CN101705273A - 通过包括热循环的多重置换扩增来扩增靶核酸序列的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及扩增靶核酸序列的方法,该方法包括多重置换扩增和热循环。根据该方法,可有效地扩增靶核酸序列。
Description
技术领域
本发明的示例性实施方式涉及通过多重置换扩增来扩增靶核酸序列的方法,更具体而言,涉及包括热循环的通过多重置换扩增来扩增靶核酸序列的方法。
背景技术
已知各种扩增核酸的方法。这些方法包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反应(LCR)、自主序列复制(3SR)、基于核酸序列的扩增(NASBA)、链置换扩增(SDA)、使用Qβ复制酶的扩增和多重置换扩增(MDA)。
MDA是基于通过多元引物进行的靶核酸序列的链置换扩增。在MDA中,产生复制链并且在复制期间,至少一条复制链通过另一复制链的链置换复制而从靶核酸序列上置换下来。对于MDA而言,可利用的引物可包括与靶序列的一条链互补的引物组以及与靶序列的另一条链互补的引物组。而且,所述引物可为一组具有随机序列的引物。此外,所述引物可为这样的一组引物,该组中每一引物仅与靶序列的一条链杂交。
相关技术公开了一种扩增靶核酸序列的方法,其中该方法包括使一组引物、DNA聚合酶以及靶样品接触,并且在促进该靶序列的复制的条件下温育该靶样品。该靶样品未经历变性条件,并且该靶序列的复制产生复制链,其中在复制期间,所述复制链中的至少一条通过另一复制链的链置换复制而从该靶序列上置换下来。
MDA在基本上恒温的温度下进行,并且温育在足以促进引物与靶序列的杂交的低温下进行。也就是说,为了促进引物的杂交,在低于聚合酶活性最适温度的温度下进行温育。结果,只有在初始的变性和退火阶段结合、并且在相应位置处结合的引物发生扩增,因而可发生扩增偏差,由此降低扩增效率。
发明内容
本发明的示例性实施方式包括通过多重置换扩增(MDA),包括热循环,来扩增靶核酸序列的方法。
其它各方面有些在随后的说明中进行阐述,有些可从该说明中明晰,或者可通过所介绍的实施方式的实践而获知。
本发明的示例性实施方式可包括扩增靶核酸序列的方法,其中该方法包括:使一组引物、DNA聚合酶以及靶核酸序列在溶液中接触;和温育该溶液以复制该靶核酸序列,其中该靶核酸序列的复制产生复制链并且在复制期间,所述复制链中的至少一条通过另一复制链的链置换复制而从该靶序列上置换下来,其中进行所述温育时,在DNA聚合酶活性最适温度范围与促进所述引物与该靶序列杂交的温度范围之间进行热循环。
附图说明
图1的电泳图像显示在30℃或60℃扩增靶序列时、或者在约30℃与约60℃之间进行热循环时的扩增结果。
图2显示靶序列按照图1所示在约30℃与约60℃之间进行热循环时的扩增结果和使用对照产物获得的结果。
具体实施方式
现在将详细提及示例性实施方式,其实施例说明于附图中,其中相同的附图标记始终表示相同的要素。在这方面,当前的各实施方式可具有不同的形式并且不应解释为限于本文中所进行的说明。因此,仅在下面通过参照附图描述这些实施方式以解释本说明的各方面。
根据本发明实施方式的扩增靶核酸序列的方法包括使一组引物、DNA聚合酶和靶核酸在溶液中接触。
引物可具有约5至约20bp的长度。解链温度Tm可根据所使用的引物的长度和核苷酸组成以及反应溶液中的组分(例如阳离子的浓度)而不同。本文中所用术语“解链温度Tm”是指核酸分子的多份拷贝中一半核酸链处于双链状态而另一半处于“无规卷曲”状态时的温度。例如,当引物具有约5至约20bp的长度并且引物的核苷酸是天然核苷酸时,Tm可为约10℃至约80℃。引物可具有约5至约8bp的长度。引物可具有约6bp的长度。除了天然核苷酸之外,引物还可包括修饰的核苷酸。例如,引物可包括至少一个修饰的核苷酸并且因此是耐核酸酶的,例如是耐外切核酸酶的。修饰的核苷酸可为生物素化核苷酸、荧光标记的核苷酸、5-甲基-dCTP、BrdUTP、或5-(3-氨基烯丙基)-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸。引物可包括DNA或RNA引物。而且,引物可用可检测的标记物进行标记。引物组可包括多个引物。引物组可包括与靶核酸的同一条链互补的两个或更多个引物,例如,三个或更多个引物、或者四个或更多个引物、或者五个或更多个引物。引物组还可包括至少一个与靶核酸的另一条链互补的引物。引物组可包括多个引物并且各引物可包括互补部分,其中这些引物的这些互补部分各自与靶核酸的不同部分互补。引物组可包括具有随机核苷酸序列的引物。在本发明的实施方式中,引物可以是长度为5bp、6bp、7bp或8bp的随机引物、或其混合物。
