KR20100061455A - 인간 영양 세포를 이용한 만능 줄기 세포 분화 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 만능 줄기 세포 분화 분야에 관한 것이다. 본 발명은 인간 영양 세포층 상에서의 만능 줄기 세포의 분화 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 인간 영양 세포층을 이용하여 만능 줄기 세포를 췌장 내분비 세포로 분화시키는 개선된 방법을 제공한다.

Description

인간 영양 세포를 이용한 만능 줄기 세포 분화{Pluripotent stem cell differentiation by using human feeder cells}
본 발명은 만능 줄기 세포 분화 분야에 관한 것이다. 본 발명은 인간 영양 세포층에서 만능 줄기 세포를 분화시키는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 인간 영양 세포층을 이용하여 만능 줄기 세포를 췌장 내분비 세포로 분화시키는 개선된 방법을 제공한다.
만능 줄기 세포, 예를 들어, 배아 줄기 세포는 모든 성체 세포 유형으로 분화하는 능력을 가지고 있다. 따라서, 배아 줄기 세포는 질환, 감염, 또는 선천성 이상의 결과로서 손상된 기관을 위한 대체 세포 및 조직의 공급원일 수 있다. 배아 줄기 세포가 대체 세포 공급원으로 사용될 잠재력은 배아 줄기 세포를 선택된 세포 유형으로 효율적으로 분화시키는 어려움에 의해 방해된다.
일 예에서, 호리(Hori) 등 (문헌[PNAS 99: 16105, 2002])은 포스포이노시티드 3-키나제의 억제제 (LY294002)로 생쥐 배아 줄기 세포를 처리한 결과 β 세포와 닮은 세포가 생산되었음을 개시한다.
다른 예에서, 블리츠주크(Blyszczuk) 등(문헌[PNAS 100:998, 2003])은 Pax4를 구성적으로 발현하는 생쥐 배아 줄기 세포로부터 인슐린-생산 세포를 생성함을 보고한다.
미칼레프(Micallef) 등은 레티노산이 배아 줄기 세포가 Pdx1 양성 췌장 내배엽을 형성하는 것을 조절할 수 있음을 보고한다 (문헌[Diabetes 54:301, 2005]).
스코우디(Skoudy) 등은 액티빈 A (TGFβ 수퍼패밀리의 구성원)가 생쥐 배아 줄기 세포에서 외분비 췌장 유전자 (p48 및 아밀라제) 및 내분비 유전자 (Pdx1, 인슐린, 및 글루카곤)의 발현을 상향조절함을 보고한다(문헌[Biochem. J. 379: 749, 2004]).
쉬라키(Shiraki) 등은 Pdx1 양성 세포로의 배아 줄기 세포의 분화를 특이적으로 향상시키는 성장 인자의 효과를 연구하였다. 그들은 TGFβ2가 재현성있게 더 높은 비율의 Pdx1 양성 세포를 생성함을 관찰하였다 (문헌[Genes Cells. 2005 Jun; 10(6): 503-16]).
고든(Gordon) 등은 혈청의 부재 하에서 그리고 Wnt 시그널링의 억제제와 함께 액티빈의 존재 하에서 생쥐 배아 줄기 세포로부터 브라키우리(brachyury)+/HNF-3베타+ 내배엽 세포의 유도를 증명하였다 (미국 특허 출원 공개 제2006/0003446A1호).
고든 등(문헌[PNAS 103: 16806, 2006])은 "Wnt 및 TGF-베타/ 노달(nodal)/ 액티빈 시그널링은 전방 원시선(anterior primitive streak)의 생성에 동시에 필요하였다"라고 진술한다.
톰슨(Thomson) 등은 인간 배반포로부터 배아 줄기 세포를 단리하였다 (문헌[Science 282:114, 1998]). 동시에, 기어하트(Gearhart)와 동료들은 태아 생식선 조직으로부터 인간 배아 배(human embryonic germ, hEG) 세포주를 유도하였다 (문헌[Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998]). 백혈병 억제 인자(Leukemia Inhibitory Factor, LIF)를 이용하여 배양함으로써 간단하게 분화를 방지할 수 있는 생쥐 배아 줄기 세포와는 달리, 인간 배아 줄기 세포는 매우 특별한 조건하에서 유지되어야 한다(미국 특허 제6,200,806호; 국제특허 공개 WO 99/20741호; 국제특허 공개 WO 01/51616호).
드'아무르(D'Amour) 등은 고농도의 액티빈과 저 혈청의 존재 하에서 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽의 농축 배양물의 생성을 개시한다 (문헌[Nature Biotechnology 2005]). 생쥐의 신장 피막하에 이들 세포를 이식하면 일부 내배엽 기관의 특징을 가진 보다 성숙한 세포로 분화되었다. 인간 배아 줄기 세포-유래 완성 내배엽 세포는 FGF-10의 첨가 후에 Pdx1 양성 세포로 추가로 분화될 수 있다 (미국 특허 출원 공개 제2005/0266554A1호).
드'아무르 등 (문헌[Nature Biotechnology - 24, 1392 - 1401 (2006)])은 "우리는 인간 배아 줄기(hES) 세포를 췌장 호르몬 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 췌장 폴리펩티드 및 그렐린(ghrelin)을 합성할 수 있는 내분비 세포로 전환시키는 분화 과정을 개발하였다. 이 과정은 도중에 완성 내배엽, 창자관 내배엽, 췌장 내배엽, 및 내분비 전구체를 닮은 단계들을 통해 세포를 내분비 호르몬 발현 세포가 되도록 함으로써 생체내(in vivo) 췌장 기관형성을 모방한다"라고 진술한다.
다른 예에서, 피스크(Fisk) 등은 인간 배아 줄기 세포로부터 췌도 세포를 생성하는 시스템을 보고한다 (미국 특허 출원 공개 제2006/0040387A1호). 이 경우에는, 분화 경로가 세 단계로 나뉘어졌다. 인간 배아 줄기 세포를 먼저 소듐 부티레이트와 액티빈 A의 조합을 이용하여 내배엽으로 분화시켰다. 이어서 당해 세포를 EGF 또는 베타셀룰린과 조합된 노긴(Noggin)과 같은 TGFβ 길항제를 이용하여 배양하여 Pdx1 양성 세포를 생성하였다. 마지막 분화는 니코틴아미드에 의해 유도되었다.
일 예에서, 벤베니스트리(Benvenistry) 등은 "우리는 Pdx1의 과다 발현이 췌장에 풍부한 유전자의 발현을 향상시켰으며 인슐린 발현의 유도는 생체내에서만 존재하는 추가의 시그널을 필요로 할 수 있다고 결론내린다"라고 진술한다 (문헌[Benvenistry et al, Stem Cells 2006; 24:1923-1930]).
다른 예에서는, 콘디(Condie) 등은 "감마-시크리타아제 또는 노치(Notch) 시그널링을 억제하는 리간드 또는 다른 화합물을 함유하거나 발현하는 영양 세포층은 만능 세포를 만능 상태로 유지하는 것을 향상시킨다"고 개시한다 (국제특허 공개 WO2004090110호).
다른 예에서는, 미타리포바(Mitalipova) 등은 "인간 배아 줄기 세포는 인간 과립막 영양 세포, 근육 세포, 난관(Fallopian ductal) 상피 세포, 골수 기질 세포, 및 피부 섬유아세포를 이용하여 배양되며 배아 줄기 세포는 그들의 만능성 표현형을 유지한다"라고 개시한다 (미국 특허 출원 공개 제20050037488호).
다른 예에서는, 수(Xu) 등은 "배아 조직으로부터 얻어지거나 배아 줄기 세포로부터 분화된 중간엽 및 섬유아세포-유사 세포주. 그러한 세포주를 유도하는 방법, 배지를 처리하는 방법, 및 영양 세포 또는 조절된 배지를 이용하여 줄기 세포를 성장시키는 방법이 개시된다"라고 개시한다 (미국 특허 출원 공개 제20020072117호).
따라서, 췌장 내분비 세포, 췌장 호르몬 발현 세포, 또는 췌장 호르몬 분비 세포로 분화하는 잠재력을 보유하는 한편, 현재의 임상적 필요성에 대처하도록 확장될 수 있는 만능 줄기 세포주를 확립하기 위한 조건을 개발하는 것에 대한 상당한 필요성이 여전히 남아있다. 본 발명자들은 인간 배아 줄기 세포를 췌장 내분비 세포로 분화시키는 효율을 향상시키기 위해 대안적인 접근법을 취하였다.
본 발명은 만능 줄기 세포 분화 분야에 관한 것이다. 본 발명은 인간 영양 세포층에서의 만능 줄기 세포의 분화 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 인간 영양 세포층을 이용하여 만능 줄기 세포를 췌장 내분비 세포로 분화시키는 개선된 방법을 제공한다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 만능 줄기 세포를 분화시키는 방법을 제공한다:
a. 만능 줄기 세포를 배양하는 단계,
b. 만능 줄기 세포를 인간 영양 세포층 상에 도말하는 단계, 및
c. 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 적어도 하나의 인자로 만능 줄기 세포를 처리하는 단계.
<도 1>
도 1은 MEF 조절된 배지로 매트리젤(MATRIGEL) 상에서 배양되며, 생쥐 배아 섬유아세포(MEF), 구매가능한 생쥐 배아 섬유아세포 (MEF-SM), 인간 피부 섬유아세포 (D551), 인간 포피 섬유아세포 (Hs27), 및 인간 췌장-유래 기질 세포(HP)로 옮겨진 세포와 비교한, 계대 46의, 인간 배아 줄기 세포주 H9의 집단에서 분화와 관련된 마커들인 CXCR4, Sox-17, FoxA2, HNF-4a, HNF6 및 AFP의 발현을 보여준다.
<도 2>
도 2는 인간 배아 줄기 세포가 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화하는 것에 대한 인간 영양 세포층의 효과를 보여준다. 이 도면은 생쥐 배아 섬유아세포(MEF), 구매가능한 생쥐 배아 섬유아세포 (MEF-SM), 인간 피부 섬유아세포 (D551), 인간 포피 섬유아세포 (Hs27), 및 인간 췌장-유래 기질 세포(HP) 상에서 배양된, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화된, 계대 48의, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 집단에서 실시간 PCR로 결정한 CXCR4, Sox-17, 및 FoxA2의 발현을 보여준다.
<도 3>
도 3은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성에 대한 인간 영양 세포층의 효과를 보여준다. 이 도면은 생쥐 배아 섬유아세포(MEF), 구매가능한 생쥐 배아 섬유아세포 (MEF-SM), 인간 피부 섬유아세포 (D551), 인간 포피 섬유아세포 (Hs27), 및 인간 췌장-유래 기질 세포(HP) 상에서 배양된, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화된, 계대 48의, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 집단에서 실시간 PCR로 결정한, FoxA2, HNF-4a, HNF-6 및 PDX-1의 발현을 보여준다.
<도 4>
도 4는 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성에 대한 인간 영양 세포층의 효과를 보여준다. 이 도면은 생쥐 배아 섬유아세포(MEF), 구매가능한 생쥐 배아 섬유아세포 (MEF-SM), 인간 피부 섬유아세포 (D551), 인간 포피 섬유아세포 (Hs27), 및 인간 췌장-유래 기질 세포(HP)에서 배양된, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화된, 계대 48의, 인간 배아 줄기 세포주 H1의 집단에서 실시간 PCR로 결정한 FoxA2, HNF-4a, HNF-6, NeuroD1, Nkx 2.2, Pax-4, Nkx 6.1, PDX-1, 글루카곤(GCG), 및 인슐린(INS)의 발현을 보여준다.
