KR20090075679A - 악티노마두라 나미비엔시스로부터의 항세균성 및 항바이러스성 펩타이드 - Google Patents

악티노마두라 나미비엔시스로부터의 항세균성 및 항바이러스성 펩타이드 Download PDF

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Abstract

본 발명은 악티노마두라 나미비엔시스(Actinomadura namibiensis)(DSM 6313)로부터 수득가능한 화학식 I의 화합물, 및 세균 감염, 바이러스 감염 및/또는 통증을 치료하기 위한 이의 용도 및 이를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
화학식 I
Figure 112009020078617-PCT00017
상기 화학식 I에서, R3 및 R4는 독립적으로 H 또는 OH이고, m 및 n은 서로 독립적으로 0, 1 또는 2이다. 화학식 I의 화합물은 라비린토펩틴으로 정의되었고, 란티오닌-유사 잔기 및 알파 이치환된 아미노산 유사체를 함유하는 18개 아미노산의 고도로 브릿지된 펩타이드 구조로 이루어져 있다. 아미노산 서열은 XDWXLWEXCXTGXLFAXC이고, 여기서 2개의 Cys 잔기는 이황화 결합을 형성하고 각각의 X는 독립적으로 가교 결합에 포함된 비-천연 아미노산 중 하나를 나타낸다.
악티노마두라 나미비엔시스, 라비린토펩틴, 항세균성, 항바이러스성, 통증 치료

Description

악티노마두라 나미비엔시스로부터의 항세균성 및 항바이러스성 펩타이드{Antibacterial and antiviral peptides from Actinomadura namibiensis}
본 발명은 악티노마두라 나미비엔시스(Actinomadura namibiensis)(DSM 6313)로부터 분리된 신규 펩타이드, 이의 제조방법, 및 세균 감염의 치료, 바이러스 감염의 치료 및/또는 통증 치료를 위한 약제의 제조시 이의 용도에 관한 것이다.
몇가지 고도로 브릿지된 펩타이드, 예를 들면, 옥수수 달팽이(cone snail)로부터 분리된 코노펩타이드(conopeptide)(참조: Terlau & Olivera, Physiol. Rev. 2004, 84, 41-68) 또는 그람-양성 세균기원으로부터의 소위 란티바이오틱(lantibiotic)(참조: Chatterjee et al., Chem. Rev. 2005, 105, 633-683)은 문헌에 공지되어 있다. 상기 펩타이드는 다양한 용도를 지닌다. 란티바이오틱 니신은 다른 용도들 중에서도 수년동안 식품 보존제로서 사용되어 왔다.
코노펩타이드는 예를 들면, 통증, 당뇨병, 다발성 경화증 및 심혈관질환의 치료에 유용하며 현재 전임상 또는 임상 개발중에 있다. 코노펩타이드의 예는 α-GI(서열: ECCNPACGRHYSC*, *아미드화됨, 연결성: 1-3,2-4) 및 α-GID(서열: IRγ CCSNPACRVNNOHVC, 연결성: 1-3,2-4)이며, 여기서, O/Hyp는 하이드록시프롤린이고 연결성은 각각의 특정 이황화 결합에 관련된 시스테인의 위치를 나타내며, 예를 들면, α-GID에서와 같이 첫번째에서 세번째로의 연결 및 두번째에서 네번째로의 연결을 나타낸다.
Figure 112009020078617-PCT00001
(α-GI)
Figure 112009020078617-PCT00002
(α-GID)
발명의 요약
놀랍게도 본 발명에 이르러, 고도로 브릿지된 펩타이드가 미생물 균주 악티노마두라 나미비엔시스(DSM 6313)로부터 분리될 수 있으며 세균 감염, 바이러스 감염 및/또는 통증의 치료에 유용함이 밝혀졌다.
본 발명의 양태는 임의의 입체화학적 형태의 화학식 I의 화합물, 또는 임의의 입체화학적 형태들의 임의의 비의 혼합물, 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염이다.
Figure 112009020078617-PCT00003
상기 화학식 I에서,
R1은 H, C(O)-(C1-C6)알킬 또는 C(O)-O-(C1-C6)알킬이고;
R2는 OH, NH2, NH-(C1-C6)알킬, NH-(C1-C4)알킬렌-페닐 또는 NH-(C1-C4)알킬렌-피리딜이며;
R3 및 R4는 서로 독립적으로 H 또는 OH이거나, R3 및 R4는 함께 =O이고;
m 및 n은 서로 독립적으로 0, 1 또는 2이다.
추가의 양태에서, 화학식 I의 화합물은 화학식 II에 의해 특징지어진다.
Figure 112009020078617-PCT00004
상기 화학식 II에서,
R1, R2, R3, R4, m 및 n은 위에서 정의한 바와 같다.
R1은 바람직하게는 H이다. R2는 바람직하게는 OH다. R3 및 R4는 바람직하게는 H 또는 OH이고, 여기서, R3이 OH인 경우 R4는 H이고, R3이 H인 경우 R4는 OH이거나, R3 및 R4가 함께 =O이다. 보다 바람직하게는, R3 및 R4는 H 또는 OH이고, 여기서, R3이 OH인 경우 R4는 H이고, R3이 H인 경우 R4는 OH이다.
바람직하게는, m 및 n은 둘다 0이거나, m 및 n은 둘다 2이거나, m은 0이고 n은 2이거나, m은 2이고 n은 0이다. 가장 바람직하게는, m 및 n은 둘다 0이다.
본 발명의 추가의 양태는,
R1이 H이고;
R2가 OH이며;
R3 및 R4가 H 또는 OH이고, 여기서, R3이 OH인 경우, R4는 H이고, R3이 H인 경우, R4는 OH이며;
m 및 n이 서로 독립적으로 0, 1 또는 2이고, 바람직하게는 m 및 n이 둘다 0이거나, m 및 n은 둘다 2이거나, m이 0이고 n이 2이거나, m이 2이고 n이 0이며, 특히 바람직하게는 m 및 n이 둘다 0인 화학식 I 또는 화학식 II의 화합물, 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염이다.
가장 바람직하게는, 화학식 I의 화합물은 다음 화학식 III의 화합물에 의해 특징지어진다:
Figure 112009020078617-PCT00005
본 발명의 화합물의 추가의 특성규명을 위해, 펩타이드 잔기를 리보좀 펩타이드 합성으로부터 이들의 가능한 전구체로 역 전환시켰다. 잔기 1번 및 10번에서 알파, 알파-이치환된 아미노산은 문헌에 기술되어 있지 않다. 상기 아미노산은 하기 나타낸 바와 같이 메틸렌 그룹에 의해 브릿지되고 베타-위치에서 치환된 Ala 잔기로서 기술될 수 있다:
Figure 112009020078617-PCT00006
본 발명은 또한 본 발명에 따른 화학식 I, II 및 III의 화합물의 모든 분명한 화학적 등가물에 관한 것이다. 이들 등가물은 약간의 화학적 차이만을 나타내며 동일한 약리학적 효과를 갖거나, 적당한 조건하에 본 발명에 따른 화합물로 전환되는 화합물이다. 상기 등가물은 또한 예를 들면, 화학식 I, II 및 III의 화합물의 염, 환원 생성물, 산화 생성물, 부분 가수분해 과정 에스테르, 에테르, 아세탈 또는 아미드와, 당해 분야의 숙련자가 표준 방법을 사용하여 제조할 수 있는 등가물, 및 이들 외에도, 모든 거울상 이성체 및 부분입체이성체 및 모든 입체이성체 형태를 포함한다.
