WO2017039080A1 - Sample concentration apparatus and method for extracting concentrated sample by using same - Google Patents

Sample concentration apparatus and method for extracting concentrated sample by using same Download PDF

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WO2017039080A1
WO2017039080A1 PCT/KR2015/014457 KR2015014457W WO2017039080A1 WO 2017039080 A1 WO2017039080 A1 WO 2017039080A1 KR 2015014457 W KR2015014457 W KR 2015014457W WO 2017039080 A1 WO2017039080 A1 WO 2017039080A1
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WO
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sample
ion
selective membrane
microchannels
solution
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PCT/KR2015/014457
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Inventor
김성재
이상준
박성민
Original Assignee
서울대학교 산학협력단
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N1/00—Sampling; Preparing specimens for investigation
    • G01N1/28—Preparing specimens for investigation including physical details of (bio-)chemical methods covered elsewhere, e.g. G01N33/50, C12Q
    • G01N1/40—Concentrating samples

Definitions

  • the present invention relates to a sample concentrating device and a method for extracting a sample concentrated using the same, and more particularly, a sample concentrating device capable of separating and concentrating a sample sample to be detected at a high concentration in a bio-environmental field and concentrated using the same. It relates to a sampling method.
  • the technique of concentrating the sample to improve the detection and analysis efficiency is very important.
  • Recent methods for sample concentration in micro systems include Field Amplified Sample Stacking (FASS), Isotachophoresis, Electrokinetic trapping, Micellar electrokinetic sweeping, Chromatographic preconcentration and Membrane preconcentration.
  • FSS Field Amplified Sample Stacking
  • Isotachophoresis Isotachophoresis
  • Electrokinetic trapping Micellar electrokinetic sweeping
  • Chromatographic preconcentration Chromatographic preconcentration
  • Membrane preconcentration membrane preconcentration
  • the present invention is to solve a number of problems including the above problems, the process is simple, economical, mass production apparatus capable of mass production and concentrated sample extraction method using the same.
  • these problems are exemplary, and the scope of the present invention is not limited thereby.
  • a sample concentrating device may include an ion-selective membrane connected to one end of n microchannels so as to form an ion depletion zone by ion concentration polarization (ICP) phenomenon; Electrodes formed at the other ends of the n microchannels to apply a voltage; And a pipette tip capable of contacting a central portion of the ion selective membrane and allowing a solution containing a sample to flow in or out of the sample; and a pipette tip through the pipette tip.
  • ICP ion concentration polarization
  • the solution is separated into a fluid and the sample by the ion concentration polarization phenomenon generated by applying a voltage to the solution injected into the central portion of the membrane, and the separated fluid flows out to the other ends of the n microchannels.
  • Samples can be concentrated in the central portion of the ion selective membrane and extracted outwards through a pipette tip.
  • the ion-selective membrane may comprise a nano-membrane printed in a circular or polygonal shape.
  • the ion selective membrane and the electrode may be radially spaced apart from each other.
  • a sample extraction method comprises the steps of supplying a solution comprising a sample to a central portion of a microchannel device having n microchannels and an ion-selective membrane using a pipette tip; By applying a voltage to the microchannel device, an ion concentration polarization (ICP) phenomenon occurs at one end of the n microchannels and the ion selective membrane to form an ion depletion zone. step; And the solution is separated into a fluid and the sample based on the ion depletion region, the fluid flows out through the n microchannel other ends, and the sample is extracted to the outside of the microchannel device through the pipette tip. It may comprise the steps.
  • ICP ion concentration polarization
  • the solution is microparticles having a micro-nano size, and the polar particles are dielectrically polarized by an electric field.
  • the solution may be separated into the fluid and the sample by the force due to the electroosmotic flow and the force due to the ion concentration polarization phenomenon.
  • the solution may be supplied to the central portion of the microchannel device or the sample separated by the ion concentration polarization phenomenon according to the pressure change on the pipette tip.
  • the extracting of the sample to the outside of the micro channel device may include collecting the sample extracted through the pipette tip in a separate device.
  • FIG. 1A to 1C schematically illustrate a micro channel device according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 2 is a photograph of the micro channel device shown in FIG.
  • FIG. 3 is a photograph of a sample concentrating device and a sample extraction process concentrated using the same according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 1 (a) to (c) is a view schematically showing a micro channel device according to an embodiment of the present invention
  • Figure 2 is a picture of the micro channel device shown in (a) of FIG.
  • the micro channel device 10 may have an ion depletion zone due to ion concentration polarization (ICP).
  • ICP ion concentration polarization
  • An ion-selective membrane 14 connected to one end of the n microchannels 12 and an electrode 16 formed at the other end of the n microchannels 12 to apply a voltage to form the And a pipette tip 18 capable of contacting the central portion of the ion-selective membrane 14, into which a solution 20 comprising the sample 20a can be introduced, or into which the sample 20a can flow. can do.
  • the ion selective membrane 14 may comprise, for example, a nanomembrane printed in a circular or polygonal shape.
  • the nanomembrane is connected to one end of the n microchannels 12 to be described later, and may be printed as a circular nanomembrane having a uniform shape so that separate concentration of the sample 20a can be reproducibly implemented.
  • the ion-selective membrane 14 is not formed in a uniform shape, separation and concentration of the sample 20a may not be performed properly due to a minute error occurring in a portion in contact with the microchannel 12.
  • the most ideal type of ion selective membrane 14 may be circular in shape, but when the number of micro channels 12 is not large, the ion selective membrane 14 may be easily matched with the portions contacting each of the micro channels 12. ) May be formed in a polygonal shape, and a portion contacting each of the microchannels 12 may be formed flat.
  • each of the n microchannels 12 may be understood as a straight microchannel, and the edge surface of the nanomembrane contacts one end of each microchannel 12 to overlap each other to form the microchannel device 10. can do. This eliminates fine errors in the manufacturing process of the micro channel device 10 so that the separation concentration of the sample 20a is always stable.
  • the number of microchannels 12 may be designed differently in number and shape according to the capacity of the sample 20a to be separated and concentrated.
  • the microchannel device 10 may be designed to be smaller or larger in size than the radial structure by configuring the microchannel 12 in a form arranged in parallel with each other rather than a radial structure.
  • the concentration of the sample 20a may be controlled by adjusting the number, length and thickness of each microchannel 12. Further, the concentration of the sample 20a may be controlled according to the magnitude of the voltage applied to the micro channel device 10.
  • a high concentration of the sample 20a may be extracted by stacking at least two microchannel devices 10 formed in a single layer.
  • the micro channel device 10 may include an electrode 16.
  • the electrodes may be formed at the other ends of the n micro channels 12.
  • the electrode 16 may be arranged differently according to the form in which the n microchannels 12 are disposed.
  • the circular ion-selective membrane 14 and the electrode 16 may be surrounded by the ion-selective membrane 14. Radially spaced apart from each other along the micro-channels 12 coupled to the. If the microchannels 12 are arranged next to each other by using a flat polygonal ion selective membrane 14 instead of a circular ion selective membrane 14, the electrode 16 is ion selective.
  • the membrane 14 may be spaced apart from the membrane 14 by a predetermined distance.
  • a sample extraction method includes a microchannel device 10 having n microchannels 12 and an ion selective membrane 14. Supplying a solution 20 containing a sample 20a to a central portion of the pipette tip 18 using a pipette tip, applying a voltage to the microchannel device 10, thereby applying n microchannels 12.
  • Ion Concentration Polarization ICP
  • ICP Ion Concentration Polarization
  • the fluid 20b is separated into a sample 20a based on the fluid, and the fluid 20b flows out through the other ends of the n microchannels 12, and the sample 20a passes through the pipette tip 18. It may include extracting to the outside of the device 10.
  • a pipette tip 18 is brought into contact with a central portion of the microchannel device 10 to obtain a solution 20 including a sample 20a.
  • a sample 20a may be understood as a sample that can be used in the bioenvironment field.
  • the solution 20 may include microparticles having a micro-nano size and the polarized microparticles may be subjected to dielectric polarization by an electric field.
  • the particulates may be self-assembled and collected near the ion selective membrane 14.
  • the ion concentration polarization phenomenon used in one embodiment of the present invention is one of the electrochemical transfer phenomenon observed around the structure having a nano-membrane. It is theoretically known that when the thickness of the electric double layer is similar to the size of the nanomembrane, the polar double layer overlaps inside the nanomembrane and exhibits monopolar ion permeability. That is, most of the surface of the material has its own surface charge when it comes into contact with the liquid. If the microchannel device 10 is made of such a material and the liquid is poured into the microchannel device 10, the surface charge of the material Counter ions form an electrical double layer. The electrical double layer has a thickness of several nanometers to several hundred nanometers, and has a selective permeability to pass only ions of opposite polarity to nano size.
  • an ion concentration polarization phenomenon occurs in which an ion depletion layer is formed at one side of the nanomembrane and an ion floating layer is at the opposite side by a selective permeable nanomembrane.
  • the circular cation-selective nanomembrane 14 is coupled to the n microchannels 12 using this, negatively charged samples can be simultaneously concentrated in the direction where the potential is high due to the ion concentration polarization phenomenon.
  • a solution containing a sample is injected into the top of the micro multi-channel, and a pressure and voltage are applied to cause ion concentration polarization due to ion concentration. do.
  • Samples are subjected to dielectric polarization by an external electric field, behaving like charged particles, and subjected to electrostatic forces at the edge of the ion depletion layer resulting from ion concentration polarization, which are pushed away from the nanomembrane.
  • the sample is moved to the microchannel, and the sample is pushed out of the ion depletion layer by the force F ICP due to the ion concentration polarization phenomenon and concentrated in the central portion of the microchannel device 10. By collecting the concentrated samples separately, high concentration sample samples can be obtained.
  • a voltage may be applied to the electrode 16 while applying pressure.
  • the ion depletion occurs by simultaneously applying the ion concentration polarization (ICP) to a portion adjacent to the branching point where the ion selective membrane 14 and the n microchannels 12 are in contact with the applied pressure and voltage. zones).
  • the introduced solution 20 may be separated into the fluid 20b and the sample 20a based on the ion depletion region. In the separation process, the sample 20a may be pushed out from the interface of the ion depletion region by the force of the electroosmotic flow and the force of the ion concentration polarization phenomenon.
  • the separated fluid 20b flows outward to the center of the microchannel 12, and the sample 20a is pushed out by the electric repulsive force at the interface of the ion depletion region to the center portion where the ion selective membrane 14 is disposed.
  • the pipette tip 18 may again contact the central portion of the micro channel device 10 and then apply pressure to collect the concentrated sample 20a into a separate device (not shown), and the concentrated sample 20a If collected separately, a high concentration of sample can be extracted.
  • the separated sample 20a may be extracted using the same pipette tip 18 used to inject the solution 20 into the microchannel device 10, It is also possible to use an alternative to a mechanism that can apply pressure or allow material to pass through the outlet portion formed in the central portion of the channel device 10.
  • the microchannel device 10 may control the concentration of a sample according to the number of microchannels.
  • FIG. 2A illustrates the microchannel 12.
  • FIG. 2B illustrates a micro channel device 10 having 8 micro channels 12.
  • the micro channel device 10 may use a transparent material as the first substrate.
  • a transparent material for example, one of pyrex, silicon dioxide, silicon nitride, quartz or SU-8 may be used as the first substrate.
  • the micro channel device 10 is coated with a low-autofluorescent material.
  • a second substrate may be included.
  • the second substrate can be used to cover or seal the micro channel device 10.
  • the second substrate may be made of the same material as the first substrate. Depending on the solution used in some embodiments, the first substrate and the second substrate may be made of different materials.
  • the substrate is a support structure of the micro channel device 10. At least a portion of the substrate may be made of silicon. In one embodiment of the invention, the substrate, device or portions of the device may be made of a polymer.
  • the polymer may be polydimethylsiloxane (PDMS). When PDMS is used, oxygen (O 2 ) plasma may be treated to have hydrophilicity, but oxygen plasma treatment may be omitted in some cases.
  • the solution 20 may include an introduction portion protruding upward in the central portion of the micro channel device 10 so that the solution 20 may be introduced or the concentrated sample 20a may flow out.
  • One end of the n microchannels 12 may be disposed with an ion selective membrane 14 to be electrically grounded (GND).
  • GND electrically grounded
  • sample 20a comprising charged species in solution introduced through the inlet can be concentrated in the central portion where ion selective membrane 14 is disposed, and the non-charged species
  • the fluid 20b including may be discharged to the other ends of the n micro channels 12.
  • the ion selective membrane 14 may use, for example, Nafion.
  • the ion selective membrane 14 may be predominantly behaving against cations that do not match the ionic conductivity in the electrolyte. As a result, ion concentration gradients can be generated on both sides of the ion selective membrane 14. Once ion concentration polarization is induced near the cation exchange ion selective membrane 14, both the cation and anion concentrations decrease on the anode side and increase on the cathode side of the junction. Moreover, charged particles, cells, other small colloids, and the like, may similarly exhibit ion depletion or ionic hyperplasia, which makes it possible to obtain a depletion region in rectified state.
  • a circular electrode is deposited on the other end of the microchannel using a metal deposition technique in a microchannel coupling structure having four legs on a circularly printed nanofilm. Later, using a pipette tip, about 990 ⁇ l of deionize water (DI), about 10 ⁇ l of 100 mM potassium chloride (KCl), and about 2 ⁇ l of Alexa 488 in the central portion of the microchannel bonding structure The mixed solution was injected, and a concentration of about 70 V and a circular electrode at the other end of the micro channel using a voltage applying device in the center of the micro channel was concentrated after about 10 and 60 seconds. It photographed with the fluorescent light source of 480 nm wavelength band.
  • DI deionize water
  • KCl potassium chloride
  • Alexa 488 Alexa 488
  • FIG. 3 is a photograph of a sample concentrating device and a sample extraction process concentrated using the same according to an embodiment of the present invention.
  • FIG. 3 is a microscopic photograph of a microchannel structure in which a circular ion-selective membrane and four microchannels are combined
  • (b) of FIG. 3 is a voltage applied to the microchannel structure.
  • the microscopic structure was analyzed by a microscope while applying a fluorescent light source to the microchannel structure after about 10 seconds
  • Figure 3 (c) is a microscope while applying a fluorescent light source to the microchannel structure after about 60 seconds after applying a voltage to the microchannel structure This is a photograph analyzed.
  • the sample and the fluid are formed by an ion depletion region formed in the vicinity of the ion selective membrane and the four microchannels as time passes after the voltage is applied to the microchannel structure. It can be seen that it is separated into and concentrated to the central portion of the microchannel structure by electrostatic repulsive force.
  • the present invention is based on a low cost device based on PDMS with a micro-nano channel binding system, and can concentrate ions in an aqueous solution to a high concentration.
  • Increasing the number of microchannels compensates for the disadvantages of the microconcentrator with low sample throughput and detection sensitivity, and compensates for the disadvantages of low-accuracy bulk concentrators by adjusting pressure and voltage.
  • the denatured protein test in the blood flow is widely used as an indicator of the diagnosis of the disease, the amount of protein in the blood flow is very small, so the concentration process is necessary to detect and analyze it.
  • heavy metals can have a deadly effect when accumulated in a very small amount in a living body, so it is important to concentrate them at a high concentration when detecting heavy metals, and to detect harmful substances such as fine heavy metals in foods that humans consume such as heavy metals detection.
  • the concentration of the sample concentration device according to the embodiments of the present invention, and the like, the field that needs to detect or maximize the concentration or the experiment to maximize the concentration thereof Concentrated sample extraction methods can be applied.

