BRPI0719978A2 - Peptídeos antibacterianos e antivirais de actinomadura namibiensis - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "PEPTÍDEOS ANTIBACTERIANOS E ANTIVIRAIS DE ACTINOMADURA NAMIBIENSIS".

Campo da Invenção

A presente invenção refere-se aos novos peptídeos isolados de

Actinomadura namibiensis (DSM 6313), a um método para sua preparação e a seu uso na fabricação de um medicamento para o tratamento de infecções bacterianas, para o tratamento de infecções virais e/ou para o tratamento de dor.

Antecedentes da Invenção

Vários peptídeos altamente em ponte são conhecidos na literatura, por exemplo, conopeptídeos isolados de moluscos em cone (para uma revisão, veja, por exemplo, Terlau e Olivera, Physioi Rev. 2004, 84, 41-68), ou os denominados !antibióticos (Chatterjee et ai, Chem. Rev. 2005, 105, 15 633-683) originados de bactérias Gram-positivas. Os referidos peptídeos possuem várias utilidades. O lantibiótico nisina tem sido usado, entre outras utilidades, como conservante de alimentos há muitos anos.

Os conopeptídeos são, por exemplo, úteis no tratamento de dor, diabetes, esclerose múltipla e doenças cardiovasculares, e atualmente estão 20 em desenvolvimento pré-clínico ou clínico. Exemplos de conopeptídeos são α-GI (seqüência: ECCNPACGRHYSC*, *amidada, conectividade: 1-3,2-4) e α-GID (seqüência: IRyCCSNPACRVNNOHVC, conectividade: 1-3,2-4), em que O/Hyp é hidroxiprolina e a conectividade indica a posição da cisteína envolvida em cada ligação dissulfeto Específica, por exemplo, primeira a ter25 ceira e segunda a quarta, como em.a-GID:

I-s —s-1

H 2N -G Iu -C ys-C ys-A s n-P ro-A Ia-C ys-G Iy-A rg-H is-Ty r-S er-C ys-O H(NH2)

I-S —S-1

(a-GI)

I-S-S-1

H2N-I Ie-Arg-Cys-Cys-Ser-Asn-Pro-Ala-Cys-Arg-Va I-Asn-Asn-Hyp-His-His-Cys-O H

(a-GID). Sumário da Invenção

Verificou-se agora surpreendentemente que peptídeos altamente em ponte podem ser isolados de uma cepa do micro-organismo Actinomadura namibiensis (DSM 6313) e são úteis para o tratamento de infecções bacterianas, infecções virais e/ou dor.

Descrição Detalhada da Invenção

Uma modalidade da presente invenção é um composto da fór

mula (I)

em que:

R1 é H, C(0)-(CrC6)alquila ou C(0)-0-(CrC6)alquila;

R2 é OH, NH2, NH-(CrC6)alquila, NH-(CrC4)alquileno-fenila ou

*

NH-(Ci-C4)alquileno-piridila; '

R3 e R4, independentemente um do outro, são H ou OH, ou R3 e R4 juntos são =0; e m e n são, independentemente um do outro, 0, 1 ou 2;

em qualquer forma estereoquímica, ou uma mistura de quaisquer formas estereoquímicas em qualquer proporção, ou um sal fisiologicamente tolerável destas.

Em uma modalidade adicional, o composto da fórmula (I) é caracterizado por um composto da fórmula (II) em que R1, R2, R3, R4, m e n são como definidos acima. R1 é, de preferência, H. R2 é, de preferência, OH. R3 e R4 são, de preferência, H ou OH, em que, se R3 for OH, então R4 será H, e se R3 for H, então R4 será OH, ou R3 e R4 juntos são =O. De preferência, R3 e R4 são H ou OH, em que, se R3 for OH, então R4 será H1 e se R3 for H, então R4 será OH.

De preferência, m e n são 0, ou m e n são 2, ou m ê O e n é 2, ou m é 2 e n é 0. Prefere-se, principalmente, que m e n sejam ambos 0.

Uma modalidade adicional da presente invenção é um composto da fórmula (I) ou da fórmula (II)1 em que:

R1 é H;

R2 é OH;

R3 e R4 são H ou OH, em que, se R3 for OH, então R4 será H, e se R3 for H, então R4 será OH; e m e n são, independentemente um do outro, 0, 1 ou 2, de prefe

rência m e n são 0, ou m e n são 2, ou m é 0 e n é 2, ou m é 2 e n é 0, preferindo-se particularmente que m e n sejam ambos 0;

ou um sal fisiologicamente tolerável destes.

De preferência, o composto (I) é caracterizado por um composto da fórmula (III) S-S

HO

(III).

Para uma caracterização adicional dos compostos da presente

invenção, os resíduos do peptídeo foram convertidos de volta em seus precursores prováveis da síntese peptídica ribossômica. Os aminoácidos alfa,alfa-dissubstituídos nos resíduos 1 e 10 não têm precedentes na literatura.

O referido aminoácido pode ser descrito como um resíduo Ala em ponte por um grupo metileno e substituído na posição beta, como mostrado abaixo:

H2N-AIa-Asp-Trp-Ala-Leu-Trp-Qu-Ala-Cys-Ala-Thr-Qy-Ala-Leu-Phe-Ala-Ala-Cys-OH

lentes químicos óbvios dos compostos das fórmulas (I), (II) e (III) de acordo com a invenção. Esses equivalentes são compostos que exibem somente 10 uma ligeira diferença química, e possuem o mesmo efeito farmacológico, ou que são convertidos nos compostos de acordo com a invenção sob condições suaves. Os referidos equivalentes também incluem, por exemplo, sais, produtos de redução, produtos de oxidação, ésteres de processos hidrolíticos parciais, éteres, acetais ou amidas dos compostos das fórmulas (I), (II) e 15 (III), além de equivalentes que aqueles versados na técnica podem preparar com o uso de métodos-padrão e, além disso, todos os antípodas e diastereômeros ópticos e todas as formas estereoisoméricas.

S(O)m

S(O)n

S-S

A presente invenção ainda está relacionada a todos os equiva

A menos que indicado de forma diferente, os centros quirais nos compostos da fórmula (I) podem estar presentes na configuração R ou na configuração S. A invenção está relacionada tanto aos compostos opticamente puros quanto às misturas estereoisoméricas como, por exemplo, misturas enantioméricas e misturas diastereoméricas.

Entende-se que sais fisiologicamente tolerados de compostos

das fórmulas (I), (II) e (III) são tanto seus sais orgânicos quanto seus sais inorgânicos, como descritos em "Remington's Pharmaceutical Sciences" (17a edição, página 1418 (1985)). Em função de sua estabilidade física e química e de sua solubilidade, sais de sódio, potássio, cálcio e amônio são preferi10 dos, inter alia, para grupos ácidos; sais de ácido clorídrico, ácido sulfúrico ou ácido fosfórico, ou de ácidos carboxílicos ou ácidos sulfônicos como, por exemplo, ácido acético, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico e ácido p-toluenossulfônico, são preferidos, inter alia, para grupos básicos.

Os compostos da presente invenção foram denominados Labi

rintopeptinas por todo o texto.

A invenção também está relacionada a um processo para a preparação de um composto da fórmula (I), em que: m e n são, independentemente um do outro, 0, 1 ou 2, que compreende:

a) a cepa de Actinomadura namibiensis (DSM 6313), ou uma de

suas variantes é/ou mutantes, sendo fermentadas sob condições adequadas em um meio de cultura, até que um ou mais dos compostos da fórmula (I) se acumulem no meio de cultura,

b) um composto da fórmula (I) sendo isolado do meio de cultura,

e

c) o composto da fórmula (I) sendo derivatizado, quando apropriado, e/ou, quando apropriado, sendo convertido em um sal fisiologicamente tolerado.

De preferência, a invenção está relacionada a um processo para a preparação de um composto da fórmula (I), em que o composto (I) é caracterizado por um composto da fórmula (II), mais preferivelmente, a invenção está relacionada a um processo para a preparação de um composto da fórmula (I) ou preferido (II), em que: m e n são 0, ou m e n são 2, ou m é 0 e n é 2, ou m é 2 e n é 0.