달리 나타내지 않는 한, 화학식 I의 화합물내 키랄 중심은 R 배위 또는 S 배위로 존재할 수 있다. 본 발명은 에난티오머 혼합물 및 부분입체이성체 혼합물과 같은 입체이성체 혼합물 및 광학적으로 순수한 화합물 둘다에 관한 것이다.
화학식 I, II 및 III의 화합물의 생리학적으로 허용되는 염은 문헌[참조: Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th edition, page 1418 (1985)]에 기술되어 있는 바와 같은, 이들의 유기염 및 이들의 무기 염 둘다로 이해된다. 이들의 물리학적 및 화학적 안정성 및 이들의 가용성으로 인하여, 특히 산성 그룹의 경우에는 나트륨, 칼륨, 칼슘 및 암모늄 염이 바람직하며, 특히 염기성 그룹의 경우에는 염산, 황산 또는 인산의 염, 또는 카복실산, 또는 아세트산, 시트르산, 벤조산, 말레산, 푸마르산, 타르타르산 및 p-톨루엔설폰산과 같은 설폰산의 염이 바람직하 다.
본 발명의 화합물은 전문을 통해 라비린토펩틴(Labyrinthopeptin)으로 명명된다.
본 발명은 또한,
a) 악티노마두라 나미비엔시스 균주(DSM 6313), 또는 이의 변이체 및/또는 돌연변이체 중 하나를, 하나 이상의 화학식 I의 화합물이 배양 배지에 축적될 때까지 적당한 조건하에 배양 배지에서 발효시키는 단계,
b) 화학식 I의 화합물을 상기 배양 배지로부터 분리하는 단계, 및
c) 상기 화학식 I의 화합물을, 경우에 따라 유도체화시키고/시키거나, 경우에 따라, 생리학적으로 허용되는 염으로 전환시키는 단계를 포함하는, 화학식 I의 화합물(여기서, m 및 n은 서로 독립적으로 0, 1 또는 2이다)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
본 발명은 바람직하게는 화학식 I의 화합물의 제조방법에 관한 것이며, 여기서, 화학식 I의 화합물은 화학식 II의 화합물에 의해 특징지어지며, 보다 바람직하게는, 본 발명은 화학식 I의 화합물 또는 바람직하게는 화학식 II의 화합물(여기서, m 및 n은 둘다 0이거나, m 및 n은 둘다 2이거나, 또는 m은 0이고 n은 2이거나, m은 2이고 n은 0이다)을 제조하는 방법에 관한 것이다.
특히 바람직하게는, 본 발명은 바람직하게는 화학식 III의 화합물에 의해 특징지어지는 화학식 I의 화합물의 제조방법에 관한 것이다.
배양 배지는 하나 이상의 통상의 탄소원 및 하나 이상의 질소원과 하나 이상 의 통상의 무기 염을 함유하는 영양 용액 또는 고체 배지이다.
본 발명에 따른 방법은 실험실 규모(밀리리터 내지 리터 규모)의 발효 및 산업 규모(입방 미터 규모)의 발효에 사용될 수 있다.
발효에 적합한 탄소원은 동화가능한 탄수화물, 및 글루코즈, 락토즈, 슈크로즈 또는 D-만니톨과 같은 당 알코올, 및 맥아 추출물 또는 효모 추출물과 같은 탄수화물-함유 천연 생성물이다. 질소-함유 영양물의 예는 아미노산; 펩타이드 및 단백질 및 또한 이들의 분해 생성물, 예를 들면, 카제인, 펩톤 또는 트립톤; 고기 추출물; 효모 추출물; 글루텐; 미분된 종자, 예를 들면, 옥수수, 밀, 콩, 대두 또는 면화 식물로부터의 종자; 알코올 생산으로부터의 증류 잔사; 육류 사료; 효모 추출물; 암모늄 염; 니트레이트이다. 질소원은 합성적으로 또는 생합성적으로 수득된 하나 이상의 펩타이드(들)인 것이 바람직하다. 무기 염의 예는 알칼리 금속, 알칼리 토금속, 철, 아연, 코발트 및 망간의 클로라이드, 카보네이트, 설페이트 또는 포스페이트이다. 미량 원소의 예는 코발트 및 망간이다.
본 발명에 따른 라비린토펩틴을 형성시키는데 특히 적합한 조건은 다음과 같다: 0.05 내지 5%, 바람직하게는 0.1 내지 2.5%의 효모 추출물; 0.2 내지 5.0%, 바람직하게는 0.1 내지 2%의 카시톤; 0.02 내지 1.0%, 바람직하게는 0.05 내지 0.5%의 CaCl2　X 2　H2O; 0.02 내지 1.5%, 바람직하게는 0.05 내지 0.7%의 MgSO4　X 7　H2O 및 0.00001% 내지 0.001%의 시아노코발라민. 제공된 퍼센트 값은 각 경우에 총 영양물 용액의 중량을 기준으로 한다.
미생물은 호기적으로 배양하는데, 즉, 예를 들면, 고체 배지상에서 또는 진 탕 플라스크 또는 발효기 속에서 진탕시키거나 교반하면서 침지시키고, 경우에 따라 공기 또는 산소를 통과시킨다. 미생물은 약 18 내지 35℃, 바람직하게는 약 20 내지 32℃, 특히 27 내지 30℃ 범위의 온도에서 배양할 수 있다. pH 범위는 4 내지 10, 바람직하게는 6.5 내지 7.5이다. 미생물은 일반적으로 상기 조건에서 2 내지 10일, 바람직하게는 72 내지 168　시간 동안 배양된다. 미생물은 몇몇 단계, 즉, 하나 이상의 예비 배양물이 초기에 액체 영양물 배지속에서 제조되는 단계, 및 이들 예비 배양물이 이후에 실제 생산 배지, 즉, 주 배양물속에, 예를 들면, 1:10 내지 1:100의 용적 비로 접종되는 단계로 유리하게 배양된다. 예비 배양물은 예를 들면, 영양세포 또는 포자의 형태의 균주를 영양물 용액속에 접종하고 이를 약 20 내지 120 시간, 바람직하게는 48 내지 96　시간동안 성장시켜 수득된다. 영양세포 및/또는 포자는 예를 들면, 균주를 약 1 내지 15일, 바람직하게는 4 내지 10일 동안, 고체 또는 액체 영양물 기질, 예를 들면, 효모 한천상에서 성장시켜 수득될 수 있다.
라비린토펩틴 유도체는 공지된 방법을 사용하고 천연 물질의 화학적, 물리학적 및 생물학적 특성을 고려하여 배양 배지로부터 분리하고 정제할 수 있다. HPLC는 배양 배지 또는 개개의 분리 단계에서 각각의 라비린토펩틴 유도체의 농도를 시험하고, 형성된 물질의 품질을 편의상 교정 용액과 비교하는데 사용되었다.
분리를 위해, 배양 브로쓰 또는 배양물을 고체 배지와 함께 임의로 동결건조시키고, 유기 용매 또는 바람직하게는 50 내지 90%의 유기 용매를 함유하는 물과 유기 용매의 혼합물을 사용하여 라비린토펩틴 유도체를 동결건조물로부터 추출한 다. 유기 용매의 예는 메탄올 및 2-프로판올이다. 유기 용매상은 본 발명에 따른 천연 물질을 함유하며; 이는 경우에 따라 진공에서 농축하고 추가로 정제한다.
본 발명에 따른 하나 이상의 화합물의 추가의 정제는 적합한 물질, 바람직하게는 예를 들면, 분자체, 실리카 겔, 산화알루미늄, 이온 교환기 또는 흡착 수지 또는 역상(RP)에서 크로마토그래피하여 수행한다. 당해 크로마토그래피는 라비린토펩틴 유도체를 분리하는데 사용된다. 라비린토펩틴 유도체는 완충된, 염기성 또는 산성 수용액 또는 수성 및 유기 용액의 혼합물을 사용하여 크로마토그래피한다.
