KR20090057015A - 난을 사용하지 않는 인플루엔자 바이러스 백신의 제조 - Google Patents

Abstract

현재, 인플루엔자 백신을 백신 제조자에게 방출하기 전에 행하는 단계는 난을 통해 인플루엔자 바이러스를 계대배양하는 것을 수반한다. 본 발명은 인플루엔자 백신 제조에 유용한 과정을 제공하는 것이 목적이며, 이는 난의 사용을 줄이고, 바람직하게는 완전히 피한다. 예컨대, 인플루엔자 백신 분리를 위해 난의 사용보다는, 예컨대 현탁액에서 성장하고, 무혈청 배지에서 성장하고, 무단백질 배지에서 성장하고, 비종양형성성이고, 중층 배지의 부재에서 성장하는 등의 MDCK(Madin Darby 개과 신장 세포)을 사용할 수 있다.

인플루엔자 바이러스 백신

Description

난을 사용하지 않는 인플루엔자 바이러스 백신의 제조{MAKING INFLUENZA VIRUS VACCINES WITHOUT USING EGGS}

본원에 언급된 모든 문헌은 그 전체로 참고자료로서 포함된다.

본 발명은 인플루엔자 바이러스에 대하여 보호하기 위한 백신의 제조 분야에 속한다.

인간 인플루엔자 바이러스 감염에 대한 계절적 백신의 제조공정은 하기 단계를 포함한다: (a) 순환하는 바이러스 균주의 분리; (b) 분리된 바이러스의 항원 및 유전자 분석; (c) 도래하는 계절 동안 사용하기 위한 바이러스 균주의 선택; (d) 재배열 또는 역유전학의 사용에 의한 고성장 종자 균주의 제조; (e) 백신 제조자에게 종자 균주 방출; (f) 제조자에 의해 산업상 생산성에 대한 균주의 적합성 평가; 및 (g) 백신이 제조되는 바이러스를 생산하기 위한 종자 균주의 성장[1,2].

이 공정의 단계 (a) 내지 (e)는 통상적으로 세계 보건 기구의 찬조하에 FDA 및 정부 승인된 국제 인플루엔자 센터에 의해 행해지고; 단계 (f) 및 (g)는 제조자에 자신들에 의해 행해진다.

단계 (d)는 바이러스를 사람 감염을 위해 자연적으로 적응된 것에서 산업적 성장 조건하에서 높은 역가로 성장되는 것으로 변화시킨다. 인플루엔자 A 바이러스 에 대하여, 이 단계는 통상적으로 (c)에서 선택된 균주로부터의 HA- 및 NA-인코딩 게놈 분절 및 계란에서 효과적으로 성장하는 균주로부터의 나머지 6개 게놈 분절을 포함하는 6:2 재배열 균주를 생성하는 것을 포함하며, 이 균주는 통상 A/PR/8/34이다. 재배열 과정 다음에 발육란에서 균주의 계대배양(passage)을 반복하여 난 적응 및 성장 향상을 가능하게 한다. 인플루엔자 B 바이러스에 대하여, 통상 재배열체를 발생시키려는 시도 없이 양호한 성장 특성을 지닌 원형 균주가 발육란에서의 직접 반복된 계대배양에 의해 얻어진다.

따라서 백신 제조자에게 방출하기 전에 행해지는 단계는 난을 통해 인플루엔자 바이러스를 계대배양하는 것을 수반한다. 바이러스가 제조자에 의해 단계 (g)에서 난에서 보다 오히려 세포 기질 상에서 성장되더라도, 바이러스는 여전히 단계 (a)에서의 분리와 단계 (e)에서 제조자에 의한 수취 사이의 어느 단계에서 난을 통해 계대배양된다.

예를 들어, 단계 (a)는 환자 시료에 기질을 노출하여 시료 중의 어떤 바이러스가 기질을 감염시키도록 하는 것을 수반한다. 그 다음 기질은 존재하는 바이러스의 양을 증대시킬 수 있고, 증대된 바이러스는 그 후 또 다른 연구에 이용가능하다. 이 단계는 난 또는 포유류 세포에서 일어날 수 있다. 일차 분리에서 사용되는 것으로 알려진 세포는 MRC-5 세포 [3], 베로 세포 [4,5], MDCK 세포 [6], HepG2 세포 [7], LLC-MK2 세포 [8] 등을 포함한다. 그러나 일반적으로 계란이 인플루엔자 백신의 제조를 위한 표준 균주를 분리하는데 지속적으로 사용된다. 본래 난에서 분리되지 않았고[2,9] 항원적으로 유사한 난-분리된 균주가 입수가능하지 않았기 때 문에 FDA가 2003-04 시기에 가장 적절한 H3N2 균주 (A/Fujian/411/2002)의 사용을 거부한 현 과정에 난의 사용은 매우 중요하다.

인플루엔자 바이러스 제조의 여러 단계로부터 난의 사용을 제거하는 것이 이전부터 제안되어 왔다.

참고자료 10은 백신이 (i) 계대배양된 임상 분리체의 고성장 균주 또는 (ii) 적어도 하나의 자연 발생 포유류 인플루엔자 바이러스 균주로부터 유래한 재배열체 중 어느 하나를 사용하여 세포 배양액에서 성장하여야 하고, 단, 분리체 또는 재배열체는 조류의 난에서 계대배양되지 않는다는 것을 제안한다. 따라서 참고자료 10에 기재되어 있는 공정은 선택한 세포 배양액에서 성장을 위해 이미 선택 또는 조작된 종자 바이러스로 시작한다.

참고자료 11은 난을 통해 계대배양된 바이러스를 MDCK 세포를 통해 계대배양된 것과 비교하지만, 구체적으로 백신 제조를 위해 전자를 선택한다.

참고자료 12는 유행성 인플루엔자 백신을 위한 종자 바이러스가 발육란을 통하는 대신 유행성 균주를 포유류 세포 배양액에 직접 증식시킴으로써 제조될 수 있다는 것을 제안하지만, 유행기 사이의 제조에 대하여 난 계대배양은 의무적이었다는 것을 주지한다. 이 의무적인 난 계대배양에 대한 근거는 이것이 외래 인자에 대한 '필터'로서 작용하는 것으로 생각되어 왔고: 인간으로부터의 최초 임상 분리체와 인간에게 투여하기 위한 최종 백신 사이에 조류계에서의 일련의 계대배양은 포유류형 외래 인자가 인플루엔자 바이러스와 공동-복제되는 것을 방지할 것이라는 것을 규제 기관이 수용하여 왔다는 것이다.

본 발명은 난의 사용을 줄이고, 바람직하게는 완전히 피하는 인플루엔자 백신의 제조에 유용한 또 다른 과정을 제공하는 것이 목적이다. 한 특정 양태에서, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 분리에 유용한 또 다른 개선된 과정을 제공하는 것이 목적이다.

인플루엔자 바이러스 제조의 여러 단계로부터 난의 사용을 제거하는 것이 이미 제안되어 있지만, 본 발명은 여러 양태에서 이들 제안과 다르다.

종자 바이러스의 제조

본 발명의 제1 양태는 (i) 환자로부터 또는 일차 분리체로부터 직접 얻어진 인플루엔자 바이러스로 셀라인을 감염시키는 단계; (ii) 단계 (i)에서 얻어진 감염된 셀라인으로부터의 바이러스를 1회 이상 계대배양하는 단계; 및 (iii) 단계 (ii)로부터의 감염된 셀라인을 배양하여 인플루엔자 바이러스를 생산하는 단계를 포함하는 백신 제조를 위한 인플루엔자 종자 바이러스의 제조공정을 제공한다. 단계 (iii)의 배양으로부터의 정제된 인플루엔자 바이러스는 종자 바이러스로서 사용할 수 있다.

참고자료 12와는 달리, 단계 (i)에서 사용되는 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 B 바이러스 또는 비유행성 인플루엔자 A 바이러스, 즉 현 시점에서는 인플루엔자 A의 H1N1 또는 H3N2 균주이다.

단계 (i), (ii) 또는 (iii) 중 어느 것도 난에서 바이러스의 성장 또는 계대배양을 수반하지 않는다. 바람직하게는 적어도 두 단계, 이상적으로는 모든 세 단계가 동일한 세포 유형, 예컨대 모두 MDCK 세포에서 일어날 것이다. 단계 (ii)에서 계대배양은 통상적으로 인플루엔자 바이러스를 세포 배양액에서 복제하는 단계; 복제된 바이러스를 예컨대 배양 상청액으로부터 수집하는 단계; 및 수집된 복제된 바이러스를 감염되지 않은 세포 배양액으로 이송하는 단계를 수반할 것이다. 이 공정은 반복할 수 있다. 적어도 1회 계대배양 후에 바이러스를 단계 (iii)에서 복제하고 바이러스를 수집할 수 있지만, 바이러스를 또 다른 계대배양을 위해 감염되지 않은 배양액으로 이송하기 보다는 종자 바이러스로서 사용한다.

제1 양태에서 사용되는 셀라인은 인간 셀라인이 아닌 것이 바람직하다. 인간 세포의 사용을 피함으로써, 난을 사용하지 않고도 외래 인자의 '필터링'이 유지될 수 있다. 인간에 대한 밀접한 관계 때문에, 셀라인은 영장류 셀라인이 아닌 것이 바람직하고, 예컨대 이것은 베로(Vero) 셀라인 (원숭이 신장으로부터 유래)가 아니다. 참고자료 10은 백신 제조 동안 베로 세포의 사용을 제안하지만 이들 세포는 많은 인간 바이러스에 복제를 허용하고, 따라서 단계 (i)에서 사용되는 인플루엔자 바이러스 시료에 존재하는 어떤 또 다른 인간 바이러스가 인플루엔자 바이러스와 동시에 성장할 수 있어 최후 종자 바이러스의 오염을 초래할 것이다.

본 발명의 제1 양태에 사용하기 위한 바람직한 셀라인은 참고자료 10의 특정 지침과는 달리 MDCK(Madin Darby 개과 신장) 셀라인과 같은 개과 셀라인이다. MDCK 세포의 또 다른 상세를 하기에 제시한다. MDCK 세포는 조류의 알에 의해 얻어지는 것과 동등한 외래 인자에 대한 '필터링' 효과를 나타낸다는 것이 발견되었다. 이 발견에 기초하여, 그러므로 MDCK 세포는 규제 위험성을 증가시키지 않고 난 대신 사용될 수 있으며, 인플루엔자 바이러스의 난 계대배양이 MDCK 배양 동안 성장 이점을 전달한다는 참고자료 13의 보고에도 불구하고, 난에서의 성장이 피해진다.