De preferência, particularmente a invenção está relacionada a um processo para a preparação de um composto da fórmula (I), em que: o 5 composto (I) é caracterizado por um composto da fórmula (III).

O meio de cultura é uma solução nutriente ou um meio sólido que contém pelo menos uma fonte convencional de carbono e pelo menos uma fonte de nitrogênio, além de um ou mais sais inorgânicos convencionais.

O processo de acordo com a invenção pode ser usado para a

fermentação em uma escala laboratorial (escala de mililitros a litros) e para a fermentação em uma escala industrial (escala de metros cúbicos).

Fontes de carbono adequadas para a fermentação são carboidratos assimiláveis e alcoóis de açúcar como, por exemplo, glicose, lactose, sacarose ou D-manitol, bem como produtos naturais que contêm carboidratos, tais como extrato de malte ou extrato de levedura. Exemplos de nutrientes que contêm nitrogênio são aminoácidos; peptídeos e proteínas, e também seus produtos de degradação, por exemplo, caseína, peptonas ou triptonas; extratos de carne; extratos de levedura; glúten; sementes moídas, por exemplo, de milho, trigo, grãos, soja ou da planta do algodão; resíduos da destilação da produção de álcool; rações de carne; extratos de levedura; sais de amônio; nitratos. Prefere-se que a fonte de nitrogênio seja um ou mais peptídeos que tenham sido obtidos de forma sintética ou biossintética. Exemplos de sais inorgânicos são cloretos, carbonatos, sulfatos ou fosfatos dos metais alcalinos, dos metais alcalino-terrosos, ferro, zinco, cobalto e manganês. Exemplos de microelementos são cobalto e manganês.

Condições que são especialmente adequadas à formação das Labirintopeptinas de acordo com a invenção são as seguintes: de 0,05 a 5%, de preferência de 0,1 a 2,5%, de extrato de levedura; de 0,2 a 5,0%, de pre30 ferência de 0,1 a 2%, de casitona; de 0,02 a 1,0%, de preferência de 0,05 a 0,5%, de CaCI2 χ 2 H2O; de 0,02 a 1,5%, de preferência de 0,05 a 0,7%, de MgSO4 χ 7 H2O e de 0,00001% a 0,001% de cianocobalamina. Os valores de percentagens que são fornecidos são, em cada caso, baseados no peso da solução nutriente total.

O micro-organismo é cultivado aerobicamente, ou seja, por exemplo, submerso durante agitação ou movimentação em frascos de agitação ou fermentadores, ou em meio sólido, quando apropriado, enquanto ar ou oxigênio está sendo passado em seu interior. O micro-organismo pode ser cultivado em uma faixa de temperatura a partir de cerca de 18 a 35°C, de preferência, de cerca de 20 a 32°C, em particular, de 27 a 30°C. A faixa de pH deve estar entre 4 e 10, de preferência entre 6,5 e 7,5. O microorganismo é geralmente cultivado sob essas condições por um período de 2 a 10 dias, de preferência de 72 a 168 horas. O micro-organismo é cultivado vantajosamente em várias etapas, isto é, uma ou mais culturas preliminares são inicialmente preparadas em um meio nutriente líquido, com essas culturas preliminares sendo então inoculadas no verdadeiro meio de produção, isto é, a cultura principal, por exemplo, em uma proporção por volume de 1:10 a 1:100. A cultura preliminar é obtida, por exemplo, por inoculação da cepa, na forma de células vegetativas ou esporos, em uma solução nutriente, e permitindo-se que ela cresça por cerca de 20 a 120 horas, de preferência por cerca de 48 a 96 horas. As células vegetativas e/ou os esporos podem ser obtidos, por exemplo, permitindo-se que a cepa cresça por cerca de

1 a 15 dias, de preferência de 4 a 10 dias, em um substrato nutriente sólido ou líquido, por exemplo, ágarde levedura.

Os derivados de Labirintopeptina podem ser isolados e purificados do meio de cultura com o uso de métodos conhecidos e considerando25 se as propriedades químicas, físicas e biológicas das substâncias naturais. A HPLC foi usada para testar as concentrações dos respectivos derivados de Labirintopeptina no meio de cultura ou nas etapas individuais de isolamento, com a quantidade da substância formada de forma eficaz sendo comparada com uma solução de calibração.

Para o isolamento, o caldo de cultura, ou a cultura juntamente

com o meio sólido, é opcionalmente liofilizado, e os derivados de Labirintopeptina são extraídos do liofilizado com a utilização de um solvente orgânico ou uma mistura de água e um solvente orgânico, de preferência contendo 50-90% de solvente orgânico. Exemplos de solventes orgânicos são metanol e 2-propanol. A fase de solvente orgânico contém as substâncias naturais de acordo com a invenção; ela é concentrada, quando apropriado, em vácuo, e submetida à purificação adicional.

A purificação adicional de um ou mais compostos de acordo com a invenção é efetuada por cromatografia em materiais adequados, de preferência, por exemplo, em peneiras moleculares, em sílica-gel, em óxido de alumínio, em permutadores de íons ou em resinas adsorventes ou em 10 fases reversas (RPs). Essa cromatografia é usada para separar os derivados de Labirintopeptina. Os derivados de Labirintopeptina são submetidos à cromatografia com a utilização de soluções aquosas tamponadas, básicas ou acidificadas, ou misturas de soluções aquosas e orgânicas.

Entende-se que misturas de soluções aquosas ou orgânicas 15 são, todas, solventes orgânicos miscíveis na água, de preferência metanol, 2-propanol ou acetonitrila, em uma concentração de 5 a 99% de solvente orgânico, de preferência de 5 a 50% de solvente orgânico ou, além disso, todas as soluções aquosas tamponadas que sejam miscíveis com solventes orgânicos. Os tampões que devem ser usados são os mesmos que os espe20 cificados acima.

Os derivados de Labirintopeptina são separados com base em suas polaridades diferentes, por meio de cromatografia de fase reversa, por exemplo, em MCI (resina adsorvente, Mitsubishi, Japão) ou Amberlite XAD (TOSOHAAS), ou em outros materiais hidrofóbicos, por exemplo, em fases 25 RP-8 ou RP-18. Além disso, a separação pode ser efetuada por meio de cromatografia de fase normal, por exemplo, em sílica-gel, óxido de alumínio, e similares.

Entende-se que soluções aquosas tamponadas, básicas ou acidificadas são, por exemplo, água, tampão de fosfato, acetato de amônio e tampão de citrato, em uma concentração de até 0,5 M, bem como ácido fórmico, ácido acético, ácido trifluoracético, amônia e trietilamina, ou todos os ácidos e bases disponíveis comercialmente conhecidos por aqueles versados na técnica, de preferência em uma concentração de até 1%. No caso de soluções aquosas tamponadas, é dada preferência particular ao acetato de amônio0,1%.

A cromatografia pode ser realizada com o uso de um gradiente 5 que começava com 100% de água e terminava com 100% de solvente orgânico; a cromatografia foi executada, de preferência, com um gradiente linear de 5 a 95% de acetonitrila.

Alternativamente, também é possível realizar uma cromatografia em gel ou cromatografia em fases hidrofóbicas. A cromatografia em gel, por exemplo, pode ser efetuada em géis de poliacrilamida ou géis de copolímero. A seqüência das etapas cromatográficas mencionadas acima pode ser invertida.

Na medida em que as Labirintopeptinas estejam presentes como estereoisômeros, elas podem ser separadas com a utilização de métodos conhecidos, por exemplo, por meio de separação com o uso de uma coluna quiral.

A derivatização do grupo OH em um derivado éster ou éter é efetuada com o uso de métodos que são conhecidos per se (J. March, "Advanced Organic Chemistry", John Wiley & Sons, 4a edição, 1992), por exem20 pio, por meio da reação com um anidrido ácido, ou por reação com um carbonato de dialquila ou sulfato de dialquila . A derivatização do grupo COOH em um derivado éster ou amida é efetuada com o uso de métodos que são conhecidos per se (J. March, "Advanced Organic Chemistry", John Wiley & Sons, 4a edição, 1992), por exemplo, por meio da reação com amônia até o 25 respectivo grupo CONH2, ou com um composto alquila opcionalmente ativado no respectivo éster de alquila. A oxidação de grupos -CH2-S-CH2- em um grupo -CH2-S(O)-CH2- ou em um grupo -CH2-S(O)2-CH2- pode ser obtida mediante exposição do respectivo derivado de Labirintopeptina ao oxigênio ou ao ar.