수성 또는 유기 용액의 혼합물은 약 5 내지 99% 유기 용매, 바람직하게는 5 내지 50% 유기 용매 농도의 모든 수혼화성 유기 용매, 바람직하게는 메탄올, 2-프로판올 또는 아세토니트릴, 또는 또한 유기 용매와 혼화성인 모든 완충된 수용액인 것으로 이해된다. 사용되는 완충액은 위에서 정의한 바와 동일하다.
라비린토펩틴 유도체는 예를 들면, MCI[흡착제 수지, 일본, 미쓰비시(Mitsubishi) 제조원] 또는 앰버라이트(Amberlite) XAD(TOSOHAAS), 또는 기타 소수성 물질, 예를 들면, RP-8 또는 RP-18 상위에서 역상 크로마토그래피에 의해, 이들의 상이한 극성을 기준으로 하여 분리한다. 또한, 분리는 정상 크로마토그래피, 예를 들면, 실리카겔, 산화알루미늄에 의해 수행할 수 있다.
완충된, 염기성 또는 산성 수용액은 예를 들면, 0.5M 이하의 농도의 물, 포스페이트 완충액, 암모늄 아세테이트 및 시트레이트 완충액, 및 포름산, 아세트산, 트리플루오로아세트산, 암모니아 및 트리에틸아민, 또는 바람직하게는 1% 이하의 농도의, 숙련자에게 공지된 모든 시판되는 산 및 염기인 것으로 이해된다. 완충된 수용액의 경우에, 0.1% 암모늄 아세테이트가 특히 바람직하다.
크로마토그래피는 100% 물로부터 개시하여 100% 유기 용매로 종결되는 구배를 사용하여 수행할 수 있으며; 크로마토그래피는 바람직하게는 5 내지 95% 아세토니트릴의 선형 구배로 수행하였다.
또는, 겔 크로마토그래피 또는 소수성 상위에서의 크로마토그래피를 수행하는 것도 또한 가능하다. 겔 크로마토그래피는 예를 들면, 폴리아크릴아미드 겔 또는 공중합체 겔상에서 수행할 수 있다. 상술한 크로마토그래피 단계의 순서는 역전될 수 있다.
지금까지 라비린토펩틴은 입체이성체로 존재하고 있지만, 이들은 공지된 방법, 예를 들면, 키랄 컬럼을 사용하는 분리에 의해 분리할 수 있다.
에스테르 또는 에테르 유도체로의 OH 그룹의 유도체화는 문헌(참조: J. March, Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, 4th edition, 1992)에 공지된 방법, 예를 들면, 산 무수물과의 반응 또는 디-알킬 카보네이트 또는 디-알킬 설페이트와의 반응에 의해 수행된다. COOH 그룹의 에스테르 또는 아미드 유도체로의 유도체화는 문헌(참조: J. March, Advanced Organic Chemistry, John Wiley & Sons, 4th edition, 1992)에 공지된 방법, 예를 들면, 각각의 CONH2 그룹에 대한 암모니아와의 반응, 또는 각각의 알킬 에스테르에 대한 임의로 활성화된 알킬 화합물과의 반응에 의해 수행한다. -CH2-S-CH2- 그룹의 -CH2-S(O)-CH2- 또는 -CH2-S(O)2-CH2- 그룹으로의 산화는 각각의 라비린토펩틴 유도체를 산소 또는 공기에 노출시킬 때 달성될 수 있다.
미생물 균주 악티노마두라 나미비엔시스의 분리주는 1991년 1월 23일자로 부다페스트 조약에 따라 DSM 6313번으로, 독일 38124 브라운슈바이히 마쉐로더 벡 1베 소재의 도이체 잠믈룽 폰 미크로오르가니스멘 운트 첼쿨투렌(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen: 미생물 및 세포 배양물의 독일 수집기관)에 확인 번호 FH-A 1198로 기탁되었다. 미생물 균주 악티노마두라 나미비엔시스는 또한 문헌(참조: Wink et al. in International Journal of Systematic and Evolutionary Microbiology 2003, 53, 721-724)에 기술되어 있다.
균주 악티노마두라 나미비엔시스(DSM 6313) 대신에, 본 발명에 따른 하나 이상의 화합물을 합성하는 이의 돌연변이체 및/또는 변이체를 사용하는 것도 가능하다.
돌연변이체는, 게놈내 하나 이상의 유전자가, 작용 및 유전성을 유지하면서 본 발명에 따른 화합물을 생산할 수 있는 유기체의 능력에 관여하는 유전자 또는 유전자들로 변형된 미생물이다.
이러한 돌연변이체는 익히 공지된 방식으로, 물리적 수단, 예를 들면, 자외선 또는 X-선을 사용하는 조사, 또는 에틸 메탄설포네이트(EMS); 2-하이드록시-4-메톡시벤조페논(MOB) 또는 N-메틸-N'-니트로-N-니트로소구아니딘(MNNG)과 같은 화학 돌연변이유발원을 사용하거나, 또는 문헌[참조: Brock et al., "biology of Microorganisms" Prentice Hall, pages 238-247 (1984)]에 기술된 바와 같이 생산할 수 있다.
변이체는 미생물의 표현형이다. 미생물은 이들의 환경에 적응하는 능력을 지니므로 고도로 발달된 생리학적 유연성을 나타낸다. 미생물의 모든 세포는 표현형 적응에 관여하며, 변화의 특성은 유전적으로 조건화되지 않고 변경된 조건하에서 역전될 수 있다(참조: H.　Stolp, Microbial ecology: organism, habitats, activities. Cambridge University Press, Cambridge, GB, page 180, 1988).
본 발명에 따른 하나 이상의 화합물을 합성하는 돌연변이체 및/또는 변이체의 스크리닝은 발효 배지를 임의로 동결건조시키고 동결건조물 또는 발효 브로쓰를 유기 용매 또는 물과 위에서 정의한 유기 용매의 혼합물을 사용하여 추출하고, HPLC 또는 TLC에 의해 또는 생물학적 활성의 시험에 의해 분석함으로써 달성된다.
발효 조건은 악티노마두라 나미비엔시스(DSM 6313) 및 이의 돌연변이체 및/또는 변이체에 적용될 수 있다.
본 발명의 추가의 양태는 세균 감염, 특히 그람-양성 세균에 의해 유발된 세균 감염의 치료, 바이러스 감염의 치료 및/또는 통증, 특히 신경병증성 통증 또는 염증 유발된 통증의 치료를 위한, 위에서 정의한 바와 같은 화학식 I의 화합물, 바람직하게는 화학식 II 또는 III의 화합물의 용도이다.
위에서 기술한 약제(약제학적 제제 또는 약제학적 조성물로도 언급됨)는 위에서 기술한 바와 같은, 유효량의 임의의 입체화학적 형태의 하나 이상의 화학식 I의 화합물, 또는 임의의 입체화학적 형태들의 임의의 비의 혼합물, 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염 또는 화학적 등가물, 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체, 바람직하게는 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체 물질(또는 비히클) 및/또는 첨가제(또는 부형제)를 함유한다.