Abstract

The present invention provides a sample concentration apparatus and a method for extracting the sample by using the same, the sample concentration apparatus comprising: an ion-selective membrane connected to one end of n microchannels so that an ion depletion zone can be formed by ion concentration polarization (ICP); an electrode, formed at the other end of n microchannels, capable of applying voltage; and a pipet tip capable of contacting a central portion of the ion- selective membrane and capable of introducing a solution containing the sample or draining the sample, wherein the solution is separated into a fluid and the sample by the ion concentration polarization phenomenon which is generated by applying voltage to the solution injected into the central portion of the ion-selective membrane through the pipet tip, the separated fluid is drained into the other end of the n microchannels, and the sample is concentrated in the central portion of the ion-selective membrane and is extracted externally through the pipet tip.

Description

샘플 농축 장치 및 이를 이용하여 농축된 샘플 추출 방법Sample concentrating device and concentrated sample extraction method using the same
본 발명은 샘플 농축 장치 및 이를 이용하여 농축된 샘플 추출 방법에 관한 것으로서, 더 상세하게는 바이오·환경 분야에서 검출하고자 하는 시료 샘플을 고농도로 분리 농축할 수 있는 샘플 농축 장치 및 이를 이용하여 농축된 샘플 추출 방법에 관한 것이다.The present invention relates to a sample concentrating device and a method for extracting a sample concentrated using the same, and more particularly, a sample concentrating device capable of separating and concentrating a sample sample to be detected at a high concentration in a bio-environmental field and concentrated using the same. It relates to a sampling method.
의료, 제약, 약물검사, 수질검사 및 임상진단 등 바이오·환경 분야에서 검출하고자 하는 시료의 농도가 극히 낮기 때문에 검출 및 분석 효율을 높이기 위해 샘플을 농축하는 기술은 매우 중요하게 연구되고 있다.Since the concentration of the sample to be detected in the bio-environment field such as medical, pharmaceutical, drug test, water test, and clinical diagnosis is extremely low, the technique of concentrating the sample to improve the detection and analysis efficiency is very important.
현재 샘플 농축을 위한 방법은 규모에 따라 크게 두 종류로 나눌 수 있는데 먼저 대형 시스템(bulk)에서의 방법은 동결건조, 삼투압 방법, 침전법, 이온 교환 크로마토그래피 및 흡습법 등이 있다. 이 기술들은 처리용량이 큰 대신 전처리 과정이 필요하거나 샘플이 손실되는 등 정확도가 떨어지는 단점이 있다.Current methods for sample concentration can be divided into two types according to the scale. First, in a large system, there are lyophilization, osmotic method, precipitation method, ion exchange chromatography, and hygroscopic method. These technologies have the disadvantage of inaccurate accuracy, such as the need for pretreatment or loss of samples, instead of large throughput.
최근 소형 시스템(micro)에서의 샘플 농축을 위한 방법은 Field Amplified Sample Stacking(FASS), Isotachophoresis, Electrokinetic trapping, Micellar electrokinetic sweeping, Chromatographic preconcentration 및 Membrane preconcentration 등이 있고, 이 기술들은 샘플 종류와 무관하게 농축 가능하고, 농축도가 크지만 마이크로 채널 내부에서 농축 현상이 일어나므로 pL~nL 매우 소량의 샘플이 농축되어 검출감도가 낮고, 농축 장치를 구동하기 위한 외부 제어 장치가 반드시 필요하고, 숙련된 연구자만이 농축기를 원활이 사용할 수 있는 등의 문제점이 있다. Recent methods for sample concentration in micro systems include Field Amplified Sample Stacking (FASS), Isotachophoresis, Electrokinetic trapping, Micellar electrokinetic sweeping, Chromatographic preconcentration and Membrane preconcentration. In addition, since the concentration is high, but the concentration occurs inside the micro channel, very small amounts of pL to nL are concentrated, so the detection sensitivity is low, and an external control device is necessary for driving the concentration device. There is a problem that can be used smoothly.
본 발명은 상기와 같은 문제점을 포함하여 여러 문제점들을 해결하기 위한 것으로서, 공정이 간단하고, 경제적이며, 대량 생산이 가능한 샘플 농축 장치 및 이를 이용하여 농축된 샘플 추출 방법에 대한 것이다. 그러나 이러한 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.The present invention is to solve a number of problems including the above problems, the process is simple, economical, mass production apparatus capable of mass production and concentrated sample extraction method using the same. However, these problems are exemplary, and the scope of the present invention is not limited thereby.
본 발명의 일 관점에 따르면, 샘플 농축 장치가 제공된다. 상기 샘플 농축 장치는 이온농도분극(ICP;Ion Concentration Polarization) 현상에 의해 이온공핍영역(ion depletion zone)을 형성할 수 있도록, n개의 마이크로 채널 일단에 연결되는 이온 선택성 멤브레인(ion-selective membrane); 상기 n개의 마이크로 채널 타단에 형성되어 전압을 인가할 수 있는 전극; 및 상기 이온 선택성 멤브레인의 중앙 부분에 접촉이 가능하며, 샘플을 포함하는 용액이 유입되거나 상기 샘플이 유출될 수 있는 파이펫 팁(pipet tip);을 포함하고, 상기 파이펫 팁을 통해 상기 이온 선택성 멤브레인의 중앙 부분에 주입된 상기 용액에 전압을 인가함으로써 발생되는 상기 이온농도분극 현상에 의하여 상기 용액은 유체 및 상기 샘플로 분리되고, 분리된 상기 유체는 상기 n개의 마이크로 채널 타단으로 유출되며, 상기 샘플은 상기 이온 선택성 멤브레인의 중앙 부분에 농축되어 파이펫 팁을 통해서 외부로 추출될 수 있다.According to one aspect of the invention, a sample concentrating device is provided. The sample concentrating device may include an ion-selective membrane connected to one end of n microchannels so as to form an ion depletion zone by ion concentration polarization (ICP) phenomenon; Electrodes formed at the other ends of the n microchannels to apply a voltage; And a pipette tip capable of contacting a central portion of the ion selective membrane and allowing a solution containing a sample to flow in or out of the sample; and a pipette tip through the pipette tip. The solution is separated into a fluid and the sample by the ion concentration polarization phenomenon generated by applying a voltage to the solution injected into the central portion of the membrane, and the separated fluid flows out to the other ends of the n microchannels. Samples can be concentrated in the central portion of the ion selective membrane and extracted outwards through a pipette tip.
상기 샘플 농축 장치에 있어서, 상기 이온 선택성 멤브레인은 원형 또는 다각형 형상으로 프린팅 된 나노막을 포함할 수 있다.In the sample concentrating device, the ion-selective membrane may comprise a nano-membrane printed in a circular or polygonal shape.
상기 샘플 농축 장치에 있어서, 상기 이온 선택성 멤브레인과 상기 전극은 방사형으로 서로 이격되어 배치된 것일 수 있다.In the sample concentrating device, the ion selective membrane and the electrode may be radially spaced apart from each other.
본 발명의 다른 관점에 따르면, 샘플 추출 방법이 제공된다. 상기 샘플 추출 방법은 n개의 마이크로 채널 및 이온 선택성 멤브레인(ion-selective membrane)을 구비한 마이크로 채널 디바이스의 중앙 부분에 샘플을 포함하는 용액을 파이펫 팁(pipet tip)을 이용하여 공급하는 단계; 상기 마이크로 채널 디바이스에 전압을 인가하여, 상기 n개의 마이크로 채널 일단과 상기 이온 선택성 멤브레인이 연결된 부위에 이온농도분극(ICP;Ion Concentration Polarization) 현상이 발생함으로써 이온공핍영역(ion depletion zone)을 형성하는 단계; 및 상기 용액은 상기 이온공핍영역을 기준으로 유체와 상기 샘플로 분리되며, 상기 유체는 상기 n개의 마이크로 채널 타단을 통해 유출되고, 상기 샘플은 상기 파이펫 팁을 통해 상기 마이크로 채널 디바이스의 외부로 추출되는 단계를 포함할 수 있다.According to another aspect of the present invention, a sample extraction method is provided. The sample extraction method comprises the steps of supplying a solution comprising a sample to a central portion of a microchannel device having n microchannels and an ion-selective membrane using a pipette tip; By applying a voltage to the microchannel device, an ion concentration polarization (ICP) phenomenon occurs at one end of the n microchannels and the ion selective membrane to form an ion depletion zone. step; And the solution is separated into a fluid and the sample based on the ion depletion region, the fluid flows out through the n microchannel other ends, and the sample is extracted to the outside of the microchannel device through the pipette tip. It may comprise the steps.
