KR20090105159A - 식물 병원균에 대하여 항균 활성을 가지는 신규한슈도모나스 푸티다 ｎｂ12 및 이를 포함하는 조성물 - Google Patents

식물 병원균에 대하여 항균 활성을 가지는 신규한슈도모나스 푸티다 ｎｂ12 및 이를 포함하는 조성물 Download PDF

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Abstract

본 발명은 식물 병원균에 대하여 항균활성을 가지는 신규 슈도모나스 푸티다 NB12 균주, 이를 포함하는 조성물 및 상기 조성물을 식물 또는 토양에 처리하여 식물 병원균을 방제하는 방법에 관한 것이다. 본 발명의 슈도모나스 푸티다 NB12 균주는 다양한 종류의 식물 병원균에 대하여 광범위한 항균 활성을 가지며 식물 병원균에 의해 유발되는 식물의 병해를 환경친화적으로 방제할 수 있다.
Pseudomonas putida, 식물병 방제균

Description

식물 병원균에 대하여 항균 활성을 가지는 신규한 슈도모나스 푸티다 ＮＢ12 및 이를 포함하는 조성물{Novel Pseudomonas putida NB12 Having Anti-plant pathogens Activity and Composition Comprising the Same}
본 발명은 식물 병원균에 대하여 항균활성을 가지는 신규한 슈도모나스 푸티다 NB12 균주, 이를 포함하는 조성물 및 상기 조성물을 처리하여 식물 병원균을 방제하는 방법에 관한 것이다.
식물 병원균은 농작물 및 화훼류 등의 식물에 감염하여 식물의 수확량을 감소시키고 품질의 저하를 초래하여 상품가치를 떨어뜨리는 등 농업경제에 막대한 손실을 초래한다. 이런 식물 병원균을 방제하기 위하여, 일반적으로 유기합성 농약을 사용하였다. 그러나, 반복적이고 과도한 유기합성 농약의 사용은 식물 및 토양에 잔류하는 농약성분으로 인한 안전성의 문제, 약제 내성균의 출현, 환경오염과 자연생태계의 파괴를 초래하고 있다.
따라서, 이러한 유기합성 농약의 여러 가지 문제점을 보완 및 대체하기 위하 여, 저독성의 안전한 유기합성 농약의 개발이 요구되고 있다. 또 다른 대안은 항균 활성이 우수한 자연에 존재하고 있는 곰팡이, 세균, 바이러스 등의 미생물 또는 이들 미생물로부터 생산된 활성물질을 유기합성 농약 대신 이용하는 방법으로, 이러한 미생물학적 제제는 유기합성 농약과 비교하여, 생태계에 미치는 영향이 적고 약제 내성이나 저항성 유발을 유발하지 않아 환경친화적이고 안전하다는 장점을 가진다.
유기합성 농약을 대체할 수 있는 식물 병원균에 효율적으로 작용할 수 있는 새로운 미생물을 동정하고자 한다.
이에 본 발명자는, 식물 병원균에 대하여 항균 활성을 가지는 균주를 선별하였고, 선별된 균주는 슈도모나스 푸티다에 속하는 신규 균주임을 동정하였으며, 상기 균주는 다양한 종류의 식물 병원균에 대하여 항균 활성을 가지는 것을 재확인하였다.
이하 본 발명을 자세히 설명한다.
하나의 양태로서, 본 발명은 수탁번호 KFCC 11414P로 기탁된, 식물 병원균에 대하여 항균활성을 가지는 신규한 슈도모나스 푸티다 NB12 균주에 관한 것이다.
본 발명의 “슈도모나스 푸티다 NB12”는 경남 하동 지역에서 채집한 각종 식물의 뿌리에서 분리한 균주로, 형태학적, 생리학적 및 생화학적 특성 분석을 통해 슈도모나스 푸티다인 것으로 동정된 균주이다. 본 발명의 균주는 탄저병균, 피티엄 울티멈, 역병균, 잿빛곰팡이병균, 푸사리움 옥시스포룸 등의 다양한 종류의 식물 병원균에 대하여 광범위하면서도 우수한 생육저지 활성, 즉 길항 작용을 나타내는 것을 특징으로 한다.
