KR20100013120A - Analytic method of food dye - Google Patents
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Abstract
Description
본 발명은 식품에 미량 존재하는 염료를 높은 검출감도로 손쉽고, 신속하게 분석할 수 있는 식품에 함유된 염료분석방법에 관한 것이다.The present invention relates to a dye analysis method contained in food that can be easily and quickly analyzed dyes present in the food in a small amount with high detection sensitivity.
극미량의 시료를 분석하는 일의 비중이 증가하면서 랩온어칩(lab-on-a-chip)기술을 이용한 분석 기술에 관한 연구가 활발히 이루어지고 있다. 랩온어칩은 반도체 분야에서 널리 사용되는 사진식각인쇄기술이나 미세 가공 기술을 이용하여 유리, 실리콘 또는 플라스틱으로 된 칩 위에 여러 가지 장치들을 집적시킨 화학 마이크로 프로세스로서, 고속, 고효율 및 저비용의 자동화된 실험이 가능하다. 이와 같은 분석 방법은 적은 양의 시료만으로 빠른 시간에 분석을 간편하게 수행할 수 있다는 장점이 있다. As the work of analyzing trace amounts of samples increases, researches on analytical technologies using lab-on-a-chip technology are being actively conducted. Lab-on-a-Chip is a chemical micro process that integrates various devices on a chip made of glass, silicon, or plastic using photolithography or micromachining techniques widely used in the semiconductor field. This is possible. Such an analysis method has an advantage that the analysis can be easily performed in a short time with only a small amount of sample.
그러나 이러한 랩온어칩 기술을 이용하여 분석할 때, 검출 농도의 역치값보다 낮은 농도의 시료를 분석하려면 따로 시료의 농축과정을 수행해주어야 하는 단점이 있다. However, when analyzing using the lab-on-a-chip technology, there is a disadvantage in that the concentration of the sample must be separately performed to analyze a sample having a concentration lower than the threshold value of the detection concentration.
종래에는 시료의 농축을 위하여 필드 증폭 시료 주입(field amplified sample injection, FASI), 필드 증폭 시료 스태킹(field amplified sample stacking, FASS) 등의 방법을 이용하였다.Conventionally, methods such as field amplified sample injection (FASI) and field amplified sample stacking (FASS) have been used to concentrate the sample.
상기 필드 증폭 시료 주입방법은 낮은 pH의 지지전해질(low-pH background electrolyte, BGE)과 물의 주입을 이용하여 농축하는 것으로, 채널 내에서의 시료의 위치조절의 어려움으로 인하여 아직까지 FASI법을 마이크로칩에 이용한 농축방법은 잘 알려져 있지 않다.The field amplification sample injection method is concentrated by the injection of low pH support electrolyte (BGE) and water, and the FASI method is still microchip due to the difficulty in controlling the position of the sample in the channel. The concentration method used in the process is not well known.
또, 상기 필드 증폭 시료 스태킹방법은 낮은 전도도를 갖는 용액에서 제조된 시료 용액을 높은 전도도를 갖는 완충액으로 채워진 농축채널에 주입하여 농축하며, 이때 전압이 걸리면 시료가 신속하게 낮은 전도도를 갖는 용액과 높은 전도도를 갖는 완충액 간의 경계면으로 이동하여 농축되는 것으로, 농축과정 중 시료의 정확한 위치를 제어하는 것이 곤란한 문제가 있었다.In addition, the field amplification sample stacking method concentrates a sample solution prepared in a solution having a low conductivity into a concentration channel filled with a buffer having a high conductivity. There is a problem that it is difficult to control the exact position of the sample during the concentration process by being concentrated to the interface between the buffer having conductivity.
한편, 아직까지 식품에 함유된 미량의 염료를 식품으로부터 추출하는 방법과 이렇게 추출된 미량의 염료를 분석하는 방법에 대한 연구가 전무한 실정이다.On the other hand, there is no research on how to extract the trace amount of the dye contained in the food from the food and how to analyze the trace amount of the extracted dye so far.
