KR102014989B1 - 폴리뉴클레오티드 및 그의 용도 - Google Patents

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Abstract

표적 핵산에 대하여 상보적인 영역, 표적 핵산과 동일한 서열을 가지는 영역, 및 스템-루프 구조를 가지는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 그의 용도에 관한 것이다.

Description

폴리뉴클레오티드 및 그의 용도{Polynucleotide and use thereof}
표적 핵산에 대하여 상보적인 영역, 표적 핵산과 동일한 서열을 가지는 영역, 및 스템-루프 구조를 가지는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드 및 그의 용도에 관한 것이다.
의료 분야에서 얻어지는 시료의 양은 소량이며 여러 종류의 핵산이 혼합된 혼합물로 존재한다. 시료에 존재하는 표적 핵산은 분석에 필요한 양으로 증폭시켜야 정확한 분석을 할 수 있다.
또한, 특정 유전자의 돌연변이, 결실, 삽입, 융합 또는 역위 등의 변이가 있는 경우에, 비용을 절감하기 위해서는 특정 유전자만을 정확하게 검출하여 시퀀싱하는 것이 필요하다. 따라서, 서열 특이적 증폭을 통해 질병 특이적 유전자를 특이적으로 증폭하는 기술을 개발할 필요가 있다.
표적 핵산에 대하여 상보적인 영역, 표적 핵산과 동일한 서열을 가지는 영역, 및 스템-루프 구조를 가지는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
표적 핵산에 대하여 상보적인 영역, 표적 핵산과 동일한 서열을 가지는 영역, 및 스템-루프 구조를 가지는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 표적 핵산을 증폭하기 위한 조성물을 제공한다.
표적 핵산에 대하여 상보적인 영역, 표적 핵산과 동일한 서열을 가지는 영역, 및 스템-루프 구조를 가지는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 표적 핵산을 증폭하기 위한 키트를 제공한다.
표적 핵산에 대하여 상보적인 영역, 표적 핵산과 동일한 서열을 가지는 영역, 및 스템-루프 구조를 가지는 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드를 사용하여 표적 핵산을 증폭하는 방법을 제공한다.
일 양상은 3'-말단으로부터 2 이상의 연속 뉴클레오티드가 표적 핵산의 2 이상의 연속 뉴클레오티드와 상보적인 제1 영역;
제1 영역의 5' 방향으로부터 2 이상의 연속 뉴클레오티드가 표적 핵산의 2 이상의 연속 뉴클레오티드와 동일한 서열을 가지는 제2 영역; 및
제2 영역의 5'-방향으로부터 스템-루프 구조를 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서,
상기 제1 영역은 표적 핵산의 뉴클레오티드 순서를 기준으로 제2 영역과 동일한 서열을 가지는 표적 핵산의 영역으로부터 3' 방향의 뉴클레오티드에 혼성화하는 것인 폴리뉴클레오티드를 제공한다.
상기 폴리뉴클레오티드의 제1 영역은 3'-말단으로부터 2 이상의 연속 뉴클레오티드가 표적 핵산의 3'-말단 영역으로부터 3' 말단 뉴클레오티드를 포함한 2 이상의 연속 뉴클레오티드와 상보적인 것일 수 있다. 상기 제1 영역은 예를 들면, 표적 핵산의 3'-말단 영역으로부터 3' 말단 뉴클레오티드(이하, 'nt'라고 함)를 포함한 5 nt 내지 50 nt, 5 nt 내지 45 nt, 5 nt 내지 40 nt, 5 nt 내지 35 nt, 10 nt 내지 35 nt, 또는 15 nt 내지 35 nt의 연속 뉴클레오티드와 상보적인 것일 수 있다. 상기 제1 영역은 프라이머로 작용할 수 있다. 상기 용어 "프라이머(primer)"는 적합한 온도에서 적합한 버퍼 내에서 적합한 조건(예를 들면, 4종의 다른 뉴클레오시드 트리포스페이트 및 중합 반응 효소)에서 주형-지시 DNA 합성의 개시점으로 작용할 수 있는 단일 가닥의 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 상기 프라이머는 주형의 한 부위에 혼성화 또는 어닐링되어, 이중쇄 구조를 형성할 수 있다. 이러한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 당업자에게 잘 알려져 있다.
상기 폴리뉴클레오티드의 제2 영역은 5'-말단으로부터 2 이상의 연속 뉴클레오티드가 표적 핵산의 5'-말단 영역으로부터 5' 말단 뉴클레오티드를 포함한 2 이상의 연속 뉴클레오티드와 동일한 서열을 가지는 것일 수 있다. 예를 들면, 표적 핵산의 3'-말단 영역으로부터 3' 말단 뉴클레오티드(이하, 'nt'라고 함)를 포함한 5 nt 내지 50 nt, 5 nt 내지 45 nt, 5 nt 내지 40 nt, 5 nt 내지 35 nt, 10 nt 내지 35 nt, 또는 15 nt 내지 35 nt의 연속 뉴클레오티드와 상보적인 것일 수 있다. 상기 제2 영역은 표적 서열과 동일한 서열을 가지기 때문에, 프라이머로부터 연장되어 표적 서열에 상보적인 서열을 가지는 연장된 산물과 상기 폴리뉴클레오티드의 제2 영역은 자가-혼성화될 수 있다. 상기 용어 "혼성화(hybridization)"는 뉴클레오티드 서열이 상보적인 염기 배열에 의해 결합하는 것을 말한다. 또한, 상기 용어 "자가-혼성화(self-hybridization)"는 동일 분자 내 뉴클레오티드 서열이 혼성화하는 것을 말한다.
