JP2010535035A - ヒトフィーダー細胞を用いた多能性幹細胞の分化 - Google Patents

Abstract

本発明は、多能性幹細胞分化の分野に関するものである。本発明は、ヒトフィーダー細胞層における多能性幹細胞の分化のための方法を提供する。特に本発明は、ヒトフィーダー細胞層を用いて多能性幹細胞を膵内分泌細胞に分化させるための改善された方法を提供する。

Description

開示の内容

〔技術分野〕
本発明は、多能性幹細胞分化の分野に関するものである。本発明は、ヒトフィーダー細胞層における多能性幹細胞の分化のための方法を提供する。特に本発明は、ヒトフィーダー細胞層を用いて多能性幹細胞を膵内分泌細胞に分化させるための改善された方法を提供する。

〔背景技術〕
多能性幹細胞、例えば胚幹細胞などは、あらゆる成体細胞種に分化する能力を有している。この胚幹細胞は、疾患、感染症、又は先天性異常の結果損傷した器官の、細胞及び組織の移植源となり得る。移植細胞源として利用する胚幹細胞の可能性は、胚幹細胞が目的の細胞種に効果的に分化する際の問題によって制限される。

１つの例として、ホリ（Hori）ら（ＰＮＡＳ ９９：１６１０５、２００２年）は、β細胞に似たホスホイノシチド３−キナーゼ（ＬＹ２９４００２）産生細胞の阻害剤で、マウス胚幹細胞を処理することを開示している。

別の例において、ブリスチュック（Blyszczuk）ら（ＰＮＡＳ １００：９９８、２００３年）は、Ｐａｘ４を構成的に発現するマウス胚幹細胞からインスリン産生細胞を発生させることを報告している。

ミカレフ（Micallef）らは、レチノイン酸が、Ｐｄｘ１陽性膵内胚葉を形成する胚幹細胞の関与を調節できることを報告している（Ｄｉａｂｅｔｅｓ ５４：３０１、２００５年）。

スカウディ（Skoudy）らは、アクチビンＡ（ＴＧＦβスーパーファミリーのメンバー）が、マウス胚幹細胞において、膵外分泌遺伝子の発現（ｐ４８及びアミラーゼ）並びに膵内分泌遺伝子の発現（Ｐｄｘ１、インスリン、及びグルカゴン）を増加させることを報告している（Ｂｉｏｃｈｅｍ．Ｊ．３７９：７４９、２００４年）。

シラキ（Shiraki）らは、胚幹細胞のＰｄｘ１陽性細胞への分化を特に強化する増殖因子の影響を研究した。これによると、ＴＧＦβ２はより高い割合のＰｄｘ１陽性細胞を良好な再現性で産生していることが観察された（Ｇｅｎｅｓ Ｃｅｌｌｓ．２００５年６月；１０（６）：５０３〜１６．）。

ゴードン（Gordon）らは、血清がなく、Ｗｎｔ信号阻害物質と共にアクチビンが存在する状態において、マウス胚幹細胞からブラキュリ（brachyury）^＋／ＨＮＦ−３ベータ^＋内胚葉細胞への誘導が起こることを示した（米国特許第２００６／０００３４４６Ａ１号）。

ゴードン（Gordon）ら（ＰＮＡＳ １０３：１６８０６、２００６年）は、「前原始線条の形成には、Ｗｎｔ及びＴＧＦ−ベータ／ノーダル／アクチビンの同時信号が必要である」と述べている。

トムソン（Thomson）らは、ヒト胚盤胞から胚幹細胞を分離した（Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４、１９９８年）。同時に、ゲアハート（Gearhart）とその共同研究者らは、胎児生殖腺組織からヒト胚生殖（ｈＥＧ）細胞株を誘導した（シャムブロット（Shamblott）ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：１３７２６、１９９８年）。単に白血病阻害因子（ＬＩＦ）と共に培養することによって分化を防ぐことができるマウス胚幹細胞とは異なり、ヒト胚幹細胞は、非常に特殊な条件下で管理する必要がある（米国特許第６，２００，８０６号；ＷＯ９９／２０７４１号；ＷＯ０１／５１６１６号）。

ダムール（D’Amour）らは、高濃度のアクチビン及び低濃度の血清の存在下で、ヒト胚幹細胞由来の胚体内胚葉の富化培養の産生について記述している（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２００５年）。これらの細胞をマウスの腎臓カプセル下に移植したところ、内胚葉器官の特徴を有した成熟細胞への分化が生じた。ヒト胚幹細胞由来の胚体内胚葉細胞は更に、ＦＧＦ−１０の添加後、Ｐｄｘ１陽性細胞に分化することができる（米国特許第２００５／０２６６５５４Ａ１号）。

ダムール（D’Amour）ら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ−２４、１３９２〜１４０１（２００６年））は、「我々は、ヒト胚幹（ｈＥＳ）細胞を、膵臓ホルモンのインスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵ポリペプチド及びグレリンを合成することができる内分泌細胞に変換する分化プロセスを開発した。このプロセスは、胚体内胚葉、腸管内胚葉、膵内胚葉及び内分泌前駆体が、内分泌ホルモンを発現する細胞に至る経路と同様の段階を経て、細胞を誘導することにより、生体内の膵臓器官形成を模したものである」と述べている。

別の例において、フィスク（Fisk）らは、ヒト胚幹細胞から膵島細胞を生成するためのシステムを報告している（米国特許出願公開第２００６／００４０３８７Ａ１号）。この事例では、分化経路は３段階に分かれていた。ヒト胚幹細胞は最初に、酪酸ナトリウム及びアクチビンＡの組み合わせを用いて内胚葉に分化させた。この細胞を、ノギンなどのＴＧＦβ拮抗物質を、ＥＧＦ又はベータセルリンと組み合わせて加えて培養し、Ｐｄｘ１陽性細胞を生成した。最終分化はニコチンアミドによって誘導した。

１つの例において、ベンベニストリー（Benvenistry）らは「我々は、Ｐｄｘ１の過剰発現が、膵臓性富化遺伝子の発現を強化し、インスリン発現の誘導には生体内にのみ存在する追加の信号が必要である可能性があると結論づける」と述べている（ベンベニストリー（Benvenistry）ら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００６年；２４：１９２３〜１９３０）。

別の例において、コンディー（Condie）らは「フィーダー層は、ガンマセクレターゼ又はノッチシグナリングを阻害するリガンド又はその他の化合物を含むか又は発現し、これにより、ガンマセクレターゼ又はノッチシグナリングを阻害するリガンド又はその他の化合物を含むか又は発現する多能性状態フィーダー層における多能性細胞の維持を強化し、これにより多能性状態にある多能性細胞の維持が強化される」と開示している（ＷＯ２００４０９０１１０号）。

別の例において、ミタリポーバ（Mitalipova）らは「ヒト胚幹細胞は、顆粒膜フィーダー細胞、筋細胞、卵管上皮細胞、骨髄間質細胞、及び皮膚線維芽細胞と共に培養され、その胚幹細胞は多能性表現型を維持する」と開示している（米国特許第２００５００３７４８８号）。

別の例において、シュ（Xu）らは「間葉性及び線維芽細胞様の細胞株が、胚組織から得られ、又は胚幹細胞から分化した。このような細胞株の誘導方法、培地の処理方法、及びフィーダー細胞又は条件付き培地を用いた幹細胞の増殖方法が記述される」と開示している（米国特許第２００２００７２１１７号）。

〔発明の概要〕
〔発明が解決しようとする課題〕
したがって、膵内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞、又は膵臓ホルモン分泌細胞に分化する可能性を保持しながら、現在の臨床ニーズに対処するために拡張し得る多能性幹細胞株の確立のための条件開発に対する大きなニーズがなお残っている。我々は、多能性幹細胞の膵内分泌細胞への分化の効率を高めるため、別のアプローチを用いた。

〔課題を解決するための手段〕
本発明は、多能性幹細胞分化の分野に関するものである。本発明は、ヒトフィーダー細胞層における多能性幹細胞の分化のための方法を提供する。特に本発明は、ヒトフィーダー細胞層を用いて多能性幹細胞を膵内分泌細胞に分化させるための改善された方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、多能性幹細胞の分化のための方法を提供し、その方法は：
ａ．多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．その多能性幹細胞を、ヒトフィーダー細胞層上に蒔く（Plating）工程と、
ｃ．その多能性幹細胞の分化を促進する少なくとも１つの因子で、その多能性幹細胞を処理する工程と、を含む。

ヒト胚幹細胞株Ｈ９の細胞集団（継代培養第４６代）における、分化に関するマーカーＣＸＣＲ４、Ｓｏｘ−１７、ＦｏｘＡ２、ＨＮＦ−４ａ、ＨＮＦ６及びＡＦＰの発現を示す。培養はＭＥＦ条件付きマトリゲル（MATRIGEL）培地上で行われ、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、市販のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ−ＳＭ）、ヒト皮膚線維芽細胞（Ｄ５５１）、ヒト***線維芽細胞（Ｈｓ２７）、及びヒト膵臓由来間質細胞（ＨＰ）に移された細胞と比較されている。 ヒト胚幹細胞から、胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞への分化に対する、ヒトフィーダー細胞層の影響を示す。この図は、ヒト胚幹細胞株Ｈ１の細胞集団（継代培養第４８代）が、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、市販のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ−ＳＭ）、ヒト皮膚線維芽細胞（Ｄ５５１）、ヒト***線維芽細胞（Ｈｓ２７）、及びヒト膵臓由来間質細胞（ＨＰ）で培養され、胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化した際の、リアルタイムＰＣＲで決定されたＣＸＣＲ４、Ｓｏｘ−１７、及びＦｏｘＡ２の発現を示す。 膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞の形成に対する、ヒトフィーダー細胞層の影響を示す。この図は、ヒト胚幹細胞株Ｈ１の細胞集団（継代培養第４８代）が、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、市販のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ−ＳＭ）、ヒト皮膚線維芽細胞（Ｄ５５１）、ヒト***線維芽細胞（Ｈｓ２７）、及びヒト膵臓由来間質細胞（ＨＰ）で培養され、膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化した際の、リアルタイムＰＣＲで決定されたＦｏｘＡ２、ＨＮＦ−４ａ、ＨＮＦ−６及びＰＤＸ−１の発現を示す。 膵内分泌系譜に特有のマーカーを発現する細胞の形成に対する、ヒトフィーダー細胞層の影響を示す。この図は、ヒト胚幹細胞株Ｈ１の細胞集団（継代培養第４８代）が、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、市販のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ−ＳＭ）、ヒト皮膚線維芽細胞（Ｄ５５１）、ヒト***線維芽細胞（Ｈｓ２７）、及びヒト膵臓由来間質細胞（ＨＰ）で培養され、膵内分泌系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化した際の、リアルタイムＰＣＲで決定されたＦｏｘＡ２、ＨＮＦ−４ａ、ＨＮＦ−６、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｎｋｘ ２．２、Ｐａｘ−４、Ｎｋｘ ６．１、ＰＤＸ−１、グルカゴン（ＧＣＧ）、及びインスリン（ＩＮＳ）の発現を示す。 ヒト胚幹細胞から、胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞への分化に対する、ヒトフィーダー細胞層の影響を示す。この図は、ヒト胚幹細胞株Ｈ９の細胞集団（継代培養第４６代）が、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、市販のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ−ＳＭ）、ヒト皮膚線維芽細胞（Ｄ５５１）、ヒト***線維芽細胞（Ｈｓ２７）、及びヒト膵臓由来間質細胞（ＨＰ）で培養され、胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化した際の、リアルタイムＰＣＲで決定されたＣＸＣＲ４、Ｓｏｘ−１７、及びＦｏｘＡ２の発現を示す。 膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞の形成に対する、ヒトフィーダー細胞層の影響を示す。この図は、ヒト胚幹細胞株Ｈ９の細胞集団（継代培養第４６代）が、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、市販のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ−ＳＭ）、ヒト皮膚線維芽細胞（Ｄ５５１）、ヒト***線維芽細胞（Ｈｓ２７）、及びヒト膵臓由来間質細胞（ＨＰ）で培養され、膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化した際の、リアルタイムＰＣＲで決定されたＦｏｘＡ２、ＨＮＦ−４ａ、ＨＮＦ−６及びＰＤＸ−１の発現を示す。 膵内分泌系譜に特有のマーカーを発現する細胞の形成に対する、ヒトフィーダー細胞層の影響を示す。この図は、ヒト胚幹細胞株Ｈ９の細胞集団（継代培養第４６代）が、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）、市販のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ−ＳＭ）、ヒト皮膚線維芽細胞（Ｄ５５１）、ヒト***線維芽細胞（Ｈｓ２７）、及びヒト膵臓由来間質細胞（ＨＰ）で培養され、膵内分泌系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化した際の、リアルタイムＰＣＲで決定されたＦｏｘＡ２、ＨＮＦ−４ａ、ＨＮＦ−６、ＮｅｕｒｏＤ１、Ｎｋｘ ２．２、Ｐａｘ−４、Ｎｋｘ ６．１、ＰＤＸ−１、グルカゴン（ＧＣＧ）、及びインスリン（ＩＮＳ）の発現を示す。