Um isolado da cepa do micro-organismo Actinomadura namibi

ensis foi depositado sob a referência de identificação FH-A 1198 no "Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen" ["German Collection of Micro-organismos and Cell Cultures"] GmbH (DSMZ), Mascheroder Weg 1B, 38124 Braunschweig1 Alemanha, de acordo com as regras do tratado de Budapeste, em 23 de janeiro de 1991 sob o seguinte número: DSM 6313. A cepa do micro-organismo Actinomadura namibiensis é ainda descrita por 5 Wink et ai no International Journal of Systematic and Evolutionary MierobioIogy 2003, 53, 721-724.

Em vez da cepa de Actinomadura namibiensis (DSM 6313), também é possível usar seus mutantes e/ou variantes que sintetizam um ou mais compostos de acordo com a invenção.

Um mutante é um micro-organismo no qual um ou mais genes

no genoma foi modificado, com o gene, ou os genes, que são responsáveis pela habilidade do organismo para produzir o composto de acordo com a invenção, permanecendo funcional e hereditário.

Esses mutantes podem ser produzidos, de uma forma conheci15 da per se, com o uso de meios físicos, por exemplo, irradiação, por exemplo, com raios ultravioletas ou raios X, por mutágenos químicos, por exemplo, metanossulfonato de etila (EMS); 2 hidróxi-4-metoxibenzofenona (MOB) ou N-metil-N’-nitro-N-nitrosoguanidina (MNNG), ou como descrito por Brock et al em "Biology of Micro-organisms", Prentice Hall, páginas 238-247 (1984).

Uma variante é um fenótipo do micro-organismo. Micro

organismos possuem a habilidade para se adaptar ao seu ambiente e, portanto, exibir flexibilidade fisiológica altamente desenvolvida. Todas as células do micro-organismo estão envolvidas na adaptação fenotípica, com a natureza da alteração não estando geneticamente condicionada e sendo reversí25 vel sob condições alteradas (H. Stolp, Microbial ecology: organism, habitats, activities. Cambridge University Press, Cambridge, GB, página 180, 1988).

A separação de mutantes e/ou variantes que sintetizam um ou mais compostos de acordo com a invenção é obtido liofilizando-se opcionalmente o meio de fermentação e extraindo-se o liofilizado ou o caldo de fer30 mentação com um solvente orgânico ou uma mistura de água e um solvente orgânico, como definido acima, e analisando-se por meio de HPLC ou TLC ou por teste da atividade biológica. As condições de fermentação podem ser aplicadas a Actinomadura namibiensis (DSM 6313) e para mutantes e/ou variantes deste.

Uma modalidade adicional da presente invenção é o uso de um composto da fórmula (I), de preferência um composto da fórmula (II) ou (III), 5 como definidos acima, para o tratamento de infecções bacterianas, especialmente infecções bacterianas causadas por bactérias Gram-positivas, para o tratamento de infecções virais e/ou para o tratamento de dor, especialmente dor neuropática ou dor de origem inflamatória.

O medicamento descrito acima (também, denominado prepara10 ção farmacêutica ou composição farmacêutica) contém uma quantidade eficaz de pelo menos um composto da fórmula (I), em qualquer forma estereoquímica, ou uma mistura de quaisquer formas estereoquímicas em qualquer proporção, ou um sal fisiologicamente tolerável ou equivalente químico deste, como descrito acima, e pelo menos um veículo farmaceuticamente acei15 tável, de preferência uma ou mais substâncias transportadoras (ou veículos) e/ou aditivos (ou excipientes) farmaceuticamente aceitáveis.

O medicamento pode ser administrado por via oral, por exemplo, na forma de pílulas, comprimidos, comprimidos laqueados, comprimidos revestidos, grânulos, cápsulas de gelatina dura e macia, soluções, xaropes, 20 emulsões, suspensões ou misturas em aerossol. A administração, no entanto, também pode ser realizada por via retal, por exemplo, na forma de supositórios, ou parenteralmente, por exemplo, por via intravenosa, intramuscular ou subcutânea, na forma de soluções para injeção ou soluções para infusão, microcápsulas, implantes ou bastonetes, ou por via percutânea ou tópica, 25 por exemplo, na forma de pomadas, soluções ou tinturas, ou em outras formas, por exemplo, na forma de aerossóis ou sprays nasais.

Os medicamentos de acordo com a invenção são preparados de uma forma conhecida per se e familiar por aqueles versados na técnica, sendo usadas substâncias transportadoras e/ou aditivos inorgânicos e/ou 30 orgânicos inertes farmaceuticamente aceitáveis, além do(s) composto(s) das fórmulas (I) em qualquer forma estereoquímica, ou uma mistura de quaisquer formas estereoquímicas em qualquer proporção, ou um sal fisiologicamente tolerável ou equivalente químico deste, como descrito acima. Para a produção de pílulas, comprimidos, comprimidos revestidos e cápsulas de gelatina rígida, é possível usar, por exemplo, lactose, amido de milho ou derivados deste, talco, ácido esteárico ou seus sais etc. Substâncias transportadoras para cápsulas de gelatina macia e supositórios são, por exemplo, gorduras, ceras, polióis semissólidos e líquidos, óleos naturais ou endurecidos etc. Substâncias transportadoras adequadas para a produção de soluções, por exemplo, soluções para injeção, ou de emulsões ou xaropes são, por exemplo, água, solução salina, alcoóis, glicerol, polióis, sacarose, açúcar invertido, glicose, óleos vegetais etc. Substâncias transportadoras adequadas para microcápsulas, implantes ou bastonetes são, por exemplo, copolímeros de ácido glicólico e ácido lático. As preparações farmacêuticas normalmente contêm cerca de 0,5 a cerca de 90% em peso de um composto da fórmula (I) e/ou seus sais fisiologicamente aceitáveis e/ou seus prófármacos. A quantidade do ingrediente ativo da fórmula (I) em qualquer forma estereoquímica, ou em uma mistura de quaisquer formas estereoquímicas em qualquer proporção, ou em um sal fisiologicamente tolerável ou equivalente químico deste, como descrito acima, nos medicamentos, normalmente é de cerca de 0,5 a cerca de 1.000 mg, de preferência de cerca de 1 a cerca de 500 mg.

Além dos ingredientes ativos da fórmula (I) em qualquer forma estereoquímica, ou uma mistura de quaisquer formas estereoquímicas em qualquer proporção, ou um sal fisiologicamente tolerável ou equivalente químico deste, como descrito acima, e das substâncias transportadoras, as 25 preparações farmacêuticas podem conter um ou mais aditivos como, por exemplo, agentes de enchimento, desintegrantes, aglutinantes, lubrificantes, agentes umidificantes, estabilizantes, emulsificantes, conservantes, adoçantes, corantes, flavorizantes, aromatizantes, espessantes, diluentes, substâncias de tamponamento, solventes, solubilizantes, agentes para obtenção de 30 um efeito de depósito, sais para alteração da pressão osmótica, agentes de revestimento ou antioxidantes. Elas também podem conter dois ou mais compostos da fórmula (I) em qualquer forma estereoquímica, ou uma mistura de quaisquer formas estereoquímicas em qualquer proporção, ou um sal fisiologicamente tolerável ou equivalente químico deste. Caso uma preparação farmacêutica contenha dois ou mais compostos da fórmula (I), a seleção dos compostos individuais poderá ter como objetivo um perfil farmacológiço 5 global específico da preparação farmacêutica. Por exemplo, um composto altamente potente com uma duração de ação mais curta pode ser combinado com um composto de longa ação de potência menor. A flexibilidade permitida com relação à escolha de substituintes nos compostos da fórmula (I) permite um grau maior de controle sobre as propriedades biológicas e físico10 químicas dos compostos e, dessa forma, permite a seleção desses compostos desejados. Além disso, além de pelo menos um composto da fórmula (I), as preparações farmacêuticas também podem conter um ou mais outros ingredientes terapêutica ou profilaticamente ativos.