<도 5>
도 5는 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 인간 배아 줄기 세포의 분화에 대한 인간 영양 세포층의 효과를 보여준다. 이 도면은 생쥐 배아 섬유아세포(MEF), 구매가능한 생쥐 배아 섬유아세포 (MEF-SM), 인간 피부 섬유아세포 (D551), 인간 포피 섬유아세포 (Hs27), 및 인간 췌장-유래 기질 세포(HP) 상에서 배양된, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화된, 계대 46의, 인간 배아 줄기 세포주 H9의 집단에서 실시간 PCR로 결정한, CXCR4, Sox-17, 및 FoxA2의 발현을 보여준다.
<도 6>
도 6은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성에 대한 인간 영양 세포층의 효과를 보여준다. 이 도면은 생쥐 배아 섬유아세포(MEF), 구매가능한 생쥐 배아 섬유아세포 (MEF-SM), 인간 피부 섬유아세포 (D551), 인간 포피 섬유아세포 (Hs27), 및 인간 췌장-유래 기질 세포(HP) 상에서 배양된, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화된, 계대 46의, 인간 배아 줄기 세포주 H9의 집단에서 실시간 PCR로 결정한 FoxA2, HNF-4a, HNF-6 및 PDX-1의 발현을 보여준다.
<도 7>
도 7은 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성에 대한 인간 영양 세포층의 효과를 보여준다. 이 도면은 생쥐 배아 섬유아세포(MEF), 구매가능한 생쥐 배아 섬유아세포 (MEF-SM), 인간 피부 섬유아세포 (D551), 인간 포피 섬유아세포 (Hs27), 및 인간 췌장-유래 기질 세포(HP) 상에서 배양된, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화된, 계대 46의, 인간 배아 줄기 세포주 H9의 집단에서 실시간 PCR로 결정한, FoxA2, HNF-4a, HNF-6, NeuroD1, Nkx 2.2, Pax-4, Nkx 6.1, PDX-1, 글루카곤 (GCG), 및 인슐린 (INS)의 발현을 보여준다.
개시 내용의 명확함을 위하여, 그리고 제한하지 않고서, 발명을 실시하기 위한 구체적인 내용은 본 발명의 소정의 특징, 실시 형태, 또는 응용을 설명하거나 예시하는 세부 항목으로 나뉘어진다.
정의
줄기 세포는 단일 세포 수준에서 자가-재생하고 분화하여 자가-재생 조상세포(progenitors), 비-재생 조상세포, 및 최종 분화 세포를 비롯한 자손 세포(progeny cells)를 생성하는 그의 능력에 의해 규정되는 미분화 세포이다. 줄기 세포는 또한 다수의 배엽층(내배엽, 중배엽 및 외배엽)으로부터 다양한 세포 계통의 기능성 세포로 시험관 내에서(in vitro) 분화하는 그의 능력, 및 이식 후 다수의 배엽층의 조직이 생기게 하며 배반포 내로의 주입 후, 전부는 아니라 하더라도 대부분의 조직에 실질적으로 기여하는 그의 능력을 특징으로 한다.
줄기 세포는 그들의 발생 잠재력에 의해 분류된다: (1) 모든 배아 및 배아외 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 전능성; (2) 모든 배아 세포 유형이 생기게 할 수 있음을 의미하는 만능성; (3) 세포 계통의 하위세트이지만 모두 특정 조직, 기관 또는 생리학적 시스템 내에 있는 하위세트가 생기게 할 수 있음을 의미하는 다능성(예를 들어, 조혈 줄기 세포(hematopoietic stem cell, HSC)는 HSC(자가-재생), 혈구 세포 제한된 소기능성(oligopotent) 조상세포 및 혈액의 정상 성분인 모든 세포 유형 및 요소(예를 들어, 혈소판)를 포함하는 자손을 생성할 수 있음); (4) 다능성 줄기 세포보다 더 제한된 하위세트의 세포 계통이 될 수 있음을 의미하는 소기능성; 및 (5) 단일 세포 계통(예를 들어, 정자발생 줄기 세포)이 생기게 할 수 있음을 의미하는 단일기능성.
분화는 특화되지 않은("미결된") 또는 덜 특화된 세포가 예를 들어, 신경 세포 또는 근육 세포와 같은 특화된 세포의 특징을 획득하는 과정이다. 분화된 또는 분화-유도된 세포는 세포의 계통 내에서 보다 특화된 ("결정된(committed)") 위치를 차지한 것이다. 분화 과정에 적용될 때, 용어 "결정된"은 분화 경로에서, 정상 환경 하에서 특정 세포 유형 또는 세포 유형의 하위세트로 계속 분화할 것이며 정상 환경 하에서 다른 세포 유형으로 분화할 수 없거나 덜 분화된 세포 유형으로 돌아갈 수 없는 시점까지 진행한 세포를 말한다. 탈분화(De-differentiation)는 세포가 세포의 계통 내의 덜 특화된(또는 결정된) 위치로 되돌아가는 과정을 말한다. 본 명세서에 사용되는 바와 같이, 세포의 계통은 세포의 유전, 즉 어느 세포로부터 왔는지 그리고 어떤 세포가 생성되게 할 수 있는지를 규정한다. 세포의 계통은 세포를 발생과 분화의 유전적 체계 내에 둔다. 계통-특이적 마커는 관심있는 계통의 세포의 표현형과 특이적으로 관련되며 미결정 세포가 관심있는 계통으로 분화하는지를 평가하기 위해 사용될 수 있는 특징을 말한다.
다양한 용어가 배양 중인 세포를 설명하기 위하여 사용된다. "유지"는 세포 성장 및/또는 분열을 촉진하는 조건 하에서 성장 배지에 세포를 두는 것을 말하며, 이는 보다 큰 세포 집단으로 이어질 수도 있고 이어지지 않을 수도 있다. "계대"는 세포 성장 및/또는 분열을 촉진하는 조건 하에서 세포를 하나의 배양 용기로부터 꺼내어 이 세포를 제2 배양 용기에 두는 과정을 말한다.
세포의 특정 집단, 또는 세포주는 때로는 그가 계대된 횟수를 말하거나 또는 상기 횟수에 의해 특성화된다. 예를 들어, 10회 계대된 배양된 세포 집단은 P10 배양물로서 지칭될 수 있다. 일차 배양물, 즉, 조직으로부터의 세포의 단리 후 첫 번째 배양물은 P0으로 표기된다. 첫 번째 계대배양(subculture) 후, 세포를 2차 배양물(P1 또는 계대 1)로서 기재한다. 두 번째의 계대배양 후, 세포는 3차 배양물(P2 또는 계대 2)이 되며, 기타 등등이다. 당업자라면 계대 기간 동안 많은 집단의 배가가 있을 수 있으며, 따라서 배양물의 집단 배가 수는 계대 수보다 크다는 것을 이해할 것이다. 계대들 사이의 기간 동안 세포의 확장(즉, 집단 배가 수)은 접종 밀도, 기질, 배지, 성장 조건, 및 계대 사이의 시간을 포함하지만 이에 한정되지 않는 많은 인자에 의존적이다.
"β-세포 계통"은 전사 인자 PDX-1 및 하기 전사 인자 중 적어도 하나에 대해 양성(positive) 유전자 발현을 가진 세포를 말한다: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 베타, MAFA, Pax4, 및 Pax6. β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: SOX-17, GATA-4, HNF-3 베타, GSC, Cer1, 노달, FGF8, 브라키우리, Mix 유사 호메오박스 단백질, FGF4 CD48, 에오메소데르민(eomesodermin) (EOMES), DKK4, FGF17, GATA-6, CXCR4, C-Kit, CD99, 또는 OTX2. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포, 원시선 세포, 중내배엽 세포 및 완성 내배엽 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: PDX-1, HNF-1베타, HNF-3베타, PTF-1 알파, HNF-6, 또는 HB9. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: NGN-3, NeuroD, Islet-1, PDX-1, NKX6.1, Pax-4, Ngn-3, 또는 PTF-1 알파. 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포, 췌장 호르몬 발현 세포, 및 췌장 호르몬 분비 세포, 및 β-세포 계통의 세포를 포함한다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "완성 내배엽"은 낭배형성동안 상배엽으로부터 생기는 세포의 특징을 보유하며 위장관 및 그 유도체를 형성하는 세포를 말한다. 완성 내배엽 세포는 하기 마커들을 발현한다: CXCR4, HNF-3 베타, GATA-4, SOX-17, 세르베루스, OTX2, 구스코이드, C-Kit, CD99, 및 Mixl1.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "배아외 내배엽"은 하기 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포 집단을 말한다: SOX-7, AFP, 및 SPARC.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "마커"는 관심있는 세포에서 차등적으로 발현되는 핵산 또는 폴리펩티드 분자이다. 이와 관련하여, 차등 발현은 양성 마커의 수준 증가 및 음성 마커의 수준 감소를 의미한다. 마커 핵산 또는 폴리펩티드의 검출가능한 수준은 다른 세포에 비하여 관심있는 세포에서 충분히 더 높거나 더 낮아, 관심있는 세포는 당업계에 알려진 다양한 방법 중 임의의 것을 이용하여 다른 세포로부터 식별되고 구별될 수 있다.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "중내배엽 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: CD48, 에오메소데르민(EOMES), SOX-17, DKK4, HNF-3 베타, GSC, FGF17, GATA-6.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "췌장 내분비 세포", 또는 "췌장 호르몬 발현 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 췌장 폴리펩티드, 및 그렐린.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "췌장 호르몬 분비 세포"는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 분비할 수 있는 세포를 말한다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "전(pre)-원시선 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: 노달, 또는 FGF8.
본 명세서에 사용되는 바와 같이 "원시선 세포"는 하기 마커 중 적어도 하나를 발현하는 세포를 말한다: 브라키우리, Mix-유사 호메오박스 단백질, 또는 FGF4.
본 발명은 만능 줄기 세포 분화 분야에 관한 것이다. 본 발명은 인간 영양 세포층에서 만능 줄기 세포를 번식시키는 방법을 제공한다. 본 발명은 또한 인간 영양 세포층에서 만능 줄기 세포를 분화시키는 방법을 제공한다. 구체적으로, 본 발명은 인간 영양 세포층을 이용하여 만능 줄기 세포를 췌장 내분비 세포로 분화시키는 개선된 방법을 제공한다.
일 실시 형태에서, 본 발명은 하기 단계를 포함하는, 만능 줄기 세포를 분화시키는 방법을 제공한다:
a. 만능 줄기 세포를 배양하는 단계,
b. 인간 영양 세포층 상에 만능 줄기 세포를 도말하는 단계, 및
c. 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 인자 적어도 하나로 만능 줄기 세포를 처리하는 단계.
본 발명의 방법은 만능 줄기 세포를 분화시키는 개선된 방법을 제공하며, 여기서 만능 줄기 세포는 만능 줄기 세포를 분화시키기 전에 인간 영양 세포층 상에 도말된다. 만능 줄기 세포는 당업계의 임의의 적합한 방법에 의해 배양할 수 있다. 유사하게, 만능 줄기 세포는 당업계의 임의의 적합한 방법에 의해 인간 영양 세포층 상에 도말할 수 있다. 만능 줄기 세포는 인간 영양 세포층 상에 도말한 직후 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 인자 적어도 하나로 처리할 수 있다. 대안적으로, 일정 기간 동안 인간 영양 세포층의 존재 하에서 만능 줄기 세포를 배양한 후 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 인자 적어도 하나로 만능 줄기 세포를 처리할 수 있다. 예를 들어, 만능 줄기 세포는 만능 줄기 세포가 단층을 형성하기에 충분한 시간 동안 인간 영양 세포층의 존재 하에서 배양될 수 있다.
