ITMI960033A1 - Procedimento per la sintesi enzimatica di antibiotici b-lattamici in presenza di un inibitore dell'enzima - Google Patents

Abstract

Un procedimento per la produzione di penicilline e cefalosporine per reazione tra un nucleo ?-lattamico ed un'amide. La reazione è catalizzata da un enzima penicillina acilasi ed avviene in presenza di inibitori enzimatici.

Description

Descrizione di un'invenzione industriale a nome:

La presente invenzione si riferisce ad un procedimento enzimatico migliorato per l'ottenimento di penicilline e cefalosporine di formula (I) e(II)

in cui X è S o CH.2 , R è un anello idrocarburico a 6 termini opzionalmente sostituito ed R1 è un atomo di idrogeno, un atomo di alogeno, un gruppo metile, un gruppo metossile, un gruppo alchenile C1-C4 o un gruppo metilenico legato ad un radicale organico a mezzo di un atomo di ossigeno, zolfo o azoto.

L 'US-A-3816253 descrive un procedimento per l'ottenimento di penicilline o cefalosporine per reazione di un α-aminoacido a -sostituito con un composto derivante dall'acido 7-aminocefalosporanico o 7-aminodesacetossicefalosporanico in presenza di un microrganismo attivo o enzima, in soluzione acquosa, ad una temperatura compresa tra 5*C e 50°C, preferibilmente tra 20°C e 40°C. E' stato trovato che, operando come descritto nell'USP precedentemente citato, la resa del prodotto finale desiderato viene fortemente diminuita a causa di reazioni concomitanti parallele con formazione di sottoprodotti che sono difficilmente separabili dalla miscela di reazione. ;Per eliminare o perlomeno ridurre gli inconvenienti sovracitati, 1'EP-A-0473008 propone un metodo per produrre penicilline e cefalosporine di formula (I) o (II). Secondo detto metodo l'acido 6-amino penicillanico o 7-amino cefalosporanico viene fatto reagire con un α-aminoacido otsostituito di formula R-CH(NH2 )-COOH o con un derivato reattivo degli stessi, in presenza di una penicillina acilasi immobilizzata, effettuando la reazione in mezzo acquoso ad una temperatura compresa tra -5°C e 20eC, preferibilmente a circa 4°C. ;Le condizioni di reazione sono fornite chiaramente nell'EP-A-0473008 che riporta anche, in dettaglio, 25 esempi di realizzazione con rese molto buone (90% e più) del prodotto finale desiderato. ;A questo proposito è necessario notare che un procedimento è industrialmente realizzabile solo quando le rese sono sufficientemente elevate (circa 90%) ed il prodotto finale è facilmente purificabile. ;L 'EP-A-0473008 menziona in termini generici gli α-aminoacidi α-sostituiti di formula R-CH(NH2)~ COOH o i loro derivati reattivi che possono essere usati come sostanze di partenza. Pur tuttavia l'unico aminoacido specificatamente esemplificato è solo il metil estere della D-fenilglicina. ;I presenti richiedenti hanno effettuato molte ed accurate prove sperimentali seguendo il procedimento descritto negli esempi riportati nell 'EP-A-0473008: i risultati ottenuti sono stati però tutti scoraggianti. ;E1 stato infatti verificato che, qualora nel mezzo di reazione il rapporto molare del citato aminoacido è inferiore a 4 moli per 1 mole di acido 6-amino penicillanico o 7-amino cefalosporanico usato, la resa del prodotto finale desiderato è molto bassa (inferiore a circa il 60%) e, come tale, non è industrialmente accettabile. ;Buone rese, industrialmente accettabili, sono invece ottenute solo se il numero di moli della D-fenilglicina metilestere in reazione