상기 샘플 추출 방법에 있어서, 상기 용액은 마이크로-나노 크기를 갖는 미립자이며, 극성을 띠는 상기 미립자는 전기장에 의해 유전분극이 일어날 수 있다.In the sample extraction method, the solution is microparticles having a micro-nano size, and the polar particles are dielectrically polarized by an electric field.
상기 샘플 추출 방법에 있어서, 상기 용액은 전기삼투 흐름에 의한 힘과 상기 이온농도분극 현상에 의한 힘에 의해 상기 유체와 상기 샘플로 분리되는 것일 수 있다.In the sample extraction method, the solution may be separated into the fluid and the sample by the force due to the electroosmotic flow and the force due to the ion concentration polarization phenomenon.
상기 샘플 추출 방법에 있어서, 상기 파이펫 팁에 압력 변화에 따라 상기 용액이 상기 마이크로 채널 디바이스의 중앙 부분에 공급되거나 상기 이온농도분극 현상에 의해 분리된 상기 샘플이 추출되는 것일 수 있다.In the sample extraction method, the solution may be supplied to the central portion of the microchannel device or the sample separated by the ion concentration polarization phenomenon according to the pressure change on the pipette tip.
상기 샘플 추출 방법에 있어서, 상기 샘플이 상기 마이크로 채널 디바이스의 외부로 추출되는 단계는, 상기 파이펫 팁을 통해 추출되는 상기 샘플을 별도의 장치에서 모아주는 단계;를 포함할 수 있다.In the sample extraction method, the extracting of the sample to the outside of the micro channel device may include collecting the sample extracted through the pipette tip in a separate device.
상기한 바와 같이 이루어진 본 발명의 일 실시예에 따르면, 이온 선택성 멤브레인을 구비한 미세 채널 디바이스를 사용함으로써 구조가 간단하며, 저전력으로 미세조류세포로부터 바이오디젤을 생산하는 방법을 구현할 수 있다. 물론 이러한 효과에 의해 본 발명의 범위가 한정되는 것은 아니다.According to one embodiment of the present invention made as described above, it is possible to implement a method for producing biodiesel from microalgal cells with a simple structure and low power by using a microchannel device having an ion selective membrane. Of course, the scope of the present invention is not limited by these effects.
도 1의 (a) 내지 (c)는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 채널 디바이스를 개략적으로 도시한 도면이다.1A to 1C schematically illustrate a micro channel device according to an embodiment of the present invention.
도 2는 도 1의 (a)에 도시된 마이크로 채널 디바이스의 사진이다.FIG. 2 is a photograph of the micro channel device shown in FIG.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 샘플 농축 장치 및 이를 이용하여 농축된 샘플 추출 과정을 관찰한 사진이다.3 is a photograph of a sample concentrating device and a sample extraction process concentrated using the same according to an embodiment of the present invention.
이하, 첨부된 도면들을 참조하여 본 발명의 실시예를 상세히 설명하면 다음과 같다. 그러나 본 발명은 이하에서 개시되는 실시예에 한정되는 것이 아니라 서로 다른 다양한 형태로 구현될 수 있는 것으로, 이하의 실시예는 본 발명의 개시가 완전하도록 하며, 통상의 지식을 가진 자에게 발명의 범주를 완전하게 알려주기 위해 제공되는 것이다. 또한 설명의 편의를 위하여 도면에서는 구성 요소들이 그 크기가 과장 또는 축소될 수 있다.Hereinafter, exemplary embodiments of the present invention will be described in detail with reference to the accompanying drawings. However, the present invention is not limited to the embodiments disclosed below, but can be implemented in various forms, and the following embodiments are intended to complete the disclosure of the present invention, the scope of the invention to those skilled in the art It is provided to inform you completely. In addition, the components may be exaggerated or reduced in size in the drawings for convenience of description.
이하, 본 발명의 실시예들은 본 발명의 이상적인 실시예들을 개략적으로 도시하는 도면들을 참조하여 설명한다. 도면들에 있어서, 예를 들면, 제조 기술 및/또는 공차(tolerance)에 따라, 도시된 형상의 변형들이 예상될 수 있다. 따라서, 본 발명 사상의 실시예는 본 명세서에 도시된 영역의 특정 형상에 제한된 것으로 해석되어서는 아니 되며, 예를 들면 제조상 초래되는 형상의 변화를 포함하여야 한다.Embodiments of the present invention will now be described with reference to the drawings, which schematically illustrate ideal embodiments of the present invention. In the figures, for example, variations in the shape shown may be expected, depending on manufacturing techniques and / or tolerances. Accordingly, embodiments of the inventive concept should not be construed as limited to the specific shapes of the regions shown herein, but should include, for example, changes in shape resulting from manufacturing.
도 1의 (a) 내지 (c)는 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 채널 디바이스를 개략적으로 도시한 도면이고, 도 2는 도 1의 (a)에 도시된 마이크로 채널 디바이스의 사진이다.1 (a) to (c) is a view schematically showing a micro channel device according to an embodiment of the present invention, Figure 2 is a picture of the micro channel device shown in (a) of FIG.
도 1의 (a) 내지 (c)를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 마이크로 채널 디바이스(10)는 이온농도분극(ICP;Ion Concentration Polarization) 현상에 의해 이온공핍영역(ion depletion zone)을 형성할 수 있도록, n개의 마이크로 채널(12) 일단에 연결되는 이온 선택성 멤브레인(ion-selective membrane, 14), n개의 마이크로 채널(12) 타단에 형성되어 전압을 인가할 수 있는 전극(16) 및 이온 선택성 멤브레인(14)의 중앙 부분에 접촉이 가능하며, 샘플(20a)을 포함하는 용액(20)이 유입되거나 샘플(20a)이 유출될 수 있는 파이펫 팁(pipet tip, 18)을 포함할 수 있다.Referring to (a) to (c) of FIG. 1, the micro channel device 10 according to an embodiment of the present invention may have an ion depletion zone due to ion concentration polarization (ICP). An ion-selective membrane 14 connected to one end of the n microchannels 12 and an electrode 16 formed at the other end of the n microchannels 12 to apply a voltage to form the And a pipette tip 18 capable of contacting the central portion of the ion-selective membrane 14, into which a solution 20 comprising the sample 20a can be introduced, or into which the sample 20a can flow. can do.
먼저, 이온 선택성 멤브레인(14)은 예를 들어, 원형 또는 다각형 형상으로 프린팅 된 나노막을 포함할 수 있다. 나노막은 후술할 n개의 마이크로 채널(12)의 일단과 연결되며, 샘플(20a)의 분리 농축이 재현성 있게 구현될 수 있도록 균일한 모양의 원형 나노막으로 프린팅 될 수 있다.First, the ion selective membrane 14 may comprise, for example, a nanomembrane printed in a circular or polygonal shape. The nanomembrane is connected to one end of the n microchannels 12 to be described later, and may be printed as a circular nanomembrane having a uniform shape so that separate concentration of the sample 20a can be reproducibly implemented.
만약, 이온 선택성 멤브레인(14)이 균일한 모양으로 형성되지 않으면, 마이크로 채널(12)과 맞닿는 부분에서 미세하게 생기는 오차로 인해 샘플(20a)의 분리 농축이 제대로 되지 않을 수 있다. 따라서, 가장 이상적인 이온 선택성 멤브레인(14)의 형태는 원형이 가장 좋으나, 마이크로 채널(12)의 개수가 많지 않을 경우, 각각의 마이크로 채널(12)과 맞닿는 부분이 일치하기 용이하도록 이온 선택성 멤브레인(14)이 다각형 형상으로 이루어져 각각의 마이크로 채널(12)과 맞닿는 부분이 플랫(flat)하게 형성될 수도 있다.If the ion-selective membrane 14 is not formed in a uniform shape, separation and concentration of the sample 20a may not be performed properly due to a minute error occurring in a portion in contact with the microchannel 12. Thus, the most ideal type of ion selective membrane 14 may be circular in shape, but when the number of micro channels 12 is not large, the ion selective membrane 14 may be easily matched with the portions contacting each of the micro channels 12. ) May be formed in a polygonal shape, and a portion contacting each of the microchannels 12 may be formed flat.
즉, n개의 마이크로 채널(12) 각각이 일자 모양의 마이크로 채널로 이해될 수 있으며, 나노막의 테두리 면이 각각의 마이크로 채널(12)의 일단과 맞닿아 서로 겹쳐지면서 마이크로 채널 디바이스(10)를 형성할 수 있다. 이는 마이크로 채널 디바이스(10)의 제작과정에서 미세하게 발생하는 오차를 없애 샘플(20a)의 분리 농축이 항상 안정하게 이루어지도록 한다.That is, each of the n microchannels 12 may be understood as a straight microchannel, and the edge surface of the nanomembrane contacts one end of each microchannel 12 to overlap each other to form the microchannel device 10. can do. This eliminates fine errors in the manufacturing process of the micro channel device 10 so that the separation concentration of the sample 20a is always stable.