만능 줄기 세포는 임의의 밀도로 인간 영양 세포층에 도말할 수 있다. 그러나 최적 밀도는 예를 들어, 사용되는 만능 줄기 세포, 인간 영양 세포층에 포함되는 세포, 분화된 세포 유형, 배양 용기의 크기 등과 같은 인자에 의존할 수 있다. 일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 인간 영양 세포층 상에서 5일 배양 후 만능 줄기 세포가 약 60% 내지 약 80% 융합성이도록 하는 밀도로 도말된다.
본 발명에 사용하기 적합한 만능 줄기 세포는 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H9 (NIH 코드: WA09), 인간 배아 줄기 세포주 H1 (NIH 코드: WA01), 인간 배아 줄기 세포주 H7 (NIH 코드: WA07), 및 인간 배아 줄기 세포주 SA002 (스웨덴 소재의 셀라르티스(Cellartis))를 포함한다. 만능 세포의 특징적인 하기 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 또한 본 발명에 사용하기에 적합하다: ABCG2, 크립토(cripto), CD9, FoxD3, 커넥신(Connexin)43, 커넥신45, Oct4, Sox2, Nanog, hTERT, UTF-1, ZFP42, SSEA-3, SSEA-4, Tra1-60, Tra1-81.
인간 영양 세포층에 포함되는 세포는 만능 줄기 세포의 분화를 촉진할 수 있는 임의의 인간 세포일 수 있다. 인간 영양 세포층에 포함되는 세포는 성체 세포일 수 있다. 대안적으로, 인간 영양 세포층에 포함되는 세포는 태아 또는 배아일 수 있다. 일 실시 형태에서, 인간 영양 세포층은 섬유아세포로 이루어진다. 일 실시 형태에서, 섬유아세포는 피부 섬유아세포이다. 피부 섬유아세포는 인간 피부 섬유아세포주 디트로이트(Detroit) 551 (CCL-110 ATCC)일 수 있다. 다른 실시 형태에서, 섬유아세포는 포피 섬유아세포이다. 인간 포피 섬유아세포는 인간 포피 섬유아세포주 Hs27 (CRL-1634 ATCC)일 수 있다.
대안적으로, 인간 영양 세포층은 췌장-유래 기질 세포로 이루어진다. 일 실시 형태에서, 췌장-유래 기질 세포는 미국 특허 출원 공개 제20040241761호에 개시된 세포이다. 대안적 실시 형태에서, 췌장-유래 기질 세포는 문헌[Science 306: 2261-2264, 2004]에 개시된 세포이다. 대안적 실시 형태에서, 췌장-유래 기질 세포는 문헌[Nature Biotechnology 22: 1115 - 1124, 2004]에 개시된 세포이다. 대안적 실시 형태에서, 췌장-유래 기질 세포는 미국 특허 출원 공개 제20030082155호에 개시된 세포이다. 대안적 실시 형태에서, 췌장-유래 기질 세포는 미국 특허 제5834308호에 개시된 세포이다. 대안적 실시 형태에서,췌장-유래기질 세포는 문헌[Proc Nat Acad Sci 97: 7999-8004, 2000]에 개시된 세포이다. 대안적 실시 형태에서, 췌장-유래 기질 세포는 국제특허 공개 WO2004011621호에 개시된 세포이다. 대안적 실시 형태에서, 췌장-유래 기질 세포는 국제특허 공개 WO03102134호에 개시된 세포이다. 대안적 실시 형태에서, 췌장-유래 기질 세포는 미국 특허 출원 공개 제2004015805호에 개시된 세포이다. 대안적 실시 형태에서, 췌장-유래 기질 세포는 미국 특허 제6458593호에 개시된 세포이다. 대안적 실시 형태에서, 췌장-유래 기질 세포는 국제특허 공개 WO2006094286호에 개시된 세포이다. 대안적 실시 형태에서, 췌장-유래 기질 세포는 ATCC No. PTA-6974로 기탁된 H5f3P6 세포주이다.
영양 세포층의 생성
본 출원에서 개시된 인간 영양 세포층은 만능 줄기 세포의 분화에 유용하다. 다른 유형의 세포가 이들 영양 세포층에서 분화됨으로써 효과를 얻을 수 있음이 인식되며, 본 발명의 조성물은 제한없이 그러한 목적을 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 일 태양에서, 영양 세포층은 본질적으로 하기 단계를 포함하는 방법에 의해 생성된다:
a. 영양층을 형성할 세포를 배양하는 단계, 및
b. 세포를 불활성화시키는 단계.
영양 세포층을 형성할 세포는 적합한 배양 기재 상에서 배양될 수 있다. 일 실시 형태에서, 적합한 배양 기재는 세포외 매트릭스 성분, 예를 들어, 기저막으로부터 유래된 것들, 또는 부착 분자 수용체-리간드 커플링의 일부를 형성할 수 있는 것들이다. 일 실시 형태에서, 적합한 배양 기재는 매트리젤(MATRIGEL)(등록상표) (벡톤 디켄슨(Becton Dickenson) )이다. 매트리젤(등록상표)은 실온에서 젤화하여 재구성된 기저막을 형성하는 엔젤브레스-홈-스왐(Engelbreth-Holm-Swarm) 종양 세포 유래의 용해성 제제이다. 다른 실시 형태에서, 적합한 배양 기재는 젤라틴(시그마(Sigma))이다.
다른 세포외 매트릭스 성분 및 성분 혼합물이 대안으로서 적합하다. 증식되는 세포 유형에 따라, 이것은 라미닌, 피브로넥틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴, 헤파란 설페이트 등을 단독으로 또는 다양한 조합으로 포함할 수 있다.
영양 세포층을 형성하기 위해 사용되는 세포는 예를 들어, 방사선, 화학적 불활성화제, 예를 들어, 마이토마이신 c를 이용한 처리에 의해, 또는 임의의 다른 효과적인 방법에 의해 불활성화될 수 있다(즉, 사실상 복제할 수 없게 됨).
영양 세포층을 형성하기 위해 사용되는 세포를 배양하기 위해 사용되는 배지는 몇몇 상이한 제형 중 임의의 것을 가질 수 있다. 배지는 적어도 영양 세포층을 형성하기 위해 사용되는 세포주의 번식을 지지할 수 있어야 한다. 배지는 또한 만능 줄기 세포의 번식을 지지하는 것이 편리하다. 그러나, 대안으로서, 배지는 다른 인자로 보충되거나 또는 다르게는 만능 줄기 세포의 번식을 위해 적응하도록 처리될 수 있다.
일 실시 형태에서, 췌장-유래 기질 세포는 국제특허 공개 WO2006094286호에 개시된다.
췌장-유래 세포의 단리: 본 발명의 일 태양에서, 췌장 세포는 본질적으로 하기 단계를 포함하는 다단계 방법에 의해 단리된다:
a. 사체 췌장, 생 공여체 또는 자가조직 췌장에 효소 용액을 관류하는 단계,
b. 관류된 췌장을 기계적으로 분리하는 단계,
c. 폴리수크로스 또는 피콜(Ficoll) 구배 위에 소화된 조직을 층화하고, 이어서 원심분리하여 세 가지 구별되는 계면을 생성하는 단계,
d. 각 계면에서 조직과 세포를 제거하는 단계,
e. 5% 미만의 혈청을 함유한 영양소 풍부 선발 배지에서 표준 조직 배양 플레이트에서 조직과 세포를 배양하는 단계, 및
f. 임의의 배지 교환없이 약 2 내지 4주 동안 배양물을 교란없이 두는 단계.
사체 췌장의 관류는 당업계에 잘 알려진 임의의 효소 용액으로 달성될 수 있다. 본 발명에 사용하기 적합한 효소 용액의 예는 리버라아제(LIBERASE) HI™ (로쉐(Roche) - 0.5 ㎎/㎖) 및 DNase I (0.2 ㎎/㎖)을 함유한다.
췌장 조직의 기계적 분리는 조직 처리기를 이용하여 신속하게 실시될 수 있다. 대안적으로, 췌장 조직의 기계적 분리는 리코르디 챔버(Ricordi Chamber) 또는 다른 절차에 비하여 조직의 덜 파괴적인 분리를 가능하게 하는 다른 동등한 장치를 이용하여 실시할 수 있다.
이어서 분해된 췌장 조직을 폴리수크로스 또는 피콜 구배 원심분리에 처하여 세 개의 구별되는 계면을 생성하며, 이들은 각각 췌도, 관 조직 및 선방 조직 유래의 세포가 풍부하다. 일 실시 형태에서, 조직과 세포가 각 계면으로부터 제거되어 별도로 배양된다. 대안적 실시 형태에서, 모든 계면으로부터의 조직과 세포가 조합되어 배양된다. 췌장 기질 세포는 세 가지 계면 중 임의의 것으로부터 유래될 수 있음이 본 발명에 따라 결정되었다. 대안적으로, 연속 구배를 이용할 수 있으며 췌장 기질 세포를 생성하도록 선발된 선택된 세포 집단이 선발될 수 있다.
본 발명에 따르면, 계면 중 하나 이상으로부터 수집된 조직과 세포는 세포 집단에서 기질 세포를 선택적으로 풍부하게 위하여 선발 배지에서 배양된다. 선발 배지는 영양소가 풍부하며 글루코스와 혈청 수준이 낮다. 일반적으로 말해서, 선발 배지는 5% 미만의 혈청, 대안적으로 1-3% 혈청, 대안적으로 약 2% 혈청, 및 30 mM 미만의 글루코스를 함유한다. 일 실시 형태에서, 선발 배지는 공여 췌장이 수집된 동일한 포유류 종으로부터 유래된 2% 혈청으로 보충된다. 대안적으로, 태아 또는 송아지 혈청, 다른 종으로부터의 혈청, 또는 다른 혈청 보충물 또는 대체물을 사용하여 선발 배지를 보충할 수 있다. 적합한 선발 배지의 예는 DMEM (5 mM 글루코스), 2% 소과 태아 혈청 (FBS), 100 U/㎍ 페니실린/스트렙토마이신, 인슐린-트랜스페린-셀레늄(ITS), 2 mM L-글루타민, 0.0165 mM ZnSO4, 및 0.38 μM 2-머캡토에탄올로 구성된다.
선발 배지에서의 배양 동안("선발 단계"), 세포는 저산소 또는 정상산소 조건 하에서 배양될 수 있다. 저산소 조건 하에서, 산소 수준은 20% 미만, 대안적으로 10% 미만, 대안적으로 5% 미만, 그러나 1% 초과이다.
바람직하게는, 배양물은 임의의 배지 교환없이 약 2 내지 4주 동안 교란없이 선발 배지에서 유지되어야 하며, 이 시점에 세포는 전형적으로 사용된 배양 기재에 부착성이 된다. 선발 단계는 부착 세포 수의 증가가 더 이상 없을 때 완료되는 것으로 간주된다.
본 발명에 따른 조직 수집 및 배양 방법은 췌장 기질 세포가 풍부한 세포 집단을 생성함이 발견되었다. "풍부한"이란 췌장 기질 세포가 집단 내의 모든 세포의 적어도 약 30%, 대안적으로 약 40%, 대안적으로 약 50%를 차지함을 의미한다.