Quando se utilizam os compostos das fórmulas (I), a dose pode variar dentro de limites amplos e, como é comum e conhecido pelos médicos, deve ser adaptada às condições individuais de cada caso individual. Ela depende, por exemplo, do composto específico empregado, da natureza e da gravidade da doença a ser tratada, do modo e do esquema de administração, ou se está sendo tratada uma condição aguda ou crônica ou se está sendo feita a profilaxia. Pode ser estabelecida uma dosagem apropriada com a utilização de abordagens clínicas conhecidas na técnica médica. Em geral, a dose diária para a obtenção dos resultados desejados em um adulto pesando cerca de 75 kg é de cerca de 0,01 a cerca de 100 mg/kg, de preferência de cerca de 0,1 a cerca de 50 mg/kg, em particular, de cerca de 0,1 a cerca de 10 mg/kg (em cada caso, em mg por kg de peso corporal). A dose diária pode ser dividida, em particular no caso da administração de quantidades relativamente grandes, em várias administrações parciais, por exemplo, 2, 3 ou 4. Como é comum, dependendo do comportamento individual, pode ser necessário se desviar para mais ou para menos da dose diária indicada.

Exemplo 1: Preparação de uma criocultura de Actinomadura namibiensis (DSM 6313) Cem m! de meio de cultura (10 g de amido, 2 g de extrato de levedura, 10 g de glicose, 10 g de glicerina, 2,5 g de pó de milho macerado, 2 g de peptona, 1 g de NaCI1 3 g de CaCO3 em 1 I de água de torneira, pH 7,2, antes da esterilização) foram semeados com a cepa de Actinomadura nami5 biensis (DSM 6313) em um frasco de Erlenmeyer estéril de 500 ml e incubados por 72 horas a 27°C e 120 rpm em um agitador. Subsequentemente, 1 ml da cultura e 1 ml de solução de conservação estéril (20 g glicerina, 10 g de sacarose, 70 ml de água deionizada) foram misturados e armazenados a -80°C. Alternativamente, pequenos pedaços de uma cultura bem desenvol10 vida em ágar foram transferidos para Cryotubes® (Vangard International) com 1,5 ml de solução estéril de glicerina a 50% e armazenados a -196°C em nitrogênio líquido.

Exemplo 2: Preparação de Labirintopeptinas

Um frasco de Erlenmeyer estéril de 500 ml contendo 100 ml do meio de cultura descrito no Exemplo 1 foi semeado com uma cultura de Actinomadura namibiensis (DSM 6313) que foi desenvolvida em uma placa de ágar e foi incubada a 27°C e 120 rpm em um agitador. Após 72 horas, mais frascos de Erlenmeyer contendo o mesmo meio de cultura na mesma quantidade foram semeados com 2 ml dessa pré-cultura cada, e incubados sob condições idênticas por 168 horas. Alternativamente, um frasco de Erlenmeyer de 300 ml contendo 100 ml do meio de cultura descrito no Exemplo 1 foi semeado com uma cultura de Aetinomadura namibiensis (DSM 6313) e incubado a 25°C e 180 rpm. Após 72 horas, mais frascos de Erlenmeyer contendo o mesmo meio de cultura na mesma quantidade foram semeados com 5 ml dessa pré-cultura cada, e incubados sob condições idênticas por 168 horas.

Exemplo 3: Isolamento de Labirintopeptinas

Terra diatomácea Hyflo Super-cel a 2% (Hyflo Supercell; VWR, Darmstadt, Alemanha) foi adicionada a 10 I do caldo de cultura de acordo com Exemplo 2, e a cultura foi filtrada através de uma prensa de filtro a fim de separar a solução de cultura dos micélios. O filtrado foi adicionado em uma coluna contendo 1 I da resina Amberlite XAD-16 (diâmetro da coluna: 5,5 cm, altura da coluna: 42 cm), e lavado com 5 I de água deionizada e 5 I de metanol 20% em água. A Labirintopeptina foi eluída com 5 I de metanol 60% em água e 5 I de metanol 80% em água. As frações contendo Labirintopeptina foram identificadas por HPLC-DAD e LC-ESI-MS, concentradas 5 coletivamente em um evaporador rotatório até que fosse obtido um resíduo aquoso, e subsequentemente liofilizadas. Foram obtidos 300 mg de produto bruto.

Exemplo 4: Cromatografia líquida de alto desempenho com detecção de arranjo de diodo (HPLC-DAD) de Labirintopeptinas Coluna: Nucleosif 100 - C18; 20 + 125 mm χ 4,6 mm, 5 μ (Ma

chery-Nagel).

Fase móvel: H3PO4 a 0,1% em água (Eluente A) e acetonitrila (Eluente B); gradiente linear de 0% a 100% de Eluente B em Eluente A ao longo de um período de 15 minutos.

Fluxo: 2 ml por minuto.

Detecção por absorção UV/Vis gerou picos em 210, 230, 260, 280, 310, 360, 435 e 500 nm.

O tempo de retenção da Labirintopeptina da fórmula (II): 7,75

minutos.

Exemplo 5: Cromatografia líquida de alto desempenho com espectroscopia de massa com ionizacão por eletrosprav (HPLC-ESI-MS) de Labirintopeptinas

Coluna: Purospher RP-18e; 125 mm ( 4 mm, 5 μ (Agilent).

Fase móvel: ácido trifluoracético a 0,1% em água (Eluente A) e ácido trifluoracético a 0,1% em acetonitrila (Eluente B); gradiente linear de 5% a 100% do Eluente B em Eluente A, ao longo de um período de 10 minutos.

Fluxo: 1,5 ml por minuto. O fluxo da interface ES do espectrômetro de massa foi reduzido para 0,4 ml por minuto por meio de um divisor em "T".

Detecção por absorção UV a 210 nm e ESI-MS (modo positivo), em que: uma captura de íonsfoi usada como analisadorde massa. O tempo de retenção da Labirintopeptina da fórmula (III) foi de 5,9 minutos. A massa molecular foi de 1.922 Da.

Exemplo 6: Purificação de Labirintopeptinas

O produto bruto de Labirintopeptina obtido de acordo com o E5 xemplo 3 (300 mg) foi dissolvido em uma mistura de sulfóxido de dimetila, metanol e água (1:3:6), e os componentes foram separados por meio de cromatografia em uma coluna Nucleosil 100 - C18 (tamanho de partícula: 10 μ, tamanho da coluna: 250 (16 mm) usando eluição isocrática (água + ácido fórmico 0,1% / metanol 35:65) em uma taxa de fluxo de 20 ml por minuto. As 10 frações foram analisadas com HPLC (conforme o Exemplo 4). Foram obtidos 62 mg de Labirintopeptina da fórmula (III) em 99% de pureza.

Exemplo 7: Características gerais de Labirintopeptina (III)

O composto da fórmula (III) foi oxidado mediante exposição ao ar nos respectivos sulfóxidos. O composto da fórmula (III) contém 2 αεί 5 amidas entre 2Asp-3Trp e 11 Thr-12Gly.

Exemplo 8: ESl-FTICR-espectrometria de massa de alta resolução

Uma solução da Labirintopeptina da fórmula (III) em metanol (c = 0,2 mg/ml) foi introduzida através de uma bomba de seringa em uma taxa de fluxo de 2 μΙ/min a um Bruker Apex NI FTICR MS (imã de 7T) equipado com uma fonte de eletrospray. Os espectros foram registrados no modo positivo com a utilização de uma calibração externa.

m/z observada em Da (z = 2, M + 2 íons de Na+) 984,3333 Exato, massa monoisotópica de neutro [M] 1922,6872 Massa teórica [M] para C85H110N20O24S4 1922,6885 Fórmula molecular C85H110N20O24S4 Exemplo 9: Análise de Aminoácidos

Hidrólise: Labirintopeptina (III) (0,05 mg) foi hidrolisada em atmosfera de nitrogênio com HCI a 6 N, fenol a 5% a 1100C por 24 horas. O hidrolisado foi seco em um jato de nitrogênio.