마이크로 채널(12)의 개수는 분리 농축하고자 하는 샘플(20a)의 용량에 따라 그 개수 및 모양을 다르게 설계할 수 있다. 또, 마이크로 채널 디바이스(10)는 마이크로 채널(12)을 방사형 구조가 아니라 서로 나란하게 배치된 형태로 구성함으로써 마이크로 채널 디바이스(10)의 크기를 방사형 구조 대비 상대적으로 작거나 크게 설계할 수도 있다. 예를 들면, 이온 선택성 멤브레인(14)의 두께를 일정하게 유지할 경우, 각 마이크로 채널(12)의 개수, 길이 및 두께 등을 조절함에 따라 샘플(20a)의 농축량을 제어할 수 있다. 또, 마이크로 채널 디바이스(10)에 인가되는 전압의 크기에 따라 샘플(20a)의 농축량이 제어될 수도 있다.The number of microchannels 12 may be designed differently in number and shape according to the capacity of the sample 20a to be separated and concentrated. In addition, the microchannel device 10 may be designed to be smaller or larger in size than the radial structure by configuring the microchannel 12 in a form arranged in parallel with each other rather than a radial structure. For example, when the thickness of the ion selective membrane 14 is kept constant, the concentration of the sample 20a may be controlled by adjusting the number, length and thickness of each microchannel 12. Further, the concentration of the sample 20a may be controlled according to the magnitude of the voltage applied to the micro channel device 10.
또한, 샘플(20a)의 분리 농축 처리 용량을 극대화하기 위하여, 단층으로 형성된 마이크로 채널 디바이스(10)를 적어도 두 개 이상 적층함으로써 고농도의 샘플(20a)을 대량으로 추출할 수 있다.In addition, in order to maximize the separation concentration processing capacity of the sample 20a, a high concentration of the sample 20a may be extracted by stacking at least two microchannel devices 10 formed in a single layer.
마이크로 채널 디바이스(10)는 전극(16)을 포함할 수 있다. 전극은 n개의 마이크로 채널(12)의 타단에 형성될 수 있다. 전극(16)은 n개의 마이크로 채널(12)이 배치된 형태에 따라 다르게 배치될 수 있으며, 예를 들어, 원형의 이온 선택성 멤브레인(14)과 전극(16)은 이온 선택성 멤브레인(14)의 테두리에 결합된 마이크로 채널(12)들을 따라 방사형으로 서로 이격되어 배치될 수 있다. 만약, 원형의 이온 선택성 멤브레인(14)을 사용하지 않고 플랫(flat)한 다각형 형태의 이온 선택성 멤브레인(14)를 사용함으로써 마이크로 채널(12)들이 서로 나란하게 배치된다면, 전극(16)은 이온 선택성 멤브레인(14)과 소정의 거리만큼 이격되어 배치될 수 있다.The micro channel device 10 may include an electrode 16. The electrodes may be formed at the other ends of the n micro channels 12. The electrode 16 may be arranged differently according to the form in which the n microchannels 12 are disposed. For example, the circular ion-selective membrane 14 and the electrode 16 may be surrounded by the ion-selective membrane 14. Radially spaced apart from each other along the micro-channels 12 coupled to the. If the microchannels 12 are arranged next to each other by using a flat polygonal ion selective membrane 14 instead of a circular ion selective membrane 14, the electrode 16 is ion selective. The membrane 14 may be spaced apart from the membrane 14 by a predetermined distance.
다시 도 1의 (a) 내지 (c)를 참조하면, 본 발명의 일 실시예에 따른 샘플 추출 방법은 n개의 마이크로 채널(12) 및 이온 선택성 멤브레인(14)을 구비한 마이크로 채널 디바이스(10)의 중앙 부분에 샘플(20a)을 포함하는 용액(20)을 파이펫 팁(pipet tip, 18)을 이용하여 공급하는 단계, 마이크로 채널 디바이스(10)에 전압을 인가하여, n개의 마이크로 채널(12)의 일단과 이온 선택성 멤브레인(14)이 연결된 부위에 이온농도분극(ICP;Ion Concentration Polarization) 현상이 발생함으로써 이온공핍영역(ion depletion zone)을 형성하는 단계 및 용액(20)은 상기 이온공핍영역을 기준으로 유체(20b)와 샘플(20a)로 분리되며, 유체(20b)는 n개의 마이크로 채널(12)의 타단을 통해 유출되고, 샘플(20a)은 파이펫 팁(18)을 통해 마이크로 채널 디바이스(10)의 외부로 추출되는 단계를 포함할 수 있다.Referring again to FIGS. 1A through 1C, a sample extraction method according to an embodiment of the present invention includes a microchannel device 10 having n microchannels 12 and an ion selective membrane 14. Supplying a solution 20 containing a sample 20a to a central portion of the pipette tip 18 using a pipette tip, applying a voltage to the microchannel device 10, thereby applying n microchannels 12. Ion Concentration Polarization (ICP) occurs at one end of the cation and the ion selective membrane 14 to form an ion depletion zone, and the solution 20 is the ion depletion region. The fluid 20b is separated into a sample 20a based on the fluid, and the fluid 20b flows out through the other ends of the n microchannels 12, and the sample 20a passes through the pipette tip 18. It may include extracting to the outside of the device 10.
좀 더 구체적으로, 도 1의 (a) 및 (b)를 참조하면, 마이크로 채널 디바이스(10)의 중앙 부분에 파이펫 팁(18)을 접촉시켜 샘플(20a)을 포함하는 용액(20)을 주입할 수 있다. 여기서, 샘플(20a)은 바이오·환경 분야에서 사용될 수 있는 시료로 이해될 수 있다. 용액(20)은 마이크로-나노 크기를 갖는 미립자를 포함할 수 있으며, 극성을 띠는 상기 미립자는 전기장에 의해 유전분극이 일어날 수 있다. 상기 미립자는 이온 선택성 멤브레인(14) 부근에서 자가 응집(self-assembled)되어 모여 있을 수 있다.More specifically, referring to FIGS. 1A and 1B, a pipette tip 18 is brought into contact with a central portion of the microchannel device 10 to obtain a solution 20 including a sample 20a. Can be injected. Here, the sample 20a may be understood as a sample that can be used in the bioenvironment field. The solution 20 may include microparticles having a micro-nano size and the polarized microparticles may be subjected to dielectric polarization by an electric field. The particulates may be self-assembled and collected near the ion selective membrane 14.
또한, 본 발명의 일 실시예에서 이용되는 이온농도분극 현상은 나노막을 갖는 구조 주변에서 관찰되는 전기화학전달 현상 중의 하나이다. 전기 이중층의 두께가 나노막의 크기와 비슷할 때 나노막 내부에서 전기 이중층이 겹침으로써 단일 극성 이온 투과성을 보인다는 것이 이론적으로 알려져 있다. 즉, 대부분의 물질 표면은 액체와 접촉시 고유의 표면전하를 띄게 되는데, 이러한 물질로 마이크로 채널 디바이스(10)를 제작하고 마이크로 채널 디바이스(10)의 내부에 액체를 흘려주면 물질의 표면전하에 의해 반대 이온들이 전기 이중층을 형성한다. 전기 이중층의 두께는 수 나노미터에서 수백 나노미터 정도이고, 나노 크기와 반대 극성의 이온만 통과시키는 선택적 투과성을 가진다.In addition, the ion concentration polarization phenomenon used in one embodiment of the present invention is one of the electrochemical transfer phenomenon observed around the structure having a nano-membrane. It is theoretically known that when the thickness of the electric double layer is similar to the size of the nanomembrane, the polar double layer overlaps inside the nanomembrane and exhibits monopolar ion permeability. That is, most of the surface of the material has its own surface charge when it comes into contact with the liquid. If the microchannel device 10 is made of such a material and the liquid is poured into the microchannel device 10, the surface charge of the material Counter ions form an electrical double layer. The electrical double layer has a thickness of several nanometers to several hundred nanometers, and has a selective permeability to pass only ions of opposite polarity to nano size.
이 때, 마이크로-나노 구조물을 결합시킨 후 상기 구조물의 내부에 액체를 채우고 전압을 걸어주면 선택적 투과성 나노막에 의해 나노막 한쪽에는 이온 공핍층, 반대쪽에는 이온 부유층이 생기는 이온농도분극 현상이 일어난다. 이를 이용하여 n개의 마이크로 채널(12)에 원형의 양이온 선택적 나노막(14)을 결합시켰을 때 이온농도분극 현상에 의해 전위가 높게 걸린 방향으로 음전하를 띤 샘플이 동시에 농축될 수 있다.In this case, when the micro-nano structure is combined and the liquid is filled in the structure and the voltage is applied, an ion concentration polarization phenomenon occurs in which an ion depletion layer is formed at one side of the nanomembrane and an ion floating layer is at the opposite side by a selective permeable nanomembrane. When the circular cation-selective nanomembrane 14 is coupled to the n microchannels 12 using this, negatively charged samples can be simultaneously concentrated in the direction where the potential is high due to the ion concentration polarization phenomenon.
예를 들어, 마이크로-나노 멀티 채널 결합구조를 만든 후, 샘플을 포함하는 용액을 이 마이크로 멀티 채널의 상단에 주입하고, 압력과 전압을 인가하게 되면, 이온농도구배로 인한 이온농도분극 현상이 일어나게 된다. 샘플들은 외부 전기장에 의해 유전분극이 일어나 전하를 띤 입자처럼 행동하게 되고, 이온농도분극 현상으로 생긴 이온 공핍층 가장자리에서 정전기적 힘을 받아 나노막으로부터 밀려나는 힘을 받게 된다.For example, after making a micro-nano multi-channel coupling structure, a solution containing a sample is injected into the top of the micro multi-channel, and a pressure and voltage are applied to cause ion concentration polarization due to ion concentration. do. Samples are subjected to dielectric polarization by an external electric field, behaving like charged particles, and subjected to electrostatic forces at the edge of the ion depletion layer resulting from ion concentration polarization, which are pushed away from the nanomembrane.