DNA聚合酶活性最适温度可高于引物与靶序列杂交时的温度。详言之,DNA聚合酶的最适温度可高于与靶序列杂交的引物变性时的变性温度。在这种情况下,“变性温度”可为约50%或更多的双链变性时的温度、约60%或更多的双链变性时的温度、约70%或更多的双链变性时的温度、约80%或更多的双链变性时的温度、或者约90%或更多的双链变性时的温度。也就是说,当引物链和靶序列的双链的一部分例如约10%、约20%、约30%、约40%、或者约50%或更多未变性而保留时,可通过新引物的退火而改进扩增。
根据本发明的实施方式,术语“最适温度”可根据条件如反应溶液而不同,但在给定的缓冲液条件下所用聚合酶的最适温度对于本领域技术人员是显而易见的。本文中所用术语“最适温度范围”可为最适温度±10℃、或最适温度±5℃、或最适温度±2.5℃,并且低于在促进引物与靶序列杂交的温度范围内因温育而复制的链变性时的变性温度。术语“变性温度”与以上描述的相同。
根据本发明的实施方式,除非另外进行说明,术语“杂交温度”是指通过引物与靶序列之间的杂交而使一半的可杂交位点发生杂交时的温度.杂交温度可以由本领域技术人员通过实验或计算很容易地得出.可通过使用公开于SantaLucia.&Hicks(2004)Annu.Rev.Biophys.Biomol.Struct.,33:415-40中的方法计算杂交温度.
根据本发明的实施方式,“促进引物与靶序列杂交的温度范围”可以是促进了引物与靶序列之间的杂交的温度范围。为此,所述温度范围可等于或低于DNA聚合酶的最适温度-5℃、DNA聚合酶的最适温度-10℃、或DNA聚合酶的最适温度-15℃。
根据本发明的实施方式,DNA聚合酶的最适温度范围可为约30℃至约75℃,而促进引物与靶序列杂交的温度范围可为约0℃至约30℃。根据本发明的实施方式,DNA聚合酶的最适活化温度范围可为约30℃至约75℃,而促进引物与靶序列杂交的温度范围可为约0℃至约30℃。DNA聚合酶的最适温度范围例如DNA聚合酶的最适温度范围可为约32℃,外切(-)BstDNA聚合酶的最适温度范围可为约65℃,VENTTM外切DNA聚合酶的最适温度范围可为约75℃,9°Nm DNA聚合酶的最适温度范围可为约75℃,Klenow片段的最适温度范围可为约37℃,MMLV逆转录酶的最适温度范围可为约42℃。
DNA聚合酶为能进行链置换复制的聚合酶,其可为DNA聚合酶、Tts DNA聚合酶、M2DNA聚合酶、VENTTM DNA聚合酶、T5 DNA聚合酶、PRD1 DNA聚合酶、或Bst DNA聚合酶,但不限于此。
表1.DNA聚合酶及其特性
Bst DNAL片段 | VentR | VentR(外切) | Deep VentR | Deep VentR(外切) | 9°Nm | |
5′→3′外切核酸酶 | - | - | - | - | - | - |
3′→5′外切核酸酶 | - | ++ | - | +++ | - | + |
错误率a(×106) | ND | 57b | 190b | ND | ND | ND |
链置换 | ++++ | ++g | +++g | ++ | ++ | +++x |
切口平移 | - | - | - | - | - | - |
热稳定性 | + | +++ | +++ | +++ | +++ | +++ |
Km dNTP | ND | 60μMg | 40μMg | 50μMg | ND | 80μMx |
Km DNAd | ND | 0.1nMg | 0.1nMg | 0.01nMg | ND | 0.05nMx |
RNA引物延伸 | + | - | - | - | - | - |
从切口延伸 | + | + | + | + | + | + |
续表1
Therminator | Therminator II | Klenow片段polI | Klenow片段外切 | MMRT | |
5′→3′外切核酸酶 | - | - | - | - | - |
3′→5′外切核酸酶 | - | - | ++ | - | - |
错误率a(×106) | ND | ND | 18w | 100W | ND |
链置换 | + | + | ++ | ++ | +++ |
切口平移 | - | - | - | - | - |
热稳定性 | +++ | +++ | - | - | - |
Km dNTP | ND | ND | 4μMk | ND | 18μMp |
Km DNAd | ND | ND | ND | ND | ND |
RNA引物延伸y | + | + | + | + | ND |
从切口延伸 | + | + | + | + | ND |
MMRT:M-MulV逆转录酶,ND:未检测到
Km dNTP和Km DNA各自表示dNTP和DNA的米氏常数。
