KR20090066297A - 치료용 피라졸릴 티에노피리딘 - Google Patents

치료용 피라졸릴 티에노피리딘 Download PDF

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KR20090066297A
KR20090066297A KR1020097007709A KR20097007709A KR20090066297A KR 20090066297 A KR20090066297 A KR 20090066297A KR 1020097007709 A KR1020097007709 A KR 1020097007709A KR 20097007709 A KR20097007709 A KR 20097007709A KR 20090066297 A KR20090066297 A KR 20090066297A
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마크 로렌스 보이스
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화이자 프로덕츠 인크.
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Abstract

본 발명은 TGFβ-매개된 증상의 치료에 있어서 치료제로 유용한 하기 화학식 I의 화합물 및 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다. 또한, 본 발명은 하나 이상의 하기 화학식 I의 화합물을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
<화학식 I>
Figure 112009022642739-PCT00044
식 중, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 본 명세서에 정의된 임의의 값을 갖는다.
피라졸릴 티에노피리딘, TGFβ-매개된 증상, 섬유성 질환, 반흔 형성

Description

치료용 피라졸릴 티에노피리딘 {THERAPEUTIC PYRAZOLYL THIENOPYRIDINES}
TGF-β (전환 성장 인자-β)는 섬유성 및 종양-촉진성 신호전달 캐스케이드를 활성화시킨다. 3종의 포유동물 TGFβ, 즉 TGFβ1, TGFβ2 및 TGFβ3은 TGFβ 경로를 활성화시킬 수 있다. TGFβ는 세포 표면 수용체에 결합하여 그것을 통해 신호를 전달한다 (문헌 [Singh et al. (2004) Curr. Opin. Drug Disc. and Dev., 7: 437-445] 참조). TGFβ는 먼저 제II형 수용체 (TβRII)에 결합하고, 이어서 제I형 수용체 (TβRI) (즉, 액티빈 수용체-유사 키나제 (ALK))에 결합하여 그것을 인산화시킨다. TGFβ에 대해 가장 특이적인 ALK인 ALK-5를 비롯한 ALK 단백질 군이 존재한다. ALK-5의 활성화는 세포내 단백질의 인산화를 유도하고, 이는 섬유증 및 종양발생의 조절을 초래한다. 이에 따라, ALK-5 억제제의 개발은 암 및 섬유증 수반 증상 치료용 억제제를 개발하기 위한 활발한 연구 분야이다 (문헌 [Singh et al. (2004)] 참조).
섬유증 수반 증상의 한 예는 상처 회복 동안의 반흔의 형성이다. 비후성 및 켈로이드성 반흔을 비롯한 반흔은 통상적으로 상처 부위에서의 콜라겐의 침착으로부터 기인한다. 상처는 수술, 사고성 손상, 화상, 외상 등을 비롯한 매우 다양한 종류의 메카니즘을 통해 생성될 수 있다. TGFβ 경로를 억제시키는 TGFβ1 및 TGF β2에 대한 항체, TGFβ3의 적용이 반흔화를 감소시키는데 도움을 줄 수 있다는 것이 보고되었다 (문헌 [O'Kane and Ferguson, (1997) Int. J. Biochem. Cell Biol., 29: 63-78]). 이에 따라, 반흔 형성을 감소시키는데, 또한 암 뿐만 아니라 여타 섬유성 증상의 치료에 사용될 수 있는 소분자 ALK-5 억제제에 대한 당업계의 요구가 계속되고 있다.
<발명의 개요>
한 측면에서, 본 발명은 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 제공한다.
Figure 112009022642739-PCT00001
식 중,
R1은 티에노[3,2-c]피리디닐, 티에노[3,2-b]피리디닐, 티에노[2,3-c]피리디닐 또는 티에노[2,3-b]피리디닐이고, 이들 각각은 -C1-C3-알킬, -(C1-C3-알킬)-S-(C1-C3-알킬), -S-C1-C3-알킬, -(C1-C3-알킬)-O-(C1-C3-알킬), -O-C1-C3-알킬, -C(O)O-C1-C3-알킬, -C(O)O-H, -C(O)NR30R31, 할로, -CN, -OH (여기서, R30 및 R31은 H 및 -C1-C3 알킬-OH, -C1-C3-알킬, 할로 및 -O-C1-C3-알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택됨)로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있고;
R2 및 R3은 수소, -C1-C3-알킬, -(C1-C3-알킬)-S-(C1-C3-알킬), -S-C1-C3-알킬, -(C1-C3-알킬)-O-(C1-C3-알킬), -O-C1-C3-알킬, -C(O)O-C1-C3-알킬, -C(O)O-H, -C(O)NR30R31, 할로, -CN, -OH 및 C3-C6-시클로알킬 (여기서, R30 및 R31은 H 및 -C1-C3 알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택됨)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나; 또는
R2 및 R3은 함께 5 또는 6원 헤테로아릴, 페닐, C4-C6-시클로알킬 또는 4 내지 6원 헤테로시클로알킬을 형성할 수 있고, 여기서 상기 C4-C6-시클로알킬 또는 4 내지 6원 헤테로시클로알킬은 할로, -OH, 옥소 및 -C1-C3 알킬로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있으며, 상기 5 또는 6원 헤테로아릴, 또는 페닐은 할로, -CN, -OH, -O-C1-C3 알킬 및 -C1-C3 알킬로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있고;
R4, R5, R6 및 R7은 H, -OH, C3-시클로알킬, -C1-C3-알킬, -(C1-C3-알킬)-S-(C1-C3-알킬), -S-C1-C3-알킬, -(C1-C3-알킬)-O-(C1-C3-알킬), -O-C1-C3-알킬, -C(O)O- C1-C3-알킬, -C(O)O-H, -C(O)NR30R31, 할로, -CN, -OH (여기서, R30 및 R31은 H 및 -C1-C3 알킬, -O-C1-C3-알킬 및 할로로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택됨)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
특정 실시양태에서, R1은 본원에 명시된 바와 같이 임의로 치환될 수 있는 티에노[3,2-c]피리디닐이다. 티에노[3,2-c]피리딘의 상대적 위치는 다음과 같이 번호 매겼다:
Figure 112009022642739-PCT00002
. 티에노[3,2-c]피리디닐은 티에노[3,2-c]피리딘의 1가 라디칼이다. 따라서, 본 발명의 특정 실시양태에서, 하기 화학식 II의 화합물을 제공한다:
Figure 112009022642739-PCT00003
식 중, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 본원에 명시된 임의의 값을 가지며, 여기서 티에노[3,2-c] 라디칼은 2, 3, 4, 6 또는 7 중 어느 하나의 위치에서 부착된다.
특정 실시양태에서, R1은 명시된 바와 같이 임의로 치환될 수 있는 티에노[2,3-c]피리디닐이다. 티에노[2,3-c]피리딘의 상대적 위치는 다음과 같이 번호 매겼다:
Figure 112009022642739-PCT00004
. 티에노[2,3-c]피리디닐은 티에노[2,3-c]피리딘의 1가 라디칼이다. 따라서, 본 발명의 특정 실시양태에서, 하기 화학식 III의 화합물을 제공한다:
Figure 112009022642739-PCT00005
식 중, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 본원에 명시된 임의의 값을 가지며, 여기서 티에노[2,3-c] 라디칼은 2, 3, 4, 5 또는 7 중 어느 하나의 위치에서 부착된다.
특정 실시양태에서, R1은 본원에 명시된 바와 같이 임의로 치환될 수 있는 티에노[2,3-b]피리디닐이다. 티에노[2,3-b]피리딘의 상대적 위치는 다음과 같이 번호 매겼다:
Figure 112009022642739-PCT00006
. 티에노[2,3-b]피리디닐은 티에노[2,3-b]피리딘의 1가 라디칼이다. 따라서, 본 발명의 특정 실시양태에서, 하기 화학식 IV의 화합물을 제공한다:
Figure 112009022642739-PCT00007
식 중, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 본원에 명시된 임의의 값을 가지며, 여기서 티에노[2,3-b] 라디칼은 2, 3, 4, 5 또는 6 중 어느 하나의 위치에서 부착된다.
특정 실시양태에서, R1은 본원에 명시된 바와 같이 임의로 치환될 수 있는 티에노[3,2-b]피리디닐이다. 티에노[3,2-b]피리딘의 상대적 위치는 다음과 같이 번호 매겼다:
Figure 112009022642739-PCT00008
. 티에노[3,2-b]피리디닐은 티에노[3,2-b]피리딘의 1가 라디칼이다. 따라서, 본 발명의 특정 실시양태에서, 하기 화학식 V의 화합물을 제공한다:
Figure 112009022642739-PCT00009
식 중, R1, R2, R3, R4, R5, R6 및 R7은 본원에 명시된 임의의 값을 가지며, 여기서 티에노[3,2-b] 라디칼은 2, 3, 5, 6 또는 7 중 어느 하나의 위치에서 부착된다.
특정 실시양태에서, R1은 티에노[3,2-c]피리디닐 또는 티에노[2,3-c]피리디닐이다.
특정 실시양태에서, R1은 티에노[3,2-c]피리디닐 또는 티에노[2,3-c]피리디닐이고, 이들은 C1-C3-알킬, -(C1-C3-알킬)-S-(C1-C3-알킬), -S-C1-C3-알킬, -(C1-C3-알킬)-O-(C1-C3-알킬), -O-C1-C3-알킬, -C(O)O-C1-C3-알킬, -C(O)O-H, -C(O)NR30R31, 할로, -CN, -OH (여기서, R30 및 R31은 H 및 C1-C3 알킬-OH, C1-C3-알킬, 할로 및 -O-C1-C3-알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택됨)로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있다.
특정 실시양태에서, R1은 티에노[3,2-c]피리디닐 또는 티에노[2,3-c]피리디닐이고, 이들은 -OH, C1-C3 알킬, 할로 및 -O-C1-C3 알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있다.
특정 실시양태에서, R2 및 R3은 함께 C4-C6-시클로알킬, 또는 4 내지 6원 헤테로시클로알킬을 형성하고, 여기서 상기 C4-C6-시클로알킬, 또는 4 내지 6원 헤테 로시클로알킬은 옥소 및 C1-C3 알킬로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있다. 다른 실시양태에서, R2 및 R3은 함께 C5-시클로알킬, 또는 4 내지 6원 헤테로시클로알킬을 형성하고, 여기서 상기 4 내지 6원 헤테로시클로알킬은 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로티에닐, 이미다졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이미다졸리닐, 이속사졸리디닐 및 피롤리디닐로 이루어진 군으로부터 선택된다. 다른 실시양태에서, R2 및 R3은 함께 C5-시클로알킬을 형성하고, R1은 티에노[3,2-c]피리디닐 또는 티에노[2,3-c]피리디닐이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 (2-(6-메틸피리딘-2-일)-2,4,5,6-테트라히드로시클로펜타[c]피라졸-3-일)티에노[3,2-c]피리딘 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 2-(2-(6-메틸피리딘-2-일)-2,4,5,6-테트라히드로시클로펜타[c]피라졸-3-일)티에노[2,3-c]피리딘 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
다른 실시양태에서, R2 및 R3은 수소, C1-C3-알킬, -(C1-C3-알킬)-O-(C1-C3-알킬), -O-C1-C3-알킬, -C(O)O-C1-C3-알킬, -C(O)O-H, -C(O)NR30R31, 할로, -CN, -OH 및 C3-C6-시클로알킬 (여기서, R30 및 R31은 H 및 C1-C3 알킬로 이루어진 군으로부터 각 각 독립적으로 선택됨)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 특정 실시양태에서, R2 및 R3은 수소 및 C1-C3 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다. 보다 특정 실시양태에서, R2는 C1-C2 알킬이고 R3은 수소이다.
특정 실시양태에서, R5, R6 및 R7은 H이고 R4는 C1-C3-알킬이다. 또 다른 실시양태에서, R4는 메틸이다. 특정 실시양태에서, R5, R6 및 R7은 H이고 R4는 메틸이다.
특정 실시양태에서, R1은 티에노[3,2-c]피리디닐 또는 티에노[2,3-c]피리디닐이고, 이들은 -OH, C1-C3 알킬, 할로 및 -O-C1-C3 알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있다.
특정 실시양태에서, R1은 티에노[3,2-c]피리딘-2-일 또는 티에노[2,3-c]피리딘-2-일이고, 이들은 -OH, C1-C3 알킬, 할로 및 -O-C1-C3 알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있다.
특정 실시양태에서, R1은 티에노[3,2-c]피리딘-2-일이고, 이는 -OH, C1-C3 알킬, 할로 및 -O-C1-C3 알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있다. 특정 실시양태에서, R1은 티에노[3,2-c]피 리디닐-2-일이다.
특정 실시양태에서, R5, R6 및 R7은 H이고; R4는 C1-C3-알킬이고; R1은 티에노[3,2-c]피리디닐 또는 티에노[2,3-c]피리디닐이고, 이들은 -OH, C1-C3 알킬, 할로 및 -O-C1-C3 알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있다. 특정 실시양태에서, R5, R6 및 R7은 H이고; R4는 메틸이고; R1은 티에노[3,2-c]피리디닐 또는 티에노[2,3-c]피리디닐이고, 이들은 -OH, C1-C3 알킬, 할로 및 -O-C1-C3 알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있다. 특정 실시양태에서, R5, R6 및 R7은 H이고; R4는 메틸이고; R1은 티에노[3,2-c]피리디닐 또는 티에노[2,3-c]피리디닐이다. 특정 실시양태에서, R5, R6 및 R7은 H이고; R4는 메틸이고; R1은 티에노[2,3-c]피리디닐이다. 특정 실시양태에서, R5, R6 및 R7은 H이고; R4는 메틸이고; R1은 티에노[3,2-c]피리디닐이다.
특정 실시양태에서, R5, R6 및 R7은 H이고; R4는 메틸이고; R1은 티에노[2,3-c]피리디닐이고; R2 및 R3은 수소 및 C1-C3 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 실시양태에서, R5, R6 및 R7은 H이고; R4는 메틸이고; R1은 티에노[3,2-c]피리디닐이고; R2 및 R3은 수소 및 C1-C3 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 실시양태에서, R5, R6 및 R7은 H이고; R4는 메틸이고; R1은 티에노[2,3-c]피리딘-2-일이고; R2 및 R3은 수소 및 C1-C3 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
특정 실시양태에서, R5, R6 및 R7은 H이고; R4는 메틸이고; R1은 티에노[3,2-c]피리딘-2-일이고; R2 및 R3은 수소 및 C1-C3 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된다.
화학식 I의 화합물의 예로는
2-[1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일]티에노[3,2-c]피리딘;
2-[3,4-디메틸-1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일]티에노[3,2-c]피리딘;
2-[3-메틸-1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일]티에노[3,2-c]피리딘;
2-[3-에틸-1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일]티에노[3,2-c]피리딘;
2-[4-에틸-1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일]티에노[3,2-c]피리딘; 및 그의 제약상 허용되는 염이 포함된다.
화학식 I의 화합물의 또다른 예는 2-[4-메틸-1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라 졸-5-일]티에노[3,2-c]피리딘; 및 그의 제약상 허용되는 염이다. 한 특정 실시양태에서, 화합물은 2-[4-메틸-1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일]티에노[3,2-c]피리딘이다.
화학식 I의 화합물의 또다른 예는 2-(4-메틸-1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일)티에노[2,3-c]피리딘, 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
다른 측면에서, 본 발명은 반흔 형성을 감소시키는 치료가 필요한 포유동물에게 치료상 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 반흔 형성을 감소시키는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 국소적으로 투여된다. 특정 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 2-[4-메틸-1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일]티에노[3,2-c]피리딘 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
특정 실시양태에서, 본 발명은 기존의 반흔을 감소시키는 치료가 필요한 포유동물에게 치료상 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 기존의 반흔을 감소시키는 방법을 제공한다.
특정 실시양태에서, 2-[4-메틸-1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일]티에노[3,2-c]피리딘 또는 그의 제약상 허용되는 염이 반흔 형성의 억제를 위한 의약의 제조에 사용될 수 있다.
다른 측면에서, 본 발명은 TGFβ-매개된 증상의 치료가 필요한 포유동물에게 치료상 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, TGFβ-매개된 증상을 치료하는 방법을 제공한다. 특정 실시양태에 서, TGFβ-매개된 증상은 암, 유방암, 폐암, 결장암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 흑색종, 섬유성 질환, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 간 섬유증, 폐 섬유증, 동맥 과다형성, 재협착, 경피증 및 피부 반흔화를 포함하는 군으로부터 선택된다. 특정 실시양태에서, TGFβ-매개된 증상은 피부 반흔화이다. 특정 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 2-[4-메틸-1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일]티에노[3,2-c]피리딘 또는 그의 제약상 허용되는 염이다. 특정 실시양태에서, TGFβ-매개된 증상은 피부 반흔화이고, 화학식 I의 화합물은 2-[4-메틸-1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일]티에노[3,2-c]피리딘 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
다른 측면에서, 본 발명은 치료상 유효량의 화학식 I의 화합물 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 2-[4-메틸-1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일]티에노[3,2-c]피리딘 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
다른 측면에서, 본 발명은 치료상 유효량의 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 국소 적용에 적합한 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 국소용 제약 조성물을 제공한다. 특정 실시양태에서, 화학식 I의 화합물은 2-[4-메틸-1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일]티에노[3,2-c]피리딘 또는 그의 제약상 허용되는 염이다.
추가의 실시양태에서, 본 발명은, TGFβ-매개된 증상을 완화시키기 위하여 본 발명의 화합물을 어떻게 사용하는지에 대해 소비자에게 조언해 주는 설명서와 함께, 소매용으로 패키징된 하나 이상의 본 발명의 화합물을 함유하는 키트에 관한 것이다. 추가의 실시양태는 TGFβ 활성화된 경로의 부적절한 활성화를 검출하기 위한 진단제로서의 본 발명의 화합물의 용도에 관한 것이다.
정의
특허청구범위를 포함한 본 출원 전반에 걸쳐 사용된 바와 같이, 하기 용어들은 달리 구체적으로 나타내지 않는다면 다음 정의된 의미를 갖는다.
복수 및 단수는 숫자의 표시를 제외하고는 상호교환가능하게 대해져야 한다.
"반흔"은 상처 부위에 상처 회복 후에 존재하는 자국이다. 용어 "반흔"에는 켈로이드성 반흔, 비후성 반흔, 및 두드러지게 융기하지 않고 원래 상처의 경계면을 넘어서까지는 두드러지게 성장하지 않는 반흔이 있다.
"켈로이드성 반흔"은, 통상적으로 원래 상처의 경계면을 넘어서까지 성장하는, 상처 부위에서의 반흔 조직의 과성장이다.
"비후성 반흔"은 원래 상처의 경계면을 넘어서까지는 두드러지게 성장하지 않는 융기 반흔이다.
용어 "상처"는 조직, 예컨대 피부의 정상적인 보전성(integrity)을 파괴하는 손상을 나타낸다. "상처"는 고의적으로 또는 우발적으로 발생할 수 있다. 상처의 예로는 열상, 좌상, 폐쇄성 창상, 개방형 창상, 천공성(perforated) 창상, 절창, 자상, 화상 등이 있다.
용어 "화학식 I의 화합물", "본 발명의 화합물" 및 "화합물(들)"은 본 출원 전반에 걸쳐 상호교환가능하게 사용되고, 동의어로 대해져야 한다.
용어 "환자"는 온혈 동물, 예컨대 기니 피그, 마우스, 래트, 저빌(gerbil), 고양이, 래빗, 개, 원숭이, 침팬지, 땅딸보 꼬리 머카크(stump tail macaque) 및 인간을 나타낸다.
용어 "치료"는 환자의 질환 (또는 증상) 또는 질환과 관련된 임의의 조직 손상의 진행을 경감시키거나 완화시키거나 또는 늦추는 화합물의 능력을 나타낸다.
용어 "포유동물"은 포유강의 구성원을 나타낸다. 포유동물의 예로는, 이에 제한되지 않고, 인간, 영장류, 침팬지, 설치류, 마우스, 래트, 래빗, 말, 가축, 개, 고양이, 양 및 암소가 있다. 한 특정 실시양태에서, 포유동물은 인간이다.
용어 "이성질체"는 하기 정의된 바와 같은 "입체이성질체" 및 "기하 이성질체"를 의미한다.
용어 "입체이성질체"는 하나 이상의 키랄 중심을 갖고 각 중심이 R 또는 S 배열로 존재할 수 있는 화합물을 의미한다. 입체이성질체로는 모든 부분입체이성질체, 거울상이성질체 및 에피머 형태 뿐만 아니라, 라세미체, 및 이들의 혼합물이 있다.
용어 "기하 이성질체"는 시스, 트랜스, 안티, 엔트게겐(entgegen) (E) 및 추잠멘(zusammen) (Z) 형태, 및 이들의 혼합물로 존재할 수 있는 화합물을 의미한다.
화학식 I의 특정 화합물은 기하 이성질체로서 존재할 수 있다. 화학식 I의 화합물은 하나 이상의 비대칭 중심을 가질 수 있고, 따라서 둘 이상의 입체이성질체 형태로 존재한다. 본 발명은 화학식 I의 화합물의 모든 개별 입체이성질체 및 기하 이성질체, 및 이들의 혼합물을 포함한다. 개별 거울상이성질체들은, 키랄 분리에 의해, 합성에서 적절한 입체화학을 갖는 해당 비대칭 중심을 포함하는 이용가 능한 합성 빌딩 블럭(building block)의 사용에 의해, 또는 아키랄(achiral) 합성 빌딩 블럭으로 출발하는 비대칭 합성에 의해 얻어질 수 있다.
본 발명의 특정 화합물은 호변이성질체 형태로 존재할 수 있다. 그러한 모든 호변이성질체 형태는 본 발명의 범주 내에 포함된다.
또한, 본 발명의 화합물은 용매화되지 않은 형태, 및 제약상 허용되는 용매, 예컨대 물, 에탄올 등으로 용매화된 형태, 예를 들면 수화된 형태로 존재할 수 있다. 화합물은 또한 하나 이상의 결정질 상태, 즉 다형체로 존재할 수 있거나, 또는 이들은 무정형 고체로 존재할 수 있다. 상기 모든 형태는 본 발명의 범주 내에 포함되도록 의도한다.