대안적으로, 계면 중 하나 이상으로부터 수집된 조직 및 세포는 세포 집단에서 기질 세포를 선택적으로 풍부하게 하기 위해 선발 배지에서 배양된다. 선발 배지는 영양소가 풍부하며 낮은 수준의 글루코스를 함유한다. 일반적으로 말해서, 선발 배지는 20% 미만의 혈청, 대안적으로 10 내지 5% 혈청, 대안적으로 약 10% 혈청, 및 30 mM 미만의 글루코스를 함유한다. 일 실시 형태에서, 선발 배지는 공여 췌장이 수집된 동일한 포유류 종으로부터 유래된 10% 혈청으로 보충된다. 대안적으로, 태아 또는 송아지 혈청, 다른 종으로부터의 혈청, 또는 다른 혈청 보충물 또는 대체물을 사용하여 선발 배지를 보충할 수 있다. 적합한 선발 배지의 예는 DMEM (5 mM 글루코스), 10% 소과 태아 혈청 (FBS), 100 U/㎍ 페니실린/스트렙토마이신으로 구성된다.
선발 배지에서의 배양 동안("선발 단계"), 세포는 저산소 또는 정상산소 조건 하에서 배양될 수 있다. 저산소 조건 하에서, 산소 수준은 20% 미만, 대안적으로 10% 미만, 대안적으로 5% 미만, 그러나 1% 초과이다.
이들 배양 조건하에서, 배지는 2-4일 간격으로 규칙적으로 교환된다.
본 발명에 따른 조직 수집 및 배양 방법은 췌장 기질 세포가 풍부한 세포 집단을 생성함이 발견되었다. "풍부한"이란 췌장 기질 세포가 집단 내의 모든 세포의 적어도 약 30%, 대안적으로 약 40%, 대안적으로 약 50%를 차지함을 의미한다.
선발과 세포 부착의 초기 단계에 이어, (기질 세포가 풍부한) 세포는 이하에서 추가로 설명되는 조건 하에서 확장된다.
필요하면, 기질 세포가 풍부한 세포 집단은 췌장 기질 세포를 확인하고 선발하기 위하여, 예를 들어, 기질 세포에 의해 발현되는 단백질 마커를 특이적으로 인식하는 제제(예를 들어, 항체)에 노출되어, 사실상 순수한 췌장 기질 세포 집단을 얻을 수 있다.
단리된 췌장 기질 세포의 특성화: 배양되거나 단리된 세포에서 단백질 및 핵산 마커의 발현을 평가하는 방법은 당업계의 표준이다. 이들은 정량적 역전사효소 폴리머라아제 연쇄 반응(RT-PCR), 노던 블롯(Northern blots), 원위치 혼성화(예를 들어, 문헌[Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel et al., eds. 2001 supplement)] 참고), 및 면역분석, 예를 들어, 단면(sectioned) 재료의 면역조직화학적 분석, 웨스턴 블롯팅(Western blotting), 및 온전한 상태의 세포에서 접근가능한 마커의 경우, 유세포분석(flow cytometry analysis, FACS) (예를 들어, 문헌[Harlow and Lane, Using Antibodies: A Laboratory Manual, New York: Cold Spring Harbor Laboratory Press (1998)] 참고)을 포함한다.
본 발명에 따라 단리된 췌장 기질 세포는 특히, 실질적으로 하기 단백질 마커 중 적어도 하나가 결핍됨을 특징으로 한다: CD117, NCAM, ABCG2, 사이토케라틴 7, 8, 18, 또는 19. 소정의 특정 실시 형태에서, 본 발명에 따라 단리된 췌장 기질 세포는 하기 단백질 마커 중 적어도 하나에 대해 실질적으로 양성임을 특징으로 한다: CD44, CD73, CD90 및 CD105.
췌장 기질 세포의 확장: 추가 태양에서, 본 발명은 본 발명에 따라 얻어진 췌장 기질 세포를 확장시키는 방법을 제공한다. 상기에 설명된 바와 같이, 췌도, 관 단편 및 외분비 조직의 이질성 혼합물을 함유할 수 있는 췌장 소화물은 2-4주 동안 저혈청 선발 배지에서, 바람직하게는 임의의 배지 교환 없이, 배양되어, 원하는 기질 세포를 선택적으로 풍부하게 한다. 이제 췌장 기질 세포가 풍부한, 생성된 세포 집단은 이어서 세포 집단에서 췌장 기질 세포를 확장시키기 위해 성장 배지로 옮겨진다.
본 발명에 사용하기 적합한 성장 배지는 페니실린/스트렙토마이신(P/S) 및 2% 내지 20%, 대안적으로 약 5 내지 10%의 농도의 혈청을 함유한 DMEM과 같은 배지로 구성될 수 있다. 일 실시 형태에서, 성장 배지는 DMEM (1000 ㎎/L D-글루코스; 862 ㎎/L 글루타민), 및 10% 소과 태아 혈청으로 구성된다. 대안적 실시 형태에서, 성장 배지는 공여 췌장이 수집된 동일한 포유류 종으로부터 유래된 혈청으로 보충된다. 대안적으로, 태아 또는 송아지 혈청, 또는 다른 혈청 보충물 또는 대체물, 예를 들어, 혈청 알부민을 사용하여 성장 배지를 보충할 수 있다.
더욱이, 기질 세포는 본 발명의 세포의 증식을 자극하는 제제(들)를 함유한 규명된 성장 배지에서 배양시켜 확장시킬 수 있다. 이들 인자는 예를 들어, 니코틴아미드, TGF-β1, 2, 및 3을 비롯한 TGF-β패밀리의 구성원, 골 형성 단백질(BMP-2, -4, 6, -7, -11, -12, 및 -13), 혈청 알부민, 섬유아세포 성장 인자 패밀리, 혈소판-유래 성장 인자-AA, 및 -BB, 혈소판 풍부 혈장, 인슐린 성장 인자(IGF-I, II), 성장 분화 인자(GDF-5, -6, -8, -10, 11), 글루카곤 유사 펩티드-I 및 II (GLP-I 및 II), GLP-1 및 GLP-2 미메토바디(mimetobody), 엑센딘(Exendin)-4, 레틴산, 부갑상선 호르몬, 인슐린, 프로게스테론, 아프로티닌, 하이드로코르티손, 에탄올아민, 베타 메르캅토에탄올, 상피 성장 인자(EGF), 가스트린 I 및 II, 구리 킬레이팅제, 예를 들어, 트라이에틸렌 펜타민, TGF-α, 포르스콜린, Na-부티레이트, 액티빈, 베타셀룰린, 인슐린/트랜스페린/셀레늄(ITS), 간세포 성장 인자(HGF), 각질형성세포 성장 인자(KGF), 소과 뇌하수체 추출물, 췌도 신생-관련 단백질(islet neogenesis-associated protein)(INGAP), 프로테아좀 억제제, 노치(notch) 경로 억제제, 소닉 헤지호그 억제제, 또는 그 조합일 수 있다. 대안적으로, 기질 세포는 조절된 배지에서 배양시켜 확장시킬 수 있다. "조절된 배지"란 세포 집단이 기본적인 규명 세포 배양 배지에서 성장되며 배지에 용해성 인자를 기여함을 의미한다. 한 가지 그러한 용도에서, 세포는 배지로부터 제거되는 한편, 세포가 생산하는 용해성 인자는 남게 된다. 이 배지는 이어서 상이한 세포 집단에 영양을 제공하기 위하여 사용된다.
소정의 실시 형태에서, 췌장 기질 세포는 표준 조직 배양 플레이트에서 배양된다. 대안적으로, 배양 플레이트는 세포외 매트릭스 단백질, 예를 들어, 매트리젤(등록상표), 성장 인자 감소된 매트리젤(등록상표), 라미닌, 콜라겐, 젤라틴, 테나신, 피브로넥틴, 비트로넥틴, 트롬보스폰딘, 태반 추출물 또는 그 조합으로 코팅될 수 있다.
더욱이, 췌장 기질 세포는 저산소 또는 정상산소 조건하에서 시험관 내에서 확장될 수 있다.
만능 줄기 세포의 분화
본 발명의 일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 그들의 만능성을 유지하면서 배양에서 번식된다. 이어서 만능 줄기 세포는 분화 전에 인간 영양 세포층 상으로 옮겨진다. 시간에 따른 세포의 만능성의 변화는 만능성과 관련된 마커의 발현 수준의 변화를 검출하여 결정할 수 있다. 대안적으로, 만능성의 변화는 분화와 관련된 마커, 또는 다른 세포 유형과 관련된 마커의 발현 수준의 변화를 검출하여 모니터할 수 있다.
만능 세포는 그들이 다른 세포 유형으로 분화하도록 촉진하는 인자 적어도 하나로 처리된다. 다른 세포 유형은 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포일 수 있다. 대안적으로, 세포 유형은 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포일 수 있다. 대안적으로, 세포 유형은 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포일 수 있다. 대안적으로, 세포 유형은 β-세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포일 수 있다.
본 발명의 방법에 따라 처리된 만능 줄기 세포는 당업계의 임의의 적합한 방법에 의해 다양한 다른 세포 유형으로 분화될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 처리된 만능 줄기 세포는 신경 세포, 심장 세포, 간세포 등으로 분화될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 방법에 따라 처리된 만능 줄기 세포는 국제특허 공개 WO2007030870호에 개시된 방법에 따라 신경 전구체 및 심근세포로 분화될 수 있다.
다른 예에서, 본 발명의 방법에 따라 처리된 만능 줄기 세포는 미국 특허 제6,458,589호에 개시된 방법에 따라 간세포로 분화될 수 있다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커들을 발현하는 세포로의 만능 줄기 세포의 분화
본 발명의 일 태양에 따라, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 하기 단계를 포함하는 다단계 방법에 의해 만능 줄기 세포로부터 형성된다:
a. 만능 줄기 세포를 배양하는 단계,
b. 인간 영양 세포층 상에 만능 세포를 도말하는 단계,
c. 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계,
d. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계, 및
e. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 단계.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커는 SOX-17, GATA4, Hnf-3베타, GSC, Cer1, 노달, FGF8, 브라키우리, Mix-유사 호메오박스 단백질, FGF4 CD48, 에오메소데르민(EOMES), DKK4, FGF17, GATA6, CXCR4, C-Kit, CD99, 및 OTX2로 이루어진 군으로부터 선택된다. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 원시선 전구 세포이다. 대안적 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 중내배엽 세포이다. 대안적 태양에서, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 완성 내배엽 세포이다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커는 Pdx1, HNF-1베타, PTF1a, HNF-6, HB9 및 PROX1로 이루어진 군으로부터 선택된다. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내배엽 세포이다.
췌장 내분비 계통의 특징적인 마커는 NGN-3, NeuroD, Islet-1, Pdx-1, NKX6.1, Pax-4, Ngn-3, 및 PTF-1 알파로 이루어진 군으로부터 선택된다. 일 실시 형태에서, 췌장 내분비 세포는 하기 호르몬 중 적어도 하나를 발현할 수 있다: 인슐린, 글루카곤, 소마토스타틴, 및 췌장 폴리펩티드. 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커들 중 적어도 하나를 발현하는 세포가 본 발명에 사용하기에 적합하다. 본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 췌장 내분비 세포이다. 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 발현 세포일 수 있다. 대안적으로, 췌장 내분비 세포는 췌장 호르몬 분비 세포일 수 있다.
