CN103328633B - 诱导rna干扰的核酸分子及其用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种具有新结构的诱导RNAi的核酸分子及其用途，并且更具体地，涉及一种具有下述结构的新核酸分子和使用所述核酸分子抑制靶基因表达的方法，所述结构包含第一链和第二链，所述第一链具有24‑121个核苷酸长度并包含与靶核酸互补的区域，所述第二链具有13‑21个核苷酸长度并具有与互补于靶核酸的第一链的所述区域互补性结合的区域，从而所述核酸分子以提高的效率抑制靶基因表达。本发明的核酸分子结构提高了核酸分子抑制靶基因的效率。可选地，通过导入反义DNA、反义RNA、核酶或脱氧核酶，本发明的核酸分子可以提高siRNA结合靶基因的能力或引起协同性切割，从而提高核酸分子抑制靶基因的效率。此外，当使用本发明核酸分子时，抑制靶基因的效率可以维持延长的时间段。因而，本发明的诱导RNAi的核酸分子可以替代常规siRNA分子而有效用于治疗癌症或病毒性感染。

Description

诱导RNA干扰的核酸分子及其用途
技术领域
本发明涉及一种具有新结构的诱导RNAi的核酸分子及其用途，并且更具体地，涉及一种具有下述结构的新核酸分子和使用所述核酸分子抑制靶基因表达的方法，所述结构由第一链和第二链组成，所述第一链具有24-121个核苷酸(nt)长度并包含与靶核酸互补的部分区域，所述第二链具有13-21个核苷酸长度并具有与所述第一链内部互补于所述靶核酸的部分区域互补性结合的区域，从而所述核酸分子以提高的效率抑制靶基因的表达。
背景技术
RNA干扰(RNAi)是一种能够以高度特异且有效的方式抑制基因表达的机制，其中通过向细胞等导入包含有义链和反义链的双链RNA而诱导靶基因的mRNA降解，从而抑制靶基因的表达，其中所述有义链具有与所述靶基因的mRNA同源的序列，所述反义链具有与所述靶基因的mRNA互补的序列。
在已经用于本领域的大部分siRNA中，反义链的长度限于19-23个核苷酸(nt)。这是因为已经由研究者使用的siRNA的结构模拟了细胞中通过dicer切割长dsRNA所获得的产物的结构(Elbashir等人,Nature2001,411:494-498)。此外，早期X射线结晶学研究提出一个模型，其中，导入Argonaute-2(Ago2，其是RISC复合体的关键组件)中的siRNA反义链的5′和3′末端分别与mid结构域和PAZ结构域的结合袋结合(Song等人,Nat.Struct.Biol.2003,10:1026-1032)，但是后续研究揭示，反义链第16个核苷酸后的3′末端不与PAZ结构域结合(Wang等人,Nature2009,461:754-761)。这表明siRNA反义链的3′末端在序列和长度方面可能存在灵活性。
与此同时，一项关于siRNA的额外研究报道了包含单链DNA分子的改良siRNA-DNA构建体，其中所述单链DNA分子可以充当PCR的引物用于检测样品中siRNA(US2009/0012022A1)。然而，这种改良siRNA-DNA构建体仅具有用于定量的额外手段，但是对抑制靶基因的效率没有积极影响。
因而，发明人对一种新的以提高的效率抑制靶基因的诱导RNAi的核酸分子进行广泛研究，结果设计出一种双链核酸分子，所述双链核酸分子包含第一链和第二链，所述第一链具有24-121个核苷酸长度并包含与靶核酸互补的区域，所述第二链具有13-21个核苷酸长度并具有与互补于所述靶核酸的第一链的所述区域互补性结合的区域，并且发明人已经预期在第一链3′末端处单链区内所含有的核酸寡核苷酸将靶向其他靶基因或引导这种核酸分子至靶基因。此外，发明人已经使用显示最小脱靶效应并且不使RNAi装置饱和的siRNA结构(发明人提交的韩国专利公开号10-2009-0065880)，构建了一种在第一链3′末端处具有长单链区的核酸分子结构，并且发明人预期，在第一链3′末端处单链区内所含有的核酸寡核苷酸可以显示靶向其他靶基因或引导在5′末端的siRNA至靶基因的作用，同时脱靶效应将最小，从而完成本发明。
在这个背景部分中公开的以上信息仅用于增强对本发明背景的理解，并且因此，它可以含有不构成本领域技术人员已知的现有技术的信息。
发明简述