약제는 예를 들면, 환제, 정제, 래커(lacquered) 정제, 제피 정제, 입제, 경질 및 연질 젤라틴 캅셀제, 액제, 시럽제, 에멀젼제, 현탁액제 또는 에어로졸 혼합물의 형태로 경구 투여될 수 있다. 그러나, 투여를 또한 예를 들면, 좌제의 형태로 직장에, 또는 주사 액제 또는 주입 액제, 미세과립제, 임플란트(implant) 또는 로드(rod)의 형태로 비경구적으로, 예를 들면, 정맥내, 근육내 또는 피하로, 또는 연고제, 액제 또는 팅크제의 형태로 경피적으로 또는 국소적으로, 또는 예를 들면, 에어로졸 또는 비강 스프레이의 형태로 다른 방식에 의해 투여할 수 있다.
본 발명에 따른 약제는 당해 분야의 숙련자에게 잘 알려지고 익숙한 방식으로 제조되며, 약제학적으로 허용되는 불활성 무기 및/또는 유기 담체 물질 및/또는 첨가제가 위에서 기술한 바와 같은 임의의 입체화학적 형태, 또는 임의의 입체화학적 형태들의 임의의 비의 혼합물, 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염 또는 화학적 등가물과 함께 사용된다. 환제, 정제, 제피 정제 및 경질 젤라틴 캅셀제의 제조를 위해, 예를 들면, 락토즈, 옥수수 전분 또는 이의 유도체, 활석, 스테아르산 또는 이의 염 등을 사용하는 것도 가능하다. 연질 젤라틴 캅셀제 및 좌제용 담체 물질은 예를 들면, 지방, 왁스, 반고체 및 액체 폴리올, 천연 또는 경화 오일 등이다. 액제, 예를 들면, 주사 액제, 또는 에멀젼제 또는 시럽제의 제조에 적합한 담체 물질은 예를 들면, 물, 염수, 알코올, 글리세롤, 폴리올, 슈크로즈, 불활성 당, 글루코즈, 식물성 오일 등이다. 미세캅셀제, 임플란트 또는 로드용으로 적합한 담체 물질은 예를 들면, 글리콜산 및 락트산의 공중합체이다. 약제학적 제제는 일반 적으로 약 0.5 내지 약 90중량%의 화학식 I의 화합물 및/또는 이들의 생리학적으로 허용되는 염 및/또는 이들의 전구약물을 함유한다. 약제내 입체화학적 형태의 화학식 I의 활성 성분, 또는 위에서 기술한 바와 같은, 임의의 입체화학적 형태들의 임의의 비의 혼합물, 또는 생리학적으로 허용되는 염 또는 이의 화학적 등가물의 양은 일반적으로 약 0.5 내지 약 1000mg, 바람직하게는 약 1 내지 약 500mg이다.
위에서 기술한 바와 같이, 임의의 입체화학적 형태의 화학식 I의 활성 성분, 또는 임의의 입체화학적 형태들의 임의의 비의 혼합물, 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염 또는 화학적 등가물, 및 담체 물질외에, 약제학적 제제는 예를 들면, 충전재, 붕해제, 결합제, 윤활제, 습윤제, 안정화제, 유화제, 보존제, 감미제, 착색제, 풍미제, 방향제, 증점제, 희석제, 완충 물질, 용매, 가용화제, 점적 효과를 달성하기 위한 제제, 삼투압을 변경시키기 위한 염, 피복제 또는 항산화제와 같은 하나 이상의 첨가제를 함유할 수 있다. 이들은 또한 2개 이상의 입체화학적 형태의 화학식 I의 화합물, 또는 임의의 입체화학적 형태들의 임의의 비의 혼합물, 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염 또는 화학적 등가물을 함유할 수 있다. 약제학적 제제가 2개 이상의 화학식 I의 화합물을 함유하는 경우에, 개개의 화합물의 선택은 약제학적 제제의 특정한 전체적인 약리학적 프로파일에 목표를 둘 수 있다. 예를 들어, 보다 짧은 작용 지속기간을 갖는 가장 강력한 화합물을 보다 낮은 효능의 지속-작용성 화합물과 혼합할 수 있다. 화학식 I의 화합물에서 치환체의 선택과 관련하여 허용된 유연성은, 화합물의 생물학적 및 물리-화학적 특성 전체에 걸쳐 크게 조절가능하게 하므로 이러한 목적한 화합물을 선택할 수 있게 한다. 또한, 하 나 이상의 화학식 I의 화합물외에, 약제학적 제제는 또한 하나 이상의 다른 치료학적 또는 예방학적 활성 성분을 함유할 수 있다.
화학식 I의 화합물을 사용하는 경우에, 투여량은 광범위한 한계내에서 변할 수 있으며, 의사에게 통상적이고 공지된 바와 같이, 각각의 개개의 경우에 개개의 조건에 적합하여야 한다. 이는 예를 들면, 사용된 특정 화합물, 치료될 질병의 특성 및 중증도, 투여 방식 및 스케줄, 또는 급성 또는 만성 상태의 치료여부 또는 예방이 수행되는지의 여부에 따라 달라진다. 적절한 용량은 의학 분야에 익히 공지된 임상적 접근법을 사용하여 달성할 수 있다. 일반적으로 체중이 약 75kg인 성인에서 바람직한 결과를 달성하기 위한 1일 투여량은 약 0.01 내지 약 100mg/kg, 바람직하게는 약 0.1 내지 약 50mg/kg, 특히 약 0.1 내지 약 10mg/kg(각각의 경우에, 체중 kg당 mg)이다. 1일 투여량은, 특히 비교적 많은 양을 투여하는 경우에는, 수회, 예를 들면 2, 3 또는 4회 투여로 분할될 수 있다. 일반적으로, 개개의 반응에 따라서, 상기 1일 투여량으로부터 상향 또는 하향 변경하는 것도 필요할 수 있다.
실시예 1: 악티노마두라 나미비엔시스(DSM 6313)의 냉동배양물의 제조
100 ml의 배양 배지(1l의 수돗물 중 10 g의 전분, 2 g의 효모 추출물, 10 g의 글루코즈, 10 g의 글리세린, 2.5 g의 콘스팁(cornsteep) 분말, 2 g의 펩톤, 1 g의 NaCl, 3g의 CaCO3, 멸균 전 pH 7.2)에 균주 악티노마두라 나미비엔시스(DSM 6313)를 멸균된 500ml 에를렌마이어(Erlenmeyer) 플라스크 속에 종균배양하고 72시간 동안 27℃ 및 진탕기상에서 120 rpm으로 항온배양하였다. 후속적으로 1ml의 배양물 및 1ml의 멸균 보전 용액(20 g의 글리세린, 10 g의 사카로즈, 70 ml의 탈이온수)을 혼합하고 -80℃에서 저장하였다. 또는, 한천상에서 잘 성장된 배양물의 작은 조각을 1.5 ml의 50% 멸균 글리세린 용액이 들어있는 Cryotubes®[제조원: 반가드 인터네셔날(Vangard International)]로 옮기고 -196℃에서 액체 질소에 저장하였다.
실시예 2: 라비린토펩틴의 제조
실시예 1에 기술된 100ml의 배양 배지를 함유하는 멸균된 500ml 에를렌마이어 플라스크에 한천 플레이트상에서 성장시킨 악티노마두라 나미비엔시스(DSM 6313)의 배양물을 종균배양하고 진탕기상에서 27℃ 및 120rpm으로 항온배양하였다. 72시간 후, 동일한 양의 동일한 배양 배지를 함유하는 추가의 에를렌마이어 플라스크에 2ml의 당해 예비-배양물을 각각 종균배양하고 동일한 조건하에 168시간 동안 항온배양하였다. 또는, 실시예 1에서 기술한 100ml의 배양 배지를 함유하는 300ml의 에를렌마이어 플라스크에 악티노마두라 나미비엔시스(DSM 6313)의 배양물을 종균배양하고 25℃ 및 180rpm에서 항온배양하였다. 72시간 후, 동일한 양의 동일한 배지를 함유하는 추가의 에를렌마이어 플라스크에 5ml의 당해 예비-배양물 각각을 종균배양하고 동일한 조건하에 168시간 동안 항온배양하였다.