상기 폴리뉴클레오티드의 제3 영역은 스템-루프 구조를 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 상기 용어 "스템-루프(stem-loop)"는 동일한 가닥에 뉴클레오티드 서열과 그의 역방향으로 상보적인 서열이 존재하고 그 사이에 상보적이지 않은 서열이 존재하는 경우에 분자 내 염기 쌍 형성(intramolecular base pairing)으로 생기는 구조를 말한다. 용어 "스템-루프"는 용어 "헤어핀(hairpin)" 또는 용어 "헤어핀 루프(hairpin loop)"와 상호교환적으로 사용될 수 있다. 상기 제3 영역의 길이는 예를 들면 10 nt 내지 100 nt, 10 nt 내지 90 nt, 10 nt 내지 80 nt, 10 nt 내지 70 nt, 10 nt 내지 60 nt, 20 nt 내지 60 nt 또는 25 nt 내지 60 nt일 수 있다.
상기 제3 영역은 5'-말단이 인산화(phosphrylation)된 것일 수 있다. 5'-말단을 인산화시키는 효소는 당업계에 알려진 효소일 수 있다. 예를 들면, 5'-말단을 인산화시키는 효소는 T4 폴리뉴클레오티드 키나제 (T4 PNK) 또는 그의 변이체인 것일 수 있다. 인산화시키는 조건은 선택되는 효소에 따라 당업자가 적절하게 선택할 수 있다. 인산화된 제3 영역의 5'-말단과 연장된 산물의 3'-말단은 라이게이션되어 환형의 폴리뉴클레오티드를 형성할 수 있다.
상기 제3 영역을 프라이머 결합 부위, 제한효소 인식 부위, 프로브 결합 부위 또는 이들의 조합을 포함할 수 있다. 제3 영역과 상보적인 프라이머는 표적 서열과 관계없이 증폭하는데 이용할 수 있기 때문에 유니버셜(universal) 프라이머로 이용할 수 있다. 제한 효소 및 제한 효소 인식 부위는 당업자가 적절하게 선택할 수 있다. 상기 용어 "제한 효소(restriction enzyme)"는 DNA의 특정한 염기배열을 식별하고 이중사슬을 절단하는 엔도뉴클레아제를 말한다. 용어 "제한 효소 인식 부위(restriction enzyme recognition site)"는 제한 효소가 인지하여 작용하는 DNA 내부에 존재가 짧은 서열을 말한다. 상기 제3 영역은 시료 중의 표적 핵산의 존재를 확인하기 위한 프로브로서 사용될 수 있다.
상기 폴리뉴클레오티드는 DNA, RNA, 펩티드 핵산(Peptide Nucleic Acid; PNA), 잠금 핵산(Locked Nucleic Acid; LNA) 또는 뉴클레오티드 유사체(nucleotide analogue)를 포함하는 것일 수 있다.
다른 양상은 3'-말단으로부터 2 이상의 연속 뉴클레오티드가 표적 핵산의 2 이상의 연속 뉴클레오티드와 상보적인 제1 영역, 제1 영역의 5' 방향으로부터 2 이상의 연속 뉴클레오티드가 표적 핵산의 2 이상의 연속 뉴클레오티드와 동일한 서열을 가지는 제2 영역, 및 제2 영역의 5'-방향으로부터 스템-루프 구조를 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 제1 영역은 표적 핵산의 뉴클레오티드 순서를 기준으로 제2 영역과 동일한 서열을 가지는 표적 핵산의 영역으로부터 3' 방향의 뉴클레오티드에 혼성화하는 것인 폴리뉴클레오티드; 및
표적 핵산을 포함하는 표적 핵산을 증폭하기 위한 조성물을 제공한다.
상기 조성물에 있어서, 폴리뉴클레오티드는 전술한 바와 같다.
상기 표적 핵산은 DNA, RNA 또는 상보적 DNA(complementary DNA,cDNA)일 수 있다. 상기 표적 핵산은 단일가닥 또는 이중가닥인 것일 수 있다. 상기 표적 핵산은 특정 유전자의 돌연변이, 결실, 삽입, 융합 또는 역위 등의 변이를 포함하는 것일 수 있다. 상기 표적 핵산은 길이가 15 nt 내지 300 nt, 15 nt 내지 250 nt, 15 nt 내지 200 nt, 15 nt 내지 150 nt, 30 nt 내지 150 nt, 또는 50 nt 내지 150 nt인 것일 수 있다. 상기 표적 핵산은 길이가 작은 RNA일 수 있다.