본 발명의 일 태양에서, 췌장 내분비 세포는 β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포이다. β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 Pdx1 및 하기 전사 인자들 중 적어도 하나를 발현한다: NGN-3, Nkx2.2, Nkx6.1, NeuroD, Isl-1, HNF-3 베타, MAFA, Pax4, 및 Pax6. 본 발명의 일 태양에서, β 세포 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 β 세포이다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌 [D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성: 만능 줄기 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 또는 본 발명에서 제안된 임의의 방법에 의해 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[Shinozaki et al, Development 131, 1651 - 1662(2004 )]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[McLean et al, Stem Cells 25 , 29 - 38 (2007)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 만능 줄기 세포는 혈청 부재 하에서 액티빈 A를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 액티빈 A와 혈청을 이용하여 세포를 배양하고, 이어서 상이한 농도의 액티빈 A와 혈청을 이용하여 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이러한 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 23, 1534 - 1541 (2005)]에 개시된다.
예를 들어 만능 줄기 세포는 혈청 부재 하에서 액티빈 A를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 다른 농도의 혈청을 포함하는 액티빈 A를 이용하여 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이 방법의 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2005]에 개시된다.
예를 들어 만능 줄기 세포는 혈청 부재 하에서 액티빈 A와 Wnt 리간드를 함유하는 배지에서 만능 줄기 세포를 배양하고, 이어서 Wnt 리간드를 제거하고 혈청을 포함하는 액티빈 A를 이용하여 세포를 배양함으로써 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된다.
췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포의 형성: 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 또는 본 발명에서 제안된 임의의 방법에 의해 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 섬유아세포 성장 인자 및 헤지호그 시그널링 경로 억제제 KAAD-사이클로파민으로 처리하고, 이어서 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민을 함유하는 배지를 제거하고, 그 후 세포를 레틴산, 섬유아세포 성장 인자 및 KAAD-사이클로파민을 함유하는 배지에서 배양함으로써, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예가 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된다.
췌장 내분비 계통의 마커를 발현하는 세포의 형성: 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 당업계의 임의의 방법에 의해 또는 본 발명에서 개시된 임의의 방법에 의해 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 문헌[D'Amour et al, Nature Biotechnology 24, 1392-1401 (2006)]에 개시된 방법에 따라 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화될 수 있다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 DAPT 및 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하고, 이어서 DAPT와 엑센딘 4를 함유하는 배지를 제거하고, 그 후 엑센딘 1, IGF-1 및 HGF를 함유하는 배지에서 상기 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[Nature Biotechnology 24, 1392 - 1401 (2006)]에 개시된다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양하고, 이어서 엑센딘 4를 함유하는 배지를 제거하고, 그 후 엑센딘 4, IGF-1 및 HGF를 함유하는 배지에서 상기 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 DAPT와 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된다.
예를 들어, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포는 엑센딘 4를 함유하는 배지에서 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포를 배양함으로써, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 추가로 분화된다. 이 방법의 예는 문헌[D' Amour et al, Nature Biotechnology, 2006]에 개시된다.
만능 줄기 세포의 단리, 확장 및 배양
만능 줄기 세포의 특성화
만능 줄기 세포는 단계-특이적 배아 항원(stage-specific embryonic antigen, SSEA) 3 및 4, 및 Tra-1-60 및 Tra-1-81로 표기되는 항체를 이용하여 검출가능한 마커 중 하나 이상을 발현할 수 있다 (문헌[Thomson et al., Science 282:1145, 1998]). 시험관 내에서 만능 줄기 세포의 분화는 SSEA-4, Tra- 1-60, 및 Tra-1-81 발현(존재한다면)의 손실 및 SSEA-1의 발현 증가로 이어진다. 미분화된 만능 줄기 세포는 전형적으로 알칼라인 포스파타아제 활성을 가지며, 이 활성은 상기 세포를 4% 파라포름알데히드로 고정시키고, 이어서 제조사(미국 캘리포니아주 벌링게임 소재의 벡터 래보러토리즈(Vector Laboratories))가 설명한 바와 같이, 기질로서 벡터 레드(Vector Red)를 이용하여 현상함으로써 검출될 수 있다. 미분화된 만능 줄기 세포는 또한 전형적으로 실시간 PCR에 의해 검출할 때, Oct-4 및 TERT를 발현한다.
번식된 만능 줄기 세포의 다른 바람직한 표현형은 모든 삼배엽층의 세포, 즉, 내배엽, 중배엽 및 외배엽의 조직으로 분화하는 잠재력이다. 만능 줄기 세포의 만능성은 예를 들어, 세포를 중증 복합형 면역결핍증(severe combined immunodeficient, SCID) 생쥐내로 주사하고, 형성되는 기형종을 4% 파라포름알데히드를 이용하여 고정하고, 이어서 삼배엽층으로부터의 세포 유형의 증거에 대해 그들을 조직학적으로 조사함으로써 확인할 수 있다. 대안적으로, 만능성은 배양체(embryoid bodies)의 형성 및 삼배엽층과 관련된 마커들의 존재에 대해 배양체를 평가함으로써 결정할 수 있다.
번식된 만능 줄기 세포주는 표준 G-밴딩 기술을 이용하여 핵형을 결정하고 상응하는 영장류 종의 공개된 핵형과 비교할 수 있다. "정상 핵형"을 가진 세포를 얻는 것이 필요하며, 이는 세포가 모든 인간 염색체가 존재하며 눈에 띄게 변경되지 않은 정배수체임을 의미한다.
만능 줄기 세포의 공급원
사용될 수 있는 만능 줄기 세포의 유형은 전-배아(pre-embryonic) 조직(예를 들어, 배반포), 배아 조직, 또는 임신 동안 그러나 전형적으로 약 10-12주 임신 전일 필요는 없는 임의의 시점에 취한 태아 조직을 비롯한, 임신 후 형성된 조직으로부터 유래된 만능 세포의 확립된 주를 포함한다. 비제한적인 예로는 인간 배아 줄기 세포 또는 인간 배아 배 세포의 확립된 주, 예를 들어, 인간 배아 줄기 세포주 H1, H7, 및 H9 (위셀(WiCell))가 있다. 그러한 세포의 초기 확립 또는 안정화 동안 본 명세서의 조성물의 사용도 고려되며, 이 경우에는 공급원 세포는 공급원 조직으로부터 직접 취한 일차 만능 세포일 것이다. 영양 세포의 부재 하에서 이미 배양된 만능 줄기 세포 집단으로부터 취한 세포가 또한 적합하다. 돌연변이 인간 배아 줄기 세포주, 예를 들어, BG01v (미국 조지아주 아텐스 소재의 브레사젠(BresaGen))가 또한 적합하다.
일 실시 형태에서, 인간 배아 줄기 세포는 톰슨(Thomson) 등 (미국 특허 제5,843,780호; 문헌[Science 282:1145, 1998]; 문헌[Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff., 1998];문헌[Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 92:7844, 1995])에 개시된 바와 같이 제조된다.
만능 줄기 세포의 배양
일 실시 형태에서, 만능 줄기 세포는 전형적으로 다양한 방식으로 만능 줄기 세포를 지지하는 영양 세포층 상에서 배양된다. 대안적으로, 만능 줄기 세포는 본질적으로 영양 세포가 없지만, 그럼에도 불구하고 실질적인 분화를 거치지 않고 만능 줄기 세포의 증식을 지지하는 배양 시스템에서 배양된다. 영양세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 이전에 다른 세포 유형을 이용하여 배양함으로써 조절된 배지를 이용하여 지지된다. 대안적으로, 영양세포가 없는 배양에서 분화 없는 만능 줄기 세포의 성장은 화학적 규명 배지를 이용하여 지지된다.
예를 들어, 루비노프(Reubinoff) 등 (문헌[Nature Biotechnology 18: 399 - 404 (2000)]) 및 톰슨등 (문헌[Science 6 November 1998: Vol. 282. no. 5391, pp. 1145 - 1147])은 생쥐 배아 섬유아세포 영양 세포층을 이용하여 인간 배반포로부터 만능 줄기 세포주를 배양하는 것을 개시한다.
리차즈(Richards) 등, (문헌[Stem Cells 21: 546-556, 2003])은 인간 만능 줄기 세포 배양을 지지하는 능력에 대해 11가지 상이한 인간 성인, 태아 및 신생아 영양 세포층의 패널을 평가하였다. 리차즈 등은 "성인 피부 섬유아세포 영양세포 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포주는 인간 배아 줄기 세포 형태를 유지하며 만능으로 남아 있다"고 진술한다.
미국 특허 출원 공개 제20020072117호는 영양세포가 없는 배양에서 영장류 만능 줄기 세포의 성장을 지지하는 배지를 생성하는 세포주를 개시한다. 이용된 세포주는 배아 조직으로부터 얻어지거나 배아 줄기 세포로부터 분화된 중간엽 및 섬유아세포-유사 세포주이다. 미국 특허 출원 공개 제20020072117호는 또한 일차 영양 세포층으로서의 당해 세포주의 사용을 개시한다.
다른 예에서는, 왕(Wang) 등 (문헌[Stem Cells 23: 1221-1227, 2005])은 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 영양 세포층 상에서 인간 만능 줄기 세포의 장기 성장을 위한 방법을 개시한다.
다른 예에서는, 스토코빅(Stojkovic) 등 (문헌[Stem Cells 2005 23: 306-314, 2005])은 인간 배아 줄기 세포의 자발적 분화로부터 유래된 영양 세포 시스템을 개시한다.
추가 예에서, 미야모토(Miyamoto) 등 (문헌[Stem Cells 22: 433-440, 2004])은 인간 태반으로부터 얻은 영양 세포의 공급원을 개시한다.
아미트(Amit) 등 (문헌[Biol. Reprod 68: 2150-2156, 2003])은 인간 포피로부터 유래된 영양 세포층을 개시한다.
다른 예에서, 인준자(Inzunza) 등 (문헌[Stem Cells 23: 544-549, 2005])은 인간 출생후 포피 섬유아세포 유래의 영양 세포층을 개시한다.
미국 특허 제6642048호는 영양세포가 없는 배양에서 영장류 만능 줄기(primate pluripotent stem, pPS) 세포의 성장을 지지하는 배지 및 그러한 배지의 생성에 유용한 세포주를 개시한다. 미국 특허 제6642048호는: "본 발명은 배아 조직으로부터 얻어지거나 배아 줄기 세포로부터 분화된 중간엽 및 섬유아세포-유사 세포주를 포함한다. 그러한 세포주를 유도하고, 배지를 가공하고, 조절된 배지를 이용하여 줄기 세포를 성장시키는 방법이 이 개시 내용에 기재되고 예시된다."라고 진술한다.
다른 예에서, 국제특허 공개 WO2005014799호는 포유류 세포의 유지, 증식 및 분화를 위한 조절된 배지를 개시한다. 국제특허 공개 WO2005014799호는 "본 발명에 따라 생성된 배양 배지는 쥐과 세포, 특히 MMH(Met 쥐과 간세포(Met Murine Hepatocyte))로 불리는, 분화되고 불멸화된 트랜스제닉(transgenic) 간세포의 세포 분비 활성에 의해 조절된다"고 진술한다.
다른 예에서, 수(Xu) 등 (문헌[Stem Cells 22: 972-980, 2004])은 인간 텔로머라아제 역전사효소를 과다 발현하도록 유전적으로 변형된 인간 배아 줄기 세포 유도체로부터 얻은 조절된 배지를 개시한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20070010011호는 만능 줄기 세포의 유지를 위한 화학적으로 규명된 배양 배지를 개시한다.