실시예 3: 라비린토펩틴의 분리
2% 하이플로 슈퍼-셀 규조토[제조원: 하이플로 슈퍼셀(Hyflo Supercell; VWR, 독일 다름슈타트 소재]를 실시예 2에 따라 함유하는 10l의 배양 브로쓰에 가하고 배양물을 여과기 압력을 통해 여과하여 마이셀(mycel)로부터 배양 용액을 분리하였다. 여액을 1l 앰버라이트 XAD-16 수지(컬럼 직경: 5.5cm, 컬럼 높이: 42cm)를 함유하는 컬럼에 공급하고 5l의 탈이온수 및 5l의 수중 20% 메탄올로 세척하였다. 라비린토펩틴을 5l의 수중 60% 메탄올 및 5l의 수중 80% 메탄올로 용출시켰다. 분획을 함유하는 라비린토펩틴을 HPLC-DAD 및 LC-ESI-MS로 확인하고, 수성 잔사가 수득될 때까지 회전 증발기 상에서 완전히 농축시킨 후 동결-건조시켰다. 300mg의 조 생성물을 수득하였다.
실시예 4: 라비린토펩틴의 다이오드-배열 검출을 사용한 고성능 액체 크로마토그래피(HPLC-DAD)
컬럼: 뉴클레오실 100-C18; 20 + 125mm x 4.6mm, 5μ[제조원: 마체리-나겔(Machery-Nagel)]
이동상: 수중 0.1% H3PO4(용리액 A) 및 아세토니트릴(용리액 B)
용리액 A중 0% 내지 100% 용리액 B의 선형 구배
15분의 기간에 걸쳐
유량: 분당 2 ml
UV/Vis 흡광에 의한 검출로 210, 230, 260, 280, 310, 360, 435 및 500 nm에서 피크를 얻었다.
화학식 II의 라비린토펩틴의 잔류 시간: 7.75분
실시예 5: 라비린토펩틴의 전자분무 이온화 질량 분광법(HPLC-ESI-MS)을 사용한 고성능 액체 크로마토그래피
컬럼: 퓨로스퍼(Purospher) RP-18e; 125 mm x 4 mm, 5μ[제조원: 아질런트(Agilent)]
이동상: 수중 0.1% 트리플루오로아세트산(용리액 A) 및
아세토니트릴 중 0.1% 트리플루오로아세트산(용리액 B)
용리액 A 중 5% 내지 100 % 용리액 B의 선형 구배
10분에 걸쳐
유량: 분당 1.5ml. 질량 분광계의 ES 인터페이스로의 유량은 T 스플리터(splitter)를 통해 분당 0.4ml로 감소되었다.
210nm에서의 UV 흡광 및 ESI-MS (포지티브 모드)에 의한 검출(여기서, 이온 트랩을 질량 분석계로서 사용하였다)
화학식 III의 라비린토펩틴의 잔류 시간은 5.9분이었다. 분자량은 1922Da이었다.
실시예 6: 라비린토펩틴의 정제
실시예 3에 따라 수득된 라비린토펩틴 조 생성물(300mg)을 디메틸설폭사이드, 메탄올 및 물(1:3:6)의 혼합물 속에 용해하고 성분들을 뉴클레오실 100 - C18 컬럼(입자 크기: 10μ, 컬럼 크기: 250 x 16 mm)상에서 등용매 용리액(물 + 0.1% 포름산 / 메탄올 35:65)을 분당 20ml의 유속으로 사용하여 분리하였다. 분획을 HPLC로 분석하였다(참조: 실시예 4). 62 mg의 화학식 III의 라비린토펩틴을 99% 순도로 수득하였다.
실시예 7: 라비린토펩틴(III)의 일반적인 특징
화학식 III의 화합물을 공기에 노출시켜 각각의 설폭사이드로 산화시켰다. 화학식 III의 화합물은 2Asp-3Trp과 11Thr-12Gly 사이에 2개의 시스-아미드를 함유한다.
실시예 8: 고해상 ESI-FTICR-질량 분광법
메탄올 중 화학식 III의 라비린토펩틴의 용액(c = 0.2 mg/ml)을 주사기 펌프를 통해 2㎕/분의 유속으로 전자분무 공급원이 장착된 Bruker Apex III FTICR MS (7T 자석)에 공급시켰다. 스펙트럼을 외삽을 사용하여 포지티브 모드로 기록하였다.
Da에서 측정된 m/z (z=2, M+2Na+ 이온) 984.3333
정확한 단일-동위원소 중성 질량 [M] 1922.6872
C85H110N20O24S4에 대한 이론적 질량 [M] 1922.6885
분자식 C85H110N20O24S4
실시예 9: 아미노산 분석
가수분해: 라비린토펩틴(III)(0.05 mg)을 질소 대기 속에서 6N HCl, 5% 페놀을 사용하여 110℃에서 24시간 동안 가수분해하였다. 가수분해물을 질소 스트림에서 건조시켰다.
비-키랄 GC-MS: 가수분해물을 비스-(트리메틸실릴)트리플루오로-아세트아미드(BSTFA)/아세토니트릴(1:1)과 함께 150℃에서 4시간 동안 가열하였다. GC-MS 실험을 위해, DB5-융합된-실리카-모세관(l = 15 m x 0.25 ㎛의 디메틸-(5%-페닐메틸)-폴리실록산으로 피복된 융합 실리카, df = 0.10 ㎛; 온도 프로그램: T = 65°/3'/6/280℃)을 사용하였다.
키랄 GC-MS: 가수분해물을 에탄올 중 200㎕의 2N HCl로 110℃에서 30분 동안 에스테르화하고 건조시켰다. 후속적으로, 혼합물을 100㎕의 디클로로메탄중 25㎕의 TFAA로 110℃에서 10분 동안 아실화하고 건조시켰다. GC-MS를 위해 융합된-실리카-모세관을 사용하였다[l = 22m x 0.25㎛의 키라실-S-Val로 피복된 융합 실리카, 제조원: 마케리-나겔, df = 0.13㎛; 온도 프로그램: T = 55°/3',2/180℃).
배위
아미노산 1 Ala, 1 Thr, 2 Leu, 1 Asp, 2 Cys, 1 Phe, 1 Glu, 2 Trp, 1 Gly 모두 S-아미노산
실시예 10: NMR 분광법
2-D NMR 스펙트럼(COSY, TOCSY, NOESY, HSQC, HMBC)을 5mm Z-그래드 삼중 공 명 프로브 헤드가 장착된 AMX 600 MHz NMR 분광계[제조원: 브루커(Bruker), 독일 카를스루헤 소재] 및 5mm Z-그래드 광대역 역 프로브헤드가 장착된 DRX500 NMR 분광계(제조원: 브루커, 독일 카를스루헤 소재) 상에서 측정하였다. 다음 표는 측정시 얻어진 시그날을 나타낸다.