참고자료 14는 난 또는 세포 배양액에서의 어떤 계대배양 없이 인간 환자로부터 분리된 인플루엔자 균주가 무혈청 배양액을 포함하는 MDCK 세포 배양액에서 효과적으로 성장할 수 있다는 것을 개시한다. 따라서 단계 (i)에서의 감염은 환자로부터 직접 얻어진 임상 시료로부터(예컨대 인후 스웝(swab) 등으로부터) 인플루엔자 바이러스를 사용할 수 있거나, 이미 일차 분리가 실시된 바이러스를 사용할 수 있다. 일부 상황에서, 단계 (i) 이전의 일차 분리는 난에서 일어날 수 있지만, 본 발명에서 사용하기 위한 바람직한 일차 분리체는 난을 사용하지 않고 예컨대 포유류 세포에서 얻어진 것이다. 일차 분리에서 사용하기 위해 알려진 세포는 MRC-5 세포 [3], 베로 세포 [4,5], MDCK 세포 [6], HepG2 세포 [7], LLC-MK2 세포 [8] 등을 포함하지만 여기에 제한되지 않는다.

본 발명이 단계 (i)에서 일차 분리체를 사용하는 경우, 일차 분리는 단계 (i) 내지 (iii)과 동일한 세포 유형에서 일어나는 것이 바람직하다. MDCK는 이미 일차 분리, 계대배양 및 인플루엔자 바이러스의 성장 모두에 적합한 것으로 알려져 있지만, MDCK 분리의 개선은 이하에 설명된다.

인플루엔자 바이러스 분리체의 내력의 이해를 최대로 하기 위해서, 일차 분리체를 사용하기 보다는 임상 분리체로부터 직접 얻어진 바이러스를 사용하는 것이 바람직하다. 현재 인플루엔자 감시 시스템은 병원에서 일차 분리를 수반하며 목적의 균주가 국내 및 국제 인플루엔자 센터로 보내진다. 일차 분리를 위한 환자 시료의 사용에 더하여, 재분리를 위해 초기 물질로 되돌아갈 수 있도록 일부에 대하여 별도로 모아서 (예컨대 냉동에 의해) 저장하는 것이 일반적이다. 이렇게 저장된 시료가 이용가능한 경우 단계 (i)에서 일차 분리체 대신에 사용할 수 있다.

분리체의 내력이 불명이면, 특히 임상 시료로부터 직접적이 아닌 바이러스로 출발할 때, 단계 (i)과 (iii) 사이에 역유전학을 사용하여 모체 바이러스로부터 적어도 하나의 바이러스 게놈 분절을 갖는 신규의 바이러스 균주를 발생시킬 수 있다. 단계 (i)과 (iii) 사이에 역유전학의 사용은 단계 (i)에서 사용하는 바이러스 생성물과 단계 (iii)에서 사용하는 바이러스 생성물을 분리시키고, 따라서 단계 (i) 전에 유도될 수 있는 외래 인자에 대하여 필터로서 작용할 수 있다. 이 방식으로 '필터'로서 사용되는 것에 더하여, 역유전학 기술은 다른 이유로, 예컨대 재배열체 발생, 코딩 서열 조작, 특정 분절 대체 등을 위해서 사용할 수도 있다. 본 발명의 제2 양태와 관련하여 더욱 상세한 것은 하기에 제시한다.

인플루엔자 바이러스의 세포 배양과 관련한 역유전학의 사용

본 발명의 제2 양태는 (i) 셀라인을 환자로부터 또는 일차 분리체로부터 직접 얻어진 인플루엔자 바이러스로 감염시키는 단계; (ii) 단계 (i)에서 얻어진 감염된 셀라인에 의해 생산된 인플루엔자 바이러스의 하나 이상의 바이러스성 RNA 분절의 cDNA를 제조하고, 역유전학 과정에서 cDNA를 사용하여 단계 (i)의 인플루엔자 바이러스와 공통된 하나 이상의 바이러스성 RNA 분절을 갖는 신규 인플루엔자 바이러스를 제조하는 단계; 및 (iii) 신규 인플루엔자 바이러스로 셀라인을 감염시킨 후 이 셀라인을 배양하여 종자 바이러스로서 사용하기 위한 신규 인플루엔자 바이러스를 생산하는 단계를 포함하는 백신 제조를 위한 인플루엔자 종자 바이러스의 제조공정을 제공한다.

단계 (i)에서 사용하는 바이러스는 어떤 인플루엔자 A 바이러스의 아형이 될 수 있거나, 인플루엔자 B 바이러스가 될 수 있다. 바람직한 인플루엔자 A 바이러스 아형은 H1, H3 및 H5이다.

단계 (i), (ii) 또는 (iii) 중 어느 것도 난에서의 바이러스의 성장 또는 계대배양을 수반하지 않는다. 바람직하게는 이들은 모두 동일한 유형의 세포에서 일어나고, 예컨대 이들은 모두 MDCK 세포에서 일어난다.

본 발명의 제2 양태의 또 다른 특징은 제1 양태에 대하여 상술한 바이다. 따라서, MDCK 세포의 사용 등이 바람직하다.

역유전학 기술은 하기에 보다 상세히 설명한다. 단계 (ii)로 이송되는 게놈 분절(들)은 HA 분절을 포함할 것이며, NA 분절 및/또는 하나 이상의 다른 분절을 포함할 수 있다.

종자 바이러스

본 발명의 제1 및 제2 양태는 종자 바이러스를 제공한다. 이들 종자 바이러스는 다양한 방식으로 사용할 수 있다.

종자 바이러스는 예컨대 그들의 핵산 및/또는 단백질 서열, 다른 균주(예컨대, 순환하는 균주)에 대한 그들의 항원 관계 확인, 그들의 면역원성 확인 등을 특징으로 할 수 있다. HA 아미노산 서열을 밝히기 위한 바이러스 HA 유전자의 서열화가 통상적이다.

종자 바이러스는 항혈청을 도출하는데 사용할 수 있다.

종자 바이러스는 백신 제조자에게 분배될 수 있다.

종자 바이러스는 미래 사용을 위해 저장될 수 있다.

종자 바이러스는 제조용(working) 종자를 다량으로 제조하는데 사용할 수 있다. 이 시스템은 최초 종자 바이러스의 안전한 저장을 가능하게 하면서 다량의 제조용 종자로 일상의 사용을 행한다. 제조용 종자는 필요할 때까지 냉동시켜도 좋다. 제조용 종자의 다량 제조는 바람직하게는 종자 바이러스의 제조에 사용된 것과 동일한 세포 유형으로 세포 배양액에서 바이러스 성장의 단계를 수반할 수 있다. 난에서의 성장은 제조용 종자를 다량으로 제조하는데 사용되지 않는다.

종자 바이러스를 성장용 셀라인을 감염시키는데 사용하여 백신 제조를 위한 또는 진단 시험물 제조에 사용하기 위한 바이러스를 제공할 수 있다.

본 발명의 종자 바이러스는 현재 난-유래된 종자 바이러스의 많은 특징을 공유하지만 여러 방면에서 다를 수 있다.

예컨대, 본 발명의 바람직한 인플루엔자 A 종자 바이러스는 하기에 보다 상세히 설명하는 바와 같이 PR/8/34 인플루엔자 바이러스로부터 6개 보다 적은(즉 0, 1, 2, 3, 4 또는 5) 바이러스성 분절을 포함한다.

난을 사용하지 않는 백신 제조

본 발명의 제3 양태는 (i) 개체군에서 순환하거나 또는 개체군에서 순환하는 인플루엔자 바이러스의 항원 대표인 헤마글루티닌을 갖는 인플루엔자 바이러스를 얻는 단계; (ii) 단계 (i)에서 얻어진 인플루엔자 바이러스로 셀라인을 감염시키는 단계; (iii) 단계 (ii)에서 얻어진 감염된 셀라인으로부터의 바이러스를 적어도 한번 계대배양하여 종자 균주를 제공하는 단계; 및 (iv) 단계 (iii)로부터의 종자 균주를 배양하여 인플루엔자 바이러스를 생산하는 단계를 포함하는 백신 제조를 위한 인플루엔자 바이러스의 제조공정을 제공한다.

제1 및 제2 양태가 서로 상이한 것과 동일한 방식으로(상기 참조), 본 발명의 제4 양태는 (i) 개체군에서 순환하거나 또는 개체군에서 순환하는 인플루엔자 바이러스의 항원 대표인 헤마글루티닌을 갖는 인플루엔자 바이러스를 얻는 단계; (ii) 단계 (i)에서 얻어진 인플루엔자 바이러스로 셀라인을 감염시키는 단계; (iii) 단계 (i)에서 얻어진 감염된 셀라인에 의해 생산된 인플루엔자 바이러스의 하나 이상의 바이러스성 RNA 분절의 cDNA를 제조하고, 역유전학 과정에서 cDNA를 사용하여 단계 (i)의 인플루엔자 바이러스와 공통된 하나 이상의 바이러스성 RNA 분절을 갖는 인플루엔자 종자 바이러스를 제조하는 단계; 및 (iv) 인플루엔자 종자 바이러스로 셀라인을 감염시킨 후 단계 (iii)으로부터의 계대배양된 셀라인을 배양하여 인플루엔자 바이러스를 생산하는 단계를 포함하는 백신 제조를 위한 인플루엔자 바이러스의 제조공정을 제공한다.

본 발명은 또한 제3 또는 제4 양태의 이들 단계 (i) 내지 (iv), 그 다음 (v) 단계 (iv)에서 얻어진 바이러스를 처리하여 백신을 제공하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스 백신의 제조공정을 제공한다. 단계 (v)에서 사용되는 기술의 상세는 하기에 제시한다.

단계 (i), (ii), (iii), (iv) 또는 (v) 중 어느 것도 난에서 바이러스의 성장 또는 계대배양을 수반하지 않는다.