용어 "알킬 기" 또는 "알킬"은 직쇄형 또는 분지쇄형 알칸의 1가 라디칼을 의미한다. 예를 들어, "C1 -3 알킬"은 1 내지 3개의 탄소 원자를 갖는 알킬 기이다. C1-C3 직쇄형 알킬 기의 예로는 메틸, 에틸 및 n-프로필이 있다. 분지쇄형 C1-C3 알킬 기의 예로는 이소프로필이 있다.
용어 알킬은 "치환되지 않은 알킬" 및 "치환된 알킬" 모두를 포함하고, 후자는 탄화수소 백본의 하나 이상의 탄소 상의 수소를 대체시키는 치환기 (예를 들어, 1 내지 6개의 치환기)를 갖는 알킬 기를 나타낸다. 그러한 치환기는 할로, I, Br, Cl, F, -OH, -COOH 및 -NH2로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택될 수 있다.
통상적인 치환된 C1-C3 직쇄형 알킬 기로는 2-클로로프로필, 2-히드록시-에틸, 2-아미노프로필 및 트리플루오로메틸이 있다.
용어 "C3-C6시클로알킬"은 3 내지 6개의 탄소를 함유하는 모노시클릭 알칸의 1가 라디칼을 나타낸다. "C3-C6시클로알킬"의 예로는 시클로프로필, 시클로부틸, 시클로펜틸 및 시클로헥실이 있다.
용어 "C4-C6시클로알킬"은 4 내지 6개의 탄소를 함유하는 모노시클릭 알칸의 1가 라디칼을 나타낸다. "C4-C6시클로알킬"의 예로는 시클로부틸, 시클로펜틸 및 시클로헥실이 있다.
"4 내지 6원 헤테로시클로알킬"은 4 내지 6원 모노시클릭 헤테로시클로알칸의 1가 라디칼을 나타낸다.
4원 헤테로시클로알킬은 3개의 탄소, 및 산소, 질소, 황으로부터 선택된 1개의 헤테로원자를 함유하는 4원 고리이다. 황은 또한 S(O) 또는 S(O)2로 존재할 수 있다. 4원 헤테로시클로알킬 기의 예로는 옥세타닐, 티에타닐 및 아제티디닐이 있다.
5원 헤테로시클로알킬은 2 내지 4개의 탄소 원자, 및 1 O; 1 S; 1 N; 2 N; 1 S 및 1 N; 1 S 및 2 N; 1 O 및 1 N; 및 1 O 및 2 N (여기서, 2개의 O 원자, 또는 1개의 O 원자 및 1개의 S 원자가 고리에 존재하는 경우, 2개의 O 원자, 또는 1개의 O 원자 및 1개의 S 원자는 서로 직접 결합하지 않음)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유한다. 황은 또한 S(O) 또는 S(O)2로 존재할 수 있다. 5원 헤테로시클로알킬의 예로는 테트라히드로푸라닐, 테트라히드로티에 닐, 이미다졸리디닐, 옥사졸리디닐, 이미다졸리닐, 이속사졸리디닐 및 피롤리디닐이 있다.
"6원 헤테로시클로알킬"은 3 내지 5개의 탄소 원자, 및 1 O; 2 O;1 S; 2 S; 1 N; 2 N; 3 N; 1 S, 1 O 및 1 N; 1 S 및 1 N; 1 S 및 2 N; 1 S 및 1 O; 1 S 및 2 O; 1 O 및 1 N; 및 1 O 및 2 N (여기서, 2개의 O 원자, 또는 1개의 O 원자 및 1개의 S 원자가 존재하는 경우, 2개의 O 원자, 또는 1개의 O 원자 및 1개의 S 원자는 서로 직접 결합하지 않음)으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 함유한다. 황은 또한 S(O) 또는 S(O)2로 존재할 수 있다. 6원 헤테로시클로알킬의 예로는 테트라히드로피라닐, 디옥사닐, 1,3-디옥솔라닐, 1,4-디티아닐, 헥사히드로피리미딘, 모르폴리닐, 피페라지닐, 피페리디닐, 피라졸리디닐, 피라졸리닐, 1,2,3,6-테트라히드로피리디닐, 테트라히드로티오피라닐, 1,1-디옥소-헥사히드로-1λ6-티오피라닐, 1,1-디옥소-1λ6-티오모르폴리닐, 티오모르폴리닐, 티옥사닐 및 1,3,5-트리티아닐이 있다.
"5원 헤테로아릴"은 2 내지 4개의 탄소 원자, 및 1 O; 1 S; 1 N; 2 N; 3 N; 1 S 및 1 N; 1 S 및 2 N; 1 O 및 1 N; 및 1 O 및 2 N으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 내지 3개의 헤테로원자를 갖는 5원 모노시클릭 방향족 고리 라디칼이다. 특정 실시양태에서, 5원 헤테로아릴은 푸라닐, 이미다졸릴, 이속사졸릴, 이소티아졸릴, 옥사디아졸릴, 옥사졸릴, 피라졸릴, 피롤릴, 티에닐, 티아졸릴 및 트리아졸릴로 이루어진 군으로부터 선택된다.
"6원 헤테로아릴"은 4 내지 5개의 탄소 원자, 및 1 N; 및 2 N으로 이루어진 군으로부터 선택된 1 또는 2개의 헤테로원자를 갖는 6원 모노시클릭 방향족 고리 라디칼이다. 특정 실시양태에서, 6원 헤테로아릴은 피리디닐, 피리미디닐, 피리다지닐 및 피라지닐로 이루어진 군으로부터 선택된다.
화합물의 제조
화학식 I의 화합물을 제조하기 위한 일반적인 합성 반응식을 하기에 설명한다.
Figure 112009022642739-PCT00010
반응식 1은 피라졸 (6)의 합성을 도시한다. 비양성자성 용매, 예컨대 THF (테트라히드로푸란), 디에틸에테르 등 중의 티에노[3,2-c]피리딘 (1) (예를 들어, 문헌 [Wikel et al. (1993) J. Het. Chem., 30: 289-290] 참조)을 알킬-리튬 시약, 예컨대 n-부틸리튬과 약 -40℃ 이하의 온도에서 반응시킬 수 있다. 티에노[3,2-c]피리딘은 반응식 1에서 치환되지 않는 것으로 나타나 있지만, 이는 본원에 기재된 바와 같이 임의로 치환될 수 있다. 이후에, N-메틸-N-메톡시아세트아미드 (2) (또는 여타 적합한 아실화제, 예컨대 N-아세틸-모르폴린, 아세트산 무수물 및 아세틸 클로라이드)를 반응물에 첨가하고, 반응을 -30 내지 -45℃에서 진행시켜 케톤 (3) (예를 들어, 1-(티에노[3,2-c]피리딘-2-일)에탄온)을 제공한다.
이후에, 케톤 (3)을 약 70℃에서 DMF (디메틸포름아미드) 중 디메톡시-N,N-디메틸메탄아민 ("DMF-DMA")과 반응시켜 (4) (예를 들어, (E)-3-(디메틸아미노)-1-(티에노[3,2-c]피리딘-2-일)프로프-2-엔-1-온)를 제공한다. (4)를 약 80℃에서 아세트산 중 피리디닐-히드라진 (5) (예를 들어, 1-(6-메틸피리딘-2-일)히드라진)로 처리하여 위치이성질체 (6) 및 (7)을 수득한다. 위치이성질체 (7)을, 통상적인 정제 기술, 예컨대 침전, 여과 및 컬럼 크로마토그래피를 이용하여 (6)으로부터 분리시켜 (6)을 제공할 수 있다.
Figure 112009022642739-PCT00011
반응식 2는 피라졸 (6)에 대한 별법의 합성 경로를 도시한다. 티에노[3,2-c]피리딘 (1)의 용액을 질소 기체 대기하에 용매, 예컨대 THF 중에서 약 -50℃ 내지 -78℃에서 알킬리튬 시약, 예컨대 n-부틸리튬과 반응시킬 수 있다. 티에노[3,2-c]피리딘은 반응식 2에서 치환되지 않는 것으로 나타나 있지만, 이는 본원에 기재된 바와 같이 임의로 치환될 수 있다. 트리이소프로필 보레이트 및 인산을 첨가하여 보론산 (9)의 인산염을 수득한다. 이후에, 염기, 예컨대 무기 탄산염 염기 (예를 들어, Na2CO3, K2CO3, NaHCO3 등) 또는 제3인산칼륨, 및 팔라듐 촉매, 예컨대 Pd(Cl2)dppf (디클로로(1,1-비스(디페닐포스피노)페로센)팔라듐(II)) 및 dppf (1,1-비스(디페닐포스피노)페로센)을 첨가하여, 보로네이트 (9)를 피리디닐-피라졸 (10)과 커플링시켜 피라졸 (6)을 제공한다. 적합한 용매, 예컨대 THF 또는 1,2-디메톡시에탄 중에서 1 내지 24시간 동안 환류시킴으로써, 또는 약 80 내지 100℃에서 디옥산 중에서 반응을 수행할 수 있다. 또한, KF 및 물의 존재하에 이 반응을 수행할 수 있다. 상응하는 보로네이트 에스테르를 보론산 (9) 대신에 사용할 수 있다. (10)의 LG 기는 적합한 이탈기, 예컨대 트리플루오로메탄술포닐, Br, I 또는 Cl을 나타낸다. (6)의 상응하는 티에노[3,2-b]피리딘-2-일, 티에노[2,3-c]피리딘-2-일 및 티에노[2,3-b]피리딘-2-일 유사체는 각각 (1) 대신에 티에노[3,2-b]피리딘, 티에노[2,3-c]피리딘 및 티에노[2,3-b]피리딘을 사용하여 제조할 수 있다.
제약상 허용되는 염
본 발명의 화합물 (예를 들어, 화학식 I의 화합물)은 산 부가염 및/또는 염기 염을 비롯한 (이에 제한되지 않음) 제약상 허용되는 염을 형성할 수 있다. 화학식 I의 화합물의 제약상 허용되는 염은 그의 산 부가염 및 염기 염 (2염 포함)을 포함한다. 적합한 염의 예는, 예를 들어 문헌 [Stahl and Wermuth, Handbook of Pharmaceutical Salts: Properties, Selection, and Use, Wiley-VCH, Weinheim, Germany (2002)]; 및 문헌 [Berge et al., "Pharmaceutical Salts," J. of Pharmaceutical Science, 1977;66: 1-19]에서 찾아볼 수 있다.
화학식 I의 화합물의 제약상 허용되는 산 부가염으로는, 무기산, 예컨대 염산, 질산, 인산, 황산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 아인산 등으로부터 유래된 무독성 염, 및 유기산, 예컨대 지방족 모노- 및 디카르복실산, 페닐-치환된 알칸산, 히드록시 알칸산, 알칸디오산, 방향족 산, 지방족 및 방향족 술폰산 등으로부 터 유래된 염이 있다. 따라서, 그러한 염으로는 화학식 I의 화합물의 아세테이트, 아스파르테이트, 벤조에이트, 베실레이트 (벤젠술포네이트), 비카르보네이트/카르보네이트, 비술페이트, 카프릴레이트, 캄실레이트 (캄포르 술포네이트), 클로로벤조에이트, 시트레이트, 에디실레이트 (1,2-에탄 디술포네이트), 디히드로겐포스페이트, 디니트로벤조에이트, 에실레이트 (에탄 술포네이트), 푸마레이트, 글루셉테이트, 글루코네이트, 글루쿠로네이트, 히벤제이트, 히드로클로라이드/클로라이드, 히드로브로마이드/브로마이드, 히드로요오다이드/요오다이드, 이소부티레이트, 모노히드로겐 포스페이트, 이세티오네이트, D-락테이트, L-락테이트, 말레이트, 말레에이트, 말로네이트, 만델레이트, 메실레이트 (메탄술포네이트), 메타포스페이트, 메틸벤조에이트, 메틸술페이트, 2-나프실레이트 (2-나프탈렌 술포네이트), 니코티네이트, 니트레이트, 오로테이트, 옥살레이트, 팔모에이트, 페닐아세테이트, 포스페이트, 프탈레이트, 프로피오네이트, 피로포스페이트, 피로술페이트, 사카레이트, 세바케이트, 스테아레이트, 수베레이트, 숙시네이트 술페이트, 술파이트, D-타르트레이트, L-타르트레이트, 토실레이트 (톨루엔 술포네이트) 및 크시나포에이트 염 등이 있다. 또한, 아미노산의 염, 예컨대 아르기네이트, 글루코네이트, 갈락투로네이트 등도 고려된다.
염기성 화합물의 산 부가염은 유리 염기 형태를, 특정 염을 제조하기 위한 충분한 양의 바람직한 산과 접촉시킴으로써 제조될 수 있다. 유리 염기 형태는 염 형태를 염기와 접촉시키고 유리 염기를 단리시킴으로써 재생될 수 있다. 유리 염기 형태는 특정 물리학적 특성, 예컨대 극성 용매 중의 용해도에 있어서 그들 각각 의 염 형태와 어느 정도 상이할 수 있다.
제약상 허용되는 염기 부가염은 금속 또는 아민, 예컨대 알칼리 및 알칼리 토금속 히드록시드, 또는 유기 아민으로 형성될 수 있다. 양이온으로서 사용되는 금속의 예로는 알루미늄, 칼슘, 마그네슘, 칼륨, 나트륨 등이 있다. 적합한 아민의 예로는 아르기닌, 콜린, 클로로프로카인, N,N'-디벤질에틸렌디아민, 디에틸아민, 디에탄올아민, 디올아민, 에틸렌디아민 (에탄-1,2-디아민), 글리신, 리신, 메글루민, N-메틸글루카민, 올아민, 프로카인 (벤자틴) 및 트로메타민이 있다.
산성 화합물의 염기 부가염은 유리 산 형태를, 통상적인 방식으로 염을 제조하기 위한 충분한 양의 바람직한 염기와 접촉시킴으로써 제조될 수 있다. 유리 산 형태는 염 형태를 산과 접촉시키고 유리 산을 단리시킴으로써 재생될 수 있다. 유리 산은 특정 물리학적 특성, 예컨대 극성 용매 중의 용해도에 있어서 그들 각각의 염 형태와 어느 정도 상이할 수 있다.
제약 조성물
일반적으로, 본 발명의 화합물은 하나 이상의 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물로 투여될 수 있다. 용어 "제약 조성물"은 의학적 또는 수의학적 용도로 투여하는데 적합한 조성물을 나타낸다. 용어 "치료상 유효량"은, 특정 대상체 또는 대상체 집단에서 단독으로 또는 또다른 제약 제제 또는 치료법과 함께 투여되는 경우에, 치료되는 질환을 억제하거나, 중지시키거나 또는 개선되게 하는데 충분한, 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염의 양을 의미한다. 예를 들어 인간 또는 여타 포유동물에서, 치료상 유효량은 치료되는 특정 질환 및 대상체에 대 하여 실험실 또는 임상 세팅에서 실험적으로 결정될 수 있다.
적합한 투여형, 투여량 및 투여 경로의 결정은 제약학 및 의학 분야의 통상의 지식 수준 내에 있다는 것을 알아야 하고, 하기에 설명된다.
본원에 사용된 용어 "부형제"는 본 발명의 화합물(들) 이외의 임의의 성분을 나타낸다. 부형제의 선택은 통상적으로 다양한 인자들, 예컨대 특정 투여 방식, 용해도 및 안정성에 대한 부형제의 효과, 및 투여형의 성질에 따라 달라진다. 제약상 허용되는 부형제는 부분적으로 투여되는 특정 조성물에 의해, 또한 조성물을 투여하기 위해 사용되는 특정 방법에 의해 결정된다. 이에 따라, 본 발명의 제약 조성물의 수많은 적합한 제형들이 존재한다 (예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 20th ed.], 문헌 [Gennaro et al. Eds., Lippincott Williams and Wilkins, 2000] 참조).
본 발명의 화합물은 시럽, 엘릭시르, 현탁액, 산제, 과립, 정제, 캡슐, 로젠지제, 트로키, 수용액, 크림, 연고, 로션, 겔, 에멀션 등의 형태의 제약 조성물로 제형화될 수 있다.
본 발명의 화합물로부터 제약 조성물을 제조하는데 있어서, 제약상 허용되는 부형제는 통상적으로 고체 및 액체 부형제이다. 고체 형태 제제로는 산제, 정제, 환제, 캡슐, 카세제, 좌약 및 분산성 과립이 있다. 고체 부형제는, 희석제, 착향제, 결합제, 보존제, 정제 붕해제 또는 캡슐화 물질로 또한 작용할 수 있는 하나 이상의 물질일 수 있다.
산제에서, 부형제는 통상적으로 미분된 활성 성분과의 혼합물로 존재하는 미 분된 고체이다. 정제에서, 활성 성분은 적합한 비율로 필요한 결합 특성을 갖는 부형제와 혼합되고 원하는 형태 및 크기로 압축된다.
산제 및 정제는 통상적으로 활성 화합물 1％ 내지 95％ (w/w)를 함유한다. 특정 실시양태에서, 활성 화합물은 5％ 내지 70％ (w/w)의 범위이다. 적합한 부형제는 탄산마그네슘, 마그네슘 스테아레이트, 탈크, 당, 락토스, 펙틴, 덱스트린, 전분, 젤라틴, 트래거캔스, 메틸셀룰로스, 나트륨 카르복시메틸셀룰로스, 저융점 왁스, 코코아 버터 등이다. 용어 "제제"는, 여타 부형제와 함께 또는 여타 부형제 없이 활성 성분이 부형제에 의해 둘러싸여지고 그에 따라 부형제와 회합된 상태의 캡슐을 제공하는 부형제로서의 캡슐화 물질이 포함된 활성 화합물의 제형을 포함하도록 의도된다. 유사하게, 카세제 및 로젠지제가 포함된다. 정제, 산제, 캡슐, 환제, 카세제 및 로젠지제는 경구 투여에 적합한 고체 투여형으로 사용될 수 있다.
좌약을 제조하기 위해서는, 저융점 왁스, 예컨대 지방산 글리세리드 또는 코코아 버터의 혼합물을 먼저 용융시키고, 활성 성분을 교반에 의해 그 안에서 균질하게 분산시킨다. 이후에, 용융된 균질 혼합물을 편리한 크기의 성형틀에 붓고, 냉각시켜 고형화할 수 있다.
액체 형태 제제로는 용액, 현탁액 및 에멀션, 예를 들어, 물 또는 물/프로필렌 글리콜 용액이 있다. 액체 제제는 수성 또는 비수성 제약상 허용되는 용매 중에 활성 성분을 용해시켜 제조할 수 있고, 이는 또한 당업계에 공지된 현탁제, 감미제, 착향제 및 보존제를 함유할 수 있다.
또한, 사용되기 직전에 경구 투여를 위한 액체 형태 제제로 전환될 수 있도 록 의도된 고체 형태 제제도 포함된다. 그러한 액체 형태로는 용액, 현탁액 및 에멀션이 있다. 이들 제제는 활성 성분 이외에도, 착색제, 착향제, 안정화제, 완충제, 합성 및 천연 감미제, 분산제, 증점제, 가용화제 등을 함유할 수 있다.
본 발명의 화합물은, 단독으로 또는 여타 적합한 성분들과 함께 흡입을 통해 투여되는 에어로졸 제형으로 제조될 수 있다 (즉, 이들은 "네뷸라이저화(nebulized)"될 수 있다). 에어로졸 제형은 압축된 허용되는 분사제, 예컨대 디클로로디플루오로메탄, 프로판 질소 등에 넣을 수 있다.
본 발명에 따른 국소용 조성물은 용액, 로션, 샐브(salve), 크림, 연고, 리포좀, 스프레이, 겔, 포말제(foam), 롤러 스틱(roller stick) 또는 국소용 제약 조성물을 전달하는데 통상적으로 사용되는 임의의 여타 제형들의 형태일 수 있다.
비경구 투여, 예컨대 정맥내, 근육내, 피부내 및 피하 경로에 적합한 제형으로는, 항산화제, 완충제, 정균제, 및 제형을 의도한 수여자의 혈액과 등장성으로 만들어주는 용질을 함유할 수 있는 수성 및 비수성의 등장성 멸균 주사액, 및 현탁제, 가용화제, 증점제, 안정화제 및 보존제를 포함할 수 있는 수성 및 비수성의 멸균 현탁액이 포함된다.
제약 제제는 단위 투여형이 바람직하다. 그러한 형태에 있어서, 제제는 적절한 양의 활성 성분을 함유하는 단위 용량으로 재분할된다. 단위 투여형은 패키징된 제제, 분리된 양의 제제를 함유하는 패키지, 예컨대 바이알 또는 앰풀 중의 패킷화된 정제, 캡슐 및 산제일 수 있다. 또한, 단위 투여형은 캡슐, 정제, 카세제 또는 로젠지제 그 자체일 수 있거나, 또는 이들 중 어느 것이 적절한 개수로 패 키징된 형태일 수 있다. 화합물의 제형은 단위 용량 또는 다중 용량의 밀봉된 컨테이너, 예컨대 앰풀 및 바이알 중에 존재할 수 있다.
본 발명의 화합물을 함유하는 조성물은 소매용으로 패키징될 수 있다 (즉, 제조품일 수 있다). 그러한 제조품들은 환자들에게 그 제품의 사용 방법을 지시하는 방식으로 표지되고 패키징될 수 있다. 그러한 지시는 치료되는 증상, 치료 기간, 투여 스케줄 등을 포함할 수 있다.
단위 투여 제제 중 활성 성분의 양은, 특정 적용 및 활성 성분의 효력에 따라 0.1 mg 내지 1000 mg, 바람직하게는 1.0 mg 내지 100 mg, 또는 0.01％ 내지 95％ (w/w)의 단위 용량으로 변화하거나 조정될 수 있다. 본 발명의 문맥에서, 대상체에게 투여되는 용량은 시간 경과에 따라 대상체에서의 유익한 치료학적 반응에 영향을 주기에 충분하여야 한다. 원하는 경우, 조성물은 또한 여타 상용가능한 치료제를 함유할 수 있다.
특정 상황에 대한 적절한 투여량의 결정은 담당의의 기술 내에 있다. 용량은 통상적으로 이용되는 특정 화합물의 효능 및 대상체의 증상, 치료되는 질환의 중증도, 및 치료되는 대상체의 체중 또는 표면적에 의해 결정될 것이다. 용량의 크기는 또한 특정 대상체에 있어서 특정 화합물의 투여에 수반되는 임의의 부작용의 존재, 성질 및 정도에 의해 결정될 것이다. 치료할 질환의 치료 또는 예방시에 투여되는 화합물의 유효량을 결정하는데 있어서, 의사는 화합물의 순환 혈장 수준, 화합물 독성 및/또는 질환의 진행 등과 같은 인자들을 평가할 수 있다. 또한, 본 발명의 화합물은 대상체의 체중 및 전반적인 건강 상태에 따라 적용될 시에, 화합 물의 약동학 프로파일, 금기 약물 및 다양한 농도에서의 화합물의 부작용을 포함할 수 있는 인자들에 의해 결정되는 속도로 투여될 수 있다.