限定するためではなく、開示の明確さのために、本発明の詳細な説明は、以下の小項に分けて、本発明の特定の機能、実施形態又は適用について記述又は説明する。

定義
幹細胞は、単独の細胞レベルで自己複製と、分化による後継細胞産生との両方を行う能力によって定義される、未分化の細胞であり、これには自己複製を行う前駆細胞、複製を行わない前駆細胞、及び終末分化細胞が含まれる。幹細胞はまた、生体外において、複数の胚葉層（内胚葉、中胚葉及び外胚葉）からさまざまな細胞系譜の機能に分化する能力、並びに、移植後に複数の胚葉層の組織を形成する能力、及び、胚盤胞への注入後に全てではなくとも実質的にほとんどの組織に寄与する能力によっても特徴付けられる。

幹細胞は、発生学的能力によって次のように分類される：（１）分化全能性幹細胞−すべての胚性細胞種及び胚体外細胞種を形成する能力をもつ、（２）分化多能性幹細胞−すべての胚性細胞種を形成する能力をもつ、（３）分化複能性幹細胞−細胞系譜の一部分を形成することができるが、特定の組織、器官、又は生理学的システム内にあるすべてを形成する能力をもつ（例えば、造血幹細胞（ＨＳＣ）は、ＨＳＣ（自己複製）、血球限定寡能性前駆細胞及び血中の通常の成分であるあらゆる血球種及び要素（例えば血小板）を含む子孫細胞を生成できる）、（４）分化寡能性幹細胞−細胞系譜のうち、分化多能性幹細胞よりも更に制限された一部を形成する能力をもつ、（５）分化単一性幹細胞−単一の細胞系譜を形成する能力をもつ（例えば***形成幹細胞）。

分化とは、未特化（「関連づけられていない」）又は特化度の低い細胞が、例えば神経細胞又は筋肉細胞といった特化した細胞の機能を取得するプロセスである。分化した細胞、又は分化誘導された細胞とは、ある細胞の系譜内のより特化した（「関連付けられた」）位置に移行したものである。用語「関連付けられた」は、分化プロセスについて用いられる場合、ある細胞が分化の経路を進行しており、通常の環境のもとでは特定の細胞種又は細胞種の一部に向けて分化し続ける段階であり、かつ、通常の環境のもとでは別の細胞種に分化できず、また分化程度の低い細胞種に戻ることもできないような段階まで至っていることを意味する。脱分化とは、細胞の系譜の中で、細胞が分化程度のより低い（関連付けのより低い）段階まで戻るプロセスを意味する。本明細書で使用される場合、細胞の系譜とは、細胞の遺伝形質（すなわちどの細胞がどこから来たか、及びどの細胞を形成できるか）を定義する。細胞の系譜とは、発生及び分化の遺伝体系内に細胞を配置するものである。系譜固有のマーカーとは、関心対象の系譜の細胞の表現型に特有の特性を意味し、関連付けられていない細胞の、関心対象の系譜への分化を評価するのに用いることができる。

培養中の細胞を記述するのにはさまざまな用語が使用される。「維持」は、一般に、細胞の成長及び／又は***を促進する条件下で増殖培地に細胞を置くことを意味し、細胞の数が増殖する場合も増殖しない場合もある。「継代」とは、ある培養容器から細胞を取り出し、細胞の成長及び／又は***を促進する条件下で別の培養容器にその細胞を置くプロセスを意味する。

特定の細胞集団、又は細胞株は、継代培養された回数によって言及され、又は特徴付けられる。例えば、１０回継代培養された培養細胞集団は、Ｐ１０培養と記載され得る。初代培養（すなわち、組織から細胞を分離した後の最初の培養）はＰ０と指定される。最初の継代培養の後、その細胞は２代培養（Ｐ１又は継代培養第１代）と呼ばれる。２代目の継代培養後、その細胞は３代培養（Ｐ２又は継代培養第２代）となり、以降同様となる。当業者には、継代培養の期間中に数多くの細胞集団倍加があり得ることが理解されるであろう；よって、培養の細胞集団倍加の数は、継代回数よりも大きい。継代培養間の期間中の細胞増殖（すなわち細胞集団倍加の回数）は、さまざまな要素に依存し、この要素には例えば植種密度、基質、培地、成長条件、及び継代培養間の時間が含まれ、これらに限定されない。

「β細胞系譜」は、転写因子ＰＤＸ−１、並びにＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３ベータ、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４、及びＰａｘ６の転写因子のうち少なくとも１つの、陽性遺伝子発現を有する細胞を意味する。β細胞系譜に特有のマーカーを発現する細胞は、β細胞を含む。

本明細書で使用される「胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞」は、ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ−４、ＨＮＦ−３ベータ、ＧＳＣ、Ｃｅｒ１、ノーダル（Nodal）、ＦＧＦ８、ブラキュリ（brachyury）、ミックスライク（Mixlike）ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４ ＣＤ４８、エオメソダーミン（eomesodermin）（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、又はＯＴＸ２のマーカー群のうち少なくとも１つを発現する細胞を意味する。胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞には、原条前駆細胞、原条細胞、中内胚葉細胞及び胚体内胚葉細胞が挙げられる。

本明細書で使用される「膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞」は、ＰＤＸ−１、ＨＮＦ−１ベータ、ＨＮＦ−３ベータ、ＰＴＦ−１アルファ、ＨＮＦ−６、又はＨＢ９マーカー群のうち少なくとも１つを発現する細胞を意味する。膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞には、膵内胚葉細胞が挙げられる。

本明細書で使用される「膵内分泌系譜に特有のマーカーを発現する細胞」は、ＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌｅｔ−１、ＰＤＸ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、又はＰＴＦ−１アルファマーカー群のうち少なくとも１つを発現する細胞を意味する。膵内分泌系譜に特有のマーカーを発現する細胞には、膵内分泌細胞、膵臓ホルモン発現細胞、及び膵臓ホルモン分泌細胞、並びにβ細胞系譜の細胞が挙げられる。

本明細書で使用される「胚体内胚葉（Definitive endoderm）」は、原腸形成中に胚盤葉上層から生じる細胞の特性を有する細胞であり、胃腸管及びその派生器官を形成するものを意味する。胚体内胚葉細胞は、ＣＸＣＲ４、ＨＮＦ−３ベータ、ＧＡＴＡ−４、ＳＯＸ−１７、サーベラス（Cerberus）、ＯＴＸ２、グースコイド（goosecoid）、ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＭｉｘｌ１マーカー群を発現する。

本明細書で使用される「胚体外内胚葉」は、ＳＯＸ−７、ＡＦＰ、及びＳＰＡＲＣマーカー群のうち少なくとも１つを発現する細胞集団を意味する。

本明細書で使用される「マーカー」とは、関心対象の細胞において差次的に発現される核酸又はポリペプチド分子である。この文脈において、発現差異とは、陽性マーカーのレベル増大又は陰性マーカーのレベル減少を意味する。マーカー核酸又はマーカーポリペプチドの検出可能なレベルとは、関心対象の細胞において、他の細胞よりも十分に高いか又は低いことであり、これにより関心対象の細胞が、当該技術分野において既知のさまざまな任意の方法を使用して同定され、他の細胞と区別することが可能となる。

本明細書で使用される「中内胚葉細胞」は、ＣＤ４８、エオメソダーミン（eomesodermin）（ＥＯＭＥＳ）、ＳＯＸ−１７、ＤＫＫ４、ＨＮＦ−３ベータ、ＧＳＣ、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ−６マーカー群のうち少なくとも１つを発現する細胞を意味する。

本明細書で使用される「膵内分泌細胞」又は「膵臓ホルモン発現細胞」は、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、膵ポリペプチド及びグレリンのホルモン群のうち少なくとも１つを発現することができる細胞を意味する。

本明細書で使用される「膵臓ホルモン分泌細胞」は、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵ポリペプチドのホルモン群のうち少なくとも１つを分泌することができる細胞を意味する。

本明細書で使用される「原条前駆細胞」は、ノーダル（Nodal）又はＦＧＦ８のマーカー群のうち少なくとも１つを発現する細胞を意味する。

本明細書で使用される「原条細胞」は、ブラキュリ（brachyury）、ミックスライク（Mix-like）ホメオボックスタンパク質、又はＦＧＦ４のマーカー群のうち少なくとも１つを発現する細胞を意味する。

本発明は、多能性幹細胞分化の分野に関するものである。本発明は、ヒトフィーダー細胞層における多能性幹細胞の増殖のための方法を提供する。本発明はまた、ヒトフィーダー細胞層における多能性幹細胞の分化のための方法も提供する。特に本発明は、ヒトフィーダー細胞層を用いて多能性幹細胞を膵内分泌細胞に分化させるための改善された方法を提供する。

１つの実施形態において、本発明は、多能性幹細胞の分化のための方法を提供し、その方法は：
ａ．多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．その多能性幹細胞を、ヒトフィーダー細胞層上に蒔く工程と、
ｃ．その多能性幹細胞の分化を促進する少なくとも１つの因子で、その多能性幹細胞を処理する工程と、を含む。

本発明の方法は、多能性幹細胞の分化のための改善された方法を提供し、この方法において、多能性幹細胞の分化の前に、その多能性幹細胞がヒトフィーダー細胞層上に蒔かれる。多能性幹細胞は、当該技術分野において適切な任意の方法で培養することができる。同様に、多能性幹細胞は、当該技術分野において適切な任意の方法で、ヒトフィーダー細胞層上に蒔かれることができる。多能性幹細胞は、ヒトフィーダー細胞層上に蒔かれた直後に、その多能性幹細胞の分化を促進する少なくとも１つの因子で処置することができる。別の方法として、多能性幹細胞は、ヒトフィーダー細胞層の存在下において一定時間培養した後、その多能性幹細胞の分化を促進する少なくとも１つの因子で処置することができる。例えば、多能性幹細胞は、単層を形成するのに十分な時間、ヒトフィーダー細胞層の存在下において培養することができる。

多能性幹細胞は、任意の密度でヒトフィーダー細胞層上に蒔かれることができる。ただし最適な密度は、例えば、使用する多能性幹細胞、ヒトフィーダー細胞層に含まれる細胞、分化細胞種、培養容器の大きさなどの要素によって異なることがある。１つの実施形態において、多能性幹細胞は、ヒトフィーダー細胞層上で５日間培養した後に約６０％〜約８０％コンフルエントとなるような密度で蒔かれる。