단계 (i)에서 사용되는 바이러스는 인플루엔자 A 바이러스의 어떤 아형의 일수 있거나, 또는 인플루엔자 B 바이러스일 수 있다. 바람직한 인플루엔자 A 바이러스 아형은 H1, H3 및 H5, 예컨대 H1N1 또는 H3N2이다.

단계 (i)에서 사용되는 바이러스는 그것의 일차 분리 때문에 난에서 증식되지 않고, 바람직하게는 최초 바이러스가 존재하는 환자와 단계 (i)의 시작 사이에 어느 상태에서 난에서 증식되지 않는다.

용어 "항원 대표인"은 실질적으로 개체군 내에서 광범위한 순환에 존재하지 않지만, 순환에 존재하는 균주에 대하여 보호할 수 있는 면역 반응을 도출하고 제조 목적에 편리한 바이러스 균주를 설명하기 위해 인플루엔자 백신 분야에서 사용된다. "항원 대표인" 균주에 의해 도출된 혈청들은 예컨대 적혈구 응집반응 억제 분석에서 순환하는 균주를 억제할 수 있을 것이다.

단계 (i)은 다수의 상이한 균주로 출발한 다음 그 후 사용하기 위한 균주를 선택하는 것을 수반할 수 있다. 예컨대, 다수의 상이한 인플루엔자 A 바이러스의 H1N1 균주로 출발한 다음 그 후 사용하기 위한 균주를 선택하는 것을 수반할 수 있다. 다수의 상이한 인플루엔자 A 바이러스 H3N2 균주로 출발한 다음 그 후 사용하기 위한 균주를 선택하는 것을 수반할 수 있다. 다수의 상이한 인플루엔자 B 바이러스의 균주로 출발한 다음 그 후 사용하기 위한 균주를 선택하는 것을 수반할 수 있다. 선택은 인플루엔자 바이러스에서 봉입체를 위한 균주를 선택할 때 통상적으로 사용되는 면역학적 혈청학적 기준에 근거하여, 예컨대 순환에서 가장 일반적인 및/또는 병원성인 균주 중 항원 대표인 균주를 선택할 것이다.

단계 (iii) 다음은 종자 바이러스가 단계 (i)에서 얻어진 균주의 항원 대표인 것을 확인하는 단계가 될 수 있다. 이 확인 단계는 단계 (iv) 시작 전에 행할 수 있거나, 또는 단계 (iv)와 동시에 행할 수 있다.

본 발명은 또한 (a) 제1 양태의 단계 (i) 내지 (iii) 또는 제2 양태의 단계 (i) 내지 (iv) 중 어느 하나를 포함하는 방법에 의해 제조된 바이러스를 얻는 단계; 및 (b) 이 바이러스를 처리하여 백신을 제공하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스 백신의 제조공정을 제공한다.

총괄하여, 그러므로 본 발명의 제3 및 제4 양태는 환자 시료(또는 일차 분리체)로부터 인플루엔자 백신의 생산을 가능하게 하며, 이때 백신의 제조에 사용되는 인플루엔자 바이러스는 어느 상태에서도 난을 통해 계대배양되지 않는다.

바이러스 재배열

본 발명의 제5 양태는 (i) 제1 세트의 게놈 분절을 갖는 인플루엔자 바이러스의 제1 균주와 제2 세트의 게놈 분절을 갖는 인플루엔자 바이러스의 제2 균주 모두로 셀라인을 감염시키는 단계로서, 이때 제1 균주는 원하는 헤마글루티닌을 인코딩하는 HA 분절을 갖는 단계; 및 (ii) 단계 (i)로부터 감염된 세포를 배양하여 제1 세트의 게놈 분절로부터 하나 이상의 분절 및 제2 세트의 게놈 분절로부터 하나 이상의 분절을 갖는 인플루엔자 바이러스를 생산하는 단계로서, 단 제1 세트의 게놈 분절로부터의 상기 하나 이상의 분절은 제1 균주로부터의 HA 분절을 포함하는 단계를 포함하는 재배열 인플루엔자 바이러스의 제조공정을 제공한다. 따라서, 공정은 제1 균주로부터 제2 균주로 적어도 HA 분절을 이동시키며, 이것에 의해 난을 사용하지 않고 제1 또는 제2 균주 중 어느 것으로부터 바이러스 게놈 분절의 상이한 수집에 의해 신규의 재배열 균주를 생성할 수 있다.

단계 (ii)의 배양으로부터 정제된 인플루엔자 바이러스는 본원에 설명된 바와 같이 사용할 수 있다. 재배열체는 제1 균주에 비하여 개선된 성장 특성을 나타낼 수 있다.

재배열체는 또한 원하는 뉴라미니다아제를 인코딩하는 제1 균주로부터 NA 분절을 포함할 수 있다.

재배열체는 일반적으로 제1 균주 및 제2 균주로부터의 분절을 1:7, 2:6, 3:5, 4:4, 5:3, 6:2 또는 7:1의 비율로 포함할 것이다. 제2 균주로부터 대부분의 균주를 갖는 것이 통상적이다.

이 공정은 인플루엔자 A 바이러스와 인플루엔자 B 바이러스의 재배열체 발생에 사용할 수 있다. 인플루엔자 A 바이러스에 대하여 일부 구체예에서 제2 균주는 PR/8/34일 것이지만, PP8/34와 공통된 분절 NP, M, NS, PA, PB1 또는 PB2 중 1, 2, 3, 4 또는 5개만을 공유하는 것을 포함하여 다른 균주를 사용할 수도 있다.

본 발명은 또한 제5 양태의 재배열 방법에 의해 얻을 수 있는 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 본 발명은 또한 백신 제조에서 이러한 바이러스의 용도를 제공한다.

단계 (i) 또는 (ii) 중 어느 것도 난에서의 바이러스의 성장, 재배열 또는 계대배양을 수반하지 않는다. 재배열 공정은 본원에서 설명한 바와 같이 분리 또는 계대배양에 사용된 것과 동일한 세포 유형(예컨대, MDCK 세포)에서 편리하게 행할 수 있다.

제1 균주는 편리하게 환자로부터 또는 일차 분리체로부터 직접 얻어진 인플루엔자 바이러스일 수 있다.

바이러스 분리

상술한 바와 같이, 인플루엔자 바이러스 분리를 위해 난을 사용하려는 강한 경향이 있다. 대신, 본 발명의 제6 양태는 MDCK 세포를 사용한다. 일부 구체예에서, MDCK 세포는 현탁액에서 성장된다. 다른 구체예에서, MDCK 세포는 무혈청 배지 또는 무단백질 배지에서 성장된다. 다른 구체예에서, MDCK 세포는 비종양형성성이다. 다른 구체예에서, MDCK 세포는 중층 배지의 존재하에서 성장된다.

따라서, 본 발명은 현탁 배양액에서 성장하는 MDCK 세포와 함께 환자 시료를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 환자 시료로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는방법을 제공한다.

본 발명은 무혈청 배지에서 성장하는 MDCK 세포와 함께 환자 시료를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 환자 시료로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명은 무단백질 배지에서 성장하는 MDCK 세포와 함께 환자 시료를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 환자 시료로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 비종양형성성 MDCK 세포와 함께 환자 시료를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 환자 시료로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 중층 배지가 제공되지 않은 MDCK 세포와 함께 환자 시료를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 환자 시료로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 무혈청 현탁 배양액에서 성장하는 MDCK 세포와 함께 환자 시료를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 환자 시료로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 무단백질 현탁 배양액에서 성장하는 MDCK 세포와 함께 환자 시료를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 환자 시료로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 현탁 배양액에서 성장하는 비종양형성성 MDCK 세포와 함께 환자 시료를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 환자 시료로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 무혈청 현탁 배양액에서 성장하는 비종양형성성 MDCK 세포와 함께 환자 시료를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 환자 시료로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 무단백질 현탁 배양액에서 성장하는 비종양형성성 MDCK 세포와 함께 환자 시료를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 환자 시료로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 이들 방법 중 하나에 의해 분리된 인플루엔자 바이러스를 제공한다. 본 발명은 또한 백신 제조에서 이러한 바이러스의 용도를 제공한다.

환자 시료와 MDCK 세포의 인큐베이션은 일반적으로 인간 인플루엔자 바이러스, 특히 인간 인플루엔자 A 바이러스와 같은 인플루엔자 바이러스에 의한 MDCK 세포의 감염을 가져온다. 바이러스는 세포에서 복제될 수 있으며, 복제된 바이러스를 그 후 수집할 수 있다. 선택적으로, 이것은 하류 방법 단계, 예컨대 검출, 특성화, 분석, 종자 바이러스의 제조, 조작 등에서 사용할 수 있다.

MDCK 세포에서의 분리 후, 바이러스는 또한 MDCK 세포에서 계대배양 및/또는 성장될 수 있다. 대안적으로, 비-MDCK 세포에서, 또는 난에서, 또는 또 다른 기질에서 계대배양 및/또는 성장될 수 있다.

본 발명의 제6 양태는 MDCK 셀라인의 사용을 수반한다. 최초 MDCK 셀라인은 ATCC로부터 이용가능하지만, 본 발명의 제6 양태는 이 셀라인의 유도체를 사용한다. 하기 나타낸 바와 같이, 이들 유도체에서의 분리는 최초 MDCK 셀라인에서의 분리 보다 우수한 것으로 보인다. 적합한 MDCK 세포 및 이들의 특성은 하기에 더욱 상세히 논의한다.

예컨대, 제6 양태의 일부 구체예는 현탁 배양액에서 자발적으로 복제할 수 있는 MDCK 셀라인을 사용한다. 참고자료 30은 현탁 배양액에서의 성장에 적응된 MDCK 셀라인을 개시하고, 이 셀라인 ('MDCK 33016')는 제6 양태의 방법에 특히 유용하다. MDCK 33016은 무혈청 배양액에서 성장할 수 있고, 중층 배지를 필요로 하지 않고 성장할 수 있다. 무혈청 배양액을 포함하여 현탁 배양액에서 성장할 수 있는 또 다른 MDCK 셀라인은 'B-702' 셀라인이다[36; 하기 참조].

제6 양태에서 사용하기 위한 비종양형성성 MDCK 셀라인은 'MDCK-S', 'MDCK-SF1O1', 'MDCK-SF102' 및 'MDCK-SF103'와 같은 참고자료 37에 개시된 것을 포함한다(하기 참조).