GC-MS aquiral: o hidrolisado foi aquecido com bis-(trimetilsilil)trifluoracetamida (BSTFA)/acetonitrila (1:1) a 150°C por 4 h. Para experimentos de GC-MS, foi usado um capilar de sílica fundida a DB5 (I = 15 m χ 0,25 pm de sílica fundida revestida com dimetil-(5%-fenilmetil)-polissiloxano, df = 0,10 μηη; foi usado um programa de temperatura: T = 65°/376/280°C).

GC-MS quiral: o hidrolisado foi esterificado com 200 μΙ de HCI a

2 N em etanol a IlO0C por 30 min e seco. Subsequentemente, a mistura foi acilada com 25 μΙ de TFAA em 100 μΙ de diclorometano a 110°C por 10 minutos e seca. Para GC-MS, foi usado um capilar de sílica fundida (I = 22 m χ 0,25 μιτι de sílica fundida revestida com chirasil-S-Val (Machery-Nagel), df =

0,13 μιη; programa de temperatura: T = 557373,2/180°C).

Configuração Aminoácidos 1 Ala, 1 Thr, 2 Leu, 1 Asp, 2 Cys, 1 Phe, Todos S-aminoácidos 1 Glu1 2 Trp, 1 Gly Exemplo 10: Espectroscopia por RMN

Os espectros 2-D por RMN (COSY, TOCSY, NOESY1 HSQC, 10 HMBC) foram medidos em um espectrômetro de RMN de 600 MHz AMX (Bruker, Karlsruhe, Alemanha) equipado com uma leitora da sonda de ressonância tripla de 5 mm Z-Grad e em um espectrômetro de RMN DRX500 (Bruker, Karlsruhe, Alemanha) equipado com uma leitora da sonda inversa de banda ampla de 5 mm Z-Grad. A tabela a seguir mostra os sinais obtidos 15 nas medidas.

Dados da RMN para a Labirintopeptina da fórmula (NI) em DM

SO-d6:

1H 0,68; 0,71; 0,75; 0,78; 1,05; 1,07; 1,10; 1,35; 1,40; 1,42; 1,49; 1,90; 1,96 2,00; 2,10; 2,17; 2,26; 2,77; 2,86; 2,90; 2,97; 3,03; 3,14; 3,16; 3,18; 3,18 3,20; 3,24; 3,29; 3,30; 3,39; 3,59; 3,67; 3,67; 3,72; 3,99; 4,02; 4,03; 4,10 4,13; 4,14; 4,16; 4,19; 4,34; 4,36; 4,45; 4,49; 4,59; 6,96; 7,26; 7,00; 7,04 7,08; 7,08; 7,10; 7,18; 7,22; 7,23; 7,24; 7,24; 7,31; 7,35; 7,36; 7,42; 7,51 7,53; 7,65; 7,65; 7,69; 7,77; 7,84; 7,98; 8,00; 8,01; 8,56; 10,80; 10,81, 13C 19,7; 21,3; 21,4; 22,6; 23,04; 23,2; 23,7; 26,4; 26,4; 27,1; 33,4; 35,2; 35,4 36,7; 38,3; 40,0; 40,5; 40,7; 40,8; 40,8; 41,2; 41,2; 43,4; 48,4; 48,7; 49,0 51,2; 51,4; 52,5; 52,6; 52,7; 53,2; 53,5; 54,0; 56,9; 60,0; 60,3; 66,4; 109,8 110,6; 111,2; 111,2; 117,4; 118,1; 118,1; 118,2; 120,7; 120,7; 122,1 123,4; 126,5; 127,2; 127,3; 127,8; 129,4; 136,0; 136,1; 136,6; 140,8 169,4; 173,0; 174,3; 176,9, Exemplo 11: Cristalografia por raios X de Labirintopeptina (III)

Condições de cristalização: a proteína foi dissolvida em Tris a 0,02 M pH 8,2 (concentração de 7 mg/ml). Os cristais cresceram em temperatura ambiente por difusão de gota de vapor de uma mistura 1:1 da solução de proteína com uma solução de etanol a 60%, PEG 6000 a 0,75%, acetato de sódio a 0,025 M e cloreto de sódio a 0,05 M. Os cristais cresceram em cerca de uma semana.

Medida: os dados de raios X foram coletados em um difratômetro de 3 círculos Bruker com anodo rotatório e radiação CuK-alfa monocromada em especular. As intensidades foram coletadas em um detector de área SMART 6000 CCD.

Dados dos cristais:

Fórmula Na N20 Ce5 S4 O48 Na Cs5 N20 O24 S4 Peso da fórmula 2220,29 1834,82 Sistema cristal ortorrômbico Grupo de espaço P21 21 2 (n° 18) Dimensões da célula unitária a = 41,1360 A b = 12,8850 Â c = 25,5900 A Volume da célula 13563,66 A3 Z 4 Densidade, calculada 1,087 g/cm3 Código de Pearson oP732 Tipo de fórmula N04P20Q48R85 Seqüência de Wyckoff c1B1b3a Coordenadas atômicas:

N0 Átomo N0 do átomo X y Z Densidade e' 0 Na NA 0,26282 1,11533 -0,20024 1,0 1 N 18NH 0,16643 0,62593 0,30751 2 C 18Ca 0,15933 0,69120 0,26221 3 C 18Cb 0,12264 0,69329 0,24928 4 S 18Sg 0,11248 0,78619 0,19945 C 18CO 0,16446 0,80225 0,28144 6 O 180C1 0,15211 0,83361 0,32212 7 O 180C3 0,17868 0,86558 0,25381 0,290 8 O 180C2 0,18240 0,86116 0,25780 0,710 9 N 17NH2 0,17255 0,50082 0,39461 0,570 C 17Ca2 0,19839 0,49670 0,35604 0,570 11 N 17NH1 0,17994 0,49779 0,40196 0,430 12 C 17Ca1 0,20056 0,49833 0,35678 0,430 13 C 17Cb 0,20165 0,38479 0,33630 1,0 14 S 13S1 0,16523 0,32006 0,32001 C 17CO 0,19312 0,57036 0,31036 16 O 170C 0,21276 0,57136 0,27366 17 N 16NH1 0,11776 0,48825 0,45694 0,570 18 C 16Ca1 0,14725 0,54296 0,47554 0,570 19 C 16Cb2 0,14824 0,52387 0,53451 0,570 N0 Átomo N0 do átomo X y Z Densidade e' C 16C02 0,17744 0,51223 0,44580 0,570 21 O 160C2 0,20586 0,50283 0,46026 0,570 22 N 16NH2 0,12522 0,46605 0,47460 0,430 23 C 16Ca2 0,15695 0,50741 0,49039 0,430 24 C 16Cb1 0,17666 0,42678 0,52110 0,430 C 16C01 0,17829 0,54862 0,44623 0,430 26 O 160C1 0,19399 0,62818 0,45350 0,430 27 N 15NH 0,08606 0,28654 0,38875 1,0 28 C 15Ca 0,08545 0,33846 0,43783 29 C 15Cb 0,07342 0,26519 0,48191 C 15Cg 0,07342 0,31743 0,53443 31 C 15Cd1 0,09641 0,30051 0,57015 32 C 15Ce1 0,09892 0,34692 0,61802 33 C 15Cz 0,07361 0,41607 0,62963 34 C 15Ce2 0,04891 0,43679 0,59512 C 15Cd2 0,04787 0,38914 0,54580 36 C 15C02 0,11795 0,38518 0,45303 0,570 37 O 150C2 0,14083 0,32503 0,46100 0,570 38 C 15C01 0,11985 0,37400 0,45272 0,430 39 O 150C1 0,14260 0,31215 0,44467 0,430 40 N 14NH 0,09663 0,22957 0,28367 1,0 41 C 14Ca 0,06493 0,21832 0,30973 42 C 14Cb 0,05881 0,10260 0,32228 43 C 14Cg 0,06148 0,01917 0,28163 44 C 14Cd1 0,05246 -0,08320 0,30793 45 C 14Cd2 0,04038 0,05153 0,23556 46 C 14CO 0,06073 0,27513 0,35936 47 O 140C 0,03420 0,31036 0,37413 48 N 13NH 0,14348 0,21739 0,21016 49 C 13Ca 0,13259 0,32131 0,22415 50 C 13Cb 0,15887 0,37393 0,25639 51 C 13CO 0,10174 0,31603 0,25729 52 O 130C 0,08431 0,39162 0,25920 53 N 12NH 0,13789 0,04315 0,10383 54 C 12Ca 0,14494 0,06092 0,15913 55 C 12CO 0,12665 0,15374 0,17941 56 O 120C 0,09846 0,17540 0,16440 57 N 11NH 0,18026 0,23392 0,10274 58 C 11 Ca 0,18245 0,14769 0,06491 59 C 11 Cb 0,21437 0,08040 0,07601 60 O 11 Og 0,24067 0,15367 0,06932 N0 Átomo N0 do átomo X y Z Densidade e' 61 C 11Cg 0,21483 -0,00652 0,03877 62 C 11CO 0,15298 0,08188 0,06213 63 O 110C 0,14289 0,05192 0,01723 64 N 10NH 0,15427 0,48630 0,10547 65 C 10Ca 0,15553 0,39216 0,13693 66 C 10Cb 0,12680 0,38774 0,17495 67 C IOCO 0,15563 0,30214 0,09785 68 O 100C 0,13341 0,29174 0,06737 69 N 9NH 0,15921 0,62732 0,02599 70 C 9Ca 0,17078 0,65813 0,07761 71 C 9Cb1 0,15364 0,74568 0,10696 0,650 72 S 9Sg2 0,11348 0,70773 0,12986 0,650 73 C 9Cb2 0,14430 0,73147 0,09699 0,350 74 S 9Sg1 0,15631 0,80140 0,15424 0,350 75 C 9CO 0,17309 0,56593 0,11423 1,0 76 O 90C 0,19300 0,56593 0,15084 77 N 8NH 0,18541 0,52953 -0,09746 78 C 8Ca 0,16349 0,52728 -0,05346 79 C 8Cb 0,15665 0,41428 -0,03791 80 S 4S1 0,14207 0,33194 -0,08922 81 C 8CO 0,17870 0,57819 -0,00528 82 O 80C 0,20763 0,56423 0,00430 83 N 7NH 0,20632 0,49826 -0,20125 84 C 7Ca 0,21045 0,59830 -0,17558 1,0 85 C 7Cb 0,20977 0,68941 -0,21403 86 C 7Cg 0,23965 0,69290 -0,24846 87 C 7 Cd 0,27179 0,70780 -0,21942 88 O 702 0,27356 0,77789 -0,18617 89 O 702 0,29422 0,64688 -0,23185 90 C 7CO 0,18551 0,60947 -0,13036 91 O 70C 0,16934 0,68669 -0,12474 92 N 6NH 0,14508 0,31502 -0,23408 93 C 6Ca 0,17581 0,36438 -0,24779 94 C 6Cb 0,17865 0,38440 -0,30618 95 C 6Cg 0,21065 0,42228 -0,32263 96 C 6Cd1 0,24023 0,37835 -0,31634 97 N 6Ne 0,26396 0,43927 -0,33810 98 C 6Ce2 0,24957 0,52674 -0,35877 99 C 6Cd2 0,21551 0,51704 -0,34959 100 C 6Ce1 0,19382 0,59341 -0,36554 101 C 6Cz1 0,20739 0,67707 -0,39101 N0 Átomo N0 do átomo X y z Densidade e' 102 C 6Ch 0,24169 0,68111 -0,39910 103 C 6Cz2 0,26459 0,61009 -0,38421 104 C 6CO 0,17783 0,46644 -0,21817 105 O 60C 0,15276 0,51859 -0,21294 106 N 5NH 0,09092 0,22755 -0,18031 107 C 5Ca 0,10636 0,17447 -0,22462 108 C 5Cb 0,08579 0,17788 -0,27331 109 C 5Cg1 0,06556 0,08855 -0,29223 0,400 110 C 5Cd2 0,05562 0,00295 -0,25553 0,400 111 C 5CD3 0,03406 0,13232 -0,31950 0,400 112 C 5Cg2 0,05122 0,12511 -0,26843 0,600 113 C 5Cd1 0,05227 0,02119 -0,24021 0,600 114 C 5Cd2 0,03647 0,22422 -0,25795 0,600 115 C 5CO 0,14049 0,21405 -0,23552 1,0 116 O 50C 0,16220 0,15250 -0,24447 117 N 4NH 0,04424 0,29531 -0,10297 118 C 4Ca 0,07828 0,26318 -0,08968 119 C 4Cb 0,09901 0,36213 -0,08847 120 C 4CO 0,09150 0,19084 -0,13193 121 O 40C 0,10378 0,10656 -0,12020 122 N 3NH -0,02049 0,37136 -0,10602 123 C 3Ca -0,01386 0,26387 -0,12087 124 C 3Cb -0,02263 0,24478 -0,17726 125 C 3Cg -0,05642 0,26752 -0,19336 126 C 3Cd1 -0,08244 0,28646 -0,16303 127 N 3Ne -0,10966 0,30431 -0,19328 128 C 3Ce2 -0,10052 0,29888 -0,24451 129 C 3Cd2 -0,06697 0,27528 -0,24627 130 C 3Ce1 -0,05275 0,26512 -0,29539 131 C 3Cz1 -0,07001 0,27753 -0,33970 132 C 3Ch -0,10351 0,30097 -0,33634 133 C 3Cz2 -0,11905 0,31339 -0,29019 134 C 3CO 0,02125 0,22763 -0,11313 135 O 30C 0,02703 0,13349 -0,11547 136 N 2NH 0,00873 0,33093 -0,00078 137 C 2Ca -0,02584 0,34024 -0,01079 138 C 2Cb -0,04293 0,38712 0,03587 139 C 2Cg -0,07852 0,41234 0,02763 140 O 20d1 -0,09430 0,35452 -0,00285 141 O 20d2 -0,09060 0,48825 0,05303 142 C 2CO -0,02912 0,40784 -0,06006 N0 Átomo N0 do átomo X y Z Densidade e‘ 143 O 20C -0,03851 0,49903 -0,05444 144 N 1NH 0,07381 0,20163 0,05701 145 C 1Ca 0,06250 0,25417 0,00903 146 C 1Cb 0,07969 0,20450 -0,03763 147 C 1CO 0,02526 0,24331 0,00649 148 O IOC 0,01235 0,15545 0,00653 Exemplo 12: Oxidação de Labirintopeptina (III)

Cinqüenta mg de Labirintopeptina (III) (0,026 mmol) foram dissolvidos em 1 ml de DMSO e misturados com 11 mg de 1-hidróxi-1-óxido1,2-benziodoxol-3(1H)-ona (IBX, 0,039 mmol) em temperatura ambiente. A 5 mistura foi agitada por 6 h a 40 0C e por mais 12 h em temperatura ambiente, e subsequentemente purificada por HPLC de fase reversa em uma coluna Phenomenex Luna® Axia C18 de 5 pm (2) (dimensão: 100 mm x 30 mm) com uma pré-coluna XTerra® Prep MS C18 de 10 pm (Waters, Dimensão: 19 x 10 mm). Um gradiente de 5% a 95% de acetonitrila em água ao longo de 10 30 min (contendo acetato de amônio 0,1%, pH 7,0) foi usado como o eluente. O fluxo da coluna (60 ml/min) foi fracionado e, por detecção UV, a Fração 7 a 11 continha o composto desejado. As referidas frações geraram 25 mg (50%) após liofilização. O produto foi caracterizado por espectroscopia de massa (Bruker Daltonics MicroTof).

UV: 222 sh, 278 nm ESI-MS: Peso molecular (PM) = 1920,66518 (PM mono)

Fórmula molecular: C85H108N20024S4 Peso molecular (PM) = 1922,2 Exemplo 13: Síntese peotídica na extremidade do terminal C de Labirinto

Quarenta mg de Labirintopeptina (III) (0,021 mmol) foram dissolvidos em 2 ml de dimetilformamida abs., e tratados com 10 mg (0,045 mmol) de di-terc-butil-dicarbonato (Boc2O) e 7 mg (0,054 mmol) de diisopropiletilamina por 1 h em temperatura ambiente. Subsequentemente, 6,8 mg (0,063 mmol) de benzilamina e 50 μί (0,072 mmol) de uma solução 50% de anidrido de ácido propil fosfônico em DMF foram adicionados. A mistura de reação foi purificada por meio de HPLC de fase reversa em uma coluna C18 Waters XBridge Shield® de 5 pm (dimensão: 100 mm x 30 mm) contendo uma pré-coluna C18 XBridge Shield® de 10 pm (Waters, dimensão: 19 x 10 mm). Um gradiente de 5% a 95% de acetonitrila em água ao longo de 30 min (contendo acetato de amônio 0,1%, pH 7,0) foi usado como o eluente. O fluxo da coluna (60 ml/min) foi fracionado e por detecção UV. As frações 30 e 31 foram combinadas e geraram 9,6 mg (22 %) do composto desejado. O produto foi caracterizado por espectroscopia de massa (Bruker Daltonics MicroTof).