일반적으로, 치료법은 화합물의 최적 용량 미만인 보다 적은 투여량으로 개시된다. 그 이후에, 투여량은 환경하에서 최적 효과가 얻어질 때까지 조금씩 증가된다. 편의를 위해, 총 1일 투여량은 원하는 경우, 하루 동안에 소정의 분량으로 분할되어 투여될 수 있다.
사용 방법
본 발명의 화합물이 가장 통상적으로 반흔화를 감소시키는데 사용될 수 있지만, 본 발명은 이러한 특정 증상에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 화합물은 기존의 반흔을 감소시키는데 사용될 수 있다. 본 발명의 화합물은 또한 임의 유형의 TGFβ-매개된 증상을 완화시키는데 사용될 수 있다. TGFβ-매개된 증상의 예로는 모든 유형의 암 (예를 들어, 유방암, 폐암, 결장암, 전립선암, 난소암, 췌장암, 흑색종, 모든 혈액암 등), 및 모든 유형의 섬유성 질환 (예를 들어, 사구체신염, 당뇨병성 신장병증, 간 섬유증, 폐 섬유증, 동맥 과다형성 및 재협착, 경피증 및 피부 반흔화)이 있다. 한 특정 실시양태에서, TGFβ-매개된 증상은 피부 반흔화이다.
용어 "투여"는 화합물을 대상체와 접촉시키는 방법을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 화합물은 주사를 비롯한 다양한 경로에 의해, 즉 정맥내, 근육내, 피부내, 피하, 십이지장내, 비경구 또는 복막내로 투여될 수 있다. 또한, 본원에 기재된 화합물은 흡입에 의해, 예를 들어 비내로 투여될 수 있다. 추가적으로, 본 발명의 화합물은 경피, 국소 및 이식을 통해 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 경구로 전달된다. 화합물은 또한 직장내, 협측, 질내 또는 안내로 전달될 수 있다.
반흔화를 감소시키기 위해 투여되는 경우에, 본 발명의 화합물은 통상적으로 상처 및/또는 상처 주위의 영역에 적용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 화합물은 패치, 용액, 로션, 샐브, 크림, 연고, 리포좀, 스프레이, 겔, 포말제, 롤러 스틱, 또는 국소용 제약 조성물을 전달하는데 통상적으로 사용되는 임의의 여타 제형의 형태로 상처에 국소적으로 투여될 수 있다. 별법으로, 본 발명의 화합물은 상처 또는 상처 주의의 영역에 주사를 통해 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 봉합된, 철심으로 고정된, 테이핑된 및/또는 붕대로 감겨진 상처 등의 상처에 투여된다. 특정 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 상처 발생 직후에 투여된다. 다른 실시양태에서, 본 발명의 화합물은 상처 발생 후 1시간, 8시간, 12시간, 1일, 2일, 3일, 1주, 2주, 1개월, 6개월, 1년 이내, 또는 1년 초과의 기간 이내에 투여된다. 한 특정 실시양태에서, 상처는 절개를 통해 발생한다. 특정 실시양태에서, 치료상 유효량의 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 켈로이드성 반흔 형성을 억제하기 위해 그러한 치료가 필요한 포유동물에게 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서, 치료상 유효량의 본 발명의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염은 비후성 반흔 형성을 억제하기 위해 그러한 치료가 필요한 포유동물에게 투여될 수 있다. 특정 실시양태에서 반흔이 피부 상에 발생하는 경우에, 반흔 형성을 억제하는 치료가 필요한 포유동물에게 치료상 유효량의 화학식 I의 화 합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 반흔 형성을 억제하는 방법을 제공한다.
반흔화의 감소 또는 반흔 형성의 억제는, 본 발명의 화합물이 환자 또는 보건 의료인 (예를 들어, 의사)에 의해 판단되는 바와 같이 반흔이 생기는 것을 감소시키는 것과 관련있음을 의미하고자 한다. 반흔화의 감소 또는 반흔 형성의 억제는 치유 동안의 세포외 매트릭스 침착의 감소, 콜라겐 침착의 감소, 크기의 감소, 형태의 감소, 두께의 감소, 표면적의 감소, 중증도의 감소, 높이의 감소, 착색의 개선 등을 비롯한 하나 이상의 징후의 개선을 수반할 수 있다.
통상적인 실시양태에서, 화합물은 국소적으로 투여된다. 본원에 사용된 바와 같이, 국소 투여는 피부 또는 상처 영역에 직접적으로 화합물 (및 임의적 담체)을 적용하는 것을 나타낸다. 국소 투여는 특히 피부에의 상처에 적절하다. 용량은 변할 수 있지만, 일반적인 가이드라인으로서, 화합물은 약 0.01 내지 50 w/w％ 및 보다 통상적으로는 약 0.1 내지 10 w/w％의 양으로 제약상 허용되는 담체 중에 존재할 수 있다. 제약 조성물은 1일 1 내지 4회 환부에 적용될 수 있다.
본 발명의 추가 실시양태에서, 화합물은 그의 활성을 더 증진시키거나 잠재적인 부작용을 최소화하기 위해 여타 화합물, 작용제 또는 드레싱과 공동 투여될 수 있다. 본 출원에서 사용되는, 공동 투여는 화학식 I의 화합물을, 원하는 결과를 촉진시키는 투여 요법을 사용하여 통상적으로 상이한 작용 메카니즘을 갖는 제2 의약품과 함께 투여하는 것을 나타낸다. 이는 동시 투여, 하루 동안에 서로 다른 시간에의 투여, 또는 서로 다른 날에의 투여도 나타낼 수 있다. 화합물은 개별적 으로 투여될 수 있거나, 또는 단일 제형으로 조합될 수 있다. 반흔화의 감소를 위해, 작용제, 화합물 또는 드레싱은 본 발명의 화합물과 공동 투여될 수 있으며, 여기에는 TGFβ3, TGFβ1 항체, TGFβ2 항체, 트리암시놀론 아세토니드 (9-플루오로-11,16,17-트리히드록시-17-(2-히드록시아세틸)-10,13-디메틸-6,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17-도데카히드로시클로펜타[a]페난트렌-3-온), 스테로이드, 코르티코스테로이드, 항생제, 국소용 항생제 및 실리콘 시팅이 포함된다. 또한, 작용제, 화합물 또는 드레싱은 상처 치유를 개선시키기 위해 상처에 공동 투여될 수 있으며, 여기에는 5-플루오로우라실, 에스트로겐, nACh (니코틴계 아세틸콜린) 수용체 효능제, FGF (섬유아세포 성장 인자), EGF (상피세포 성장 인자), IGF (인슐린-유사 성장 인자) 및 PDGF (혈소판-유래된 성장 인자)가 포함된다.
또한, 하기 치료제가 TGFβ-매개된 증상을 치료하기 위해 본 발명의 화합물과 공동 투여될 수 있다. 적합한 치료제(들)의 예로는, 이들로 제한되지는 않지만 표준 비-스테로이드성 항염증제 (이하, NSAID라고 함) (예를 들어, 피록시캄, 디클로페낙), 프로피온산 (예를 들어, 나프록센, 플루비프로펜, 페노프로펜, 케토프로펜 및 이부프로펜), 페나메이트 (예를 들어, 메페남산, 인도메타신, 술린닥, 아파존), 피라졸론 (예를 들어, 페닐부타존), 살리실레이트 (예를 들어, 아스피린), COX-2 억제제 (예를 들어, 셀레콕시브, 발데콕시브 및 에토리콕시브), 진통제 및 관절내 치료제 (예를 들어, 코르티코스테로이드) 및 히알루론산 (예를 들어, 히알간 및 신비스크), 항암제 (예를 들어, 엔도스타틴 및 안지오스타틴), 세포독성 약 물 (예를 들어, 아드리아마이신, 다우노마이신, 시스-플라티눔, 에토포시드, 탁솔, 탁소테르), 알칼로이드 (예를 들어, 빈크리스틴) 및 항대사제 (예를 들어, 메토트렉세이트), 심혈관 제제 (예를 들어, 칼슘 채널 차단제), 지질 강하제 (예를 들어, 스타틴), 피브레이트, 베타-차단제, ACE 억제제, 안지오텐신-2 수용체 길항제 및 혈소판 응집 억제제, CNS 제제 (예를 들어, 항우울제 (예컨대, 세르트랄린)), 항-파킨슨 약물 (예를 들어, 데프레닐, L-도파, 레큅(Requip), 미라펙스(Mirapex)), MAOB 억제제 (예를 들어, 셀레진 및 라사길린), comP 억제제 (예를 들어, 타스마르(Tasmar)), A-2 억제제, 도파민 재흡수 억제제, NMDA 길항제, 니코틴 효능제, 도파민 효능제 및 뉴런 산화질소 신타제의 억제제, 항-알츠하이머 약물 (예를 들어, 도네페질, 타크린, COX-2 억제제, 프로펜토필린 또는 메트리포네이트), 골다공증 제제 (예를 들어, 롤록시펜, 드롤록시펜, 라소폭시펜 또는 포소맥스) 및 면역억제제 (예를 들어, FK-506 및 라파마이신)가 있다.
본 발명이 그의 특정 실시양태와 연계하여 기재되었지만, 추가의 변형이 가능하고, 본 출원은 일반적으로 본 발명의 취지에 따른 본 발명의 모든 변화, 사용 또는 응용을 포괄하도록 하며, 본 개시내용으로부터의 그러한 이탈은 당업계에 공지되었거나 관습적인 실시 수준의 범위 내에 있다는 것을 이해할 것이다. 하기 실시예 및 생물학적 데이터는 본 발명을 추가로 설명하기 위해 제공된다. 이러한 개시내용은 어떤 식으로든 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
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실시예 1. 2-(1-(6- 메틸피리딘 -2-일)-1H- 피라졸 -5-일) 티에노 [3,2-c]피리딘.
단계 i: 티에노[3,2-c]피리딘 . 티에노[3,2-c]피리딘 (9.20 g; 진한 브라운 오렌지색 고체; 문헌 [Wikel et al. (1993) J. Het. Chem., 30: 289-290] 참조)을 CH2Cl2에 용해시켜 컬럼 크로마토그래피하였다 (바이오타지 호리즌 시스템(Biotage Horizon system), 120 g 이스코 레디셉(Isco RediSep) 컬럼, 헥산으로 평형화, 45％ EtOAc ("에틸 아세테이트")/헥산으로 용리, 등용매용리). 수집한 분획은 담황색 오일이었고 이를 진공하에 농축시켜 고체 8.48 g을 제공하였다.
별법으로, 티에노[3,2-c]피리딘을 또한 다음과 같이 정제하였다: 티에노[3,2-c]피리딘 (84.6 g)을 대략 180 mL의 디클로로메탄에 용해시켰다. 용액을 대체로 동일한 3 분량으로 나누었다. 각각의 분량을 플래쉬 실리카 카트리지 (아날로직스 수퍼플래쉬(Analogix SuperFlash) SF65-400)에 적용하여 등용매용리법 (헥산 중 45％ 또는 50％ 에틸 아세테이트)으로 용리하였다. 목적 분획을 농축시켜 티에노[3,2-c]피리딘을 밝은 황색 고체로서 제공하였다. 3회의 조합된 크로마토그래피로 표제 화합물 총 75 g을 수득하였다;
Figure 112009022642739-PCT00013
단계 ii: 1-( 티에노[3,2-c]피리딘 -2-일) 에타논 . THF (테트라히드로푸란) 75 mL 중 티에노[3,2-c]피리딘 (5.0 g)의 용액을 CH3CN/드라이아이스조에서 -45℃로 냉각시켰다. 내부 온도를 -40℃ 이하로 유지시키면서 n-부틸리튬 (헥산 중 1.6 M) (35.0 mL)을 적가하였다. 약 45분 첨가하였다. 반응물을 -45℃에서 1시간 동안 교반하였다. THF 5 mL 중의 N-메틸-N-메톡시아세트아미드를 첨가하고, 그 결과 반응물은 -30℃로 가온되었다. 반응물을 -45℃에서 1.5시간 동안 교반하였다. 반응물을 포화 NH4Cl로 켄칭시켰다. 수성층은 약 8의 pH를 가졌다. 수성층을 EtOAc로 3회 추출하였다. 합쳐진 유기 추출물을 염수로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시켰다. 상기 물질을 여과하고, 회전식 증발기에서 농축시키고, 컬럼 크로마토그래피하였다 (바이오타지 호리즌 시스템, 120 g 아날로직스 컬럼, 헥산으로 평형화, 50％ EtOAc/헥산으로 용리). 가장 순수한 분획을 회전식 증발기에서 농축시키고, 이후 Et2O로 분쇄하여 약간의 색을 제거하였으며, 여과에 의해 엷은 오렌지색 고체를 수집하였다 (2.667 g).
단계 iii: (E)-3-(디메틸아미노)-1-( 티에노[3,2-c]피리딘 -2-일) 프로프 -2-엔-1-온. N,N-디메틸포름아미드-디메틸아세탈 (DMF-DMA) (9.5 mL)을 DMF 20 mL 중 1-(티에노[3,2-c]피리딘-2-일)에타논 (3.17 g)의 용액에 첨가하였다. 반응물을 밤새 70℃로 가열하였다. 이후, 반응물을 실온으로 냉각시켰다. DMF를 회전식 증발기에서 제거하여 진한 브라운 오렌지색 고체를 얻었다. 잔류물을 EtOAc 및 물로 희석시켰다. 다량의 황색 고체가 분명히 나타났다. 이를 여과에 의해 수집하였다 (3.54 g). 상기 고체를 50℃ 진공 오븐에서 건조시켰다.
단계 iv: 2-(1-(6- 메틸피리딘 -2-일)-1H- 피라졸 -5-일) 티에노 [3,2-c]피리딘. (E)-3-(디메틸아미노)-1-(티에노[3,2-c]피리딘-2-일)프로프-2-엔-1-온 (3.69 g) 및 1-(6-메틸피리딘-2-일)히드라진 (3.3 g) (이는 실시예 7, 단계 ii에 기재된 바와 같이 합성할 수 있음)을 아세트산 40 mL에 용해시켰다. 반응물을 4.5시간 동안 80℃로 가열하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, 용매를 회전식 증발기에서 제거하였다.
진한 오렌지 레드색 잔류물을 EtOAc에 용해시키고, 수성층이 pH 약 7 내지 8이 될 때까지 포화 NaHCO3을 첨가하였다 (약 250 mL). 수성층을 EtOAc로 4회 추출하였다. 합쳐진 유기 추출물을 염수로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시켰다. 상기 물질을 여과하고, 농축시키고, 컬럼 크로마토그래피하였다 (바이오타지 호리즌 시스템, 80 g 이스코 레디셉 컬럼, EtOAc/헥산을 이용하여 0-50％, 50％에서 유지, 50-75％, 75％에서 유지).
목적 물질을 함유하는 분획을 합하고 농축시켰다. 얻어진 물질을 고온의 MeOH에 용해시킨 후, 실온으로 냉각시 침전물이 형성되었다. 실온에서 1시간 이후, 플라스크를 4℃에서 3시간 동안 보관하였다. 고체를 여과에 의해 수집하고, 헥산으로 세정하여 2.79 g을 얻었다. 물질을 비등 아세토니트릴에 용해시키고, 실온으로 냉각시켰다. 일단 침전물이 분명히 나타나게 되면, 침전물을 여과에 의해 수집하였다. 침전물은 원하지 않는 위치이성질체 (2-(1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-3-일)티에노[3,2-c]피리딘)였다. 상기 과정을 4회 반복하여, 목적 위치이 성질체 (2-(1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일)티에노[3,2-c]피리딘)를 갖는 아세토니트릴 여과물을 농축시켰다. 총 수득량 1.21 g의 목적 생성물 (2-(1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일)티에노[3,2-c]피리딘)을 얻었다.
Figure 112009022642739-PCT00014
실시예 2. 2-[3- 메틸 -1-(6- 메틸피리딘 -2-일)-1H- 피라졸 -5-일] 티에노 [3,2-c]피리딘.
단계 i: 티에노[3,2-c]피리딘 -2-일 보론산 . 티에노[3,2-c]피리딘 (5.0 g, 37 mmol, 1 당량)을 함유하는, 내부 온도계가 장착된 3-목 플라스크를 탈기시키고, 이후 질소 기체 대기로 충전시켰다. THF (60 mL)를 첨가하고, 용액을 -44℃ (CH3CN/드라이아이스)로 냉각시켰다. 내부 온도를 -33℃ 이하로 유지시키면서 n-부틸리튬 (1.6 M/헥산, 25 mL, 41 mmol, 1.1 당량)을 10분에 걸쳐서 첨가하였다. 반응물을 -33 내지 -45℃에서 60분 동안 교반하였다. 트리이소프로필 보레이트 (10.2 mL, 44 mmol, 1.2 당량)를 첨가하고, 냉각조를 제거하였다. 반응을 105분 동안 진행시켰다. 이후, 인산 3.0 mL (85％ 수성, 3.0 mL, 44 mmol, 1.2 당량)를 첨가하였다. 황색 고체가 형성되었으며, 이를 물 및 Et2O (각각 약 150 mL)로 희석시켰다. 황색 고체를 여과에 의해 수집하고, 밤새 흡인에 의해 건조시켰다 (5.05 g).
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C7H6BNSO2·H3PO4에 대한 미량분석: 계산치 C, 30.35; H, 3.27; N, 5.06; P, 11.18. 실측치: C, 41.12; H, 3.19; N, 6.53; P, 0.68％.
단계 ii. 3- 메틸 -1-(6- 메틸피리딘 -2-일)-1H- 피라졸 -5-올. 에틸 아세토아세테이트 (10 mL, 78 mmol) 및 (6-메틸-피리딘-2-일)-히드라진 (10.1 g, 82 mmol)을 아세트산 100 mL 중에서 합하였다. 반응물을 4시간 15분 동안 80℃로 가열하였다. 반응물을 실온으로 냉각시켰다. 용매를 회전식 증발기에서 제거하여 암색 잔류물을 제공하였으며, 이를 EtOAc에 용해시켰다. 용액을 포화 NaHCO3으로 2회, 이후 물로 1회, 이후 염수로 1회 세척하였다. 적갈색 고체가 2상 혼합물에서 분명히 나타났다. 상기 2상 혼합물을 여과하여, 고체를 수집하였다. 고체를 Et2O로 세척하여 제1 고체를 제공하였다 (6.02 g). 여과물의 층을 분별 깔때기를 사용하여 분리하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조시켰다. 물질을 여과하고, 회전식 증발에 의해 농축시켰다. 얻어진 갈색 고체를 Et2O로 분쇄하고, 여과하여, 제2 고체 (1.98 g) 및 제1 여과물을 제공하였다. 고체가 제1 여과물로부터 침전되었으며, 여과물을 또 다른 필터에 부어 수집함으로써, 제3 고체 1.69 g을 제공하였다. 제1 여과물 및 1.98 g (제2 고체)을 건고 상태로 농축시켰다. 얻어진 고체를 고온의 EtOAc에 용해시키고, 혼탁함이 지속될 때까지 헥산을 첨가하였다. 용액을 밤새 정치하였다. 매우 진한 색의 고체를 여과에 의해 단리하고 컬럼 크로마토그래피하였다 (바 이오타지 호리즌 시스템, 35 g 아날로직스 컬럼, 30％ EtOAc/헥산). 황색 고체를 단리하여 고온의 EtOAc에 용해시키고, 혼탁함이 지속될 때까지 헥산을 첨가하였다. 용액을 밤새 정치하였다. 모액을 따라내고, 고체를 50℃ 진공 오븐에서 수시간 동안 건조시켜 제4 고체를 제공하였다. 제1 고체 (6.02 g), 제3 고체 (1.69 g) 및 제4 고체 (4.03 g)를 합하여 표제 화합물 11.74 g을 제공하였다.
단계 iii. 3- 메틸 -1-(6- 메틸피리딘 -2-일)-1H- 피라졸 -5-일 트리플루오로메탄술포네이트 . CH2Cl2 (100 mL) 및 Et3N (트리에틸아민) (8.1 mL) 중 3-메틸-1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올 (10.0 g)의 혼합물을 -70℃에서 냉각시켰다. 온도를 -50℃ 미만으로 유지시키면서 트리플산 무수물 (9.8 mL)을 10분에 걸쳐서 첨가하였다. 반응 현탁액을 실온으로 가온시키면, 용액이 되었다. 용액을 농축시켜 대부분의 CH2Cl2를 제공하였다. 바이오타지 자동 분획 수집기; EtOAc/헥산 (20/80)을 사용하여 용액을 아날로직스 수퍼플래쉬 SF65-400에 바로 로딩하였다. 무색 액체를 함유하는 분획을 단리하였다 (9.46 g).
단계 iv. 2-[3- 메틸 -1-(6- 메틸피리딘 -2-일)-1H- 피라졸 -5-일] 티에노 [3,2-c]피리딘.
환류 응축기가 장착된 100 mL 용량의 3-목 둥근 바닥 플라스크에 3-메틸-1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일 트리플루오로메탄술포네이트 (1.16 g), 티에노[3,2-c]피리딘-2-일보론산 (1.0 g), 제3인산칼륨 (2.3 g) 및 디옥산 30 mL를 첨가하였다. 플라스크를 진공하에 탈기시키고, 현탁액을 질소 기체로 버블링하였다. 여기에 PdCl2(dppf) (스트렘(Strem), 디클로로[1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]팔라듐 (II) 디클로로메탄 부가생성물, 0.60 g)를 첨가하였다. 다시, 플라스크를 진공하에 탈기시키고, 현탁액을 질소 기체로 버블링하였다. 반응물을 100℃로 가열하고, 밤새 반응하도록 하였다. 반응물을 실온으로 냉각시키고, EtOAc (약 600 mL)로 용리하여 셀라이트 패드를 통해 여과하였다. EtOAc 여과물을 회전식 증발기에서 건고 상태로 농축시켰다. 잔류물을 CH2Cl2로 희석시키고, 베이지색 고체를 여과 제거하였다. CH2Cl2 여과물을 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다 (바이오타지 호리즌 시스템, 34 g 아날로직스 컬럼, 0-100％ EtOAc/hep, 100％ EtOAc, 이어서 10％ MeOH/EtOAc에서 유지). 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하고, 회전식 증발기에서 농축시켜, 암색 오일을 얻었다.