상기 슈도모나스 푸티다 NB12 균주는 2008년 3월 10일자 서울 서대문구 홍제동 유림빌딩2층에 소재한 한국종균협회(Korean Federation of Culture Colleftions,KFCC)에 수탁번호 KFCC 11414P로 기탁하였다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 슈도모나스 푸티다 NB12 균주, 배양여액, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 식물 병원균 억제 조성물에 관한 것이다.
배양여액은 상기 슈도모나스 푸티다 NB12 균주 배양액에서 균체를 제거한 상청액으로, 원심분리 또는 여과를 통해 얻을 수 있다. 본 발명의 슈도모나스 푸티다 NB12 균주, 배양여액, 또는 이들의 혼합물은 식물 병원균 억제 조성물로 유용하게 사용될 수 있다. 이 때, 본 발명의 조성물은 당 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 계면활성제, 식물 영양제, 방부제, 생물보충제, 계면활성제, 무기염류, 보조제, 결합제 및 증량제 등을 포함할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 저장성을 개선할 수 있는 물질, 예를 들어 피트 모스(peat moss), 지올라이트 (zeolite), 탈크(talc) 및 카올리나이트(kaolinite), 점토 등을 포함할 수 있다. 상기 본 발명의 조성물은 분말, 펠렛, 과립, 및 용액 등의 다양한 제제로 제형화될 수 있다.
본 발명의 식물 병원균 억제 조성물은 탄저병균, 피티엄 울티멈, 역병균, 잿빛곰팡이병균, 푸사리움 옥시스포룸 등의 식물 병원균에 의해 유발되는 식물의 다양한 병해를 효과적으로 방제할 수 있지만 생태계 파괴, 지하수 오염, 농작물의 잔류독성 등의 문제를 유발하지 않아 친환경적이라는 장점을 가진다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 슈도모나스 푸티다 NB12 균주, 배양액, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 식물 병원균 억제 조성물을 처리하여 식물 병원균의 생육을 억제시키는 방법에 관한 것이다.
본 발명의 조성물은 슈도모나스 푸티다 NB12 균주가 길항작용을 하는 병원균의 감염에 의해 병해가 유발되거나 유발될 수 있는 모든 식물에 적용될 수 있다. 본 발명의 조성물은 식물의 종자, 줄기, 잎 등의 다양한 부위에 직접 살포하거나, 또는 식물이 생장하고 있는 토양 등에 처리함으로서 식물 병원균을 효과적으로 방제할 수 있다. 또한, 본 발명의 조성물은 재배중인 식물뿐만 아니라, 수확 후에 저장 및 유통되는 단계의 채소, 과일, 화훼 등의 식물에 처리하여 병원균을 방제할 수도 있다.
본 발명의 슈도모나스 푸티다 NB12는 탄저병균 (Colletotrichum acutatum), 피티엄 울티멈 (Pythum ultimum), 역병균 (Phytophthora capsici), 잿빛곰팡이병균 (Botrytis cineriea) 및 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum) 등의 다양한 종류의 식물 병원균에 대하여 우수한 항균 활성을 나타내었다.
이하, 본 발명을 실시예에 의하여 보다 상세히 설명한다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적일 뿐 본 발명의 권리 범위는 하기 실시예에만 한정 되는 것은 아니다.
실시예 1: NB1 균주분리
경남 하동 지역에서 채집한 각종 식물 뿌리를 각각 물로 세척한 후, 뿌리들을 막자 사발을 이용하여 분쇄한 다음, 멸균수로 희석하여 10% 티에스에이(TSA, Triptic Soy Agar) 배지에 분주 및 도말하여 28℃에서 4일간 배양하였다. 배양된 배지에서 단일 콜로니(single colony)를 선발하여 King' B 배지에서 재 배양한 후, 배양된 균주를 보관균주로 만들어 사용하였다.
실시예 2: 균주 특성 분석
