KR20090121310A - 베타-락탐 화합물의 제조 방법 - Google Patents

베타-락탐 화합물의 제조 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 핵, D-페닐글라이신 및 D-다이하이드로-페닐글라이신으로 이루어진 군으로부터 선택된, 측쇄 에스터 형태의 측쇄, 및 상기 핵에 상기 측쇄 에스터를 커플링시키는 것을 촉진시키는 효소로부터의 반합성 β-락탐 화합물의 합성 방법에 관한 것으로서, 상기 측쇄 에스터를 고체 중간체로서 단리하지 않는 것을 특징으로 한다.

Description

베타-락탐 화합물의 제조 방법{PROCESS FOR THE PREPARATION OF BETA-LACTAM COMPOUNDS}
본 발명은 아실화제를 사용한 모(parent) 아미노 β-락탐의 효소적 아실화에 의한 반합성 β-락탐 화합물의 제조 방법에 관한 것이다.
측쇄 산 유도체 예컨대 아미드 또는 에스터를 사용한 모 아미노 β-락탐 잔기의 아실화에 의한 반합성 β-락탐 항생제의 효소적 제조는 특허 문헌 예컨대 EP-A-339751, EP-A-473008, WO92/01061, WO93/12250, WO96/02663, WO96/05318, WO96/23796, WO97/04086, WO98/56946, WO99/20786, WO2005/00367, WO2006/069984, US 3,816,253, 및 독일 특허 문헌 2163792 및 2621618에 널리 기재되어 있다. 당업계에서 사용되는 효소는 대부분의 경우 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)로부터 수득된 페니실린 아실라제이고, 다양한 유형의 수-불용성 물질 상에 부동화된 것이다(예: WO97/04086).
종래 기술 공정의 주된 단점은, 측쇄 에스터를 정제하여 예컨대 에스터의 유리 측쇄의 양을 감소시키기 위해 측쇄 에스터가 고체 형태로 단리되어야 하는 것이 다. 특히 소수성 측쇄 예컨대 D-페닐글라이신 및 D-다이하이드로-페닐글라이신이 많은 경우일수록, 후속 효소 커플링 반응에서의 유리 측쇄의 존재는 효소적 커플링 반응의 수율에 매우 부정적 효과를 미치는 것이 밝혀졌다. 이는, 효소적 커플링 반응의 조건 하에서의 유리 측쇄의 낮은 용해도 때문에 효소적 커플링 반응에서 유리 측쇄의 농도에 상한이 존재하는 사실에 기인한다. 이러한 한계는, 침전물이 효소적 커플링 반응의 가공성에 부정적 영향을 주기 때문에 유리 측쇄가 결정화 또는 침전되어서는 안된다는 요건에 의해 결정된다. 더욱이, 반합성 β-락탐 화합물의 다운스트림 가공의 최종 단계에서, 오염성(contaminating) 유리 측쇄는 예컨대 반합성 β-락탐 화합물의 최종 결정화 단계의 모액과 함께 제거되어야 한다. 보다 높은 수준의 유리 측쇄에서는, 유리 측쇄 제거에 보다 많은 모액이 필요하게 되고, 이는 이후에 반합성 β-락탐 화합물의 손실이 보다 높아지는 원인이 된다. 고체 형태의 측쇄 에스터의 단리를 초래하는 단위 조작은 반합성 항생제의 제조 공정을 복잡하게 하고, 이의 비용을 크게 증가시킨다.
그러므로, 에스터화 반응 동안 형성된 측쇄 에스터가 고체 형태로 단리되지 않고 후속 효소 커플링 반응에 사용될 수 있는 제조 방법에 대한 급박한 요구가 존재한다.
WO98/04732는 실시예 1, 3 및 4에서 7-PACA, 7-ADCA 및 6-APA과 D-4-하이드록시-페닐글라이신의 2-하이드록시에틸에스터로부터 각각 세프프로질, 세파드록실 및 아목시실린을 합성하되, 합성 후에 에스터를 후속 효소적 커플링 반응에 직접 첨가하고, 고체 형태로 단리하는 것을 개시한다. D-4-하이드록시-페닐글라이신은 효소적 커플링 반응 조건 하에서 매우 우수한 용해도를 가지므로, D-페닐글라이신 및 D-다이하이드로-페닐글라이신에서 직면하는 것과 같은 효소적 커플링 반응 동안의 문제를 발생시키지 않는다. 침전을 피하기 위해, 이들은 이들의 낮은 용해도 때문에 매우 낮은 농도로만 존재할 수도 있다.
본 발명의 목적은 D-페닐글라이신 및 D-다이하이드로-페닐글라이신의 β-락탐 유도체 예컨대 암피실린, 세팔렉신, 세파클로르 및 세프라딘의 제조 방법을 제공하는 것으로서, 여기서 상기 측쇄 에스터의 합성은 높은 수율을 특징으로 하고, 생성된 측쇄 에스터는 단지 낮은 농도의 유리 측쇄만을 함유하고, 상기 측쇄 에스터의 정제를 위한 고체 형태의 측쇄 에스터의 단리가 생략된다.
본원에서 "핵(nucleus)"은 반합성 β-락탐의 β-락탐 잔기로서 정의되고, 임의의 페넴(penem) 또는 세펨(cephem) 예컨대 6-아미노페니실란산(6-APA), 7-아미노데아세톡시-세팔로스포란산(7-ADCA), 7-아미노세팔로스포란산(7-ACA) 또는 7-아미노-3-클로로-3-세펨-4-카복실레이트(7-ACCA)일 수 있다.
본원에서 "측쇄"는 반합성 β-락탐 화합물에서 본원에서 정의된 핵의 6-아미노 또는 7-아미노 위치에 결합되는 잔기로서, 예컨대 암피실린, 세팔렉신, 세파클로르에서의 D-페닐글라이신, 또는 세프라딘에서의 D-다이하이드로-페닐글라이신이다.
"유리 측쇄(free side chain)"는 비유도체화된 형태의 측쇄로서, 예컨대 D-페닐글라이신 또는 D-다이하이드로-페닐글라이신이다.