대안적인 배양 시스템은 배아 줄기 세포의 증식을 촉진할 수 있는 성장 인자로 보충된 무-혈청 배지를 이용한다. 예를 들어, 천(Cheon) 등 (문헌[BioReprod DOI:10.1095/biolreprod.105.046870, October 19, 2005])은 배아 줄기 세포 자가-재생을 일으킬 수 있는 상이한 성장 인자로 보충된 비조절된 혈청 대체(serum replacement, SR) 배지에서 배아 줄기 세포가 유지되는 영양세포가 없는 무-혈청 배양 시스템을 개시한다.
다른 예에서, 레벤스타인(Levenstein) 등 (문헌[Stem Cells 24: 568-574, 2006])은 bFGF로 보충된 배지를 이용하여, 섬유아세포 또는 조절된 배지의 부재 하에서 인간 배아 줄기 세포의 장기 배양을 위한 방법을 개시한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050148070호는 혈청 없이 그리고 섬유아세포 영양 세포 없이 규명된 배지에서 인간 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 개시하며, 이 방법은 알부민, 아미노산, 비타민, 미네랄, 적어도 하나의 트랜스페린 또는 트랜스페린 대체물, 적어도 하나의 인슐린 또는 인슐린 대체물을 함유한 배양 배지에서 줄기 세포를 배양하는 단계를 포함하며, 상기 배양 배지는 본질적으로 포유류 태아 혈청이 없으며 적어도 약 100 ng/mL의, 섬유아세포 성장 인자 시그널링 수용체를 활성화시킬 수 있는 섬유아세포 성장 인자를 함유하며, 여기서 성장 인자는 단지 섬유아세포 영양 세포층 이외의 공급원으로부터 공급되며, 배지는 영양 세포 또는 조절된 배지 없이 미분화된 상태로 줄기 세포의 증식을 지지한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050233446호는 미분화 영장류 원시 줄기 세포를 비롯한 줄기 세포를 배양하는 데 유용한 규명된 배지를 개시한다. 용액에서, 배지는 배양되는 줄기 세포와 비교할 때 사실상 등장성이다. 주어진 배양물에서, 특정 배지는 기본 배지 및 원시 줄기 세포의 사실상 미분화된 성장을 지지하는 데 필요한 양의 bFGF, 인슐린 및 아스코르브산 각각을 포함한다.
다른 예에서, 미국 특허 제6800480호는 "일 실시 형태에서, 사실상 미분화된 상태의 영장류-유래 원시 줄기 세포를 성장시키기 위한 세포 배양 배지가 제공되며 이 배지는 영장류-유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하기에 효과적인 저 삼투압, 저 내독소 기본 배지를 포함한다. 기본 배지는 영장류-유래 원시 줄기 세포의 성장을 지지하기에 효과적인 영양 혈청과, 영양 세포 및 영양 세포로부터 유래된 세포외 매트릭스 성분으로 이루어진 군으로부터 선택된 기질과 조합된다. 배지는 추가로 비필수 아미노산, 산화방지제, 및 뉴클레오시드와 피루베이트염으로 이루어진 군으로부터 선택된 제1 성장 인자를 포함한다. "고 서술한다.
다른 예에서, 미국 특허 출원 공개 제20050244962호는 "일 태양에서 본 발명은 영장류 배아 줄기 세포를 배양하는 방법을 제공한다. 본질적으로 포유류 태아 혈청이 없는(바람직하게는 또한 본질적으로 임의의 동물 혈청이 없는) 배지에서 그리고 단지 섬유아세포 영양 세포층 이외의 공급원으로부터 공급된 섬유아세포 성장 인자의 존재 하에서 줄기 세포를 배양한다. 바람직한 형태에서, 이전에는 줄기 세포 배양을 지속하기 위해 필요했던 섬유아세포 영양세포층이 충분한 섬유아세포 성장 인자의 첨가에 의해 불필요해지게 된다."라고 진술한다.
추가의 예에서, 국제특허 공개 WO2005065354호는 본질적으로 영양세포가 없는 그리고 무혈청인 규명된 등장성 배양 배지를 개시하며, 이 배지는 a. 기본 배지; b. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 bFGF; c. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 인슐린; 및 d. 사실상 미분화된 포유류 줄기 세포의 성장을 지지하기에 충분한 양의 아스코르브산을 포함한다.
다른 예에서, 국제특허 공개 WO2005086845호는 미분화 줄기 세포의 유지 방법을 개시하며, 상기 방법은 원하는 결과를 성취하기에 충분한 시간 동안 미분화 상태의 세포를 유지하기에 충분한 양의 형질전환 성장 인자-베타(transforming growth factor-beta, TGFβ) 패밀리 단백질의 구성원, 섬유아세포 성장 인자(FGF) 패밀리 단백질의 구성원, 또는 니코틴아미드(NIC)에 줄기 세포를 노출시키는 것을 포함한다.
만능 줄기 세포는 적합한 배양 기재 상에 도말될 수 있다. 일 실시 형태에서, 적합한 배양 기재는 세포외 매트릭스 성분, 예를 들어, 기저막에서 유래되거나 또는 부착 분자 수용체-리간드 커플링의 일부를 형성할 수 있는 것들이다. 일 실시 형태에서, 적합한 배양 기재는 매트리젤(등록상표)(벡톤 디켄슨)이다. 매트리젤(등록상표)은 실온에서 젤화하여 재구성된 기저막을 형성하는 엔젤브레스-홈-스왐 종양 세포 유래의 용해성 제제이다.
다른 세포외 매트릭스 성분 및 성분 혼합물이 대안으로서 적합하다. 증식되는 세포 유형에 따라, 이것은 라미닌, 피브로넥틴, 젤라틴, 프로테오글리칸, 엔탁틴, 헤파란 설페이트 등을 단독으로 또는 다양한 조합으로 포함할 수 있다.
만능 줄기 세포는 적합한 분포로 그리고 세포 생존, 번식, 및 바람직한 특징의 보유를 촉진하는 배지의 존재 하에서 기재상에 도말될 수 있다. 모든 이들 특징들은 접종 분포에 대해 신중한 주의를 기울이는 것으로부터 이익을 얻으며 당업자에 의해 쉽게 결정될 수 있다.
적합한 배양 배지는 하기 성분들, 예를 들어, 둘베코 변형 이글 배지(Dulbecco's modified Eagle's medium)(DMEM), 깁코(Gibco) # 11965-092; 넉아웃(Knockout) 둘베코 변형 이글 배지 (KO DMEM), 깁코 # 10829-018; 햄(Ham's) F12/50% DMEM 기본 배지; 200 mM L-글루타민, 깁코 # 15039-027; 비-필수 아미노산 용액, 깁코 11140-050; β-메르캅토에탄올, 시그마(Sigma) # M7522; 인간 재조합 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF), 깁코 # 13256-029로부터 제조될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에 의해 추가로 설명되지만, 이에 의해 제한되지는 않는다.
[실시예]
실시예 1
인간 췌장 세포주의 확립
췌장 준비 - 임상적 이식에 적합하지 않은 인간 췌장을 연구 용도를 위한 적절한 동의 후, 더 내셔널 디지즈 리서치 인터체인지(The National Disease Research Interchange) (미국 펜실베니아주 필라델피아)로부터 입수하였다. 췌장을 기관 보존 용액과 함께 얼음 위의 스테인레스강 팬으로 옮기고 모든 무관한 조직을 제거해냈다. 췌장관에 18 게이지 카테터를 삽관하고, 리버라아제 HI ™ 효소 (로쉐 - 0.5 ㎎/㎖) 및 DNase I (0.2 ㎎/㎖) - 둘베코 인산염 완충 염수(Dulbecco's Phosphate Buffered Saline, DPBS)에 용해시킴- 을 포함하는 효소 용액을 췌장에 주입하였다.
신속한 기계적 분리에 이은 효소적 소화 - 효소 주입된 췌장을 조직 처리기에서 균질화하고, 펄스 당 3-5초 동안 3-5회 펄싱하고, 분리된 조직을 자기 교반 막대를 포함하는 2개의 500 ㎖ 트립신 처리 플라스크 (벨코(Bellco))로 옮겼다. 그 후, 50-100 ㎖의 효소 용액을 각각의 플라스크에 첨가하였다. 플라스크를 잠수 교반 플레이트 상의 37℃ 수조 내에 두고, 중간 교반 속도를 이용하여 10분 동안 인큐베이션하였다. 교반을 중단하고, 미세한 소화된 조직을 플라스크로부터 제거하고, 4℃에서 DPBS, 5% 소과 태아 혈청(FBS) 및 0.1 ㎎/㎖ DNase I (DPBS+)을 포함하는 250 ㎖ 튜브 내로 옮겨 소화 과정을 켄칭시켰다. 플라스크를 50-100 ㎖의 효소 용액으로 채우고, 수조로 되돌리고, 교반을 추가로 10분 동안 재개시하였다. 다시, 플라스크를 꺼내고, 미세한 소화물을 수집하고, 얼음 위의 250 ㎖ 튜브로 옮겼다. 췌장이 완전히 소화될 때까지 이 과정을 추가로 3-5회 반복하였다.
효소적 소화와 동시에 점진적인 기계적 분리 - 효소 주입된 췌장을 문헌[Diabetes 37:413-420 (1988)]에 설명된 방법에 따라 처리하였다. 요약하면, 췌장에서 무관한 조직을 제거하고, 상기에 설명한 바와 같이 췌장에 효소 용액을 주입하였다. 이어서, 췌장을 비드를 포함하는 리코디 챔버(Ricordi Chamber) 내에 두고, 보다 큰 조직 클러스터를 보유하도록 400-600 ㎛의 메시 크기를 갖는 스크린으로 덮었다. 챔버를 덮고, 효소 용액을 대략 37℃에서 챔버에 순환시키고, 챔버를 진탕시켜, 비드가 췌장 조직을 파괴하도록 하는 한편 효소가 췌장을 소화시키도록 하였다. 일단 적당한 분리 및 소화가 달성되었으면, 소화를 종료시키고, 조직을 수집하였다.
조직 분리 - 수집된 조직을 4℃에서 5분 동안 150 x g에서 원심분리하였다. 상청액을 흡인하고, 조직을 DPBS+에서 추가로 2회 세척하였다. 마지막 세척 후, 조직을 정제를 위하여 불연속 구배에 적용하였다. 소화된 조직을 10 ㎖의 폴리수크로스(미국 버지니아주 소재의 메디아테크(Mediatech)) 용액 당 1-2 ㎖의 조직 펠렛의 비로 1.108 g/㎖의 밀도를 갖는 폴리수크로스에 현탁시켰다. 이어서, 조직 현탁물을 둥근 바닥 폴리카르보네이트 원심분리 튜브로 옮기고, 1.096 및 1.037의 밀도를 갖는 폴리수크로스 용액을 튜브에 조심스럽게 적용하였다. 최종 DMEM 층이 불연속 정제 구배를 완성하였다. 구배 튜브를 브레이크를 전혀 적용하지 않고서 4℃에서 20분 동안 2000 rpm에서 원심분리하였다. 원심분리 후, 조직을 각각의 계면 (3개의 계면)으로부터 수집하고, 상기에 설명한 바와 같이 DPBS+에서 수회 세척하고, 50 ㎖ 시험 튜브에 수집하였다.