本発明における使用に好適な多能性幹細胞には、例えば、ヒト胚幹細胞株Ｈ９（ＮＩＨコード：ＷＡ０９）、ヒト胚幹細胞株Ｈ１（ＮＩＨコード：ＷＡ０１）、ヒト胚幹細胞株Ｈ７（ＮＩＨコード：ＷＡ０７）、及びヒト胚幹細胞株ＳＡ００２（スウェーデン・セラーティス（Cellartis）社）が挙げられる。また、本発明における使用に好適なものとしては、多能性細胞に特有のマーカー群、ＡＢＣＧ２、ｃｒｉｐｔｏ、ＣＤ９、ＦｏｘＤ３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４３、Ｃｏｎｎｅｘｉｎ４５、Ｏｃｔ４、Ｓｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、ｈＴＥＲＴ、ＵＴＦ−１、ＺＦＰ４２、ＳＳＥＡ−３、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ１−６０、Ｔｒａ１−８１のうち少なくとも１つを発現する細胞がある。

ヒトフィーダー細胞層に含まれる細胞は、多能性幹細胞の分化を促進することができる任意のヒト細胞であり得る。ヒトフィーダー細胞層に含まれる細胞は、成体細胞であり得る。あるいは、ヒトフィーダー細胞層に含まれる細胞は、胎児細胞又は胚細胞であり得る。１つの実施形態において、ヒトフィーダー細胞層は線維芽細胞で構成される。１つの実施形態において、この線維芽細胞は皮膚線維芽細胞である。この皮膚線維芽細胞は、ヒト皮膚線維芽細胞株Ｄｅｔｒｏｉｔ ５５１（ＣＣＬ−１１０ ＡＴＣＣ）であり得る。別の実施形態において、この線維芽細胞は***線維芽細胞である。このヒト***線維芽細胞は、ヒト***線維芽細胞株Ｈｓ２７（ＣＲＬ−１６３４ ＡＴＣＣ）であり得る。

あるいは、ヒトフィーダー細胞層は、膵臓由来間質細胞で構成される。１つの実施形態において、この膵臓由来間質細胞は、米国特許第２００４０２４１７６１号に開示されている細胞である。別の実施形態において、この膵臓由来間質細胞は、Ｓｃｉｅｎｃｅ ３０６：２２６１〜２２６４（２００４年）に開示されている細胞である。別の実施形態において、この膵臓由来間質細胞は、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２２：１１１５〜１１２４（２００４年）に開示されている細胞である。別の実施形態において、この膵臓由来間質細胞は、米国特許第２００３００８２１５５号に開示されている細胞である。別の実施形態において、この膵臓由来間質細胞は、米国特許第５８３４３０８号に開示されている細胞である。別の実施形態において、この膵臓由来間質細胞は、Ｐｒｏｃ Ｎａｔ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ９７：７９９９〜８００４（２０００年）に開示されている細胞である。別の実施形態において、この膵臓由来間質細胞は、ＷＯ２００４０１１６２１号に開示されている細胞である。別の実施形態において、この膵臓由来間質細胞は、ＷＯ０３１０２１３４号に開示されている細胞である。別の実施形態において、この膵臓由来間質細胞は、米国特許第２００４０１５８０５号に開示されている細胞である。別の実施形態において、この膵臓由来間質細胞は、米国特許第６４５８５９３号に開示されている細胞である。別の実施形態において、この膵臓由来間質細胞は、ＷＯ２００６０９４２８６号に開示されている細胞である。別の実施形態において、この膵臓由来間質細胞は、ＡＴＣＣ番号ＰＴＡ−６９７４のＨ５ｆ３Ｐ６細胞株である。

フィーダー細胞層の生成
本出願に記載されているヒトフィーダー細胞層は、多能性幹細胞の分化に有用である。他の細胞種で、これらフィーダー細胞層上で分化することにより利益を得られ得ることが知られており、本発明の組成物は、制限なく、そのような目的に使用することができる。

本発明の１つの態様において、フィーダー細胞層は、下記を本質的に含む方法によって生成される：
ａ．フィーダー層を形成する細胞の培養、及び
ｂ．その細胞の不活性化。

フィーダー細胞層を形成する細胞は、好適な培養基質上で培養することができる。１つの実施形態において、好適な培養基質は細胞外マトリックス構成成分であり、例えば、基底膜から誘導されるもの、又は接着分子受容体−リガンド結合の一部を構成することができるものがある。１つの実施形態において、好適な培養基質はマトリゲル（MATRIGEL）（登録商標）（ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickenson））である。マトリゲル（登録商標）は、エンゲルブレスホルムスワム（Engelbreth-Holm-Swarm）腫瘍細胞から得られた可溶性精製物で、室温でゲル化し、再構築された基底膜を形成する。別の実施形態において、好適な培養基質はゼラチン（シグマ（Sigma））である。

他の細胞外マトリックス構成成分及びその混合物が、代替物として好適である。これには、増殖させる細胞種によって、ラミニン、フィブロネクチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫酸などが、単独又はさまざまな組み合わせとして含まれる。

フィーダー細胞層を形成するのに用いられる細胞は、例えば、放射線、化学的不活性剤（例えばミトマイシンｃ）による処理、その他の効果的な任意の方法によって、不活性化する（すなわち、実質的な複製を不能にする）ことができる。

フィーダー細胞層を形成するのに用いられる細胞の培養のために使用される培地は、いくつかの異なる任意の成分を有することができる。この培地は、少なくとも、フィーダー細胞層を形成するのに用いられる細胞株の増殖を担持できなければならない。この培地が更に、多能性幹細胞の増殖を担持すると、便利である。しかしながら、別の方法として、多能性幹細胞の増殖のために、他の因子を添加、ないしはそれを適応させるための処理を行うことができる。

１つの実施形態において、膵臓由来間質細胞は、ＷＯ２００６０９４２８６号に開示されている細胞である。

膵臓由来細胞の単離：本発明の１つの態様において、膵臓細胞は複数段階の方法により単離され、これらは本質的に次の段階を含む：
ａ．死体膵臓、生体ドナー又は自家組織膵臓を、酵素溶液で潅流し、
ｂ．潅流した膵臓を機械的に分離し、
ｃ．この消化組織を、ポリスクロース又はフィコール（Ficoll）勾配上に重ねて入れた後、遠心分離によって３つの異なる界面を得て、
ｄ．各界面からこの組織及び細胞を取り出し、
ｅ．この組織及び細胞を、５％未満の血清を含み富栄養となるよう選択した培地の標準的な組織培養プレート内で培養し、及び
ｆ．培地を交換することなく、約２〜４週間、その培養を干渉なしにそのまま置く。

死体膵臓の潅流は、当業者に周知の、任意の酵素溶液によって達成することができる。本発明における使用に好適な酵素溶液の例には、リベラーゼ・ハイ（LIBERASE HI）（商標）（ロシュ（Roche）０．５ｍｇ／ｍＬ）及びＤＮａｓｅ Ｉ（０．２ｍｇ／ｍＬ）が含まれる。

膵臓組織の機械的分離は、組織プロセッサの使用により迅速に実施することができる。別の方法として、膵臓組織の機械的分離は、リコーディチャンバー（Ricordi Chamber）又は、他の手順に比べて組織の破壊的分離の程度が少なくできるような他の同等の装置を使用して、実施することができる。

消化された膵臓組織は次に、ポリスクロース又はフィコール勾配遠心分離にかけ、３つの異なる界面を得る。この３つの界面はそれぞれ、島組織、管組織及び腺房組織の細胞を豊富に含んでいる。１つの実施形態において、この組織及び細胞は、各界面から取り出され、別々に培養される。別の実施形態において、すべての界面から得られた組織及び細胞が合わせて培養される。本発明によって、膵臓間質細胞はこの３つの界面のいずれからも誘導可能であることが明らかにされている。別の方法として、連続勾配を用い、選択した細胞集合を用いて、膵臓間質細胞を生成することができる。

本発明により、１つ以上の界面から採集された組織及び細胞は、その細胞集団における間質細胞を選択的に豊富にするため選択された培地において培養される。選択された培地は、富栄養であり、低濃度のグルコース及び血清を含む。一般的に、選択された培地は５％未満の血清を含み、あるいは１〜３％の血清を含み、あるいは約２％の血清を含み；かつ、３０ｍＭ未満のグルコースを含む。１つの実施形態において、選択された培地には、ドナー膵臓が採取された同じ哺乳類に由来する血清２％が添加される。別の方法として、胎児又は子牛血清、他の種からの血清、又は他の血清添加物又は代替物が、選択された培地への添加に使用することができる。選択された培地の適切な一例は、ＤＭＥＭ（５ｍＭグルコース）、２％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／μｇペニシリン／ストレプトマイシン、インスリン−トランスフェリン−セレニウム（ＩＴＳ）、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．０１６５ｍＭ ＺｎＳＯ_４、及び０．３８μＭ ２−メルカプトエタノールで構成される。

選択された培地での培養中（「選択段階」）、細胞は低酸素条件又は正常酸素圧条件で培養することができる。低酸素条件では、酸素濃度は２０％未満であり、あるいは１０％未満であり、あるいは５％未満であるが、１％を超える濃度である。

好ましくは、この培養は約２〜４週間、使用される培養基質に典型的には細胞が付着するまで、培地を交換することなく、その選択された培地内に干渉なしにそのまま維持されるべきである。この選択段階は、付着細胞の数において更なる増加がなくなったときに、完了したと見なされる。

本発明に従った組織の採集及び培養の方法により、膵臓間質細胞を豊富に含んだ細胞集団が結果として得られたことが明らかにされている。「豊富に含む（enriched）」とは、膵臓間質細胞が、集団の全細胞のうち少なくとも約３０％を占め、あるいは約４０％を占め、あるいは約５０％を占めていることを意味する。

別の方法として、１つ以上の界面から採集された組織及び細胞は、その細胞集団における間質細胞を選択的に豊富にするため選択された培地において培養される。選択された培地は、富栄養であり、低濃度のグルコースを含む。一般的に、選択された培地は２０％未満の血清を含み、あるいは１０〜５％の血清を含み、あるいは約１０％の血清を含み；かつ、３０ｍＭ未満のグルコースを含む。１つの実施形態において、選択された培地には、ドナー膵臓が採取された同じ哺乳類に由来する血清１０％が添加される。別の方法として、胎児又は子牛血清、他の種からの血清、又は他の血清添加物又は代替物が、選択された培地への添加に使用することができる。選択された培地の適切な一例は、ＤＭＥＭ（５ｍＭグルコース）、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）、１００Ｕ／μｇペニシリン／ストレプトマイシンで構成される。

選択された培地での培養中（「選択段階」）、細胞は低酸素条件又は正常酸素圧条件で培養することができる。低酸素条件では、酸素濃度は２０％未満であり、あるいは１０％未満であり、あるいは５％未満であるが、１％を超える濃度である。

これらの培養条件下で、培地は２〜４日間隔で定期的に交換される。

本発明に従った組織の採集及び培養の方法により、膵臓間質細胞を豊富に含んだ細胞集団が結果として得られたことが明らかにされている。「豊富に含む（enriched）」とは、膵臓間質細胞が、集団の全細胞のうち少なくとも約３０％を占め、あるいは約４０％を占め、あるいは約５０％を占めていることを意味する。

最初の選択段階及び細胞付着の後、この細胞（間質細胞を豊富に含む）を、更に後述する条件下において増殖させる。

所望により、間質細胞を豊富に含む細胞集団は、例えば、間質細胞によって発現されるタンパク質マーカーを特異的に識別するような物質（抗体など）に曝露させることにより、膵臓間質細胞を同定及び選択することができ、これにより実質的に純粋な膵臓間質細胞集団を得ることができる。