DMSO-d6에서 화학식 III의 라비린토펩틴에 대한 NMR 데이터:
1H 0.68; 0.71; 0.75; 0.78; 1.05; 1.07; 1.10; 1.35; 1.40; 1.42; 1.49; 1.90; 1.96; 2.00; 2.10; 2.17; 2.26; 2.77; 2.86; 2.90; 2.97; 3.03; 3.14; 3.16; 3.18; 3.18; 3.20; 3.24; 3.29; 3.30; 3.39; 3.59; 3.67; 3.67; 3.72; 3.99; 4.02; 4.03; 4.10; 4.13; 4.14; 4.16; 4.19; 4.34; 4.36; 4.45; 4.49; 4.59; 6.96; 7,26; 7.00; 7.04; 7.08; 7.08; 7.10; 7.18; 7.22; 7.23; 7.24; 7.24; 7.31; 7.35; 7.36; 7.42; 7.51; 7.53; 7.65; 7.65; 7.69; 7.77; 7.84; 7.98; 8.00; 8.01; 8.56; 10.80; 10.81.
13C 19.7; 21.3; 21.4; 22.6; 23.04; 23.2; 23.7; 26.4; 26.4; 27.1; 33.4; 35.2; 35.4; 36.7; 38.3; 40.0; 40.5; 40.7; 40.8; 40.8; 41.2; 41.2; 43.4; 48.4; 48.7; 49.0; 51.2; 51.4; 52.5; 52.6; 52.7; 53.2; 53.5; 54.0; 56.9; 60.0; 60.3; 66.4; 109.8; 110.6; 111.2; 111.2; 117.4; 118.1; 118.1; 118.2; 120.7; 120.7; 122.1; 123.4; 126.5; 127.2; 127.3; 127.8; 129.4; 136.0; 136.1; 136.6; 140.8; 169.4; 173.0; 174.3; 176.9.
실시예 11: 라비린토펩틴(III)의 X-선 결정학
결정화 조건: 단백질을 0.02 M 트리스 pH 8.2 (농도 7 mg/ml) 속에 용해시켰다. 결정은 증기 드롭 확산(vapour drop diffusion)에 의해 단백질 용액과 60% 에탄올, 0.75% PEG 6000, 0.025 M 나트륨 아세테이트 및 0.05 M 염화나트륨의 용액의 1:1 혼합물로부터 실온에서 성장하였다. 결정은 약 1주내에 성장하였다.
측정: 회전 음극 및 거울 단색파장의 CuK-알파 조사를 사용하여 Bruker 3원 회절계 상에서 X-선 데이터를 수집하였다. 강도는 SMART 6000 CCD 면적 검출기 상에서 수집하였다.
결정 데이터:
화학식 Na N20 C85 S4 O48 Na C85 N20 O24 S4
화학식량 2220.29 1834.82
결정 시스템 사방정계
공간 그룹 P 21 21 2(18번)
단위 셀 치수 a = 41.1360Å
b = 12.8850Å
c = 25.5900Å
셀 용적 13563.66 Å3
Z 4
계산된 밀도 1.087g/cm3
피어슨(Pearson) 코드 oP732
식 유형 NO4P20Q48R85
위코프(Wyckoff) 배열 c181b3a
원자 좌표:
Figure 112009020078617-PCT00007
Figure 112009020078617-PCT00008
Figure 112009020078617-PCT00009
Figure 112009020078617-PCT00010
실시예 12: 라비린토펩틴(III)의 산화
Figure 112009020078617-PCT00011
50 mg의 라비린토펩틴(III)(0.026 mmol)을 1 ml의 DMSO 속에 용해하고 11 mg의 1-하이드록시-1-옥사이드-1,2-벤즈요오독솔-3(1H)-온(IBX, 0.039 mmol)과 함께 실온에서 혼합하였다. 혼합물을 6시간 동안 40℃에서 교반하고 추가로 12시간 동안 실온에서 교반한 후, 역상 HPLC에 의해 Phenomenex Luna® Axia 5㎛ C18 (2) 컬럼(직경: 100 mm x 30 mm)과 XTerra® Prep MS C18 10㎛ 예비-컬럼[제조원: 워터스(Waters), 직경: 19 x 10 mm] 상에서 정제하였다. 수중 5% 내지 95% 아세토니트릴의 구배를 30분에 걸쳐(0.1% 암모늄 아세테이트 함유, pH 7.0) 용리액으로서 사 용하였다. 컬럼 유체(60 ml/분)를 분획화하고 UV 검출하였다. 분획 7 내지 11은 목적한 화합물을 함유하였다. 상기 분획은 동결건조 후 25 mg(50 %)으로 수득되었다. 생성물을 질량 분광법(Bruker Daltonics MicroTof)으로 특성규명하였다.
UV: 222 sh, 278 nm
ESI-MS: MW = 1920.66518 (단일 MW)
분자식: C85H108N20O24S4
분자량(MW) = 1922.2
실시예 13: 라비린토펩틴(III)의 C-말단에서의 펩타이드 합성
Figure 112009020078617-PCT00012
40 mg의 라비린토펩틴(III)(0.021 mmol)을 2 ml의 무수 디메틸포름아미드 속에 용해하고 10 mg (0.045 mmol)의 디-3급-부틸-디카보네이트(Boc2O) 및 7 mg (0.054 mmol)의 디이소프로필에틸아민으로 1시간 동안 실온에서 처리하였다. 후속적으로, 6.8 mg (0.063 mmol)의 벤질아민 및 DMF 중 50㎕(0.072 mmol)의 무수 프로 필 인산의 50% 용액을 가하였다. 반응 혼합물을 XBridge Shield® C18 10㎛ 예비-컬럼(제조원: 워터스, 직경: 19 x 10mm)을 함유하는 Waters XBridge Shield® 5㎛ C18 컬럼(직경: 100 mm x 30 mm) 상에서 역상 HPLC를 통해 정제하였다. 수중 5% 내지 95% 아세토니트릴의 구배를 30분에 걸쳐(0.1% 암모늄 아세테이트 함유, pH 7.0) 용리액으로서 사용하였다. 컬럼 유체(60 ml/분)를 분획화하고 UV 검출하였다. 분획 30 및 31을 합하여 목적 화합물 9.6 mg (22 %)을 수득하였다. 생성물을 질량 분광법(Bruker Daltonics MicroTof)으로 특성규명하였다.
UV: 222 sh, 276 nm
ESI-MS: MW = 2111.79018 (단일 MW)
분자식: C97H125N21O25S4
분자량(MW) = 2113.5
실시예 14: 라비린토펩틴(III)의 N-말단에서의 펩타이드 합성
Figure 112009020078617-PCT00013
5 mg(0.028mmol)의 2-클로로-4,6-디메톡시-1,3,5-트리아진(CDMT)을 2 ml의 무수 디메틸포름아미드 속에 용해하고 8.6 mg (0.085 mmol)의 N-메틸모르폴린(NMM)과 혼합하였다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 3.3mg(0.028mmol)의 n-카프론산을 가하고 혼합물을 추가로 30분 동안 실온에서 교반하였다. 후속적으로, 40mg (0.021 mmol)의 라비린토펩틴(III)을 가하고 수득되는 혼합물을 추가로 2시간 동안 실온에서 교반하였다. 반응 혼합물을 Waters XBridge Shield® 5㎛ C18 컬럼(직경: 100 mm x 30 mm)과 XBridge Shield® C18 10㎛ 예비-컬럼(제조원: 워터스, 직경: 19 x 10mm) 상에서 역상 HPLC를 통해 정제하였다. 수중 5% 내지 95% 아세토니트릴의 구배를 30분에 걸쳐(0.1% 포름산 함유, pH 2.0) 용리액으로서 사용하였다. 컬럼 유체(60 ml/분)를 분획화하고 UV 검출하였다. 분획 38 및 40을 합하여 목적 화합물 11.0 mg (22 %)을 수득하였다. 생성물을 질량 분광법(Bruker Daltonics MicroTof)으로 특성규명하였다.