本发明的目的是提供一种诱导RNAi的核酸分子，其具有新结构且在抑制基因表达方面具有改进的作用。
为实现以上目的，本发明提供一种诱导RNAi的核酸分子，其包含第一链和第二链，所述第一链具有24-121个核苷酸长度并包含与靶核酸互补的区域，所述第二链具有13-21个核苷酸长度并具有与互补于靶核酸的第一链的所述区域互补性结合的区域。
本发明还提供一种核酸复合物，其包含与诱导RNAi的核酸分子结合的细胞递送载具(vehicle)。
本发明还提供一种用于胞内递送诱导RNAi的核酸分子的方法，所述方法包括将上述核酸复合物导入细胞中。
本发明还提供一种用于抑制基因表达的组合物，其含有上述诱导RNAi的核酸分子。
本发明还提供一种用于抑制基因表达的试剂盒，其含有上述诱导RNAi的核酸分子。
本发明还提供一种用于抑制基因表达的方法，所述方法包括将上述诱导RNAi的核酸分子导入细胞的步骤。
本发明还提供一种用于抑制靶基因在细胞中表达的方法，所述方法包括在所述细胞中表达上述诱导RNAi的核酸分子的步骤。
本发明还提供一种抗癌组合物，其含有上述诱导RNAi的核酸分子。
本发明还提供一种使用上述诱导RNAi的核酸分子预防或治疗癌症的方法。
本发明的其他特征和实施方案将从以下详述和所附权利要求书中显而易见。
附图说明
图1是显示本发明的诱导RNAi的核酸分子的示意图。
图2显示通过延伸反义链的3′末端所获得的长反义siRNA(lsiRNA)，以提供与靶mRNA互补的序列。
图3显示通过延伸asiRNA结构物的反义链3′末端以提供与靶mRNA互补的序列，从而获得的长反义asiRNA(lasiRNA)。
图4显示通过在siRNA结构物的3′末端连接靶向靶mRNA的核酶或脱氧核酶(DNAzyme)序列所获得的结构物。
图5显示抑制基因KRAS的表达的siRNA分子结构物，所述基因KRAS参与癌细胞的生长。
图6是显示由导入图5中所示核酸分子引起的相对KRAS mRNA水平的图示。
图7是显示在第1日、第2日和第3日测量由导入图5中所示核酸分子引起的KRASmRNA表达水平的结果的图示。
图8显示针对KRAS的asiRNA分子结构物和lasiRNA分子结构物。
图9是显示由导入图8中所示核酸分子引起的相对KRAS mRNA水平的图示。
图10是显示在第5日测量由导入图8中所示核酸分子引起的AGS细胞系存活力的结果图示。
图11显示针对KRAS的具有与mRNA互补的延长序列的lsiRNA(21S+10r)和lasiRNA(16S+10r)，和具有与mRNA不互补的延长序列的分子结构物(21S+10rc和16S+10rc)。
图12显示由导入图11中所示核酸分子引起的相对KRAS mRNA水平。
图13显示针对CTNNB1-2的asiRNA分子结构和lasiRNA分子结构。
图14显示由导入图13中所示核酸分子引起的KRAS mRNA表达水平。
图15显示在第5日测量由导入图13中所示核酸分子引起的Hep3B细胞系存活力的结果图示。
图16是显示5′RACE(cDNA末端快速扩增)分析结果的照片。
本发明的最佳实施方式
除非另外规定，否则本文中所用的全部术语及科学术语具有与本发明所属领域的技术人员通常理解的相同意义。通常，本文所用的命名和稍后将描述的实验方法是现有技术中熟知和常用的那些。
发明详述中所用的主要术语的定义如下。
如本文所用，术语“RNAi”(RNA干扰)指一种机制，通过所述机制，将由具有与靶基因mRNA互补的链和具有与之互补的序列的链组成的双链RNA(dsRNA)导入细胞等中，从而引起靶基因的mRNA降解，抑制所述靶基因的表达。
如本文所用，术语“siRNA”(小干扰性RNA)指以序列特异性方式介导高效基因沉默的短双链RNA(dsRNA)。
如本文所用，术语“反义链”指与目的靶核酸基本上或100%互补的多核苷酸。例如，反义链可以整体或部分地与mRNA(信使RNA)分子、不是mRNA的RNA序列(例如，微RNA、piwiRNA、tRNA、rRNA和hnRNA)或编码或非编码的DNA序列互补。术语“反义链”和“引导链(guide strand)”在本文中可互用。
术语“有义链”指一种多核苷酸，其具有与靶核酸整体或部分地相同的核苷酸序列，其中所述多核苷酸在整体或部分地与mRNA(信使RNA)分子、不是mRNA的RNA序列(例如，微RNA、piwiRNA、tRNA、rRNA和hnRNA)或编码或非编码的DNA序列相同。