"측쇄 에스터"는 유리 측쇄의 에스터 형태로서, 유리 측쇄의 카복실 기가 알콜로 에스터화되어 있으며, 예컨대 D-페닐글라이신 메틸 에스터 또는 D-다이하이드로-페닐글라이신 메틸 에스터이다. 측쇄 에스터는 유리 염기의 형태로 또는 염 예컨대 HCl-염으로서 존재할 수 있고, 측쇄 에스터는 고체 형태로 또는 적합한 용매에 용해되어 존재할 수 있다.
본원에서 "비(ratio)"는 하기와 같이 정의된다:
[측쇄 에스터의 양]/{[측쇄 에스터의 양]+[유리 측쇄의 양]}
상기 식에서 양은 몰로 표시된다.
한 양태에서, 본 발명은 핵, D-페닐글라이신 및 D-다이하이드로-페닐글라이신으로 이루어진 군으로부터 선택된, 측쇄 에스터 형태의 측쇄, 및 상기 핵에 상기 측쇄 에스터를 커플링시키는 것을 촉진시키는(catalyzing) 효소로부터의 반합성 β-락탐 화합물의 합성 방법으로서, 이는 상기 측쇄 에스터를 고체 중간체로서 단리하지 않는 것을 특징으로 한다. 상기 방법은 예컨대 하기와 같은 단계들을 포함할 수 있다:
(a) 알콜을 사용하여 D-페닐글라이신 및 D-다이하이드로-페닐글라이신으로 이루어진 군으로부터 선택된 유리 측쇄를 전환시켜 상응하는 측쇄 에스터를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계(이 단계에서에 측쇄 에스터의 형성은, 바람직하게는 상기에서 정의된 "비"에 의해 표시되는 전환률을 갖는 혼합물을 생성하되, 이때 상기 비는 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 96% 이상, 보다 바람직하게는 97% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상이다); 및
(b) 상기 단계 (a)에서 수득된 혼합물을 핵 및 효소와 혼합시켜 반합성 β-락탐을 형성함에 의해 반합성 β-락탐을 형성하되, 이때 단계 (a)에서 형성된 측쇄 에스터를 고체 중간체로서 단리하지 않는 단계.
본 발명의 방법에서 사용되고 상기에 정의된 핵은 6-아미노페니실란산(6-APA), 7-아미노데아세톡시-세팔로스포란산(7-ADCA), 7-아미노세팔로스포란산(7-ACA) 또는 7-아미노-3-클로로-3-세펨-4-카복실레이트(7-ACCA)로 이루어진 군으로부터 선택되어 각각 반합성 페니실린(6-APA의 유도체) 및 반합성 세팔로스포린(7-ADCA, 7-ACA 및 7-ACCA의 유도체)을 제공할 수 있다. 본 발명의 바람직한 실시양태는 암피실린, 세팔렉신, 세프라딘 및 세파클로르로 이루어진 군으로부터 선택된 반합성 β-락탐 화합물의 제조 방법이다.
본 발명의 방법의 전환 단계(단계 (a))에서, D-페닐글라이신 및 D-다이하이드로-페닐글라이신으로 이루어진 군으로부터 선택된 유리 측쇄는 알콜에 의해 전환되어 상응하는 측쇄 에스터를 포함하는 혼합물을 형성한다. 본 발명의 방법에서 사용되는 알콜은 메탄올 및 에탄올로 이루어진 군으로부터 선택되어, 각각 측쇄의 메틸 에스터 및 에틸 에스터를 형성할 수 있다. 가장 바람직한 알콜은 메탄올이다. 단계 (a)는 여러 가지 방식으로 실시될 수 있다.
전환 단계 (a)의 한 실시양태는 D-페닐글라이신 및 D-다이하이드로-페닐글라이신으로 이루어진 군으로부터 선택된 유리 측쇄, 형성되는 목적 에스터를 기준으로 선택된 알콜(예컨대 메틸 에스터를 수득하기 위한 메탄올, 또는 에틸 에스터를 수득하기 위한 에탄올), 및 강산 예컨대 황산을 포함하는 혼합물을 환류 하에 20 내지 120℃, 보다 바람직하게는 40 내지 100℃의 온도에서 가열하는 것을 포함한다. 알콜로서 메탄올을 사용하는 경우, 상기 온도는 바람직하게는 60 내지 80℃이다. 알콜로서 에탄올을 사용하는 경우, 상기 온도는 바람직하게는 65 내지 100℃이다. 적합한 조건은 EP-A-0544205에 개시된 비교예 1 및 2에서 찾을 수 있다.
전환 단계 (a)의 다른 실시양태는 종래의 실시양태의 개선점을 포함하고, 반응물로부터 알콜 및 물을 증류시켜 내면서 반응 혼합물에 알콜을 액체 또는 기체로서 첨가하는 것을 포함한다(예를 들면 EP-A-0544205에 기재된 바와 같음).
측쇄의 메틸 에스터를 포함하는 혼합물을 생성하는 전환 단계 (a)의 매우 바람직한 실시양태는 하기 단계들을 포함한다:
1. D-페닐글라이신 및 D-다이하이드로-페닐글라이신으로 이루어진 군으로부터 선택된 유리 측쇄, 메탄올 및 강산 예컨대 황산을 포함하는 반응 혼합물을 특정 시간 예컨대 0.5 내지 5시간, 바람직하게는 1시간 내지 3시간, 보다 바람직하게는 1.5 내지 2.5시간 동안 20 내지 120℃, 보다 바람직하게는 20 내지 100℃, 보다 바람직하게는 40 내지 100℃, 가장 바람직하게는 60 내지 80℃에서 환류시키는 단계; 이어서
2. 상기 혼합물을 40 내지 100℃, 바람직하게는 60 내지 90℃, 보다 바람직하게는 70 내지 80℃의 온도에서 농축시키는 단계. 이 단계 동안의 압력은 초기에는 대기압일 수 있고, 농축 단계 동안에는 바람직하게는 50 mbar 이하, 보다 바람직하게는 40 mbar 이하, 보다 바람직하게는 30 mbar 이하, 가장 바람직하게는 20 mbar 이하로 감소될 수 있다. 농축 단계는, 농축 단계 이전에 존재하는 물의 30% 초과량, 바람직하게는 40% 초과량, 바람직하게는 50% 초과량, 바람직하게는 70% 초과량, 바람직하게는 80% 초과량, 가장 바람직하게는 90% 초과량이 제거될 때까지 계속된다.