슈도모나스 푸티다 NB12 균주의 형태적 특성을 조사하기 위하여 전자현미경 이용하여 NB12균주의 세포형태, 크기, 포자 및 편모를 조사하였고, TSA 배지에서 생장하는 colony를 조사하였다.
또한 생리적 특성을 알아보기 위하여 Gram 염색반응, 생육온도, 생육pH, 산소요구성을 각각 조사하였다. Gram 염색반응은 Crystal violet stain solution을 이용하여 조사하였고(Dhingra amp;Sinclair, 1985. Basic Plant Pathology Method. Page 264, CRC Press), 생육온도범위 및 최적생육조건은 TSB(Tryptic Soy Broth)배지를 이용하여, 15~40℃의 범위에서 200rpm, pH 7 조건하에서 5℃간격으로 배양하여 진탕배양하여 그 밀도를 흡광도를 이용하여 조사하였다. 생육pH 및 최적생육pH는 TSB 배지의 산도를 3~10pH로 조절하여 27℃, 200rpm 조건하에서 진탕배양시켜 NB12균주의 밀도를 흡광도를 측정하여 조사하여 결정하였다. 산소요구성은 TSA배지에 NB12 균주를 접종한 후, 밀폐용기에 질소를 주입한 무산소 조건과 일반적인 호기적인 조건에서 생육여부를 비교하여 결정하였다.
하기 표1과 같이 NB12균주는 간균 형태로서 내생포자를 형성하지 않으며, 1~수개의 편모를 가지고 있다. 또한, 그람음성균으로서 15~40℃에서 생육이 가능하며, 최적생육온도는 25~30℃이다. 생육이 가능한 pH 범위는 5.0~8.0pH이고 최적 생육 pH는 7.0이다. 산소요구성 측정결과는 호기성(Aerobic)임을 알 수 있다. 또한 King's B배지에서 배양 시에 녹색의 형광색을 보이며, 오래된 배지에서는 색으로 배지를 변화시킨다.
슈도모나스 푸티다 NB12 균주의 특성
구분 특성
세포 형태(Cell) 간균
크기(Size; ㎛) 0.5~1.0(두께), 1.5~5.0(길이)
포자 내생포자 안함
편모 1~수 개
그람염색(Gram stain) 음성
생육온도범위(℃) 15~40
최적생육온도(℃) 25~30
생육 pH 범위 5.0~8.0
최적생육 pH 7.0
산소요구성 호기성
Colony 모양 Kins' B 배지에서 녹색 형광색 형성
실시예 3: 균체 지방산 분석 결과
균주의 동정은 미디(MIDI)의 미생물동정방법(MIDI Inc., USA)을 이용하여, 지방산메틸에스테르를 사용설명서(Operating manual. Version 6. MIDI Inc., USA)에 따라 TSA배지에서 NB1균주를 27℃, 24시간 배양한 후에 단일 colony를 취하여 용균, 혼성화반응, 메틸화 반응을 거쳐 추출하여 기체크로마토그래피를 이용하여 분석을 실시하고, 그 결과(세포지방산 구성비)를 데이터 베이스와 비교 분석하여 유사성(Sim Index)이 0.485인 슈도모나스 푸티다 NB12을 동정하였다(표2).
본 발명자들은 이 균주를 Pseudomonas putida NB12로 명명하고 한국미생물보존센터에 기탁하여 수탁번호 KFCC 11414P를 부여 받았다.
슈도모나스 푸티다 NB12의 세포 지방산 분석 결과
Fatty acid Percent
C10 :0 3OH 7.18
C12 :0 6.53
C12 :0 2OH 7.47
C12 :0 3OH 6.53
C14 :0 1.55
C15 :0 0.42
C16 :0 17.04
C17 :1 w8c 0.24
C17 :0 CYCLO 0.31
C18 :1 w7c 26.21
C18 :0 0.19
실시예 4: 슈도모나스 푸티다 NB12의 병원균 제어 효과
슈도모나스 푸티다 NB12 균주의 식물병원 미생물에 생육저지 효과를 알아보기 위해서 토양전염성병식물병원균인 Rhizoctonia solani AG4, Pythum ultimum, Phytopthora capcisi 및 Fusarium oxysporum과 공기전염성병균인 잿빛곰팡이병균(Botrytis cineriea), 탄저병균(Colletotrichum acutatum)과 대치 배양하여 식물병원균에 대한 생육저지 효과를 조사하였다.