상기 조성물은 표적 핵산을 증폭하기 위한 조성물이다. 따라서, 상기 조성물은 표적 핵산의 증폭에 요구되는 알려진 물질을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 조성물은 핵산 폴리머라제, 그의 활성에 필요한 버퍼, 보조인자, 및/또는 기질을 더 포함할 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 DNA 폴리머라제, RNA 폴리머라제, 역전사 효소(reverse transcriptase) 및 이들의 조합일 수 있다. 상기 핵산 폴리머라제는 가닥-치환 활성을 갖는 것일 수 있다.
다른 양상은 3'-말단으로부터 2 이상의 연속 뉴클레오티드가 표적 핵산의 2 이상의 연속 뉴클레오티드와 상보적인 제1 영역, 제1 영역의 5' 방향으로부터 2 이상의 연속 뉴클레오티드가 표적 핵산의 2 이상의 연속 뉴클레오티드와 동일한 서열을 가지는 제2 영역, 및 제2 영역의 5'-방향으로부터 스템-루프 구조를 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 제1 영역은 표적 핵산의 뉴클레오티드 순서를 기준으로 제2 영역과 동일한 서열을 가지는 표적 핵산의 영역으로부터 3' 방향의 뉴클레오티드에 혼성화하는 것인 폴리뉴클레오티드;
표적 핵산; 및
핵산 폴리머라제를 포함하는 표적 핵산을 증폭하기 위한 키트를 제공한다.
상기 조성물에 있어서, 폴리뉴클레오티드, 표적 핵산 및 핵산 폴리머라제는 전술한 바와 같다.
상기 키트는 표적 핵산의 증폭에 요구되는 알려진 물질을 더 포함할 수 있다. 예를 들면, 상기 키트는 핵산 폴리머라제의 활성에 필요한 버퍼, 보조인자, 및/또는 기질을 더 포함할 수 있다.
다른 양상은 3'-말단으로부터 2 이상의 연속 뉴클레오티드가 표적 핵산의 2 이상의 연속 뉴클레오티드와 상보적인 제1 영역, 제1 영역의 5' 방향으로부터 2 이상의 연속 뉴클레오티드가 표적 핵산의 2 이상의 연속 뉴클레오티드와 동일한 서열을 가지는 제2 영역, 및 제2 영역의 5'-방향으로부터 스템-루프 구조를 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 제1 영역은 표적 핵산의 뉴클레오티드 순서를 기준으로 제2 영역과 동일한 서열을 가지는 표적 핵산의 영역으로부터 3' 방향의 뉴클레오티드에 혼성화하는 것인 폴리뉴클레오티드와 표적 핵산을 포함하는 시료를 인큐베이션시켜 혼성화 산물을 형성하는 단계;
상기 혼성화 산물을 제1 핵산 폴리머라제의 존재 하에서 인큐베이션시켜, 상기 폴리뉴클레오티드의 3'-말단으로부터 상기 표적 핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 연장시켜 연장 산물을 형성하는 단계로서, 상기 연장 산물은 상기 폴리뉴클레오티드의 제2 영역에 상보적인 서열을 포함하는 것인 단계;
상기 연장 산물을 리가제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 환형의 연장 산물을 생성시키는 단계; 및
상기 환형의 연장 산물을 제2 핵산 폴리머라제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 표적 핵산을 증폭하는 단계를 포함하는 표적 핵산을 증폭하는 방법을 제공한다.
상기 방법은 3'-말단으로부터 2 이상의 연속 뉴클레오티드가 표적 핵산의 2 이상의 연속 뉴클레오티드와 상보적인 제1 영역, 제1 영역의 5' 방향으로부터 2 이상의 연속 뉴클레오티드가 표적 핵산의 2 이상의 연속 뉴클레오티드와 동일한 서열을 가지는 제2 영역, 및 제2 영역의 5'-방향으로부터 스템-루프 구조를 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 제1 영역은 표적 핵산의 뉴클레오티드 순서를 기준으로 제2 영역과 동일한 서열을 가지는 표적 핵산의 영역으로부터 3' 방향의 뉴클레오티드에 혼성화하는 것인 폴리뉴클레오티드와 표적 핵산을 포함하는 시료를 인큐베이션시켜 혼성화 산물을 형성하는 단계를 포함한다.
상기 폴리뉴클레오티드 및 표적 핵산은 전술한 바와 같다.
상기 시료는 생물학적 시료일 수 있다. 상기 생물학적 시료는 바이러스 또는 생물 유래의 시료를 포함할 수 있다. 예를 들면, 시료는 혈액, 타액, 뇨, 분변, 조직, 세포, 생검물 또는 이들의 조합일 수 있다. 시료는 보관된 생물학적 시료 또는 그로부터 분리된 DNA 또는 RNA를 포함하는 것일 수 있다. 상기 보관은 알려진 방법에 의하여 보관된 것일 수 있다. 상기 보관은 1년 이상, 예를 들면, 1년 내지 10년 동안 보관된 것일 수 있다. 상기 주형 DNA 또는 RNA는 냉동 보관 또는 포르말린 고정된 파라핀 임베드된 조직을 상온에서 보관한 조직으로부터 유래된 DNA 또는 RNA인 것일 수 있다. 생물학적 시료로부터 DNA 또는 RNA를 분리하는 방법은 알려져 있다. RNA를 DNA로 전환하는 방법은 알려져 있다.