単離された膵臓間質細胞の特性付け：培養又は単離された細胞におけるタンパク質及び核酸マーカーの発現を評価する方法は、当該技術分野において標準となっている。これには、定量的逆転写ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）、ノーザンブロット法、ｉハイブリッド形成（例えば「分子生物学の現行プロトコル（Current Protocols in Molecular Biology）」（オースベル（Ausubel）ら編、２００１年補遺）を参照）、イムノアッセイ（断片化した物質の免疫組織化学的解析など）、ウェスタンブロット法、並びに、無傷の細胞内でアクセス可能なマーカーについてはフローサイトメトリー解析（ＦＡＣＳ）が挙げられる（例えば、ハーロー（Harlow）及びレーン（Lane）、「抗体の使用：実験室マニュアル（Using Antibodies: A Laboratory Manual）」、ニューヨーク、コールドスプリングハーバーラボラトリープレス（Cold Spring Harbor Laboratory Press）（１９９８年）を参照）。

本発明に従って単離された膵臓間質細胞は、とりわけ、ＣＤ１１７、ＮＣＡＭ、ＡＢＣＧ２、サイトケラチン７、８、１８、又は１９のタンパク質マーカー群のうち少なくとも１つが実質的に欠如している点で特徴付けられる。ある具体的な実施形態において、本発明に従って単離された膵臓間質細胞は、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５のタンパク質マーカー群のうち少なくとも１つが実質的に陽性であると特徴付けられる。

膵臓間質細胞の増殖：更なる態様において、本発明は、本発明に従って得られた膵臓間質細胞の増殖方法を提供する。前述のように、島組織、管組織断片及び外分泌組織の不均質な混合物を含み得る膵臓消化物は、目的の間質細胞を選択的に豊富に含むよう、好ましくは培地を交換することなく２〜４週間、選択された低血清培地で培養される。結果として得られた、膵臓間質細胞を豊富に含む細胞集団は、増殖培地に切り替えられ、細胞集団中の膵臓間質細胞が増殖される。

本発明における使用に適した増殖培地は、ペニシリン／ストレプトマイシン（Ｐ／Ｓ）及び濃度２％〜２０％の血清、あるいは約５〜１０％の血清を含むＤＭＥＭなどの培地から構成することができる。１つの実施形態において、増殖培地はＤＭＥＭ（１０００ｍｇ／Ｌ Ｄ−グルコース；８６２ｍｇ／Ｌグルタミン）、及び１０％ウシ胎児血清から構成される。別の実施形態において、増殖培地には、ドナー膵臓が採取された同じ哺乳類に由来する血清が添加される。別の方法として、胎児又は子牛の血清、又は他の血清添加物又は代替物（例えば血清アルブミン）が、増殖培地への添加に使用することができる。

更に、この間質細胞は、本発明の細胞の増殖を刺激する物質を含むよう定められた増殖培地において培養することにより、増殖することができる。これらの因子には例えば、ニコチンアミド、ＴＧＦ−βファミリーのメンバー（ＴＧＦ−β１、２、及び３を含む）、骨形態発生タンパク質（ＢＭＰ−２、−４、６、−７、−１１、−１２、及び−１３）、血清アルブミン、線維芽細胞増殖因子ファミリー、血小板由来増殖因子−ＡＡ及び−ＢＢ、血小板富化血漿、インスリン増殖因子（ＩＧＦ−Ｉ、ＩＩ）、成長分化因子（ＧＤＦ−５、−６、−８、−１０、１１）、グルカゴン様ペプチド−Ｉ及びＩＩ（ＧＬＰ−Ｉ及びＩＩ）、ＧＬＰ−１及びＧＬＰ−２ミメトボディ（mimetobody）、エキセンジン−４、レチノイン酸、副甲状腺ホルモン、インスリン、プロゲステロン、アプロチニン、ハイドロコルチゾン、エタノールアミン、ベータメルカプトエタノール、表皮増殖因子（ＥＧＦ）、ガストリンＩ及びＩＩ、銅キレート化剤（トリエチレンペンタミンなど）、ＴＧＦ−α、フォルスコリン、酪酸ナトリウム、アクチビン、ベータセルリン、インスリン−トランスフェリン−セレニウム（ＩＴＳ）、肝細胞増殖因子（ＨＧＦ）、ケラチノサイト増殖因子（ＫＧＦ）、ウシ下垂体抽出物、膵島新生関連タンパク質（ＩＮＧＡＰ）、プロテアソーム阻害剤、ノッチ経路阻害剤、ソニック・ヘッジホッグ（sonic hedgehog）阻害剤、又はこれらの組み合わせが挙げられる。あるいは、この間質細胞は、条件付き培地において培養することにより増殖することができる。「条件付き培地」とは、ある細胞集団がある基本的に定められた細胞培養培地において成長し、その培地の可溶性因子に寄与することを意味する。そのような使用の場合、その細胞は培地から取り出され、その細胞が生成した可溶性因子が残る。この培地が次に、別の細胞集団を育てるのに使用される。

特定の実施形態において、膵臓間質細胞は標準の組織培養プレートで培養される。別の方法としては、培養プレートは細胞外マトリックスタンパク質でコーティングすることができ、これにはマトリゲル（MATRIGEL）（登録商標）、低増殖因子マトリゲル（MATRIGEL）（登録商標）、ラミニン、コラーゲン、ゼラチン、テナシン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、トロンボスポンジン、胎盤抽出物又はこれらの組み合わせが挙げられる。

更に、膵臓間質細胞は、低酸素又は正常酸素圧条件下で生体外において増殖することができる。

多能性幹細胞の分化
本発明の１つの実施形態において、多能性幹細胞は、その多能性を維持したまま、培養で増殖される。多能性幹細胞は次にヒトフィーダー細胞層に移されてから、分化する。経時的な細胞の多能性の変化は、多能性に関連するマーカー発現のレベル変化を検出することによって決定することができる。別の方法として、多能性の変化は、分化に関連するマーカー発現の、又は別の細胞種に関連するマーカー発現の、レベル変化を検出することによって監視することができる。

多能性細胞は、その多能性細胞が別の細胞種に分化するのを促進する少なくとも１つの因子によって処理される。他の細胞種は、その胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞であり得る。あるいは、その細胞種は、膵臓内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞であり得る。あるいは、その細胞種は、膵内分泌系譜に特有のマーカーを発現する細胞であり得る。あるいは、その細胞種は、β細胞系譜に特有のマーカーを発現する細胞であり得る。

本発明の方法に従って処理された多能性幹細胞は、当該技術分野において好適な任意の方法によって、他のさまざまな細胞種に分化し得る。例えば、本発明の方法に従って処理された多能性幹細胞は、神経細胞、心臓細胞、肝細胞などに分化し得る。

例えば、本発明の方法に従って処理された多能性幹細胞は、ＷＯ２００７０３０８７０号に開示されている方法に従って、神経前駆細胞及び心筋細胞に分化することができる。

別の例において、本発明の方法に従って処理された多能性幹細胞は、米国特許第６，４５８，５８９号に開示されている方法に従って、肝細胞に分化することができる。

膵内分泌系譜に特有のマーカーを発現する細胞への、多能性幹細胞の分化
本発明の１つの態様において、膵内分泌系譜に特有のマーカーを発現する細胞は、次の段階を含む複数段階の方法により、多能性幹細胞から形成される：
ａ．多能性幹細胞を培養し、
ｂ．ヒトフィーダー細胞層上にその多能性細胞を蒔き、
ｃ．その多能性細胞が、胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化し、
ｄ．胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞が、膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化し、
ｅ．膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞が、膵内分泌系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化する。

胚体内胚葉系譜に特有のマーカーは、ＳＯＸ−１７、ＧＡＴＡ４、Ｈｎｆ−３ベータ、ＧＳＣ、Ｃｅｒ１、ノーダル（Nodal）、ＦＧＦ８、ブラキュリ（brachyury）、ミックスライク（Mix-like）ホメオボックスタンパク質、ＦＧＦ４ ＣＤ４８、エオメソダーミン（eomesodermin）（ＥＯＭＥＳ）、ＤＫＫ４、ＦＧＦ１７、ＧＡＴＡ６、ＣＸＣＲ４、Ｃ−Ｋｉｔ、ＣＤ９９、及びＯＴＸ２から成る群から選択される。本発明における使用に好適なのは、胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを少なくとも１つ発現する細胞である。本発明の１つの態様において、胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞は、原条前駆細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞は、中内胚葉細胞である。別の態様において、胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞は、胚体内胚葉細胞である。

膵内胚葉系譜に特有のマーカーは、Ｐｄｘ１、ＨＮＦ−１ベータ、ＰＴＦ１ａ、ＨＮＦ−６、ＨＢ９及びＰＲＯＸ１から成る群から選択される。本発明における使用に好適なのは、膵内胚葉系譜に特有のマーカーを少なくとも１つ発現する細胞である。本発明の１つの態様において、膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞は、膵内胚葉細胞である。

膵内分泌系譜に特有のマーカーは、ＮＧＮ−３、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌｅｔ−１、Ｐｄｘ−１、ＮＫＸ６．１、Ｐａｘ−４、Ｎｇｎ−３、及びＰＴＦ−１アルファから成る群から選択される。１つの実施形態において、膵内分泌細胞は、インスリン、グルカゴン、ソマトスタチン、及び膵ポリペプチドのホルモン群のうち少なくとも１つを発現することができる。本発明における使用に好適なのは、膵内分泌系譜に特有のマーカーのうち少なくとも１つを発現する細胞である。本発明の１つの態様において、膵内分泌系譜に特有のマーカーを発現する細胞は、膵内分泌細胞である。膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン発現細胞であり得る。あるいは、膵内分泌細胞は、膵臓ホルモン分泌細胞であり得る。

本発明の１つの態様において、膵内分泌細胞は、β細胞系譜に特有のマーカーを発現する細胞である。β細胞系譜に特有のマーカーを発現する細胞は、Ｐｄｘ１と、ＮＧＮ−３、Ｎｋｘ２．２、Ｎｋｘ６．１、ＮｅｕｒｏＤ、Ｉｓｌ−１、ＨＮＦ−３ベータ、ＭＡＦＡ、Ｐａｘ４、及びＰａｘ６の転写因子のうち少なくとも１つと、を発現する。本発明の１つの態様では、β細胞系譜に特有のマーカーを発現する細胞は、β細胞である。

例えば、多能性幹細胞は、ダムール（D’Amour）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている方法に従って、膵内分泌系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化することができる。

胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞の形成：多能性幹細胞は、当該技術分野の任意の方法、又は本発明に提示されている任意の方法によって、胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化することができる。

例えば、多能性幹細胞は、ダムール（D’Amour）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３、１５３４〜１５４１（２００５年）に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化することができる。

例えば、多能性幹細胞は、シノザキ（Shinozaki）ら、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １３１、１６５１〜１６６２（２００４年）に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化することができる。

例えば、多能性幹細胞は、マクレイン（McLean）ら、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２５、２９〜３８（２００７年）に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化することができる。

例えば、多能性幹細胞は、ダムール（D’Amour）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている方法に従って、胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化することができる。

例えば、多能性幹細胞は、血清が存在しない状態でアクチビンＡを含む培地において多能性幹細胞を培養し、次にアクチビンＡ及び血清で培養し、次にアクチビンＡ及び別の濃度の血清で細胞を培養することにより、胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化することができる。この方法の一例が、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２３、１５３４〜１５４１（２００５年）に開示されている。