è in un rapporto compreso tra 4 e 6 rispetto ad 1 mole di acido 6--amino-penicillanico o 7-aminocefalosporanico usato. ;In questo caso, tuttavia, si verifica non solo un aumento non accettabile dei costi (il prezzo della D-fenilglicina metilestere è molto elevato), ma si formano anche dei sottoprodotti difficilmente o del tutto ineliminabili dalle desiderate penicilline o cefalosporine finali della reazione. ;Tentativi sono stati effettuati usando diversi esteri della D-feniglicina o di differenti aminoacidi: tutti questi tentativi sono stati infruttuosi . ;Uguali risultati negativi sono stati ottenuti usando numerosi derivati reattivi degli aminoacidi. ;La domanda tedesca di brevetto DOS 2214444 riporta una sintesi enzimatica di cefalosporine (in particolare della cefalexina) per reazione del 7-ADCA con fenilglicina amide in presenza dell'enzima penicillina acilasi: le rese ottenute sono molto basse. ;PCT/DK91/00188 (W092/01061) e PCT/DK92/00388 (WO93/12250) riportano metodi per la preparazione di antibiotici β-lattamici a mezzo di acilazione enzimatica, secondi i quali una amide di formula ;; ;; viene fatta reagire con acido 6-amino-penicillanico o 7-amino-cefalosporanico in presenza di un enzima penicillina acilasi immobilizzato. ;Tali metodi si dimostrano attuabili : è stato però trovato che un apprezzabile quantitativo di amide (III) viene idrolizzato dall'enzima medesimo, aumentando in tal modo il numero delle impurezze dei prodotti finali desiderati: anche una discreta quantità del prodotto finale viene idrolizzata dallo stesso enzima. ;Fin dalle prime applicazioni della Penicillina Acilasi (E.C. 3.5..1.11) è noto che questo enzima è inibito dalla presenza di acido fenilacetico, acido fenossiacetico e/o di altri inibitori, in presenza dei quali l'enzima perde attività e la catalisi tende a fermarsi.Ciò costituisce un problema quando si affronta l'acilazione di nuclei β-lattamici che possono contenere tracce di acido fenilacetico o acido fenossiacetico o altri inibitori. ;Questo problema è stato da molti affrontato cercando enzimi che non manifestino questo tipo di inibizione (rif. D.D.Y. Ryu ed altri, Biotechnology and Bioengineering 1985, Voi XXVII pag. 953-960. A.M. Blinkowsky ed altri, Enzyme Microbial Technology 1993, Voi 15, pag. 965-973): sono stati selezionati enzimi (spesso denominati Ampicillina Acilasi o Amidasi, Cefalosporina Acilasi o Amidasi, enzima sintetizzante la Cefalessina ecc.) provenieneti da verie fonti microbiche (Acetobacter spp., Xantomonas spp.). Nessuno di questi enzimi è tuttavia disponibile commercialmente nè viene preparato su larga scala com'è necessario per impieghi industriali; questo approccio è quindi sfavorito dal fatto di richiedere notevoli investimenti in ricerca per mettere a punto un catalizzatore specifico per la sintesi degli antibiotici β-lattamici. ;Un altro modo per superare l’inibizione dell'enzima è quello di eliminare i suddetti inibitori prima di effettuare l'acilazione enzimatica, per esempio mediante estrazione con solvente organico come descritto in PCT/DK91/00188. Lo svantaggio principale di questo metodo consiste appunto nell'utilizzo di solventi organici; poiché le acilazioni enzimatiche dei nuclei β-lattamici sono state introdotte espressamente per eliminare l'utilizzo di detti solventi ed ottenere quindi dei processi ad elevata compatibilità ambientale, ne consegue che anche questo approccio non ha finora portato a