암색 오일 (약 800 mg)을 페노메넥스(Phenomenex), 제미니(Gemini) C-18 컬럼 상의 정제용 컬럼 크로마토그래피 (150×19 mm, 5 μM; 이동상 A: 물 (+0.1％ NH4OH), B: CH3CN (+0.1％ NH4OH); 구배: 10분에 걸쳐 90-10％ A, 1.5분 동안 90％ A에서 유지; 유속: 28 mL/분; 주입 부피: 2 mL; 검출: DAD 210-350 nm, MS APCI+, MS APCI-)에 적용하였다.
목적 분획을 회전식 증발기에서 건조시켰다. 고체를 고온 EtOH에 용해시키고, 헵탄 2 내지 5 mL를 첨가하였다. 정치 이후, 물질을 여과하였다.
여과물을 건고 상태로 농축시켰다. 디에틸에테르를 첨가하고, 용액을 소결 유리 깔때기에서 여과하였다. 추가의 디에틸에테르를 사용하여, 10 mg 미만의 갈색 고체가 소결 유리 깔때기에 남을 때까지 물질을 세척하였다. 여과물을 건고 상태로 농축시켜 회백색 고체를 얻었다.
회백색 고체를 고온 EtOH (약 1-2 mL)에 용해시키고, 혼탁함이 지속될 때까지 헵탄으로 희석시키고, 정치하였다. 이후 침상체 (약간 황색)가 용액으로부터 침전되기 시작하였다. 약 3시간 이후, 모액을 또 다른 플라스크로 따라냈다. 침상체를 40℃ 진공 오븐에서 48시간에 걸쳐서 건조시켜, 백색 고체 65 mg을 제공하였다. 융점 131-132℃.
Figure 112009022642739-PCT00016
실시예 3. 2-[3-에틸-1-(6- 메틸피리딘 -2-일)-1H- 피라졸 -5-일] 티에노 [3,2-c]피리딘.
단계 i: 5-에틸-2-(6- 메틸 -피리딘-2-일)-2H- 피라졸 -3-올. 빙초산 (100 mL) 중 (6-메틸-피리딘-2-일)-히드라진 (10.0 g) 및 에틸 프로피오닐아세테이트 (12 mL)의 교반 혼합물을 5시간 동안 80℃로 가온시켰다. 반응 혼합물을 감압하에 농축시키고, 증발물을 포화 수성 중탄산나트륨 (200 mL)으로 처리하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트 (200 mL)로 추출하였다. 유기상을 소정 분량의 새로운 포화 수성 중탄산나트륨 (200 mL), 물 (200 mL) 및 염수 용액 (200 mL)으로 세척하였다. 후속적으로, 유기상을 무수 황산나트륨 상에서 건조시키고, 감압하에 농축시켰다. 증발물을 플래쉬 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 소정의 구배 (100％ 헥산 → 헥산 중 60％ 에틸 아세테이트)로 실리카 카트리지 (아날로직스, 400 g)를 통해 용리하여 오일을 수득하였다. 오일을 클로로포름 중에서 재구성시키고, 용액을 감압하에 농축시켜, 오일로서 표제 화합물을 수득하였다 (7.2 g).
Figure 112009022642739-PCT00017
단계 ii: 트리플루오로 - 메탄술폰산 5-에틸-2-(6- 메틸 -피리딘-2-일)-2H- 피라 졸-3-일 에스테르. 질소 대기하에 -78℃에서 디클로로메탄 (75 mL) 중 5-에틸-2-(6-메틸-피리딘-2-일)-2H-피라졸-3-올 (7.1 g) 및 트리에틸아민 (5.4 mL)의 교반 혼합물에 트리플루오로메탄술폰산 무수물 (6.5 mL)을 5분에 걸쳐 첨가하였다. 냉각조를 제거하였으며, 반응 혼합물을 실온으로 가온시키고, 밤새 교반하였다. 반응 혼합물을 감압하에 농축시켰으며, 농축물을 플래쉬 실리카 겔 컬럼 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 소정의 구배 (2400 mL에 걸쳐 100％ 헥산 → 헥산 중 35％ 에틸 아세테이트)로 실리카 카트리지 (아날로직스 수퍼플래쉬 SF65-400)를 통해 용리하여, 클로로포름 제거 이후 오일로서 표제 화합물을 수득하였다 (10.38 g).
Figure 112009022642739-PCT00018
단계 iii: 2-[3-에틸-1-(6- 메틸피리딘 -2-일)-1H- 피라졸 -5-일] 티에노 [3,2-c]피리딘. 환류 응축기가 장착된 100 mL 용량의 3-목 둥근 바닥 플라스크에 3-에틸-1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일 트리플루오로메탄술포네이트 (1.21 g), 티 에노[3,2-c]피리딘-2-일보론산 (1.0 g), 제3인산칼륨 (2.3 g) 및 디옥산 30 mL를 첨가하였다. 플라스크를 진공하에 탈기시키고, 현탁액을 질소 기체로 버블링하였다. 여기에 PdCl2(dppf) (스트렘, 디클로로[1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]팔라듐 (II) 디클로로메탄 부가생성물, 0.60 g)를 첨가하였다. 다시, 플라스크를 진공하에 탈기시키고, 현탁액을 질소 기체로 버블링하였다. 반응물을 100℃로 가열하고, 밤새 진행시켰다. 반응물을 실온으로 냉각시켰다. 이후, 반응물을 셀라이트를 통해 여과하고, EtOAc로 잘 세정하였다. 여과물을 회전식 증발기에서 농축시켰으며, 암색 오일상 물질을 CH2Cl2로 희석시켰다. 회백색 고체를 CH2Cl2로부터 여과하였다. 여과물을 컬럼에 로딩하였다 (바이오타지 호리즌 시스템, 34 g 아날로직스 컬럼, 0-100％ 헵탄/EtOAc, 이후 100％ EtOAc에서 유지). 목적 분획을 수집하여 암색 오일을 수득하였다 (약 900 mg). 분획을 상기 실시예 2에 기재된 바와 같이 페노메넥스, 제미니 C-18 컬럼 상에서 크로마토그래피하였다.
목적 분획을 합하고, 회전식 증발기에서 건조시켜 고체 샘플을 제공하였다. 고체 샘플을 따뜻한 EtOH에 용해시켰다. 용액을 회전식 증발기에서 건고 상태로 농축시켜 암색 잔류물을 얻었다. 잔류물을 45℃ 진공 오븐에서 2시간 동안 건조시켰다. 얻어진 물질은 일부는 암색 오일이고 일부는 고체였다. 디에틸에테르를 첨가하고, 물질을 여과하여, 암갈색 고체 및 밝은 오렌지-옐로우색 여과물을 제공하였다. 여과물을 건고 상태로 농축시켜, 황갈색 고체를 얻었다 (231 mg).
디에틸에테르를 황갈색 고체에 첨가하였다. 물질을 플루트 필터지를 통해 여과하였으며, 필터지에 갈색 잔류물이 남았다. 여과물을 회전식 증발기에서 건고 상태로 농축시켰다. 얻어진 고체를 다시 고온의 EtOH (1-2 mL)에 용해시키고, 혼탁함이 지속될 때까지 헵탄으로 희석시켰다. 2시간 정치한 이후, 획실히 침전물은 없었다. 이후, 액체를 건고 상태로 농축시켰다. 회전식 증발기 상에서 액체가 원래 부피의 대략 절반으로 줄어들었을 때, 갈색 고체가 분명히 나타났다. 액체를 회전식 증발기로부터 제거하였으며, 용액은 백색의 혼탁함을 나타내기 시작하였다. 액체를 필터지를 사용하여 또 다른 플라스크로 여과하여 갈색 고체를 제거하였다. 백색 고체가 여과물에서 침전되기 시작하였다. 약 15분 이후, 더이상의 침전이 관찰되지 않았으며, 물질을 여과하여 고체를 얻었다. 고체를 40℃ 진공 오븐에서 약 48시간 동안 건조시켜 71 mg을 제공하였다. 융점 89-90℃.
Figure 112009022642739-PCT00019
실시예 4. 2-[4-에틸-1-(6- 메틸피리딘 -2-일)-1H- 피라졸 -5-일] 티에노 [3,2-c]피리딘.
단계 i: 4-에틸-1-(6- 메틸피리딘 -2-일)-1H- 피라졸 -5-올. DMF (15 mL) 중 KOMe (14.0 g) 및 에틸 부티레이트 (19.8 mL)의 현탁액을 실온에서 교반하였다. 에틸 포르메이트 (8.1 mL)를 15분에 걸쳐 첨가하였으며, 이는 심한 발포를 유발하였다. 반응물을 추가 시간 동안 교반하였으며, 반응물은 발포층이 없이 교반가능한 혼합물이 되었다. 1-(6-메틸피리딘-2-일)히드라진 (12.3 g), MeOH (35 mL) 및 HOAc (5.7 mL)의 용액을 20분에 걸쳐 첨가하였다. 반응은 발열반응이었으며, 초기 첨가 이후 30℃의 온도에 이르렀다. 빙수조를 사용하여 나머지 용액의 첨가 동안 반응물을 20℃ 미만으로 유지시켰다. 반응물을 3시간 동안 환류하에 가열하고, 이후 실온에서 약 48시간 동안 교반하였다.
반응물을 빙수조로 10℃로 냉각시켰다. HOAc (10 mL)로 pH를 약 7로 조정하여 교반가능하지 않은 농후한 질량체를 얻었다. 반응물을 H2O (100 mL)로 희석시켜 암적색 용액을 얻었다. 용액을 EtOAc (200 mL)로 추출하였다. 유기상을 H2O (2×100 mL)로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), SiO2 (30 mL)를 통해 여과하였다. 상기 물질을 농축시켜 암갈색 오일 10.50 g을 제공하였다. 아날로직스 수퍼플래쉬 SF65-400 및 바이오타지 자동 분획 수집기; EtOAc/헥산 (40/60)을 사용하여 오일을 크로마토그래피하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 합하여 옐로우-오렌지색 액체 6.40 g을 수득하였다.
단계 ii: 4-에틸-1-(6- 메틸피리딘 -2-일)-1H- 피라졸 -5-일 트리플루오로메탄술포네이트 . CH2Cl2 (65 mL) 및 Et3N (4.8 mL) 중 4-에틸-1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올 (6.40 g)의 용액을 -70℃에서 냉각시켰다. 온도를 -50℃ 미만으로 유지시키면서 트리플산 무수물 (Tf2O) (5.83 mL)을 10분에 걸쳐 첨가하였다. 반응은 발열반응이었다. 반응물을 -50℃ 미만에서 추가로 30분 동안 교반하고, 이후 실온으로 가온시켰다. 이후, 반응물을 -50℃ 미만으로 냉각시키고, 추가 분량의 Tf2O (1.1 mL; 20％) 및 Et3N (1.0 mL; 20％)을 첨가하였다. 1시간의 인큐베이션 이후, 반응물을 농축시켜 대부분의 CH2Cl2를 제거하였다. 반응물을 호리즌 자동 분획 수집기; EtOAc/헵탄 (20/80)을 사용하여 아날로직스 수퍼플래쉬 SF40-150에 바로 로딩하였다. 컬럼을 EtOAc/헵탄 (30/70)으로 세척하였다. 목적 생성물을 함유하는 분획을 수집하여, 담황색 액체로서 6.98 g을 제공하였다.
단계 iii: 2-[4-에틸-1-(6- 메틸피리딘 -2-일)-1H- 피라졸 -5-일] 티에노 [3,2-c]피리딘. 환류 응축기가 장착된 100 mL 용량의 3-목 둥근 바닥 플라스크에 4-에틸-1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일 트리플루오로메탄술포네이트 (1.2 g), 티에노[3,2-c]피리딘-2-일보론산 (1.2 g), 제3인산칼륨 (2.3 g) 및 디옥산 30 mL를 첨가하였다. 플라스크를 진공하에 탈기시키고, 현탁액을 질소 기체로 버블링하였다. 여기에 PdCl2(dppf) (스트렘, 디클로로[1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]팔라듐 (II) 디클로로메탄 부가생성물, 0.60 g)를 첨가하였다. 다시, 플라스크를 진공하에 탈기시키고, 현탁액을 질소 기체로 버블링하였다. 반응물을 밤새 100℃로 가열하였다. 이후, PdCl2(dppf) (스트렘, 디클로로[1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]팔라듐 (II) 디클로로메탄 부가생성물) 0.295 g을 첨가하고, 4시간 15분 동안 계속 반응시켰다. 반응물을 실온으로 냉각시켰다.
반응 내용물을 셀라이트를 통해 여과하고, 목적 생성물이 용리될 때까지 EtOAc로 잘 세정하였다. 여과물을 회전식 증발기에서 건고 상태로 농축시켜 암색 잔류물을 형성하였다. 암색 잔류물을 CH2Cl2에 녹이고, 고체를 여과하였다. 얻어진 여과물을 회전식 증발기에서의 농축에 의해 감소시키고, 이후 컬럼 (바이오타지 호리즌 시스템, 700 mL에 걸쳐 0-100％ EtOAc, 이후 100％ EtOAc, 500 mL에서 유지)에 물질을 로딩하였다. 분명히 나타난 대부분의 생성물을 갖는 튜브는 플라스크의 측면에 백색 고체를 가졌다.
목적 생성물을 함유하는 튜브를 회전식 증발에 의해 농축시켜 암색 오일을 수득하였다. 암색 오일을 Et2O로 분쇄하고, 고체를 여과하였다. 추가의 고체 침전물을 여과물로부터 단리하고, 처음의 여과로부터의 고체와 합하였다. 합쳐진 고체를 고온 EtOH (약 2 mL)에 용해시켰다. 침전물이 형성되기 시작할 때까지 헵탄을 첨가하였다. 이후, 암색 고체가 형성되었다. 약 10분 이후, 고체 침전이 종료된 것으로 보였다. 혼합물을 필터지를 통해 또 다른 플라스크로 여과하였다. 혼탁함이 지속될 때까지 여과물을 추가의 헵탄으로 희석시켰다. 여과물을 실온에서 밤새 정치하였다. 플라스크 바닥에의 암색 잔류물과 함께 백색 침상체가 플라스크에 형성되었다. 플라스크의 내용물을 회전식 증발기에서 건고 상태로 농축시키고, 1 내지 2 mL의 고온 EtOH에 용해시키고, 필터지를 통해 여과하고, 혼탁함이 지속될 때까지 헵탄으로 희석시켰다. 플라스크를 2시간 동안 정치하였다. 이후 혼합물을 회전식 증발기에 두어 물질의 부피를 감소시켰다. 회전식 증발기에서 원래 부피의 대략 절반이 존재할 때 갈색 고체가 분명히 나타나게 되었다. 플라스크를 회전식 증발기로부터 제거하고, 필터지를 사용하여 또 다른 플라스크로 여과하여 갈색 고 체를 제거하였다. 백색 고체가 여과물에서 침전되기 시작하였다. 백색 고체를 여과에 의해 수집하고, 40℃ 진공 오븐에서 48시간 이상 동안 건조시켜, 표제 화합물 85 mg을 얻었다.
Figure 112009022642739-PCT00020
실시예 5. 2-(2-(6- 메틸피리딘 -2-일)-2,4,5,6- 테트라히드로시클로펜타[c]피라졸 -3-일) 티에노 [3,2-c]피리딘.
단계 i: 티에노[3,2-c]피리딘 -2- 보론산 . -40℃에서 무수 테트라히드로푸란 (25 mL) 중의 티에노[3,2-c]피리딘 (2.0 g)으로 이루어진 교반 혼합물에 헥산 중의 1.6 M n-부틸리튬 (10 mL)으로 이루어진 용액을 수분에 걸쳐 첨가하였다 (먼저 적가하고, 이어서 느린 정상 상태의 스트림으로 첨가). 반응 혼합물을 5분 동안 교반하고, 후속적으로 트리이소프로필 보레이트 (4.2 mL)를 첨가하였다. 냉각조를 제거하고, 혼합물을 1시간 동안 교반하였다. 물 (2 mL)을 교반 혼합물에 첨가하였으며, 이는 담황색 고체가 즉시 침전되도록 하였다. 침전물을 진공 여과에 의해 수집하고, 고체를 물로 간단히 세정하고 (혼탁한 황색 여과물을 얻음), 후속적으로 디에틸 에테르로 세정하였다 (진한 오렌지색 여과물을 얻음). 여과물의 수성 분량을 유기 용매로부터 분리하고, 이후 1,4-디옥산 (100 mL)으로 희석시켰으며, 용액을 감압하에 농축시켰다. 1,4-디옥산 (100 mL)을 농축물에 첨가하고, 후속적으로 감압하에 농축시키는 것을 2회 반복하여 최종 증발시 황색 분말 (0.8 g)을 수득하 였다.
단계 ii: 2-[(6- 메틸 -피리딘-2-일)- 히드라조노 ]- 시클로펜탄카르복실산 에틸 에스테르. 에탄올 (100 mL) 중 에틸 2-옥소시클로펜탄카르복실레이트 (6.34 g, 5.88 mL) 및 (6-메틸-피리딘-2-일)-히드라진 (5 g)의 용액을 질소 대기하에 약 19시간 동안 80℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 실온으로 냉긱시키고, 용매를 진공하에 제거하여 조질의 물질 (7.72 g)을 제공하였으며, 이를 다음 반응에서 직접 취하였다.
단계 iii: 2-(6- 메틸 -피리딘-2-일)-2,4,5,6- 테트라히드로 - 시클로펜타피라졸 -3-올. 메탄올 (250 mL) 중 조질의 2-[(6-메틸-피리딘-2-일)-히드라조노]-시클로펜탄카르복실산 에틸 에스테르 (6.6 g) 및 나트륨 메톡시드 (2.73 g)의 용액을 감압하에 거의 건고 상태로 농축시켜 갈색 페이스트를 제공하였다. 이후, 상기 페이스트를 과다한 버블링을 주의하면서 2시간 동안 160℃로 가열하였다. 2시간 이후, 반응물을 실온으로 냉각시키고, 물 (100 mL)을 첨가하였다. 1 N HCl로 pH를 7로 조정하고, 이후 에틸 아세테이트 (200 mL)를 첨가하였으며, 침전물 용해가 일어날 때까지 얻어진 혼합물을 교반하였다. 층을 분리하고, 수성층을 또 다른 분량의 에틸 아세테이트 (100 mL)로 세척하였다. 합쳐진 유기층을 물 (200 mL) 및 염수 (200 mL)로 세척하고, MgSO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 진공하에 농축시켜 생성물 (3.6 g)을 제공하며, 임의의 추가 정제 없이 사용하였다.
별법: 동일한 반응을 2-[(6-메틸-피리딘-2-일)-히드라조노]-시클로펜탄카르 복실산 에틸 에스테르 21.0 g으로 출발하여 125℃의 보다 낮은 온도에서 수행하여 조질의 생성물 17.3 g을 제공할 수 있다.
단계 iv: 트리플루오로 - 메탄술폰산 2-(6- 메틸 -피리딘-2-일)-2,4,5,6- 테트라히드로 - 시클로펜타피라졸 -3-일 에스테르. 오븐 건조된 둥근 바닥 플라스크에 디클로로메탄 (350 mL) 중의 2-(6-메틸-피리딘-2-일)-2,4,5,6-테트라히드로-시클로펜타피라졸-3-올 (17.3 g) 및 트리에틸아민 (9.76 g, 13.44 mL)을 첨가하고, 반응 혼합물을 -78℃로 냉각시켰다. 여기에 트리플루오로메탄 술폰산 무수물 (16.23 mL)을 10분에 걸쳐 균압 깔때기를 통해 첨가하였다. 얻어진 혼합물을 -78℃에서 1시간 동안 교반하고, 이후 실온으로 가온시키고 추가 시간 동안 교반하였다. 용매를 진공하에 제거하여 갈색 침전물을 제공하였다. 상기 갈색 침전물을 플래쉬 실리카 겔 크로마토그래피 (60％ 헥산/40％ 에틸 아세테이트)를 통해 정제하여 회백색 고체 (8.848 g), 이어서 약간 덜 순수한 물질의 또 다른 물질 뱃치 (12.2 g)를 제공하였다.
단계 v: 2-(2-(6- 메틸피리딘 -2-일)-2,4,5,6- 테트라히드로시클로펜타[c]피라졸 -3-일) 티에노 [3,2-c]피리딘. 환류 응축기 및 기체 유입구 밸브가 장착된, 오븐 건조된 3-목 둥근 바닥 플라스크에 티에노[3,2-c]피리딘-2-보론산 (0.7 g)을 충전하였다. 플라스크를 탈기시키고, 질소 기체로 3회 퍼징하였다. 플라스크의 내용물을 질소 대기하에 4일 동안 유지하였다. 반응 플라스크에 트리플루오로-메탄술폰산 2-(6-메틸-피리딘-2-일)-2,4,5,6-테트라히드로-시클로펜타피라졸-3-일 에스테르 (0.7 g), 제3인산칼륨 (2.5 g) 및 1,4-디옥산 (30 mL)을 첨가하였다. 플라스크 를 탈기시키고, 질소로 3회 더 퍼징하였다. 디클로로[1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]팔라듐 (II) 디클로로메탄 부가생성물 (0.65 g) 및 1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센 (0.43 g)을 첨가하였으며, 혼합물을 탈기시키고 질소로 3회 더 퍼징하였다. 교반 혼합물을 밤새 환류시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (250 mL)로 희석시켰으며, 용액을 활성탄으로 처리하고, 셀라이트를 통해 여과하였다.