3. 메탄올을, 바람직하게는 농축 단계 이전의 반응 혼합물의 초기 부피를 수득하기 위한 양 또는 반응 혼합물의 초기 부피보다 적은 양, 예컨대 반응 혼합물의 초기 부피의 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하 또는 20% 이하의 양으로 첨가하는 단계. 첨가되는 메탄올의 양은 또한 반응 혼합물의 초기 부피보다 클 수도 있다.
4. 임의적으로 상기 단계 1 내지 3을 1회 이상, 바람직하게는 1회 이상, 바람직하게는 2회, 보다 바람직하게는 3회, 보다 바람직하게는 4회, 보다 바람직하게는 5회, 보다 바람직하게는 6회, 보다 바람직하게는 7회, 보다 바람직하게는 8회, 보다 바람직하게는 9회, 보다 바람직하게는 10회 반복하는 단계. 이들 단계들을 반복함에 의해 상기 정의된 메틸 에스터 형성의 "비"는 크게 증가함을 밝혀내었다. 예컨대, 단계 (a) 내지 (c)를 단 1회 수행한 후, 75 내지 85%의 "비"가 수득될 수 있고, 단계 (a) 내지 (c)를 1회 수행한 후, 85 내지 95%의 "비"가 수득될 수 있고, 단계 (a) 내지 (c)를 2회 수행한 후, 95 내지 97%의 "비"가 수득될 수 있고, 단계 (a) 내지 (c)를 3회 수행한 후, 97 내지 98%의 "비"가 수득될 수 있고, 단계 (a) 내지 (c)를 4회 수행한 후, 98 내지 99%의 "비"가 수득될 수 있고, 단계 (a) 내지 (c)를 5회 수행한 후, 99 내지 99.5%의 "비"가 수득될 수 있고, 단계 (a) 내지 (c)를 5회 초과로 수행한 후, 99.5% 초과의 "비"가 수득될 수 있다.
측쇄의 에틸 에스터를 포함하는 혼합물을 생성하는 전환 단계 (a)의 매우 바람직한 실시양태는 하기 단계들을 포함한다:
1. D-페닐글라이신 및 D-다이하이드로-페닐글라이신으로 이루어진 군으로부터 선택된 유리 측쇄, 에탄올 및 강산 예컨대 황산을 포함하는 반응 혼합물을 특정 시간 예컨대 0.5 내지 5시간, 바람직하게는 1시간 내지 3시간, 보다 바람직하게는 1.5 내지 2.5시간 동안 20 내지 120℃, 보다 바람직하게는 20 내지 100℃, 보다 바람직하게는 40 내지 100℃, 가장 바람직하게는 65 내지 100℃에서 환류시키는 단계; 이어서
2. 상기 혼합물을 40 내지 100℃, 바람직하게는 60 내지 90℃, 보다 바람직하게는 70 내지 80℃의 온도에서 농축시키는 단계. 이 단계 동안의 압력은 초기에는 대기압일 수 있고, 농축 단계 동안에는 바람직하게는 50 mbar 이하, 보다 바람직하게는 40 mbar 이하, 보다 바람직하게는 30 mbar 이하, 가장 바람직하게는 20 mbar 이하로 감소될 수 있다. 농축 단계는, 농축 단계 이전에 존재하는 물의 30% 초과량, 바람직하게는 40% 초과량, 바람직하게는 50% 초과량, 바람직하게는 70% 초과량, 바람직하게는 80% 초과량, 가장 바람직하게는 90% 초과량이 제거될 때까지 계속된다.
3. 에탄올을, 바람직하게는 농축 단계 이전의 반응 혼합물의 초기 부피를 수득하기 위한 양 또는 반응 혼합물의 초기 부피보다 적은 양, 예컨대 반응 혼합물의 초기 부피의 90% 이하, 80% 이하, 70% 이하, 60% 이하, 50% 이하, 40% 이하, 30% 이하 또는 20% 이하의 양으로 첨가하는 단계. 첨가되는 에탄올의 양은 또한 반응 혼합물의 초기 부피보다 클 수도 있다.
4. 임의적으로 상기 단계 1 내지 3을 1회 이상, 바람직하게는 1회 이상, 바람직하게는 2회, 보다 바람직하게는 3회, 보다 바람직하게는 4회, 보다 바람직하게는 5회, 보다 바람직하게는 6회, 보다 바람직하게는 7회, 보다 바람직하게는 8회, 보다 바람직하게는 9회, 보다 바람직하게는 10회 반복하는 단계. 이들 단계들을 반복함에 의해 상기 정의된 메틸 에스터 형성의 "비"는 크게 증가함음을 밝혀내었다. 예컨대, 단계 (a) 내지 (c)를 단 1회 수행한 후, 75 내지 85%의 "비"가 수득될 수 있고, 단계 (a) 내지 (c)를 1회 수행한 후, 85 내지 95%의 "비"가 수득될 수 있고, 단계 (a) 내지 (c)를 2회 수행한 후, 95 내지 97%의 "비"가 수득될 수 있고, 단계 (a) 내지 (c)를 3회 수행한 후, 97 내지 98%의 "비"가 수득될 수 있고, 단계 (a) 내지 (c)를 4회 수행한 후, 98 내지 99%의 "비"가 수득될 수 있고, 단계 (a) 내지 (c)를 5회 수행한 후, 99 내지 99.5%의 "비"가 수득될 수 있고, 단계 (a) 내지 (c)를 5회 초과로 수행한 후, 99.5% 초과의 "비"가 수득될 수 있다.
단계 (a)의 모든 실시양태에서, 바람직하게는 3 내지 25, 보다 바람직하게는 5 내지 25, 가장 바람직하게는 6 내지 10의, 유리 측쇄에 대한 알콜의 몰 비가 사용된다. 또한, 단계 (a)의 모든 실시양태에서, 바람직하게는 0.9 내지 10, 보다 바람직하게는 1 내지 5, 가장 바람직하게는 2 내지 3의, 유리 측쇄에 대한 강산의 몰 비(당량으로, 예컨대 1몰의 염산은 1당량이고, 1몰의 황산은 2당량이다)가 사용된다. 당업자는 과도한 실험 없이 선택된 측쇄 및 알콜에 따라 반응 조건을 최적화시킬 수 있을 것이다.