추가적인 세포 클러스터 분리 - 선택적으로, 상기 프로토콜을 이용하여 얻어진 큰 세포 클러스터를 보다 작은 클러스터 또는 단일 세포 현탁물로 추가로 분리할 수 있다. 최종 세척 후, 각각의 분획물로부터의 조직을 200U/㎖ DNase I을 포함하는 10 ㎖ 1X 트립신/EDTA 용액에 현탁시켰다. 튜브를 수조 내에 두고, 거의 단일한 세포의 현탁물이 달성될 때까지 5-6분 동안 10 ㎖ 일회용 피펫으로부터 반복적으로 흡인 및 배출하였다. 4℃ DPBS+를 첨가하여 소화를 켄칭하고, 튜브를 800 rpm에서 5분 동안 원심분리하였다. 세포 현탁물을 DPBS+로 세척하고 하기에 설명하는 바와 같이 배양하였다.
췌장 세포 배양 - 최종 세척 후, 각각의 계면으로부터의 세포를 DMEM, 2% FBS, 100 U/ ㎍ 페니실린/스트렙토마이신, ITS, 2 mM L-글루타민, 0.0165 mM ZnSO4 (시그마), 및 0.38 μM 2-메르캅토에탄올 (미국 캘리포니아 소재의 인비트로겐(Invitrogen)) (이하, "선발 배지")에 재현탁시켰다. 6 ㎖의 세포 현탁물을 T-25 조직 배양 플라스크에 접종하고, 12 ㎖의 세포 현탁물을 T-75 플라스크 내에 접종하였다. 플라스크를 5% CO2를 포함하는 37℃ 인큐베이터 내에 두었다. 2-4주의 배양 후, 완전 배지 교환을 실시하고, 5% FBS (미국 유타주 소재의 하이클론(HyClone)), 1% P/S, 0.0165 mM ZnSO4를 포함하는 DMEM (2750 ㎎/L D-글루코스, 862 ㎎/L 글루타민) (미국 캘리포니아주 소재의 깁코) (이하, "성장 배지")에서의 배양으로 부착성 세포를 되돌리고, 거의 융합에 도달되게 하고 (이 단계를 "계대 0" 또는 "P0"으로 지칭함), 이 시점에서 세포를 계대하였다. 세포를 성장 배지에서 5000개의 세포/㎠로 후속적으로 배양하였다. 배양물을 대략 70-90% 융합성으로 매 7-10일마다 계대하였다. 기질 세포를 정제 구배 후에 존재하는 3개의 분획물 각각으로부터 단리하였음을 나타내었다.
실시예 2
기질 췌장 세포의 배양
실시예 1에 따라 단리한 췌장 세포를 저산소 조건 (5% CO2, 3% O2, 및 92% N2) 또는 정상산소 조건 (5% CO2, 20% O2, 및 75% N2) 하에서 선발 배지에서 2-4주 동안 배양하였다. 이어서, 배양물을 성장 배지로 스위칭하고 주당 2 내지 3회 공급하였다. 초기 배양 기간 후, 부착성 세포가 저산소 및 정상산소 조건 하에 배양된 플레이트에서 관찰되었다. 더욱이, 초기 2-4주의 배양 후, 플레이트에는 췌도-유사 또는 췌도관 구조체가 거의 남아있지 않았다.
실시예 3
영양 세포층 상에서 배양한 만능 줄기 세포에서의 분화와 관련된 유전자의 발현
인간 배아 줄기 세포주 H9는 위셀 리서치 인스티튜트, 인크.(미국 위스콘신주 매디슨)로부터 입수하였으며 공급처인 상기 인스티튜트에 의해 제공된 설명서에 따라 배양하였다. 불활성화된 일차 생쥐 배아 섬유아세포(MEF) 상에 유지된 미분화 H9 인간 배아 줄기 세포를, 60% FBS, 20% DMSO, 및 20% DMEM/F12 (인비트로겐/깁코) - 20% 넉아웃(knockout) 혈청 대체물로 보충됨 -, 100 nM MEM 비필수 아미노산, 0.5 mM 베타-메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민 - 4 ng/㎖ 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 포함함 - (모두 인비트로겐/깁코로부터 입수)에서 -1℃/분의 속도로 동결보존하여 증기상 질소에서 보관하였다. 세포를 해동하고, 52,000개의 세포/㎠의 밀도로 접종된 마이토사이신 c 처리된 D551 인간 피부 섬유아세포 상에 도말하였다. D551 세포 상에서의 3회의 계대 후, 만능 세포를 수확하고, 이어서 8 ng/㎖ bFGF가 보충된, 불활성화 MEF의 배양물로부터의 조절 배지 중 매트리젤 상으로 옮겼다. 매트리젤 (1:30) 상에 도말된 인간 배아 줄기 세포를 60 ㎜ 조직 배양 플레이트에서, 가습된 조직 배양 인큐베이터 내에서 5% CO2의 분위기에서 37℃에서 배양하였다. 융합성일 때 (도말 후 대략 5-7일), 인간 배아 줄기 세포를 1 ㎎/㎖의 디스파아제 (인비트로겐/깁코)로 25-40분 동안 처리하였다. 일단 세포가 플레이트로부터 유리되면, 원하는 콜로니 크기가 달성될 때까지 세포를 2 ㎖ 일회용 피펫으로 반복적으로 피펫팅하였다. 세포를 5분 동안 1000 rpm에서 회전시키고, 펠렛을 재현탁시키고 신선한 배양 배지 중 1:3 내지 1:4 비의 세포로 매트리젤 코팅된 세포 배양 플레이트 상에 도말하였다. 매트리젤 상에서의 5 내지 10회의 계대 후, 만능 H9 세포를 많은 상이한 영양 세포로 옮겼다. 요약하면, 조직 배양용의 처리된 6웰 플레이트에서 20% 넉아웃 혈청 대체물로 보충된 DMEM/F12 (인비트로겐/깁코), 100 nM MEM 비필수 아미노산, 0.5 mM 베타-메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민 - 4 ng/㎖ 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 포함함 - (모두 인비트로겐/깁코로부터 입수)으로 이루어진 ES 세포 배지에서 세포를 배양하였다. 0.1% 젤라틴 (시그마)으로 코팅하고, 영양 세포의 접종 이전에 최소 4시간 동안 37℃에서 인큐베이팅함으로써 플레이트를 준비한다. 접종 직전에, 젤라틴을 흡인하고, 영양 세포 현탁물을 6웰 플레이트의 각각의 웰에 전달하였다. 분화 프로토콜의 개시 이전에 세포를 5일 동안 확장시켰다.
인간 피부 섬유아세포주 D551 (ATCC 번호 CCL-110), 인간 포피 섬유아세포주 Hs27 (ATCC 번호 CRL-1634), 및 인간 췌장-유래 기질 세포주 (국제특허 공개 WO2006094286호에 개시됨)가 만능성을 유지하는 능력을 평가하였다. D551 인간 영양 세포를 10% FBS가 보충된 EMEM (ATCC 30-2003)에서 배양하였다. 일단 융합성으로 되면, 세포를 마이토마이신-C 처리에 의해 불활성화시키고, EMEM, 10% FBS, 및 5% DMSO에서 -1℃/분의 속도로 동결보존하고, 증기상 질소에서 보관하였다. 세포를 37℃에서 해동하고, 젤라틴-코팅된 조직 배양 플레이트 상에 10% FBS를 포함하는 EMEM 중에 52,000/㎠로 접종하였다. Hs27 인간 영양 세포를 10% FBS가 보충된 DMEM (ATCC 30-2002)에서 배양하였다. 일단 융합성으로 되면, 세포를 마이토마이신-C 처리에 의해 불활성화시키고, DMEM, 10% FBS, 및 5% DMSO에서 -1℃/분의 속도로 동결보존하고, 증기상 질소에서 보관하였다. 세포를 37℃에서 해동하고, 젤라틴-코팅된 조직 배양 플레이트 상에 10% FBS를 포함하는 DMEM 중에 55,000/㎠로 접종하였다. 인간 췌장-유래 기질 세포주를 융합성으로 될 때까지 DMEM 및 10% FBS에서 배양하고 마이토마이신 C로 처리하였다. 세포를 -1℃/min 속도로 90% FBS와 10% DMSO에서 동결보존하고, 증기상 질소에서 보관하였다. 세포를 37℃에서 해동하고, 젤라틴-코팅된 조직 배양 플레이트 상에 10% FBS를 포함하는 DMEM 중에 43,000/㎠로 접종하였다. 구매가능한 생쥐 배아 섬유아세포 (MEFSM) 및 새로 유도된 생쥐 배아 섬유아세포 (MEF) 상에 도말된 인간 배아 줄기 세포의 배양물을 대조군으로 포함시켰다.
불활성화된 인간 영양 세포의 플레이트를 PBS로 세척하고 ES 배지 중의 배아 줄기 세포를 접종하였다. 배아 줄기 세포를 5일 동안 인간 영양 세포층 상에서 배양하였다. 이 기간 후, 생쥐 배아 섬유아세포 (MEF, 도 1), 구매가능한 생쥐 배아 섬유아세포 (MEF-SM, 도 1), 인간 피부 섬유아세포 (D551, 도 1), 인간 포피 섬유아세포 (Hs27, 도 1), 및 국제특허 공개 WO2006094286호에 개시된 인간 췌장-유래 기질 세포주 (HP, 도 1) 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포로부터 CXCR4, Sox-17, Fox-A2, HNF-4a, HNF-6 및 AFP의 발현을 실시간 PCR에 의해 결정하였다. 대표적인 실험으로부터의 결과가 도 1에 나타난다. 결과는 매트리젤 (Off MG, 도 1) 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포에 대해 정상화시켰다. CXCR4, Sox-17, Fox-A2, HNF-4a, HNF-6 및 AFP는 분화와 관련된 마커이다. 인간 영양 세포층에서 인간 배아 줄기 세포의 배양은 이들 마커의 발현을 감소시켰다. 이들 데이타는 인간 피부 섬유아세포주 D551, 인간 포피 섬유아세포 Hs27, 및 국제특허 공개 WO2006094286호에 개시된 인간 췌장-유래 기질 세포주가 인간 배아 줄기 세포의 만능성을 유지함을 시사한다.
실시예 4
인간 영양 세포층 상에서 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 인간 배아 줄기 세포의 분화.