상기 인큐베이션은 혼성화에 적합한 조건 하에서 이루어질 수 있다. 혼성화에 의한 이중쇄 구조를 형성하는 데 적합한 핵산 혼성화의 조건은 당업자에게 잘 알려져 있다. 인큐베이션에 의해 표적 핵산과 이에 상보적인 상기 폴리뉴클레오티드의 제1 영역은 혼성화될 수 있다.
상기 방법은 일 구체예에 따른 혼성화 산물을 제1 핵산 폴리머라제의 존재 하에서 인큐베이션시켜, 상기 폴리뉴클레오티드의 3'-말단으로부터 상기 표적 핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 연장시켜 연장 산물을 형성하는 단계로서, 상기 연장 산물은 상기 폴리뉴클레오티드의 제2 영역에 상보적인 서열을 포함하는 것인 단계를 포함한다.
상기 제1 핵산 폴리머라제는 DNA 폴리머라제일 수 있다. 예를 들면, 상기 DNA 폴리머라제는 DNA 폴리머라제 I, 크레나우(Klenow) 단편, T4 DNA 폴리머라제, T7 DNA 폴리머라제 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 인큐베이션은 핵산 중합에 적합한 조건 하에서 이루어질 수 있다. 이러한 조건은 선택되는 효소에 따라 당업자가 적절하게 선택할 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 존재 하에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 0.2 mM dNTP 혼합물 및 2.5 유닛의 크레나우 단편(klenow fragment)의 존재 하에서 인큐베이션될 수 있다. 예를 들면, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션될 수 있다.
상기 방법은 일 구체예에 따른 연장 산물을 생성시키는 단계 후에, 연장 산물을 가온 후 냉각시켜 자가-혼성화(self-hybridization)된 연장 산물을 생성키는 단계를 더 포함할 수 있다. 연장 산물을 가온시키는 경우, 연장 산물은 변성(denaturation) 또는 융해(melting)되어 표적 핵산과 분리될 수 있다. 또한 가온된 연장 산물을 냉각시키는 경우, 상기 폴리뉴클레오티드의 제2 영역과 상기 폴리뉴클레오티드의 제2 영역에 상보적인 서열을 포함하는 연장 산물이 분자내 염기쌍을 형성하여 연장 산물은 자가-혼성화될 수 있다. 예를 들면, 80℃에서 10분 동안 인큐베이션시킨 다음, 얼음 위에서 1 내지 2분 동안 냉각시킨 다음, 37℃에서 20분 동안 인큐베이션시킬 수 있다.
상기 방법은 일 구체예에 따른 연장 산물을 리가제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 환형의 연장 산물을 생성시키는 단계를 포함한다.
상기 리가제는 DNA 리가제일 수 있다. DNA 리가제는 당업계에 알려진 효소일 수 있다. 예를 들어, T4 DNA 리가제, T3 DNA 리가제, T7 DNA 리가제, 대장균 DNA 리가제, Ampligase® DNA 리가제, 서클리가제(CircLigase™) ssDNA 리가제 또는 이들의 조합일 수 있다. 서클리가제(CircLigase™) ssDNA 리가제는 5'-포스페이트와 3'-히드록시기를 갖는 단일 가닥 DNA 주형의 분자 내 라이게이션(예를 들면, 원형화)을 촉매하는 열 안정성 ATP-의존적 리가제이다.
상기 인큐베이션은 라이게이션에 적합한 조건 하에서 이루어질 수 있다. 이러한 조건은 선택되는 효소에 따라 당업자가 적절하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 1x T4 DNA 리가제 완충액 (50 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM ATP, 10 mM DTT, 1 ㎕의 T4 DNA 리가제의 존재 하에서 16℃에서 1시간 동안 인큐베이션될 수 있다.
상기 방법은 일 구체예에 따른 환형의 연장 산물을 생성시키는 단계 후에, 엑소뉴클레아제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 단일 가닥의 핵산을 분해시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법. 상기 엑소뉴클레아제는 엑소뉴클레아제 I일 수 있다. 엑소뉴클레아제 I은 3'에서 5' 방향으로 단일 가닥의 DNA로부터 뉴클레오티드를 제거할 수 있다. 상기 인큐베이션은 엑소뉴클레아제의 활성에 적절한 조건 하에서 이루어질 수 있다. 예를 들어, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션될 수 있다.
상기 방법은 일 구체예에 따른 환형의 연장 산물을 제2 핵산 폴리머라제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 표적 핵산을 증폭하는 단계를 포함한다.