UV: 222 sh, 276 nm

ESI-MS: PM = 2111,79018 (PM mono) Fórmula molecular: C97H125N21025S4 Peso molecular (PM) = 2113,5 Exemplo 14: Síntese peptídica na extremidade do terminal N de Labirintopeptinas (III)

H

O

o O -O

Cinco mg (0,028 mmol) de 2-cloro-4,6-dimetóxi-1,3,5-triazina (CDMT) foram dissolvidos em 2 ml de dimetilformamida abs., e misturados com 8,6 mg (0,085 mmol) de N-metilmorfolina (NMM). A mistura foi agitada por 1 h em temperatura ambiente. Foram adicionados 3,3 mg (0,028 mmol) 10 de ácido n-caprônico, e a mistura foi agitada por mais 30 min em temperatura ambiente. Subsequentemente, 40 mg (0,021 mmol) de Labirintopeptina (III) foram adicionados, e a mistura resultante foi agitada por mais 2 h em temperatura ambiente. A mistura de reação foi purificada por meio de HPLC de fase reversa em uma coluna C18 Waters XBridge Shield® de 5 μιη (di15 mensão: 100 mm x 30 mm) com uma pré-coluna C18 XBridge Shield® de 10 μηι (Waters, dimensão: 19 x 10 mm). Um gradiente de 5% a 95% de acetonitrila em água ao longo de 30 min (contendo ácido fórmico 0,1%, pH 2,0) foi usado como o eluente. O fluxo da coluna (60 ml/min) foi fracionado e por detecção UV. As frações 38 a 40 foram combinadas e geraram 11,0 mg (26 20 %) do composto desejado. O produto foi caracterizado por espectroscopia de massa (Bruker Daltonics MicroTof).

UV: 220 sh, 278 nm ESI-MS: PM = 2020,75738 (PM mono)

Fórmula molecular: C91H120N20025S4 Peso molecular (PM) = 2022,3 Exemplo 15: Atividade antibacteriana Após cultivo dos organismos em caldo de extrato de carne líqui

do, as suspensões de bactérias foram ajustadas até uma densidade definida por diluição com meio de cultura fresco (5-105 organismos/ml).

Labirintopeptina (III) foi dissolvida e diluída com água em uma série de diluição geométrica (fator 2). Foi misturado 1,5 ml da solução nas etapas de diluição individuais com 13,5 ml de ágar líquido (ágar de MullerHinton) a aproximadamente 45°C.

A concentração máxima de composto na placa de petri foi normalmente de 100 mg/l. Uma placa de ágar sem composto serviu como um controle.

Após o meio de cultura ter sido resfriado e solidificado, as pla

cas de ágar foram inoculadas simultaneamente com 20 cepas bacterianas diferentes usando um inoculador Multipoint que libera 5-104 unidades de formação de colônias (cfu) por "spot" de inoculação, e depois incubadas a 37°C por 17 horas sob condições aeróbicas.

Após incubação, as placas foram examinadas macroscopica

mente quanto à menor concentração de composto na qual o crescimento bacteriano não era mais visível. Uma colônia única ou um crescimento turvo no "spot" de inoculação era descartado.

O efeito antibacteriano foi avaliado como a Concentração Inibi

dora Mínima do composto de teste (MIC: menor concentração de composto na qual o crescimento bacteriano não é mais visível macroscopicamente):

OrganismodeTeste MIC Staphylococcus aureus SG 511 12,5 mg/l Staphylococcus aureus 285 12,5 mg/l Staphylococcus aureus 503 3,13 mg/l Streptoeoeeus pyogenes 308 A 3,13 mg/l Streptoeoeeus pyogenes 77 A 3,13 mg/l Streptoeoeeus faeeium D 6,25 mg/l Exemplo 16: Atividade Antiviral Os vírus só podem se multiplicar em células vivas. Portanto, foram realizados estudos virais em culturas de células. Os vírus foram selecionados por causa de sua importância como agentes infecciosos ou por estruturas bioquímicas ou morfológicas típicas.

5 Uma série de diluição de Labirintopeptina (III) foi preparada em

placas de microtitulação de 96 cavidades. São adicionadas células Hela ou Vero, de acordo com o vírus infectante, para gerar uma monocamada confluente em até 24 horas de incubação. Após incubação por 3 horas, o respectivo vírus é adicionado às células em uma concentração que suposta10 mente destrói completamente a monocamada de células em até 2 dias. As culturas são incubadas a 37°C em uma incubadora desgaseificada (CO2 a 5% no ar). Após 24 horas, a dose máxima tolerada de composto de teste (MTD) na cultura de células é avaliada por exame microscópico. Os resultados foram comparados com controle de tecido não-infectado e com um con15 trole de infecção correspondente:

N0 Organismo Hospedeiro Organismo de Teste Inibição [mg/l] 1 Células Vero Micovírus (RNA/Influenza A/Aichi) 44,44 2 Células Hela Herpes (DNA), Simples 1 133,33 3 Células Vero Herpes (DNA), Simples 2 VR 734 44,44 4 Células Hela Adenovírus (DNA), 5" 133,33 Exemplo 17: Atividade na Dor Neuropática

A Labirintopeptina (III) foi estudada no modelo em camundongo de lesão nervosa limitada (SNI) de dor neuropática a fim de provar a atividade sobre alodinia tátil. Sob anestesia geral, as duas ramificações principais do nervo ciático em machos adultos de camundongos C57B6 (22,7 g ± 0,26 SEM) foram ligadas e seccionadas, com o nervo sural deixado intacto. A aIodinia tátil foi determinada com 0 teste automático de von Frey: usando uma picada abrupta com agulha, a, pele plantar das patas traseiras foi exposta a um estímulo de pressão de intensidade crescente até 5 g. A força em gramas na qual o animal respondia com retirada da pata traseira foi usada co’ mo uma leitura para alodinia tátil. O estudo foi realizado 7 dias após a lesão nervosa ao longo de 6 horas, com uma medida adicional após 24 horas. Em até dois dias após a secção do nervo, a alodinia tátil se desenvolveu completamente e permaneceu estável ao longo de pelo menos duas semanas. O composto foi administrado por via intravenosa como uma aplicação única (3 mg/kg). Como veículo para aplicação intravenosa, foi usada uma solução 1:1:18 de etanol: solutol: solução salina tamponada com fosfato.

5 As medidas do limiar de retirada da pata (PWT) foram usadas

para calcular os efeitos significativos do tratamento, e para os cálculos da AUC ao longo de um período de tempo de referência (6 horas) e subsequentes cálculos do % de benefício. Para análise estatística, os valores de PWT das patas traseiras ipsilaterais foram usados de duas formas: primeiro, com 10 um ANOVA de duas vias baseado nos valores de PWT por tempos específicos (dentro de um período de 24 horas) e segundo com um ANOVA de uma via em valores de AUC delta não-transformados de |AUC1-6 horas|.

A análise da variância em duas vias com medidas repetidas (Fator repetido: TIME, Variável da análise: PWT), seguida por uma Análise 15 Complementar (Efeito do fator GRUPO para cada nível do fator TEMPO (análise de Winer), Variável da análise: PWT) e um teste de Dunnett subsequente para o fator TRATAMENTO para cada nível do fator TEMPO (comparação de duas vias vs nível VEÍCULO), revelaram diferenças altamente significantes do grupo de veículo de 1 a 6 horas após a aplicação intravenosa 20 para cada composto. O efeito desaparecia 24 horas após a aplicação. ANOVA de uma via usando os valores delta |AUC1-6 horas| revelou um valor p de p <0,0001. A análise de Dunnett gerou efeitos significantes do tratamento para ambos os compostos. O benefício percentual do tratamento foi avaliado com o uso dos valores de |AUC1-6 horas| do grupo de veículo ipsilateral (0% 25 de benefício) e todos os valores de |AUC1-6 horas| dos lados contralaterais de todos os três grupos (100% de benefício = efeito máximo possível). Comparada com essas margens, Labirintopeptina (III) alcançou 97% de benefício.