얻어진 여과물을 감압하에 농축시켰으며, 목적 물질이 용리될 때까지 1800 mL에 걸쳐 100％ 헥산 → 100％ 에틸 아세테이트, 이어서 100％ 에틸 아세테이트로 바이오타지 시스템에서의 120 g 레디셉 플래쉬 실리카 카트리지 상에서 농축물을 정제하였다. 목적 물질은 암색 잔류물이었다. 암색 액체를 플라스크 내부에 부착된 고체로부터 분리하였다. 액체를 피펫으로 배출시킴으로써 무수 에탄올로 제거하고, 암색 용액을 암색 점성 잔류물로 밤새 증발시켰다. 물질을 아세토니트릴 (15 mL)에 용해시키고, 정제용 HPLC에 의해 정제하였다 (워터스(Waters) 정제용 HPLC 시스템; 정지상: 워터스 델트팍(DeltPak) C18 5 μm, 100 옹스트롬, 300×50 mm I.D., P/N 011801, WAT 011801, No. 330C09125W; 이동상: 30분에 걸쳐 0.1％ 포름산을 함유하는 80:20 내지 40:60 물-아세토니트릴). 합쳐진 분획을 합하고, 감압하에 농축시켜, 투명한 무색 수용액을 얻었다. 용액을 포화 수성 탄산칼륨으로 처리하여 유백색 현탁액을 얻었다. 1 분량의 디에틸 에테르 및 2 분량의 에틸 아세테이트로 추출하고, 합쳐진 추출물을 무수 탄산칼륨 상에서 건조시키고, 감압하에 농축시켜, 시간에 따라 고형화되기 시작하는 필름을 얻었다. 상기 필름을 무수 에탄올에 용해시키고, 감압하에 농축시켜, 시간에 따라 고형화되는 밝은 황색 오일 을 수득하였다. 실온에서 물질을 고진공에 가하여 밝은 황색 고체로서 표제 화합물을 수득하였다 (21 mg); 융점: 고체 형태는 121 내지 126℃에서부터 형성되며, 146 내지 148℃에서 용융한다.
Figure 112009022642739-PCT00021
실시예 6. 2-[3,4-디메틸-1-(6- 메틸피리딘 -2-일)-1H- 피라졸 -5-일] 티에노 [ 3,2-c]피리딘 .
단계 i. 3,4-디메틸-1-(6- 메틸피리딘 -2-일)-1H- 피라졸 -5-올. 250 mL 용량의 둥근 바닥 플라스크에 에틸 2-메틸 아세토아세테이트 (5.0 g, 35 mmol), 1-(6-메틸피리딘-2-일)히드라진 (4.48 g, 36 mmol) 및 아세트산 12 mL를 첨가하였다. 혼합물을 80℃에서 9시간 동안 가열하였다. 물 및 EtOAc를 혼합물에 첨가하였다. 층을 분리하였다. 수성층을 EtOAc로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 물 및 염수로 세척하고, 건조시키고 (MgSO4), 여과하고, 진공하에 농축시켰다 (6.68 g).
단계 ii. 3,4-디메틸-1-(6- 메틸피리딘 -2-일)-1H- 피라졸 -5-일 트리플루오로메탄술포네이트 . 3,4-디메틸-1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-올 (6.68 g, 33 mmol)이 포함된 500 mL 용량의 둥근 바닥 플라스크에 Et3N (5.5 mL, 39 mmol) 및 CH2Cl2 35 mL를 첨가하였다. 용액을 드라이아이스 아세톤 조에서 냉각시켰다. Tf2O (6.1 mL, 36 mmol)를 천천히 첨가하였다. 혼합물을 -78℃에서 교반하고, 실온 으로 가온시켰다. 이후, 혼합물을 진공하에 농축시켰다. 바이오타지 호리즌 시스템 (0 → 25％ EtOAc/헥산)을 사용하여 조질의 생성물을 정제하여 무색 오일을 수득하였다 (8.28 g).
단계 iii: 2-[3,4-디메틸-1-(6- 메틸피리딘 -2-일)-1H- 피라졸 -5-일] 티에노 [ 3,2-c]피리딘 . 환류 응축기가 장착된 100 mL 용량의 3-목 둥근 바닥 플라스크에 3,4-디메틸-1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일 트리플루오로메탄술포네이트 (0.90 g, 2.7 mmol, 1.2 당량), 티에노[3,2-c]피리딘-2-일보론산 트리히드로겐 포스페이트 (0.72 g, 2.6 mmol, 1 당량), 제3인산칼륨 및 디옥산 20 mL를 첨가하였다. 플라스크를 진공하에 탈기시키고, 현탁액을 질소 기체로 버블링하였다. 여기에 PdCl2(dppf) (스트렘, 디클로로[1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]팔라듐 (II) 디클로로메탄 부가생성물, 0.54 g, 0.65 mmol, 0.3 당량)를 첨가하였다. 다시, 플라스크를 진공하에 탈기시키고, 현탁액을 질소 기체로 버블링하였다. 반응물을 16시간 동안 100℃로 가열하고, 이후 실온으로 냉각시켰다.
반응물을 셀라이트를 통해 여과하고, 모든 목적 물질이 용리될 때까지 (약 400 mL) EtOAc로 잘 세정하였다. EtOAc 여과물을 암색 잔류물로 농축시켰다. 암색 잔류물을 CH2Cl2에 녹이고, 고체를 여과하였다. CH2Cl2를 컬럼 크로마토그래피하였다 (바이오타지 호리즌 시스템, 800 mL에 걸쳐 0-100％ 헵탄/EtOAc, 이후 100％ EtOAc, 500 mL에서 유지). 분획을 3 분량으로 농축시켰다. 밝은 색 오일 (420 mg)을 함유하는 분량은 밤새 정치한 이후 부분적으로 고형화되었다. 물질을 고온 EtOH에 용해시키고, 헵탄을 첨가하였다. 밤새 정치시 고체 침전이 일어나지 않았다. 물질을 건고 상태로 농축시켰다. 약 15 mL의 Et2O를 첨가하고, 물질을 필터지를 통해 여과하면, 소량의 황갈색 잔류물이 남았다. 잔류물을 건고 상태로 농축시키고, 약 1 mL의 Et2O를 첨가하였다. 이후, 혼합물이 여전히 혼탁한 상태로 남아있을 때까지 헵탄 약 15 mL를 첨가하였다. 4℃에서 약 2시간 동안 정치한 이후 침전물은 확인되지 않았다. 이후, 물질을 건고 상태로 농축시켜 갈색 오일을 얻었다. 헵탄을 첨가하면, 소집단의 고체가 형성되었으며, 일부는 회백색이었고, 일부는 갈색이었다. 헵탄을 따라내고, 고체를 50℃ 진공 오븐에서 약 48시간 동안 건조시켜 황갈색 고체 229 mg을 제공하였다. mp 108-109℃.
Figure 112009022642739-PCT00022
실시예 7. 2-[4- 메틸 -2-(6- 메틸 -피리딘-2-일)-2H- 피라졸 -3-일]- 티에노[3,2-c]피리딘 .
단계 i: 티에노[3,2-c]피리딘 2- 보론산 트리히드로겐 포스페이트 . -40℃에서 무수 테트라히드로푸란 (25 mL) 중 티에노[3,2-c]피리딘 (2.0 g)의 교반 혼합물에 헥산 중 1.6 M n-부틸리튬 용액 (10 mL)을 5분에 걸쳐 적가하였다. 반응 혼합물을 10분 동안 교반하고, 후속적으로 트리이소프로필 보레이트 (4.2 mL)를 첨가하였다. 냉각조를 제거하고, 혼합물을 3시간 동안 교반하였다. 인산 (85％ 수용액, 1.2 mL)을 교반 혼합물에 첨가하였다. 후속적으로 물 (10 mL)을 첨가하였으며, 이 는 담황색 고체가 즉시 침전되도록 하였다. 추가의 물 (100 mL)을 첨가하고, 디에틸 에테르 (100 mL)를 첨가하였다. 현탁액을 진공 여과하였다. 고체를 흡인 건조시켜, 담황색 분말로서 표제 화합물을 수득하였다 (2.73 g); C7H6BNO2S·H3PO4에 대한 미량분석 ％C (계산치/실측치) 30.35/31.41, ％H 3.27/3.24, ％N 5.06/5.04, ％S 11.58/11.93, ％P 11.18/8.58.
Figure 112009022642739-PCT00023
단계 ii: 1-(6- 메틸피리딘 -2-일)히드라진. 2-브로모-6-메틸-피리딘 (602.10 g) 및 히드라진 수화물 (1570 mL)의 혼합물을 120℃에서 6시간 동안 환류시키고, 이후 실온에서 약 48시간 동안 교반하였다. 분리된 고체를 디에틸에테르 (3×1.5 L)로 추출하고, 합쳐진 에테르 추출물을 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하고, 농축시켰다 (약 430 g). 잔류물을 에테르 (200 mL) 및 헥산 (1.5 L)의 혼합물에서 교반하고, 여과하고, 헥산 중 5％ 디에틸에테르로 세척하여, 담황색 고체 (점성)를 얻었다. 고체를 106-113℃ / 2 mm에서 진공 증류시켰으며, 이는 즉시 고형화되었다. 이후, 고체를 디에틸에테르 2 L에 용해시키고, 헥산 2 L를 첨가하여 침전시키고, 여과하고, 진공 건조시켜, 백색 고체로서 1-(6-메틸피리딘-2-일)히드라진 (240 g)을 얻었다.
별법으로, 1-(6-메틸-피리딘-2-일)-히드라진은 다음과 같이 합성할 수도 있다:
재킷 반응 플라스크에 기계적 교반기, 질소 유입구 및 환류 응축기를 설치하 고, 재킷을 10℃로 냉각시켰다. 임의의 지점에서 내부 온도가 80℃를 초과하는 경우 자동적으로 0℃로 냉각되도록 반응기를 프로그래밍하였다. 반응기를 질소 기체의 정상 상태의 스트림으로 퍼징하였다. 반응기에 2-플루오로-6-메틸피리딘 25 g (0.225 mol), 이어서 이소프로판올 100 mL를 충전하고, 재킷 온도를 73℃ (70℃의 내부 온도에 상응함)로 조정하였다. 반응기에 65％ 수성 히드라진 44 g (0.90 mol)을 충전하고, 재킷을 70℃로 설정하여 혼합물을 밤새 교반하였다. 반응기 내용물을 메틸 t-부틸 에테르 (MTBE) 125 mL 및 포화 염수 13 mL로 희석시켜 2개 층을 얻었으며, 이를 분리하였다. 수성층을 MTBE 2×60 mL로 추출하였다. 합쳐진 유기층을 합하고 황산나트륨 (무수) 상에서 건조시켰다. 건조제를 여과에 의해 제거하였으며, 유기 여과물을 회전식 증발에 의해 농축시켰다. 얻어진 오일은 정치시 고형화되어 백색 고체로서 목적 생성물을 제공하였다 (21.1 g).
단계 iii: 4- 메틸 -2-(6- 메틸 -피리딘-2-일)-2H- 피라졸 -3-올. 실온에서 질소 대기하에, 오븐 건조된 500 mL 용량의 3-목 반응 용기내의 무수 테트라히드로푸란 (50 mL) 중 나트륨 메톡시드 (13.6 g)의 교반 혼합물에 무수 메틸 포르메이트 (12.6 mL)를 첨가하였다. 혼합물은 포말이 발생하였으며, 현탁액의 보다 효율적인 혼합을 촉진하기 위해 손으로 반응 용기를 와류시키면서 현탁액에 에틸 포르메이트 (28.7 mL)를 느린 정상 상태의 스트림으로 시린지를 통해 첨가하였다. 후속적으로 혼합물을 실온에서 5시간 동안 교반하였다. 보다 효율적인 혼합을 촉진하기 위해 반응 용기를 수분 동안 손으로 격렬히 와류시키면서 빙초산 (14 mL)을 첨가하였다. 후속적으로, 현탁액을 밤새 교반하고, 셀라이트를 통해 여과하였다. 셀라이트 필 터 플러그를 디에틸 에테르 (2×200 mL)로 2회 세척하고, 흡인하였다. 여과물은 흩어져 있는 백색 고체 침전물을 생성하였으며, 이를 중형 소결 부흐너 깔때기를 통한 추가의 진공 여과에 의해 제거하였다. 후속적으로, 여과물을 감압하에 농축시켜 (수조 온도 = 45℃), 투명한 밝은 색 오일 (대략 15 g)을 수득하였다. 오일은 아세트산의 독특한 냄새가 났다. 상기 오일을 무수 에탄올 (50 mL)에 용해시켰다. 이 용액에 고체 (6-메틸-피리딘-2-일)-히드라진 (5.4 g)을 첨가하였다. 교반 혼합물을 4일 동안 질소 대기하에 완만하게 환류시켰다. 혼합물을 감압하에 농축시키고, 수득된 오렌지색 오일을 디클로로메탄 (50 mL)에 용해시켰다. 디클로로메탄 용액을 바이오타지 기기에서 400-g 아날로직스 플래쉬 실리카 카트리지에 적용하였다. 소정의 구배 (4 컬럼 부피 또는 2400 mL에 걸쳐 100％ 헵탄 → 헵탄 중 70％ 에틸 아세테이트)로 바이오타지 기기에서 용리하였다. 분획을 건조시켜 고체를 수득하였다 (7.1 g).
별법으로, 4-메틸-2-(6-메틸-피리딘-2-일)-2H-피라졸-3-올을 다음과 같이 제조하였다:
테트라히드로푸란 (THF) 40 mL 중 에틸 포르메이트 (117.5 g) 및 에틸 프로피오네이트 (54.0 g)의 용액에 칼륨 t-부톡시드 (THF 중 1.0 몰 용액 502 mL)를 주위 온도에서 대략 0.5시간에 걸쳐 적가하였다. 약간의 버블링과 함께 백색 침전물이 형성되기 시작하였다. 또 다른 7.5시간 이후, 반응물을 여과하였으며, 고체를 디에틸 에테르로 세척하고, 이후 40℃에서 16시간 동안 진공하에 건조시켜 회색 분말로서 칼륨 2-에톡시카르보닐-프로펜-1-올레이트 (23.5 g)를 얻었다.
1-프로판올 450 mL 중 상기 칼륨 염 (17.6 g)의 용액에 (6-메틸-피리딘-2-일)-히드라진 (11.7 g), 이어서 아세트산 (6.5 mL)을 첨가하였다. 10분 동안 교반한 이후, 혼합물을 5시간 동안 완만하게 환류하에 가열하였다. 추가의 아세트산 (5.5 ml)을 첨가하고, 추가로 16시간 동안 계속해서 환류시켰다.
용매를 진공하에 제거하였다. 얻어진 잔류물을 에틸 아세테이트 (350 ml)로 희석시키고, 나머지 아세트산이 중화될 때까지 용액을 포화 중탄산나트륨 용액 (200 ml)으로 조심스럽게 세척하였다. 상을 분리하고, 수성상을 에틸 아세테이트 (50 ml)로 추출하였다. 유기상을 합하고, 이후 물 (100 ml), 이후 염수 (100 ml)로 세척하고, 황산마그네슘 상에서 건조시켰다. 건조제를 여과에 의해 제거하고, 용매를 진공하에 제거하여, 오렌지색 고체로서 생성물을 얻었다 (16.26 g).
단계 iv: 트리플루오로 - 메탄술폰산 4- 메틸 -2-(6- 메틸 -피리딘-2-일)-2H- 피라 졸-3-일 에스테르. 질소 대기하에 -78℃에서 4-메틸-2-(6-메틸-피리딘-2-일)-2H-피라졸-3-올의 디클로로메탄 용액 (디클로로메탄 50 mL 중 13.39 g) 및 추가의 디클로로메탄 (추가 50 mL, 총 100 mL 디클로로메탄) 중 트리에틸아민 (11 mL)의 교반 혼합물에 트리플산 무수물 (13.3 mL)을 느린 정상 상태의 스트림으로 시린지를 통해 5분에 걸쳐 첨가하였다. 냉각조를 제거하고, 혼합물을 1시간 30분에 걸쳐 실온으로 서서히 가온시켰다. 혼합물을 감압하에 농축시켰으며, 농축물을 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 바이오타지 기기에서 400-g 아날로직스 플래쉬 실리카 카트리지를 통해 소정의 구배 (3 컬럼 부피 또는 1800 mL에 걸쳐 100％ 헵탄 → 헵탄 중 30％ 에틸 아세테이트, 이후 추가 2 컬럼 부피 또는 1200 mL에 걸쳐 30％ → 45％ 에틸 아세테이트)로 용리하여 투명한 무색 오일로서 표제 화합물을 수득하였다 (18.04 g).
Figure 112009022642739-PCT00024
단계 v: 2-[4- 메틸 -2-(6- 메틸 -피리딘-2-일)-2H- 피라졸 -3-일]- 티에노[3,2-c]피리딘 . 환류 응축기 및 기체 유입구 밸브가 장착된, 오븐 건조된 3-목 둥근 바닥 플라스크에 티에노[3,2-c]피리딘-2-보론산 트리히드로겐 포스페이트 (1.0 g), 트리플루오로-메탄술폰산 4-메틸-2-(6-메틸-피리딘-2-일)-2H-피라졸-3-일 에스테르 (1.16 g), 제3인산칼륨 (2.3 g), 1,4-디옥산 (30 mL), 디클로로[1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]팔라듐 (II) 디클로로메탄 부가생성물 (0.60 g) 및 1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센 (0.40 g)을 충전하고, 교반 혼합물을 질소 대기하에 18시간 동안 환류시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 (250 mL)로 희석시켰으며, 용액을 활성탄으로 처리하고, 셀라이트를 통해 여과하였다. 여과물을 감압하에 농축시켰으며, 농축물을 실리카 겔 크로마토그래피에 의해 정제하였다. 원하는 질량을 갖는 물질이 용리될 때까지 1800 mL에 걸쳐 100％ 헵탄 → 100％ 에틸 아세테이트, 이어서 100％ 에틸 아세테이트로 바이오타지 시스템에서의 120 g 레디셉 플래쉬 실리카 카트리지를 통해 용리하여 오일 (1.2 g)을 수득하였다; MS (APCI+) m/z 307 (MH+). 추가로, 아세토니트릴 (30 mL)에 용해시키고, 동일한 2 분량으로 나누어 생성물을 정제하였다. 여과 이후, 용액을 정제용 HPLC (워터스 정제용 HPLC 시스템; 정지상: 워터스 델트팍 C18 5 μm, 100 옹스트롬, 300×50 mm I.D., P/N 011801, WAT 011801, No. 330C09125W; 이동상: 30분에 걸쳐 0.1％ 포름산을 함유하는 90:10 내지 50:50 물-아세토니트릴)에 의해 순차적으로 정제하였다. 합쳐진 분획을 감압하에 수용액으로 농축시켜 아세토니트릴을 제거하였다. 투명한 수용액을 포화 수성 탄산칼륨으로 처리하여 혼탁한 백색 현탁액을 얻었다. 현탁액을 실온에서 밤새 정치하였다. 형성된 고체 백색 침전물을 진공 여과에 의해 수집하고, 진공 오븐 (77℃)에서 밤새 건조시켜, 백색 고체로서 표제 화합물을 수득하였다 (0.506 g). 융점 157-158℃.
실시예 1 내지 7에 대한 1H NMR 및 질량 스펙트럼 분석 데이터를 하기 표 1에 보고한다.
Figure 112009022642739-PCT00025
실시예 8. 2-[4- 메틸 -2-(6- 메틸 -피리딘-2-일)-2H- 피라졸 -3-일]- 티에노[3,2-c]피리딘 .
단계 i. 2-(4,4,5,5- 테트라메틸 -[1,3,2] 디옥사보롤란 -2-일)- 티에노[3,2-c]피리딘 .
N2 대기하의 THF 100 mL 중 티에노[3,2-c]피리딘 (5.0 g)의 용액을 -78℃로 냉각시켰다 (아세톤/드라이아이스). 내부 온도를 -64℃ 이하로 유지시키면서 n-부틸리튬 (28 ml, 헥산 중 1.6 M, 새로 개방한 병)을 20분에 걸쳐 적가하였다. 혼합물을 -78℃에서 1시간 동안 교반하고, 후속적으로 트리이소프로필보레이트 (새로 개방한 병, 10.2 ml)를 첨가하였다. 냉각조를 제거하고, 혼합물을 30분에 걸쳐 실온으로 가온시켰다. 혼합물을 실온에서 1시간 동안 교반하였다. 디에틸 에테르 (20 mL) 중 피나콜 (5.9 g)의 혼합물을 반응 혼합물에 첨가하였다. 20분 이후, 빙초산 (2.2 mL)을 첨가하면, 침전물이 반응 혼합물내에 형성되었다. 반응 혼합물을 셀라이트를 통해 여과하고, UV-활성 물질이 용리될 때까지 클로로포름으로 세정하였다 (대략 2500 mL). 여과물을 5％ 수산화나트륨 수용액 (대략 총 500 mL)으로 2회 추출하였다. 수성 염기상을 실온에서 밤새 정치하였다. 수성층을 CH3CN/드라이아이스조에서 냉각시키고, 내부 온도를 5℃ 이하로 유지시키면서 10 ％ 수성 염산으로 중화시켰다. 중화된 수용액을 10회 클로로포름으로 추출하였다. 합쳐진 추출물을 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 감압하에 농축시켜 고체를 얻었다. 상기 생성물을 유사한 방식으로 동일한 규모에서 수행된 3가지 다른 반응의 생성물과 합하여, 합쳐진 고체를 수득하였다 (23.52 g). 합쳐진 고체를 대략 1 L의 비등 에탄올에 용해시켰다. 용액을 실온으로 냉각시켰다. 실온에서 약 4시간 이후 용액을 4℃에서 밤새 보관하였다. 황갈색 물질이 용액으로부터 침전되었다. 액체를 필터를 통해 따라냈다. 고체를 1시간 동안 진공 오븐 (50℃)에서 건조시켜 황갈색 고체로서 표제 화합물 (14.02 g)을 수득하였다.
Figure 112009022642739-PCT00026
별법으로, 2-(4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]디옥사보롤란-2-일)-티에노[3,2-c]피리딘을 또한 다음과 같이 제조하였다:
질소 기체하의 무수 테트라히드로푸란 400 mL 중 티에노[3,2-c]피리딘 (21.6 g)의 -70℃ 용액에 n-부틸 리튬 (헥산 중 1.6 몰 용액 99.9 ml)을, 온도를 -65℃ 미만으로 유지시키면서 약 15분 내지 20분에 걸쳐 첨가하였다. 용액은 혼탁한 암갈색이 되었다. 45분 이후, 트리-이소프로필 보레이트 (33.06 g)를 첨가하였으며, 혼합물은 균질해졌다. 혼합물을 -70 내지 -75℃에서 2시간 동안 교반하였다. 혼합물을 -30℃로 가온시키고, 이후 디에틸 에테르 100 mL 중 피나콜 용액을 4분에 걸쳐 첨가하였다. 반응 혼합물은 균질한 오렌지색 용액이 되었다. 온도를 5℃로 가온시키고, 이 온도에서 1시간 동안 유지하였다. 온도를 10℃ 미만으로 유지시키면서, 반응 혼합물을 1,4-디옥산 중 4 M 염산 40 mL로 매우 천천히 중화시켰다 (pH 7). 침전물이 형성되었다. 반응 혼합물을 1시간 동안 교반하고, 이후 고체를 여과에 의해 수집하였다. 고체를 40℃에서 16시간 동안 진공하에 건조시켰다. 건조 고체 (36 g)를 1.5시간 동안 물 400 mL와 함께 교반하였다. 슬러리를 여과하고, 고체를 수집하였다. 고체를 60시간 동안 공기 흐름하에 건조시켜 목적 생성물을 얻었다 (34.5 g).