如本文所用，术语“基因”意在具有最广范的含义，并且基因可以编码结构蛋白或调节蛋白。在本文中，调节蛋白包括转录因子、热休克蛋白或参与edDNA/RNA复制、转录和/或翻译的蛋白质。另外，待抑制其表达的靶基因存在于已经整合至动物基因中的病毒基因组内或可以作为染色体外元件存在。例如，靶基因可以是HIV基因组上的基因。在这种情况下，遗传构建体可用于使HIV基因在哺乳动物细胞中的翻译失活。
在一个方面，本发明涉及一种诱导RNAi的核酸分子，其包含第一链和第二链，所述第一链具有24-121个核苷酸长度并包含与靶核酸互补的区域，所述第二链具有13-21个核苷酸长度并具有与互补于靶核酸的第一链的所述区域互补性结合的区域(见图1)。
在本发明中，靶核酸的实例包括但不限于mRNA(信使RNA)、微RNA(microRNA)、piRNA(piwi-相互作用RNA)、编码DNA序列和非编码DNA序列。
在本发明中，第一链中互补于靶核酸的区域优选地是19-21个核苷酸长度。因此，第一链包含不与第二链结合的单链区。优选地，第一链还可以在单链区内包含选自反义DNA、反义RNA、核酶和脱氧核酶的核酸寡核苷酸。
在本发明中，不与第二链互补性结合的第一链的单链区可以直接或通过接头与互补性结合于第二链的区域连接。在本文中，接头可以是化学接头。化学接头的实例包括但不限于核酸部分、PNA(PNA部分)、肽部分、二硫键或聚乙二醇部分。
在本发明中，第一链还可以在单链区内包含与所述靶核酸互补或不互补的序列。当第一链包含互补序列时，互补序列可以从本发明核酸分子的双链区(即，互补于靶核酸的siRNA区域)起连续地存在。可选地，互补序列也可以与双链区相隔地存在。同样，由siRNA靶向的序列和由单链区的核酶或脱氧核酶靶向的序列可以连续地存在或彼此相隔地存在。此外，在第一链的单链区具有与siRNA所靶向的靶基因互补的序列的情况下，当单链区中所含有的序列是反义DNA或反义RNA时，所述序列可以至少约70-80%、更优选地至少约80-90%并且甚至更优选地至少95-99%地与siRNA所靶向的靶基因的序列互补，并且当单链区是核酶或脱氧核酶时，单链区的序列可以是至少约50-60%地与siRNA所靶向的靶基因的序列互补。
此外，单链区可以是5-100个核苷酸长度。如果单链区的长度小于5个核苷酸，则提高抑制基因表达的效率的作用将不明显，并且如果长度超过100核苷酸，合成RNA分子的效率将降低。优选地，单链区可以是9-100个核苷酸长度或50个核苷酸或更小长度。更优选地，单链区可以是10-15个核苷酸长度。
在本发明中，第一链中单链区的至少一个核苷酸可以包含大体积碱基类似物(abulky base analog)。当延长的序列包含大体积碱基类似物如具有苯基的脱氧腺苷衍生物时，与所述延长序列互补性结合的mRNA链在大体积碱基类似物的位置处遭切割。引起这种切割的任何大体积碱基类似物可以在本发明中不受限制地使用。
在本发明中，预期通过以互补于靶mRNA序列的方式延伸siRNA的反义链所获得的核酸结构物的5′末端将发挥RNAi机制的作用，而3′末端将发挥反义机制的作用或引导5′末端siRNA至靶mRNA。与mRNA互补的反义3′末端的序列是DNA时，它可以诱导RNase H依赖性mRNA切割。此外，预期当反义3′末端的单链区的至少一个核苷酸包含大体积碱基类似物或所述单链区与mRNA结合以形成凸出结构时，可以引起切割。另外，当向第一链单链区中导入包含核酶或脱氧核酶的核酸分子时，第一链单链区可以诱导协同切割。
韩国专利公开号10-2009-0065880公开了一种siRNA结构物，其是由19-21nt反义链和13-16nt有义链组成的siRNA分子，其中反义链的5′末端是平末端。通过siRNA的有义链或通过抑制其他RNAi机制，这种siRNA结构物以高效率抑制基因表达，而不造成脱靶效应。当将本发明的结构应用于这种siRNA时，可以使脱靶效应最小化，同时可以获得在第一链单链区中所含有的核酸寡核苷酸的上述作用。如本文所用，术语“脱靶效应”指以下任何情况，其中siRNA的有义链引起其他mRNA出人意料地降解或相应基因的沉默，并且siRNA的反义链与不希望的靶配对以造成其他mRNA的降解或相应基因的沉默，即便siRNA最初用来诱导具有与所述反义链互补的序列的mRNA降解以因此获得抑制mRNA的基因表达的作用。