본 발명은 상기의 문제점을 해결하기 위하여 창출된 것으로서, 식품 중에 함유된 낮은 농도의 염료를 C-18 카트리지를 이용하여 추출하고, 필드 증폭 시료 스태킹법과 필드 증폭 시료 주입법을 이용하여 농축한 후, 작동전극으로 유리질 탄소전극을 이용하여 분석함으로써 낮은 농도의 염료를 높은 검출감도로 신속하고, 간편하게 분석할 수 있는 식품에 함유된 염료분석방법을 제공하는데 그 목적이 있다. The present invention was created to solve the above problems, the low concentration of the dye contained in the food using a C-18 cartridge extracted, concentrated using a field amplification sample stacking method and field amplification sample injection method, and then operated It is an object of the present invention to provide a dye analysis method contained in a food which can be analyzed quickly and simply with a high detection sensitivity by analyzing a low concentration of dye by using a glassy carbon electrode as an electrode.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 In order to achieve the above object, the present invention
식품으로부터 염료시료를 추출하는 염료추출단계;A dye extraction step of extracting a dye sample from the food;
추출된 염료시료를 시료주입부에 주입하는 시료주입단계;A sample injection step of injecting the extracted dye sample into the sample injection unit;
상기 시료주입부에 양극전압을 인가하고 제1시료배출부를 접지시켜, 시료가 상기 제1시료배출부 측으로 이동되도록 하는 제1시료배출부이동단계;A first sample discharge unit moving step of applying a positive voltage to the sample injection unit and grounding a first sample discharge unit to move the sample to the first sample discharge unit;
상기 시료주입부를 플로팅시키며 제1시료배출부에 양극전압을 인가하고 제1농축부를 접지시켜, 필드 증폭 시료 스태킹(field-amplified sample stacking)을 이용하여 pH 구배에 따라 시료를 농축시키고 농축된 시료가 제1농축부 측으로 이동되도록 하는 제1농축부이동단계;The sample injection unit is floated, an anode voltage is applied to the first sample discharge unit, and the first concentration unit is grounded. The sample is concentrated according to the pH gradient using field-amplified sample stacking, and the concentrated sample is A first concentrated part moving step of moving to the first concentrated part side;
제1완충액저장부에 물을 주입한 다음, 완충액을 주입하는 제1완충액저장부주입단계;Injecting water into the first buffer storage unit, and then injecting the first buffer storage unit to inject a buffer solution;
상기 제1농축부에 음극전압을 인가하고 상기 제1완충액저장부를 접지시켜, 필드 증폭 시료 주입(field-amplified sample injection)을 이용하여 전위 차이에 따라 시료를 농축시키고 농축된 시료가 제2농축부 측으로 이동되도록 하는 제2농축부이동단계;Applying a negative voltage to the first concentration unit and grounding the first buffer storage unit, using a field-amplified sample injection (concentrate) the sample according to the potential difference and the concentrated sample is the second concentration unit A second concentrated part moving step for moving to the side;
제2농축부에 음극전압을 인가하고, 제2시료배출부를 접지시켜, 시료가 제2시료배출부 측으로 이동되도록 하는 제2시료배출부이동단계;A second sample discharge unit moving step of applying a negative voltage to the second concentration unit and grounding the second sample discharge unit to move the sample to the second sample discharge unit;
상기 제2농축부와 상기 제2시료배출부를 플로팅시키고, 제2완충액저장부에 음극전압을 인가하고, 검출부를 접지시켜 시료가 검출부 측으로 이동되도록 하는 검출부이동단계; 및 A detector moving step of floating the second concentrate part and the second sample discharge part, applying a negative voltage to a second buffer storage part, and grounding the detector to move the sample to the detector; And
마이셀 동전기 분리(micellar electrokinetic separation)를 이용하여 시료를 분리하고, 작동전극으로 유리질 탄소전극을 이용하여 상기 분리된 시료를 검출하는 검출단계를 포함하여 구성되는 것을 특징으로 하는 식품에 함유된 염료분석방법을 제공한다.Dye analysis in the food, characterized in that it comprises a detection step of separating the sample using the micelle electrokinetic separation, and detecting the separated sample using a glassy carbon electrode as the working electrode Provide a method.
본 발명에 따른 염료분석방법은 2개의 농축부를 포함하는 농축채널 및 상기 농축채널과 일정거리 이격되며 검출부를 포함하는 검출채널을 구비한 마이크로칩을 이용하여 수행된다.The dye analysis method according to the present invention is performed using a microchip having a concentration channel including two concentration units and a detection channel spaced apart from the concentration channel by a predetermined distance and including a detection unit.
여기서, 상기 농축채널은 필드 증폭 시료 스태킹(field-amplified sample stacking)을 이용하여 pH 구배에 따라 시료를 농축하는 제1농축부 및 필드 증폭 시료 주입(field-amplified sample injection)을 이용하여 전위 차이에 따라 시료를 농축하는 제2농축부를 포함하는 것이 바람직하다.Here, the enrichment channel uses a first enrichment unit for concentrating a sample according to a pH gradient using field-amplified sample stacking and a potential difference using field-amplified sample injection. Therefore, it is preferable to include a second concentration unit for concentrating the sample.
또한, 상기 농축채널은 시료가 주입되는 시료주입부; 완충액이 저장되며, 상 기 시료주입부에서 공급된 시료의 일부가 배출되는 제1시료배출부; 필드 증폭 시료 스태킹(field-amplified sample stacking)을 이용하여 pH 구배에 따라 시료를 농축하는 제1농축부; 상기 제1시료배출부와 상기 제1농축부가 연통되도록 하는 제2채널; 상기 제2채널의 일측에서 분기되며, 상기 시료주입부와 상기 제2채널이 서로 연통되도록 하는 제1채널; 필드 증폭 시료 주입(field-amplified sample injection)을 이용하여 전위 차이에 따라 시료를 농축하는 제2농축부; 완충액이 저장되는 제1완충액저장부; 및 상기 제1농축부, 상기 제2농축부 및 상기 제1완충액저장부가 서로 연통되도록 하는 제3채널을 포함하는 것이 바람직하다.In addition, the enrichment channel is a sample injection unit into which the sample is injected; A first sample discharge part in which a buffer solution is stored and a part of the sample supplied from the sample injection part is discharged; A first concentrating portion for concentrating the sample according to a pH gradient using field-amplified sample stacking; A second channel allowing the first sample discharger to communicate with the first concentrate part; A first channel branched at one side of the second channel and allowing the sample injection unit and the second channel to communicate with each other; A second concentrator for concentrating the sample according to the potential difference by using field-amplified sample injection; A first buffer storage unit for storing a buffer solution; And a third channel for allowing the first concentrate part, the second concentrate part, and the first buffer storage part to communicate with each other.