상기 제2 핵산 폴리머라제는 DNA 폴리머라제일 수 있다. 상기 DNA 폴리머라제는 Bst DNA 폴리머라제, HIV 역전사 효소, 피로파지 3173 DNA 폴리머라제, Tth 폴리머라제, BcaBEST DNA 폴리머라제 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 인큐베이션은 상기 핵산 폴리머라제의 활성에 적절한 조건 하에서 수행될 수 있다. 상기 인큐베이션은 핵산 폴리머라제, 그의 활성에 필요한 버퍼, 보조인자, 및 기질의 존재하에서 수행될 수 있다. 예를 들면, 상기 인큐베이션은 역전사 또는 PCR 증폭에 필요한 물질을 포함하는 조건에서 수행하는 것을 포함할 수 있다. 예를 들어, 1x 완충액 25 ㎕, 1 pmol 증폭용 프라이머, 0.1%(w/v) 트리톤 X-100, 및 0.5 ㎕의 Bst 폴리머라제의 존재 하에서 45℃에서 1시간 동안 인큐베이션될 수 있다.
상기 증폭은 핵산 증폭을 위하여 알려진 방법일 수 있다. 증폭은 예를 들면, DNA 증폭일 수 있다. 증폭 방법은 등온(isothermal) 또는 열순환(termal cycling) 증폭일 수 있다. 등온 증폭 방법은 롤링 서클 증폭 방법(Rolling circle amplification, RCA), 가닥-치환 증폭 방법(Strand-displacement amplification, SDA), 다중-치환 증폭(multiple-displacement amplification, MDA) 또는 이들의 조합일 수 있다.
상기 증폭은 증폭용 프라이머의 존재 하에서 증폭하는 것일 수 있다. 상기 증폭용 프라이머는 상기 폴리뉴클레오티드의 제3 영역에 상보적인 프라이머 또는 연장 산물에 상보적인 프라이머일 수 있다. 상기 폴리뉴클레오티드의 제3 영역에 상보적인 프라이머는 유니버셜 프라이머일 수 있다. 연장 산물에 상보적인 프라이머는 표적 서열 특이적 프라이머일 수 있다.
상기 방법은 일 구체예에 따른 연장 산물을 생성하는 단계 이전에, 3'-말단의 히드록시기가 제거되고 표적 핵산의 5'-말단으로부터 5' 방향의 2 이상의 연속 뉴클레오티드와 상보적인 폴리뉴클레오티드와 표적 핵산을 포함하는 시료와 인큐베시션시키는 단계를 더 포함할 수 있다. 상기 3'-말단의 히드록시기가 제거되고 표적 핵산의 5'-말단으로부터 5' 방향의 2 이상의 연속 뉴클레오티드와 상보적인 폴리뉴클레오티드는 핵산 폴리머라제의 신장을 막는 블로커(blocker)일 수 있다.
도 1은 일 양상에 따른 프라이머 및 프라이머를 이용한 표적 서열을 증폭하는 방법의 모식도이다. 도 1a는 일 양상에 따른 프라이머의 모식도이고, 도 1b는 일 양상에 따른 프라이머를 이용한 표적 서열을 증폭하는 방법의 모식도이고, 및 도 1c는 다른 양상에 따른 프라이머를 이용한 표적 서열을 증폭하는 방법의 모식도이다. 도 1a에 있어서, "표적 특이적 서열"은 표적 핵산의 영역과 상보적인 서열을 나타내고 (제1 영역), "자가-혼성화 서열"은 표적 핵산과 동일한 서열을 가지는 서열을 나타내고 (제2 영역), "스템-루프 구조"는 스템-루프(stem-loop) 구조를 가지는 뉴클레오티드 서열을 나타낸다 (제3 영역).
일 양상에 따른 폴리뉴클레오티드 및 이의 용도에 의하면, 정제 단계가 필요없이 하나의 튜브에서 반응이 이루어져 간편하다. 또한, 단일 뉴클레오티드 다형성(single, nucleotide polymorphism, SNP), 유전자의 삽입, 결실, 역위(inversion) 또는 융합을 포함하는 표적 유전자를 검출하는데 이용할 수 있다. 복수의 표적 핵산을 증폭하는데 유리하고, 폴리뉴클레오티드가 표적 서열과 상보적인 서열 및 표적 서열과 동일한 서열을 가져 증폭의 특이도가 향상된다. 아울러, 높은 증폭 효율로 표적 핵산을 증폭할 수 있다.
도 1a는 일 구체예에 따른 프라이머의 모식도이고, 도 1b 및 1c는 일 구체예에 따른 프라이머를 이용한 표적 서열을 증폭하는 방법을 나타낸다.
도 2는 일 구체예에 따라 제조된 환형의 연장 산물을 전기영동으로 확인한 겔 사진이다 (레인 1: 120 nt 주형, 레인 2: 프라이머, 레인 3: 연장 및 라이게이션시킨 반응물, 레인 4: 연장 및 라이게이션 후 엑소뉴클레오제 I을 인큐베이션시킨 반응물).
도 3a는 일 구체예에 따른 증폭용 프라이머의 모식도이고, 도 3b는 다른 구체예에 따른 증폭용 프라이머의 모식도이다 (화살표: 증폭 방향, 굵은 실선: 증폭용 프라이머). 도 3c는 일 구체예에 따라 증폭용 프라이머를 사용하여 증폭시킨 반응물을 전기영동으로 확인한 겔 사진이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. 표적 DNA 및 프라이머를 이용한 환형의 단일 가닥 DNA 의 제조
1. 표적 DNA 및 프라이머의 제조
Bioneer Corp.에 의뢰하여 하기의 표적 DNA과 5'-말단이 인산으로 변형된 프라이머를 제조하였다.