제6 양태의 일부 구체예에서, 무혈청 배지 배양액 및/또는 무단백질 배지에서 MDCK 세포가 성장한다.

특정한 종래 방법과는 달리, 본 발명의 제6 양태는 인플루엔자 바이러스 분리 동안 중층 배지 사용의 필요를 피할 수 있다.

상술한 바와 같이 MDCK 세포에 노출하기 전에 바이러스를 난에서 성장시키지 않는 것이 바람직하다. 상술한 바와 같이 MDCK 세포에서 성장한 바이러스를 이어서 난에서 성장시키지 않는 것도 바람직할 수 있다.

제6 양태에서 사용되는 환자 시료에 대하여, 인플루엔자 바이러스 분리에서 사용되는 임상 시료는 다양한 형태를 취할 수 있지만, 통상적으로 직접 흡입; 가글; 비강 세척; 비강 스웝; 인후 스웝; 인두 스웝 등을 포함하는 호흡 분비를 포함하고, 여기에 제한되지는 않는다. 이들은 일반적으로 신규의 인플루엔자 바이러스의 균주가 잠복하고 있는 환자를 포함하여 인플루엔자 바이러스에 감염되었을 것으로 추측되는 환자로부터 취한다.

제6 양태의 방법에 의해 분리된 인플루엔자 바이러스를 백신 제조를 위한 인플루엔자 종자 바이러스를 제조하는데 사용할 수 있다. 따라서 제6 양태의 방법은 감염된 MDCK 셀라인으로부터 바이러스를 1회 이상 계대배양하는 단계를 더 포함할 수 있다. 그 다음 방법은 인플루엔자 바이러스를 생산하기 위해 감염된 세포를 배양하는 단계를 포함할 수 있다. 이 배양 단계 후 정제된 인플루엔자 바이러스는 본원에 설명한 바와 같이 종자 바이러스로서 사용할 수 있다.

제6 양태에 따라 분리된 바이러스는 또한 역유전학 기술을 위한 공급원으로서 사용할 수 있다. 따라서 cDNA는 제6 양태에 따라 분리된 인플루엔자 바이러스의 하나 이상의 바이러스성 RNA 분절로부터 제조할 수 있다. 그 다음 cDNA는 분리된 인플루엔자 바이러스와 공통된 하나 이상의 바이러스성 RNA 분절을 갖는 신규의 인플루엔자 바이러스를 제조하기 위한 역유전학 과정에 사용할 수 있다. 그 다음 이 신규의 인플루엔자 바이러스는 셀라인을 예컨대 또 다른 배양을 위해 감염시키는데 사용할 수 있다.

본 발명의 제6 양태는 인간 인플루엔자 바이러스를 포함하여 어떤 적합한 인플루엔자 바이러스를 분리하는데 사용할 수 있다. 이들은 인플루엔자 A 바이러스, 인플루엔자 B 바이러스 또는 인플루엔자 C 바이러스일 수 있다. 인플루엔자 A 바이러스가 통상적이고, 유용한 인플루엔자 A 바이러스 아형은 H1, H3 및 H5이다.

현재 유행기 사이 기간에, 백신은 통상적으로 2개의 인플루엔자 A 균주 (H1N1 및 H3N2)와 하나의 인플루엔자 B 균주를 포함한다. 제6 양태는 이러한 균주를 분리하기 위해서, 또는 H2, H5, H7 또는 H9 아형 균주와 같은 유행성 바이러스 균주를 분리하기 위해서 사용할 수 있다. 일반적으로 제6 양태는 HA 아형 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H1O, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16 중 하나를 갖는 인플루엔자 A 바이러스를 분리하기 위해 사용할 수 있다.

본 발명의 제6 양태에 따라 분리된 인플루엔자 바이러스는 Sia(α2,3)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 비하여 Sia(α2,6)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 대한 결합을 선호하는 헤마글루티닌을 포함할 수 있다. 유리하게는, 본 발명의 분리 방법은 바이러스의 HA 서열의 안정한 보유, 따라서 그것의 올리고당 선호에 도움을 주는 것으로 발견되었다.

제6 양태에 따라 분리된 바이러스는 백신 제조 및 처리의 방법에 사용할 수 있다. 따라서 본 발명은 또한 환자에서 면역 반응을 증가시키기 위한 의약품의 제조에서, 제6 양태에 따라 분리된 바이러스로부터 제조된 항원의 용도를 제공한다.

수용체 결합

인간 인플루엔자 바이러스는 Sia(α2,6)Gal 말단 이당류 (갈락토스에 α-2,6 연결된 시알산)을 갖는 수용체 올리고당에 결합하지만, 난은 대신 Sia(α2,3)Gal 말단 이당류를 갖는 수용체 올리고당을 갖는다. 난에서 인간 인플루엔자 바이러스의 성장은 Sia(α2,6)Gal 결합으로부터 멀어져서 Sia(α2,3)Gal 결합을 향하여 헤마글루티닌에 계대배양에 선택압을 제공한다.

난과 같이, 베로 세포는 Sia(α2,3)Gal 수용체를 우세하게 발현한다[15]. 이와 달리, MDCK 세포 및 PER.C6 세포는 Sia(α2,3)Gal 및 Sia(α2,6)Gal을 모두 발현한다. 참고자료 16는 Sia(α2,6)Gal 결합의 우세한 선택을 위해서 α-2,6-시알산전이효소 과잉발현을 위한 MDCK 세포의 트랜스펙션을 보고한다. 그러나 이러한 조작 없이도, 이들을 Sia(α2,3)Gal 결합을 향하여 이동시키지 않고 MDCK 세포 상에 인플루엔자 바이러스를 성장시킬 수 있다. 따라서 본 발명은 Sia(α2,3)Gal과 Sia(α2,6)Gal을 모두 발현하는 세포를 사용할 수 있지만, Sia(α2,3)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 비하여 Sia(α2,6)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 대한 결합을 선호하는 인플루엔자 바이러스를 생산할 수 있다.

본 발명의 제1 및 제2 양태의 바람직한 구체예에서, 단계 (i)에서 감염을 위해 사용되는 인플루엔자 바이러스는 Sia(α2,3)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 비하여 Sia(α2,6)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 대한 결합을 선호한다. 이 결합 선호는 단계 (ii) 및 단계 (iii) 동안 유지되어서, 단계 (iii)에서 생산되는 인플루엔자 바이러스는 Sia(α2,3)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 비하여 Sia(α2,6)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 대한 결합을 선호한다.

본 발명의 제3 및 제4 양태의 바람직한 구체예에서, 단계 (ii)에서 감염에 사용되는 인플루엔자 바이러스는 Sia(α2,3)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 비하여 Sia(α2,6)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 대한 결합을 선호한다. 이 결합 선호는 단계 (iii) 및 단계 (iv) 동안 유지되어서, 단계 (iv)에서 생산되는 인플루엔자 바이러스는 Sia(α2,3)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 비하여 Sia(α2,6)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 대한 결합을 선호한다.

바이러스가 Sia(α2,3)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 비하여 Sia(α2,6)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 대한 결합을 선호하는지를 판단하기 위해서, 여러가지 분석법을 사용할 수 있다. 예컨대, 참고자료 17은 친화 상수의 감도 정량적 측정을 제공하는 인플루엔자 바이러스 수용체-결합 활성을 위한 고체상 효소-연관 분석법을 기술한다. 참고자료 18은 2개의 상이한 시알릴당단백질에 대한 바이러스의 결합을 평가하는 고체상 분석법을 사용하였고(오보뮤코이드, Sia(α2,3)Gal 결정자 보유; 및 돼지 α2-마크로글로불린, Sia(α2,6)Gal 결정자 보유), 또한 바이러스의 결합이 2개의 수용체 아날로그: 프리 시알산 (Neu5Ac) 및 3'-시알릴락토스(Neu5Acα2-3Galβ1-4Glc)에 대하여 평가되는 분석법을 설명한다. 참고자료 19는 α2,3 또는 α2,6 연결에 대한 수용체 선호를 명백히 식별할 수 있는 글리칸 배열을 사용하는 분석법을 보고한다. 참고자료 20은 Sia(α2,6)Gal 또는 Sia(α2,3)Gal을 함유하기 위해 효소적으로 변성된 인간 적혈구의 응집에 기반한 분석법을 보고한다. 분석법의 종류에 의존하여, 이것은 바이러스 자체로 직접 행할 수 있거나, 또는 바이러스로부터 정제된 헤마글루티닌으로 간접적으로 행할 수 있다.

표준 물질

인플루엔자 바이러스를 제조하기 위한 현재 공정은 각 균주를 위한 표준 시약, 즉 (i) 항-HA 혈청 및 (ii) 정제된 완전한 비리온의 제조를 수반한다. 이들 조정된 시약은 제조자에 의해 생산된 벌크 항원에서 HA의 수준을 결정하기 위한 SRID 분석에 사용되며, 이것에 의해 이들을 벌크에 희석하여 투약량 당 원하는 양의 HA을 보유하는 백신을 제공할 수 있다.

현 공정으로, 표준 균주가 난을 통해 계대배양되고 생산 균주가 난에서의 성장에 대하여 최적화된 경우, 표준 시약에서 혈청과 항원은 잘 매치된다. 그러나, 혈청은 아마도 상이한 시스템에서 상이한 선택압 때문에 세포 배양액에서 생산된 항원에 대하여 열등한 매치가 될 수 있다는 것이 발견된다. 표준 혈청과 항원 사이의 열등한 반응성은 HA 수준이 추정 이하이어서 (i) 주어진 벌크로부터 적은 투약량 및 (ii) 백신에서 HA의 과잉-투약량을 초래할 것이라는 것을 의미한다.

세포 배양액으로부터 유래한 항원과 난-유래된 물질에 대하여 증가된 혈청의 매칭 문제를 극복하기 위해서, 본 발명은 난-기반 성장에 적응되지 않은 바이러스에 기반한 표준 물질을 제공한다.

따라서 본 발명은 (i) 동물에게 정제된 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌을 투여하는 단계; 및 그 다음 (ii) 동물로부터 헤마글루티닌을 인식하는 항체를 함유하는 혈청을 회수하는 단계를 포함하고, 단계 (i)에서 사용되는 헤마글루티닌이 셀라인에서 성장한 바이러스로부터 유래하는 것을 특징으로 하는 동물로부터 항혈청을 제조하기 위한 공정을 제공한다.