즉, 샘플 흐름에 의해 받는 힘 Fdrag=-6πμＵα(Ｕ는 유속, μ는 샘플의 점도 및 α는 입자의 대표반경)과 전기삼투 흐름에 의한 힘 FEOF의 방향에 의해서 샘플을 포함하는 유체가 마이크로 채널로 이동하게 되고, 이온농도분극 현상에 의한 힘 FICP에 의해 샘플이 이온공핍층으로부터 밀려나게 되어 마이크로 채널 디바이스(10)의 중앙 부분에 농축된다. 농축된 샘플들을 별도로 모아주게 되면 고농도의 샘플 시료를 얻을 수 있다.That is, the fluid containing the sample depends on the force F drag = -6πμＵα (Ｕ is the flow rate, μ is the viscosity of the sample and α is the representative radius of the particle) and the force F EOF by the electroosmotic flow. The sample is moved to the microchannel, and the sample is pushed out of the ion depletion layer by the force F ICP due to the ion concentration polarization phenomenon and concentrated in the central portion of the microchannel device 10. By collecting the concentrated samples separately, high concentration sample samples can be obtained.
도 1의 (b) 및 (c)를 참조하면, 샘플을 포함하는 용액이 마이크로 채널 디바이스(10)의 중앙 부분에 유입된 후, 마이크로 채널 디바이스(10)의 중앙 부분에 삽입된 파이펫 팁(18)을 이용하여 압력을 가해주면서 전극(16)에 전압을 인가할 수 있다. 인가된 압력과 전압에 의하여 이온 선택성 멤브레인(14)과 n개의 마이크로 채널(12) 일단이 접하는 분기점과 인접한 부분에 이온농도분극(ICP;Ion Concentration Polarization) 현상이 동시에 발생함으로써 이온공핍영역(ion depletion zone)을 형성할 수 있다. 유입된 용액(20)은 이온공핍영역을 기준으로 유체(20b)와 샘플(20a)로 분리될 수 있다. 상기 분리과정은 전기삼투 흐름에 의한 힘과 이온농도분극 현상에 의한 힘에 의해 샘플(20a)이 이온공핍영역의 경계면에서 밀려날 수 있다.Referring to FIGS. 1B and 1C, after a solution containing a sample enters a central portion of the micro channel device 10, a pipette tip inserted into the central portion of the micro channel device 10 ( 18), a voltage may be applied to the electrode 16 while applying pressure. The ion depletion (ion depletion) occurs by simultaneously applying the ion concentration polarization (ICP) to a portion adjacent to the branching point where the ion selective membrane 14 and the n microchannels 12 are in contact with the applied pressure and voltage. zones). The introduced solution 20 may be separated into the fluid 20b and the sample 20a based on the ion depletion region. In the separation process, the sample 20a may be pushed out from the interface of the ion depletion region by the force of the electroosmotic flow and the force of the ion concentration polarization phenomenon.
한편, 분리된 유체(20b)는 마이크로 채널(12)의 중심부에 바깥쪽으로 유출되고, 샘플(20a)은 이온공핍영역의 경계면에서 전기적 반발력에 의해 밀려나 이온 선택성 멤브레인(14)이 배치된 중앙 부분에 농축될 수 있다. 파이펫 팁(18)을 다시 마이크로 채널 디바이스(10)의 중앙 부분에 접촉시킨 후 압력을 인가하여 농축된 샘플(20a)을 별도의 장치(미도시)로 모을 수 있으며, 농축된 샘플(20a)을 별도로 모아주게 되면 고농도의 샘플 시료를 추출할 수 있다. 여기서, 용액(20)을 마이크로 채널 디바이스(10)에 주입할 때 사용하던 파이펫 팁(18)을 동일하게 사용하여 분리된 샘플(20a)을 추출할 수 있으나, 파이펫 팁(18) 이외에 마이크로 채널 디바이스(10)의 중앙 부분에 형성된 도출부에 압력을 인가하거나 물질을 통과시킬 수 있는 기구를 대체하여 사용할 수도 있다.On the other hand, the separated fluid 20b flows outward to the center of the microchannel 12, and the sample 20a is pushed out by the electric repulsive force at the interface of the ion depletion region to the center portion where the ion selective membrane 14 is disposed. Can be concentrated. The pipette tip 18 may again contact the central portion of the micro channel device 10 and then apply pressure to collect the concentrated sample 20a into a separate device (not shown), and the concentrated sample 20a If collected separately, a high concentration of sample can be extracted. Herein, the separated sample 20a may be extracted using the same pipette tip 18 used to inject the solution 20 into the microchannel device 10, It is also possible to use an alternative to a mechanism that can apply pressure or allow material to pass through the outlet portion formed in the central portion of the channel device 10.
도 1의 (a) 및 도 2를 참조하면, 마이크로 채널 디바이스(10)는 마이크로 채널의 개수에 따라 샘플의 농축량이 제어될 수 있다, 구체적으로, 도 2의 (a)는 마이크로 채널(12)의 개수가 4개인 마이크로 채널 디바이스(10)이며, 도 2의 (b)는 마이크로 채널(12)의 개수가 8개인 마이크로 채널 디바이스(10)이다.Referring to FIGS. 1A and 2, the microchannel device 10 may control the concentration of a sample according to the number of microchannels. Specifically, FIG. 2A illustrates the microchannel 12. 2 is a micro channel device 10 having 4, and FIG. 2B illustrates a micro channel device 10 having 8 micro channels 12.
마이크로 채널 디바이스(10)는 투명 재료를 제 1 기판으로 사용할 수 있다. 예를 들면, 제 1 기판으로 파이렉스, 실리콘 이산화물, 실리콘 질화물, 석영 또는 SU-8 중 하나를 사용할 수 있다. 마이크로 채널 디바이스(10)는 낮은 자가 형광 재료(low-autofluorescent material)로 코팅된다. 또, 상기 제 1 기판 이외에도 제 2 기판을 포함할 수 있다. 제 2 기판은 마이크로 채널 디바이스(10)를 커버하거나 실링(sealing)하기 위해 이용될 수 있다. 제 2 기판은 제 1 기판과 동일한 재료로 이루어질 수 있다. 일부 실시예들에서 사용되는 용액에 따라 제 1 기판과 제 2 기판은 상이한 재료들로 이루어질 수도 있다.The micro channel device 10 may use a transparent material as the first substrate. For example, one of pyrex, silicon dioxide, silicon nitride, quartz or SU-8 may be used as the first substrate. The micro channel device 10 is coated with a low-autofluorescent material. In addition to the first substrate, a second substrate may be included. The second substrate can be used to cover or seal the micro channel device 10. The second substrate may be made of the same material as the first substrate. Depending on the solution used in some embodiments, the first substrate and the second substrate may be made of different materials.
한편, 마이크로 채널 디바이스(10) 제조는 제 1 기판을 제 2 기판에 플라즈마 접합하는 것을 통해 완성할 수 있다. 또, 기판은 마이크로 채널 디바이스(10)의 지지 구조이다. 기판의 적어도 일부분은 실리콘으로 만들어 질 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서, 기판, 디바이스 또는 디바이스의 부분들은 중합체로 만들어질 수 있다. 상기 중합체는 PDMS(polydimethylsiloxane)를 사용할 수 있다. PDMS를 사용할 경우, 친수성(hydrophilic)을 갖도록 산소(O2) 플라즈마 처리될 수 있으나, 경우에 따라서 산소 플라즈마 처리를 생략할 수도 있다.Meanwhile, the manufacture of the micro channel device 10 can be completed by plasma bonding the first substrate to the second substrate. The substrate is a support structure of the micro channel device 10. At least a portion of the substrate may be made of silicon. In one embodiment of the invention, the substrate, device or portions of the device may be made of a polymer. The polymer may be polydimethylsiloxane (PDMS). When PDMS is used, oxygen (O 2 ) plasma may be treated to have hydrophilicity, but oxygen plasma treatment may be omitted in some cases.
또한, 용액(20)이 유입되거나 농축된 샘플(20a)이 유출될 수 있도록 마이크로 채널 디바이스(10)의 중앙부분에 상부로 돌출된 도입부를 포함할 수 있다. n개의 마이크로 채널(12)의 일단에는 전기적으로 접지(GND)되도록 이온 선택성 멤브레인(14)이 배치될 수 있다. 이온 선택성 멤브레인(14)에 의해, 도입부를 통해 유입된 용액 중 전하를 띤 종을 포함하는 샘플(20a)은 이온 선택성 멤브레인(14)이 배치된 중앙 부분에 농축될 수 있고, 전하를 띠지 않는 종을 포함하는 유체(20b)는 n개의 마이크로 채널(12)의 타단으로 배출될 수 있다. 여기서, 이온 선택성 멤브레인(14)은 예를 들어, 나피온(Nafion)을 사용할 수 있다.In addition, the solution 20 may include an introduction portion protruding upward in the central portion of the micro channel device 10 so that the solution 20 may be introduced or the concentrated sample 20a may flow out. One end of the n microchannels 12 may be disposed with an ion selective membrane 14 to be electrically grounded (GND). By ion selective membrane 14, sample 20a comprising charged species in solution introduced through the inlet can be concentrated in the central portion where ion selective membrane 14 is disposed, and the non-charged species The fluid 20b including may be discharged to the other ends of the n micro channels 12. Here, the ion selective membrane 14 may use, for example, Nafion.