本发明的siRNA分子可以是根据一般方法合成的分子，但是不限于此。换而言之，在本发明中，siRNA分子可以是化学或酶促合成的。本发明的siRNA分子可以通过标准重组技术衍生自天然存在的基因。在这种情况下，siRNA分子可以是在核苷酸序列水平与靶基因的至少一部分mRNA基本上互补，所述靶基因的表达将被改变。
因而，本发明的核酸分子可以包含化学修饰。可以通过以下但是不限于此的方式获得这种化学修饰：用氢原子、氟原子、-O-烷基、-O-酰基和氨基中的任一个替换在所述核酸分子中所包含的至少一个核苷酸的核糖2′位置处的羟基。为了增加递送核酸分子的能力，羟基可以被-Br、-Cl、-R、-R′OR、-SH、-SR、-N3和-CN(R=烷基、芳基或亚烷基)中的任一个替换。此外，可以通过以下方式获得化学修饰：用硫代磷酸酯(phosphorothioate)形式、二硫代磷酸酯(phosphorodithioate)形式、烷基膦酸酯(alkylphosphonate)形式、氨基磷酸盐(phosphoroamidate)形式和硼烷磷酸酯(boranophosphate)形式中的任一个替换至少一个核苷酸的磷酸酯骨架。另外，可以通过用LNA(锁核酸)、UNA(非锁核酸)、吗啉代和PNA(肽核酸)中的任一个替换在核酸分子中所包含的至少一个核苷酸，获得所述化学修饰。此外，可以通过使所述核酸分子与选自脂类、细胞渗透肽和细胞靶向配体中一者或多者结合，获得所述化学修饰。
此外，本发明的核酸分子可以与用于细胞内引入的细胞递送载具结合。因此，在另一个方面，本发明涉及一种核酸复合物，其包含与诱导RNAi的核酸分子结合的细胞递送载具。
在本发明中，细胞递送载具可以选自阳离子聚合物、脂类、细胞渗透肽和细胞靶向配体。阳离子型细胞递送载具如阳离子聚合物和阳离子脂质是带正电荷的试剂，其用来在体外或在体内递送核酸(即，siRNA)至细胞中。阳离子型细胞递送载具可以与本发明的核酸分子强烈地相互作用以形成复合物，从而可以将诱导RNAi的核酸分子有效地导入细胞中。本发明中使用的细胞递送载具可以是阳离子聚合物如聚乙烯亚胺(PEI)或脂质体如Lipofectamine2000(Invitrogen)，但是不限于此。本领域技术人员将显而易见是，带正电荷的试剂可以用来产生本发明的复合物。另外，脂质如胆固醇可以与核酸分子直接连接或通过另一种细胞递送载具与核酸分子间接连接。
此外，本发明的实施方案提出，本发明的诱导RNAi的核酸分子产生高效抑制靶基因表达的作用。因此，在又一个方面，本发明涉及一种用于抑制基因表达的组合物，其含有上述诱导RNAi的核酸分子。在本文中，核酸分子可以处于具有与之结合的细胞递送载具的核酸复合物的形式。
在本发明的实例中发现，将本发明的核酸结构应用于靶向靶基因KRAS或CTNNB1-2的siRNA时，可以显著地提高抑制靶基因表达的效率，并且也可以长时间的维持其功效。因此，本领域技术人员将显而易见是，即便根据本发明提供靶向其他靶基因的核酸分子，也可以获得相同结果。
同时，用于抑制基因表达的本发明组合物可以按用于抑制基因表达的试剂盒的形式提供。用于抑制基因表达的试剂盒可以采取瓶、桶、香囊、封装物(envelop)、管、安瓿等形式，所述形式可以部分地或完全地由塑料、玻璃、纸、箔、蜡等形成。容器可以配备完全或部分可拆卸的盖，所述盖可以最初是容器的部分或可以通过机械、粘合或其他手段附加于该容器。该容器也可以配备瓶塞，从而允许通过注射器针头获得内容物。试剂盒可以包含外部包装物，所述外部包装物可以包括关于组分用途的说明书。
在又一个方面，本发明涉及一种使用上述诱导RNAi的核酸分子抑制靶基因在细胞中表达的方法。即，本发明涉及一种用于抑制靶基因在细胞中表达的方法，所述方法包括将上述诱导RNAi的核酸分子导入细胞中的步骤。
在本发明中，诱导RNAi的核酸的第一链可以与靶基因的mRNA序列互补。
在本发明中，靶基因可以是内源基因或转基因。
本发明的核酸分子不必限于合成siRNA并且也可以有利地适用于使用表达载体等在细胞中表达的siRNA或shRNA。换而言之，本发明的核酸分子可以在细胞中表达以抑制靶基因的表达。因此，在又一个方面，本发明涉及一种用于抑制靶基因在细胞中表达的方法，所述方法包括在所述细胞中表达上述诱导RNAi的核酸分子的步骤。