표적 DNA :
5'-pCCCTATAGTGAGTCGTATTACAGCAGATGTGGATCAGCAAGCAGGAGTATGACGAGTCCGGCCCC TCCATCGTCCACCGCAAATGTTCTAGGCGGACTATGACTTAGTTGCGTTACACCC-3' (서열 번호 1)
프라이머 :
5'-pGGGTTGCTGGGGGCGTATCAATCGCCCCCAGCAACCCCCCTATAGTGAGTCGTATTAC GGGTGTA ACGCAACTAAGTC-3' (서열 번호 2)
상기 표적 DNA에서 굵은 글자로 표시된 영역은 프라이머의 제1 영역에 상보적인 영역을 나타내고, 밑줄친 영역은 프라이머의 제2 영역과 동일한 서열을 갖는 영역을 나타낸다. 또한, 상기 프라이머에서 굵은 글자로 표시된 영역은 제1 영역을 나타내고, 밑줄친 영역은 제2 영역을 나타내고, 밑줄이 없는 영역은 스템-루프 구조를 가지는 제3 영역을 나타낸다.
2. 환형의 단일 가닥 DNA 의 제조
50 ng의 상기 표적 DNA와 150 ng의 프라이머를 1x NEB2 완충액 (50 mM NaCl, 10 mM Tris-HCl, 10 mM MgCl2, 1 mM dithiothreitol(DTT)의 존재 하에서 혼합하였다. 상기 혼합물을 80 ℃에서 10분 동안 인큐베이션한 다음, 얼음 위에서 1 내지 2분 동안 냉각시켰다. 반응물에 0.5 ㎕의 2 mM dNTP 혼합물 및 2.5 유닛의 크레나우 단편(klenow fragment)(NEB)을 첨가하고 증류수를 첨가하여 최종 부피를 5 ㎕로 맞춘 다음, 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 표적 DNA를 연장(extension)시켰다.
연장시킨 반응물을 80℃에서 10분 동안 인큐베이션한 다음, 얼음 위에서 1 내지 2분 동안 냉각시킨 다음, 37℃에서 20분 동안 인큐베이션하여 연장 산물을 변성 및 자가-혼성화시켰다.
자가-혼성화시킨 반응물에 2 ㎕의 10x T4 DNA 리가제 완충액 (500 mM Tris-HCl, 100 mM MgCl2, 10 mM ATP, 100 mM dithiothreitol(NEB), 1 ㎕의 T4 DNA 리가제(NEB)를 첨가하고 최종 부피를 20 ㎕로 맞춘 다음, 16℃에서 1시간 동안 인큐베이션하여 라이게이션시켰다. 1 ㎕의 엑소뉴클레아제 I(NEB)을 첨가하고 37℃에서 30분 동안 인큐베이션하여 라이게이션되지 않은 단일 가닥 DNA를 제거하였다.
환형의 단일 가닥 DNA가 제조되었는지 확인하기 위해, 반응물을 10% 변성 겔(denaturing gel)에서 전기영동하고, 1x SYBR® Gold Nucleic Acid Gel Stain (Invitrogen)으로 전기영동된 겔을 10분 동안 염색하였다. 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에 나타낸 바와 같이, 프라이머(78 nt)를 사용하여 표적 DNA(120 nt)를 연장 및 라이게이션시켜 연장된 산물(178 nt)을 확인하였다(레인 3). 또한, 엑소뉴클레아제 I를 처리한 결과, 프라이머 밴드는 엑소뉴클레아제 I를 처리한 후 밴드 강도가 감소하였으나, 연장된 산물(178 nt)은 엑소뉴클레아제 I를 처리한 후에도 밴드 강도가 감소하지 않는 것을 확인하였다. 따라서, 연장된 산물(178 nt)은 환형의 단일 가닥 DNA인 것을 확인하였다(레인 3 및 4).
실시예 2. 환형의 단일 가닥 DNA 의 증폭
실시예 1에서 exonuclease I을 처리한 반응물 1 ㎕를 증폭 반응에 사용하였다.
여러 종류의 표적을 증폭할 경우에 프라이머의 서열에 관계없이 증폭되도록 하기 위해 유니버셜 프라이머로서 스템-루프 구조를 갖는 제3 영역에 상보적인 프라이머를 사용하여 롤링 서클 증폭(RCA)을 수행하였다. 또한, 증폭 효율을 높이기 위하여 RCA용 프라이머와 함께 RCA 산물에 상보적인 프라이머를 사용하여 하이퍼브랜치드(hyperbranched) RCA(즉, RCA와 MDA의 병합)를 수행하였다. 표적 서열 특이적 프라이머에 대해서도 RCA와 하이퍼브랜치드(hyperbranched) RCA를 수행하였다(도 3a 및 3b).