risultati soddisfacenti. ;I richiedenti hanno sorprendentemente scoperto, durante lo svolgimento di studi specifici sulle reazioni catalizzate da Penicilline Acilasi, che la suddetta inibizione può essere aggirata, ottenendo quindi la sintesi di antibiotici βlattamici in presenza di quantità anche rilevanti degli inibitori sopra menzionati. In alcuni casi è anche possibile sfruttare l'inibizione dell'enzima in termini utili alla sintesi, come descritto oltre, introducendo determinate quantità di un inibitore inizialmente non presente o presente in piccole quantità. ;Come conseguenza, la presente invenzione si riferisce ad un procedimento enzimatico migliorato per produrre penicilline e cefalosporine di formula rispettivamente (I) e (II) come sopra specificato in cui un acido 6-amino-penicillanico o 7-amino cefalosporanico di formula (IV) o (V) ;; ;; in cui X e R1 hanno il significato detto sopra viene fatto reagire ad una temperatura compresa tra -50C e 35’C, in presenza di un enzima Penicillina Acilasi in forma libera o immobilizzata, con un amide di formula (III) ;;; ;;; dove R è come sopra specificato, R2 e R3 sono ciascuno indipendentemente un atomo di idrogeno o un gruppo alchilico lineare ramificato da 1 a 3 atomi di carbonio, i loro sali, in un rapporto molare da 1 a 6 moli di amide (III) per mole di acido (IV) o (V), caratterizzato dal fatto che ;nella miscela di reazione è presente un inibitore enzimatico di formula (VI): ;;dove : ; R4 è un gruppo alchilico C1-C8 lineare o ramificato, un anello aromatico sostituito o non, un alogeno, un protone, Y può essere assente o, se presente, è 0,S CH2, fenile o alogeno; ;R5 è un carbossile o estere C1-C4 lineare o ramificato oppure un gruppo -CONH2; ;R6 è H, OH OCHO, CH3; ;tale inibitore essendo presente in concentrazioni da 0,0001 a 0,5 molare. ;In particolare detto inibitore (VI) è presente in una concentrazione da 0,0005 a 0,2 molare ed è scelto tra l'acido fenilacetico, l'acido fenossiacetico, l'acido mandelico o gli esteri e le amidi C1-C9 (lineari o ramificati) di questi acidi. ;L'invenzione si riferisce anche a composizioni farmaceutiche comprendenti penicilline o cefalosporine preparate a mezzo del procedimento descritto nella presente invenzione, come pure a diluenti o veicolanti farmaceuticamente accettabili. ;Le composizioni farmaceutiche contenenti le penicilline o cefalosporine vengono comunemente preparate secondo metodi convenzionali e sono somministrate in adatta forma farmaceutica. ;Con riferimento alle formula (I) e (II), R può essere ad esempio un gruppo fenile, cicloesadienile, cicloesenile non sostituito o sostituito con un ossidrile, alogeno, alchile, alcossi, carbossile, nitro o animino. ;Ri può essere un atomo di idrogeno, un atomo di alogeno, un gruppo metile o inetilenico legato ad un gruppo organico ed in particolare ad un gruppo alcossi, alcossicarbonile o un gruppo eterociclico a cinque o sei termini contenente da 1 a 4 eteroatomi scelti fra 0, S ed N legati al gruppo inetilenico a mezzo di un atomo di 0, S, N e opzionalmente sostituiti con uno o più gruppi scelti tra un idrossile, alogeno, alchile, alcossi, carbonile, carbossi, ciano, amino e simili. ;I termini alchile ed alcossi qui usati si riferiscono a gruppi aventi da 1 a 6 atomi di carbonio, preferibilmente da 1 a 4 atomi di carbonio. ;Con riferimento agli α-aminoacidi le cui amidi hanno formula (III), si possono citare come esempio la