단계 (b)에서 반합성 β-락탐 화합물을 형성하기 이전에, 단계 (a)에서 수득된 혼합물은 상기 정의된 바와 같은 높은 "비"를 갖는 혼합물을 수득하기 위해 정제될 수 있다. 본 발명의 방법의 단계 (b)에서 사용되는 혼합물의 비는 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 96% 이상, 보다 바람직하게는 97% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상이다.
정제 단계의 한 실시양태는 측쇄 에스터로부터 유리 측쇄의 침전 및 제거를 포함한다. 이는 단계 (a)에서 수득된 혼합물의 pH를 적합한 염기 예컨대 NaOH, 암모니아 또는 KOH를 첨가하여 2 내지 6.5, 바람직하게는 2.5 내지 5, 가장 바람직하게는 3 내지 4로 조정함에 의해 성취될 수 있다. 다른 실시양태에서, 단계 (a)에서 수득된 반응 혼합물은 적합한 양의 물, 알콜 또는 물과 알콜의 혼합물에 첨가될 수 있고, 이어서 적합한 염기 예컨대 NaOH, 암모니아 또는 KOH를 첨가하여 pH 2 내지 6.5, 바람직하게는 pH 2.5 내지 5, 가장 바람직하게는 pH 3 내지 4로 조정한다. pH를 목적하는 값으로 조정한 후, pH는 적합한 염기를 첨가함에 의해 상기 목적하는 값에서 pH를 유지할 수 있다. 이러한 조건 하에, 유리 측쇄를 포함하는 침전물이 형성될 수 있다. 적합한 시간 후에, 상기 침전물은 공지의 방법을 이용하여 여과해낼 수 있다. 여액은 측쇄 에스터를 포함한다. 본 발명의 방법의 단계 (b)에서 직접 사용되도록 하기 위해, 여액은 pH 1 내지 6, 바람직하게는 pH 1 내지 4, 가장 바람직하게는 pH 1.5 내지 3이 되게 하고, 그 후 알콜을 공지의 방법을 이용하여 증발에 의해 제거한다.
정제 단계의 다른 실시양태는 측쇄 에스터 유도체와 소량의 유리 측쇄를 함유하는 유기 상, 및 유리 측쇄와 임의적으로 염을 함유하는 수성 상을 포함하는 이상(two phase) 또는 다상 계의 형성을 포함한다. 이는 단계 (a)에서 수득된 혼합물의 pH를 적합한 염기 예컨대 NaOH, 암모니아 또는 KOH를 첨가하여 7.5 내지 10, 바람직하게는 8.5 내지 9.5, 가장 바람직하게는 8.8 내지 9.2의 값으로 조정함에 의해 성취될 수 있다. 다른 실시양태에서, 단계 (a)에서 수득된 반응 혼합물은 적합한 양의 물, 알콜 또는 물과 알콜의 혼합물에 첨가될 수 있고, 이어서 적합한 염기 예컨대 NaOH, 암모니아 또는 KOH를 첨가하여 pH 7.5 내지 10, 바람직하게는 pH 8.5 내지 9.5, 가장 바람직하게는 pH 8.8 내지 9.2로 조정한다. pH를 목적하는 값으로 조정한 후, pH는 적합한 염기를 첨가함에 의해 상기 목적하는 값에서 pH를 유지할 수 있다. 임의적으로, 물은 수성 염(예: NaCl) 용액의 형태로 존재할 수 있다. 유리 측쇄는 또한 침전물을 형성할 수 있다. 상기 다상 계의 다양한 상들은 공지의 기법을 이용하여 분리될 수 있다. 임의적으로 유기 상은 물 또는 수성 염 용액으로 세척될 수 있다. 세척액의 수 상은 수율의 손실을 방지하기 위해 적합한 공정 스트림으로 재순환될 수 있다. 이러한 공정 스트림은 단계 (a) 이후 또는 전술된 pH 조정 이후에 수득된 반응 혼합물일 수 있다.
정제 단계의 매우 바람직한 실시양태는 상기 두 가지의 실시양태를 조합하는 것으로서, 즉 먼저 단계 (a)에서 수득된 혼합물의 pH를 2 내지 6.5, 바람직하게는 2.5 내지 5, 가장 바람직하게는 3 내지 4로 조정하고, 형성된 침전물을 여과해내고, 이어서 수득된 여액의 pH를 7.5 내지 10, 바람직하게는 8.5 내지 9.5, 가장 바람직하게는 8.8 내지 9.2로 조정하고, 공지의 기법을 이용하여 수득된 다상 계의 다양한 상들을 분리시킨다.
다상 계가 pH 7.5 내지 10, 바람직하게는 pH 8.5 내지 9.5, 가장 바람직하게는 pH 8.8 내지 9.2에서 형성되는 상기 두 가지의 실시양태는 유리 염기 형태의 에스터 바람직하게는 D-페닐글라이신-메틸에스터, D-페닐글라이신-에틸에스터, D-다이하이드로-페닐글라이신-메틸에스터 및 D-다이하이드로-페닐글라이신-에틸에스터로 이루어진 군으로부터 선택된 에스터를 수득할 수 있으며, 이때 상기 에스터는 하기와 같은 성질을 갖는다:
· 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 e.e.(거울상이성질체적 과량(enantiomeric excess));
· 바람직하게는 20 몰% 이하, 보다 바람직하게는 10 몰% 이하, 보다 바람직하게는 5 몰% 이하, 보다 바람직하게는 2 몰% 이하, 가장 바람직하게는 1 몰% 이하의 염 함량(에스터의 몰에 대한 염의 몰로서 표시됨); 및
· 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 96% 이상, 보다 바람직하게는 97% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 본원에 정의된 "비".