또한, 이온 선택성 멤브레인(14)은 전해질에서 이온 전도성과 일치하지 않는 양이온에 대하여 우세하게 거동할 수 있다. 그 결과 이온농도 구배가 이온 선택성 멤브레인(14)의 양쪽에서 생성될 수 있다. 일단 이온농도분극이 양이온 교환 이온 선택성 멤브레인(14) 인근에서 유발되면, 양이온과 음이온의 농도는 모두 접합면의 양극측에서 감소하고 음극측에서 증가한다. 더욱이, 전하를 띠는 입자, 세포, 다른 작은 콜로이드 등 역시 유사하게 이온 결핍 또는 이온 과다 현상을 나타낼 수 있으며, 이러한 현상을 통해 정류 상태의 공핍 영역을 얻는 것이 가능하다. In addition, the ion selective membrane 14 may be predominantly behaving against cations that do not match the ionic conductivity in the electrolyte. As a result, ion concentration gradients can be generated on both sides of the ion selective membrane 14. Once ion concentration polarization is induced near the cation exchange ion selective membrane 14, both the cation and anion concentrations decrease on the anode side and increase on the cathode side of the junction. Moreover, charged particles, cells, other small colloids, and the like, may similarly exhibit ion depletion or ionic hyperplasia, which makes it possible to obtain a depletion region in rectified state.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위해서 상술한 기술적 사상을 적용한 실험예를 설명한다. 다만, 하기의 실험예는 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명이 아래의 실험예에 의해서 한정되는 것은 아니다. Hereinafter, an experimental example to which the above-described technical concept is applied will be described to help understanding of the present invention. However, the following experimental examples are only for helping understanding of the present invention, and the present invention is not limited to the following experimental examples.
본 발명의 실험예에 의한 샘플로서, 원형으로 프린팅 된 나노막에 4개의 다리를 가진 마이크로 채널 결합 구조에 금속 증착 기술을 이용해 원형 전극을 마이크로 채널의 타단 부근에 증착한다. 이후에 파이펫 팁을 이용하여 마이크로 채널 결합 구조의 중앙 부분에 이온이 없는 순수한 물(DI;deionize water) 약 990㎕, 약 100mM의 염화칼륨(KCl) 약 10㎕ 및 알렉사(Alexa) 488 약 2㎕이 혼합된 용액을 주입하고, 마이크로 채널의 중앙에 전압 인가 장치를 이용하여 약 70V, 마이크로 채널의 타단에 있는 원형 전극에 0V를 가하여, 약 10초 및 60초 후 농축 진행한 상태를 형광 현미경의 480nm 파장 대역의 형광 광원으로 촬영했다.As a sample according to the experimental example of the present invention, a circular electrode is deposited on the other end of the microchannel using a metal deposition technique in a microchannel coupling structure having four legs on a circularly printed nanofilm. Later, using a pipette tip, about 990 μl of deionize water (DI), about 10 μl of 100 mM potassium chloride (KCl), and about 2 μl of Alexa 488 in the central portion of the microchannel bonding structure The mixed solution was injected, and a concentration of about 70 V and a circular electrode at the other end of the micro channel using a voltage applying device in the center of the micro channel was concentrated after about 10 and 60 seconds. It photographed with the fluorescent light source of 480 nm wavelength band.
도 3은 본 발명의 일 실시예에 따른 샘플 농축 장치 및 이를 이용하여 농축된 샘플 추출 과정을 관찰한 사진이다.3 is a photograph of a sample concentrating device and a sample extraction process concentrated using the same according to an embodiment of the present invention.
구체적으로, 도 3의 (a)는 원형의 이온 선택성 멤브레인과 4개의 마이크로 채널이 결합된 마이크로 채널 구조체를 현미경으로 관찰한 사진이고, 도 3의 (b)는 마이크로 채널 구조체에 전압을 인가한 후 약 10초 후의 마이크로 채널 구조체에 형광 광원을 가하면서 현미경으로 분석한 사진이며, 도 3의 (c)는 마이크로 채널 구조체에 전압을 인가한 후 약 60초 후의 마이크로 채널 구조체에 형광 광원을 가하면서 현미경으로 분석한 사진이다.Specifically, (a) of FIG. 3 is a microscopic photograph of a microchannel structure in which a circular ion-selective membrane and four microchannels are combined, and (b) of FIG. 3 is a voltage applied to the microchannel structure. The microscopic structure was analyzed by a microscope while applying a fluorescent light source to the microchannel structure after about 10 seconds, Figure 3 (c) is a microscope while applying a fluorescent light source to the microchannel structure after about 60 seconds after applying a voltage to the microchannel structure This is a photograph analyzed.
도 3의 (a) 내지 (c)를 참조하면, 마이크로 채널 구조체에 전압이 인가된 후 시간이 흐름에 따라 이온 선택성 멤브레인과 4개의 마이크로 채널이 결합된 부근에서 형성된 이온공핍영역에 의해 샘플과 유체로 분리되고, 정전기적 반발력에 의해 마이크로 채널 구조체의 중앙 부분으로 농축됨을 확인할 수 있다.Referring to (a) to (c) of FIG. 3, the sample and the fluid are formed by an ion depletion region formed in the vicinity of the ion selective membrane and the four microchannels as time passes after the voltage is applied to the microchannel structure. It can be seen that it is separated into and concentrated to the central portion of the microchannel structure by electrostatic repulsive force.
상술한 바와 같이, 본 발명은 마이크로-나노 채널 결합 시스템을 갖는 PDMS 기반의 저가형 장치를 기반으로 하여 수용액 속의 이온을 고농도로 농축할 수 있다. 마이크로 채널의 개수를 늘림으로써 샘플 처리 용량과 검출감도가 낮은 미세 농축 장치의 단점을 보완하고, 압력과 전압의 조정을 통해 정확도가 낮은 대량 농축 장치의 단점을 보완할 수 있다.As described above, the present invention is based on a low cost device based on PDMS with a micro-nano channel binding system, and can concentrate ions in an aqueous solution to a high concentration. Increasing the number of microchannels compensates for the disadvantages of the microconcentrator with low sample throughput and detection sensitivity, and compensates for the disadvantages of low-accuracy bulk concentrators by adjusting pressure and voltage.
또한, 프린팅을 이용해 나노막의 모양을 자유자재로 바꿈으로써 농축 장치의 농축도를 손쉽게 조절할 수 있으며, 일반적으로 실험실에서 사용되는 파이펫 팁을 이용하게 되므로, 시장 진입성을 크게 할 수 있다.In addition, by changing the shape of the nanomembrane freely using printing, it is easy to adjust the concentration of the concentrating device, and it is possible to use the pipette tip generally used in the laboratory, thereby increasing the market entry.
한편, 혈류 내의 변성 단백질 검사는 질병 진단의 지표로 많이 사용되는데, 혈류 내의 단백질 양이 극미하므로 이를 검출하고 분석하기 위해서 반드시 농축 과정이 필요하다. 또, 중금속도 매우 극미한 양으로도 생체 내에 쌓이면 치명적인 작용을 할 수 있기 때문에 중금속 검출시 고농도로 농축시켜 검사하는 것이 중요하며, 중금속 검출과 같이, 인간이 섭취하는 식품 내의 미세한 중금속 등의 유해물질을 검출하는 분야 및 일반적인 바이오 시스템은 샘플의 양이 매우 적기 때문에 이의 농도를 극대화시켜 검출하거나 실험을 진행할 필요가 있는 분야, 약물검사 분야 등에 본 발명의 실시예들에 의한 샘플 농축 장치 및 이를 이용하여 농축된 샘플 추출 방법이 응용될 수 있다.On the other hand, the denatured protein test in the blood flow is widely used as an indicator of the diagnosis of the disease, the amount of protein in the blood flow is very small, so the concentration process is necessary to detect and analyze it. In addition, heavy metals can have a deadly effect when accumulated in a very small amount in a living body, so it is important to concentrate them at a high concentration when detecting heavy metals, and to detect harmful substances such as fine heavy metals in foods that humans consume such as heavy metals detection. In the field of detecting and the general bio-system is very small amount of the sample, the concentration of the sample concentration device according to the embodiments of the present invention, and the like, the field that needs to detect or maximize the concentration or the experiment to maximize the concentration thereof Concentrated sample extraction methods can be applied.
본 발명은 도면에 도시된 일 실시예를 참고로 설명되었으나 이는 예시적인 것에 불과하며, 당해 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 이로부터 다양한 변형 및 균등한 다른 실시예가 가능하다는 점을 이해할 것이다. 따라서 본 발명의 진정한 기술적 보호 범위는 첨부된 특허청구범위의 기술적 사상에 의하여 정해져야 할 것이다.Although the present invention has been described with reference to one embodiment shown in the drawings, this is merely exemplary, and those skilled in the art will understand that various modifications and equivalent other embodiments are possible therefrom. Therefore, the true technical protection scope of the present invention will be defined by the technical spirit of the appended claims.