D-fenilglicina, D-p-idrossifenilglicina e la D-1,4-cicloesadien-l-il-glicina. ;Sali adatti dell'amide sono quelli con un acido inorganico quali l’acido cloridrico, fluoridrico, bromidrico, solforico o nitrico, oppure con un acido organico, ad esempio l'acido acetico, formico o maleico. ;I seguenti acidi sono di particolare interesse tra i composti di formula (IV) e (V): ;il 6-amino-penicillanico (6-APA), il 7-aminodesacetossicefalosporanico (7-ADCA), il 7-aminocefalosporanico, il 7-amino-3-cloro-cefalosporanico, il 7-amino-3-metossicefalosporanico, il 7-aminofenacetildesacetossicefalosporanico, il 7-aminofenosiacetildesacetossicefalosporanico, il 7-amino-3-cloro-carbacefem, la penicillina G e la penicillina V. ;La penicillina G o V e l'acido 7-aminofenacetil-desacetoseicefalosporanico sono comunemente utilizzati come materie prime per la preparazione di 6-APA e di 7-ADCA rispettivamente, a loro volta utilizzati per produrre Ampicillina ed Amoxicillina, Cefalessina e Cefadroxil: fino ad ora è stato necessario purificare dall'acido fenilacetico o fenossiacetico questi intermedi (6APA e 7-ADCA) per poterli utilizzare nelle reazioni di acilazione enzimatica, come descritto in PCT/DK91/00188 . La possibilità di effettuare la sintesi di questi composti anche in presenza di inibitori comporta quindi il vantaggio di effettuare la sintesi senza necessità di purificazione degli intermedi, con un notevole risparmio di lavoro ed evitando l'utilizzo di solventi organici. ;L 'inibitore enzimatico può essere presente nella miscela di reazione fin dall'inizio della sintesi oppure può essere aggiunto in un qualunque momento durante il decorso della reazione; detto inibitore può essere aggiunto anche alla fine della reazione enzimatica per facilitare l'isolamento del prodotto ed i successivi trattamenti in generale. ;L'enzima utilizzato come catalizzatore nel presente procedimento è una Penicillina Amidoidrolasi classificato E.C. 3.5.1.11 (altrimenti denominato anche penicillina acilasi, penicillina idrolasi, ampicillina acilasi ecc.) proveniente da una qualsiasi fonte microbiologica ed in particolare da ceppi di Xantomonas, Pseudomonas, Arthrobacter, Kluyvera, Acetobacter, Escherichia, Bacillus, Acromonas. Particolarmente preferiti sono gli enzimi derivanti da ceppi naturali o ingenierizzati di Escherichia coli: alcuni di questi sono disponibili in commercio in larga quantità ed anche in forma immobilizzata. ;L'enzima può essere utilizzato in forma libera (ossia solubile) oppure può essere immobilizzato su una matrice solida: tra queste ultime sono particolarmente preferiti i supporti espressamente dedicati all'immobilizzazione di biomolecole come ad esempio le resine sintetiche epossidiche o azlattoniche. ;ESEMPIO 1 ;Sintesi di Cefalessina mediante acilazione enzimatica del 7-ADCA con D(- )fenilglicinamide ;9 g (42 mmoli) di acido 7-aminodesacetossicefalosporanico e 15,7 g (100 mmoli) di D(-)fenilglicinamide sono sati sciolti in acqua (volume finale 300 mi). La soluzione è stata raffreddata a circa 4°C e portata a pH=6,8, quindi trasferita in un reattore refrigerato collegato ad un sistema di controllo (denominato in seguito pH-stat) che provvede a mantenere costante il pH aggiungendo automaticamente acido solforico 4 N. ;Alla soluzione di cui sopra sono state aggiunte 5400 UI di enzima penicillina amidoidrolasi in forma immobilizzata (su resina azlatonica o epossidica), incubando a 4*C e pH=6,8 costanti.