본 발명의 방법의 단계 (b)에서, 단계 (a)에서 수득되고 임의적으로는 상기 기재된 바와 같이 정제된 혼합물을 핵과 적합한 효소, 바람직하게는 부동화된 효소와 혼합시켜 상응하는 반합성 β-락탐 화합물을 형성함으로써, 반합성 β-락탐 화합물을 형성하되, 이때 단계 (a)에서 형성되고 임의적으로 정제된 측쇄 에스터는 고체 중간체로서 단리되지 않는다. 단계 (b)는 당업계에 공지되고 본원에 인용된 임의의 공정에 따라 실시될 수 있다. 예컨대, 암피실린의 합성은 EP-A-339751 또는 WO98/56946에 기재된 바와 같이 실시될 수 있다. 마찬가지로, 세팔렉신의 합성은 WO96/23796에 기재된 바와 같이 실시될 수 있다. 세프라딘의 합성은 WO2005/003367에 기재된 바와 같이 실시될 수 있고, 세파클로르의 합성은 WO2006/069984에 기재된 바와 같이 실시될 수 있다.
효소적 커플링 이후, 반합성 베타-락탐 항생제는 공지의 방법을 이용하여 회수될 수 있다. 예컨대, 효소 반응기는 상향 교반(upward stirring)을 이용하는 바닥 체(sieve)를 통해 배출될 수 있다. 생성된 반합성 베타-락탐 항생제 현탁액은 이후 유리 필터(glass filter)를 통해 여과될 수 있다.
효소적 커플링 반응 후에 유리 측쇄가 소량으로 존재하기 때문에, 최종 반합성 베타-락탐 항생제의 결정화는 베타-락탐 항생제가 고 농도로 수행될 수 있으며, 이는 높은 수율을 가져온다.
제 2 양태에서, 본 발명은 유리 염기 형태의 에스터, 바람직하게는 D-페닐글라이신-메틸에스터, D-페닐글라이신-에틸에스터, D-다이하이드로-페닐글라이신-메틸에스터 및 D-다이하이드로-페닐글라이신-에틸에스터로 이루어진 군으로부터 선택된 에스터를 제공하고, 이때 상기 에스터는 하기와 같은 성질을 갖는다:
· 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 바람직하게는 96% 이상, 바람직하게는 97% 이상, 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 e.e.(거울상이성질체적 과량);
· 바람직하게는 20 몰% 이하, 보다 바람직하게는 10 몰% 이하, 보다 바람직하게는 5 몰% 이하, 보다 바람직하게는 2 몰% 이하, 가장 바람직하게는 1 몰% 이하의 염 함량(에스터의 몰에 대한 염의 몰로서 표시됨); 및
· 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 96% 이상, 보다 바람직하게는 97% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상의 본원에 정의된 "비".
유리 염기 형태의 에스터가, 열거된 임의의 염 함량 값 및 임의의 "비" 값과 조합하여 열거된 임의의 e.e. 값을 갖는 것으로 제공됨은 당업자에게 명백해질 것이다.
제 3 양태에서, 본 발명은 상기 정의된 성질을 갖는 본 발명의 유리 염기 형태의 에스터의 제조 방법을 제공한다. 상기 방법은 수성 환경에서 측쇄 에스터의 염과 염기를 혼합시킴에 의해 2상 계를 생성하고 상기 수성 상으로부터 유리 염기 형태의 측쇄 에스터를 분리시키는 것을 포함할 수 있다.
상기 측쇄 에스터의 염은 임의의 적합한 염 예컨대 HCl-염일 수 있다. 그 염은 임의적으로 다른 성분(예: 염)을 함유하는 고체 형태이거나 또는 액체 형태 즉 물 또는 다른 적합한 용매중의 용액일 수 있다. 측쇄 에스터의 염과 혼합되는 염기는 임의의 염기, 바람직하게는 강 염기 예컨대 수산화나트륨, 수산화칼륨 또는 암모니아일 수 있다.
형성된 2상 계에서, 유리 염기 형태의 측쇄 에스터를 갖는 유기 상은 유리 측쇄가 바람직하게는 전혀 없거나 단지 매우 낮은 수준으로 함유되고, 즉 본원에 정의된 "비"가 바람직하게는 85% 이상, 보다 바람직하게는 90% 이상, 보다 바람직하게는 95% 이상, 보다 바람직하게는 96% 이상, 보다 바람직하게는 97% 이상, 보다 바람직하게는 98% 이상, 가장 바람직하게는 99% 이상이며, 유리 측쇄 및 임의적으로 염을 함유하는 수성 상은 바람직하게는 측쇄 에스터가 전혀 없거나 단지 매우 낮은 수준으로 함유된다.
상기 2상 계는 전술된 바와 같이 다상 계가 형성되는 정제 단계 하에서 pH 7.5 내지 10, 바람직하게는 pH 8.5 내지 9.5, 가장 바람직하게는 pH 8.8 내지 9.2에서 형성될 수 있다.
상기 다상 계의 다양한 상들은 공지의 기법을 이용하여 분리될 수 있다. 적합한 방법은 다양한 상들 사이의 밀도 차를 이용하는 것들이다. 규모에 따라, 분리는 정상 중력을 사용하여 또는 바람직하게는 원심분리력을 사용하여, 배취 방식(batch mode) 또는 보다 바람직하게는 연속 방식으로 진행될 수 있다. 바람직한 연속 원심분리 공정이 PGM에 대해서 도 1 및 실시예 5에 상세히 기재되어 있다. 이 공정은 유리 염기 형태의 임의의 에스터, 바람직하게는 D-페닐글라이신-메틸에스터, D-페닐글라이신-에틸에스터, D-다이하이드로-페닐글라이신-메틸에스터 및 D-다이하이드로-페닐글라이신-에틸에스터로 이루어진 군으로부터 선택된 에스터에 적용가능하다.