Claims (8)

  1. 이온농도분극(ICP;Ion Concentration Polarization) 현상에 의해 이온공핍영역(ion depletion zone)을 형성할 수 있도록, n개의 마이크로 채널 일단에 연결되는 이온 선택성 멤브레인(ion-selective membrane);An ion-selective membrane connected to one end of n microchannels so as to form an ion depletion zone by an ion concentration polarization (ICP) phenomenon;
    상기 n개의 마이크로 채널 타단에 형성되어 전압을 인가할 수 있는 전극; 및Electrodes formed at the other ends of the n microchannels to apply a voltage; And
    상기 이온 선택성 멤브레인의 중앙 부분에 접촉이 가능하며, 샘플을 포함하는 용액이 유입되거나 상기 샘플이 유출될 수 있는 파이펫 팁(pipet tip);A pipette tip capable of contacting a central portion of the ion-selective membrane, into which a solution containing a sample may be introduced, or into which the sample may flow out;
    을 포함하고,Including,
    상기 파이펫 팁을 통해 상기 이온 선택성 멤브레인의 중앙 부분에 주입된 상기 용액에 전압을 인가함으로써 발생되는 상기 이온농도분극 현상에 의하여 상기 용액은 유체 및 상기 샘플로 분리되고, 분리된 상기 유체는 상기 n개의 마이크로 채널 타단으로 유출되며, 상기 샘플은 상기 이온 선택성 멤브레인의 중앙 부분에 농축되어 파이펫 팁을 통해서 외부로 추출되는,The solution is separated into a fluid and the sample by the ion concentration polarization phenomenon generated by applying a voltage to the solution injected into the central portion of the ion selective membrane through the pipette tip, and the separated fluid is n Out of the other two microchannels, the sample is concentrated in a central portion of the ion-selective membrane and extracted outside through a pipette tip,
    샘플 농축 장치.Sample concentrator.
  2. 제 1 항에 있어서,The method of claim 1,
    상기 이온 선택성 멤브레인은 원형 또는 다각형 형상으로 프린팅 된 나노막을 포함하는,The ion selective membrane comprises a nano-membrane printed in a circular or polygonal shape,
    샘플 농축 장치.Sample concentrator.
  3. 제 1 항에 있어서,The method of claim 1,
    상기 이온 선택성 멤브레인과 상기 전극은 방사형으로 서로 이격되어 배치된 것인,Wherein the ion selective membrane and the electrode are radially spaced apart from each other,
    샘플 농축 장치.Sample concentrator.
  4. n개의 마이크로 채널 및 이온 선택성 멤브레인(ion-selective membrane)을 구비한 마이크로 채널 디바이스의 중앙 부분에 샘플을 포함하는 용액을 파이펫 팁(pipet tip)을 이용하여 공급하는 단계;supplying a solution comprising a sample to a central portion of a microchannel device having n microchannels and an ion-selective membrane using a pipet tip;
    상기 마이크로 채널 디바이스에 전압을 인가하여, 상기 n개의 마이크로 채널 일단과 상기 이온 선택성 멤브레인이 연결된 부위에 이온농도분극(ICP;Ion Concentration Polarization) 현상이 발생함으로써 이온공핍영역(ion depletion zone)을 형성하는 단계; 및By applying a voltage to the microchannel device, an ion concentration polarization (ICP) phenomenon occurs at one end of the n microchannels and the ion selective membrane to form an ion depletion zone. step; And
    상기 용액은 상기 이온공핍영역을 기준으로 유체와 상기 샘플로 분리되며, 상기 유체는 상기 n개의 마이크로 채널 타단을 통해 유출되고, 상기 샘플은 상기 파이펫 팁을 통해 상기 마이크로 채널 디바이스의 외부로 추출되는 단계;The solution is separated into a fluid and the sample based on the ion depletion region, the fluid flows out through the n microchannel other ends, and the sample is extracted to the outside of the microchannel device through the pipette tip. step;
    를 포함하는,Including,
    샘플 추출 방법.Sample extraction method.
  5. 제 4 항에 있어서,The method of claim 4, wherein
    상기 용액은 마이크로-나노 크기를 갖는 미립자이며, 극성을 띠는 상기 미립자는 전기장에 의해 유전분극이 일어날 수 있는,The solution is micro-nano sized microparticles, and the polarized microparticles can be subjected to dielectric polarization by an electric field,
    샘플 추출 방법.Sample extraction method.
  6. 제 4 항에 있어서,The method of claim 4, wherein
    상기 용액은 전기삼투 흐름에 의한 힘과 상기 이온농도분극 현상에 의한 힘에 의해 상기 유체와 상기 샘플로 분리되는 것인,The solution is separated into the fluid and the sample by the force of the electroosmotic flow and the force of the ion concentration polarization phenomenon,
    샘플 추출 방법.Sample extraction method.
  7. 제 4 항에 있어서,The method of claim 4, wherein
    상기 파이펫 팁에 압력 변화에 따라 상기 용액이 상기 마이크로 채널 디바이스의 중앙 부분에 공급되거나 상기 이온농도분극 현상에 의해 분리된 상기 샘플이 추출되는 것인,Wherein the sample is supplied to the central portion of the microchannel device or the sample separated by the ion concentration polarization is extracted according to the pressure change on the pipette tip,
    샘플 추출 방법.Sample extraction method.
  8. 제 4 항에 있어서,The method of claim 4, wherein
    상기 샘플이 상기 마이크로 채널 디바이스의 외부로 추출되는 단계는,Extracting the sample to the outside of the micro channel device,
    상기 파이펫 팁을 통해 추출되는 상기 샘플을 별도의 장치에서 모아주는 단계를 포함하는,Collecting the sample extracted through the pipette tip in a separate device;
    샘플 추출 방법.Sample extraction method.
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Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200074832A (en) * 2018-12-17 2020-06-25 광운대학교 산학협력단 Sample Concentration and Separation Device by Controlling Speed and Position of Sample in Microchannel