게다가, 상기 검출채널은 완충액이 저장되는 제2완충액저장부; 완충액이 저장되며, 시료의 일부가 배출되는 제2시료배출부; 상기 제2농축부와 상기 제2시료배출부가 서로 연통되도록 하는 제4채널; 내부에 전극부가 구비되고 완충액이 저장되며, 시료를 검출하는 검출부; 및 상기 제2완충액저장부와 상기 검출부를 연결시키며, 상기 제4채널의 일측과 연통되도록 하는 제5채널로 구성되는 것이 바람직하다.In addition, the detection channel may include a second buffer solution storing buffer; A second sample discharge part in which a buffer is stored and a part of the sample is discharged; A fourth channel allowing the second concentrate portion and the second sample discharger to communicate with each other; A detector configured to include an electrode part and to store a buffer, and detect a sample; And a fifth channel connecting the second buffer storage unit and the detection unit and communicating with one side of the fourth channel.
아울러, 상기 전극부는 기준전극, 반대전극 및 작동전극을 포함하며, 상기 작동전극은 유리질 탄소전극을 이용하는 것이 바람직하다.In addition, the electrode unit includes a reference electrode, a counter electrode, and a working electrode, and the working electrode preferably uses a glassy carbon electrode.
뿐만 아니라, 상기 전극부는 제5채널과 50-200 ㎛ 이격되도록 스페이서를 포함하는 것이 바람직하다.In addition, the electrode unit preferably includes a spacer to be spaced apart from the fifth channel by 50-200 μm.
또한, 상기 식품은 주스, 탁주, 젓갈, 라면 및 고추로 이루어진 군에서 선택된 어느 하나일 수 있지만, 이에 한정되는 것은 아니고 미량의 염료를 포함하는 모든 종류의 식품에 본 발명에 따른 분석방법을 적용할 수 있음은 당연하다.In addition, the food may be any one selected from the group consisting of juice, takju, salted fish, ramen and red pepper, but is not limited thereto, and the analysis method according to the present invention may be applied to all kinds of foods including trace amounts of dyes. Of course it can.
이하 첨부된 도면을 참조하면서 본 발명에 따른 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 이에 앞서, 본 명세서 및 청구범위에 사용된 용어나 단어는 통상적이거나 사전적인 의미로 한정해서 해석되어서는 아니 되며, 발명자는 그 자신의 발명을 가장 최선의 방법으로 설명하기 위해 용어의 개념을 적절하게 정의할 수 있다는 원칙에 입각하여, 본 발명의 기술적 사상에 부합하는 의미와 개념으로 해석되어야만 한다.Hereinafter, exemplary embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. Prior to this, terms or words used in the present specification and claims should not be construed as being limited to the common or dictionary meanings, and the inventors should properly explain the concept of terms in order to best explain their own invention. Based on the principle that it can be defined, it should be interpreted as meaning and concept corresponding to the technical idea of the present invention.
따라서, 본 명세서에 기재된 실시예와 도면에 도시된 구성은 본 발명의 가장 바람직한 일실시예에 불과할 뿐이고 본 발명의 기술적 사상을 모두 대변하는 것은 아니므로, 본 출원시점에 있어서 이들을 대체할 수 있는 다양한 균등물과 변형예들이 있을 수 있음을 이해하여야 한다.Therefore, the embodiments described in the specification and the drawings shown in the drawings are only one of the most preferred embodiments of the present invention and do not represent all of the technical idea of the present invention, various modifications that can be replaced at the time of the present application It should be understood that there may be equivalents and variations.
이하, 도 1을 참조하여 본 발명의 실시예에 따른 염료분석용 마이크로칩을 설명하도록 한다. 도 1은 본 발명의 실시예에 따른 염료분석용 마이크로칩의 채널 패턴도이다.Hereinafter, a microchip for dye analysis according to an embodiment of the present invention will be described with reference to FIG. 1. 1 is a channel pattern diagram of a microchip for dye analysis according to an embodiment of the present invention.
본 발명에 따른 염료분석용 마이크로칩은 제1농축부(103), 제2농축부(104)를 포함하는 농축채널과 검출부(108)를 포함하는 검출채널을 구비한다. The microchip for dye analysis according to the present invention includes a concentration channel including a
이때, 검출채널은 제2농축부와 50-200 ㎛로 이격되는 것이 바람직하며, 만약 상기 범위를 벗어나 근거리 또는 원거리로 이격되면 큰 노이즈가 발생되거나, 감도가 낮아지는 문제가 야기될 수 있다.In this case, the detection channel is preferably spaced apart from the second concentration portion by 50-200 μm. If the detection channel is spaced at a short distance or long distance out of the above range, a large noise may be generated or a sensitivity may be lowered.