구체적으로, 1 ㎕의 상기 반응물, 25 ㎕의 2x 완충액, 0.5 ㎕의 100 pmol 증폭용 프라이머, 1 ㎕의 5%(w/v) 트리톤 X-100 , 0.5 ㎕의 Bst 폴리머라제(NEB)를 혼합하고 최종 부피를 50 ㎕로 맞추었다.
사용된 증폭용 프라이머의 뉴클레오티드 서열은 하기와 같다.
스템-루프 특이적 RCA용 프라이머 : 5'-GGGTTGCTGGGGGCGATTGATA-3' (서열 번호 3)
스템-루프 특이적 MDA용 프라이머 : 5'-TATCAATCGCCCCCAGCAACCC-3' (서열 번호 4)
표적 DNA 특이적 RCA용 프라이머 : 5'-GACGAGTCCGGCCCCTCCATC-3' (서열 번호 5)
표적 DNA 특이적 MDA용 프라이머 : 5'-GTCCGCCTAGAACATTTGCGG-3' (서열 번호 6)
상기 혼합물을 45℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 인큐베이션한 반응물 중 5 ㎕를 1 ㎕의 6x agarose gel loading dye(NEB)를 혼합한 다음, 1% 아가로스 겔에서 100 V로 30분 동안 전기영동하였다. 전기영동한 겔을 도 3c에 나타내었다.
도 6에 나타낸 바와 같이, 스템-루프 특이적 증폭용 프라이머와 표적 DNA 특이적 증폭용 프라이머는 모두 RCA와 하이퍼브랜치드 RCA 반응이 잘 일어남을 확인하였다.
<110> Samsung Electronics Co. Ltd <120> Polynucleotide and use thereof <130> PN100201 <160> 6 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 120 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target DNA <400> 1 ccctatagtg agtcgtatta cagcagatgt ggatcagcaa gcaggagtat gacgagtccg 60 gcccctccat cgtccaccgc aaatgttcta ggcggactat gacttagttg cgttacaccc 120 120 <210> 2 <211> 78 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> primer <400> 2 gggttgctgg gggcgtatca atcgccccca gcaacccccc tatagtgagt cgtattacgg 60 gtgtaacgca actaagtc 78 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> stem-loop specific primer for rolling circle amplification <400> 3 gggttgctgg gggcgattga ta 22 <210> 4 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> stem-loop specific primer for multiple displacement amplification <400> 4 tatcaatcgc ccccagcaac cc 22 <210> 5 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target DNA specific primer for rolling circle amplification <400> 5 gacgagtccg gcccctccat c 21 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> target DNA specific primer for multiple displacement amplification <400> 6 gtccgcctag aacatttgcg g 21

Claims (20)

  1. 3'-말단으로부터 2 이상의 연속 뉴클레오티드가 표적 핵산의 2 이상의 연속 뉴클레오티드와 상보적인 제1 영역;
    제1 영역의 5' 방향으로부터 2 이상의 연속 뉴클레오티드가 표적 핵산의 2 이상의 연속 뉴클레오티드와 동일한 서열을 가지는 제2 영역; 및
    제2 영역의 5'-방향으로부터 스템-루프 구조를 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서,
    상기 제1 영역은 표적 핵산의 뉴클레오티드 순서를 기준으로 제2 영역과 동일한 서열을 가지는 표적 핵산의 영역으로부터 3' 방향의 뉴클레오티드에 혼성화하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  2. 청구항 1에 있어서, 제1 영역은 3'-말단으로부터 2 이상의 연속 뉴클레오티드가 표적 핵산의 3'-말단 영역으로부터 3' 말단 뉴클레오티드를 포함한 2 이상의 연속 뉴클레오티드와 상보적인 것인 폴리뉴클레오티드.
  3. 청구항 1에 있어서, 제2 영역은 5'-말단으로부터 2 이상의 연속 뉴클레오티드가 표적 핵산의 5'-말단 영역으로부터 5' 말단 뉴클레오티드를 포함한 2 이상의 연속 뉴클레오티드와 동일한 서열을 가지는 것인 폴리뉴클레오티드.
  4. 청구항 1에 있어서, 제3 영역은 5' 말단이 인산화된 것인 폴리뉴클레오티드.
  5. 청구항 1에 있어서, 제3 영역은 프라이머 결합 부위, 제한효소 인식 부위, 프로브 결합 부위 또는 이들의 조합을 포함하는 것인 폴리뉴클레오티드.
  6. 3'-말단으로부터 2 이상의 연속 뉴클레오티드가 표적 핵산의 2 이상의 연속 뉴클레오티드와 상보적인 제1 영역, 제1 영역의 5' 방향으로부터 2 이상의 연속 뉴클레오티드가 표적 핵산의 2 이상의 연속 뉴클레오티드와 동일한 서열을 가지는 제2 영역, 및 제2 영역의 5'-방향으로부터 스템-루프 구조를 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 제1 영역은 표적 핵산의 뉴클레오티드 순서를 기준으로 제2 영역과 동일한 서열을 가지는 표적 핵산의 영역으로부터 3' 방향의 뉴클레오티드에 혼성화하는 것인 폴리뉴클레오티드; 및
    표적 핵산을 포함하는 표적 핵산을 증폭하기 위한 조성물.