단계 (i)에서 사용된 헤마글루티닌은 난에서 성장하지 않은 바이러스로부터인 것이 바람직하다. 예컨대, 헤마글루티닌은 Sia(α2,3)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 비하여 Sia(α2,6)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 대한 결합을 선호할 수 있다.

항혈청을 발생시키기 위해서 사용되는 바람직한 헤마글루티닌은 MDCK와 같은 포유류 셀라인(예컨대 본원에 설명된 셀라인)에서의 성장으로부터 얻을 수 있는 글리칸으로 글리코실화된다.

항혈청은 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스에 대하여 발생할 수 있다.

동물은 염소와 같은 포유동물이 바람직하고, 보다 바람직하게는 양이다. 항혈청은 양에서 브로멜라인 처리에 의해 정제된 바이러스러부터 HA를 추출한 다음 수크로스 구배로 침전에 의한 정제에 의해 편리하게 제조할 수 있다. 약 50㎍ 투약량의 헤마글루티닌을 프로인드 완전 보조제(FCA)와 조합하여 양에게 근육주사 투여한다. 1O㎍ 투약량을 2주 후에 투여한 다음, 격주로 2-4회 더 투약할 수 있다. 그 후, 혈청을 수집할 수 있다. 사용 전에, 이것을 희석하여(예컨대 아지드 나트륨을 함유하는 PBS 버퍼로) 용기에 채울 수 있다. 수족구병 조정을 위해서 혈청을 산성 pH에 노출할 수 있다(예컨대 2시간 동안 pH 5).

본 발명은 또한 (i) 셀라인에서 인플루엔자 바이러스를 성장시키는 단계; (ii) 단계 (i)에서 성장된 바이러스로부터 헤마글루티닌 항원을 정제하는 단계; (iii) 단계 (ii)로부터의 정제된 헤마글루티닌을 동물에게 투여하는 단계; 및 그 다음 (iv) 동물로부터 헤마글루티닌을 인식하는 항체를 함유하는 혈청을 회수하는 단계를 포함하는 동물로부터 항혈청을 제조하기 위한 공정을 제공한다.

본 발명은 또한 이들 공정에 의해 얻을 수 있는 항혈청을 제공한다.

본 발명은 또한 이 항혈청을 포함하는 겔을 제공한다. 따라서 동물로부터 항혈청을 제조하기 위한 상술한 공정은 항혈청을 겔과 혼합하는 단계를 더 포함할 수 있다. 겔은 SRID 분석을 행하는데 적합하며, 예컨대 이것은 아가로스겔이다.

항혈청을 제공하는 것에 더하여, 본 발명은 항원 표준 물질을 제공한다. 따라서, 본 발명은 (i) 셀라인에서 인플루엔자 바이러스를 성장시키는 단계; (ii) 단계 (i)에서 성장한 바이러스를 정제하는 단계; 및 (iii) 바이러스를 불활성화시키는 단계를 포함하며, 단계 (i)에서 사용되는 인플루엔자 바이러스가 난에서는 성장시키지 않는 것을 특징으로 하는 항원 표준 물질을 제조하기 위한 공정을 제공한다. 공정은 (iv) 불활성화된 바이러스를 동결건조하는 단계를 더 포함할 수 있다.

단계 (i)에서 사용되는 바이러스는 난에서 성장하지 않는다. 예컨대, 그것의 헤마글루티닌은 Sia(α2,3)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 비하여 Sia(α2,6)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 대한 결합을 선호할 수 있다.

표준 물질은 난-유래된 물질이 없다(예컨대 오브알부민 없음, 오보뮤코이드 없음, 닭의 DNA 없음). 표준 물질에서 당단백질은 MDCK와 같은 포유류 셀라인(예컨대 본원에 설명된 셀라인)에서의 성장으로부터 얻을 수 있는 글리칸으로 글리코실화될 것이다. 표준 물질은 인플루엔자 A 바이러스 및 인플루엔자 B 바이러스에 대하여 발생될 수 있다.

표준 물질은 통상 쌍으로 사용되며, 따라서 본 발명은 또한 (i) 이들 공정에 의해 얻을 수 있는 항혈청 및 (ii) 이들 공정에 의해 얻을 수 있는 항원 표준 물질을 포함하는 키트를 제공한다.

본 발명은 또한 (i) 상술한 항혈청을 만드는 단계; (ii) 상술한 항원 표준 물질을 만드는 단계; 및 (iii) 단계 (i) 및 (ii)의 생산물을 키트로 조합하는 단계를 포함하는 키트를 제조하는 공정을 제공한다. 항원 및 항혈청은 적합하며 SRID 분석에 사용하도록 의도되고, 본 발명은 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌에 대한 일원 방사 면역확산 분석을 제공하며, 분석은 이들 공정에 의해 얻을 수 있는 항혈청 및/또는 이들 공정에 의해 얻을 수 있는 항원 표준 물질을 사용하는 것을 특징으로 한다. SRID 분석은 항혈청을 포함하는 겔을 제조하는 단계, 겔에(통상적으로 웰로) 항원 표준 물질(필요한 경우 수성 매체에서 재구성됨)를 적용하는 단계, 및 그 다음 항원을 겔로 방사상으로 확산시키는 단계를 수반할 것이다. 항원을 사용하기 전에 쯔비터젠트 세정제와 같은 세정제로 처리할 수 있다.

본 발명의 기술에 의해 제조되거나 분리된 바이러스(종자 바이러스 포함)

본 발명의 바람직한 인플루엔자 A 바이러스(종자 바이러스, MDCK 세포를 사용하여 환자 시료로부터 분리된 바이러스, 재배열 바이러스 등 포함)는 PR/8/34 인플루엔자 바이러스로부터 6개 미만(즉 0, 1, 2, 3, 4 또는 5)의 바이러스성 분절을 포함한다. 바람직하게 이들은 PR/8/34 분절을 포함하지 않는다. 어떤 PR/8/34 분절(들)이 존재하면 그 후 이것/이들은 PR/8/34 HA 분절을 포함하지 않을 것이고 대개 PR/8/34 NA 분절을 포함하지 않을 것이다. 따라서 바람직한 바이러스는 분절 NP, M, NS, PA, PB1 및/또는 PB2 중 하나 이상이 PR/8/34로부터 유래되지 않은 것이다. 보다 바람직하게는, 분절 NP, M, PA, PB1 및/또는 PB2 중 하나 이상이 PR/8/34로부터 유래하지 않는다. 따라서 본 발명은 정상 HA 및 NA 항원에 순환하는 균주의 대표인 하나 이상의 에피토프-함유 항원을 첨가함으로써 현존하는 백신을 능가하여 개선할 수 있다.

유사하게, 바람직한 인플루엔자 A 바이러스는 AA/6/60 인플루엔자 바이러스 (A/Ann Arbor/6/60)로부터 6개 미만(즉 0, 1, 2, 3, 4 또는 5)의 바이러스성 분절을 포함한다. 바람직하게 이들은 AA/6/60 분절을 포함하지 않는다. 어떤 AA/6/60 분절(들)이 존재하면 그 후 이것/이들은 AA/6/60 HA 분절을 포함하지 않을 것이고 대개 AA/6/60 NA 분절을 포함하지 않을 것이다. 따라서 바람직한 바이러스는 분절 NP, M, NS, PA, PB1 및/또는 PB2 중 하나 이상이 AA/6/60로부터 유래되지 않은 것이다. 보다 바람직하게는, 분절 NP, M, PA, PB1 및/또는 PB2 중 하나 이상이 AA/6/60로부터 유래하지 않는다.

바람직한 인플루엔자 B 바이러스는 AA/1/66 인플루엔자 바이러스(B/Ann Arbor/1/66)로부터 6개 미만(즉 0, 1, 2, 3, 4 또는 5)의 바이러스성 분절을 포함한다. 바람직하게 이들은 AA/1/66 분절을 포함하지 않는다. 어떤 AA/1/66 분절(들)이 존재하면 그 후 이것/이들은 AA/1/66 HA 분절을 포함하지 않을 것이고 대개 AA/1/66 NA 분절을 포함하지 않을 것이다. 따라서 바람직한 바이러스는 분절 NP, M, NS, PA, PB1 및/또는 PB2 중 하나 이상이 AA/1/66로부터 유래되지 않은 것이다. 보다 바람직하게는, 분절 NP, M, PA, PB1 및/또는 PB2 중 하나 이상이 AA/1/66로부터 유래하지 않는다.

본 발명의 바람직한 인플루엔자 바이러스(종자 바이러스, MDCK 세포를 사용하여 환자 시료로부터 분리된 바이러스, 재배열 바이러스 등 포함)는 Sia(α2,3)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 비하여 Sia(α2,6)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 대한 결합을 선호하는 헤마글루티닌을 포함한다. 이 결합 선호는 상기 보다 상세히 논의된다.

본 발명의 바람직한 인플루엔자 바이러스(종자 바이러스, MDCK 세포를 사용하여 환자 시료로부터 분리된 바이러스, 재배열 바이러스 등 포함)는 난-유래된 바이러스로부터 상이한 글리코실화 패턴을 갖는 당단백질(헤마글루티닌 포함)을 포함한다. 따라서 당단백질은 계란에서 성장된 바이러스에서 목격되지 않는 당형태를 포함할 것이고, 예컨대 이들은 포유류 당 결합을 포함하는 비조류 당 결합을 가질 수 있다.

셀라인

본 발명은 인플루엔자 바이러스 복제를 지원하는 셀라인의 사용을 수반하고, 난의 사용을 피한다. 셀라인은 통상적으로 포유류 기원의 것이다. 적합한 포유류 기원의 세포는 햄스터, 소, 영장류(인간 및 원숭이 포함) 및 개의 세포를 포함하고 여기에 제한되지는 않지만, 영장류 세포의 사용은 바람직하지 않다. 신장 세포, 섬유아세포, 망막 세포, 폐 세포 등과 같은 여러 세포 유형을 사용할 수 있다. 적합한 햄스터 세포의 예는 BHK21 또는 HKCC 이름을 갖는 셀라인이다. 적합한 원숭이 세포는 베로 셀라인에서 신장 세포와 같은 예컨대 아프리카 푸른 원숭이 세포이다[21-23]. 적합한 개의 세포는 CLDK 및 MDCK 셀라인에서 예컨대 신장 세포이다.