상기 농축채널은 시료가 주입되는 시료주입부(101), 완충액이 저장되며, 상기 시료주입부(101)에서 공급된 시료의 일부가 배출되는 제1시료배출부(102), 필드 증폭 시료 스태킹방법을 이용하여 pH 구배에 따라 시료를 농축하는 제1농축부(103), 제1시료배출부(102)와 제1농축부(103)가 연통되도록 하는 제2채널(120), 제2채널(102)의 일측에서 분기되며, 시료주입부(101)와 상기 제2채널(120)이 서로 연통되도록 하는 제1채널(110), 필드 증폭 시료 주입방법을 이용하여 전위 차이에 따라 시료를 농축하는 제2농축부(104), 완충액이 저장되는 제1완충액저장부(105), 제1농축부(103), 상기 제2농축부(104) 및 상기 제1완충액저장부(105)가 서로 연통되도록 하는 제3채널(130)을 포함한다. The concentration channel is a
또한, 상기 검출채널은 완충액이 저장되는 제2완충액저장부(106), 완충액이 저장되며, 시료의 일부가 배출되는 제2시료배출부(107), 제2농축부(104)와 상기 제2시료배출부(107)가 서로 연통되도록 하는 제4채널(140), 내부에 전극부가 구비되고 완충액이 저장되며, 시료를 검출하는 검출부(108), 제2완충액저장부(106)와 검출부(108)를 연결시키며, 제4채널(140)의 일측과 연통되도록 하는 제5채널(150)을 포함한다.In addition, the detection channel is a second
전극부의 작동전극은 유리질 탄소전극을 이용하며, 염료분석용 마이크로칩에서 다른 작동전극으로 교체가능하도록 상기 마이크로칩내에서 착탈가능하도록 구비되는 것이 바람직하다. 여기서, 작동전극 표면과 채널 사이의 거리를 조절하기 위하여 유리질 탄소전극의 외주면에 폴리에틸렌, 폴리이민, 폴리카보네이트, 또는 폴리우레탄과 같은 폴리머로 된 스페이서를 구비하는 것이 바람직하다. The working electrode of the electrode unit uses a glassy carbon electrode, and is preferably provided to be detachable from the microchip so as to be replaced by another working electrode in the dye analysis microchip. Here, in order to control the distance between the working electrode surface and the channel, it is preferable to include a spacer of polymer such as polyethylene, polyimine, polycarbonate, or polyurethane on the outer circumferential surface of the glassy carbon electrode.
이하, 도 2 및 도 3을 예시하여 본 발명의 실시예에 따른 염료분석방법을 상세하게 설명하도록 한다.2 and 3 to explain the dye analysis method according to an embodiment of the present invention in detail.
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 염료분석방법의 흐름도, 도 3a는 본 발명의 실시예에 따른 염료분석방법의 제1시료배출부이동단계를 나타낸 개념도, 도 3b는 본 발명의 실시예에 따른 염료분석방법의 제1농축부이동단계를 나타낸 개념도, 도 3c는 본 발명의 실시예에 따른 염료분석방법의 제2농축부이동단계를 나타낸 개념도, 도 3d는 본 발명의 실시예에 따른 염료분석방법의 제2시료배출부이동단계를 나타낸 개념도, 도 3e는 본 발명의 실시예에 따른 염료분석방법의 검출부이동단계를 나타낸 개념도이다.Figure 2 is a flow chart of the dye analysis method according to an embodiment of the present invention, Figure 3a is a conceptual diagram showing a first sample discharge portion moving step of the dye analysis method according to an embodiment of the present invention, Figure 3b is an embodiment of the present invention 3D is a conceptual diagram illustrating a first concentrated portion moving step of the dye analysis method according to an embodiment of the present invention, and FIG. 3D is a conceptual diagram illustrating a second concentrated portion moving step of the dye analysis method according to an embodiment of the present invention. Conceptual view showing a second sample discharge unit moving step of the analysis method, Figure 3e is a conceptual diagram showing a detection unit moving step of the dye analysis method according to an embodiment of the present invention.
우선 도 2를 참조하면, 본 발명의 실시예에 따른 염료분석방법은 염료추출단계(S101), 시료주입단계(S102), 제1시료배출부이동단계(S103), 제1농축부이동단계(S104), 제1완충액저장부주입단계(S105), 제2농축부이동단계(S106), 제2시료배출부이동단계(S107), 검출부이동단계(S108), 검출단계(S109)를 포함한다. First, referring to Figure 2, the dye analysis method according to an embodiment of the present invention, the dye extraction step (S101), the sample injection step (S102), the first sample discharge unit moving step (S103), the first concentrated part moving step ( S104), the first buffer storage unit injection step (S105), the second concentrated part moving step (S106), the second sample discharge part moving step (S107), the detector moving step (S108), the detection step (S109). .
상기 염료추출단계(S101)는 C-18 카트리지를 메탄올에 의해 활성화하는 단계; 식품을 초음파 처리하는 단계; 초음파 처리한 식품을 상기 카트리지에 통과시키는 단계; 및 세정한 후, 프로판올을 이용하여 염료를 추출하는 단계를 포함하여 구성된다. The dye extraction step (S101) is a step of activating the C-18 cartridge with methanol; Sonicating the food; Passing the sonicated food through the cartridge; And after washing, extracting the dye using propanol.