Em conclusão, o composto reduz significativamente a alodinia tátil no modelo de SNI em camundongo de dor neuropática.

Exemplo 18: Atividade na Dorde Origem Inflamatória

A Labirintopeptina (III) foi estudada no modelo de inflamação na pata traseira induzida por carragenina (CAR) em camundongos a fim de provar a atividade sobre hiperalgesia térmica, uma leitura típica para dor de origem inflamatória.

Indução de inflamação da pata traseira: sob ligeira anestesia ge5 ral com lsoflurano, CAR a 2% (Sigma, Deisenhofen, Alemanha) em 20 μΙ de solução salina foi injetada na face plantar de ambas as patas traseiras em machos de camundongos C57B6. As latências de retirada da pata (PWL) foram determinadas mediante exposição das patas a um estímulo térmico definido usando um aparelho disponível comercialmente (Plantar Test Ugo 10 Basile Biological Research Apparatus, Comerio, Itália), adaptado com uma minicâmera para assegurar a colocação adequada do calor infravermelho abaixo da pata traseira de interesse. Os camundongos foram mantidos em gaiolas de teste durante todo o período de estudo (6 horas).

Medida de hiperalgesia térmica: o cronômetro que mede a dura15 ção da Iuz infravermelha que reflete na pata traseira é iniciado pelo pesquisador e interrompido, caso o animal agite a pata traseira afetada. Um valor de corte foi definido em 16 segundos para evitar dano tecidual. O estudo foi realizado antes e ao longo de 6 horas após a injeção de CAR. As latências de retirada da pata em segundos foram usadas como leitura para análise 20 posterior.

Como veículo para a aplicação intravenosa, foi usada uma solução 1:1:18 de etanol: solutol: solução salina tamponada com fosfato).

As medidas das latências de retirada da pata (PWL) foram usadas para calcular os efeitos significantes do tratamento, e para os cálculos 25 da AUC ao longo de um período de tempo de referência (6 horas) e subsequentes cálculos do % de benefício. Para análise estatística, os valores de PWT de ambas as patas traseiras foram usados de duas formas: primeiro, com uma análise de variãncia de duas vias (ANOVA) baseada nos valores de PWT por tempos específicos (dentro de um período de 6 horas), e se30 gundo com um ANOVA de uma via em valores de AUC delta nãotransformados de |AUC1-6 horas|.

A análise de variãncia de duas vias com medidas repetidas (Fator repetido: TEMPO, Variável da análise: PWL), seguida por uma Análise Complementar (Efeito do fator GRUPO para cada nível do fator TEMPO (análise de Winer), Variável da análise: PWL) e um teste de Dunnett subsequente para o fator DOSAGEM para cada nível do fator TEMPO (comparação de duas vias vs nível 0 = VEÍCULO) revelaram diferenças altamente significantes do grupo de veículo de 1 a 2 horas após a aplicação intravenosa para ambas as dosagens. O efeito desaparecia 4 horas após a aplicação. ANOVA de uma via usando os valores delta |AUC1-6 horas| revelou um valor p de p <0,0001. A análise de Dunnett geriu efeitos significantes do tratamento para ambas as dosagens. O benefício percentual do tratamento foi avaliado com o uso dos valores de |AUC1-6 horas| do grupo de veículo (0% de benefício) e todos os valores de |AUC1-6 horas| antes de a CAR ter sido injetada (valor de base teórico ao longo de 6 horas = efeito máximo possível = 100% de efeito). Comparado com essas margens, o grupo de dosagem de 1 mg/kg alcançou 37% e o grupo 10 mg/kg alcançou 34% de benefício.

Em conclusão, o composto reduziu significativamente a hiperalgesia térmica no modelo CAR em camundongo de dor de origem inflamatória.

Claims (19)

1. Composto da fórmula (I) <formula>formula see original document page 22</formula> em que: R1 é H, C(0)-(CrC6)alquila ou C(0)-0-(CrC6)alquila; R2 é OH1 NH2, NH-(CrC6)alquila, NH-(Ci-C4)alquileno-fenila ou NH-(C1-C4)BlquiIeno-PiridiI; R3 e R4, independentemente um do outro, são H ou OH, ou R3 e R4 juntos são =0; e m e n são, independentemente um do outro, 0, 1 ou 2; em quaíquer forma estereoquímica, ou uma mistura de quaisquer formas estereoquímicas em qualquer proporção, ou um sal fisiologícamente tolerável destas.

2. Composto da fórmula (I) de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pela fórmula (II) <formula>formula see original document page 32</formula>

3. Composto da fórmula (I) de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que R1 é H.

4. Composto da fórmula (I) de acordo com a reivindicação 1 ou 3, em que R2 é OH.

5. Composto da fórmula (I) de acordo com a reivindicação 1 ou 4, em que R3 e R4 são H ou OH em que, se R3 for OH1 então R4 será H1 ou se R3 for H1 então R4 será OH1 ou R3 e R4 juntos são =0.

6. Composto da fórmula (I) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, em que R3 é OH e R4 é H ou, se R3 for H, R4 será OH.

7. Composto da fórmula (I) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 6, em que m e n são 0, ou m e n são 2, ou m é 0 e n é 2, ou m é 2 e n é 0.

8. Composto da fórmula (I) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, em que m e n são 0.

9. Composto da fórmula (I) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 8, em que R1 é H; R2 é OH; R3 e R4, independentemente um do outro, são H ou OH, em que, se R3 for OH, então R4 será H, e se R3 for H, então R4 será OH; e m e n são, independentemente um do outro, 0, 1 ou 2.

10. Composto da fórmula (I) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9, em que R1 é H; R2 é OH; R3 e R4, independentemente um do outro, são H ou OH em que, se R3 for OH, então R4 será H, e se R3 for H, então R4 será OH; e m e n são 0, ou men são 2, ou m é 0 e n é 2, ou m é 2 e n é 0.

11. Composto da fórmula (I) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 10, em que R1 é H; R2 é OH; R3 e R4, independentemente um do outro, são H ou OH em que, se R3 for OH, então R4 será H, e se R3 for H, então R4 será OH; e m e n serão 0.

12. Composto da fórmula (I) de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, caracterizado por um composto da fórmula (III)

13. Composto isolado de Actinomadura namibiensis (DSM 6313), caracterizado por uma massa molecular monoisotópica neutra de 1922,6872 Da, e uma fórmula molecular de C85H110N20O24S4.

14. Uso de um composto como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, para a preparação de um medicamento para o tratamento de infecções bacterianas, infecções virais e/ou dor.

15. Composição farmacêutica compreendendo pelo menos um composto da fórmula (I) como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, e pelo menos um ingrediente farmaceuticamente aceitável.

16. Processo para a preparação de um composto da fórmula (I) como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 13, que compreende: a) a cepa de Actinomadura namibiensis (DSM 6313), ou uma de suas variantes e/ou mutantes, sendo fermentadas sob condições adequadas em um meio de cultura, até que um ou mais dos compostos da fórmula (I) se acumule no meio de cultura, b) um composto da fórmula (I) sendo isolado do meio de cultura, e c) o composto da fórmula (I) sendo derivatizado, quando apropriado, e/ou, quando apropriado, sendo convertido em um sal fisiologicamente tolerado.

17. Processo de acordo com a reivindicação 16, em que o composto (I) é caracterizado por um composto da fórmula (II).

18. Processo de acordo com a reivindicação 16 ou 17, em que o composto (I) é caracterizado por um composto da fórmula (III).

19. Processo de acordo com qualquer uma das reivindicações 16 a 18, em que m e n são 0, ou m e n são 2, ou m é 0 e n é 2, ou m é 2 e n éO.