例えば、多能性幹細胞は、血清が存在しない状態でアクチビンＡを含む培地において多能性幹細胞を培養し、次にアクチビンＡ及び別の濃度の血清で細胞を培養することにより、胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化することができる。この方法の一例が、ダムール（D’Amour）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００５年）に開示されている。

例えば、多能性幹細胞は、血清が存在しない状態でアクチビンＡ及びＷｎｔリガンドを含む培地において多能性幹細胞を培養し、次にＷｎｔリガンドを除去し、アクチビンＡ及び血清で細胞を培養することにより、胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化することができる。この方法の一例が、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている。

膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞の形成：胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞は、当該技術分野の任意の方法、又は本発明に提示されている任意の方法によって、膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化することができる。

例えば、胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞は、ダムール（D’Amour）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている方法に従って、膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化することができる。

例えば、胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞は更に、その胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞を、線維芽細胞増殖因子及びヘッジホッグ信号経路阻害物質ＫＡＡＤ−シクロパミンで処理し、次に線維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含む培地を除去し、次いでその細胞を、レチノイン酸、線維芽細胞増殖因子及びＫＡＡＤ−シクロパミンを含む培地で培養することにより、膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化することができる。この方法の一例が、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている。

膵内分泌系譜に特有のマーカーを発現する細胞の形成：膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞は、当該技術分野の任意の方法、又は本発明に開示されている任意の方法によって、膵内分泌系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化することができる。

例えば、膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞は、ダムール（D’Amour）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている方法に従って、膵内分泌系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化することができる。

例えば、膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞は更に、その膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞を、ＤＡＰＴ及びエキセンジン４を含む培地で培養し、次にＤＡＰＴ及びエキセンジン４を含む培地を除去し、次いでその細胞を、エキセンジン１、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含む培地で培養することにより、膵内分泌系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化することができる。この方法の一例が、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ ２４、１３９２〜１４０１（２００６年）に開示されている。

例えば、膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞は更に、その膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞を、エキセンジン４を含む培地で培養し、次にエキセンジン４を含む培地を除去し、次いでその細胞を、エキセンジン４、ＩＧＦ−１及びＨＧＦを含む培地で培養することにより、膵内分泌系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化することができる。この方法の一例が、ダムール（D’Amour）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６年）に開示されている。

例えば、膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞は更に、その膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞を、ＤＡＰＴ及びエキセンジン４を含む培地で培養することにより、膵内分泌系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化することができる。この方法の一例が、ダムール（D’Amour）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６年）に開示されている。

例えば、膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞は更に、その膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞を、エキセンジン４を含む培地で培養することにより、膵内分泌系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化することができる。この方法の一例が、ダムール（D’Amour）ら、Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（２００６年）に開示されている。

多能性幹細胞の単離、増殖及び培養
多能性幹細胞の特徴付け
多能性幹細胞は、１つ以上の段階特異性胚抗原（ＳＳＥＡ）３又は４、並びに指定された抗体Ｔｒａ−１−６０及びＴｒａ−１−８１を使用して検出可能なマーカーを発現し得る（トムソン（Thomson）ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５、１９９８年）。生体外での多能性幹細胞の分化は、ＳＳＥＡ−４、Ｔｒａ−１−６０、及びＴｒａ−１−８１発現（存在する場合）の逸失、並びにＳＳＥＡ−１の発現増加を引き起こす。未分化の多能性幹細胞は通常、アルカリホスファターゼ活性を有しており、これは、４％パラホルムアルデヒドで細胞を固定してから、メーカー（ベクター・ラボラトリーズ（Vector Laboratories）、カリフォルニア州バーリンゲーム）の記述に従い、ベクターレッド（Vector Red）を基質として成長させることにより、検出することができる。未分化の多能性幹細胞はまた、典型的にＯｃｔ−４及びＴＥＲＴを発現し、これはリアルタイムＰＣＲで検出される。

増殖した多能性幹細胞の別の好ましい表現型は、内胚葉、中胚葉、及び外胚葉組織の３つすべての胚葉の細胞に分化する可能性を有する。多能性幹細胞の多能性は、例えば、細胞を重症複合免疫不全（ＳＣＩＤ）マウスに注入し、固定剤（例えば４％パラホルムアルデヒド）を用いて形成する奇形種を固定し、次にそれを組織学的に調べ、３つの胚葉に由来する細胞種の証拠を探すことによって、確認することができる。別の方法としては、胚様体を形成し、３つの胚葉に関連するマーカーの存在についてその胚様体を評価することにより、多能性を決定することができる。

増殖した多能性幹細胞株は、標準Ｇ帯技法を用いて核型を決定し、対応する霊長類の公開されている核型と比較することができる。「通常の核型」を有する細胞、すなわち正倍数体であり、ヒト染色体がすべて存在し、明らかな改変がないような細胞を得ることが望ましい。

多能性幹細胞の取得源
使用が可能な多能性幹細胞の種類には、妊娠後に形成された組織から誘導された多能性細胞の確立株が含まれ、その妊娠後に形成された組織としては、前胚組織（例えば胚盤胞）、胚組織、又は妊娠中任意の時に採取した胎児組織（典型的には妊娠約１０〜１２週以前であるが必ずしもその必要はない）が挙げられる。非制限的な例としては、ヒト胚幹細胞又はヒト胚生殖細胞の確立株であり、これは例えば、ヒト胚幹細胞株Ｈ１、Ｈ７、及びＨ９（ワイセル（WiCell））である。また想到されるのは、このような細胞の最初の確立又は安定化中に本開示の組成物を使用することであり、この場合、採取源細胞は、採取源組織から直接得られた初代多能性細胞となる。また好適なのは、フィーダー細胞の存在しない状態ですでに培養された多能性幹細胞集団から得られた細胞である。また好適なのは、突然変異体ヒト胚幹細胞株であり、例えばＢＧ０１ｖ（ブレサジェン（BresaGen）、ジョージア州アセンズ）である。

１つの実施形態において、ヒト胚幹細胞は、トムソン（Thomson）ら（米国特許第５，８４３，７８０号；Ｓｃｉｅｎｃｅ ２８２：１１４５、１９９８年；Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｄｅｖ．Ｂｉｏｌ．３８：１３３ ｆｆ．、１９９８年；Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．９２：７８４４、１９９５年）の記述に従って調製される。

多能性幹細胞の培養
１つの実施形態において、多能性幹細胞は典型的に、さまざまな方法でその多能性幹細胞を担持するフィーダー細胞層上で培養される。別の方法としては、多能性幹細胞は、フィーダー細胞が実質的に含まれないにもかかわらず、実質的な分化を進行させずに多能性各細胞の増殖を担持するような培養系において、培養される。フィーダーを含まない培地中での、分化を伴わない多能性幹細胞増殖は、事前に他の細胞種で培養することによって条件付きにした培地を使用することによって担持される。別の方法としては、フィーダーを含まない培地中での、分化を伴わない多能性幹細胞増殖は、化学的に定義された培地を使用することにより担持される。

例えば、ロイビノフ（Reubinoff）ら（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ １８：３９９〜４０４（２０００年））及びトンプソン（Thompson）ら（Ｓｃｉｅｎｃｅ １９９８年１１月６日：Ｖｏｌ．２８２．ｎｏ．５３９１、ｐｐ．１１４５〜１１４７）は、マウス胚線維芽細胞フィーダー細胞層を用いて、ヒト胚盤胞から得た多能性幹細胞株の培養を開示している。

リチャーズ（Richards）ら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２１：５４６〜５５６、２００３年）は、ヒト多能性幹細胞培養を担持する能力について、ヒト成人、胎児及び新生児のフィーダー細胞層１１種類のパネルを評価した。リチャーズ（Richards）らは、「成人皮膚線維芽細胞フィーダーで培養されたヒト胚幹細胞株は、ヒト胚幹細胞の形態学的特徴を保持し、多能性を維持している」と述べている。

米国特許第２００２００７２１１７号は、フィーダーを含まない培養における初代多能性幹細胞の増殖を担持する培地を生成する細胞株について開示している。ここで使用された細胞株は、胚組織から得られ、又は胚幹細胞から分化した、間葉性及び線維芽細胞様の細胞株である。米国特許第２００２００７２１１７号はまた、初代フィーダー細胞層としてのこの細胞株の使用についても開示している。

別の例として、ワン（Wang）ら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：１２２１〜１２２７、２００５年）は、ヒト胚幹細胞から誘導されたフィーダー細胞層上でのヒト多能性幹細胞の長期的な増殖に関する方法を開示している。

別の例として、ストイコビッチ（Stojkovic）ら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２００５ ２３：３０６〜３１４、２００５年）は、ヒト胚幹細胞の自発的分化から誘導されたフィーダー細胞系を開示している。

更に別の例において、ミヤモト（Miyamoto）ら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：４３３〜４４０、２００４年）はヒト胎盤から得られたフィーダー細胞の採取源を開示している。

アミット（Amit）ら（Ｂｉｏｌ．Ｒｅｐｒｏｄ ６８：２１５０〜２１５６、２００３年）は、ヒト***から誘導されたフィーダー細胞層を開示している。

別の例として、イヌンザ（Inzunza）ら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２３：５４４〜５４９、２００５年）は、ヒト出生直後の***線維芽細胞から得られたフィーダー細胞層を開示している。

米国特許第６６４２０４８号は、フィーダーを含まない培養における初代多能性幹（ｐＰＳ）細胞の増殖を担持する培地、及びそのような培地の生成に有用な細胞株を開示している。米国特許第６６４２０４８号は、「本発明には、胚組織から得られ、又は胚幹細胞から分化した、間葉性及び線維芽細胞様の細胞株が含まれる。このような細胞株の誘導、培地の処理、及び条件付き培地を使用した幹細胞の増殖の方法は、本開示に記述及び説明されている」と述べている。

別の例として、ＷＯ２００５０１４７９９号は、哺乳類細胞の維持、増殖及び分化のための条件付き培地を開示している。ＷＯ２００５０１４７９９号は、「本発明に関連して生成される培養培地は、ハツカネズミ細胞、特に、ＭＭＨ（Ｍｅｔハツカネズミ肝細胞）と呼ばれる分化かつ不死化した形質転換肝細胞の細胞分泌活動によって条件付けられる」と述べている。

別の例において、シュ（Xu）ら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２２：９７２〜９８０、２００４年）は、ヒトテロメラーゼ逆転写酵素を過剰発現するよう遺伝子組換えを行ったヒト胚幹細胞誘導体から得られた、条件付き培地を開示している。

別の例において、米国特許第２００７００１００１１号は、多能性幹細胞の維持のために化学的に定義された培養培地を開示している。

別の培養系では、胚幹細胞の増殖を促進することができる増殖因子を添加した、無血清培地を用いている。例えば、チェオン（Cheon）ら（ＢｉｏＲｅｐｒｏｄ ＤＯＩ：１０．１０９５／ｂｉｏｌｒｅｐｒｏｄ．１０５．０４６８７０、２００５年１０月１９日）は、胚幹細胞の自己複製の引き金となることができるさまざまな増殖因子を添加した、条件なし血清代替（ＳＲ）培地に胚幹細胞を維持する、フィーダーを含まない無血清培養系を開示している。

別の例において、レベンスタイン（Levenstein）ら（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌｓ ２４：５６８〜５７４、２００６年）は、ｂＦＧＦを添加した培地を用いて、線維芽細胞又は条件付き培地のない状態で、ヒト胚幹細胞を長期的に培養する方法を開示している。