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US10669572B2 (en) 2017-05-31 2020-06-02 University Of Notre Dame Du Lac Ultra-sensitive multi-target lateral flow molecular assay with field-induced precipitation
KR102140371B1 (en) * 2017-11-20 2020-07-31 주식회사 엘지화학 A device and method for qualitative and quantitative analysis of heavy metals using a rotary disc system
KR102318717B1 (en) * 2019-10-11 2021-10-29 주식회사 페라메드 Cell separation device and method for separating cell using the same
KR102556347B1 (en) * 2021-06-17 2023-07-14 광운대학교 산학협력단 Lateral flow assay that is ph stable and concentrates and detect samples using ionic concentration polarization

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090027671A (en) * 2006-05-29 2009-03-17 키아겐 게엠베하 Device for mounting pipette tips, pipette tip, and pipetting device
KR20100118098A (en) * 2010-10-18 2010-11-04 인비트로겐 싱가포르 피티이. 엘티디. Pipette tip for electroporation device
KR20110033866A (en) * 2008-07-22 2011-03-31 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 Amplified electrokinetic fluid pumping switching and desalting
KR20120117453A (en) * 2011-04-15 2012-10-24 울산대학교 산학협력단 Micropipette
KR20140123454A (en) * 2013-04-12 2014-10-22 에펜도르프 아게 Device for providing pipette tips

Family Cites Families (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR101511569B1 (en) 2013-11-14 2015-04-14 포항공과대학교 산학협력단 Particle separation apparatus
KR101523174B1 (en) 2014-05-23 2015-05-27 주식회사 포스코 Device for concentrating ion and concentrating method of ion using the same

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20090027671A (en) * 2006-05-29 2009-03-17 키아겐 게엠베하 Device for mounting pipette tips, pipette tip, and pipetting device
KR20110033866A (en) * 2008-07-22 2011-03-31 메사추세츠 인스티튜트 오브 테크놀로지 Amplified electrokinetic fluid pumping switching and desalting
KR20100118098A (en) * 2010-10-18 2010-11-04 인비트로겐 싱가포르 피티이. 엘티디. Pipette tip for electroporation device
KR20120117453A (en) * 2011-04-15 2012-10-24 울산대학교 산학협력단 Micropipette
KR20140123454A (en) * 2013-04-12 2014-10-22 에펜도르프 아게 Device for providing pipette tips

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
KR20200074832A (en) * 2018-12-17 2020-06-25 광운대학교 산학협력단 Sample Concentration and Separation Device by Controlling Speed and Position of Sample in Microchannel
KR102207848B1 (en) * 2018-12-17 2021-01-26 광운대학교 산학협력단 Sample Concentration and Separation Device by Controlling Speed and Position of Sample in Microchannel

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