상기 시료주입단계(S102)는 시료주입부(101)에 시료를 주입하는 단계이다. 시료 주입 전에 제1시료배출부(102)를 통해 주입된 염기성 완충액으로 제1채널(110) 및 제2채널(120)을 미리 채우고, 이때 주입되는 시료는 pH 7 내지 9의 용액인 것이 바람직하며, pH 8.0인 것이 가장 바람직하다. The sample injection step S102 is a step of injecting a sample into the
이는 염기 조건에서 염료 시료의 해리도가 증가하여 시료 용액 중 유리 페놀 성 음이온의 양이 증가하므로 결과적으로 스태킹 효율을 증가시키기 때문이다. 그러나, 시료 용액의 pH가 9.0을 초과하면 시료 용액의 이온강도가 증가되어 제2채널(120)에서 시료와 완충액 간의 전도율을 감소시키며, 결국 스태킹 효율을 감소시킬 수 있다. This is because the dissociation degree of the dye sample in the basic condition increases and the amount of free phenolic anion in the sample solution increases, resulting in increased stacking efficiency. However, when the pH of the sample solution exceeds 9.0, the ionic strength of the sample solution is increased to reduce the conductivity between the sample and the buffer solution in the
상기 제1시료배출부이동단계(S103)는 도 3a를 참조하면, 시료를 주입한 시료주입부(101)에 양극전압을 인가하고 제1시료배출부(102)를 접지시키는 단계이다. 이에 따라, 시료주입부(101)에서 주입된 시료가 제1시료배출부(102)측으로 이동한다.Referring to FIG. 3A, the first sample discharge unit moving step (S103) is a step of applying a positive voltage to the
상기 제1농축부이동단계(S104)는 도 3b를 참조하면, 시료주입부(101)를 플로팅 시키고 제1시료배출부(102)에 양극전압을 인가하고 제1농축부(103)를 접지시키는 단계이다. 이로 인해, 시료는 필드 증폭 시료 스태킹방법에 따라 농축되면서 제1농축부(103) 측으로 이동된다.Referring to FIG. 3B, the first concentration unit moving step S104 is performed by floating the
상기 제1완충액저장부주입단계(S105)는 제1완충액저장부(105)에 물을 주입한 다음 낮은 pH를 갖는 완충액을 주입하는 단계이다. 이때, 보다 높은 전극의 분리효율을 위하여 제3채널(130)에 채워지는 물의 길이가 15 내지 55 mm인 것이 바람직하며, 상기 낮은 pH를 갖는 완충액은 소듐 도데실 설페이트(sodium dodecyl sulfate, SDS)의 미셀을 함유한 산성 완충액을 사용한다. 이 단계는 pH 구배에 따라 시료를 농축하는 필드 증폭 시료 주입방법을 이용하기 위한 단계이다.The first buffer storage unit injection step (S105) is a step of injecting water into the first
상기 제2농축부이동단계(S106)는 도 3c를 참조하면, 제1농축부(103)에 음극전압을 인가하고 제1완충액저장부(105)를 접지시키는 단계이다. 이에 따라, 시료 는 필드 증폭 시료 주입방법에 따라 농축되고 농축된 시료가 제2농축부(104) 측으로 이동된다. 이때, 시료의 농축은 85 내지 95 초 동안 수행되며, 상기 농축시간 미만인 경우에는 제2농축부에 충분한 농축영역이 형성되지 않는 반면, 상기 농축시간을 초과하는 경우에는 제2농축부로부터 농축영역을 펌프질할 수 있다.Referring to FIG. 3C, the second concentration unit moving step S106 is a step of applying a negative voltage to the
상기 제2시료배출부이동단계(S107)는 도 3d를 참조하면, 제2농축부(104)에 음극전압을 인가하고 제2시료배출부(107)를 접지시키는 단계이다. 이에 따라 시료가 제2시료배출부(107) 측으로 이동된다. Referring to FIG. 3D, the second sample discharge unit moving step (S107) is a step of applying a negative voltage to the
상기 검출부이동단계(S108)는 도 3e를 참조하면, 제2농축부(104)와 제2시료배출부(107)를 플로팅시키고 제2완충액저장부(106)에 음극전압을 인가하고 검출부(108)를 접지시키는 단계이다. 이에 따라 시료는 검출부(108)측으로 이동된다.Referring to FIG. 3E, the detecting unit moving step S108 is performed by floating the second concentrating
상기 검출단계(S109)는 검출부(108)측으로 이동된 시료를 마이셀 동전기 분리(micellar electrokinetic separation)를 이용하여 분리하고 유리질 탄소전극을 이용하여 분리된 시료를 검출하는 단계이다. The detecting step (S109) is a step of separating the sample moved to the
상술한 바와 같이, 본 발명의 염료분석방법에 의하면, 필드 증폭 시료 스태킹과 필드 증폭 시료 주입 방법을 마이크로칩내에서 수행하여 식품 중 낮은 농도의 염료를 높은 검출감도로 신속하고 간편하게 검출할 수 있다.As described above, according to the dye analysis method of the present invention, the field amplification sample stacking and the field amplification sample injection method can be performed in a microchip to detect a low concentration of dye in food quickly and easily with high detection sensitivity.
본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 하기에 제시한다. 그러나 이러한 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐 본 발명 이 하기의 실시예에 한정되는 것은 아니다.Preferred examples are provided below to aid in the understanding of the present invention. However, these examples are only provided to more easily understand the present invention, the present invention is not limited to the following examples.
이하, 상기와 같은 구조를 갖는 식품 염료 검출용 마이크로칩의 채널 식각 방법을 제1실시예에서 설명하도록 한다.Hereinafter, the channel etching method of the microchip for food dye detection having the above structure will be described in the first embodiment.
[실시예 1] 마이크로칩 제조Example 1 Microchip Manufacturing
본 발명의 염료 검출용 마이크로칩은 도 1을 참조하면, 제2채널(120), 제3채널(130), 제5채널(150)이 서로 평행이 되도록 테프론 재질의 베이스에 식각하였다. 이 때, 제2채널(120), 제3채널(130), 제5채널(150)은 서로 10㎜의 거리로 이격되도록 식각하였다. 여기서, 본 발명의 제1실시예에 따른 마이크로칩에 식각된 채널의 구체적인 길이와 폭은 표 1에 나타내었다. 구체적인 마이크로칩의 제조는 Shiddiky 등의 방법(Shiddiky, M.J.A., Kim, R.E., Shim, Y.B., Electrophoresis, 26: 3043-3052, 2005)에 따라 수행하였다. Referring to FIG. 1, the dye-detecting microchip of the present invention was etched on a base made of Teflon so that the
상기 X는 제1채널(110)과 제2채널(120)의 교차지점을 나타낸다. X represents an intersection point of the
여기서, 본 발명의 제1실시예에 따른 마이크로칩은 X와 제1시료배출부(102)사이의 거리가 2㎜가 되도록 식각하였다. 이러한 마이크로칩에 따르면, 시료가 제2채널(120)내에서 최대 2㎜를 차지하도록 주입될 수 있다. Here, the microchip according to the first embodiment of the present invention was etched such that the distance between X and the first
또한, 모든 채널의 내부는 라운드지게 홈을 형성하였으며, 23㎛ 이하의 깊이를 갖도록 하였다. In addition, the insides of all the channels are rounded to form grooves, and have a depth of 23 μm or less.