따라서 적합한 셀라인은 MDCK; CHO; CLDK; HKCC; 293T; BHK; Vero; MRC-5; PER.C6 [24]; FRhL2; WI-38; 등을 포함하지만 여기에 제한되지 않는다. 적합한 셀라인은 예컨대 American Type Cell Culture (ATCC) collection [25], Coriell Cell Repositories [26], 또는 European Collection of Cell Culture (ECACC)로부터 폭넓게 이용가능하다. 예컨대, ATCC는 카탈로그 번호 CCL-81, CCL-81.2, CRL-1586 및 CRL-1587하에 여러가지 다른 베로 세포를 공급하고, 카탈로그 번호 CCL-34하에 MDCK 세포를 공급한다. PER.C6은 기탁 번호 96022940하에 ECACC로부터 이용가능하다. 이들 세포 유형은 본 발명에 따른 성장, 재배열 및/또는 계대배양에 사용될 수 있다.

가장 바람직한 셀라인은 포유류형 글리코실화를 갖는 것이다. 포유류 셀라인에 대하여 덜 바람직한 대안으로서, 바이러스는 오리(예컨대 오리 망막) 또는 암탉, 예컨대 닭의 배 섬유아세포(CEF) 등으로부터 유래한 셀라인을 포함하는 조류 셀라인 [예컨대 27-29 참조]에서 성장할 수 있지만, 포유류 세포의 사용은 백신에 조류 DNA 및 난 단백질(오브알부민 및 오보뮤코이드와 같은)이 없어서 알레르기 유발을 줄일 수 있다는 것을 의미한다.

인플루엔자 바이러스를 성장시키기 위한 가장 바람직한 셀라인은 마딘 다비 개 신장(Madin Darby canine kidney)으로부터 유래된 MDCK 셀라인이다[30-33]. 초기 MDCK 셀라인은 CCL-34로서 ATCC로부터 이용가능하지만, 이 셀라인의 유도체도 사용할 수 있다. 예컨대, 참고자료 30은 현탁 배양액에서의 성장에 적응된 MDCK 셀라인을 개시한다('MDCK 33016' 또는 '33016-PF', DSM ACC 2219로 기탁됨; 또한 34 & 35 참조). 유사하게, 참고자료 36은 무혈청 배양액에서 현탁액에서 성장하는 MDCK-유래 셀라인을 개시한다('B-702', FERM BP- 7449으로 기탁됨). 참고자료 37은 'MDCK-S' (ATCC PTA- 6500), 'MDCK-SF101' (ATCC PTA-6501), 'MDCK-SF102' (ATCC PTA-6502) 및 'MDCK- SF103' (ATCC PTA-6503)을 포함하는 비종양형성성 MDCK 세포를 개시한다. 참고자료 38은 'MDCK.5F1' 세포 (ATCC CRL- 12042)를 포함하는 감염에 과민감성을 지닌 MDCK 셀라인을 개시한다. 이들 MDCK 셀라인 중 일부는 본 발명에서 사용할 수 있다.

바이러스는 점착성 배양액 또는 현탁액에서 세포 상에서 성장할 수 있다. 마이크로캐리어 배양액도 사용할 수 있다. 일부 구체예에서, 따라서 세포는 현탁액에서의 성장에 적응할 수 있다.

셀라인은 무혈청 배양 배지 및/또는 무단백질 배지에서 성장하는 것이 바람직하다. 본 발명의 본문에서 배지는 이것이 인간 또는 동물 기원의 혈청으로부터 첨가물을 갖지 않는 경우 무혈청 배지로서 언급된다. 이러한 배양액에서의 세포 성장은 자연적으로 단백질 그들 자신을 함유하지만, 무단백질 배지는 세포 증가가 단백질, 성장 인자, 다른 단백질 첨가물 및 비혈청 단백질의 배재와 함께(배양 배지로의 첨가 없이) 발생하는 것을 의미하도록 이해되지만, 선택적으로 티로신과 같은 단백질 또는 바이러스 성장에 필요한 다른 프로테아제를 (배양 배지에) 포함할 수 있다.

인플루엔자 바이러스 복제를 지원하는 셀라인은 바이러스 복제 동안 37℃[39] (예컨대 30-36℃, 또는 약 30℃, 31℃, 32℃, 33℃, 34℃, 35℃, 36℃) 이하에서 성장하는 것이 바람직하다. 예컨대, 제6 양태에서, MDCK 세포는 특히 바이러스 복제 동안 이들 온도에서 (분리 단계 이전, 동안 또는 후에) 성장할 수 있다.

(예컨대 제6 양태에 따라 배양된 MDCK 세포에서 인플루엔자 바이러스를 성장시키기 위해) 배양된 세포에서 인플루엔자 바이러스를 증식시키기 위한 공정은 일반적으로 성장될 균주의 접종원을 지닌 세포의 배양액을 접종하는 단계, 예컨대 바이러스 역가 또는 항원 발현에 의해 결정되는 바이러스 증식을 위한 원하는 시간 동안 (예컨대 접종 후 24 내지 168 시간) 감염된 세포를 배양하는 단계 및 증식된 바이러스를 수집하는 단계를 포함한다. 배양된 세포는 1:500 내지 1:1, 바람직하게는 1:100 내지 1:5, 보다 바람직하게는 1:50 내지 1:10의 세포 비율로 바이러스가 접종된다(PFU 또는 TCID₅₀에 의해 측정됨). 바이러스는 세포의 현탁액에 첨가되거나 세포의 단층에 적용되고, 바이러스는 적어도 60분 동안, 그러나 대개 300분 미만, 바람직하게는 90 내지 240분 동안 25℃ 내지 40℃, 바람직하게는 28℃ 내지 37℃에서 세포에 흡수된다. 감염된 세포 배양액(예컨대 단층)은 냉동-해빙 또는 효소 작용에 의해 제거되어 수확한 배양액 상청액 중 바이러스 함유량을 증가시킬 수 있다. 그 다음 수확된 유체는 불활성화 또는 냉동 저장된다. 배양된 세포는 약 0.0001 내지 10, 바람직하게는 0.002 내지 5, 보다 바람직하게는 0.001 내지 2의 감염 다중도("m.o.i.")로 감염될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 세포는 약 0.01의 m.o.i로 감염된다. 감염된 세포는 감염 후 30 내지 60 시간 수확될 수 있다. 바람직하게는, 세포는 감염 후 34 내지 48 시간 수확될 수 있다. 더욱 바람직하게는, 세포는 감염 후 38 내지 40 시간 수확될 수 있다. 프로테아제(통상적으로 트립신)는 일반적으로 바이러스를 방출시키기 위해 세포 배양 동안 첨가되고, 프로테아제는 배양 동안 어느 적합한 단계, 예컨대 접종 전, 접종과 동시에, 또는 접종 후 첨가될 수 있다[39].

바람직한 구체예에서, 특히 MDCK 세포를 사용하는 경우, 셀라인은 40 개체군-배증 수준을 넘어서 마스터 작업용 세포 은행으로부터 계대배양되지 않는다.

바이러스 접종원 및 바이러스 배양액은 헤르페스 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 3, SARS 코로나 바이러스, 아데노바이러스, 리노 바이러스, 레오 바이러스, 폴리오마바이러스, 버나바이러스, 서코바이러스, 및/또는 파르보바이러스가 없는 것이(즉, 이들에 의한 오염에 대하여 테스트하여 네거티브 결과가 나옴) 바람직하다[40]. 유사하게, 제6 양태에서 사용되는 바람직한 MDCK 셀라인은 헤르페스 바이러스, 호흡기 세포융합 바이러스, 파라인플루엔자 바이러스 3, SARS 코로나바이러스, 아데노바이러스, 리노바이러스, 레오바이러스, 폴리오마바이러스, 버나바이러스, 서코바이러스, 및/또는 파르보바이러스가 없는 것이(즉, 이들에 의한 오염에 대한 테스트하여 네거티브 결과가 나옴) 바람직하다. 헤르페스 바이러스의 부재가 특히 바람직하다.

본 발명에 사용되는 MDCK 셀라인은 G418 내성에 대한 표지를 함유하지 않는 것이 바람직하다(참고자료 16 참조). 따라서 셀라인은 G418 처리에 대하여 민감성일 수 있다.

본 발명에 사용되는 셀라인은 역유전학 기술에 요구될 수 있는 어떤 것을 제외하고는 외인성 플라스미드를 함유하지 않는 것이 바람직하다(참고자료 16 참조).

역유전학 기술

상술한 바와 같이, 본 발명은 임상 분리체 또는 일차 분리체를 직접 사용할 수 있다. 또한, 그러나 본 발명은 재배열 균주일 수 있으며, 역유전학 기술을 사용하여 발생되는 것을 포함한다[예컨대, 41-45]. 역유전학 기술은 바이러스성 분절의 조합의 발생, 바이러스성 분절에서 암호화 또는 비암호화 서열의 조작 용이, 돌연변이 유도 등을 위해 플라스미드의 시험관내 조작을 사용할 수 있다. 이 기술은 인플루엔자 A 및 인플루엔자 B 바이러스 모두에 대하여 사용할 수 있다.

역 유전자학은 통상적으로 (a) 예컨대, polI 프로모터, 박테리아 RNA 중합효소 프로모터, 박테리오파지 중합효소 프로모터 등으로부터 소망하는 바이러스성 RNA 분자를 암호화하는 DNA 분자, 및 (b) 예컨대, polII 프로모터로부터 바이러스 단백질을 암호화하는 DNA 분자의 발현을 수반하여, 세포 내에서 두 유형의 DNA의 발현에 의하여 완전한 무손상 감염성 비리온의 조립을 유도한다. DNA는 바이러스성 RNA 및 단백질 모두를 제공하는 것이 바람직하나, 또한 헬퍼(helper) 바이러스를 사용하여 RNA 및 단백질의 일부를 제공하는 것도 가능하다. 각 바이러스성 RNA를 생산하기 위해 별도의 플라스미드를 사용하는 플라스미드-기반 방법이 바람직하며[46-48], 이들 방법은 일부 방법에서 사용되는 12 플라스미드와 함께, 바이러스 단백질의 전부 또는 일부(예컨대, 단지 PB1, PB2, PA 및 NP 단백질)를 발현하기 위한 플라스미드의 사용을 수반할 것이다.