a:Kunkel等,(1987)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,84,4865-4869
b:Mattila,P.,Korpela,J.,Tenkanen,T.and Pitkanen,K.(1991),NucleicAcids Res.,19,4967-4973
d:Km DNA由引物-模板复合物的摩尔数表示。
g:Kong,H.M.,Kucera,R.B.and Jack,W.E.,(1993)J.Biol.Chem.,268,1965-1975.
k:Polesky,A.H.,Steitz,T.A.,Grindley,N.D.F.and Joyce,C.M.(1990)J.Biol.Chem.,265,14579-14591.
p:Ricchetti,M.and Buc,H.(1990)EMBO J.,9,1583-1593
x:Southworth,M.W.等,(1996)Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93,5281-5285.
w:Bebenek,K.,Joyce,C.M.,Fitzgerald,M.P.and Kunkel,T.A.(1990)J.Biol.Chem.,265,13878-13887.
y:引入到RNA或DNA引物中的dNTP的量与使用单链M13DNA作为模板时相比较
根据本发明的实施方式,DNA聚合酶可为DNA聚合酶,并且最适温度范围可为约30℃至约34℃,例如约32℃,并且促进杂交时的温度可为约4℃至约22℃,例如约20℃。在该情况下,引物可为具有约6bp长度的随机引物或者具有特定序列的引物。
根据本发明的实施方式,DNA聚合酶可为外切(-)Bst DNA聚合酶,最适温度范围可为约46℃至约75℃,例如约65℃,并且促进杂交时的温度可为约4℃至约35℃,例如约30℃.在该情况下,引物可为具有约6bp长度的随机引物或者具有特定序列的引物.
靶核酸的形式可为选自以下的材料:血液、尿、***、淋巴液、脑脊髓液、羊水、活组织检查样品、针抽吸活组织检查样品、maycer样品、肿瘤样品、组织样品、细胞、细胞碎片、辅助碎片(auxiliary debris)、以及前述材料中的至少两种的组合。靶核酸可为包含整个基因组的样品或者为整个基因组本身。
引物、DNA聚合酶和靶核酸可在合适的溶液中接触。所述合适的溶液可根据本领域技术人员用于扩增核酸序列的聚合酶的类型而有不同。例如,当DNA聚合酶为DNA聚合酶时,所述合适的溶液可为包含约37mMTris-HCl(pH 8.0)、约50mM KCl、约10mM MgCl2和约5mM(NH4)2SO4的溶液。
在根据本发明实施方式的方法中,进行接触可包括或者可不包括这样的初始操作,该初始操作包括使引物和靶序列变性(例如高温变性)并进行退火。然而,除了该初始操作之外,靶序列可不暴露于使靶序列变性的条件下。如果聚合酶是热稳定的,则可在聚合酶的存在下进行变性和退火。
根据本发明实施方式的方法可包括温育该溶液以复制靶核酸序列。可在DNA聚合酶活性最适温度范围与促进引物与靶序列杂交的温度范围之间进行热循环时进行温育。DNA聚合酶的最适温度范围和促进引物与靶序列杂交的温度范围可与以上所描述的相同。热循环可包括,在“DNA聚合酶的最适温度范围”内温育该溶液一段预定的时间,例如,约30秒至约6小时,并且在“促进引物与靶序列杂交的温度范围”内温育该溶液一段预定的时间,例如约30秒至约3分钟。详言之,首先在“促进引物与靶序列杂交的温度范围”内温育该溶液以使引物相对于靶序列发生退火和延伸,然后在“DNA聚合酶的最适温度范围”内进行温育。然而,相反的情况也是可以的。
可在有聚合酶进行聚合所用的反应组分如dNTP、ATP或盐存在的条件下进行温育。
在根据本发明实施方式的方法中,可在靶核酸不变性的条件下进行温育。
在根据本发明实施方式的方法中,靶核酸的复制产生复制链并且在复制期间,复制链中的至少一条通过另一复制链的链置换复制而从靶序列上置换下来。如上所述,本发明实施方式中所用的DNA聚合酶需要与单一的或合适的链置换因子组合并在复制期间置换杂交链。在下文中,将DNA聚合酶称作链置换DNA聚合酶。链置换DNA聚合酶可不具有5′→3′外切核酸酶活性。链置换是需要的,以便合成靶序列的多份拷贝。如果存在5′→3′外切核酸酶活性,则可毁坏所合成的链。可通过链置换因子如解旋酶促进链置换。链置换DNA聚合酶可为高度有效的(highly processive)。由于链置换,从多重置换拷贝进行复制,这样的扩增方法称为多重置换扩增(MDA)。多重置换扩增在本领域中是已知的(参见US 6,124,120,将其内容全部引入本文作为参考)。