Figure 112009022642739-PCT00027
단계 ii: 2-[4- 메틸 -2-(6- 메틸 -피리딘-2-일)-2H- 피라졸 -3-일]- 티에노[3,2-c]피리딘 . 환류 응축기 및 기체 유입구 밸브가 장착된, 오븐 건조된 500 mL 용량의 3-목 둥근 바닥 플라스크에 2-(4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]디옥사보롤란-2-일)-티에노[3,2-c]피리딘 (11.56 g), 트리플루오로-메탄술폰산 5-에틸-2-(6-메틸-피리딘-2-일)-2H-피라졸-3-일 에스테르 (16.4 g), 제3인산칼륨 (28 g) 및 1,4-디옥산 (300 mL)을 충전하였다. 반응 용기를 탈기시키고, 질소 기체로 플러싱하였다. 탈기 및 질소 플러싱을 2회 반복하였다. 혼합물에 디클로로[1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]팔라듐 (II) 디클로로메탄 부가생성물 (7.3 g) 및 1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센 (5.0 g)을 첨가하고, 교반 혼합물을 3회 더 탈기 및 질소 기체 플러싱하였으며, 후속적으로 30분에 걸쳐 서서히 완만하게 환류시켰다. 혼합물을 질소하에 2.5시간 동안 환류하에 교반하고, 후속적으로 플루오르화 칼륨 (13 g) 및 물 (1.2 mL)을 첨가하였다. 교반 혼합물을 15분 동안 계속 환류시키고, 후속적으로 약간 냉각시키고 셀라이트를 통해 여과하였다. 필터 패드를 에틸 아세테이트 (1 L)로 세척하였으며, 여과물을 활성탄으로 처리하였다. 탄소 현탁액을 셀라이트를 통해 여과하였다. 상기 필터 패드를 추가의 에틸 아세테이트 (300 mL)로 세척하고, 여과물을 감압하에 농축시켜, 조질의 적갈색 오일상 잔류물을 수득하였다 (대략 35 g). 잔류물을 수 밀리리터의 무수 에탄올로 처리하고, 감압하에 농축시켰다. 잔류물을 플래쉬 실리카 겔 (100 g) 및 에틸 아세테이트 중 5％ 메탄올 용액 (200 mL)과 혼합하였다. 혼합물을 여과하고, 실리카를 새로운 에틸 아세테이트 중 5％ 메탄올 용액 200 mL로 2회 세척하였다. 여과물을 감압하에 농축시켜 적갈색 오일상 잔류물을 수득하였다 (대략 25 g). 잔류물을 수 밀리리터의 에탄올에 용해시켰다. 후속적으로, 정치시 침전물이 형성되며, 진공 여과에 의해 이를 수집하였다. 고체를 헵탄으로 세척하여 점성 레드-오렌지색 분말을 수득하였다 (4.6 g). 에탄올-헵탄 여과물은 침전물을 제공하며, 이를 진공 여과에 의해 수집하여 베이지색 고체를 얻었다 (4.3 g). 베이지색 고체를 스팀하에 무수 에탄올에 용해시켰다. 투명 용액을 서서히 냉각시키면 침전물을 생성하며 이를 진공 여과에 의해 수집하였다. 흡인 건조는 고체를 제공하였다 (2.25 g). 고체를 무수 에탄올 (15 mL)에서 비등 및 침전시켜 백색 고체를 얻었다 (1.62 g). 다시, 고체를 에탄올에서 비등 및 침전시켜 백색 고체로서 표제 화합물을 제공하였다 (1.20 g).
Figure 112009022642739-PCT00028
실시예 9. 2-[4- 메틸 -2-(6- 메틸 -피리딘-2-일)-2H- 피라졸 -3-일]- 티에노[3,2-c]피리딘 .
단계 i: 2- 메틸 -6-(4- 메틸 - 피라졸 -1-일)-피리딘.
반응 조건 1
무수 아세토니트릴 50 mL 중 4-메틸-피라졸 (1.0 g)의 용액에 탄산세슘 (5.9 g), 이어서 2-플루오로-6-메틸피리딘 (1.5 g)을 첨가하였다. 반응 혼합물을 18시간 동안 환류하에 교반하였다. 반응 혼합물을 여과하여 세슘 염을 제거하고, 이후 여과물을 증발시켜 조질의 오일을 얻었다. 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 (실리카 겔, 헵탄 중 20％ 에틸 아세테이트), 건조 이후 황색 오일로서 표제 화합물 1.32 g을 제공하였다.
Figure 112009022642739-PCT00029
반응 조건 2
단계 i, 반응 1에 대해 수행된 반응을 4-메틸-피라졸 (5.0 g)로 출발하여 보다 큰 규모에서 유사한 방식으로 수행하였다. 표제 화합물 5.92 g을 생성하였다.
반응 조건 3
별법: 아세토니트릴 중 4-메틸-피라졸 (1.0 g)로 출발하여 염기로서 칼륨 t-부톡시드 1.1 당량을 사용하여 표제 화합물 1.75 g을 생성하였다.
반응 조건 4
별법: THF 중 4-메틸-피라졸 (1.0 g)로 출발하여 염기로서 칼륨 t-부톡시드 1.1 당량을 사용하여 표제 화합물 0.238 g을 생성하였다.
반응 조건 5
추가적으로, 단계 i의 표제 화합물을 다음과 같이 제조하였다: 질소 대기하에 무수 DMF (40 mL) 중 60％ 수소화나트륨 (8.04 g)의 현탁액에 DMF 30 mL 중 4-메틸-피라졸 (15 g)의 용액을 얼음조에서 40분에 걸쳐 적가하였다. 얻어진 혼합물을 실온에서 0.5시간 동안 교반하고, 이후 2-플루오로-6-메틸피리딘 (22.33 g)을 적가하였다. 혼합물을 80℃에서 3시간 동안 교반하고, 냉각시켰다. 반응 혼합물을 빙수에 붓고 에틸 아세테이트로 2회 추출하였다. 합쳐진 유기상을 물 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 여과하였다. 여과물을 진공하에 농축시켜 잔류물을 얻었으며, 이를 크로마토그래피 (헵탄 중 2％-10％ 에틸 아세테이트)에 의해 정제하여, 무색 오일로서 표제 화합물 29.9 g을 얻었다.
단계 ii: 2-(5- 브로모 -4- 메틸피라졸 -1-일)-6- 메틸피리딘 . 무수 THF 14 mL 중 2-메틸-6-(4-메틸-피라졸-1-일)-피리딘 (0.52 g) (단계 i에서의 반응 조건 1에 의해 제조함)의 냉각된 (-60℃) 용액에 헥산 중 n-부틸리튬 (0.21 g)의 2.5 M 용액 1.33 mL를 첨가하였다. 반응 혼합물을 -60℃에서 1시간 동안 교반하였다. THF 중 N-브로모숙신이미드 (0.59 g)의 10 mL 용액을 첨가하고, 이후 최종 용액을 -60℃에서 2시간 동안 교반하였다. 포화 염화암모늄 (20 mL)을 첨가하고, 이후 반응 혼합물을 24℃로 가온시켰다. 반응 혼합물을 에틸 아세테이트 300 mL로 희석시키고, 이후 수성상을 분리하였다. 유기상을 추가 포화 염화암모늄 (50 mL), 이후 염수 (50 mL)로 세척하였다. 유기층을 분리하고, 건조시키고 (황산나트륨), 여과하였으며, 이후 여과물을 증발시켜 조질의 적색 오일을 얻었다. 플래쉬 크로마토그래피에 의해 정제하여 (실리카 겔, 헵탄 중 20％ 에틸 아세테이트), 건조 후 황색 오일로서 표제 화합물 0.377 g을 제공하였다.
Figure 112009022642739-PCT00030
별법의 반응 조건: 단계 ii의 화합물, 2-(5-브로모-4-메틸피라졸-1-일)-6-메틸피리딘을 또한 다음과 같이 제조하였다:
1.) 상기 기재된 것과 유사한 반응 조건을 사용함으로써, 2-메틸-6-(4-메틸-피라졸-1-일)-피리딘 (1.0 g)으로 출발하여 2-(5-브로모-4-메틸피라졸-1-일)-6-메틸피리딘을 제조하여 표제 화합물 (829 mg)을 제공하였다.
2.) 상기 기재된 것과 유사한 반응 조건을 사용함으로써, 2-메틸-6-(4-메틸-피라졸-1-일)-피리딘 (5.0 g)으로 출발하여 2-(5-브로모-4-메틸피라졸-1-일)-6-메틸피리딘을 제조하여 표제 화합물 (2.64 g)을 제공하였다.
3.) 상기 기재된 것과 유사한 반응 조건을 사용함으로써, 2-메틸-6-(4-메틸-피라졸-1-일)-피리딘 (1.0 g)으로 출발하여 2-(5-브로모-4-메틸피라졸-1-일)-6-메틸피리딘을 제조하여 표제 화합물을 제공하였다. 또한, 브롬화제로서 N-브로모숙신이미드 (NBS) 대신에 1,2-디브로모테트라플루오로에탄 (1.5 당량)을 사용하였다 (756 mg).
단계 iii: 2-[4- 메틸 -2-(6- 메틸 -피리딘-2-일)-2H- 피라졸 -3-일]- 티에노[3,2-c]피리딘 . 무수 1,2-디메톡시에탄 (DME) 20 mL 중 2-(5-브로모-4-메틸피라졸-1-일)-6-메틸피리딘 (2.0 g)의 용액에 팔라듐 비스트리페닐포스핀 디클로라이드 (0.153 g)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 실온에서 30분 동안 교반한 후에 물 20 mL, 이어서 중탄산나트륨 (2.0 g)을 첨가하고, 그 후에 트리플루오로-메탄술폰산 5-에틸-2-(6-메틸-피리딘-2-일)-2H-피라졸-3-일 에스테르 (3.1 g)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 18시간 동안 환류시킨 후에 실온으로 냉각시켰다. 반응 혼합물을 디에틸 에테르 400 mL로 희석시킨 후에 유기상을 물 (100 mL), 포화 중탄산나트륨 (2 x 100 mL), 및 염수 (100 mL)로 세척하였다. 유기상을 건조시키고 (황산마그네슘), 여과한 후에, 여과물을 증발시켜 황색 슬러리를 제공하였다. 혼합물을 에틸 아세테이트 25 mL로 희석시켰다. 물질이 모두 녹지는 않았다. 혼합물을 15분 동안 분쇄한 후에 여과하여 (1차 여과) 황색 고체를 제거하였고, 이를 에틸 아세테이트 (2 x 10 mL)로 세정하였다. 고체를 15분 동안 공기 건조시켜 약간 불순물이 섞여 있는 생성물 448 mg을 제공하였다. 상기 1차 여과로부터의 여과물을 6 g의 실리카 겔 상에서 증발시키고 플래쉬 크로마토그래피 (실리카 겔, 헵탄 중 80％ 에틸 아세테이트, 에틸 아세테이트, 이어서 메탄올 중 95％ 에틸 아세테이트)하여 0.565 g을 제공하였다. 표제 화합물을 합한 중량은 황색 고체로서 1.01 g이었다. 에탄올로부터 침전시켜 표제 화합물 (0.764 g)을 황색 고체로서 제공하였다; 융점 155-156℃; MS (APCI+) m/z 307 (MH+).
실시예 10. 2-[4- 메틸 -2-(6- 메틸 -피리딘-2-일)-2H- 피라졸 -3-일]- 티에노[3,2-c]피리딘 .
단계 i: 4- 브로모 -피리딘. 4-브로모피리딘 히드로클로라이드 (20.0 g, 102.9 mmol)를 EtOAc와 5％ NaHCO3 사이에 분배하였다. 층을 분리하여 수성상을 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 감압하에 40℃ 조에서 증발시켜 휘발성 오일 13.7 g (84％)을 제공하였고, 이를 다음 단계에 직접 사용하였다.
단계 ii: 4- 브로모 -피리딘-3- 카르브알데히드 . THF 300 mL 중 4-브로모피리딘 (13.7 g, 86.8 mmol)의 현탁액을 N2로 퍼징하고 무수 N2 대기하에 -78℃로 냉각시켰다. 리튬 디이소프로필아미드 용액 (헵탄/THF/에틸벤젠 중 2.0 M 용액, 43.4 mL, 86.8 mmol)을 약 3분에 걸쳐서 첨가하였다. 30분 후에, DMF (디메틸포름아미드)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 3시간 동안 -78℃에서 유지한 후에, 밤새 주위 온도로 가온시켰다. 반응 혼합물을 포화 NH4Cl로 켄칭시키고 감압하에 농축시켜 대부분의 THF를 제거하였다. 수성 혼합물을 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 증발시킨 다음, 크로마토그래피 (150 g 아날로직스 실리카 겔 컬럼, 45분에 걸쳐서 100％ 헵탄 → 30％ EtOAc/헵탄의 구배로 용리)하였다. 생성물을 함유하는 분획을 합하고 증발시켜 표제 화합물 2.20 g (13.6％)을 제공하였다. MS m/z 186 (M+H)+.
단계 iii: 1- 티에노[3,2-c]피리딘 -2-일-프로판-1-온. 물 5 mL 중 나트륨 히드로술파이드 수화물 (1.31 g, 17.7 mmol)의 용액에 DMF (30 mL) 및 K2CO3 (3.27 g, 23.7 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 얼음조에서 0℃로 냉각시킨 후에 1-브로모-2-부타논 (2.68 g, 17.7 mmol)을 첨가하였다. 15분 후에, DMF (20 mL) 중 4-브로모피리딘-3-카르브알데히드 (2.20 g, 11.8 mmol)의 용액을 첨가하였다. 반응 혼합물을 45℃에서 2.5일 동안 교반하였다. 반응 혼합물을 물로 희석시키고 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시킨 다음 증발시켜 조질의 생성물 (1.80 g, 80％)을 제공하였고, 이를 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. MS m/z 192 (M+H)+.
단계 iv: 3-디메틸아미노-2- 메틸 -1- 티에노[3,2-c]피리딘 -2-일- 프로페논 . DMF (20 mL) 중 1-티에노[3,2-c]피리딘-2-일-프로판-1-온 (1.80 g, 9.41 mmol) 및 디메톡시메틸-디메틸-아민 (5.32 mL, 37.8 mmol)의 용액을 N2로 퍼징하고 18시간 동안 80℃로 가열하였다. 반응 혼합물을 1:1의 물/염수로 희석시키고 EtOAc로 추출하였다. 유기 추출물을 1:1의 물/염수 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시킨 다음 증발시켜, 조질의 물질 2.1 g을 제공하였다. 잔류물을 반복해서 톨루엔에 용해시키고 일정한 잔류물 중량이 얻어질 때까지 증발시켰다. MS m/z 247 (M+H)+.
Figure 112009022642739-PCT00031
단계 v: 2-[4- 메틸 -2-(6- 메틸 -피리딘-2-일)-2H- 피라졸 -3-일]- 티에노[3,2-c]피리딘 . 아세트산 (20 mL) 중 3-디메틸아미노-2-메틸-1-티에노[3,2-c]피리딘-2-일-프로페논 (1.31 g, 5.32 mmol)의 용액을 90℃로 가열하였다. 아세트산 (8 mL) 중 (6-메틸-피리딘-2-일)-히드라진의 용액을 90℃로 가열한 후에 3-디메틸아미노-2-메틸-1-티에노[3,2-c]피리딘-2-일-프로페논 용액에 첨가하였다. 혼합물을 15분 동안 95℃에서 가열한 후에 열로부터 제거하고 주위 온도에서 18시간 동안 교반하였다. 용매를 감압하에 제거하고, 잔류물을 톨루엔으로부터 2회 증발시켰다. 이렇게 수득된 잔류물을 크로마토그래피 (아날로직스 110 g 실리카 겔 컬럼, 100％ CH3CN으로 용리)하여 오렌지색 오일 0.45 g (28％)을 제공하였다.
실시예 10의 단계 iii의 화합물 (1-티에노[3,2-c]피리딘-2-일-프로판-1-온)을 제조하는 제2의 방법을 또한 다음과 같이 수행하였다:
단계 i. 4- 브로모 -피리딘-3- 카르브알데히드 . THF (100 mL) 중 4-브로모피리딘 히드로클로라이드 (5.0 g, 25.7 mmol)의 현탁액을 N2로 퍼징하고 -78℃로 냉각시켰다. 리튬 디이소프로필아미드 용액 (헵탄/THF/에틸벤젠 중 2.0 M 용액, 27.0 mL, 54.0 mmol)을 3분에 걸쳐서 첨가하였다. 30분 후에, DMF (8.56 mL, 110.6 mmol)를 첨가하였다. 반응 혼합물을 -78℃에서 15분 동안 교반한 후에 수조에서 실온으로 신속히 가온시켰다. 반응물을 주위 온도에서 18시간 동안 교반하였다. 반응물을 포화 NH4Cl (100 mL)로 켄칭시키고 EtOAc로 추출하였다. 합한 유기 추출물을 물 및 염수로 세척하고, Na2SO4 상에서 건조시키고, 증발시킨 다음, 크로마토그래피 (아날로직스 150 g 실리카 겔 컬럼, 1시간에 걸쳐서 100％ 헵탄 → 50％ EtOAc/헵탄의 구배로 용리)하여 표제 화합물 1.50 g (31％)을 밝은 황색 고체로서 제공하였다. MS m/z 186 (M+H)+.
단계 ii. 티에노[3,2-c]피리딘 -2- 카르복실산 메틸 에스테르. DMF (10 mL) 및 물 (1 mL) 중 4-브로모-피리딘-3-카르브알데히드 (1.50 g, 8.06 mmol)의 용액에 K2CO3 (1.34 g, 9.68 mmol) 및 메틸 티오글리콜레이트 (0.87 mL, 9.68 mmol)를 첨가하였다. 혼합물을 45℃에서 18시간 동안 가열하였다. 반응 혼합물을 가열조로부터 꺼내어 물 (50 mL)로 희석시켰다. 1시간 후에, 형성된 솜털같은 고체를 여과하고 물로 세척하였다. 이렇게 수득된 물질을 60℃ 진공 오븐에서 0.92 g (59％)의 일정 중량까지 건조시켰다. MS m/z 194 (M+H)+.
단계 iii. 티에노[3,2-c]피리딘 -2- 카르복실산 메톡시 - 메틸 -아미드. THF (20 mL) 중 O,N-디메틸히드록실아민 히드로클로라이드 (2.32 g, 23.8 mmol)의 현탁액을 N2로 퍼징하고 -78℃로 냉각시킨 후에 n-부틸리튬 (헥산 중 1.6 M, 30.0 mL, 48.1 mmol)을 첨가하였다. 조를 제거하고 15분 동안 교반한 후에 조를 대체하고 THF (10 mL) 중 티에노[3,2-c]피리딘-2-카르복실산 메틸 에스테르 (0.92 g, 4.76 mmol)의 용액을 첨가하였다. 45분 후에, 포화 NH4Cl을 첨가하였다. 혼합물을 EtOAc로 희석시키고; 물, 1 M HCl, 물, 5％ NaHCO3, 물, 및 염수로 세척하고; Na2SO4 상에서 건조시킨 다음, 증발시켜 오일 0.54 g (51％)을 제공하였고, 이는 정치시 고형화되었다. 이렇게 수득된 생성물을 추가 정제 없이 다음 단계에 사용하였다. MS m/z 223 (M+H)+.
단계 iv. 1- 티에노[3,2-c]피리딘 -2-일-프로판-1-온. 티에노[3,2-c]피리딘-2-카르복실산 메톡시-메틸-아미드 (0.54 g, 2.43 mmol)를 THF (10 mL)에 용해시키고, N2로 퍼징하고, 얼음조에서 0℃로 냉각시켰다. 에틸 마그네슘 브로마이드 (에테르 중 3 M, 2.43 mL, 7.29 mmol)를 첨가하고, 반응물을 주위 온도로 밤새 가온시켰다. 반응 혼합물을 추가로 정제하지 않았다. MS m/z 192 (M+H)+.
실시예 10의 단계 iii의 화합물 (1-티에노[3,2-c]피리딘-2-일-프로판-1-온)을 제조하는 제3의 방법을 또한 다음과 같이 수행하였다:
단계 i: N- 메톡시 -N- 메틸 - 프로피온아미드 . 디클로로메탄 (300 mL) 중 O,N-디메틸-히드록실아민 히드로클로라이드 (11.1 g) 및 프로피오닐 클로라이드 (9.4 mL)의 교반 혼합물에 0℃에서 질소 대기하에 피리딘 (18.2 mL)을 첨가하였다. 냉각조를 제거하고 혼합물을 서서히 실온으로 가온시키고, 이 온도에서 주말동안 교반하였다. 백색 침전물이 교반 혼합물 중에 형성되었다. 혼합물을 10％ 수성 염산으로 처리하고 침전물이 2상 용액에 용해될 때까지 교반하였다. 층을 분리하고, 디클로로메탄 상을 포화 수성 중탄산나트륨 (100 mL) 및 염수 용액 (100 mL)으로 세척하고, 무수 황산마그네슘 상에서 건조시키고, 감압하에 농축시켜, 표제 화합물을 투명한 무색 오일로서 제공하였다 (12.05 g).