Dopo circa 75 minuti l'enzima è stato separato dalla soluzione mediante filtrazione; alla soluzione sono stati aggiunti circa 4 g di b-naftolo sciolto in soda diluita. Sono stati recuperati 16.6 g di prodotto sotto forma di complesso Cefalessina b-naftolo, con una resa molare rispetto al nucleo di partenza del 74%. Dal complesso con b-naftolo è stata poi ottenuta (con procedure note) la forma di Cefalessina monoidrato con buone caratteristiche di qualità.

ESEMPIO 2

Sintesi di Cefalessina in presenza di acido fenilacetico

17 g (0,077 mmoli) di acido 7-amino-desacetossicefalosporanico grezzo contenente come impurezze 1,18% di acido fenilacetico e 1,63% di acido 7-aminofenacetil-desacetossicefalosporanico e 42.68 g (0,28 mmoli) di D(-)-fenilglicinamide vengono sciolti in acqua ottenendo un volume finale di 600 mi.

Il pH-stat viene regolato a pH=7,6, il termostato a 2°C, si utilizzano 7560 UI di enzima immobilizzato e quindi la reazione viene condotta come descritto nell'esempio 1. Dopo 5 ore e 30 minuti si interrompe la reazione filtrando la penicillina Acilasi e si precipita il prodotto con 6 g di b-naftolo ottenendo una resa molare del 87.5%. Si ottiene in seguito la Cefalessina monoidrato come già descritto nell'Esempio 1.

ESEMPIO 3

Sintesi della Cefalessina da acido 7-aminofenacetil-desacetossicefalosporanico e D(-)fenilglicinamide

16 g (0,048 moli) di acido 7-aminofenacetildesacetossicefalosporanico sono stati sciolti in acqua aggiungendo NaOH diluita quanto basta a raggiungere pH=8,0 quindi la soluzione è stata scaldata a 28°C e diluita con acqua quanto basta a 320 mi e quindi trasferita in un reattore opportuno, collegato ad un sistema pH-stat ed immerso in un bagno termostatico.

A questa soluzione (soluzione A) sono state aggiunte circa 14000 UI di enzima penicillina acilasi in forma immobilizzata e quindi sono state mantenute costanti le condizioni di pH (aggiungendo NaOH 2 N) e di temperatura.

A parte è stata preparata una soluzione acquosa di D(-)feniglicinamide ad una concentrazione di circa 180 g/1 (soluzione B).

Dopo circa due ore di reazione, 190 mi circa della soluzione B sono stati aggiunti alla soluzione A, correggendo il pH e la temperatura se necessario; il pH venne mantenuto costante mediante aggiunta di acido solforico 4 N.

Dopo sette ore è stato rimosso 1'enzima per filtrazione sotto vuoto; dalla soluzione risultante è stata recuperata la Cefalessina mediante precipitazione del complesso Cefalessina bnaftolato in quantità corrispondente ad una resa molare del 80.8%. Dal complesso Cefalessina bnaftolato è stata ottenuta, mediante procedure note, la Cefalessina mono-idrato avente qualità soddisfacente per la commercializzazione.

ESEMPIO 4

Utilizzo ài inibitori nell'acilazione enzimatica dell'acido 7-amino-3-clorocefalosporanico

La reazione viene condotta come nell'Esempio 1, utilizzando però 9,85 g (0,042 mmoli) di acido 7-amino-3-clorocefalosporanico. A fine reazione si aggiungono 1,5 g di acido fenilacetico sciolto in NaOH diluita, quindi si precipita il Cefaclor bnaftolato come già descritto negli Esempi 1-3 a proposito della Cefalessina.

La resa molare da acido 7-amino-3-clorocefalosporanico è stata del 70%. Per decomposizione (con tecniche note) del complesso Cefaclor b-naftolato si ottiene il Cefaclor monoidrato .

ESEMPIO 5

Acilazione enzimatica dell'acido 6-aminopenicillanico in presenza di inibitori

Mediante procedimenti noti, dalla Penicillina G si ottiene per idrolisi enzimatica l'acido 6-aminopenicillanico (denominato in seguito 6-APA), isolandolo dalla soluzione acquosa per precipitazione con acidi: il prodotto così ottenuto presenta impurezze di acido fenilacetico.

20,8 g di 6-APA grezzo umido avente titolo 80% (0.077 moli) vengono sciolti in acqua e mescolati con D-(-)fenilglicinamide come descritto nell'esempio 2, ottenendo una soluzione contenente circa 0,7 g/1 di acido fenilacetico. Si aggiungono 6670 unità di penicillina acilasi e la reazione viene condotta analogamente a quanto descritto nell'Esempio 2: si ottiene una conversione del 6-APA del 82,4%.