同时，本发明的诱导RNAi的核酸分子可以用来抑制靶基因(如因过量表达而引起癌症或生成癌症的基因，即肿瘤相关基因)的表达。因此，诱导RNAi的核酸分子可用作抗癌组合物。在本文中，肿瘤相关基因可以是以下任一种：KRas、Wnt-1、Hec1、存活素(survivin)、生存素(livin)、Bcl-2、XIAP、Mdm2、EGF、EGFR、VEGF、VEGFR、Mcl-1、IGF1R、Akt1、Grp78、STAT3、STAT5a、β-联蛋白、WISP1和c-myc，但不限于此。在本发明的一个实例中，发现通过向细胞中导入本发明的siRNA分子抑制了参与癌细胞生长的基因KRAS。此外，显示靶向β-联蛋白基因的siRNA分子杀死癌细胞系。
本发明的抗癌组合物可以作为包含所述诱导RNAi的核酸分子的药物组合物或包含与细胞递送载具结合的所述核酸分子的复合物提供，其中所述复合物单独或同至少一种可药用载体、赋形剂或稀释剂组合。药物组合物可以根据疾病及其严重性、患者年龄、重量、健康状况及性别、施用途径和治疗时间而包含药学有效量的该复合物。
如本文所用，术语“可药用组合物”指向人施用时生理可接受并且不造成胃功能紊乱、***反应如肠胃病或眩晕或相似反应的组合物。所述载体、赋形剂或稀释剂的实例可以包括乳糖、右旋糖、蔗糖、山梨醇、甘露醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦牙糖醇、淀粉、阿位伯树胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、硬脂酸镁和矿物油。
药物组合物还可以含有填料、防团聚剂、润滑剂、润湿剂、香料、乳化剂和防腐剂。另外，可以使用本领域熟知的方法配制本发明的药物组合物，从而在施用至哺乳动物后产生有效成分的迅速、持久或延迟释放。这种制剂可以是无菌注射溶液等形式。
同时，本发明的诱导RNAi的核酸分子或包含与细胞递送载具结合的所述核酸分子的复合物还可以包含已知的抗癌化疗药以产生联合作用。可以在本发明中使用的已知抗癌化疗药的例子包括顺铂、卡铂、奥沙利铂、多柔比星、佐柔比星、表柔比星、伊达比星、米托蒽醌、戊柔比星(valrubicin)、姜黄素、吉非替尼、厄洛替尼、依立替康、拓扑替康、长春碱、长春新碱、多西紫杉醇、紫杉醇等。
实施例
下文，将参考实施例进一步详细描述本发明。本领域普通技术人员将显而易见的是，这些实施例仅起例举目的并且不解释为对本发明范围的限制。
实施例1：长反义引导的siRNA的构建：制备实施例1
按以下方式构建siRNA：第二链具有21个核苷酸的短长度；与第二链形成双链的第一链的区域是19个核苷酸长度；并且第一链的3'末端具有与靶mRNA互补的17个核苷酸的单链区。将构建的具有长反义链的siRNA命名为“长反义siRNA(lsiRNA)”。在延长序列中所包含的核酸寡核苷酸允许siRNA被引导至靶mRNA或作为常见反义机制发挥作用(见图2)。
实施例2：长反义asiRNA的构建：制备实施例2
按以下方式构建siRNA：第二链具有15个核苷酸的短长度；与第二链形成双链的第一链的区域是19个核苷酸长度；并且第一链的3′末端具有与靶mRNA互补的17个核苷酸的延长序列；并且第一链的5′末端是平末端。将构建的具有长反义链的siRNA命名为“长反义asiRNA(lasiRNA)”。在延长序列中所包含的核酸寡核苷酸允许siRNA被引导至靶mRNA或作为常见反义机制发挥作用(见图3)。
实施例3：脱氧核酶(或核酶)引导的siRNA(siRZNA)的构建：制备实施例3
使用CTNNB1-2siRNA和Dz339脱氧核酶按以下方式构建具有长反义链的结构物：有义链具有21个核苷酸的短长度；并且19个核苷酸的反义链的3′末端具有脱氧核酶。将构建的结构物命名为“脱氧核酶引导的siRNA(siRZNA)”(见图4)。
实施例4：构建抑制KRAS基因表达的lsiRNA和检验抑制KRAS基因表达的能力