  7. 3'-말단으로부터 2 이상의 연속 뉴클레오티드가 표적 핵산의 2 이상의 연속 뉴클레오티드와 상보적인 제1 영역, 제1 영역의 5' 방향으로부터 2 이상의 연속 뉴클레오티드가 표적 핵산의 2 이상의 연속 뉴클레오티드와 동일한 서열을 가지는 제2 영역, 및 제2 영역의 5'-방향으로부터 스템-루프 구조를 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 제1 영역은 표적 핵산의 뉴클레오티드 순서를 기준으로 제2 영역과 동일한 서열을 가지는 표적 핵산의 영역으로부터 3' 방향의 뉴클레오티드에 혼성화하는 것인 폴리뉴클레오티드;
    표적 핵산; 및
    핵산 폴리머라제를 포함하는 표적 핵산을 증폭하기 위한 키트.
  8. 3'-말단으로부터 2 이상의 연속 뉴클레오티드가 표적 핵산의 2 이상의 연속 뉴클레오티드와 상보적인 제1 영역, 제1 영역의 5' 방향으로부터 2 이상의 연속 뉴클레오티드가 표적 핵산의 2 이상의 연속 뉴클레오티드와 동일한 서열을 가지는 제2 영역, 및 제2 영역의 5'-방향으로부터 스템-루프 구조를 가지는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 제3 영역을 포함하는 폴리뉴클레오티드로서, 상기 제1 영역은 표적 핵산의 뉴클레오티드 순서를 기준으로 제2 영역과 동일한 서열을 가지는 표적 핵산의 영역으로부터 3' 방향의 뉴클레오티드에 혼성화하는 것인 폴리뉴클레오티드와 표적 핵산을 포함하는 시료를 인큐베이션시켜 혼성화 산물을 형성하는 단계;
    상기 혼성화 산물을 제1 핵산 폴리머라제의 존재 하에서 인큐베이션시켜, 상기 폴리뉴클레오티드의 3'-말단으로부터 상기 표적 핵산에 상보적인 뉴클레오티드 서열을 연장시켜 연장 산물을 형성하는 단계로서, 상기 연장 산물은 상기 폴리뉴클레오티드의 제2 영역에 상보적인 서열을 포함하는 것인 단계;
    상기 연장 산물을 리가제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 환형의 연장 산물을 생성시키는 단계; 및
    상기 환형의 연장 산물을 제2 핵산 폴리머라제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 표적 핵산을 증폭하는 단계를 포함하는 표적 핵산을 증폭하는 방법.
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 제1 핵산 폴리머라제는 DNA 폴리머라제인 것인 방법.
  10. 청구항 9에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제는 DNA 폴리머라제 I, 크레나우(Klenow) 단편, T4 DNA 폴리머라제, T7 DNA 폴리머라제 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 연장 산물을 생성시키는 단계 후에, 연장 산물을 가온 후 냉각시켜 자가-혼성화된 연장 산물을 생성키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  12. 청구항 8에 있어서, 상기 리가제는 DNA 리가제인 것인 방법.
  13. 청구항 12에 있어서, 상기 리가제는 T4 DNA 리가제, T3 DNA 리가제, T7 DNA 리가제, 대장균 DNA 리가제, Ampligase® DNA 리가제, 서클리가제(CircLigase™) ssDNA 리가제 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  14. 청구항 8에 있어서, 상기 환형의 연장 산물을 생성시키는 단계 후에, 엑소뉴클레아제의 존재 하에서 인큐베이션시켜 단일 가닥의 핵산을 분해시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
  15. 청구항 8에 있어서, 상기 제2 핵산 폴리머라제는 DNA 폴리머라제인 것인 방법.
  16. 청구항 15에 있어서, 상기 DNA 폴리머라제는 Bst DNA 폴리머라제, HIV 역전사 효소, 피로파지 3173 DNA 폴리머라제, Tth 폴리머라제, BcaBEST DNA 폴리머라제 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  17. 청구항 8에 있어서, 상기 증폭하는 단계는 등온 증폭 방법으로 증폭하는 것인 방법.
  18. 청구항 17에 있어서, 상기 등온 증폭 방법은 롤링 서클 증폭 방법(Rolling circle amplification, RCA), 가닥-치환 증폭 방법(Strand-displacement amplification, SDA), 다중-치환 증폭(multiple-displacement amplification, MDA) 또는 이들의 조합인 것인 방법.
  19. 청구항 8에 있어서, 상기 증폭하는 단계는 상기 폴리뉴클레오티드의 제3 영역에 상보적인 프라이머 또는 상기 연장 산물에 상보적인 프라이머의 존재 하에서 증폭하는 것인 방법.
  20. 청구항 8에 있어서, 상기 연장 산물을 생성하는 단계 이전에, 3'-말단의 히드록시기가 제거되고 표적 핵산의 5'-말단으로부터 5' 방향의 2 이상의 연속 뉴클레오티드와 상보적인 폴리뉴클레오티드와 표적 핵산을 포함하는 시료와 인큐베이션시키는 단계를 더 포함하는 것인 방법.
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