필요한 플라스미드의 수를 감소시키기 위하여, 최근의 연구[49]는 복수의 RNA 중합효소 I 전사 카세트 (바이러스성 RNA 합성용)를 동일한 플라스미드(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 모든 8 인플루엔자 A vRNA 분절을 암호화하는 서열) 상에서 결합하고, RNA 중합효소 II 프로모터를 보유한 복수의 단백질-암호화 영역을 다른 플라스미드(예컨대, 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7 또는 모든 8 인플루엔자 A mRNA 전사체를 암호화하는 서열) 상에서 결합한다. 참고자료 49 방법의 바람직한 양태는 (a) 단일 플라스미드 상의 PB1, PB2 및 PA mRNA-암호화 영역; 및 (b) 단일 플라스미드 상의 모든 8 vRNA-암호화 분절을 수반한다. 하나의 플라스미드 상의 NA 및 HA 분절 및 다른 플라스미드 상의 6개의 다른 분절을 포함하는 것은 문제를 촉진시킬 수 있다.

polI 프로모터의 종특이성 때문에, MDCK 세포에서 역유전학을 행할 때 개의 polI 프로모터[50]를 사용할 수 있다. 바이러스성 RNA 분절을 암호화하기 위한 polI 프로모터 사용의 대안으로서, 박테리오파아지 중합효소 프로모터를 사용할 수 있다 [51]. 예를 들면, SP6, T3 또는 T7 중합효소의 프로모터는 편리하게 사용할 수 있다. polI 프로모터의 종특이성 때문에, 세포는 외인성 중합효소를 암호화하는 플라스미드로 트랜스펙션되어야 하지만, 박테리오파지 중합효소 프로모터는 많은 세포 유형(예컨대, MDCK)에 대하여 더욱 편리할 수 있다.

다른 기술에서 2중 polI 및 polII 프로모터를 사용하여 바이러스성 RNA 및 단일 주형으로부터 발현가능한 mRNA를 동시에 암호화할 수 있다[52, 53].

난에서 성장을 위해 사용되는 균주가 대개 PR/8/34 인플루엔자 A 바이러스로부터 6개 RNA 분절을 포함하는 반면(백신 균주로부터 HA 및 N 분절을 보유, 즉 6:2 재배열체), 본 발명에서 난의 회피는 PR/8/34 분절을 생략할 수 있다는 것을 의미한다. 따라서 인플루엔자 A 바이러스는 PR/8/34 인플루엔자 바이러스로부터 6개 미만(즉 0, 1, 2, 3, 4 또는 5)의 바이러스성 분절을 포함할 수 있다. 따라서 바람직한 바이러스는 분절 NP, M, NS, PA, PB1 및/또는 PB2 중 하나 이상이 PR/8/34로부터 유래하지 않은 것이다. 바이러스는 조류 인플루엔자 바이러스에서 기원한 NS 분절을 포함할 수 있다.

본 발명이 역유전학을 사용하는 경우, 공급원 인플루엔자 바이러스로부터의 바이러스성 RNA 분절을 목적 인플루엔자 바이러스의 게놈으로 이송할 수 있다. 따라서 이들 두개의 바이러스는 공통된 적어도 하나의 바이러스성 RNA 분절을 가질 것이다. 여기서 용어 "공통된"은 완전한 분절의 동일한 카피를 의미하지만, 암호화 및/또는 비암호화 영역에서 변성된 분절의 변성된 카피를 의미하도록 연장될 수도 있다. 변성이 암호화-영역에서 이루어지면, 이들은 암호화된 단백질의 면역원성 및/또는 활성을 실질적으로 변화시키지 않을 것이다. 따라서 HA 분절은 환자에게 투여할 때 효과적인 항-HA 항체를 도출하기 위한 그것의 능력을 변화시키지 않고 HA1/HA2 절단 부위 주변에서 조작될 수 있다. 따라서 역유전학은 제6 양태에 따라 분리된 바이러스의 천연 HA를 변성시키는데, 예컨대 조류종에서 고병원성으로 되는 바이러스를 유발하는 결정자(예컨대 HA1/HA2 절단 부위 주변의 고염기성 영역)를 제거하는데 사용할 수 있다.

백신 제조

인플루엔자 바이러스 백신의 여러 형태는 시중에서 이용가능하다(예컨대 참고자료 54의 17 및 18장 참조). 백신은 일반적으로 생 바이러스 또는 불활성화된 바이러스에 기반한다. 불활성화된 백신은 완전한 비리온, '분할' 비리온, 또는 정제된 표면 항원에 기반할 수 있다. 인플루엔자 항원은 바이로좀의 형태로 존재할 수도 있다. 본 발명은 이들 형태의 백신 중 어느 것을 제조하는 경우에 사용될 수 있다.

생 바이러스는 Medlmmune's FLUMIST^TM 생성물(3가 생 바이러스)을 포함한다. 백신은 적합한 기질에서 바이러스를 성장시킨 다음 비리온-함유 유체로부터 비리온을 정제하는 것을 포함하는 공정에 의해 제조된다. 예컨대, 유체는 원심분리에 의해 정화되고 버퍼(예컨대 수크로스, 포타슘 포스페이트 및 글루탐산 모노나트륨)로 안정될 수 있다.

불활성화된 바이러스를 사용하는 경우, 백신은 완전한 비리온, 분할 비리온 또는 정제된 표면 항원(헤마글루티닌을 포함하고, 대개 뉴라미니다아제도 포함)을 포함할 수 있다. 바이러스를 불활성화시키는 화학적 수단은 하나 이상의 다음 제제의 유효량으로 처리하는 것을 포함할 수 있다: 세정제, 포름알데히드, β-프로피오락톤, 메틸렌 블루, 소랄렌, 카르복시플러렌(C60), 2원 에틸아민, 아세틸 에틸렌이민, 또는 이들의 조합. 바이러스 불활성화의 비-화학적 공정은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있으며, 예컨대, 예를 들면 UV 광 또는 감마선 조사이다.

비리온은 다양한 방법을 통하여 바이러스-함유 유체로부터 수확될 수 있다. 예를 들어, 정제 공정은 비리온을 파괴하기 위한 세정제를 포함하는 선형 수크로스 구배 용액을 사용하는 구역원심분리를 수반할 수 있다. 그 다음 항원은 선택적 희석 후에 정용여과에 의하여 정제될 수 있다.

분할 비리온은 정제된 비리온을 세정제(예컨대, 에틸 에테르, 폴리소르베이트 80, 데옥시콜레이트, 트리-N-부틸 포스페이트, 트리톤 X-100, 트리톤 N101, 세틸트리메틸암모늄 브로마이드, 테르기톨 NP9 등)로 처리하여 획득하여 서브비리온 제조물을 생산하며, '트윈-에테르' 분할 공정을 포함한다. 인플루엔자 바이러스의 분할 공정은 당해 기술 분야, 예컨대 참고자료 55-60 등에 공지되어 있다. 바이러스의 분할은 일반적으로 감염성 또는 비감염성인 완전한 바이러스를 분할제의 파괴 농도로 파괴 또는 절편화함으로써 수행된다. 파괴에 의하여 바이러스 단백질의 전체 또는 일부 가용화가 되었으며, 바이러스의 통합성을 변화시켰다. 바람직한 분할제는 비이온성 및 이온성(예컨대, 양이온성) 계면활성제 예컨대, 알킬글리코시드, 알킬티오글리코시드, 아실당, 설포베타인, 베타인, 폴리옥시에틸렌알킬에테르, N,N-디알킬-글루카마이드, 헤카메그(Hecameg), 알킬페녹시-폴리에톡시에탄올, NP9, 4차 암모늄 화합물, 사르코실, CTAB(세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드), 트리-N-부틸 포스페이트, 세타브론, 미리스틸트리메틸암모늄염, 리포펙틴, 리포펙타민, 및 DOT-MA, 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올(예컨대, 트리톤 계면활성제, 예컨대, 트리톤 X-100 또는 트리톤 N101), 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르(트윈 계면활성제), 폴리옥시에틸렌 에테르, 폴리옥시에틸렌 에스테르 등이다. 유용한 하나의 분할 과정은 나트륨 데옥시콜레이트 및 포름알데히드의 연속 효과를 사용하며, 분할은 초기 비리온 정제시 발생할 수 있다(예컨대, 수크로스 밀도 구배 용액 내에서). 따라서 분할 공정은 비리온-함유 물질의 정화(비-비리온 물질을 제거하기 위함), 수확된 비리온의 농축(예컨대, 흡착 공정, 예컨대, CaHPO₄ 흡착을 사용), 비-비리온 물질로부터 완전한 비리온의 분리, 밀도 구배 원심분리 단계에서 분할제를 사용하는 비리온 분할(분할제, 예컨대 나트륨 데옥시콜레이트를 함유한 수크로스 구배를 사용), 및 원치않는 물질을 제거하기 위한 후속적인 여과(예컨대, 한외여과)를 수반할 수 있다. 분할 비리온은 나트륨 포스페이트-완충 등장성 염화 나트륨 용액에 유용하게 재현탁될 수 있다. BEGRIVAC™, FLUARIX™, FLUZONE™ 및 FLUSHIELD™ 제품은 분할 백신이다.

정제된 표면 항원 백신은 인플루엔자 표면 항원 헤마글루티닌 및, 일반적으로 또한 뉴라미니다아제를 포함한다. 정제된 형태의 이러한 단백질의 제조 공정이 당해 기술 분야에 공지되어 있다. FLUVIRIN™, AGRIPPAL™ 및 INFLUVAC™ 제품은 서브유닛 백신이다.

불활성화된 인플루엔자 항원의 또 다른 형태는 바이로좀이다[61](핵산이 없는 바이러스-유사 리포좀 입자). 바이로좀은 인플루엔자 바이러스를 세정제로 가용화한 다음 바이러스 당단백질을 함유하는 멤브레인의 뉴클레오캡시드 및 재구성체를 제거함으로써 제조할 수 있다. 바이로좀을 제조하기 위한 대안적 공정은 과량의 인지질에 바이러스 멤브레인당단백질을 첨가하여 그들의 멤브레인에 바이러스 단백질을 보유하는 리포좀을 제공하는 것을 수반한다. 본 발명은 INFLEXAL V™ 및 INVAVAC™ 제품과 같이 벌크 바이로좀을 저장하는데 사용될 수 있다.