设计了抑制参与癌细胞生长的KRAS基因表达的siRNA。此外，通过向常规siRNA结构(19+2)的反义链的3′末端分别添加5nt、10nt和15nt，构建长反义siRNAs(lsiRNA)。在本文中，构建了具有与靶mRNA互补的延长DNA序列的结构物(21S+5d，10d和15d)和具有不与靶mRNA互补的延长DNA序列的对照结构物(21S+5c、10c和15c)，并且将所构建的结构物抑制靶基因表达的效率相互比较(见图5)。此外，通过突变lsiRNA的种子序列构建一种结构物(21+15d-mut)，并且测试lsiRNA抑制基因表达的能力是否像siRNA一样是依赖于所述种子序列。使用lipofectamine2000(Invitrogen)，将每种siRNA和lsiRNA以10nM浓度转染至AGS细胞(ATCCCRL1739，人胃腺癌)中。用于mRNA测量的实时PCR中所用的引物如下：
KRAS
正向序列5′-GAGTGCCTTGACGATACAGC-3′(SEQ ID NO:15)；和
反向序列5′-CCCTCATTGCACTGTACTCC-3′(SEQ ID NO:16)。
结果如图6中可见，与常规siRNA结构物相比，具有与靶mRNA互补的单链区的lsiRNA显示改进的抑制靶基因的能力，并且这种趋势与单链区的长度成正比。然而，在具有不与靶mRNA互补的单链区的对照lsiRNA情况下，不能观察到这种改进的抑制基因表达的能力。在具有种子序列突变的lsiRNA的情况下，抑制靶基因的能力几乎消失。这表明，lsiRNA像常规siRNA一样通过种子序列依赖性RNAi机制抑制靶基因，并且不显示由修饰的结构引起的非特异性基因沉默。
随后，与siRNA相比，检验是否在胞内导入后充分维持lsiRNA抑制靶基因的能力。显示，常规siRNA结构物抑制基因表达的能力在胞内导入后1日达到最大并且在胞内导入后2日和3日降低(见图7)。然而，lsiRNA抑制靶基因表达的能力在胞内导入后维持甚至多至3日。相反，在具有不与靶mRNA互补的单链区的对照lsiRNA情况下，不能观察到这种改进的抑制基因表达的能力。这些结果表明，与常规siRNA结构物相比，具有与靶基因的mRNA互补的单链区的lsiRNA显示高效率抑制基因表达，并且其功效也维持较长的时间。
实施例5：构建抑制KRAS基因表达的lasiRNA和检验抑制KRAS基因表达的能力
除实施例4之外，还进行检验以便确定应用于非对称较短双链体siRNA(asiRNA)时，本发明的核酸分子结构物是否可以改善抑制靶基因表达的能力。
以与实施例4相似的方式，通过用具有与靶mRNA互补的序列的DNA延伸常规asiRNA结构物的反义链的3′末端，构建了结构物(16S+5d、10d和15d)，并且构建了具有不与靶mRNA互补的延长DNA序列的对照结构物(16S+5c，10c和15c；长反义asiRNA(lasiRNA))(见图8)。将构建的结构物转染至AGS细胞中，并且比较抑制癌细胞生长的能力。将这些RNA转染至AGS细胞中，并且随后以实施例4中所述相同的方式进行实时PCR以便验证所述结构物抑制靶基因KRAS表达的效率(见图9)。使用lipofectamine2000(Invitrogen)，将每种asiRNA和lasiRNA以10nM浓度转染至AGS细胞(ATCCCRL1739，人胃腺癌)中。
结果，具有与靶mRNA互补的延长单链序列的lasiRNA抑制靶mRNA的能力以正比于延长序列的长度的方式增加，与lsiRNA的情况相似。然而，在其中延长的序列不与靶mRNA互补的情况下，观察不到这种作用。
实施例6：抑制KRAS基因表达的lasiRNA和检验抑制AGS癌细胞生长的能力
随后，进行检验以便确定与dsiRNA和asiRNA相比，显示改进的抑制靶基因能力的靶向KRAS的lsiRNA和lasiRNA结构物是否也具有增加的抑制AGS癌细胞生长的能力。具体而言，使用lipofectamine2000，将96孔板中接种的AGS细胞用10nM RNA转染，并且在5日后，通过显微镜观察目视计数细胞数目测量细胞的存活力。