조사방법은 식물병원균과 NB1이 모두 잘 자라는 감자한천배지(PDA, Potato Dextrose Agar)에서 수행하였다. 병원균을 plate의 중앙에 접종 후 24시간 경과 후에 King's B배지에서 36시간 NB12를 배양하여 충분히 자란 배양액에 페이퍼디스크(직경 8mm)를 10분간 침지 후에 무균상태에서 1분간 건조한 다음 병원균 균총에서 3cm 떨어진곳에 대치하였다. 이를 각각 표3과 같이 28℃에서 5~7일간 배양하면서 조사하였다.
생육저지 효과의 병원균과 NB12사이에 형성되는 저지원(Inhibition zone)의 간격을 임의로 no, +, ++,+++,++++의 5단계로 나누어 분석한 결과 아래 표3과 같은 결과를 얻었다. 표3 에서 보이는 바와 같이 NB12은 실험에 사용된 식물병원균중 Rhizoctonia solani AG4를 제외한 모든 균에서 생육저지 효과를 가지며 특히, 잿빛곰팡이병균 (Botrytis cineriea), 역병균 (Phytophthora capsici), 탄저병균 (Colletotrichum acutatum), Pyhium ultimum에서 대해서 가장 강력한 생육저지효과가 나타난다.
슈도모나스 푸티다 NB12의 식물병원균에 대한 생육저지 효과
식물병원균 항진균 효과 배양온도(℃) 조사일
Rhizoctonia solani AG4 no 28 5
Botrytis cineriea ++++ 28 5
Pythum ultimum ++++ 28 5
Phytophthora capsici +++ 28 7
Fusarium oxysporum ++ 28 7
Colletotrichum acutatum ++++ 28 7
본 발명의 슈도모나스 푸티다 NB12 균주는 다양한 식물 병원균에 광범위한 항균 활성을 가지는 균주로, 농업 생태계 보전과 식물 병원균에 의한 병해에 대한 우수한 방제 효과를 모두 얻을 수 있으므로, 다양한 농업 분야에서의 응용을 기대할 수 있다.
도 1는 슈도모나스 푸티다 NB12의 식물병원균에 대한 길항효과를 보여주는 결과로서, (A)는 탄저병균 (Colletotrichum acutatum), (B)는 피티엄 울티멈 (Pythum ultimum), (C)는 역병균 (Phytophthora capsici), (D)는 라이족토니아 솔라니 AG4 (Rhizoctonia solani AG4), (E)는 잿빛곰팡이병균 (Botrytis cineriea) 및 (F)는 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum)에 대한 길항효과를 나타낸다.

Claims (5)

  1. 수탁번호 KFCC 11414P로 기탁된, 식물 병원균에 대하여 항균활성을 가지는 신규한 슈도모나스 푸티다 NB12 균주.
  2. 제 1 항에 있어서, 식물 병원균이 탄저병균 (Colletotrichum acutatum), 피티엄 울티멈 (Pythum ultimum), 역병균 (Phytophthora capsici), 잿빛곰팡이병균(Botrytis cineriea) 및 푸사리움 옥시스포룸 (Fusarium oxysporum)으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인 균주.
  3. 제 1 항의 슈도모나스 푸티다 NB12 균주, 배양여액, 또는 이들의 혼합물을 포함하는 식물 병원균 억제 조성물.
  4. 제 3 항의 조성물을 식물 또는 토양에 처리하여 식물 병원균의 생육을 억제시키는 방법.
  5. 제 4 항에 있어서, 식물 병원균이 탄저병균, 피티엄 울티멈, 역병균, 잿빛곰팡이병균 및 푸사리움 옥시스포룸으로 이루어진 그룹 중에서 선택되는 것인 방법.
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