UV: 220 sh, 278 nm
ESI-MS: MW = 2020.75738 (단일 MW)
분자식: C91H120N20O25S4
분자량(MW) = 2022.3
실시예 15: 항세균 활성
액체 육즙 추출물 브로쓰에서 유기체를 배양한 후, 세균 현탁액을 새로운 배양 배지로 희석시켜 일정한 밀도로 조절하였다(5·105개 유기체/ml).
라비린토펩틴(III)을 용해하고 기하학적 연속 희석(2배)으로 물로 희석시켰다. 개개의 희석 단계에서 1.5 ml의 용액을 13.5 ml의 액체 한천[뮐러-힌톤 한천(Muller-Hinton agar)과 약 45℃에서 혼합하였다.
페트리 디쉬내 최대 화합물 농도는 일반적으로 100 mg/l였다. 화합물이 없는 한천 플레이트를 대조군 역할을 하였다.
배양 배지를 냉각하고 고체화시킨 후, 한천 플레이트에 접종 스폿당 5·104개 콜로니 형성 단위(cfu)를 전달하는 다점 접종기(Multipoint Inoculator)를 사용하여 20개의 상이한 세균 균주를 동시에 접종한 후 37℃에서 17시간 동안 호기성 조건하에 항온배양하였다.
항온배양한 후, 플레이트를 세균 성장이 더 이상 관측되지 않는 최저 화합물 농도에 대해 육안으로 시험하였다. 접종 스폿에서 단일 콜로니 또는 헤이즈 성장(haze growth)은 무시하였다.
항세균 효과는 시험 화합물의 최소 억제 농도(MIC: 세균 성장이 더 이상 육안으로 관측되지 않는 최저 화합물 농도)로 평가하였다:
시험 유기체 MIC
스타필로코커스 아우레우스(Staphylococcus aureus) SG 511 12.5 mg/l
스타필로코커스 아우레우스 285 12.5 mg/l
스타필로코커스 아우레우스 503 3.13 mg/l
스트렙토코커스 피오게네스(Streptococcus pyogenes) 308 A 3.13 mg/l
스트렙토코커스 피오게네스 77 A 3.13 mg/l
스트렙토코커스 파에시움(Streptococcus faecium) D 6.25 mg/l
실시예 16: 항바이러스 활성
바이러스는 살아있는 세포에서만 증식할 수 있다. 따라서, 바이러스 연구는 세포 배양물에서 수행하였다. 바이러스는 감염원 또는 통상적인 생화학적 또는 형태학적 구조물로서의 중요성으로 인하여 선택되었다.
라비린토펩틴(III)의 연속 희석물을 96-웰 미세역가 플레이트에서 제조하였다. 감염 바이러스에 따라서 헬라(Hela) 또는 베로(Vero) 세포를 가하여 배양 24시간 내에 컨플루언트(confluent) 단층을 수득한다. 3시간 동안 항온배양한 후, 각각의 바이러스를 세포에 세포 단층을 2일내에 완전히 파괴하는 것으로 예상되는 농도로 가한다. 배양물을 가스투입된 항온배양기(공기중 5% CO2)에서 37℃에서 항온배양한다. 24시간 후, 세포 배양물내 시험 화합물의 최대 허용 용량(MTD)을 현미경 검사로 평가한다. 결과를 감염되지 않은 조직 대조군 및 상응하는 감염 대조군과 비교하였다:
번호 숙주 유기체 시험 유기체 억제[mg/l]
1 베로 세포 마이코바이러스(Mycovirus) (RNA/인플루엔자 A/Aichi) 44.44
2 헬라 세포 헤르페스 (DNA), 심플렉스 1 133.33
3 베로 세포 헤르페스 (DNA), 심플렉스 2 VR 734 44.44
4 헬라 세포 아데노바이러스(DNA), 5" 133.33
실시예 17: 신경병증성 통증 활성
라비린토펩틴(III)을 신경병증성 통증의 여분의 신경 손상(spared nerve injury: SNI) 마우스 모델에서 연구하여 촉각 이질통에 대한 활성을 입증하였다. 일반적인 마취하에서, 성체 수컷 C57B6 마우스(22.7g ± 0.26SEM)에서 좌골 신경의 2개의 주요 가지를 장딴지 신경 좌측 완전한 부위와 함께 결찰시키고 횡절단하였다. 촉각 이질통을 자동화된 폰 프레이 시험(von Frey test)으로 측정하였다: 덤프 바늘 스틱(dump needle stick)을 사용하여, 뒷발의 발바닥 피부를 5g까지의 증가하는 강도의 압력 자극에 노출시켰다. 동물이 뒷발을 움츠리며 반응하는 시점의 힘(그램)을 촉각 이질통에 대한 판독값으로 사용하였다. 당해 연구는 24시간 후 추가의 측정과 함께 6시간에 걸쳐 신경 병변 후 7일째에 수행하였다. 신경 횡절단 후 2일 이내에, 촉각 이질통은 완전히 발생하였으며 2주 이상에 걸쳐 안정하게 유지되었다. 화합물을 단일 투여(3mg/kg)으로서 정맥내 투여하였다. 정맥내 투여를 위한 비히클로서 1:1:18(에탄올:솔루톨:포스페이트 완충된 염수) 비히클을 선택하였다.
발 움츠림 역치(PWT) 측정을 사용하여 유의적인 치료 효과를 계산하고, 참조 기간(6시간)에 걸쳐 AUC 계산 및 후속적인 % 이익 계산을 수행하였다. 통계적 분석을 위해 동측 뒷발의 PWT 값을 두가지 방식으로 사용하였다: 첫째, 특정 시간(24 시간의 기간내)에 대한 PWT 값을 기준으로 하는 2원 ANOVA 및 둘째, 비-변환된 델타 AUC 값 |AUC1-6시간|에 대한 1원 ANOVA.
반복된 측정(반복 인자: "시간", 분석 변수: PWT)을 사용한 2원 분산분석에 이어 보완적 분석[인자 "시간"(위너 분석: Winer analysis)의 각각의 수준에 대한 인자 "그룹"의 효과, 분석 변수: PWT] 및 인자 "시간"의 각각의 수준에 대한 인자 "처리"에 대한 후속적인 던넷 검정(Dunnett's test)("비히클" 수준에 대한 양측 비교)은 각각의 화합물에 대한 정맥내 투여 후 1 내지 6시간째 비히클 그룹으로부터의 매우 유의적인 차이를 나타내었다. 효과는 투여 24시간후에 사라졌다. 델타 |AUC1-6시간| 값을 사용하는 1원 ANOVA는 p < 0.0001의 p 값을 나타내었다. 던넷 분석은 화합물 둘다에 대한 유의적인 치료 효과를 제공하였다. 처리의 이익 퍼센트는 동측 비히클 그룹(0% 이익)의 |AUC1-6시간| 값 및 모든 3개 그룹(100% 이익 = 최대 가능 효과)의 반대측의 모든 |AUC1-6시간| 값을 사용하여 평가하였다. 이들 한계와 비교하여 라비린토펩틴(III)은 97% 이익을 달성하였다.
결론적으로, 상기 화합물은 신경병증성 통증의 SNI 마우스 모델에서 촉각 이질통을 유의적으로 감소시킨다.
실시예 18: 염증 유발된 통증 활성
라비린토펩틴(III)을 마우스에서 카라기난(carrageenan: CAR) 유발된 뒷발 염증 모델에서 연구하여 염증 유발된 통증에 대한 통상적인 판독값인 열 통각과민에 대한 활성을 입증하였다.