结果证实，抑制KRAS mRNA表达的能力与抑制癌细胞生长的能力高度相关。具体而言，证实与siRNA相比，具有15个核苷酸的延长序列的lsiRNA(21S+15d)显示强的抑制癌细胞生长的能力，并且与asiRNA相比，lasiRNA(16S+15d)抑制癌细胞生长的能力增加(见图10)。同时，向种子序列中导入突变的lsiRNA(LASmut)不诱导对癌细胞生长的抑制，表明由延长的长序列结构物所致的非特异性细胞毒性没有出现。该结果表明，将互补于靶mRNA的单链区导入siRNA和asiRNA各自的反义链的3'末端时，可以提高抑制细胞中基因表达和表型表达的能力。
实施例7：检验lsiRNA和lasiRNA(具有RNA作为延长序列)抑制KRAS基因表达的能力
随后，进行检验以确定与对应的siRNA和asiRNA抑制靶基因表达的能力相比，lsiRNA和lasiRNA(各自具有替代DNA的RNA作为延长序列)抑制靶基因表达的能力是否提高。
如图11中所示，构建了各自具有与mRNA互补的10-nt延长序列的lsiRNA(21S+10r)和lasiRNA(16S+10r)，并且还构建了各自具有与mRNA不互补的延长序列的对照结构物(21S+10rc和16S+10rc)。将构建的结构物转染至AGS细胞中，并且随后以实施例4中所述相同的方式检验它们抑制靶基因KRAS mRNA表达的效率。
结果如图12中可见，与对应的siRNA和asiRNA相比，具有延长的RNA序列的lsiRNA和lasiRNA具有高的抑制靶基因表达的能力。特别地，与具有延长DNA序列的lasiRNA相比，具有延长RNA序列的lasiRNA显示增加的抑制能力。这表明，除DNA之外，甚至当长反义序列是RNA时，也可以实现抑制靶基因表达的能力。
实施例8：构建抑制CTNNB1基因表达的lasiRNA和检验抑制CTNNB1基因表达的能力
8-1：测量CTNNB1mRNA表达水平
随后，为了检验本发明的核酸分子结构物是否可以提高靶向其他基因的asiRNA的活性，构建了与靶向β-联蛋白(CTNNB1)的asiRNA相对应的lasiRNA结构物(见图13)。随后，使用lipofectamine2000(Invitrogen)，将构建的每种结构物以10nM浓度转染至Hep3B细胞(ATCC HB8064)中，并且随后通过实时PCR检验抑制靶基因表达的能力。
CTNNB1
正向序列5′-ATGTCCAGCGTTTGGCTGAA-3′(SEQ ID NO:32)；和
反向序列5′-TGGTCCTCGTCATTTAGCAGTT-3′(SEQ ID NO:33)。
结果如图14中可见，与常规的siRNA结构相比，asiRNA抑制靶基因表达的能力下降，但是在反义链的3′末端具有与mRNA序列互补的15nt DNA序列的lasiRNA(16S+15d)的靶基因抑制能力增加到与siRNA相似的水平。在另一方面，与asiRNA相比，在结构物(16S+15c)具有不与靶基因互补的延长DNA序列的情况下，抑制靶基因的能力的下降不显著。因此，发现lasiRNA结构具有提高的抑制靶基因的能力，而与asiRNA序列无关。
8-2：测量抑制Hep3B癌细胞生长的能力
通过测量抑制Hep3B癌细胞生长的能力再次验证lasiRNA结构物抑制靶基因的能力增加。具体而言，将10nM每种siRNA、asiRNA和lasiRNA转染至Hep3B细胞中，并且在5日后，通过计数细胞数目检验细胞生长的程度。通过显微镜观察目视计数细胞数目检验细胞的存活力。简而言之，将96孔板中接种的AGS细胞用每种10nM的siRNA、asiRNA和lasiRNA转染，并且在5日后，目视计数活细胞数目。
结果如图15中可见，与siRNA相比，asiRNA杀伤癌细胞的能力下降，但是具有与靶基因互补的延长序列的lasiRNA显示与siRNA相似的细胞杀伤能力。在另一方面，与asiRNA相比，具有不与靶基因互补的延长序列的lasiRNA的细胞杀伤能力不提高。这表明，在反义链的3′末端含有与靶基因互补的延长序列的siRNA分子具有提高的抑制靶基因表达的能力。
实施例9：分析基因表达的抑制机制
为了检验本发明的核酸分子是否根据与常规19+2siRNA或asiRNA相同的RNAi机制抑制基因表达，进行以下试验。具体而言，为分析靶mRNA的切割位点，进行5′RACE(cDNA末端快速扩增)分析。