Figure 112009022642739-PCT00032
단계 ii: 1- 티에노[3,2-c]피리딘 -2-일-프로판-1-온. 무수 테트라히드로푸란 (50 mL) 중 티에노[3,2-c]피리딘 (1.0 g)의 교반 혼합물에 -40℃ (아세토니트릴-드라이아이스조)에서 헥산 중 n-부틸리튬 용액 (1.6 M, 4.7 mL)을 첨가하였다. 혼합물을 -78℃로 냉각시킨 후에 이어서 무수 테트라히드로푸란 (10 mL) 중 N-메톡시-N-메틸-프로피온아미드 (0.97 g)의 용액을 첨가하였다. 냉각조를 제거하고 반응 혼합물을 실온으로 서서히 가온시켰다. 혼합물을 밤새 (14시간) 교반하였다. 혼합물을 포화 수성 염화암모늄 (150 mL)으로 처리하였다. 이어서 혼합물을 에틸 아세테이트 (500 mL)로 추출하고, 추출물을 염수 용액 (100 mL)으로 세척하였다. 유기상을 무수 탄산칼륨 상에서 건조시키고, 감압하에 농축시키고, 클로로포름 중에서 재구성시키고, 감압하에 다시 농축시켜, 오렌지-브라운색의 반고체 (1.17 g)를 제공하였다. 반고체를 플래쉬 실리카 크로마토그래피에 의해 아날로직스 실리카 컬럼 (115 g 실리카)을 사용하고, 0-30％ 에틸 아세테이트/헵탄, 이어서 30-60％ 에틸 아세테이트/헵탄으로 용리하여 정제하였다. 생성물을 함유하는 분획을 농축시켜 생성물 0.49 g을 제공하였다. 출발 물질 (0.45 g) 또한 적절한 분획을 증발시킴으로써 단리하였다.
실시예 11. 2-[4- 메틸 -2-(6- 메틸 -피리딘-2-일)-2H- 피라졸 -3-일]- 티에노[3,2- c]피리딘. 환류 응축기 및 기체 유입구 밸브가 장착된 500 mL 용량의 3-목 둥근 바닥 플라스크에 2-(4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]디옥사보롤란-2-일)-티에노[3,2-c]피리딘 (10 g), 트리플루오로-메탄술폰산 4-메틸-2-(6-메틸-피리딘-2-일)-2H-피라졸-3-일 에스테르 (14 g), 제3인산칼륨 (24 g) 및 1,4-디옥산 (200 mL)을 충전하였다. 반응 용기를 탈기시키고 질소 기체로 플러싱하였다. 탈기 및 질소 플러싱을 2회 반복하였다. 혼합물에 디클로로[1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]팔라듐 (II) 디클로로메탄 부가생성물 (3.2 g), 1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센 (2.2 g), 플루오르화 칼륨 (11 g) 및 물 (1 mL)을 첨가하고, 교반 혼합물을 3회 더 탈기하고 질소 기체로 플러싱하고, 그 후에 20분에 걸쳐서 서서히 80℃가 되도록 하였다. 혼합물을 80℃에서 10분 동안 교반한 후에 서서히 실온으로 냉각시키고, 그대로 밤새 정치하였다. 혼합물을 셀라이트(Celite)를 통해 진공 여과하고 필터 플러그를 통해 2 분량의 에틸 아세테이트 (800 mL 및 600 mL)를 이용하여 세척하였다. 여과물을 합하고 감압하에 농축시켜 암색 잔류물을 제공하였다. 잔류물을 디클로로메탄 (200 mL)에 용해시켰다. 고체가 침전되었고 이를 진공 여과에 의해 제거하였다. 여과물을 감압하에 농축시켜 오렌지-브라운색 고체 (20 g)를 제공하였다. 고체를 실온의 아세토니트릴 (200 mL)로 처리하고, 생성 현탁액에 와류를 발생시킨 다음, 진공 여과하여 황색 고체 (9.1 g)를 제공하였다. 이 제2 고체를 스팀조에서 비등 아세토니트릴 (고온의 75 mL 용액 부피)에 용해시키고, 오렌지색 용액을 30분에 걸쳐서 실온으로 냉각시켰다. 고체가 침전되었고, 플라스크를 밀봉하여 밤새 4℃에서 보관하였다. 침전물을 진공 여과하고 흡인 건조시켜 표제 화합물을 회백색 고체 (4.80 g)로서 제공하였다. 이 고체를 다른 실험으로부터 유사한 방식으로 단리된 고체의 뱃치와 합하여 (총 질량 21.5 g) 합쳐진 고체를 제공하였다.
합쳐진 고체를 다음 실험으로부터 수득된 고체 (8.92 g)와 추가로 합하였다:
빙초산 (500 mL) 중 3-디메틸아미노-2-메틸-1-티에노[3,2-c]피리딘-2-일-프로페논 (31.35 g)의 용액 및 빙초산 (200 mL) 중 (6-메틸-피리딘-2-일)-히드라진 (15.67 g)의 용액을 무수 질소로 퍼징하고 질소 기체하에 90℃로 가열하였다. 두 혼합물을 합하여 15분 동안 95℃로 가열하였다. 가열을 중단하고 반응 혼합물을 냉각시키고 실온에서 밤새 교반하였다. 조질의 반응 혼합물을 감압하에 암색 오일 약 100 g까지 농축시켰다. 잔류물을 톨루엔에 용해시키고 약 70 g까지 증발시켰다. 아세트산의 강한 냄새가 나서, 증발물을 톨루엔에 용해시키고 오일 약 70 g까지 증발시켰다. 이렇게 수득된 잔류물은 여전히 희미한 아세트산 냄새가 났지만, 이를 아세토니트릴 (200 mL)에 용해시키고 실온에서 정치하였다. 2.5일 후에, 형성된 침전물은 없었고, 용액을 60℃ 조에서 감압하에 증발시켰다. 생성 오일을 아세토니트릴 (약 200 mL)에 용해시키고 실온으로 냉각시켰다. 소량의 침전물이 형성되었고, 이를 수집하여 소량의 아세토니트릴로 세척하였다. 여과하면, 다량의 고체가 모액으로부터 침전되었다. 침전물을 수집하여 소량의 아세토니트릴로 세척하였다. 60℃ 진공 오븐에서 건조시키면, 12.05 g의 물질이 수득되었다. 이렇게 수득된 고체를 250 mL의 비등 아세토니트릴로부터 재단리하여, 진공 오븐에서 60℃에서 일정 중량까지 건조시킨 후에, 고체 (8.92 g) 2-[4-메틸-2-(6-메틸-피리딘-2-일)-2H-피라졸-3-일]-티에노[3,2-c]피리딘을 제공하였다.
21.5 g 및 8.92 g 뱃치를 합하여 500 mL의 총 부피로 아세토니트릴에 현탁시켰다. 현탁액을 스팀조에서 비등할 때까지 가열하였다. 대부분의 고체가 용액으로 용해되었지만, 약간의 침전물이 용해되지 않은 채로 남아있었고, 이를 고온 진공 여과에 의해 제거하였다. 2 L 용량의 필터 플라스크에 수집된 여과물은 신속히 백색 고체 침전물이 되었다. 아세토니트릴을 600 mL 부피까지 첨가하였다. 모든 고체가 용해될 때까지 여과물을 스팀조에서 비등시켰다. 플라스크를 스팀조로부터 꺼내어 혼합물을 서서히 실온으로 냉각시키고 그대로 벤치 상에 2.5시간 동안 정치하였다. 그 동안 용액으로부터 백색 고체가 형성되었고 이를 진공 여과에 의해 수집하여 표제 화합물을 백색 고체 (24.85 g)로서 제공하였다.
Figure 112009022642739-PCT00033
Figure 112009022642739-PCT00034
실시예 12. 2-(4- 메틸 -1-(6- 메틸피리딘 -2-일)-1H- 피라졸 -5-일) 티에노 [2,3-c]피리딘.
실시예 12, 단계 iii의 티에노[2,3-c]피리딘은 이전에 합성되었다(예를 들면, 문헌 [Graulich et al. (2004) Synthesis 12: 1935-1937]; 문헌 [Graulich et al. (2005) J. Med. Chem. 48(15): 4972-4982] 참조).
단계 i. (2,2- 디메톡시 -에틸)-티오펜-2- 일메틸렌 -아민. 톨루엔 100 mL 중 티오펜-2-카르복스알데히드 (7.5 mL, 82.3 mmol, 알파 애사르(Alfa Aesar)), 아미노아세트알데히드 디메틸 아세탈 (8.82 mL, 82.3 mmol, 알파 애사르)의 용액을 딘-스타크(Dean-Stark) 트랩을 사용하여 115℃로 가열하여 물을 제거하였다. 3시간 후에, 반응물을 실온으로 냉각시켰다. 반응물을 회전식 증발기에 넣어 톨루엔을 증발시켰고, 이때 갈색 액체 (약 17.3 g)가 수득되었으며, 이를 추가 조작 없이 다음 단계에 사용하였다.
Figure 112009022642739-PCT00035
단계 ii. {[(2,2- 디메톡시 -에틸)- 에톡시카르보닐 -아미노]-티오펜-2-일- 메틸 }-포스폰산 디메틸 에스테르. 단계 i에서 수득된 오일 (16.3 g, 82.3 mmol)에 N2 대기하에 THF 60 mL를 첨가하였다. 반응물을 -10℃ (MeOH/얼음)로 냉각시키고 내부 온도계를 설치하였다. 내부 온도를 -9.5℃ 이하로 유지시키면서 에틸 클로로포르메이트 (7.9 mL, 82.3 mmol)를 적가하였다. 반응물을 10분 동안 -10℃에서 교반한 후에 조를 제거하고 반응물을 실온으로 가온시켰다. 히트 싱크(heat sink)로서 얼음조를 사용하여, 트리메틸 포스파이트 (10.7 mL, 90.5 mmol)를 첨가하였다. 반응물을 서서히 실온으로 가온시키고 밤새 교반하였다. 용매를 회전식 증발기에서 제거하였다. 톨루엔을 첨가하고 회전식 증발기에서 증발시켰다. 이어서 톨루엔 첨가 및 증발을 또 다시 수행하였다.
얻어진 농후한 갈색 오일을 컬럼 크로마토그래피 (바이오타지 호리즌 시스템, 330 g 이스코 레디셉 컬럼, 1 컬럼 부피 동안 0-100％ EtOAc/헥산, 이어서 100％ EtOAc에서 유지)에 의해 정제하였다. 목적 분획을 합하고 농축시켜 농후한 갈색 오일 23.48 g을 제공하였다.
단계 iii. 티에노[2,3-c]피리딘 . 단계 ii로부터의 물질 (23.5 g, 61.6 mmol)을 CH2Cl2 100 mL에 용해시켰다. 3-목 플라스크에 N2 대기하에 환류 응축기 및 내부 온도계를 설치하였다. 플라스크를 탈기시키고 질소로 퍼징하였다. 염화티탄 (IV) (40 mL, 369 mmol)을 반응물에 서서히 첨가하였다. 반응 온도를 40℃ 정도에서 유지하였다. 약 15 mL를 첨가한 후에, 반응물을 얼음조에 넣어 온도를 조절하였다. 반응물을 서서히 실온으로 가온시킨 후에 밤새 40℃로 가열하였다. 반응물을 18시간 동안 40℃로 가열한 후에, 실온으로 냉각시켰다. 반응 내용물을 얼음 200 g 및 NH4OH 200 mL를 함유하는 대용량 비커에 나누어서 부었고, 이때 많은 연기가 관찰되었다. 반응물을 수분간 격렬하게 교반하였다. 반응물을 여과하고 고체를 CHCl3 (3 x 100 mL)로 세정하였다.
2상 여과물을 분별 깔때기로 옮겨 층을 분리하였다. 유기층을 1 N HCl (2 x 100 mL)로 추출하였다. 수성 HCl 층을 CH2Cl2 20 mL로 세척하고 진한 NH4OH로 pH 약 9에 도달할 때까지 주의하여 염기성화하였다. 생성물을 CH2Cl2 (3 x 100)로 추출하였다. 유기층을 MgSO4 상에서 건조시키고, 여과한 다음, 오렌지색 오일로 농축시켰고, 이는 오렌지색 고체로 고형화되었다. 조질의 물질을 컬럼 크로마토그래피 (바이오타지 호리즌 시스템, 120 g 이스코 레디셉 컬럼, 100％ 헵탄으로 평형화, 45％ EtOAc/헵탄으로 용리)에 의해 정제하였다. 백색 고체가 단리되었다 (4.20 g).
Figure 112009022642739-PCT00036
단계 iv. 티에노[2,3-c]피리딘 -2- 일보론산 트리히드로겐 포스페이트 . 단계 iii으로부터의 물질 (4.12 g, 30.5 mmol)을 함유하는, 내부 온도계가 설치된 3-목 플라스크를 탈기시킨 후에 질소 대기로 충전시켰다. THF (50 mL)를 첨가하고 용액을 -44℃ (CH3CN/드라이아이스)로 냉각시켰다. 내부 온도를 -35℃ 이하로 유지시키면서, n-부틸리튬 (1.6 M/헥산, 21 mL, 34 mmol)을 10분에 걸쳐 첨가하였다. 반응물을 -33 내지 -45℃에서 75분 동안 교반하였다. 트리이소프로필 보레이트 (8.4 mL, 36.6 mmol)를 첨가하고 냉각조를 제거하였다. 반응물을 1시간 동안 교반한 후에 인산 (85％ 수성, 2.5 mL, 33.5 mmol)을 첨가하였다. 반응물을 물 10 mL로 희석시키면 침전물이 생성되었다. 반응물을 15분 동안 격렬하게 교반하였다. 황색 고체를 여과에 의해 수집하고, EtOAc (약 50 mL)로 세정하여, 백색 분말 고체 (9.57 g)를 제공하였다. 상기 물질의 대략 절반을 물 50 mL로 세척하여 엷은 핑크색 고체 3.16 g을 단리하였다. 두 수득 물질은 모두 스펙트럼 데이터에 의해 동일한 것으로 판명되었다.
Figure 112009022642739-PCT00037
단계 v. 2-(4- 메틸 -1-(6- 메틸피리딘 -2-일)-1H- 피라졸 -5-일) 티에노 [2,3-c]피리딘. 250 mL 용량의 3-목 플라스크에, 디옥산 50 mL 중의 트리플루오로-메탄술폰산 4-메틸-2-(6-메틸-피리딘-2-일)-2H-피라졸-3-일 에스테르 (1.23 g, 실시예 7, 단계 iv에 기재된 바와 같이 합성할 수 있음), 단계 iv로부터의 물질 (2.00 g), 플루오르화 칼륨 (1.11 g), 제3인산칼륨 (2.44 g)을 첨가하였다. 플라스크를 진공으로 탈기시키고 질소 기체로 퍼징하였다. 여기에 PdCl2(dppf) (스트렘, 디클로로[1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]팔라듐 (II) 디클로로메탄 부가생성물, 280 mg) 및 dppf 리간드 (스트렘, 1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센, 212 mg) 및 물 (0.10 mL)을 첨가하였다. 반응물을 2.5시간 동안 80-111℃로 가열한 후에 실온으로 냉각시켰다. 반응물을 유사한 방식으로 시행한 또다른 반응으로부터의 물질과 합하였다. 조질의 반응 물질을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 EtOAc (약 750 mL)로 세정하였다. 여과물을 회전식 증발기에서 건고 상태로 농축시켰다. 암색 잔류물을 CH2Cl2로 희석시키고 고체를 여과하였다. CH2Cl2 여과물을 회전식 증발기에서 흑색 잔류물로 농축시켰다. 조질의 물질을 50％ EtOAc/헥산 (약 총 800 mL)으로 용리하여 실리카 겔 플러그를 통해 여과함으로써 정제하였다. 실리카 겔 플러그 여과로부터의 분획은 2개 로트의 물질 (하나는 순수, 하나는 불순물이 섞여 있음)을 제공하였다. 이들을 별개로 건고 상태로 농축시켰다. 불순물이 섞여 있는 물질을 Et2O로 분쇄하고 백색 고체를 여과에 의해 수집하였다. 여과물을 농축시키고 Et2O 분쇄를 반복하여 83 mg을 제공하였다. 목적 생성물만을 함유하는 분획과 83 mg의 뱃치를 합하여 순수한 로트와 함께 정제하였다. 약 5-10 mL의 EtOH를 물질에 첨가하였고, 이를 비등할 때까지 가열하였다. 모든 물질이 용해되면, 열로부터 제거하고 정치해 두었다. 이어서 베이지색 고체가 침전되기 시작했다. 모액을 따라내고 침전물을 소량의 냉각된 EtOH로 세정하였다. 침전물을 50℃ 진공 오븐에서 밤새 건조시켜 베이지색 고체 550 mg을 제공하였다.
Figure 112009022642739-PCT00038
Figure 112009022642739-PCT00039
실시예 13. 2-(2-(6- 메틸피리딘 -2-일)-2,4,5,6- 테트라히드로시클로펜타[c]피 라졸-3-일) 티에노 [2,3-c]피리딘. 250 mL 용량의 3-목 플라스크에, 디옥산 45 mL 중의 트리플루오로-메탄술폰산 2-(6-메틸-피리딘-2-일)-2,4,5,6-테트라히드로-시클로펜타피라졸-3-일 에스테르 (1.33 g, 실시예 5, 단계 iv에 기재된 바와 같이 합성할 수 있음), 실시예 12, 단계 iv로부터의 물질 (2.00 g), 플루오르화 칼륨 (1.11 g), 제3인산칼륨 (2.44 g)을 첨가하였다. 플라스크를 감압하에 탈기시키고 질소 기체로 퍼징하였다. 여기에 PdCl2(dppf) (스트렘, 디클로로[1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센]팔라듐 (II) 디클로로메탄 부가생성물, 280 mg) 및 dppf 리간드 (스트렘, 1,1'-비스(디페닐포스피노)페로센, 212 mg) 및 물 (0.10 mL)을 첨가하였다. 반응물을 3.5시간 동안 80-111℃로 가열한 후에 실온으로 냉각시켰다. 반응 물질을 셀라이트 패드를 통해 여과하고 EtOAc (약 250 mL)로 세정하였다. EtOAc 여과물을 회전식 증발기에서 건고 상태로 농축시켰다. 생성된 암색 잔류물을 CH2Cl2로 희석시키고 고체를 여과하였다. CH2Cl2 여과물을 회전식 증발기에서 흑색 잔류물로 농축시키고 이를 CH3CN으로 희석시키고 초음파 처리하였다. 황갈색 고체 (0.520 g)를 여과에 의해 수집하였다. 여과물을 건고 상태로 농축시키고 컬럼 크로마토그래피 (바이오타지 호리즌 시스템, 12 g 아날로직스 컬럼, 0-50％ EtOAc/헵탄, 이어서 50％ EtOAc/헵탄에서 유지)에 의해 정제하여 고체 약 300 mg을 제공하였다. 고체 300 mg 및 황갈색 고체 (0.520 g)를 합하여 EtOH 약 10 mL로 희석시키고, 비등할 때까지 가열하고, 여과한 다음, 실온으로 냉각시켰다. 고체 물질이 침전되기 시작하였다. 실온에서 밤새 정치한 후에 모액을 따라내고 잔류 물질을 소량의 냉각된 EtOH로 세정하였다. 고체를 45℃ 진공 오븐에서 1.5시간 동안 건조시켜 고체 410 mg을 제공하였다.
Figure 112009022642739-PCT00040
실시예 14. 2-[4- 메틸 -2-(6- 메틸피리딘 -2-일)2H- 피라졸로 -3-일] 티에노 [3,2-c]피리딘. 트리플루오로-메탄술폰산 4-메틸-2-(6-메틸-피리딘-2-일)-2H-피라졸-3-일 에스테르 (36.6 g, 114 mmol), 탄산칼륨 (39.4 g, 285 mmol), 및 2-(4,4,5,5-테트라메틸-[1,3,2]디옥사보롤란-2-일)-티에노[3,2-c]피리딘 (31.2 g, 120 mmol)을 톨루엔 (300 mL), 이소프로필 알콜 (IPA) (75 mL) 및 물 (75 mL) 중에 슬러리화하였다. 반응 혼합물을 순차적으로 진공에 적용한 후에 질소로 퍼징하였다. 이를 총 5회 반복하였다. 비스(트리페닐포스핀)팔라듐(II) 클로라이드 (4.4 g, 6.27 mmol)를 첨가하고, 반응물을 78℃로 가열하였다. 2시간 후에, 반응 혼합물을 냉각시켰다. 수성층을 분리하고, 유기층을 여과하여 흑색 촉매 잔류물을 제거하였다. 유기층을 물 (80 mL)로 세척하였다. 유기층을 3 M HCl (100 mL) 및 물 (100 mL)로 추출하였다. 탄소 (0.5 g) 및 셀라이트 (9 g)를 수성층에 첨가하고 용액을 농축시켜 잔류 톨루엔을 제거하였다. 수성층을 여과하였다. 50％ NaOH를 첨가하여 수성층을 염기성 (pH = 10)으로 만들었다. 황색 고체가 침전되었다. 고체를 여과하고, 물로 세척한 다음, 공기를 관통시킴으로써 건조시켜, 황색 고체 24.1 g (69.1％)을 제공하였다. 고체를 톨루엔 (250 mL) 중에 슬러리화하였다. 슬러리를 65℃로 가열하고 여과하였다. 여과물을 농축시켰다. 잔류물을 톨루엔 (100 mL) 중에 슬러리화하고 여과하였다. 케이크를 톨루엔 (40 mL)으로 세척하였다. 공기를 관통시킴으로써 케이크를 건조시켜 조질의 생성물 19.2 g (55％)을 제공하였다.
19.2 g을 다른 유사하게 제조된 샘플과 합하여 141.7 g을 제공하였다. 합쳐진 고체를 IPA (500 mL) 중에 슬러리화하고 슬러리를 83℃로 가열하였지만, 고체가 모두 녹지는 않았다. IPA (300 mL)를 첨가하고 슬러리를 83℃로 가열하여 암색 용액을 제공하였다. 용액을 8℃/시간으로 실온으로 냉각시켰다. 슬러리를 여과하고, 케이크를 IPA (200 mL)로 세척하였다. 케이크를 50℃에서 60시간 동안 건조시켜 목적 생성물 131.8 g을 제공하였다.
생물학적 실시예 1
ALK-5 키나제 분석 방법은 당업계에 개시되어 있다 (예를 들면, 문헌 [Laping et al. (2002) Mol. Pharmacol. 2002; 62: 58-62] 참조). 특정한 실시예에서 명시된 화합물들을 ALK-5 자가인산화 활성 및 α-카세인의 ALK-5 인산화의 억제에 대해 다음과 같이 시험하였다.
재료:
* 완충액: 10 mM NaCl, 10 mM MgCl2, 및 1 mM DTT가 포함된 pH 7.6의 50 mM HEPES.