根据本发明的实施方式,靶核酸序列包括DNA、RNA和PNA。而且,除了天然核苷酸之外,靶核酸序列还包括修饰的核苷酸。靶核酸可为双链或单链核酸。
将参照以下实施例进一步详细描述以上实施方式。这些实施例仅用于说明性目的并且不意图限制本发明实施方式的范围。
实施例
实施例1:热循环对多重置换扩增的影响
在本实施例中,使用外切(-)Bst DNA聚合酶(New England Biolab)作为Bst DNA聚合酶。将外切(-)Bst DNA聚合酶、六聚体随机引物(Bioneer Co.,Korea)、以及通过使用血液DNA纯化试剂盒(Qiagen Co.)纯化血液而获得的人类基因组样品在Bst DNA聚合酶缓冲液(约20mM Tris-HCl、约10mM(NH4)2SO4、约10mM KCl、约2mM MgSO4、约0.1%Triton X-100、pH约8.8、约25℃)(New England Biolab)中进行接触,然后在约30℃或约60℃温育,或者当在约30℃与约60℃之间进行热循环时进行温育。当在约30℃与约60℃之间进行热循环时,是在聚合酶链反应(PCR)装置中,在30℃进行约20秒、和在约60℃进行约40秒。
已知外切(-)Bst DNA聚合酶在约65℃具有最佳活性(Mead,D.A.等,(1991)Biotechniques,11,76-87)。在反应完成后,用电泳装置使所得扩增产物在约1%凝胶中电泳,随后用SYBR Green I对双链DNA进行特异性标记。然后,所得产物用波长约480nm的激发光辐照,并检测580nm的发射光。
图1的电泳图像显示在约30℃或约60℃扩增靶序列时,或者在约30℃与约60℃之间进行热循环时的扩增结果。如图1所示,与在30℃或60℃进行反应时相比,当在约30℃与约60℃之间进行热循环时的短时间段期间,靶序列扩增得更多。在图1中,M为分子量标志物,0.5h、1h、1.5h和2h分别表示0.5小时、1小时、1.5小时和2小时。
图2显示热循环按照图1所示在约30℃与约60℃之间进行时靶序列的扩增结果以及使用对照样品所获得的结果。该对照样品为REPLI-G ULTRAKit(Qiagen Co.)。现在将详细描述详细的反应条件。将50ng模板DNA用变性缓冲液和复性缓冲液各处理2分钟,然后用1X反应缓冲液和1X酶混合物进行处理。
如图2所示,与使用对照产物时相比,当按照本发明实施方式的方法在约30℃与约60℃之间进行热循环期间扩增靶序列时,扩增产物类似于原始的模板。在图2中,T表示完整的纯化的人类基因组,M表示分子量标志物,并且0.5h、1h、1.5h和2h分别表示0.5小时、1小时、1.5小时和2小时。将约50ng模板DNA、约100μM随机六聚体引物、约1X热稳定的Bst DNA聚合酶缓冲液(约20mM Tris-HCl、约10mM(NH4)2SO4、约10mM KCl、约2mM MgSO4、约0.1%Triton X-100、约25℃、pH值约为8.8)、以及约10单位Bst DNA聚合酶混合,将约30℃温育约20秒和约60℃温育约40秒的热循环反复进行,直至过了上述时间,即,约0.5小时、约1小时、约1.5小时和约2小时。
如上所述,可基于以下机理实现在进行热循环时靶序列扩增效率的改善。然而,本发明的实施方式不限于该机理。
首先,将随机六聚体引物、外切(-)Bst DNA聚合酶和人类基因组在约60℃温育以使一部分人类基因组的序列变性。然而,由于60℃是高于随机六聚体引物的Tm的温度,因而随机六聚体引物不与该靶序列杂交。当将温育温度降至约30℃时,随机六聚体引物与该靶序列杂交并延伸。然后,将温育温度升至约60℃,延伸的随机六聚体引物将部分地变性并且可以不与靶序列分离。当将温育温度从约60℃降至约30℃时,新的随机六聚体引物杂交与已在约60℃变性的那部分靶序列杂交并延伸。如上所述,由于热循环,引物的退火增加并且因而引物的延伸也增加。因此,靶序列的扩增效率增加。
根据本发明实施方式的扩增靶核酸序列的方法,可有效地扩增靶核酸序列。
应理解,本文中所述示例性实施方式应当仅在说明性意义上考虑,而不应当用于限制目的。各实施方式中的特征或方面的描述应当通常认为可用于其它实施方式中的其它类似特征或方面。
Claims (17)
1.扩增靶核酸序列的方法,该方法包括:
使一组引物、DNA聚合酶以及靶核酸序列在溶液中接触;和
温育该溶液以复制该靶核酸序列,
其中该靶核酸序列的复制产生复制链,并且在复制期间,所述复制链中的至少一条通过另一复制链的链置换复制而从该靶序列上置换下来,
其中所述温育时在两个温度范围之间进行热循环,其中一个温度范围是该DNA聚合酶的活性最适温度范围,另一个温度范围是促进所述引物与该靶序列杂交的温度范围。
2.权利要求1的方法,其中所述引物包括随机核苷酸序列或特定序列。