[실시예 2] 염료의 전기화학적 특성 검토Example 2 Examination of Electrochemical Properties of Dye
식품에 함유된 염료의 전기화학적인 특성을 확인하기 위하여, 유리질 탄소 전극을 이용하여 순환전압전류(Cyclic voltammetry;CV) 실험을 실시하였다. Cyclic voltammetry (CV) experiments were performed using glassy carbon electrodes to confirm the electrochemical properties of dyes in foods.
먼저 사용되는 시료인 표준식품염료는 TCI(Japna)에서 구입한 청색1호(brilliant blue FCF; B1), 청색2호(indigo carmine; B2), 녹색3호(fast green FCF; G3), 적색2호(amaranth; R2), 적색3호(erythrosine; R3), 적색40호(allura red; R40), 적색102호(ponceau 4R; R102), 황색4호(tartrazine; Y4), 황색5호(sunset yellow; Y5)를 각각 10 mM PBS(pH 7.0)용액에 녹여 사용하였다.The standard food dyes used first are brilliant blue FCF (B1), indigo carmine (B2), fast green FCF (G3) and red 2 purchased from TCI (Japna). Amaranth (R2), erythrosine (R3), allura red (R40), red 102 (ponceau 4R; R102), tartrazine (Y4), yellow 5 (sunset yellow; Y5) was dissolved in 10 mM PBS (pH 7.0) solution, respectively.
모든 식품에 포함된 염료들은 그들 구조 내의 페놀성 OH 또는 아민기로 인해 680-950 mV 사이의 전위에서 산화 피크를 확인할 수 있었다. 염료의 농도가 증가할수록 피크 전류 또한 증가하며 몇몇의 염료에서는 가역적인 반응을 확인할 수 있었다(황색5호 및 적색2호). The dyes included in all foods were able to identify oxidation peaks at potentials between 680-950 mV due to phenolic OH or amine groups in their structure. As the concentration of the dye increases, the peak current also increases, and in some dyes, a reversible reaction was observed (yellow 5 and red 2).
MEKC-ED 분석법을 통한 식품 염료의 동시 분리 분석에 이용되는 검출 전위의 최적화 조건을 찾기 위하여 유체역학 전압전류곡선(hydrodynamic voltammograms)을 얻었다. Hydrodynamic voltammograms were obtained to find the optimal conditions for the detection potential used for simultaneous separation of food dyes by MEKC-ED analysis.
전압전류곡선의 셋업 전위(setup potential)가 +0.4V 에서 +1.0V 까지는 피크 전류가 증가하고 그 이상의 셋업 전위에서는 피크 전류가 점차 감소하게 되지만, +0.9V 이상의 검출 전위를 가하게 되면 배경 전류가 커져서 기준선이 불안정하게 되고 민감하고 안정한 검출을 방해한다. 따라서 +0.9V를 검출전위로 하여 MEKC-ED 실험을 실시하였다. When the setup potential of the voltage current curve increases from + 0.4V to + 1.0V, the peak current increases and at higher setup potentials, the peak current gradually decreases, but when a detection potential of + 0.9V or more is applied, the background current increases. The baseline becomes unstable and interferes with sensitive and stable detection. Therefore, MEKC-ED experiment was conducted with + 0.9V as the detection potential.
[실시예 3] 마이크로칩 성능 검토Example 3 Microchip Performance Review
본 발명의 실시예에 따른 마이크로칩의 염료 검출 성능을 다음과 같은 방법으로 검토하였다.The dye detection performance of the microchip according to the embodiment of the present invention was examined by the following method.
이때, 각 식품염료의 농도는 R2가 16.5μM, R3가 11.4μM, R40이 20.3μM, Y4가 18.7μM, Y5가 22.1μM, B1이 12.6μM이었다.At this time, the concentration of each food dye was 16.5μM R2, 11.4μM R3, 20.3μM R40, 18.7μM Y4, 22.1μM Y5, 12.6μM B1.
실시예 1에서 준비된 마이크로칩을 0.1M NaOH 용액에 10분, 초순수(deionized water)에 10분, BGE 완충액[low-pH background electrolyte, 100 mM 아세테이트 완충액 + 10 mM SDS (pH 4.2)]에 10분 동안 세척하는 과정을 수행하였다. The microchips prepared in Example 1 were diluted with 0.1 M NaOH solution for 10 minutes, 10 minutes in deionized water, and 10 minutes in BGE buffer [low-pH background electrolyte, 100 mM acetate buffer + 10 mM SDS (pH 4.2)]. During the process of washing.