別の例において、米国特許第２００５０１４８０７０号は、血清なし、及び線維芽細胞フィーダー細胞なしの定義された培地においてヒト胚幹細胞を培養する方法を開示している。この方法は次のものを含む：アルブミン、アミノ酸、ビタミン、ミネラル、少なくとも１種のトランスフェリン又はトランスフェリン代替物、少なくとも１種のインスリン又はインスリン代替物を含有する培養培地であって、哺乳類胎児血清を本質的に含まず、線維芽細胞増殖因子信号受容体を活性化することができる線維芽細胞増殖因子１００ｎｇ／ｍＬを含む、培養培地内で幹細胞を培養し、ここでその増殖因子は線維芽細胞フィーダー層のみ以外の取得源から供給され、この培地は、フィーダー細胞又は条件付き培地を含まず、分化していない状態で幹細胞の増殖を担持する。

別の例において、米国特許第２００５０２３３４４６号は、分化していない霊長類始原幹細胞を含む幹細胞の培養に有用な、定義された培地を開示している。この培地は溶液状態で、培養される幹細胞と比べて、実質的に等張性である。所与の培養において、特定の培地は、基本培地、及び、始原幹細胞の未分化増殖を実質的に担持するのに必要な、ｂＦＧＦ、インスリン、及びアスコルビン酸の所定量を含む。

別の例において、米国特許第６８００４８０号は、「１つの実施形態において、霊長類由来の始原幹細胞を実質的に未分化状態で増殖するための細胞培養培地が提供され、これには、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を担持するのに効果的な、低浸透圧で内毒素の少ない基本培地が含まれる。この基本培地は、霊長類由来の始原幹細胞の増殖を担持するのに効果的な栄養豊富な血清と、フィーダー細胞及びフィーダー細胞から誘導された細胞外マトリックス構成成分から成る群から選択される基質とを合わせたものである。この培地は更に、非必須アミノ酸、抗酸化性物質、及びヌクレオシド類とピルビン酸塩から成る群から選択される第一増殖因子を含む」と述べている。

別の例において、米国特許第２００５０２４４９６２号は、「１つの態様において、本発明は、霊長類胚幹細胞の培養の方法を提供する。哺乳類胎児血清を本質的に含まない（好ましくは、いかなる動物血清も本質的に含まない）培養において、及び線維芽細胞フィーダー層のみ以外の取得源から供給された線維芽細胞増殖因子の存在下で、この幹細胞が培養される。好ましい形態において、この線維芽細胞フィーダー層は、以前は幹細胞培養を維持するのに必要であったが、十分な線維芽細胞増殖因子の添加によりこれが不要になっている」と述べている。

更なる例において、ＷＯ２００５０６５３５４号は、本質的にフィーダーも血清も含まない、定義された等張性培養培地を開示しており、この培地は次のものを含む：ａ．基礎培地；ｂ．本質的に未分化の哺乳類幹細胞の増殖を担持するのに十分な量のｂＦＧＦ；ｃ．本質的に未分化の哺乳類幹細胞の増殖を担持するのに十分な量のインスリン；及びｄ．本質的に未分化の哺乳類幹細胞の増殖を担持するのに十分な量のアスコルビン酸。

別の例において、ＷＯ２００５０８６８４５号は未分化の幹細胞の維持方法を開示しており、この方法は、望ましい結果を達成するために十分な時間、細胞を未分化の状態で維持するのに十分な量の、トランスフォーミング増殖因子−ベータ（ＴＧＦβ）タンパク質ファミリーのメンバー、線維芽細胞増殖因子（ＦＧＦ）タンパク質ファミリーのメンバー、又はニコチンアミド（ＮＩＣ）に、幹細胞を曝露させることを含む。

多能性幹細胞は、好適な培養基質上に蒔かれることができる。１つの実施形態において、好適な培養基質は細胞外マトリックス構成成分であり、例えば、基底膜から誘導されるもの、又は接着分子受容体−リガンド結合の一部を構成することができるものがある。１つの実施形態において、好適な培養基質はマトリゲル（MATRIGEL）（登録商標）（ベクトン・ディッキンソン（Becton Dickenson））である。マトリゲル（登録商標）は、エンゲルブレスホルムスワム（Engelbreth-Holm-Swarm）腫瘍細胞から得られた可溶性精製物で、室温でゲル化し、再構築された基底膜を形成する。

他の細胞外マトリックス構成成分及びその混合物が、代替物として好適である。これには、増殖させる細胞種によって、ラミニン、フィブロネクチン、ゼラチン、プロテオグリカン、エンタクチン、ヘパラン硫酸などが、単独又はさまざまな組み合わせとして含まれる。

多能性幹細胞は、好適な分布で、また、細胞の生存、増殖、及び望ましい特性の保持を促進する培地の存在下で、基質上に蒔かれることができる。これらすべての特性は、播種分布に注意を払うことにより利益が得られ、これは当業者によって容易に決定され得る。

好適な培地は、例えば次の構成成分から生成することができる：ダルベッコ（Dulbecco）改良型イーグル（Eagle）培地（ＤＭＥＭ）、ギブコ（Gibco）＃１１９６５−０９２；ノックアウトのダルベッコ（Dulbecco）改良型イーグル（Eagle）培地（ＫＯ ＤＭＥＭ）、ギブコ（Gibco）＃１０８２９−０１８；ハム（Ham）Ｆ１２／５０％ＤＭＥＭ基礎培地；２００ｍＭ Ｌ−グルタミン、ギブコ（Gibco）＃１５０３９−０２７；非必須アミノ酸溶液、ギブコ（Gibco）１１１４０−０５０；β−メルカプトエタノール、シグマ（Sigma）＃Ｍ７５２２；ヒト遺伝子組換え塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）、ギブコ（Gibco）＃１３２５６−０２９。

本発明は更に次の実施例により説明されるが、これらにより限定されるものではない。

（実施例１）
ヒト膵細胞株の確立
膵臓の調製−臨床的移植に不適のヒト膵臓を、研究用途用の適切な合意の後、国立疾病研究互助組織（National Disease Research Interchange、ペンシルバニア州フィラデルフィア）から取得した。この膵臓を、臓器保存溶液から氷上のステンレススチール製皿に移し、余分の組織をすべて除去した。膵管に１８ゲージのカテーテルを挿入し、ダルベッコ（Dulbecco）のリン酸緩衝生理食塩水（ＤＰＢＳ）に溶かした、リベラーゼ・ハイ（LIBERASE HI）（商標）酵素（ロシュ（Roche）−０．５ｍｇ／ｍＬ）及びＤＮａｓｅ Ｉ（０．２ｍｇ／ｍＬ）を含む酵素溶液を、膵臓に注入した。

急速な機械的分離とその次の酵素消化−酵素を染み込ませた膵臓を、組織プロセッサ内で、１回当たり３〜５秒間のパルスを３〜５回行い、均質化した。この分離した組織を、磁気攪拌子の入った５００ｍＬトリプシン処理フラスコ（ベルコ（Bellco））２本に移した。この後、酵素溶液５０〜１００ｍＬを各フラスコに加えた。このフラスコを、浸漬可能な攪拌プレート上に乗せ、３７℃の水浴内に置き、中程度の攪拌速度で１０分間インキュベートした。攪拌を止め、微細な消化組織をフラスコから取り出して、ＤＰＢＳ、５％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）及び０．１ｍｇ／ｍＬ ＤＮａｓｅ Ｉ（ＤＰＢＳ＋）の入った２５０ｍＬ試験管に移し、４℃にして消化プロセスを止めた。フラスコに５０〜１００ｍＬの酵素溶液を再び満たし、水浴に戻して、更に１０分間、攪拌を再開した。再び、フラスコを取り出して、微細な消化組織を回収し、氷上の２５０ｍＬ試験管に移した。このプロセスを膵臓が完全に消化されるまで、更に３〜５回繰り返した。

同時酵素消化を伴う機械的勾配分離−Ｄｉａｂｅｔｅｓ ３７：４１３〜４２０（１９８８年）に記述されている方法に従い、酵素を染み込ませた膵臓を処理した。簡単に言うと、余分の組織をすべて除去し、上記のように酵素溶液を注入した。次に、この膵臓をビーズ入りリコーディチャンバー（Ricordi Chamber）に入れ、組織の大きな塊を保持するためにメッシュサイズ４００〜６００μｍのスクリーンで覆った。チャンバーを覆い、酵素溶液を約３７℃でチャンバー内に循環させ、このチャンバーを振盪して、ビーズが膵臓組織を破砕し、同時に酵素が膵臓を消化するようにした。適切な分離及び消化が達成された時点で、消化を止め、組織を採取した。

組織分離−採取した組織を４℃で５分間、１５０×ｇで遠心分離にかけた。上澄みを吸引し、組織をＤＰＢＳ＋であと２回洗浄した。最後の洗浄後、精製のために、組織を不連続勾配に適用した。消化した組織をポリスクロース（メディアテック（Mediatech）、バージニア州）に、１０ｍＬのポリスクロース溶液当たり１〜２ｍＬの組織ペレットの比率で入れて、密度１．１０８ｇ／ｍＬで懸濁させた。組織懸濁液を次に丸底のポリカーボネート製遠心管に移し、密度１．０９６及び１．０３７のポリスクロース溶液を注意して遠心管に適用した。最後にＤＭＥＭの層で、不連続精製勾配を完成した。勾配管を４℃で２０分間、ブレーキを使用せずに２０００ｒｐｍで遠心分離した。遠心分離の後、組織を各界面（３界面）から採取し、上記のようにＤＰＢＳで数回洗浄し、５０ｍＬ試験管に回収した。

更なる細胞塊の分離−所望により、上記のプロトコルを用いて得られた大きな細胞塊を更に分離し、より小さな塊又は単細胞の懸濁液にすることができる。最後の洗浄の後、各分画から得た組織を、２００Ｕ／ｍＬ ＤＮａｓｅ Ｉを含む１０ｍＬ １Ｘトリプシン／ＥＤＴＡ溶液中に懸濁させた。試験管を水浴に入れ、ほぼ単細胞の懸濁液となるまで、１０ｍＬ血清用ピペットで繰り返し吸い上げては戻すことを５〜６分間繰り返した。４℃のＤＰＢＳ＋を加えて消化を止め、この試験管を８００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけた。細胞懸濁液をＤＰＢＳ＋で洗浄し、下記のように培養した。

膵臓細胞の培養−最後の洗浄の後、各界面から得た細胞を、ＤＭＥＭ、２％ＦＢＳ、１００Ｕ／μｇペニシリン／ストレプトマイシン、ＩＴＳ、２ｍＭ Ｌ−グルタミン、０．０１６５ｍＭ ＺｎＳＯ４（シグマ（Sigma））、及び０．３８μＭ ２−メルカプトエタノール（イントロビジェン（Invitrogen）、カリフォルニア州）中に再懸濁させた（以降、「選択された培地」と呼ぶ）。細胞懸濁液６ｍＬをＴ−２５組織培養フラスコに播種し、細胞懸濁液１２ｍＬをＴ−７５フラスコに播種した。このフラスコを、５％ＣＯ_２で３７℃のインキュベーター内に置いた。２〜４週間の培養後、完全な培地交換を実施し、付着している細胞を、ＤＭＥＭ（２７５０ｍｇ／Ｌ Ｄ−グルコース、８６２ｍｇ／Ｌグルタミン）（ギブコ（Gibco）、カリフォルニア州）、５％ＦＢＳ（ハイクローン（HyClone）、ユタ州）、１％Ｐ／Ｓ、０．０１６５ｍＭ ＺｎＳＯ４の中での培養に戻す（以降、「増殖培地」と呼ぶ）。これを、コンフルエント近くに達するまで置き（この段階を「継代培養０」又は「Ｐ０」と呼ぶ）、この段階で細胞が継代された。続く細胞培養は、増殖培地で細胞５０００個／ｃｍ^２であった。培養は、約７０％〜９０％コンフルエントで、７〜１０日ごとに継代された。精製勾配の後に得られた３つの分画それぞれから、間質細胞が分離されたことが示された。