뒷발 염증의 유발: 약간의 일반적인 이소플루란 마취하에, 20㎕의 염수 중 CAR 2%[제조원: 시그마(Sigma), 독일 다이젠호펜 소재]를 수컷 C57B6 마우스의 양 뒷발의 발바닥에 주사하였다. 발 움츠림 잠복기(Paw withdrawal latency: PWL)를, 목적한 뒤발 아래에 적외선 열이 적절히 위치하도록 소형 카메라가 장착된 시판되는 장치[Plantar Test Ugo Basile Biological Research Apparatus, 제조원: 코메리오(Comerio), 이탈리아 소재]를 사용하여 발을 일정한 열 자극에 노출시켜 측정하였다. 마우스를 전체 연구 기간(6 시간) 동안 시험 우리안에 두었다.
열 통각과민의 측정: 연구자는 뒷발에 의해 적외광을 반사하는 기간을 측정하는 타이머를 시작시키고, 동물이 영향을 받은 뒷발을 흔드는 경우에 타이머를 중지시킨다. 조직 손상을 방지하기 위하여 16초에 중지하였다. 연구는 CAR 주사 전 및 주사 후 6시간에 걸쳐 수행하였다. 발 움츠림 잠복기(초)를 추가 분석을 위한 판독값으로 사용하였다.
정맥내 투여를 위한 비히클로서 1:1:18(에탄올: 솔루톨: 포스페이트 완충된 염수) 비히클을 선택하였다.
발 움츠림 잠복기(PWL) 측정을 사용하여 유의적인 치료 효과를 계산하고, 참조 기간(6 시간)에 걸친 AUC 계산 및 후속적인 % 이익 계산을 수행하였다. 통계적 분석을 위해 양쪽 뒷발의 PWL 값을 두가지 방식으로 사용하였다: 첫째, 특정 시간(6시간의 기간내)에 대한 PWT 값을 기준으로 하는 2원 분산분석(ANOVA) 및 둘째, 비-변환된 델타 AUC 값 |AUC1-6시간|에 대한 1원 ANOVA.
반복된 측정(반복 인자: "시간", 분석 변수: PWT)을 사용한 2원 분산분석에 이어 보완적 분석[인자 "시간"(위너 분석: Winer analysis)의 각각의 수준에 대한 인자 "그룹"의 효과, 분석 변수: PWT] 및 인자 "시간"의 각각의 수준에 대한 인자 "용량"에 대한 후속적인 던넷 검정("수준 0 = 비히클"에 대한 양측 비교)은 두 용량에 대한 정맥내 투여 후 1 내지 2시간째 비히클 그룹으로부터의 매우 유의적인 차이를 나타내었다. 효과는 투여 4시간후에 사라졌다. 델타 |AUC1-6시간| 값을 사용하는 1원 ANOVA는 p < 0.0001의 p 값을 나타내었다. 던넷 분석은 용량 둘다에 대한 유의적인 치료 효과를 제공하였다. 치료의 이익 퍼센트는 비히클 그룹(0% 이익)의 |AUC1-6시간| 값 및 CAR을 주사하기 전 모든 |AUC1-6시간| 값(6시간에 걸친 이론적 기준선 = 최대 가능 효과 = 100% 효과)을 사용하여 평가하였다. 이들 한계와 비교하여 1mg/kg 용량 그룹은 37을 달성하였고 10mg/kg 그룹은 34% 이익을 달성하였다.
결론적으로, 상기 화합물은 염증 유발된 통증의 CAR 마우스 모델에서 열 통각과민을 유의적으로 감소시켰다.

Claims (19)

  1. 임의의 입체화학적 형태의 화학식 I의 화합물, 또는 임의의 입체화학적 형태들의 임의의 비의 혼합물, 또는 이의 생리학적으로 허용되는 염.
    화학식 I
    Figure 112009020078617-PCT00014
    상기 화학식 I에서,
    R1은 H, C(O)-(C1-C6)알킬 또는 C(O)-O-(C1-C6)알킬이고;
    R2는 OH, NH2, NH-(C1-C6)알킬, NH-(C1-C4)알킬렌-페닐 또는 NH-(C1-C4)알킬렌-피리딜이며;
    R3 및 R4는 서로 독립적으로 H 또는 OH이거나, R3 및 R4는 함께 =O이고;
    m 및 n은 서로 독립적으로 0, 1 또는 2이다.
  2. 제1항에 있어서, 화학식 II에 의해 특징지어지는 화학식 I의 화합물.
    화학식 II
    Figure 112009020078617-PCT00015
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R1이 H인 화학식 I의 화합물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 OH인 화학식 I의 화합물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R3 및 R4가 H 또는 OH이고, 여기서, R3이 OH인 경우 R4가 H이거나, R3이 H인 경우 R4가 OH이거나, R3 및 R4가 함께 =O인 화학식 I의 화합물.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, R3이 OH이고 R4가 H이거나, R3이 H이고 R4가 OH인 화학식 I의 화합물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, m 및 n이 둘다 0이거나, m 및 n이 둘다 2이거나, m이 0이고 n이 2이거나, m이 2이고 n이 0인 화학식 I의 화합물.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, m 및 n이 둘다 0인 화학식 I의 화합물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 H이고; R2가 OH이며; R3 및 R4가 서로 독립적으로 H 또는 OH이고, 여기서, R3이 OH인 경우 R4는 H이고, R3이 H인 경우 R4는 OH이며; m 및 n이 서로 독립적으로 0, 1 또는 2인 화학식 I의 화합물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 H이고; R2가 OH이며; R3 및 R4가 서로 독립적으로 H 또는 OH이고, 여기서, R3이 OH인 경우 R4는 H이고, R3이 H인 경우 R4는 OH이며; m 및 n이 둘다 0이거나, m 및 n이 둘다 2이거나, m이 0이고 n이 2이거나, m이 2이고 n이 0인 화학식 I의 화합물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, R1이 H이고; R2가 OH이며; R3 및 R4가 서로 독립적으로 H 또는 OH이고, 여기서, R3이 OH인 경우 R4는 H이고, R3이 H인 경우 R4가 OH이며; m 및 n이 둘다 0인 화학식 I의 화합물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 화학식 III의 화합물에 의해 특징지어지는 화학식 I의 화합물.
    화학식 III
    Figure 112009020078617-PCT00016
  13. 1922.6872Da의 단일동위원소 중성 분자량 및 C85H110N20O24S4의 분자식을 특징으로 하는, 악티노마두라 나미비엔시스(Actinomadura namibiensis)(DSM 6313)으로부터 분리된 화합물.
  14. 세균 감염, 바이러스 감염 및/또는 통증 치료용 약제의 제조를 위한, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 화합물의 용도.
  15. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 하나 이상의 화학식 I의 화합물 및 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 성분을 포함하는 약제학적 조성물.
  16. a) 악티노마두라 나미비엔시스 균주(DSM 6313), 또는 이의 변이체 및/또는 돌연변이체 중 하나를, 하나 이상의 화학식 I의 화합물이 배양 배지에 축적될 때까지, 적당한 조건하에 배양 배지에서 발효시키는 단계,
    b) 화학식 I의 화합물을 상기 배양 배지로부터 분리하는 단계, 및
    c) 상기 화학식 I의 화합물을, 경우에 따라 유도체화시키고/시키거나, 경우에 따라, 생리학적으로 허용되는 염으로 전환시키는 단계
    를 포함하는, 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 따른 화학식 I의 화합물의 제조방법.
  17. 제16항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 화학식 II의 화합물에 의해 특징지어지는 제조방법.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 화학식 I의 화합물이 화학식 III의 화합물에 의해 특징지어지는 제조방법.
  19. 제16항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, m 및 n이 둘다 0이거나, m 및 n이 둘다 2이거나, m이 0이고 n이 2이거나, m이 2이고 n이 0인 제조방법.
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