세척과정이 끝나면, 제1시료배출부(102)로 100mM PBS(Phosphate buffer, pH 8.0)를 주입하여 제1채널(110) 및 제2채널(120)의 내부를 채우고, BGE 완충액을 제1완충액저장부(105) 및 제2완충액저장부(106)로 주입하여 제3채널(130), 제4채널(140) 및 제5채널(150)의 내부를 채워두었다. 먼저 시료주입부(101)로 표준염료시료 50㎕을 주입하였다. After the washing process, the 100 mM PBS (Ph 8.0) is injected into the
다음으로 시료주입부(101)에 +100 V/cm의 전압을 20초 동안 인가하고 제1시료배출부(102)를 접지시켰다. 도 5를 참조하여 설명하면, 이 과정에서 시료주입부(101)에 있던 시료가 제1시료배출부(102)측으로 이동하게 된다. Next, a voltage of +100 V / cm was applied to the
이때, 시료주입부(101)를 플로팅시키고 제1시료배출부(102)에 +200V/cm의 전압을 230초 동안 인가하였다. 도 6을 참조하면, 이 과정에서 X와 제1시료배출부(102) 사이에 존재하는 시료가 제1농축부(103)측으로 이동하게 되면서 필드 증폭 시료 스태킹 방법에 의해 시료의 농축이 진행된다. 상기의 과정에서 채널내에 강한 전기삼투력이 발생하여 음전하를 갖는 시료 물질이 음극 전극으로 이동하게 된다. At this time, the
이와 동시에, 물을 시린지 펌프(syringe pump, KDS-200, KDS scientific, USA)를 이용하여 0.1㎕/min의 속도로 2분 동안 제1완충액저장부(105)에 주입한 후 상기 BGE 완충액을 상기와 같은 속도인 0.1㎕/min로 1분동안 제1완충액저장부(105)에 주입하였다. 이에 따라, 제3채널(130)의 대략 55mm는 물로, 대략 28mm는 BGE 완충액으로 채워졌다. At the same time, water is injected into the first
다음으로 필드 증폭 시료 주입방법을 시작하기 위하여 제1농축부(103)에 90초동안 -200V/cm의 전압을 인가하였다. 이 과정에서 표준염료시료의 이온들이 상기 제3채널(130)에 주입된 물층을 통과하면서 제1완충액저장부(105)를 향해 이동되었다. 이렇게 제3채널(130)내에서 제1완충액저장부(105)를 향해 이동되던 표준염료시료의 이온들은 낮은 pH를 갖는 BGE 완충액과 접촉하면 이동을 멈추게 된다.Next, to start the field amplification sample injection method, a voltage of −200 V / cm was applied to the
여기서, BGE 완충액은 전기삼투력을 약화시키고 표준염료시료의 음이온을 중성으로 바뀌게 함으로써, 시료를 가두는 역할을 하게 된다. 이때, 물은 제1농축부(103)로 배출된다. 60초가 경과하면, 농축된 시료층이 제2농축부(104)측으로 이동되고 이때, BGE 완충액을 물과 같은 속도로 50 초 동안 제2농축부(104)에 첨가시켰다 Here, the BGE buffer serves to trap the sample by weakening the electroosmotic force and changing the anion of the standard dye sample to neutral. At this time, the water is discharged to the
다음으로 제2농축부(104)에 20초동안 -100V/cm의 전압을 인가하면 농축된 시료가 제2시료배출부(107)측으로 이동된다. 이때, 제2완충액저장부(106)와 제2시료배출부(107)에는 100㎕의 BGE 완충액이 채워있는 상태이고 검출부(108)는 1mL의 10mM PBS(pH7.0)가 채워져 있는 상태이다. Next, when a voltage of -100 V / cm is applied to the
다음으로, 제2완충액저장부(106)에 -200V/cm의 전압을 인가함으로써, 표준염료시료로부터 염료를 분리하였다. 이때, 보다 안정적인 전기장을 제5채널(150)내에 생성시키기 위하여 안정적인 기준선을 얻은 후 제2완충액저장부(106)에 -200V/cm의 전압을 5초간 인가하여 염료를 주입하는 단계를 수행하였다. Next, the dye was separated from the standard dye sample by applying a voltage of −200 V / cm to the second
비교를 위하여 종래 사용하던 MEKC-ED 분석법을 유리탄소전극으로 농축시키는 단계를 수행하지 않고 단지 제5채널(150)만을 이용하여 수행하였다. 이때, 제2완충액저장부(106)를 시료저장부로 이용하였다.For comparison, the conventional MEKC-ED analysis was performed using only the
그 결과, 이동시간은 R2, G3, Y4, Y5, B2, R40, R3 및 B1 각각이 29초, 43초, 58초, 72초, 82초, 102초, 108초 및 113초이며, 대응 반피크너비(half-peak width)는 각각 약 2.3, 3.0, 2.5, 3.2, 2.8, 2.4, 1.9 및 2.7초이다. As a result, the travel time is 29 seconds, 43 seconds, 58 seconds, 72 seconds, 82 seconds, 102 seconds, 108 seconds, and 113 seconds for R2, G3, Y4, Y5, B2, R40, R3, and B1, respectively. The half-peak widths are about 2.3, 3.0, 2.5, 3.2, 2.8, 2.4, 1.9 and 2.7 seconds, respectively.
종래 MEKC-ED 분석법에 의한 B1에 관한 전기영동도는 도 4a이며, 분리효율은 약 1.0 X 104이었다. 이때, B1의 농도는 12.6μM이었다.Electrophoresis of B1 by the conventional MEKC-ED analysis method is Figure 4a, the separation efficiency was about 1.0 X 10 4 . At this time, the concentration of B1 was 12.6 μM.
한편, 상기 B1 농도를 125배 희석한 0.1μM의 B1을 이용하여 농축단계 즉, FASS 및 FASI 단계 후 MEKC-ED를 수행하면 도 4b에 도시된 바와 같이 종래 MEKC-ED 분석법과 동일한 이동시간과 거의 동일한 분리효율을 나타낸다. On the other hand, when the concentration step, that is, MEKC-ED after the FASS and FASI step using 0.1 μM B1 diluted 125 times the B1 concentration as shown in Figure 4b and almost the same travel time as the conventional MEKC-ED assay It shows the same separation efficiency.