인간 배아 줄기 세포주 H1 및 H9를 위셀 리서치 인스티튜트, 인크 (미국 위스콘신주 매디슨)로부터 입수하였으며 공급처인 상기 인스티튜트에 의해 제공된 설명서에 따라 배양하였다. 불활성화된 일차 생쥐 배아 섬유아세포(MEF) 상에 유지된 미분화 H1 및 H9 인간 배아 줄기 세포를, 60% FBS, 20% DMSO, 및 20% DMEM/F12 (인비트로겐/깁코) - 20% 넉아웃(knockout) 혈청 대체물로 보충됨 -, 100 nM MEM 비필수 아미노산, 0.5 mM 베타메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민 - 4 ng/㎖ 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 포함함 - (모두 인비트로겐/깁코로부터 입수)에서 -1℃/분의 속도로 동결보존하여 증기상 질소에서 보관하였다. 세포를 해동하고, 52,000개의 세포/㎠의 밀도로 접종된 마이토사이신 C 처리된 D551 인간 피부 섬유아세포 상에 도말하였다. D551 세포 상에서의 3회의 계대 후, 만능 세포를 수확하고, 이어서 8 ng/㎖ bFGF가 보충된, 불활성화 MEF의 배양물로부터의 조절 배지 중 매트리젤 상으로 옮겼다. 매트리젤 (1:30) 상에 도말된 인간 배아 줄기 세포를 60 ㎜ 조직 배양 플레이트에서, 가습된 조직 배양 인큐베이터 내에서 5% CO2의 분위기에서 37℃에서 배양하였다. 융합성일 때(도말 후 대략 5-7일), 인간 배아 줄기 세포를 1 ㎎/㎖ 디스파아제(인비트로겐/깁코)로 25-40분 동안 처리하였다. 일단 세포가 플레이트로부터 유리되면, 원하는 콜로니 크기가 달성될 때까지 세포를 2 ㎖ 일회용 피펫으로 반복적으로 피펫팅하였다. 세포를 5분 동안 1000 rpm에서 회전시키고, 펠렛을 재현탁시키고 신선한 배양 배지 중 1:3 내지 1:4 비의 세포로 매트리젤 코팅된 세포 배양 플레이트 상에 도말하였다. 매트리젤 상에서의 11회 계대 후, 만능 H1 H9 세포를 후술하는 바와 같이 많은 상이한 영양 세포로 옮겼다. 요약하면, 조직 배양용의 처리된 6웰 플레이트에서 20% 넉아웃 혈청 대체물로 보충된 DMEM/F12 (인비트로겐/깁코), 100 nM MEM 비필수 아미노산, 0.5 mM 베타-메르캅토에탄올, 2 mM L-글루타민 - 4 ng/mL 인간 염기성 섬유아세포 성장 인자(bFGF)를 포함함 - (모두 인비트로겐/깁코로부터 입수)으로 이루어진 ES 세포 배지에서 영양 세포 상에서 세포를 배양하였다. 0.1 젤라틴 (시그마)으로 코팅하고 영양세포 접종 이전에 최소 4시간 동안 37℃에서 인큐베이팅함으로써 플레이트를 준비한다. 접종 직전에, 젤라틴을 흡인하고, 영양 세포 현탁물을 6웰 플레이트의 각각의 웰에 전달하였다. 분화 프로토콜의 개시 이전에 세포를 5일 동안 확장시켰다.
인간 영양 세포층이 인간 배아 줄기 세포의 분화를 지지하는 능력을 평가하였다. 배아 줄기 세포를 마이토마이신 C 불활성화 인간 영양 세포층 상에서 5일 동안 배양하였다. 구매가능한 생쥐 배아 섬유아세포 (MEF-SM), 및 새로 유도된 생쥐 배아 섬유아세포 (MEF) 상에 도말된 인간 배아 줄기 세포의 배양물을 대조군으로 포함시켰다.
인간 피부 섬유아세포 (D551, 도 2 및 5), 인간 포피 섬유아세포 (HS27, 도 2 및 5), 및 국제특허 공개 WO2006094286호에 개시된 인간 췌장-유래 기질 세포주 (HP, 도 2 및 5)가 인간 배아 줄기 세포주 H9 (도 2) 및 H1 (도 5) 집단의 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 분화를 지지하는 능력을 평가하였다. 구매가능한 생쥐 배아 섬유아세포 (MEF-SM, 도 2 및 5), 및 새로 유도된 생쥐 배아 섬유아세포 (MEF, 도 2 및 5) 상에서 배양된 배아 줄기 세포 집단을 대조군으로 포함시켰다. 액티빈 A (100ng/㎖)를 영양 세포층 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포 집단에 첨가하였다. 액티빈 A의 존재 하에서 세포를 연속하여 배양하고 3일 후 수확하였다. 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커의 발현 수준을 실시간 PCR에 의해 분석하였다(도 2 및 5). 도 2 및 5에 나타난 결과를 분화 프로토콜의 시작 전에 당해 세포에 대하여 정상화시킨다 (D0).
액티빈 A는 생쥐 배아 섬유아세포와 인간 영양 세포층 상에서 배양된 세포에서 CXCR4, Sox-17 및 Fox-A2의 발현 증가를 야기하였다. 이들 데이터는 인간 영양 세포층이 인간 배아 줄기 세포의 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로의 분화를 지지할 수 있음을 시사한다.
인간 피부 섬유아세포 (D551, 도 3 및 6), 인간 포피 섬유아세포 (HS27, 도 3 및 6), 및 국제특허 공개 WO2006094286호에 개시된 인간 췌장-유래 기질 세포주(HP, 도 3 및 6)가, 인간 배아 줄기 세포주 H9 (도 3) 및 H1 (도 6) 집단으로부터 유래된, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포 집단이 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화하는 것을 지지하는 능력을 평가하였다. 구매가능한 생쥐 배아 섬유아세포 (MEF-SM, 도 3 및 6), 및 새로 유도된 생쥐 배아 섬유아세포 (MEF, 도 3 및 6) 상에서 배양된 배아 줄기 세포 집단을 대조군으로 포함시켰다. 1 μM 레틴산, 0.25 uM KAAD-사이클로파민 및 FGF-10 (50ng/㎖)을 영양 세포층 상에서 배양된 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된, 완성 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포 집단에 첨가하였다. 세포를 8일 후 수확하였다. 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커의 발현 수준을 실시간 PCR에 의해 분석하였다(도 3 및 6). 도 3 및 6에 나타난 결과를 D0 유전자 발현에 대해 정상화시킨다.
레틴산 0.25 μM KAAD 사이클로파민, 및 FGF-10 처리는 생쥐 배아 섬유아세포, 및 인간 영양 세포층 상에서 배양된 세포에서 Fox-A2, HNF-4a, HNF-6 및 PDX-1의 발현 증가를 야기하였다. 이들 데이터는 인간 영양 세포층이, 인간 배아 줄기 세포주 H9(도 3) 및 H1(도 6) 집단으로부터 유래된, 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포가 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화하는 것을 지지할 수 있음을 시사한다.
인간 피부 섬유아세포 (D551, 도 4 및 7), 인간 포피 섬유아세포 (HS27, 도 4 및 7), 및 국제특허 공개 WO2006094286 호에 개시된 인간 췌장-유래 기질 세포주 (HP, 도 4 및 7)가, 인간 배아 줄기 세포주 H9(도 4) 및 H1(도 7) 집단으로부터 유래된 체장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포 집단이 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화하는 것을 지지하는 능력을 평가하였다. 구매가능한 생쥐 배아 섬유아세포 (MEF-SM, 도 4 및 7), 및 새로 유도된 생쥐 배아 섬유아세포 (MEF, 도 4 및 7) 상에서 배양된 배아 줄기 세포 집단을 대조군으로 포함시켰다. 1 μM의 γ-시크리타아제 억제제 DAPT, 엑센딘-4, IGF-1 및 HGF (모두 50 ng/㎖)를 영양 세포층에서 배양된 인간 배아 줄기 세포로부터 유래된 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포 집단에 첨가하였다. 9일의 배양 후, 췌장 내분비 세포의 특징적인 마커의 발현 수준을 실시간 PCR로 분석하였다(도 4 및 7). 도 4 및 7에 나타난 결과를 D0 유전자 발현에 대해 정상화시킨다.
γ-시크리타아제 억제제, 엑센딘-4, IGF-1 및 HGF 처리는 생쥐 배아 섬유아세포 및 인간 영양 세포층 상에서 배양된 세포에서, Fox-A2, HNF-4a, HNF-6, neuro-D1, Nkx2.2, Pax-4, Nkx6.1, PDX-1, 글루카곤 및 인슐린의 발현 증가를 야기하였다. 이들 데이터는 인간 영양 세포층이, 인간 배아 줄기 세포주 H9(도 3) 및 H1(도 6) 집단으로부터 유래된, 췌장 내분비 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포 집단이 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화하는 것을 지지할 수 있음을 시사한다. 인슐린 및 글루카곤의 발현은 생쥐 영양 세포층에서보다 인간 영양 세포층 상에서 배양된 세포에서 더 높았다. 이들 데이터는 인간 영양 세포층이 인간 배아 줄기 세포의 분화를 더 잘 지지할 수 있음을 시사한다.
본 명세서 전체에 걸쳐 인용된 간행물은 본 명세서에 전체적으로 참고로 포함된다. 본 발명의 다양한 태양이 실시예와 바람직한 실시 형태를 참고로 하여 상기에서 예시되었지만, 본 발명의 범주는 전술한 상세한 설명에 의해서가 아니라 특허법의 원리하에서 적절하게 해석되는 하기 특허청구범위에 의해 규정됨이 이해될 것이다.

Claims (16)

  1. a. 만능 줄기 세포(pluripotent stem cell)를 배양하는 단계,
    b. 만능 줄기 세포를 인간 영양 세포층(feeder cell layer) 상에 도말하는 단계, 및
    c. 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 적어도 하나의 인자로 만능 줄기 세포를 처리하는 단계를 포함하는, 만능 줄기 세포를 분화시키는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 인간 영양 세포층이 피부 섬유아세포를 포함하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 인간 영양 세포층이 포피 섬유아세포를 포함하는 방법.
  4. 제1항에 있어서, 인간 영양 세포층이 췌장-유래된 기질 세포를 포함하는 방법.
  5. 제1항에 있어서, 만능 줄기 세포가 배아 줄기 세포인 방법.
  6. 제5항에 있어서, 배아 줄기 세포가 인간 배아 줄기 세포인 방법.
  7. 제4항에 있어서, 췌장-유래된 기질 세포는 NCAM, ABCG2, 사이토케라틴 7, 사이토케라틴 8, 사이토케라틴 18 및 사이토케라틴 19로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 단백질 마커의 발현에 있어서 실질적으로 음성인 방법.
  8. 제4항에 있어서, 췌장-유래된 기질 세포는 CD44, CD73, CD90 및 CD105로 이루어진 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 단백질 마커의 발현에 있어서 실질적으로 양성인 방법.
  9. 제1항에 있어서, 만능 줄기 세포를 완성 내배엽 계통(definitive endoderm lineage)의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 방법.
  10. 제1항에 있어서, 만능 줄기 세포를 췌장 내배엽 계통의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 방법.
  11. 제1항에 있어서, 만능 줄기 세포를 췌장 내분비 계통(pancreatic endocrine lineage)의 특징적인 마커를 발현하는 세포로 분화시키는 방법.
  12. 제1항에 있어서, 만능 줄기 세포의 배양 단계를 세포외 매트릭스 상에서 성취하는 방법.
  13. 제1항에 있어서, 만능 줄기 세포의 배양 단계를 인간 영양 세포층 상에서 성취하는 방법.
  14. a. 만능 줄기 세포를 배양하는 단계,
    b. 만능 줄기 세포를 인간 영양 세포층 상에 도말하는 단계,
    c. 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 적어도 하나의 인자로 만능 줄기 세포를 처리하는 단계, 및
    d. 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 적어도 하나의 인자로 처리된 만능 줄기 세포를 당뇨병에 걸린 인간 환자 내에 이식하는 단계를 포함하는, 당뇨병을 치료하는 방법.
  15. 제14항에 있어서, 만능 줄기 세포의 분화를 촉진하는 적어도 하나의 인자로 만능 줄기 세포를 처리하는 단계는 만능 줄기 세포의 췌장 내분비 계통의 세포로의 분화를 야기하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 만능 줄기 세포의 분화는 2 이상의 단계로 성취되며, 각각의 단계는 완성 내배엽, 췌장 내배엽, 및 췌장 내분비 계통 중 하나 이상으로 세포가 분화하는 것을 촉진하는 적어도 하나의 인자로 세포를 처리하는 것을 필요로 하는 방법.
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