3.权利要求1的方法,其中所述引物具有约5至约20bp的长度。
4.权利要求1的方法,其中所述引物具有约5至约8bp的长度。
5.权利要求1的方法,其中所述引物具有约6bp的长度。
6.权利要求1的方法,其中该DNA聚合酶的最适温度高于杂交至该靶序列上的引物发生变性时的变性温度,并且低于在促进所述引物与该靶序列杂交的温度范围内进行温育期间复制链发生变性时的变性温度。
7.权利要求1的方法,其中该DNA聚合酶的最适温度范围为约40℃至约65℃。
8.权利要求1的方法,其中促进所述引物与该靶序列杂交的温度范围为约0℃至约35℃。
10.权利要求1的方法,其中该DNA聚合酶包括外切(-)Bst DNA聚合酶,该DNA聚合酶的最适温度范围为约46℃至约75℃,并且促进所述引物与该靶序列杂交的温度范围为约4℃至约35℃。
11.权利要求10的方法,其中所述引物包括具有约6bp长度的随机引物或具有特定序列的引物。
12.权利要求11的方法,其中所述引物包括至少一种修饰的核苷酸,其中所述引物是耐核酸酶的。
13.权利要求12的方法,其中该修饰的核苷酸包括生物素化核苷酸、荧光标记核苷酸、5-甲基-dCTP、BrdUTP、或5-(3-氨基烯丙基)-2′-脱氧尿苷-5′-三磷酸。
14.扩增靶核酸序列的方法,该方法包括:
使一组引物、DNA聚合酶以及靶核酸序列在溶液中接触;和
温育该溶液以复制该靶核酸序列,
其中所述温育时在该DNA聚合酶的活性最适温度范围与另一温度范围之间进行热循环,所述另一温度范围是促进所述引物与该靶序列杂交的温度范围,
其中该DNA聚合酶的最适温度高于杂交至该靶序列上的引物发生变性时的变性温度,并且低于在促进所述引物与该靶序列杂交的温度范围内进行温育期间复制链发生变性时的变性温度。
15.权利要求14的方法,其中该靶核酸序列的复制产生复制链,并且在复制期间,所述复制链中的至少一条通过另一复制链的链置换复制而从该靶序列上置换下来。
16.扩增靶核酸序列的方法,该方法包括:
使一组引物、DNA聚合酶以及靶核酸序列在溶液中接触;和
温育该溶液以复制该靶核酸序列,
其中所述温育时,在该DNA聚合酶的活性最适温度范围与另一温度范围之间进行热循环,所述另一温度范围是促进所述引物与该靶序列杂交的温度范围,
其中该DNA聚合酶包括外切(-)Bst DNA聚合酶,该DNA聚合酶的最适温度范围为约46℃至约75℃,并且促进所述引物与该靶序列杂交的温度范围为约4℃至约35℃。
17.权利要求16的方法,其中该靶核酸序列的复制产生复制链,并且在复制期间,所述复制链中的至少一条通过另一复制链的链置换复制而从该靶序列上置换下来。
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US9598724B2 (en) | 2007-06-01 | 2017-03-21 | Ibis Biosciences, Inc. | Methods and compositions for multiple displacement amplification of nucleic acids |
ES2628739T3 (es) * | 2009-10-15 | 2017-08-03 | Ibis Biosciences, Inc. | Amplificación por desplazamiento múltiple |
DK2756098T3 (en) * | 2011-09-16 | 2018-09-03 | Lexogen Gmbh | Process for Preparing a Library of Nucleic Acid Molecules |
ES2961374T3 (es) * | 2015-04-24 | 2024-03-11 | Atila Biosystems Incorporated | Amplificación con cebadores de composición de nucleótidos limitada |
AU2018313286A1 (en) | 2017-08-11 | 2020-03-12 | Atila Biosystems Incorporated | Digital amplification with primers of limited nucleotide composition |
US20220056498A1 (en) | 2019-01-25 | 2022-02-24 | President And Fellows Of Harvard College | Compositions and method for synthesizing nucleic acids |