도 1에 대한 설명
A. 실시예 4에 기재된 바와 같이 수득가능한, PGM 용액을 함유하는 용기.
B. 물(724 g/kg 용액)중 NaOH(65 g/kg 용액) 및 NaCl(211 g/kg 용액)의 용액을 함유하는 용기.
C. 교반기, 배플(baffle), 온도계, pH계, PGM 용액 주입구, NaOH/NaCl 용액 주입구 및 반응 혼합물 배출구가 구비된 10 L 유리 용기. 상기 용기는 냉각욕에 위치되어 있다.
D. 원심분리기에 도입 이전에 반응 혼합물의 온도를 30℃로 상승시키는 열 교환기(내부 부피 1 L).
E. 25%(w/w) Na2SO4 용액을 함유하는 용기. 상기 용기의 내용물은 30℃로 가온되었다.
F. 2개의 로바텔 BXP130 추출 원심분리기(액체/액체 추출기, 보울(bowl) 직경 125 mm, 보울 부피 1.4 L, 경질 상 웨이어(light phase weir) 직경 61 mm, 중질 상 웨이어(heavy phase weir) 직경 66 mm). 원심분리기의 주입구 및 배출구는 하기와 같이 연결되었다:
· 원심분리기 1의 경질 상 주입구로 10 L 용기로부터의 반응 혼합물이 도입되었다.
· 원심분리기 2의 중질 상 주입구로 25%(w/w) Na2SO4 용액이 도입되었다.
· 원심분리기 1의 중질 상 배출구는 수용 용기(G)에 연결되었다. 실험 후 내용물은 폐기하였다.
· 원심분리기 1의 경질 상 배출구는 원심분리기 2의 경질 상 주입구에 연결되었다.
· 원심분리기 2의 중질 상 배출구는 원심분리기 1의 중질 상 주입구에 연결되었다.
· 원심분리기 2의 경질 상 배출구는 연동 펌프에 의해 열 교환기를 통해 펌핑되어 이 공정 스트림을 3 내지 5℃로 냉각시켰다.
G. 원심분리기 1로부터 수성 상을 수집하는 수용 용기.
H. 공정 스트림을 3 내지 5℃로 냉각시키는 열 교환기.
I. 3 내지 5℃로 유지되어 PGM(유리 염기)를 수집하는 용기.
도 1에는 하기의 연동 펌프들이 도시되어 있지 않다:
· PGM 용액을 10 L 용기로 펌핑하는 연동 펌프.
· NaOH/NaCl 용액을 10 L 용기로 펌핑하는 연동 펌프. 이 펌프의 유동은 pH계에 의해 제어되었다.
· 반응 혼합물을 열 교환기를 통해 원심분리기로 펌핑하는 연동 펌프.
· 25%(w/w) Na2SO4 용액을 원심분리기로 펌핑하는 연동 펌프.
실시예 1
a) 페닐글라이신-메틸에스터(PGM) 용액의 합성
90 g D-페닐글라이신을 170 ml 메탄올에 현탁시키고, 73.2 g 농축 황산을 첨가하였다. 그 혼합물을 환류 하에 2시간 동안 약 73℃로 유지시키고, 진공 펌프를 사용하여 감압 하에 농축시켰다. 압력을 대기압에서 20 mBar로 하강시키고, 동시에 반응 혼합물의 온도를 40℃에서 80℃로 상승시켰다.
170 ml 메탄올을 첨가하고, 그 혼합물을 환류 하에 2시간 동안 유지시키고, 감압 하에 농축시켰다. 다시, 170 ml 메탄올을 첨가하고, 그 혼합물을 환류 하에 2시간 동안 유지시키고, 감압 하에 농축시켰다. 최종적으로, 125 ml 메탄올을 첨가하였다. 이 단계에서, 본원에 정의된 "비"는 95%이었다.
그 용액을, 1시간 동안 20℃에서 20 ml 메탄올로 미리 충진된 제 2 반응기로 투여하였다. 암모니아를 사용하여 pH를 3.5로 유지하였다. 고체가 형성되고, 이를 여과에 의해 제거하였다. 생성 모액을 25 ml 물로 희석하고, 감압(p = 20 mm Hg, T = 40 내지 45℃) 하에 농축시켰다. 최종적으로 207.5 g D-페닐글라이신-메틸에스터(PGM) 용액을 수득하였다. 생성 용액의 "비"는 99%이었다.
b) 세팔렉신의 효소적 합성
175 ㎛ 체 바닥을 갖는 반응기를 15 g 부동화된 에스케리치아 콜라이 PenG 아실라제 돌연변이 Phe-B24-Ala로 충진시켰다. 그 후 21.4 g 7-ADCA 및 95 g 물을 25℃에서 첨가하고, 25% 암모니아를 사용하여 pH를 7.0으로 조정하였다.
상기 단계 a)에서 수득된 PGM 용액 38 g을 120분간 일정한 속도로 반응기에 투여하였다. 암모니아를 사용하여 pH를 7.0으로 유지시켰다. 온도를 25℃로 유지시켰다. 30분 후, 0.25 g 고체 세팔렉신(시드)을 첨가하였다. 세팔렉신의 결정화는 45분에서 시작하였다. 120분 내지 150분에서, 25% 황산을 사용하여 pH를 7.0으로 유지시켰다. 그 후, 25% 황산을 사용하여 pH를 5.7로 감소시켰다.
c) 세팔렉신의 회수
상향 교반을 하면서 반응기를 바닥 체를 통해 배출시켰다. 생성된 세팔렉신 현탁액을 유리 필터를 통해 여과하였다. 생성 모액을 반응기로 다시 이동시켰다. 이런 순서의 단계들을 5회 반복하였다. 이어서, 효소를 10 ml 물로 2회 세척하였다. 이런 방식으로, 98% 이상의 세팔렉신이 고체 바이오촉매로부터 분리되었다.
세팔렉신 습윤 케이크, 모액 및 세척수(wash water)를 합치고, 온도를 2℃로 유지시켰다. 합친 습윤 케이크 및 모액의 pH를 농축 황산을 사용하여 1.5로 감소시키고, 생성 용액을 0.45 ㎛ 필터를 통해 여과시켰다.
결정화 반응기를 20 g 물 및 1.0 g의 세팔렉신(시드)으로 충진시켰다. 전술된 산성 세팔렉신 용액을 80분간 30℃에서 결정화 반응기에 투여하였다. 암모니아를 사용하여 pH를 5.0으로 유지시켰다. 이어서, 현탁액을 20℃에서 추가 30분 동안 교반하였다. 현탁액을 유리 필터를 통해 여과하고, 습윤 케이크를 15 ml 물로 2회 및 15 ml 아세톤으로 2회 세척하였다. 건조 후, 32.6 g 세팔렉신 모노하이드레이트를 수득하였다(순도 > 99.8%).