* GST-ALK-5 단백질 - 0.44 mg/ml (대략 7 μM 스톡). 1:350 희석으로 20 nM 스톡을 제공하고, 이는 분석법에서 최종 2 nM로 전환된다. pFastBac 벡터 (인비트로젠(Invitrogen))에서 글루타티온 S-트랜스퍼라제 GST에 N-말단에서 융합된, ALK-5 말단절단형(truncation) 서열 (아미노산 H149-M503)을 발현하는 바큘로바이러스로 감염된 Sf9 곤충 세포에서 인간 ALK-5를 발현시켰다. 세포를 4℃에서 초음파 처리에 의해 파괴시켰다. 용해물을 45분 동안 40,000 x g에서 원심분리하고, 상등액을, 300 mM NaCl, 10％ 글리세롤, 1％ NP40, 2 mM 디티오트레이톨 (DTT) 및 50 mL 당 1개의 프로테아제 억제제 완전 EDTA-무함유 정제 (로쉐(Roche))를 함유하는 pH 7.6의 100 mM 트리스-HCl 완충액으로 평형화된 글루타티온 세파로스 4 패스트 플로우 (Glutathione Sepharose 4 Fast Flow; 아머샴 바이오사이언시즈(Amersham Bioscienses))의 10 mL 컬럼에 적용하였다. 컬럼을 150 mM NaCl, 10％ 글리세롤, 2 mM DTT 및 100 mL 당 1개의 프로테아제 억제제 완전 EDTA-무함유 정제를 함유하는 pH 8.0의 50 mM 트리스 HCl 5 컬럼 부피로 세척하였다. 컬럼을 8 mM 환원 글루타티온을 함유하는 세척 완충액으로 용리하였다. 분획을 수집하고 10％ 글리세롤, 150 mM NaCl, 2 mM DTT 및 1 mM 4-(2-아미노에틸)-벤젠술포닐플루오라이드.HCl (AEBSF) (시그마(Sigma))을 함유하는 pH 8.0의 20 mM 트리스 HCl 중에서 밤새 4℃에서 투석시켰다.
* α-카세인 (시그마, #C8032)은 완충액 (50 mg/ml) 중에서 2 mM로 구성되었다.
* 냉각된 ATP는 10 μM 냉각 ATP (완충액 중 10 mM 스톡으로부터)를 함유하였다.
* 가열된 ATP는 완충액 중 0.5 μCi/웰 γ-33P-ATP (아머샴, AH9968)로 구성되었다.
* 분석 완충액 - 완충액 10 mL 당
500 mM HEPES (pH 7.6) 1 mL
5 M NaCl 20 ㎕
1 M MgCl2 100 ㎕
1 M DTT (디티오트레이톨) 10 ㎕
분석 방법:
96 웰 필터-바닥 플레이트 (밀리포어(Millipore), #MSDV N6B 50)에서, 분석 완충액 58 ㎕를 각각의 웰에 첨가하였다. 분석 완충액 중의 냉각된 ATP 혼합물 10 ㎕, 이어서 α-카세인 스톡의 1:10 희석액 10 ㎕를 첨가하였다. 이어서 시험 화합물 2 ㎕ (DMSO)를 50X 최종 농도에서 첨가하였다. 가열된 ATP 혼합물 (10 ㎕)을 첨가하고, 0.05％ BSA (소 혈청 알부민)가 포함된 분석 완충액 중의 ALK-5 단백질의 1:350 희석액 (최종 2 nM) 10 ㎕를 첨가하여 반응을 개시하였다. 반응물을 실온에서 5분 동안 혼합한 후에, 실온에서 145분 동안 계속하였다. 이어서 얼음-냉각된 20％ TCA (트리클로로아세트산) 100 ㎕를 첨가하여 반응을 중지시켰다. 이어서 분석물을 4℃에서 1시간 이상 동안 인큐베이션한 후에, 각각의 웰의 내용물을 필터를 통해 흡인에 의해 여과하였다. 웰을 얼음-냉각된 10％ TCA 200 ㎕로 3회 세척하였다. 플라스틱 보조-기반을 제거하기 전후에 플레이트 바닥을 블롯팅하고, 밤새 실온에서 건조시켰다. 신틸레이션액 30 ㎕를 첨가하고, 왈락 트리-룩스(Wallac Tri-Lux) 신틸레이션 카운터에서 웰마다 1분 동안 카운팅하였다.
IC50 (nM) 값을 1회 이상의 실험에서 측정된 2개 이상의 IC50 값의 평균으로서 하기 표 2에 기록하였다. 측정치의 개수 ("n")를 괄호 안에 기록하였다. 평균 IC50 값을 얻기 위한 개개의 값들을, 측정치가 4개 이하라면, 괄호 안에 나열하였다. 표준 오차 (SE) 또한 기록하였다. 표준 오차는 측정치의 개수 ("n")로 나눈 표준 편차이다.
Figure 112009022642739-PCT00041
생물학적 실시예 2
ALK-5 유전자 리포터 분석 방법은 당업계에 개시되어 있다 (예를 들면, 문헌 [Maliekal et al. (2004) J Biol Chem 279(35):36287-36292] 참조). 특정한 실시예에서 명시된 화합물들을 TGFβ1 자극된 NIH-3T3 세포에서의 Smad 결합 요소 (SBE) 루시퍼라제 리포터 활성의 억제에 대해 다음과 같이 시험하였다. 하기 루시퍼라제 분석은 Smad 결합 요소 (SBE) 루시퍼라제 리포터 구조물로 일시적으로 형질감염된 NIH/3T3 (뮤린 섬유아세포) 세포를 이용하였다. 이 발현된 구조물은 Smad 신호전달 경로를 자극하는 작용제에 대해 반응성을 갖는다.
재료:
* NIH-3T3 세포 (ATCC CRL-1658)
* 페놀 레드가 포함된 둘베코 변형된 이글 배지(Dulbecco's Modified Eagle Medium) (라이프 테크놀로지즈(Life Technologies) 11965-092)
* 페놀 레드가 포함되지 않은 둘베코 변형된 이글 배지 (라이프 테크놀로지즈 21063-029)
* 우태혈청 (라이프 테크놀로지즈 SH30071.03)
* 퓨진(Fugene) (로쉐 1814443)
* Opti-MEM I (라이프 테크놀로지즈 31985-070)
* 듀얼-글로 루시퍼라제 분석 시스템(Dual-Glo Luciferase Assay System; 프로메가(Promega) E2940, E2980)
* 젠타마이신 용액 (10 밀리그램/밀리미터)(라이프 테크놀로지즈 15710-064)
* 96-웰 분석 플레이트, 백색, TCT (코닝 코스타(Corning Costar) 3917)
* 75 센티미터 조직 배양 플라스크 (코닝 코스타 430641)
* pRL-CMV 벡터 (미국 위스콘신주 매디슨 소재의 프로메가 코포레이션(Promega Corporation), 제품 E2261) (pRL은 구조적으로 활성인 사이토메갈로바이러스 (CMV) 프로모터의 조절하에 레닐라 레니포르미스(Renilla reniformis) 루시퍼라제를 코딩하는 벡터임)
* 전환 성장 인자 β1 - (미국 미네소타주 미니애폴리스 소재의 R&D 시스템즈, 제품 240-B)
* pSBE4-Luc/BV4 벡터 (pSBE4-luc 벡터라고도 알려져 있음)(카피수 4개의 Smad 결합 요소 및 개똥벌레 루시퍼라제 코딩 영역을 함유함) (문헌 [Zawel et al. (1998) Mol Cell. 1(4):611-617]).
방법:
NIH-3T3 세포를 10％ 우태혈청 및 10 마이크로그램/ml의 젠타마이신이 포함된 둘베코 변형된 이글 배지에서 보존하였다. 세포를 월요일마다 1:5 내지 1:10으로 나누고, 다시 수요일에 나누었다. 분석에 필요한 세포는, 세포를 금요일에 1:20으로 나누고 월요일에 유지하였다. 세포가 완전한 전면생장 상태까지 성장하게 하지 않는다.
제1일, 0시간 (실험 개시)
15 밀리미터의 성장 배지 (둘베코 변형된 이글 배지, 10％ 우태혈청, 10 마이크로그램/밀리미터의 젠타마이신)를 사용하여 형질감염을 위해 75 센티미터 플라스크에서 160만개의 NIH/3T3 세포를 플레이팅하였다.
제1일, 실험 개시 후 7시간
형질감염 준비:
a. 1.5 밀리미터 마이크로원심분리 튜브에서, 48 마이크로리터의 퓨진을 400 마이크로리터의 Opti-MEM에 직접 첨가하였다. 실온에서 5분 동안 인큐베이션하였다.
b. 상기 인큐베이션 동안에, 8 마이크로그램의 SBE-luc 및 0.16 마이크로그램의 CMV-pRL을 400 마이크로리터의 Opti-MEM으로 분취하였다.
c. "a" 단계로부터의 퓨진/Opti-MEM을 "b" 단계에서의 DNA에 첨가하였다. 실온에서 15 내지 45분 동안 인큐베이션하였다.
d. 복합체 DNA를 상기 플레이팅한 세포 (제1일, 0시간)에 첨가하였다. 배지를 교체할 필요는 없다. 37℃, 5％ CO2에서 밤새 인큐베이션하였다.
제2일, 실험 개시 후 24시간
200,000개의 세포/ml의 밀도로 둘베코 변형된 이글 배지, 10％ 우태혈청, 10 마이크로그램/밀리미터의 젠타마이신 중의 형질감염된 세포 (제1일, 2 단계)로부터의 세포 현탁액(들)을 제조하였다. 96-웰 플레이트의 경우에 100 마이크로리터/웰로, 분석 플레이트 (백색 TCT)에 세포를 플레이팅하였다. 이는 세포 개수를20,000개의 세포/웰로 만들 것이다. 5-6시간 동안 37℃, 5％ CO2에서 인큐베이션하였다.
제2일, 실험 개시 후 31시간
a. 필요에 따라 용량 반응 플레이트를 준비하였다.
b. 플레이트를 혈청 없이 100 마이크로리터의 둘베코 변형된 이글 배지, 10 마이크로그램/밀리미터의 젠타마이신으로 세척하였다.
c. 170 마이크로리터/웰의 둘베코 변형된 이글 배지, 10 마이크로그램/밀리미터의 젠타마이신, 0.5％ 우태혈청을 첨가하였다.
d. 96-웰 플레이트의 경우에 20 마이크로리터의 10X 스톡으로, 시험 화합물 및 대조군을 분석 플레이트 (백색, TCT)로 옮겼다.
e. 화합물로 처리한지 30-60분 후에, 250 피코그램/밀리미터의 전환 성장 인자 β1을 각각의 웰에 첨가하였다. (10 마이크로리터의 20X 스톡을 첨가함).
제3일, 실험 개시 후 51시간
루시퍼라제 활성을 위한 분석 플레이트.
a. 동결건조된 듀얼-글로 루시퍼라제 기질을 듀얼-글로 루시퍼라제 완충액으로 제조업자의 지침에 따라 재구성하였다.
b. 분석 플레이트를 인큐베이터로부터 꺼내어 10분 동안 실온이 되도록 하였다.
c. 분석 플레이트로부터 배지를 흡인시켰다. 페놀 레드 없이 둘베코 변형된 이글 배지 1 부를 함유하는 80 마이크로리터의 희석된 스테디-글로(Steady-Glo) 루시퍼라제 기질을 첨가하였다. 플레이트를 밀봉하고 실온에서 10분 이상 동안 인큐베이션하였다.
d. 6초/웰 동안 단일 광자 카운팅 (SPC) 모드를 사용하여 팩커드 탑카운트(Packard TopCount) HTS 플레이트 판독기에서 판독하여 pSBE4-Luc/BV4 pSBE4-luc로부터의 개똥벌레 루시퍼라제 활성을 알아냈다.
e. 개똥벌레 루시퍼라제 활성을 위한 플레이트를 판독한 후에, 밀봉을 제거하고 40 마이크로리터의 정지 및 글로 시약을 각각의 웰에 첨가하였다. 플레이트를 재밀봉하고 실온에서 10분 이상 동안 인큐베이션하였다. 개똥벌레 루시퍼라제의 경우와 같이 팩커드 탑카운트에서 플레이트를 판독하여, pRL로부터 레닐라 루시퍼라제 활성을 알아냈다.
레닐라 루시퍼라제 활성은 형질감염 대조군으로서 사용된다. 개똥벌레 루시퍼라제 활성은 분석 판독치로서 사용된다. 루시퍼라제 분석 활성을 각각의 특정 샘플에 대해 레닐라 분석 활성으로 표준화하였다.
IC50 (nM) 값을 1회 이상의 실험에서 측정된 2개 이상의 IC50 값의 평균으로서 하기 표 3에 기록하였다. 측정치의 개수 ("n")를 괄호 안에 기록하였다. 평균 IC50 값을 얻기 위한 개개의 값들을, n이 4 이하인 경우에는, 괄호 안에 나열하였다. 표준 오차 (SE) 또한 기록하였다. 표준 오차는 측정치의 개수 ("n")로 나눈 표준 편차이다.
Figure 112009022642739-PCT00042
제형화 실시예 1
2％ (w/w) 2-[4-메틸-2-(6-메틸-피리딘-2-일)-2H-피라졸-3-일]-티에노[3,2-c]피리딘을 함유하는 겔의 제조.
재료:
에탄올 (200 Proof), USP (미국 켄터키주 소재의 아퍼 알콜 앤드 케미컬 컴파니(Aaper Alcohol and Chemical Co))
프로필렌 글리콜 (순도 >99.5％), ACS 시약 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치 케미컬즈(Sigma-Aldrich Chemicals))
폴리에틸렌 글리콜 (PEG 400), 분자량: 380-420 (미국 뉴저지주 필립스버그 소재의 말린크로트 베이커 인크.(Mallinkrodt Baker Inc.))
히드록시프로필 셀룰로스 (클루셀(KLUCEL)® HF) (미국 델라웨어주 윌밍톤 소재의 허큘레스 인코포레이티드(Hercules Incorporated))
HPLC용 물, 크로모솔브(Chromosolve)® (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치 케미컬즈)
벤질 알콜 (순도 >99％) (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치 케미컬즈)
절차:
2-[4-메틸-2-(6-메틸-피리딘-2-일)-2H-피라졸-3-일]-티에노[3,2-c]피리딘 (2 g)을 150 mL 용량의 유리병으로 옮겼다. 이어서 프로필렌 글리콜 (30 g), 폴리에틸렌 글리콜 (30 g), 물 (10 g), 및 벤질 알콜 (2 g) 및 에탄올 (20 g)을 상기 병에 첨가하였다. 혼합물을 2시간 동안 교반하였다. 이어서 클루셀® HF (500 mg)를 용액에 첨가한 후에, 에탄올을 100 g까지 충분히 첨가하였다. 용액을 밤새 교반하여 2％ (w/w) 2-[4-메틸-2-(6-메틸-피리딘-2-일)-2H-피라졸-3-일]-티에노[3,2-c]피리딘을 함유하는 겔을 제공하였다.
제형화 실시예 2
1％ (w/w) 2-[4-메틸-2-(6-메틸-피리딘-2-일)-2H-피라졸-3-일]-티에노[3,2-c]피리딘을 함유하는 겔의 제조.
재료:
에탄올 (200 Proof), USP (미국 켄터키주 소재의 아퍼 알콜 앤드 케미컬 컴파니)
프로필렌 글리콜 (순도 >99.5％), ACS 시약 (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치 케미컬즈)
폴리에틸렌 글리콜 (PEG 400), 분자량: 380-420 (미국 뉴저지주 필립스버그 소재의 말린크로트 베이커 인크.)
히드록시프로필 셀룰로스 (클루셀® HF) (미국 델라웨어주 윌밍톤 소재의 허큘레스 인코포레이티드)
HPLC용 물, 크로모솔브® (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치 케미컬즈)
벤질 알콜 (순도 >99％) (미국 미주리주 세인트 루이스 소재의 시그마-알드리치 케미컬즈)
절차:
2-[4-메틸-2-(6-메틸-피리딘-2-일)-2H-피라졸-3-일]-티에노[3,2-c]피리딘 (1 g)을 150 mL 용량의 유리병으로 옮겼다. 이어서 프로필렌 글리콜 (30 g), 폴리에틸렌 글리콜 (30 g), 물 (10 g), 및 벤질 알콜 (2 g) 및 에탄올 (20 g)을 상기 병에 첨가하였다. 혼합물을 30분 내지 1시간 동안 교반하였다. 이이서 클루셀® HF (500 mg)을 용액에 첨가한 후에, 에탄올을 100 g까지 충분히 첨가하였다. 용액을 밤새 교반하여 1％ (w/w) 2-[4-메틸-2-(6-메틸-피리딘-2-일)-2H-피라졸-3-일]-티에노[3,2-c]피리딘을 함유하는 겔을 제공하였다.
본원에 기재된 실시예 및 실시양태는 단지 예시하기 위한 것이고 그들의 측면에서 다양한 변경 또는 변화가 당업자들에게 자명할 것이며 본 출원 및 첨부된 청구의 범위의 취지 및 범주 내에 포함되어야 함이 이해된다. 본원에 인용된 모든 공개문헌, 특허 및 특허출원은 모든 목적을 위해 그 전문이 본원에 참고로 포함된다.

Claims (13)

  1. 하기 화학식 I의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
    <화학식 I>
    Figure 112009022642739-PCT00043
    식 중,
    R1은 티에노[3,2-c]피리디닐, 티에노[3,2-b]피리디닐, 티에노[2,3-c]피리디닐 또는 티에노[2,3-b]피리디닐이고, 이들 각각은 C1-C3-알킬, -(C1-C3-알킬)-S-(C1-C3-알킬), -S-C1-C3-알킬, -(C1-C3-알킬)-O-(C1-C3-알킬), -O-C1-C3-알킬, -C(O)O-C1-C3-알킬, -C(O)O-H, -C(O)NR30R31, 할로, -CN, -OH (여기서, R30 및 R31은 H 및 C1-C3 알킬-OH, C1-C3-알킬, 할로 및 -O-C1-C3-알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택됨)로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있고;
    R2 및 R3은 수소, C1-C3-알킬, -(C1-C3-알킬)-S-(C1-C3-알킬), -S-C1-C3-알킬, -(C1-C3-알킬)-O-(C1-C3-알킬), -O-C1-C3-알킬, -C(O)O-C1-C3-알킬, -C(O)O-H, -C(O)NR30R31, 할로, -CN, -OH 및 C3-C6-시클로알킬 (여기서, R30 및 R31은 H 및 C1-C3 알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택됨)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택되거나; 또는
    R2 및 R3은 함께 5 또는 6원 헤테로아릴, 페닐, C4-C6-시클로알킬, 또는 4 내지 6원 헤테로시클로알킬을 형성할 수 있고, 여기서 상기 C4-C6-시클로알킬 또는 4 내지 6원 헤테로시클로알킬은 할로, -OH, 옥소 및 C1-C3 알킬로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있으며, 상기 5 또는 6원 헤테로아릴, 또는 페닐은 할로, -CN, -OH, -O-C1-C3 알킬 및 C1-C3 알킬로부터 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있고;
    R4, R5, R6 및 R7은 H, -OH, C3-시클로알킬, C1-C3-알킬, -(C1-C3-알킬)-S-(C1-C3-알킬), -S-C1-C3-알킬, -(C1-C3-알킬)-O-(C1-C3-알킬), -O-C1-C3-알킬, -C(O)O-C1-C3-알킬, -C(O)O-H, -C(O)NR30R31, 할로, -CN, -OH (여기서, R30 및 R31은 H 및 C1-C3 알킬 C1-C3-알킬, -O-C1-C3-알킬 및 할로로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선 택됨)로 이루어진 군으로부터 선택된다.
  2. 제1항에 있어서, R1이 -OH, C1-C3 알킬, 할로 및 -O-C1-C3 알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택된 1 내지 3개의 치환기로 임의로 치환될 수 있는 티에노[3,2-c]피리디닐 또는 티에노[2,3-c]피리디닐인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, R2 및 R3이 수소, C1-C3-알킬, -(C1-C3-알킬)-O-(C1-C3-알킬), -O-C1-C3-알킬, -C(O)O-C1-C3-알킬, -C(O)O-H, -C(O)NR30R31, 할로, -CN, -OH 및 C3-C6-시클로알킬 (여기서, R30 및 R31은 H 및 C1-C3 알킬로 이루어진 군으로부터 각각 독립적으로 선택됨)로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 것인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, R2 및 R3이 수소 및 C1-C3 알킬로 이루어진 군으로부터 독립적으로 선택된 것인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, R2가 C1-C2 알킬이고 R3이 수소인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  6. 제1항에 있어서,
    2-[1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일]티에노[3,2-c]피리딘;
    2-[3,4-디메틸-1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일]티에노[3,2-c]피리딘;
    2-[3-메틸-1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일]티에노[3,2-c]피리딘;
    2-[3-에틸-1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일]티에노[3,2-c]피리딘;
    2-[4-에틸-1-(6-메틸피리딘-2-일)-1H-피라졸-5-일]티에노[3,2-c]피리딘; 및 그의 제약상 허용되는 염으로 이루어진 군으로부터 선택된 화합물.
  7. 제1항에 있어서, 2-[4-메틸-2-(6-메틸피리딘-2-일)-2H-피라졸-3-일]티에노[3,2-c]피리딘인 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  8. 2-[4-메틸-2-(6-메틸피리딘-2-일)-2H-피라졸-3-일]티에노[3,2-c]피리딘 또는 그의 제약상 허용되는 염.
  9. 반흔 형성을 억제하는 치료가 필요한 포유동물에게 치료상 유효량의 제1항의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염을 투여하는 것을 포함하는, 반흔 형성을 억제하는 방법.
  10. 반흔 형성의 억제를 위한 의약의 제조에 있어서의 2-[4-메틸-2-(6-메틸피리딘-2-일)-2H-피라졸-3-일]티에노[3,2-c]피리딘 또는 그의 제약상 허용되는 염의 용도.
  11. 치료상 유효량의 제1항의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 제약 조성물.
  12. 제1항에 있어서, 상기 화합물이 2-[4-메틸-2-(6-메틸피리딘-2-일)-2H-피라졸-5-일]티에노[3,2-c]피리딘 또는 그의 제약상 허용되는 염인 제약 조성물.
  13. 치료상 유효량의 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항의 화합물 또는 그의 제약상 허용되는 염, 및 국소 적용에 적합한 제약상 허용되는 부형제를 포함하는 국소용 제약 조성물.
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