 같이 상기 실시예 1-1 및 실시예 1-3의 흑마늘 열수 추출물, 흑마늘 에탄올 추출물에서는 0.5% (500 μg/ml)까지, 상기 실시예 1-2의 흑마늘 메탄올 추출물에서는 0.25%(250 μg/ml)까지 세포 증식에 큰 영향이 없는 것으로 나타났으나, 상기 비교예 1-2의 생마늘 메탄올 추출물(비교군)의 경우 흑마늘 메탄올 추출물에 비해 상대적으로 세포독성이 매우 강한 것으로 나타났다(도 1 참조).

실험예 2. 멜라닌 생성 억제 효과 측정

상기 실시예 1의 흑마늘 추출물의 멜라닌 생성 억제 효과를 알아보기 위해 호세이 등의 방법(Hosoi J, et al., Regulation of melanin synthesis of B16 mouse melanoma cells by α-25-dehydroxyvitamin D3 and retinoic acid, Cancer Res. 45, pp.1474-78, 1985)을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

세포 배양용 6-웰 플레이트에 1.0 ×10⁵/2ml/well 농도로 분주하고 24시간이 지난 뒤 멜라닌(melanin) 생성세포로 분화를 촉진하기 위하여 α-MSH(100 nM)와 멜라닌 생성 억제 시약으로 알려진 코직 산 (kojic acid; 0.5 mM 또는 1 mM(도 3에서는 0.5 mM 사용)을 멜라닌 생성 억제 양성대조군 시약으로 하여 각각의 흑마늘 추출물 및 생마늘 추출물 시료 0.3%(w/v)(생마늘 메탄올 추출물은 0.03%(w/v))를 처리하여 2일 마다 배지를 갈아주며 5일간 처리 배양하였다. 최종 배양 후 배양액을 모아 배양배지에 분비된 멜라닌 농도 측정에 사용하였으며, 동시에 수집된 세포에 1N NaOH를 첨가하여 60℃에서 약 1시간 동안 반응시켜 멜라닌을 용출시킨 후 세포내 멜라닌의 양을 405nm 흡광도로 측정하였다.

실험결과, 도 2에 나타난 바와 같이, 세포외(배지) 멜라닌 생성 억제 효과는 양성대조군으로 사용된 코직 산(kojic acid) 1 mM (도 2-A, 2-C), 0.5 mM (도 2-B)에서 농도 의존적으로 멜라닌 분비 억제효과가 나타났으며, 상기 실시예 1의 흑마늘 추출물이 상기 비교예 1의 생마늘 추출물들에 비해 약 2배 이상 탁월한 멜라닌 분비 억제 효과를 보였다(도 2 참조).

또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 세포내 멜라닌 생성 억제 효과는 상기 도 2의 결과인 세포외(배지) 멜라닌 생성 억제효과의 결과와 매우 유사하게 나타났다. 이러한 결과는 흑마늘 추출물이 세포내에서의 멜라닌 생성을 억제하여 분비 멜라닌의 농도를 억제함을 나타낸다(도 3 참조).

실험예 3. 티로시나아제(Tyrosinase) 활성 측정

상기 세포내 멜라닌 생합성의 주요 경로의 가장 주요한 효소인 티로시나아제(Tyrosinase) 활성 효과를 알아보기 위해 마티네즈의 방법(Matinez Esparza M., et al., Mechanisms and melanogenesis inhibition by tumor necrosis factor-α in B16/F10 mouse melanoma cells, Eur. J. Biochem, 225, pp.139, 1998)을 이용하여 하기와 같이 실험을 수행하였다.

세포내 티로시나아제 활성에 미치는 영향을 알아보기 위하여 시료 처리 2일째의 효소활성을 조사하였다. 세포 배양용 12-웰 플레이트에 세포를 5 × 10⁴/ml/well을 분주하고, 24시간 후 α-MSH(100 nM)와 코직 산(kojic acid; 0.5 mM)를 포함하여 50%(w/v)농도의 생마늘 추출물 및 흑마늘 추출물 희석 시료를 배지에 적절히 희석하여 각 실험 농도별(열수 추출물: 0.5%, 에탄올 추출물: 0.1, 0.2, 0.3, 0.4%, 메탄올 추출물: 0.001, 0.003, 0.01, 0.03%)로 첨가 하였다. 시료 처리 2일 경과 후 media를 제거하고 PBS로 수세한 후 세포 용해 완충액(cell lysis buffer; 50mM sodium phosphate buffer, containing 1% triton X-100, 0.2mM PMSF) 250㎕씩 가하고, 동결-해동법으로 세포를 용해시켰다. 용해된 세포를 모은 후 4℃에서 13,000xg로 30분간 원심분리 한 후, 상층액을 취하였다. L-DOPA 용액(2mg/ml) 40㎕씩을 96-well 마이크로플레이트의 웰에 분주한 후 세포 용해 상층액 160㎕을 가하여 잘 섞은 다음 37℃에서 반응 시키며 490nm에서 10분 간격으로 70분까지 측정하였다. 이 중 가장 높은 변화 값을 보이는 30분 또는 40분 시간대의 측정값을 효소활성 계산에 사용하였다. 이 때 사용된 세포 용해액 내의 단백질 정량은 BCA법 (Smart^TM BCA Protein Assay kit, iNtRON)으로 하였으며, 표준 단백질을 이용 562nm에서의 흡광도를 측정하여 단백질 농도 표준곡선과 농도공식을 구한 후 구하였다.