이때, 본 발명에 따른 검출법에 의하여 피크높이가 종래 MEKC-ED 분석법에 의한 피크높이보다 86배 더 높았고, 민감도도 10800배 증가하였다.At this time, the peak height by the detection method according to the present invention was 86 times higher than the peak height by the conventional MEKC-ED analysis method, the sensitivity was also increased 10800 times.
또한, 본 발명에 따른 검출법은 전류반응 및 이동시간에서 재현성이 뛰어나며(RSD <7.2%), 검량선은 1.0nM 내지 1.0μM의 범위에서 선형(r2=0.998)을 나타내었다.In addition, the detection method according to the present invention was excellent in reproducibility (RSD <7.2%) in current response and movement time, and the calibration curve was linear (r 2 = 0.998) in the range of 1.0 nM to 1.0 μM.
[실시예 4] 실제 시료 분석Example 4 Actual Sample Analysis
주스, 탁주, 젓갈, 라면 및 고추 분말을 C-18(Sep-Pak) packed syringe를 이용하여 AOAC법(Official Methods of Analysis of AOAC International, 16th ed., Chapter 46, pp3-4)에 의해 추출되었다. Juice, Takju, Salted Fish, Ramen and Red Pepper powders were extracted by AOAC method using the C-18 (Sep-Pak) packed syringe. .
먼저, 식품시료를 20분 동안 초음파처리하였다. C-18(Sep-Pak) packed syringe를 100% 메탄올에 의해 활성화한 후, 초음파처리된 식품시료를 상기 시린지에 통과시켰다. 그후, 정제수로 세정하고 50% 2-프로판올을 이용하여 염료를 추출하였다. 이렇게 추출된 염료 시료를 이용할 때까지 25℃에서 보관하였다.First, the food sample was sonicated for 20 minutes. After activating the C-18 (Sep-Pak) packed syringe with 100% methanol, the sonicated food sample was passed through the syringe. Then, washed with purified water and extracted the dye using 50% 2-propanol. The dye samples thus extracted were stored at 25 ° C. until use.
상기 염료시료는 필터를 통과시켜 이물질을 제거시킨 후 0.1mM NaOH를 가하여 pH를 8.0으로 조정하고, 1.0mM PBS(pH 8.0)를 이용하여 100배 희석하여 사용하였다.The dye sample was passed through a filter to remove foreign substances, 0.1mM NaOH was added to adjust the pH to 8.0, and diluted 100-fold using 1.0mM PBS (pH 8.0).
이렇게 준비한 탁주 시료를 앞선 실시예와 동일한 방법으로 분석한 결과 10nM의 Y4를 함유하였다. 그후, 내부표준물질로서 5.0nM의 B1을 사용하였다. 도 5에 도시된 바와 같이, 두 개의 피크가 재현성있게 잘 분리되었다.The Takju sample thus prepared was analyzed in the same manner as in the previous example and contained 10 nM of Y4. Thereafter, 5.0 nM of B1 was used as an internal standard. As shown in FIG. 5, the two peaks separated well reproducibly.
이상과 같이, 본 발명은 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 본 발명은 이것에 의해 한정되지 않으며 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 본 발명의 기술 사상과 아래에 기재될 청구범위의 균등 범위 내에서 다양한 수정 및 변형이 가능함은 물론이다. As mentioned above, although this invention was demonstrated by the limited embodiment and drawing, this invention is not limited by this, The person of ordinary skill in the art to which this invention belongs, Of course, various modifications and variations are possible within the scope of equivalents of the claims to be described.
도 1은 본 발명의 실시예에 따른 식품염료 분석용 마이크로칩의 채널 패턴도,1 is a channel pattern diagram of a microchip for food dye analysis according to an embodiment of the present invention,
도 2는 본 발명의 실시예에 따른 식품염료 분석방법의 흐름도,2 is a flow chart of a food dye analysis method according to an embodiment of the present invention;
도 3a 내지 도 3e는 본 발명의 실시예에 따른 식품염료 분석방법의 각 공정들을 구체적으로 나타낸 개념도, 3a to 3e is a conceptual diagram showing in detail each process of the food dye analysis method according to an embodiment of the present invention,
도 4a 및 도 4b는 각각 종래 MEKC-ED 분석법 및 본 발명의 실시예에 따른 식품염료 분석방법에 관한 전기영동도를 나타낸 그래프, Figures 4a and 4b is a graph showing the electrophoresis of the conventional MEKC-ED analysis method and food dye analysis method according to an embodiment of the present invention,
도 5는 본 발명의 실시예에 따른 탁주 시료로부터 염료를 분석한 전기영동도를 나타낸 것이다.Figure 5 shows the electrophoresis analysis of the dye from the Takju sample according to an embodiment of the present invention.
<도면의 주요 부분에 대한 부호의 설명><Explanation of symbols for the main parts of the drawings>
101 : 시료주입부 102 : 제1시료배출부101: sample injection unit 102: first sample discharge unit
103 : 제1농축부 104 : 제2농축부 103: first concentration unit 104: second concentration unit
105 : 제1완충액저장부 106 : 제2완충액저장부 105: first buffer storage unit 106: second buffer storage unit
107 : 제2시료배출부 108 : 검출부107: second sample discharge unit 108: detection unit
110 : 제1채널 120 : 제2채널 110: first channel 120: second channel
130 : 제3채널 140 : 제4채널 130: third channel 140: fourth channel
150 : 제5채널150: fifth channel
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