首先，使用PEI，将实施例4和5中所构建的siKRAS、asiKRAS、LaiKRAS和LasiKRAS分别导入HeLa细胞中，并且在18小时后，使用Tri-试剂试剂盒(Ambion)提取总RNA。用0.25μgGeneRacer RNA寡聚物连接总RNA(3μg)，并且使用GeneRacer寡聚dT和SuperScriptTM IIIRT试剂盒(Invitrogen)，逆转录GeneRacer RNA寡聚物连接的总RNA。使用基因特异性引物扩增RNA寡聚物连接的mRNA。将PCR产物克隆至T＆A载体(RBC)中，并随后用M13正向引物测序。
KRAS基因特异性引物：
5′-CTGCATGCACCAAAAACCCCAAGACA-3′(SEQ ID NO:34)；
巢式KRAS基因特异性引物：
5′-CACAAAGAAAGCCCTCCCCAGTCCTCA-3′(SEQ ID NO:35)。
作为结果，如可以在图16中见到，用siKRAS、asiKRAS、LsiKRAS和LasiKRAS处理可能提供具有相同大小的RACE产物。另外，将这些RACE产物克隆至T-载体(RBC)中，并且通过测序检查核苷酸序列中的精确切割位置。作为结果证实，在siKRAS、asiKRAS、LsiKRAS和LasiKRAS的情况下，与从反义链5′末端起第10核苷酸和第11核苷酸之间的位置相对应的mRNA位置受到切割。
工业应用性
如上文所述，本发明的核酸分子结构通过在第一链3′末端处单链区内所包含的核酸寡核苷酸靶向与第一链的一部分互补的靶基因，以引导所述siRNA至靶基因中，从而提高核酸分子抑制靶基因的效率。可选地，通过引入反义DNA、反义RNA、核酶或脱氧核酶，本发明的核酸分子可以提高siRNA与靶基因结合的能力或引起协同性切割，从而提高核酸分子抑制靶基因的效率。此外，当使用本发明核酸分子时，抑制靶基因的效率可以维持延长的时间段。因而，本发明的诱导RNAi的核酸分子可以替代常规siRNA分子而有效用于治疗癌症或病毒性感染。
虽然已经参考具体特征详述本发明，但是本领域技术人员将显而易见的是，这种描述仅用于优选的实施方案并且不限制本发明的范围。因此，本发明的实质范围将由所附权利要求书及其等同物限定。
免费文本
附电子文件。

Claims (7)

1.一种诱导RNAi的核酸分子，其由第一链和第二链组成，所述第一链是由以下区域组成的RNA：与靶核酸100％互补的、长度为19或21个核苷酸且与第二链形成双链的区域，在第一链5'末端的平末端，以及在第一链3'末端的长度为5-15个核苷酸的、直接或通过接头与100％互补于所述靶核酸的区域连接的单链区，所述单链区与靶核酸互补；所述第二链是长度为16个核苷酸的RNA，其互补结合于所述第一链的与靶核酸100％互补的区域。
2.根据权利要求1所述的诱导RNAi的核酸分子，其中所述接头是化学接头。
3.核酸复合物，其包含与权利要求1至2中任一项所述的诱导RNAi的核酸分子结合的细胞递送载具。
4.用于抑制基因表达的组合物，其包含权利要求1至2中任一项所述的诱导RNAi的核酸分子。
5.抗癌组合物，其包含权利要求1至2中任一项所述的诱导RNAi的核酸分子。
6.根据权利要求5所述的抗癌组合物，其中所述诱导RNAi的核酸分子用来抑制肿瘤相关基因的表达。
7.根据权利要求6所述的抗癌组合物、其中所述肿瘤相关基因是以下任一种：KRAS、Wnt-1、Hec1、Survivin、Livin、Bcl-2、XIAP、Mdm2、EGF、EGFR、VEGF、VEGFR、Mcl-1、IGF1R、Akt1、Grp78、STAT3、STAT5a、β-联蛋白、WISP1和c-myc。
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Assignor: OLIX PHARMACEUTICALS, Inc.

Contract record no.: X2023990000999

Denomination of invention: Nucleic acid molecules that induce RNA interference and their applications

Granted publication date: 20180710

License type: Common License

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