실험결과, 도 4에 나타난 바와 같이, 흑마늘 추출물 및 코직 산의 세포내 티로시나아제 저해활성은 각각 56%, 66%로 나타나 대조군(0.5 mM 코직 산)보다 흑마늘 추출물이 탁월한 세포내 티로시나아제 활성 억제 효과를 보였다(도 4 참조).

실험예 4. 웨스턴 블롯 분석에 의한 멜라닌 생성관련 유전자 발현에 대한 영향

실시예 1-3의 흑마늘 추출물의 세포내 멜라닌 합성경로에서 가장 중요한 티로시나아제 활성과 함께 멜라닌 생성관련 유전자인 티로시나아제 및 TRP-1 유전자 발현에 대한 영향을 알아보기 위해 하기와 같이 실험을 수행하였다.

세포 배양용 6-well 플레이트에 B16F10 세포를 1.0 × 10⁵/2ml/well 농도로 분주하고, 37℃, 5% CO₂ 조건하에서 24시간 배양 후 α-MSH(100 nM)와 코직 산(kojic acid; 0.5 mM)를 포함하여 상기 실시예 1-3의 흑마늘 에탄올 추출물과 비교군으로 상기 비교예 1-3의 생마늘 에탄올 추출물시료를 각각 0.3% 처리하였다. 처리 후 2일과 3일째 세포를 용해 완충액(lysis buffer; Pro-Prep, iNtRON)을 첨가하여 수확한 후, 4℃에서 13,000×g로 약 30분간 원심분리 하여 얻은 상층액을 BCA Protein Assay kit(Smart^TM BCA Protein Assay kit, iNtRON)를 이용하여 단백질 농도를 정량하였다. SDS (sodium dodecyl sulphate)-폴리아크릴아미드 겔(polyacrylamide gel) 전기영동을 위하여 20 ~ 50㎍의 단백질을 취하고 동량의 램나이 샘플 용액(Laemmli sample buffer, Bio-Rad)을 섞어서 열변성 단백질 샘플(sample)을 만들어 전기영동으로 분리하였다. 분리된 단백질을 PVDF 막(membrane) (Bio-Rad)으로 일렉트로블롯팅(electroblotting)법에 의해 전이시킨 후, 5% 알부민(albumin)을 함유한 PBS-T (0.1% Tween 20 in PBS)에 담구어 4℃에서 하룻밤(over night) 동안 반응시켜 비특이적인 단백질들에 대한 블록킹(blocking)을 실시하였다. 준비된 막(membrane)에 1차 항체로 TRP-1(tyrosinase related protein-1, Santa Cruz; 2일째)와 TYR(tyrosinase, Santa Cruz; 3일째)를 처리하여 실온에서 2시간 이상 반응시킨 다음 PBS-T로 세척하고 처리된 1차 항체에 맞는 2차 항체로 bovine anti-goat IgG-AP(Santa Crutz)를 사용하여 실온에서 1시간 정도 반응시켰다. 다시 PBS-T로 세척한 후 BCIP/NBT 발색제 (Promega)로 반응시켜 나타나는 밴드를 관찰하였다.

실험 결과, 도 5에 나타난 바와 같이, 멜라닌 세포 분화 촉진제인 a-MSH에 의해 그 발현이 촉진됨과 양성 대조군인 코직 산에 의해 발현이 억제됨을 뚜렷이 보여 주었다. 흑마늘 에탄올 추출물은 티로시나아제의 발현을 현저하게 억제시킴을 보임으로써, 흑마늘 추출물이 멜라닌 생합성에 중요한 역할을 수행하는 티로시나아제의 발현에 크게 영향을 미쳐 세포의 멜라닌 생성을 억제할 수 있음을 보여 주었다. 반면에 TRP-1의 발현은 추출물간에 거의 차이가 없는 것으로 보아 서로 다른 기전으로 작용하는 것으로 사료된다(도 5 참조).

하기에 상기 조성물의 제형예를 설명하나, 이는 본 발명을 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제형예 1. 유연 화장수(스킨)

원료	제형예 1 함량(w/w %)
실시예 1의 흑마늘	50.0
부틸렌 글리콜	7.0
글리세린	5.0
폴리옥시에틸렌(60) 경화 피마자유	0.2
에탄올	5.0
베타인	2.0
구연산	0.02
구연산 나트륨	0.06
방부제	미량
향료	미량
정제수	잔량

제형예 2. 로션(에멀젼)

원료	제형예 2 함량(w/w %)
실시예 1의 흑마늘 추출물	40.0
부틸렌글리콜	8.0
글리세린	5.0
스쿠알란	10.0
부틸렌글리콜 디카프릴레이트/디카프레이트	5.0
소르비탄스테아레이트	1.5
폴리소르베이트 60	1.0
글리세릴스테아레이트	0.5
스테아릴글리시레티네이트	0.2
카르복시비닐폴리머	0.1
아르기닌	0.1
방부제	미량
향료	미량
정제수	잔량