CN115176027A (zh) | 2019-12-12 | 2022-10-11 | 哈佛大学校长及研究员协会 | 用于光指导的生物分子条形码化的组合物和方法 |
Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6124120A (en) * | 1997-10-08 | 2000-09-26 | Yale University | Multiple displacement amplification |
Family Cites Families (6)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4683202A (en) * | 1985-03-28 | 1987-07-28 | Cetus Corporation | Process for amplifying nucleic acid sequences |
US5876924A (en) * | 1994-06-22 | 1999-03-02 | Mount Sinai School Of Medicine | Nucleic acid amplification method hybridization signal amplification method (HSAM) |
US6323009B1 (en) * | 2000-06-28 | 2001-11-27 | Molecular Staging, Inc. | Multiply-primed amplification of nucleic acid sequences |
US6977148B2 (en) * | 2001-10-15 | 2005-12-20 | Qiagen Gmbh | Multiple displacement amplification |
JP2005333920A (ja) * | 2004-05-28 | 2005-12-08 | Aisin Seiki Co Ltd | 等温増幅可能な鎖置換dnaポリメラーゼを用いたテンプレートdna分子の増幅方法 |
JP2009506788A (ja) * | 2005-09-06 | 2009-02-19 | ジェン−プローブ・インコーポレーテッド | 核酸の等温増幅のための方法、組成物及びキット |
-
2008
- 2008-08-08 KR KR1020080078141A patent/KR20100019220A/ko not_active Application Discontinuation
-
2009
- 2009-08-06 US US12/536,939 patent/US20100035303A1/en not_active Abandoned
- 2009-08-06 CN CN200910165728A patent/CN101705273A/zh active Pending
- 2009-08-10 EP EP09167522.3A patent/EP2151506B1/en not_active Not-in-force
Patent Citations (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6124120A (en) * | 1997-10-08 | 2000-09-26 | Yale University | Multiple displacement amplification |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
DAVID YONG ZHANG ET AL: "Amplification of target-specific, ligation-dependent circular probe", 《GENE》 * |
ENRIQUE VIGUERA ET AL: "In vitro Replication Slippage by DNA Polymerases from Thermophilic Organisms", 《J. MOL. BIOL.》 * |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
KR20100019220A (ko) | 2010-02-18 |
EP2151506B1 (en) | 2013-04-17 |
EP2151506A1 (en) | 2010-02-10 |
US20100035303A1 (en) | 2010-02-11 |
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