ESEMPIO 6

Inibizione idrolitica della penicillina G acilasi durante la sintesi di cefalessina. in presenza di acido fenilacetico.

13 g (60.75 mmoli) di acido 7-aminodesacetossicefalosporanico (7-ADCA), 46.5 g (230,84 mmoli) di D-fenilglicina metilestere.HCl e 140 mg (1,03 mmoli) di acido fenilacetico furono sciolti in Ha0 per un volume totale di 1000 mi.

L'acilazione venne eseguita con 17.5 g (3000 I.U.) di penicillina G acilasi nelle seguenti condizioni: il pH iniziale era 7.25 ad una temperatura di 3°C. Dopo circa 3 ore, il 93% di 7-ADCA era trasformato in cefalessina.

Dopo conversione del 93% di 7-ADCA in cefalessina, il rapporto molare tra produzione sintetica di cefalessina rispetto alla formazione idrolitica di D-fenilglicina era di 2,15 in confronto di 1,44 ottenuto senza inibitore.

Claims (5)

1. RIVENDICAZIONI 1. Un procedimento per produrre una penicillina o cefalosporina di formula (I) o (II)

   in cui X è S o CH2, R è un anello idrocarburico a 6 termini opzionalmente sostituito ed R1 è un atomo di idrogeno, un atomo di alogeno, un gruppo metile, un gruppo metossile, un gruppo alchenile C1-C4 o un gruppo metilenico legato ad un radicale organico a ezzo di un atomo di ossigeno, zolfo o azoto, in cui: un. acido 6-amino-penicillanico o 7-aminocefalosporanico di formula (IV) o (V)

   in cui X ed R1 sono come sopra definiti, viene fatto reagire in mezzo acquoso ad una temperatura tra -5°C e 35°C in presenza di un enzima penicillina acilasi immobilizzato od in forma solubile con una amide di formula (III)

   in cui R è come sopra definito, R2 ed Ra sono ciascuno indipendentemente un atomo di idrogeno o un gruppo alchilico lineare o ramificato da 1 a 3 atomi di carbonio o i loro sali, in rapporto molare da 1 a 6 moli di detta amide (III) per 1 mole di acido (IV) o (V), caratterizzato dal fatto che al mezzo di reazione viene aggiunto un inibitore enzimatico di formula (VI): dove:

   R4 è scelto da un gruppo costituito da un alchile C1-C5 lineare o ramificato, un anello aromatico sostituito o non, un alogeno, un protone; Y può essere assente o, se presente, è O, S, CH2, fenile o alogeno; R5 è scelto dal gruppo costituito da un carbossile, un estere C1-C4 lineare o ramificato oppure un gruppo -CONH2; R6 è scelto dal gruppo costituito da H, OH, OCHO, CH3, tale inibitore essendo presente in concentrazioni da 0,0001 a 0,5 molare.
2. 2. Un procedimento secondo la rivendicazione 1, caratterizzato dal fatto che la concentrazione di detto inibitore è preferibilmente da 0,0005 a 0,2 molare.
3. 3. Un procedimento secondo le rivendicazioni 1 e 2, caratterizzato dal fatto che detto inibitore (VI) è scelto dal gruppo costituito da acido fenilacetico, acido fenossiacetico, acido mandelico o gli esteri e le amidi C1-C8 (lineari o ramificati) di questi acidi.
4. 4. Un procedimento secondo le rivendicazioni 1 e 2 caratterizzato dal fatto che detta amide (III) è scelta dal gruppo costituito da D-feniglicina amide o un suo sale con un acido organico o inorganico.
5. 5. Composizione farmaceutica contenente una penicillina o cefalosporina ottenuta secondo i procedimenti delle rivendicazioni da 1 a 4.