제형예 3. 에센스

원료	제형예 3 함량(w/w %)
실시예 1의 흑마늘 추출물	10.0
시토 스테롤	1.70
폴리글리세릴 2-올레이트	1.50
세라마이드	0.7
세테아레스-4	1.2
콜레스테롤	1.5
디세틸포스페이트	0.4
농글리세린	5.0
카르복시비닐폴리머	0.2
산탄검	0.2
방부제	미량
향료	미량
정제수	잔량

제형예 4. 세안제(클렌징 폼)

원료	제형예 4 함량(w/w %)
실시예 1의 흑마늘 추출물	20.0
N-아실글루타민산 나트륨	20.0
글리세린	10.0
PEG-400	15.0
프로필렌 글리콜	10.0
POE(15)올레일알코올 에테르	3.0
라우린 유도체	2.0
메틸 파라벤	0.2
EDTA-4Na	0.03
향료	0.2
정제수	잔량

도 1은 흑마늘 추출물의 세포 생존률을 용매(열수, 메탄올, 에탄올)별로 비교하여 나타낸 도이고,

도 2는 B16F10세포의 배지내의 멜라닌 생성 억제 효과를 흑마늘 추출물의 용매(열수, 메탄올, 에탄올)별로 비교하여 나타낸 도이며,

도 3은 B16F10세포의 멜라닌 생성 억제 효과를 흑마늘 추출물의 용매(열수, 메탄올, 에탄올)별로 비교하여 나타낸 도이고,

도 4는 B16F10세포의 티로시나아제(tyrosinase) 억제효과를 흑마늘 추출물의 용매(열수, 메탄올, 에탄올)별로 비교하여 나타낸 도이며,

도 5는 B16F10세포의 멜라닌 생성관련 유전자(TRP-1, 티로시나아제) 발현에 미치는 흑마늘 에탄올 추출물의 영향을 웨스턴 블롯 분석으로 비교하여 나타낸 도이다.

Claims (6)

1. 흑마늘 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물.
2. 제 1항에 있어서, 상기 흑마늘 추출물은 생마늘을 숙성, 건조, 숙성의 단계를 거쳐 흑마늘로 가공하여 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매에 가용한 추출물인 화장료 조성물.
3. 제 2항에 있어서, 상기 생마늘은 국내산 남해마늘, 국내산 의성마늘 또는 국내산 무안마늘을 사용한 것임을 특징으로 하는 화장료 조성물.
4. 제 2항에 있어서, 상기 흑마늘 추출물은 국내산 남해마늘, 국내산 의성마늘 또는 국내산 무안마늘인 생마늘을 선택하여 10 내지 120℃에서 150 내지 500시간 동안 열풍으로 1차 숙성하는 제 1단계; 상기 단계에서 숙성된 마늘을 10 내지 60시간 동안 자연 건조하는 제 2단계; 상기 건조 마늘을 다시 10 내지 50℃의 온도의 열풍으로 10 내지 100시간 동안 숙성하는 2차 숙성 단계를 포함하는 제 3단계: 상 기 제 3단계에서 수득한 흑마늘을 동결건조하고 이를 분쇄한 후, 시료중량의 1 내지 30배 부피의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매로부터 선택된 용매를 1 내지 48시간 동안 실온에서 열수추출, 냉침추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 또는 가열추출의 추출방법으로 추출하는 제 4단계: 상기 제 4단계에서 수득한 추출물을 감압여과하여 수득한 제 1차 추출액과 잔사를 각각 분리하는 제 5단계: 상기 5단계에서 수득한 잔사에 추출 시작 당시의 흑마늘 시료중량의 1 내지 20배 부피(w/v)의 물, 탄소수 1 내지 4의 저급알코올 또는 이들의 혼합용매로부터 선택된 용매를 실온에서 1 내지 10시간 동안 열수추출, 냉침추출, 초음파 추출, 환류냉각 추출 또는 가열추출의 추출방법으로 추출하여 감압여과하고 상기 5단계에서 분리한 1차 추출액과 합쳐 농축 및 건조하는 제 6단계의 제조공정을 특징으로 하는 흑마늘 추출물을 유효성분으로 함유하는 피부 미백 및 주름 개선용 화장료 조성물.
5. 제 1항에 있어서, 상기 추출물은 조성물 총 중량에 대하여 0.1 ~ 50 중량% 로 함유되는 것을 특징으로 하는 화장료 조성물.
6. 제 1항에 있어서, 상기 조성물은 스킨로션, 스킨소프너, 스킨토너, 아스트린젠트, 로션, 밀크로션, 모이스쳐 로션, 영양로션, 맛사지크림, 영양크림, 모이스처 크림, 핸드크림, 파운데이션, 에센스, 영양에센스, 팩, 비누, 클렌징폼, 클렌징로션, 클렌징크림, 바디로션 또는 바디클린저의 제형으로 구성된 그룹에서 선택된 제형임을 특징으로 하는 화장료 조성물.

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