（実施例２）
膵臓間質細胞の培養
実施例１に従って分離された膵臓細胞を、選択された培地において２〜４週間、低酸素条件（５％ＣＯ_２、３％Ｏ_２、及び９２％Ｎ_２）又は正常酸素圧条件（５％ＣＯ_２、２０％Ｏ_２、及び７５％Ｎ_２）のいずれかで培養した。次に培養を増殖培地に切り替え、週に２〜３回栄養補給した。最初の培養期間後、低酸素条件及び正常酸素圧条件で培養されたプレートに、付着した細胞が観察された。更に、最初の培養２〜４週間が経過後、プレート上には膵島状又は膵管構造はほとんど残っていなかった。

（実施例３）
フィーダー細胞層上で培養した多能性幹細胞における分化に関連する遺伝子の発現
ヒト胚幹細胞株Ｈ９は、ワイセル研究所（WiCell Research Institute, Inc）（ウィスコンシン州マディソン）から入手され、入手源から提供された説明に従って培養された。不活性化された初代マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上に維持された未分化Ｈ９ヒト胚幹細胞を、６０％ＦＢＳ、２０％ＤＭＳＯ、及び２０％ＤＭＥＭ／Ｆ１２（イントロビジェン（Invitrogen）／ギブコ（GIBCO））に、２０％ノックアウト血清代替物、１００ｎＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸、０．５ｍＭベータメルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ−グルタミンと、４ｎｇ／ｍＬヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（すべてイントロビジェン（Invitrogen）／ギブコ（GIBCO））を加えた中で、−１℃／分の速度で低温保存し、窒素蒸気中に保管した。この細胞を解凍し、ミトマイシン（mitocycin）ｃ処理Ｄ５５１ヒト皮膚線維芽細胞を細胞数５２，０００個／ｃｍ^２の密度で播種した上に蒔いた。Ｄ５５１細胞上での３代継代培養後、多能性細胞を採取し、８ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦを添加した不活性化ＭＥＦの培養から、条件付き培地のマトリゲル（MATRIGEL）に移した。マトリゲル（１：３０）上に適用されたヒト胚幹細胞を、６０ｍｍ組織培養プレートに入れ、加湿組織培養インキュベーター内で、３７℃、５％ＣＯ_２の雰囲気中で培養した。コンフルエントに達したら（蒔いてから約５〜７日後）、ヒト胚幹細胞を、１ｍｇ／ｍＬディスパーゼ（イントロビジェン（Invitrogen）／ギブコ（GIBCO））で２５〜４０分間処理した。細胞がプレートから遊離したら、２ｍＬの血清用ピペットで繰り返しピペット操作を行い、望ましいコロニーサイズを達成した。細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけ、ペレットを再懸濁させ、マトリゲル（MATRIGEL）をコーティングした細胞培養プレート上の新しい培養培地内で、１：３〜１：４の細胞の比率で蒔いた。マトリゲル（MATRIGEL）上で５〜１０回の継代培養後、多能性Ｈ９細胞を、数多くのさまざまなフィーダー細胞に移した。簡単に言うと、細胞は、ＥＳ細胞培地内のフィーダー上で培養され、このＥＳ細胞培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２（イントロビジェン（Invitrogen）／ギブコ（GIBCO））に、２０％ノックアウト血清代替物、１００ｎＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸、０．５ｍＭベータメルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ−グルタミンと、４ｎｇ／ｍＬヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（すべてイントロビジェン（Invitrogen）／ギブコ（GIBCO））を加えたものから成り、これを組織培養処理された６ウェルプレート内に入れられた。プレートは、０．１％ゼラチン（シグマ（Sigma））でコーティングされ、３７℃で最低４時間インキュベートしてから、フィーダーを播種することによって調製された。播種の直前に、ゼラチンを吸引し、６ウェルプレートの各ウェルにフィーダー細胞懸濁液を配分した。細胞を５日間増殖させてから、分化プロトコルを開始した。

ヒト皮膚線維芽細胞株Ｄ５５１（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＣＬ−１１０）、ヒト***線維芽細胞株Ｈｓ２７（ＡＴＣＣ Ｎｏ．ＣＲＬ−１６３４）、及びヒト膵臓由来間質細胞株（ＷＯ２００６０９４２８６号に開示）の、多能性を維持する能力が評価された。Ｄ５５１ヒトフィーダー細胞が、ＥＭＥＭ（ＡＴＣＣ ３０−２００３）に１０％ＦＢＳを添加した中で培養された。コンフルエントに達したら、細胞をミトマイシン−Ｃ処理によって不活性化し、ＥＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、及び５％ＤＭＳＯ中で、−１℃／分の速度で低温保存し、窒素蒸気中に保管した。この細胞を３７℃で解凍し、ゼラチンコーティングした組織培養プレートに、１０％ＦＢＳを加えたＥＭＥＭ中で、５２，０００／ｃｍ^２の割合で播種した。Ｈｓ２７ヒトフィーダー細胞が、ＤＭＥＭ（ＡＴＣＣ ３０−２００２）に１０％ＦＢＳを添加した中で培養された。コンフルエントに達したら、細胞をミトマイシン−Ｃ処理によって不活性化し、ＤＭＥＭ、１０％ＦＢＳ、及び５％ＤＭＳＯ中で、−１℃／分の速度で低温保存し、窒素蒸気中に保管した。この細胞を３７℃で解凍し、ゼラチンコーティングした組織培養プレートに、１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ中で、５５，０００／ｃｍ^２の割合で播種した。ヒト膵臓由来間質細胞株が、コンフルエントに達するまでＤＭＥＭ及び１０％ＦＢＳ中で培養され、ミトマイシン−Ｃ処理された。この細胞を９０％ＦＢＳ及び１０％ＤＭＳＯ中で、−１℃／分の速度で低温保存し、窒素蒸気中に保管した。この細胞を３７℃で解凍し、ゼラチンコーティングした組織培養プレートに、１０％ＦＢＳを加えたＤＭＥＭ中で、４３，０００／ｃｍ^２の割合で播種した。市販のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦＳＭ）、及び新たに誘導されたマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上に蒔かれたヒト胚幹細胞の培養物が、対照標準として含められた。

不活性化ヒトフィーダー細胞のプレートをＰＢＳで洗浄し、胚幹細胞をＥＳ培地に播種した。胚幹細胞をヒトフィーダー細胞層上で５日間培養した。この後、マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ、図１）、市販のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ−ＳＭ、図１）、ヒト皮膚線維芽細胞（Ｄ５５１、図１）、ヒト***線維芽細胞（Ｈｓ２７、図１）及びＷＯ２００６０９４２８６号に開示されているヒト膵臓由来間質細胞株（ＨＰ、図１）の上で培養されたヒト胚幹細胞のＣＸＣＲ４、Ｓｏｘ−１７、Ｆｏｘ−Ａ２、ＨＮＦ−４ａ、ＨＮＦ−６及びＡＦＰの発現が、リアルタイムＰＣＲにより測定された。代表的な実験結果を図１に示す。結果は、マトリゲル（MATRIGEL）（Ｏｆｆ ＭＧ、図１）上でのヒト胚幹細胞に対して正規化された。ＣＸＣＲ４、Ｓｏｘ−１７、Ｆｏｘ−Ａ２、ＨＮＦ−４ａ、ＨＮＦ−６及びＡＦＰは、分化に関連するマーカーである。ヒトフィーダー細胞層上でのヒト胚幹細胞の培養は、これらのマーカー発現の低下をもたらした。これらのデータから、ヒト皮膚線維芽細胞株Ｄ５５１、ヒト***線維芽細胞Ｈｓ２７、及びＷＯ２００６０９４２８６号に開示されたヒト膵臓由来間質細胞株は、ヒト胚幹細胞の多能性を維持したことが示されている。

（実施例４）
ヒトフィーダー細胞層上で、膵内分泌系譜に特有のマーカーを発現する細胞への、ヒト胚幹細胞の分化
ヒト胚幹細胞株Ｈ１及びＨ９は、ワイセル研究所（WiCell Research Institute, Inc）（ウィスコンシン州マディソン）から入手され、入手源から提供された説明に従って培養された。不活性化された初代マウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上に維持された未分化Ｈ１＆Ｈ９ヒト胚幹細胞を、６０％ＦＢＳ、２０％ＤＭＳＯ、及び２０％ＤＭＥＭ／Ｆ１２（イントロビジェン（Invitrogen）／ギブコ（GIBCO））に、２０％ノックアウト血清代替物、１００ｎＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸、０．５ｍＭベータメルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ−グルタミンと、４ｎｇ／ｍＬヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（すべてイントロビジェン（Invitrogen）／ギブコ（GIBCO））を加えた中で、−１℃／分の速度で低温保存し、窒素蒸気中に保管した。この細胞を解凍し、ミトマイシン（mitocycin）Ｃ処理Ｄ５５１ヒト皮膚線維芽細胞を細胞数５２，０００個／ｃｍ^２の密度で播種した上に蒔いた。Ｄ５５１細胞上での３代継代培養後、多能性細胞を採取し、８ｎｇ／ｍＬ ｂＦＧＦを添加した不活性化ＭＥＦの培養から、条件付き培地のマトリゲル（MATRIGEL）に移した。マトリゲル（１：３０）上に蒔かれたヒト胚幹細胞を、６０ｍｍ組織培養プレートに入れ、加湿組織培養インキュベーター内で、３７℃、５％ＣＯ_２の雰囲気中で培養した。コンフルエントに達したら（蒔いてから約５〜７日後）、ヒト胚幹細胞を、１ｍｇ／ｍＬディスパーゼ（イントロビジェン（Invitrogen）／ギブコ（GIBCO））で２５〜４０分間処理した。細胞がプレートから遊離したら、２ｍＬの血清用ピペットで繰り返しピペット操作を行い、望ましいコロニーサイズを達成した。細胞を１０００ｒｐｍで５分間遠心分離にかけ、ペレットを再懸濁させ、マトリゲル（MATRIGEL）をコーティングした細胞培養プレート上の新しい培養培地内で、１：３〜１：４の細胞の比率で蒔いた。マトリゲル（MATRIGEL）上で１１回の継代培養後、多能性Ｈ１＆Ｈ９細胞を、下記のように数多くのさまざまなフィーダー細胞に移した。簡単に言うと、細胞は、ＥＳ細胞培地内のフィーダー上で培養され、このＥＳ細胞培地はＤＭＥＭ／Ｆ１２（イントロビジェン（Invitrogen）／ギブコ（GIBCO））に、２０％ノックアウト血清代替物、１００ｎＭ ＭＥＭ非必須アミノ酸、０．５ｍＭベータメルカプトエタノール、２ｍＭ Ｌ−グルタミンと、４ｎｇ／ｍＬヒト塩基性線維芽細胞増殖因子（ｂＦＧＦ）（すべてイントロビジェン（Invitrogen）／ギブコ（GIBCO））を加えたものから成り、これを組織培養処理された６ウェルプレート内に入れられた。プレートは、０．１％ゼラチン（シグマ（Sigma））でコーティングされ、３７℃で最低４時間インキュベートしてから、フィーダーを播種することによって調製された。播種の直前に、ゼラチンを吸引し、６ウェルプレートの各ウェルにフィーダー細胞懸濁液を配分した。細胞を５日間増殖させてから、分化プロトコルを開始した。

ヒトフィーダー細胞層がヒト胚幹細胞の分化を担持する能力が評価された。胚幹細胞を、ミトマイシンＣ不活性化ヒトフィーダー細胞層上で５日間培養した。市販のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ−ＳＭ）、及び新たに誘導されたマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ）上に蒔かれたヒト胚幹細胞の培養物が、対照標準として含められた。