실시예 2
a) D-다이하이드로페닐글라이신-메틸에스터(DHPGM) 용액의 합성
90 g D-다이하이드로-페닐글라이신(DHPG)을 200 ml 메탄올에 현탁시키고, 73.2 g 농축 황산을 첨가하였다. 그 혼합물을 환류 하에 2시간 동안 약 73℃로 유지시키고, 진공 펌프를 사용하여 감압 하에 농축시켰다. 압력을 대기압에서 20 mBar로 하강시키고, 동시에 반응 혼합물의 온도를 40℃에서 80℃로 상승시켰다.
170 ml 메탄올을 첨가하고, 그 혼합물을 환류 하에 2시간 동안 유지시키고, 감압 하에 농축시켰다. 다시, 170 ml 메탄올을 첨가하고, 그 혼합물을 환류 하에 2시간 동안 유지시키고, 감압 하에 농축시켰다. 최종적으로, 125 ml 메탄올을 첨가하였다. 이 단계에서, 본원에 정의된 "비"는 94.8%이었다.
그 용액을, 1시간 동안 20℃에서 20 ml 메탄올로 미리 충진된 제 2 반응기로 투여하였다. 암모니아를 사용하여 pH를 3.5로 유지하였다. 고체가 형성되고, 이를 여과에 의해 제거하였다. 생성 모액을 25 ml 물로 희석하고, 3 g 목탄(활성탄)으로 탈색시키고, 감압(p = 20 mm Hg, T = 40 내지 45℃) 하에 농축시켰다. 최종적으로 217.6 g DHPGM 용액을 수득하였다. 생성 용액의 "비"는 99.2%이었다.
b) 세프라딘의 효소적 합성
이 단계는 WO2005/003367에 기재된 바와 같이 실시되었다.
실시예 3
a) D-페닐글라이신-메틸에스터(PGM) 용액의 합성
90 g D-페닐글라이신을 170 ml 메탄올에 현탁시키고, 73.2 g 농축 황산을 첨가하였다. 그 혼합물을 환류 하에 2시간 동안 약 73℃로 유지시키고, 진공 펌프를 사용하여 감압 하에 농축시켰다. 압력을 대기압에서 20 mBar로 하강시키고, 동시에 반응 혼합물의 온도를 40℃에서 80℃로 상승시켰다.
170 ml 메탄올을 첨가하고, 그 혼합물을 환류 하에 2시간 동안 유지시키고, 감압 하에 농축시켰다. 다시, 170 ml 메탄올을 첨가하고, 그 혼합물을 환류 하에 2시간 동안 유지시키고, 감압 하에 농축시켰다. 최종적으로, 125 ml 메탄올을 첨가하였다. 이 혼합물을 에스터화 혼합물로 부른다.
상기 에스터화 혼합물 대부분(약 95%)을, 1시간 동안 25 내지 30℃에서 40 ml 물로 미리 충진된 제 2 반응기로 투여하였다. 8 M NaOH(34 g 소비)를 사용하여 pH를 3.5로 유지하였다. 고체가 형성되고, 이를 여과에 의해 제거하였다. 생성 모액을 에스터화 혼합물(약 5%)과 혼합하여 여액의 pH를 pH=2로 감소시켰다. 그 혼합물을 감압(p = 20 mm Hg, T = 40 내지 45℃) 하에 농축시켰다. 최종적으로 190 g의 점성 혼합물을 수득하였다.
b) 5 M NaCl중 2 M NaOH의 제조
80 g NaOH를 149 ml 물에 용해시켰다. 그 용액을 5 M NaCl을 첨가하여 1000 ml로 희석하였다. 체적을 1000 ml로 조정하는데 약 840 ml의 5 M NaCl이 필요하다.
c) 유리 염기로서의 PGM의 합성
a)에서 수득된 점성 혼합물을 40℃에서 120 ml의 5 M NaCl과 혼합시켰다. pH를 5 M NaCl중 2 M NaOH를 첨가하여 pH=9로 유지시키면서, 이 혼합물을 20분 동안 50 ml의 5 M NaCl에 첨가하였다. 혼합물의 온도를 20℃로 유지시켰다. 그 혼합물을 분리 깔때기로 이동시키고, 그 혼합물을 20분 동안 정치시켜 침전시켰다. 이어서, 층들을 분리시켰다. 상부 층을 실온에서 120 ml의 5 M NaCl과 혼합시켰다. 그 혼합물을 분리 깔때기로 이동시키고, 20분 동안 정치시켜 침전시켰다. 층들을 분리시켰다. 상부 층을 5000 rpm으로 원심분리시켰다. 소량의 하부 층이 형성되고, 이를 오일성 생성물로부터 제거하였다. 95 g의 PGM(유리 염기)을 수득하였다. 어세이(assay): 85%; e.e. = 97%; 단계 (a)에서 투입된 PG를 기준으로 한 수율: 82%. PGM(유리 염기)중 PG의 어세이: 0.2%(즉, 99.8%의 "비").
d) 암피실린의 합성
본 단계는, 6-APA 및 PGA(즉, 메틸에스터를 대신하는 PG의 아미드 유도체)로부터의 암피실린의 합성에 대한 WO98/56946에 기재된 바와 같이 실시되었다.
실시예 4
D-페닐글라이신-메틸에스터(PGM) 용액의 합성
135 g D-페닐글라이신을 252 ml 메탄올에 현탁시키고, 107 g 농축 황산(98%)을 첨가하였다. 그 혼합물을 환류 하에 2시간 동안 약 73℃로 유지시키고, 진공 펌프를 사용하여 감압 하에 농축시켰다. 압력을 대기압에서 20 mBar로 하강시키 고, 동시에 반응 혼합물의 온도를 40℃에서 80℃로 상승시켰다. 126 ml(100 g) 메탄올을 첨가하고, 그 혼합물을 환류 하에 1시간 동안 약 81℃로 유지시키고, 전술된 바와 같이 농축시켰다.
상기 절차를 추가로 4회 반복하였다(메탄올의 첨가, 환류 및 농축). 최종적으로, 126 ml 메탄올을 첨가하고, 그 용액을 추가 시간 동안 환류시키고, 주변 온도로 냉각시켰다.
pH 2.3 내지 2.4까지 15 ml 암모니아를 일정한 속도로 35분간 투여하였다. 메탄올을 50℃ 미만의 온도에서 감압 하에 증류시켜 내었다. 최종 PGM 용액의 pH는 2.0이고, "비"는 99.0%이었다.
실시예 5
역류 추출 원심분리기의 사용에 의한 PGM 유리 염기의 제조
도 1에 도시된 공정 라인을 다음과 같이 조작하였다:
· 원심분리기는 2400 rpm으로 개시 및 작동시켰다.
· 25%(w/w) Na2SO4 용액을 7.5 kg/h의 유속으로 원심분리기 2에 도입하였다. 반응 혼합물(하기 참조)은 원심분리기 1의 중질 상 배출구로부터 유동이 있은 후에 원심분리기 1로 도입되었다.
· 1000 ml의 5.3 M NaCl을 10 L 용기에 첨가하였다.
· 상기 10 L 용기의 내용물을 8 내지 10℃로 냉각시켰다.
· PGM 용액을 15 kg/h의 유속으로 상기 10 L 용기에 도입시켰다.
· 상기 10 L 용기 내의 pH를, NaOH/NaCl 용액을 첨가하여 pH=9.7로 유지시켰다.
· 상기 10 L 용기의 부피를, 상기 용기로부터의 반응 혼합물의 유속 조정에 의해 5L로 유지시켰다.
· 상기 10 L 용기의 온도를 8 내지 10℃로 유지시켰다.
· 상기 10 L 용기의 반응 혼합물은 열 교환기를 통해 펌핑하여 30℃까지 가온되었으며, 그 후 반응 혼합물이 원심분리기 1로 도입되었다.
· 원심분리기 2로부터의 경질 상을 열 교환기를 통해 3 내지 5℃로 냉각시키고, 3 내지 5℃에서 용기 내에 저장시켰다.
· 경질 상의 생성 후 4시간 미만 내에 경질 상을 암피실린으로의 전환에 적용하였다.

Claims (12)

  1. 핵, D-페닐글라이신 및 D-다이하이드로-페닐글라이신으로 이루어진 군으로부터 선택된, 측쇄 에스터 형태의 측쇄, 및 상기 핵에 상기 측쇄 에스터를 커플링시키는 것을 촉진시키는(catalyzing) 효소로부터의 반합성 β-락탐 화합물의 합성 방법으로서,
    상기 측쇄 에스터를 고체 중간체로서 단리하지 않는 것을 특징으로 하는, 합성 방법.
  2. 제 1 항에 있어서,
    측쇄 에스터의 형성을 포함하며 상기 측쇄 에스터를 고체 중간체로서 단리하지 않는 것을 특징으로 하는, 합성 방법.
  3. 제 1 항 또는 제 2 항에 있어서,
    (a) 알콜을 사용하여 D-페닐글라이신 및 D-다이하이드로-페닐글라이신으로 이루어진 군으로부터 선택된 유리(free) 측쇄를 전환시켜 상응하는 측쇄 에스터를 포함하는 혼합물을 형성하는 단계; 및
    (b) 상기 단계 (a)에서 수득된 혼합물을 핵 및 효소와 혼합시켜 반합성 β-락탐을 형성함에 의해 반합성 β-락탐을 형성하되, 이때 단계 (a)에서 형성된 측쇄 에스터를 고체 중간체로서 단리하지 않는 단계
    를 포함하는, 합성 방법.
  4. 제 3 항에 있어서,
    단계 (a)에서 수득된 혼합물을, 단계 (b)에서 반합성 β-락탐 화합물을 형성하기 이전에 정제하는, 합성 방법.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 핵이 6-아미노페니실란산(6-APA), 7-아미노-데아세톡시세팔로스포란산(7-ADCA), 7-아미노세팔로스포란산(7-ACA) 및 7-아미노-3-클로로-3-세펨-4-카복실레이트(7-ACCA)로 이루어진 군으로부터 선택되는, 합성 방법.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 반합성 β-락탐 화합물이 암피실린, 세팔렉신, 세프라딘 및 세파클로르로 이루어진 군으로부터 선택되는, 합성 방법.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 알콜이 메탄올 또는 에탄올, 바람직하게는 메탄올인, 합성 방법.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항중 어느 한 항에 있어서,
    상기 효소가, 바람직하게는 부동화된 형태의, 페니실린 G 아실라제인, 합성 방법.
  9. 제 7 항에 있어서,
    상기 페니실린 G 아셀라제가 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli)로부터 유래된, 합성 방법.
  10. D-페닐글라이신 및 D-다이하이드로-페닐글라이신으로 이루어진 군으로부터 선택된 측쇄의 에스터를 포함하는 제제로서,
    상기 측쇄 에스터가 유리 염기 형태이고, 90% 이상의 e.e.를 갖고,
    상기 제제가, 측쇄 에스터에 대해 바람직하게는 20 몰% 이하의 염 함량 및 바람직하게는 85% 이상의 "비(ratio)"를 갖는, 제제.
  11. 제 8 항에 있어서,
    D-페닐글라이신-메틸에스터, D-페닐글라이신-에틸에스터, D-다이하이드로-페닐글라이신-메틸에스터 및 D-다이하이드로-페닐글라이신-에틸에스터로 이루어진 군으로부터 선택된 에스터를 포함하는, 제제.
  12. 제 10 항 또는 제 11 항의 에스터의 제조 방법으로서,
    측쇄 에스터의 염을 수성 환경에서 염기와 혼합시킴으로써 2상 계(two phase system)를 생성하는 단계, 및
    상기 수성 상으로부터 유리 염기 형태의 측쇄 에스터를 바람직하게는 원심분리, 가장 바람직하게는 연속식 원심분리에 의해 분리시키는 단계
    를 포함하는, 제조 방법.
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