ヒト胚幹細胞株Ｈ９（図２）及びＨ１（図５）の細胞集団の、胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞への分化を、ヒト皮膚線維芽細胞（Ｄ５５１、図２及び５）、ヒト***線維芽細胞（ＨＳ２７、図２及び５）、並びにＷＯ２００６０９４２８６号で開示されているヒト膵臓由来間質細胞株（ＨＰ、図２及び５）が担持する能力が、評価された。市販のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ−ＳＭ、図２及び５）並びに新たに誘導されたマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ、図２及び５）の上で培養された胚幹細胞集団が、対照標準として含められた。アクチビンＡ（１００ｎｇ／ｍＬ）が、フィーダー細胞層上で培養されたヒト胚幹細胞集団に添加された。細胞は、アクチビンＡの存在下で継続的に培養され、３日後に採取された。胚体内胚葉に特有のマーカーを発現するレベルが、リアルタイムＰＣＲによって解析された（図２及び５）。図２及び５に示す結果は、分化プロトコル開始前の細胞（Ｄ０）に正規化されている。

アクチビンＡは、マウス胚線維芽細胞及びヒトフィーダー細胞層上で培養された細胞において、ＣＸＣＲ４、Ｓｏｘ−１７及びＦｏｘ−Ａ２の発現の増加を引き起こした。これらのデータから、ヒトフィーダー細胞層は、ヒト胚幹細胞が、胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化するのを担持できることが示唆されている。

ヒト胚幹細胞株Ｈ９（図３）及びＨ１（図６）の細胞集団から誘導され、胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞集団の、膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞への分化を、ヒト皮膚線維芽細胞（Ｄ５５１、図３及び６）、ヒト***線維芽細胞（ＨＳ２７、図３及び６）、並びにＷＯ２００６０９４２８６号で開示されているヒト膵臓由来間質細胞株（ＨＰ、図３及び６）が担持する能力が、評価された。市販のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ−ＳＭ、図３及び６）並びに新たに誘導されたマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ、図３及び６）の上で培養された胚幹細胞集団が、対照標準として含められた。フィーダー細胞層上で培養されたヒト胚幹細胞から誘導された胚体内胚葉に特有のマーカーを発現する細胞集団に対し、１μＭレチノイン酸、０．２５ｕＭ ＫＡＡＤ−シクロパミン及びＦＧＦ−１０（５０ｎｇ／ｍＬ）が添加された。細胞は８日後に採取された。膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現するレベルが、リアルタイムＰＣＲによって解析された（図３及び６）。図３及び６に示されている結果は、Ｄ０遺伝子発現に対して正規化されている。

レチノール酸０．２５μＭ ＫＡＡＤシクロパミン、及びＦＧＦ−１０の処理により、マウス胚線維芽細胞上、及びヒトフィーダー細胞層上で培養された細胞において、Ｆｏｘ−Ａ２、ＨＮＦ−４ａ、ＨＮＦ−６及びＰＤＸ−１の発現の増加が引き起こされた。これらのデータから、ヒトフィーダー細胞層は、ヒト胚幹細胞株Ｈ９（図３）及びＨ１（図６）の細胞集団から、膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞へと誘導された、膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞の分化を、担持できることが示されている。

ヒト胚幹細胞株Ｈ９（図４）及びＨ１（図７）の細胞集団から誘導され、膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞集団の、膵内分泌系譜に特有のマーカーを発現する細胞への分化を、ヒト皮膚線維芽細胞（Ｄ５５１、図４及び７）、ヒト***線維芽細胞（ＨＳ２７、図４及び７）、並びにＷＯ２００６０９４２８６号で開示されているヒト膵臓由来間質細胞株（ＨＰ、図４及び７）が担持する能力が、評価された。市販のマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ−ＳＭ、図４及び７）並びに新たに誘導されたマウス胚線維芽細胞（ＭＥＦ、図４及び７）の上で培養された胚幹細胞集団が、対照標準として含められた。γ−セクレターゼ阻害剤ＤＡＰＴ（１μＭ）、エキセンジン−４、ＩＧＦ−１及びＨＧＦ（すべて５０ｎｇ／ｍＬ）を、フィーダー細胞層上で培養されたヒト胚幹細胞から誘導された、膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞集団に加えた。９日間の培養後、膵内分泌細胞に特有のマーカー発現のレベルが、リアルタイムＰＣＲで解析された（図４及び７）。図４及び７に示されている結果は、Ｄ０遺伝子発現に対して正規化されている。

γ−セクレターゼ阻害剤、エキセンジン−４、ＩＧＦ−１及びＨＧＦの処理により、マウス胚線維芽細胞上、及びヒトフィーダー細胞層上で培養された細胞において、Ｆｏｘ−Ａ２、ＨＮＦ−４ａ、ＨＮＦ−６、ｎｅｕｒｏ−Ｄ１、Ｎｋｘ２．２、Ｐａｘ−４、Ｎｋｘ６．１、ＰＤＸ−１、グルカゴン、及びインスリンの発現の増加が引き起こされた。これらのデータから、ヒトフィーダー細胞層は、ヒト胚幹細胞株Ｈ９（図３）及びＨ１（図６）の細胞集団から、膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞へと誘導された、膵内分泌系譜に特有のマーカーを発現する細胞の分化を、担持できることが示されている。インスリン及びグルカゴンの発現は、マウスフィーダー細胞層上よりも、ヒトフィーダー細胞層上で培養された細胞の方が高かった。これらのデータから、ヒトフィーダー細胞層は、ヒト胚幹細胞分化を担持する能力がより高いことが示されている。

本明細書全体にわたって引用されている文献は、参照により全体が本明細書に組み込まれる。本発明のさまざまな態様が、例及び好ましい実施形態に対して参照により上記に説明されているが、本発明の権利範囲は前述の説明によって定義されるものではなく、特許法の原則のもとに適切に解釈される下記の特許請求の範囲によって定義されるものであることが理解されるであろう。

〔実施態様〕
（１） ａ．多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．該多能性幹細胞を、ヒトフィーダー細胞層上に蒔く工程と、
ｃ．該多能性幹細胞の分化を促進する少なくとも１つの因子で、該多能性幹細胞を処理する工程と、を含む、多能性幹細胞を分化させる方法。
（２） 前記ヒトフィーダー細胞層が、皮膚線維芽細胞を含む、実施態様１に記載の方法。
（３） 前記ヒトフィーダー細胞層が、***線維芽細胞を含む、実施態様１に記載の方法。
（４） 前記ヒトフィーダー細胞層が、膵臓由来間質細胞を含む、実施態様１に記載の方法。
（５） 前記多能性幹細胞が、胚幹細胞である、実施態様１に記載の方法。
（６） 前記胚幹細胞が、ヒト胚幹細胞である、実施態様５に記載の方法。
（７） 前記膵臓由来間質細胞が、ＮＣＡＭ、ＡＢＣＧ２、サイトケラチン７、サイトケラチン８、サイトケラチン１８、及びサイトケラチン１９からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質マーカーの発現において実質的に陰性である、実施態様４に記載の方法。
（８） 前記膵臓由来間質細胞が、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質マーカーの発現において実質的に陽性である、実施態様４に記載の方法。
（９） 前記多能性幹細胞が、胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化する、実施態様１に記載の方法。
（１０） 前記多能性幹細胞が、膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化する、実施態様１に記載の方法。

（１１） 前記多能性幹細胞が、膵内分泌系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化する、実施態様１に記載の方法。
（１２） 前記多能性幹細胞を培養する前記工程が、細胞外マトリックス上で達成される、実施態様１に記載の方法。
（１３） 前記多能性幹細胞を培養する前記工程が、ヒトフィーダー細胞層上で達成される、実施態様１に記載の方法。
（１４） ａ．多能性幹細胞を培養する工程と、
ｂ．該多能性幹細胞を、ヒトフィーダー細胞層上に蒔く工程と、
ｃ．該多能性幹細胞の分化を促進する少なくとも１つの因子で、該多能性幹細胞を処理する工程と、
ｄ．該多能性幹細胞の分化を促進する少なくとも１つの因子で処理した多能性幹細胞を、糖尿病を有するヒトの患者に移植する工程と、を含む、糖尿病を治療する方法。
（１５） 前記多能性幹細胞の前記分化を促進する少なくとも１つの因子で該多能性幹細胞を処理する前記工程が、該多能性幹細胞を膵内分泌系譜の細胞へと分化させる、実施態様１４に記載の方法。
（１６） 前記多能性幹細胞の前記分化が、２つ又はそれ以上の工程で達成され、各工程において、胚体内胚葉系譜、膵内胚葉系譜、及び膵内分泌系譜のうち１つ以上への細胞の分化を促進する少なくとも１つの因子によって細胞を処理することが必要である、実施態様１５に記載の方法。

Claims (16)

1. ａ．多能性幹細胞を培養する工程と、
   ｂ．該多能性幹細胞を、ヒトフィーダー細胞層上に蒔く工程と、
   ｃ．該多能性幹細胞の分化を促進する少なくとも１つの因子で、該多能性幹細胞を処理する工程と、を含む、多能性幹細胞を分化させる方法。
2. 前記ヒトフィーダー細胞層が、皮膚線維芽細胞を含む、請求項１に記載の方法。
3. 前記ヒトフィーダー細胞層が、***線維芽細胞を含む、請求項１に記載の方法。
4. 前記ヒトフィーダー細胞層が、膵臓由来間質細胞を含む、請求項１に記載の方法。
5. 前記多能性幹細胞が、胚幹細胞である、請求項１に記載の方法。
6. 前記胚幹細胞が、ヒト胚幹細胞である、請求項５に記載の方法。
7. 前記膵臓由来間質細胞が、ＮＣＡＭ、ＡＢＣＧ２、サイトケラチン７、サイトケラチン８、サイトケラチン１８、及びサイトケラチン１９からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質マーカーの発現において実質的に陰性である、請求項４に記載の方法。
8. 前記膵臓由来間質細胞が、ＣＤ４４、ＣＤ７３、ＣＤ９０及びＣＤ１０５からなる群から選択される少なくとも１つのタンパク質マーカーの発現において実質的に陽性である、請求項４に記載の方法。
9. 前記多能性幹細胞が、胚体内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化する、請求項１に記載の方法。
10. 前記多能性幹細胞が、膵内胚葉系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化する、請求項１に記載の方法。
11. 前記多能性幹細胞が、膵内分泌系譜に特有のマーカーを発現する細胞に分化する、請求項１に記載の方法。
12. 前記多能性幹細胞を培養する前記工程が、細胞外マトリックス上で達成される、請求項１に記載の方法。
13. 前記多能性幹細胞を培養する前記工程が、ヒトフィーダー細胞層上で達成される、請求項１に記載の方法。
14. ａ．多能性幹細胞を培養する工程と、
    ｂ．該多能性幹細胞を、ヒトフィーダー細胞層上に蒔く工程と、
    ｃ．該多能性幹細胞の分化を促進する少なくとも１つの因子で、該多能性幹細胞を処理する工程と、
    ｄ．該多能性幹細胞の分化を促進する少なくとも１つの因子で処理した多能性幹細胞を、糖尿病を有するヒトの患者に移植する工程と、を含む、糖尿病を治療する方法。
15. 前記多能性幹細胞の前記分化を促進する少なくとも１つの因子で該多能性幹細胞を処理する前記工程が、該多能性幹細胞を膵内分泌系譜の細胞へと分化させる、請求項１４に記載の方法。
16. 前記多能性幹細胞の前記分化が、２つ又はそれ以上の工程で達成され、各工程において、胚体内胚葉系譜、膵内胚葉系譜、及び膵内分泌系譜のうち１つ以上への細胞の分化を促進する少なくとも１つの因子によって細胞を処理することが必要である、請求項１５に記載の方法。

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