인플루엔자 바이러스는 감독(attenuate)될 수 있다. 인플루엔자 바이러스는 온도-민감성이 될 수 있다. 인플루엔자 바이러스 저온-적응될 수 있다. 항원으로서 생 바이러스를 사용하는 경우, 이들 세 가지 특성이 특히 유용하다.

HA는 현재 불활성화된 인플루엔자 백신에서 주면역원이며, 백신 투약량은 통상적으로 SRID으로 측정되는 HA 수준에 대한 기준에 의해 표준화된다. 현존하는 백신은 통상적으로 균주 당 약 15㎍의 HA을 함유하지만, 예컨대 어린이에 대해서 또는 유행하는 상황에서, 또는 보조제를 사용하는 경우에는 적은 투약량을 사용할 수 있다. 많은 투약량을 갖는 경우(예컨대 3x 또는 9x 투약량 [62,63]) ½(즉 균주 당 7.5㎍ HA), ¼ 및 ⅛과 같은 분할 투약량을 사용한다[81,82]. 따라서 백신은 인플루엔자 균주 당 0.1 내지 150㎍, 바람직하게는 0.1 내지 50㎍, 예컨대 0.1-20㎍, 0.1-15㎍, 0.1-10㎍, 0.1-7.5㎍, 0.5-5㎍ 등의 HA를 포함할 수 있다. 특히 투약량은 균주 당 예컨대 약 45, 약 30, 약 15, 약 10, 약 7.5, 약 5, 약 3.8, 약 1.9, 약 1.5 등을 포함한다.

생 백신에 대하여, 투약량은 HA 함유량 보다는 중간 조직 배양 감염성 투약량(TCID₅₀)에 의해 측정되고, 균주 당 10⁶ 내지 10⁸(바람직하게는 10^6.5-10^7.5)의 TCID₅₀이 통상적이다.

본 발명에서 사용되는 균주는 야생형 바이러스에서 발견되는 천연 HA 또는 변성된 HA를 가질 수 있다. 예컨대, HA를 변성시켜서 조류종에서 고병원성으로 되는 바이러스를 유발하는 결정자(예컨대 HA1/HA2 절단 부위 주변의 고염기성 영역)를 제거하는 것이 공지되어 있다.

백신에 사용하기 위한 인플루엔자 바이러스 균주는 계절별로 변화한다. 현재 유행기 사이에, 백신은 일반적으로 두 인플루엔자 A 균주(H1N1 및 H3N2) 및 하나의 인플루엔자 B 균주를 포함하며, 그리고 3가 백신이 일반적이다. 본 발명은 유행성 바이러스 균주(즉, 백신 수용자 및 일반 인간 개체군이 면역학적으로 미경험인 균주, 특히 인플루엔자 A 바이러스), 예컨대 H2, H5, H7 또는 H9 아형 균주를 사용할 수도 있으며, 유행성 균주용 인플루엔자 백신은 1가이거나 유행성 균주에 의하여 보충된 정상 3가 백신에 기초할 수 있다. 그러나, 계절 및 백신에 포함된 항원의 특성에 따라, 본 발명은 하나 이상의 HA 아형 H1, H2, H3, H4, H5, H6, H7, H8, H9, H10, H11, H12, H13, H14, H15 또는 H16에 대하여 보호할 수 있다. 본 발명은 하나 이상의 인플루엔자 A 바이러스 NA 아형 N1, N2, N3, N4, N5, N6, N7, N8 또는 N9에 대하여 보호할 수 있다.

유행기 사이의 균주에 대하여 면역시키는데 적합할 뿐만 아니라, 본 발명의 조성물은 유행성 균주에 대하여 면역시키는데 특히 유용하다. 유행성 발병을 유발할 수 있는 잠재성을 부여하는 인플루엔자 균주의 특성은: (a) 현재-순환하는 인간 균주 내의 헤마글루티닌과 비교하여 신규의 헤마글루티닌, 즉 10년 이상 인간 개체군에게 명백하지 않았거나(예컨대, H2), 또는 이전에 인간 개체군에서 전혀 발견되지 않아서(예컨대, 일반적으로 조류 개체군에서만 발견된 H5, H6 또는 H9), 인간 개체군이 균주의 헤마글루티닌에 면역학적으로 미경험인 것을 함유하고; (b) 인간 개체군에 수평적으로 전염될 수 있고; 및 (c) 인간에 병원성이라는 것이다. H5 헤마글루티닌 형태를 보유한 바이러스는 유행성 인플루엔자, 예컨대 H5N1 균주에 대하여 면역시키는데 바람직하다. 그 밖의 가능한 균주는 H5N3, H9N2, H2N2, H7N1 및 H7N7, 및 기타 발생하는 잠재적인 유행성 균주를 포함한다. H5 아형 내에서, 바이러스는 HA 클레이드 1, HA 클레이드 1', HA 클레이드 2 또는 HA 클레이드 3에 해당될 수 있으며[64], 클레이드 1 및 3가 특히 관련되어 있다.

항원이 조성물에 유용하게 포함될 수 있는 그 밖의 균주는 저항성 유행성 균주를 포함하는 항바이러스 요법에 내성(예컨대, 오셀타미비르[65] 및/또는 자나미비르에 내성)인 균주이다[66].

따라서 본 발명의 조성물은 인플루엔자 A 바이러스 및/또는 인플루엔자 B 바이러스를 포함하는, 하나 이상의(예컨대, 1, 2, 3, 4 또는 그 이상) 인플루엔자 바이러스 균주로부터의 항원(들)을 포함할 수 있다. 백신이 하나 이상의 인플루엔자의 균주를 포함하는 경우, 통상적으로 다른 균주는 별도로 성장하며, 바이러스를 수확한 후 혼합되고, 항원이 제조된다. 따라서 본 발명의 공정은 하나 이상의 인플루엔자 균주로부터의 항원 혼합 단계를 포함할 수 있다. 3가 백신은 두개의 인플루엔자 A 바이러스 균주 및 하나의 인플루엔자 B 바이러스 균주의 항원을 포함하는 것이 바람직하다.

본 발명의 일부 구체예에서, 조성물은 단일 인플루엔자 A 균주로부터의 항원을 포함할 수 있다. 일부 구체예에서, 조성물은 두개의 인플루엔자 A 균주로부터의 항원을 포함할 수 있으며, 단 이들 두개의 균주는 H1N1 및 H3N2가 아니다. 일부 구체예에서, 조성물은 두개 이상의 인플루엔자 A 균주로부터의 항원을 포함할 수 있다.

본 발명은 (i) 인플루엔자 바이러스를 수취하는 단계; (ii) 이 인플루엔자 바이러스로 셀라인을 감염시키는 단계; 및 (iii) 인플루엔자 바이러스를 생산하기 위해 단계 (ii)로부터 감염된 세포를 배양하는 단계를 포함하는, 백신에 사용하기 위한 인플루엔자 바이러스 항원의 제조공정을 제공한다. 단계 (iii)에서 얻어진 바이러스는, 예컨대 불활성화, 제형화 등을 수반하는 방법에 의해 백신을 제조하는데 사용할 수 있다. 단계 (i)에서 수취한 인플루엔자 바이러스는 하기 특성 중 하나 이상을 가질 것이다: (a) 난 기질에서 증식되지 않음; (b) 무혈청 배지에서 성장하는 MDCK 33016 세포 및/또는 MDCK 세포와 같은 MDCK 세포에서 분리되었음; (c) 혈청-함유 배지에서 성장하는 기질에서 증식되지 않음; (d) 역유전학 기술을 사용하여 발생하였음; (e) PR/8/34 인플루엔자 바이러스로부터 6개 미만의 바이러스성 분절 및/또는 AA/6/60 인플루엔자 바이러스로부터 6개 미만의 바이러스성 분절을 보유한 인플루엔자 A 바이러스이거나, AA/1/66 인플루엔자 바이러스로부터 6개 미만의 바이러스성 분절을 보유한 인플루엔자 B 바이러스임; (f) Sia(α2,3)Gal 말단 이당류를 보유하는 올리고당에 비하여 Sia(α2,6)Gal 말단 이당류를 보유하는 올리고당에 대한 결합을 선호하는 헤마글루티닌를 포함함; 및/또는 (g) 난-유래된 바이러스와 상이한 글리코실화 패턴을 갖는 당단백질(헤마글루티닌 포함)을 가짐. 따라서, 단계 (i)에서 수취한 인플루엔자 바이러스는 본원에 설명한 바와 같이 얻을 수 있다.

숙주 세포 DNA

바이러스가 셀라인 상에서 성장하는 경우, 이는 DNA의 발암 활성을 최소화하기 위하여, 최종 백신 내의 잔여 셀라인 DNA의 양을 최소화하는 표준 기술이다.

따라서 본 발명에 따라 제조된 백신 조성물은 미량의 숙주 세포 DNA가 존재할 수 있어도 투약량 당 10ng 미만(바람직하게는 1ng 미만, 보다 바람직하게는 100pg 미만)의 잔류 숙주 세포 DNA를 함유하는 것이 바람직하다.

15㎍의 헤마글루티닌 당 <10ng (예컨대, <1ng, <100pg) 숙주 세포 DNA를 함유하는 백신이 바람직하며, 따라서 백신은 0.25㎖ 부피 당 <10ng (예컨대, <1ng, <100pg) 숙주 세포 DNA를 함유한다. 50㎍의 헤마글루티닌 당 <10ng (예컨대, <1ng, <100pg) 숙주 세포 DNA를 함유하는 백신이 더 바람직하며, 따라서 백신은 0.5㎖ 부피 당 <10ng (예컨대, <1ng, <100pg) 숙주 세포 DNA를 함유한다.

어떤 잔여 숙주 세포 DNA의 평균 길이는 500bp 미만, 예컨대 400bp 미만, 300bp 미만, 200bp 미만, 100bp 미만 등인 것이 바람직하다.

DNA의 오염은, 예컨대 크로마토그래피 등의 표준 정제 과정을 사용하여 백신 제조시 제거될 수 있다. 잔여 숙주 세포 DNA의 제거는, 예컨대 DNase를 사용함으로써 핵산분해효소 처리에 의하여 증진될 수 있다. 숙주 세포 DNA 오염을 감소시키는 편리한 방법은 참고자료 67 및 68에 개시되어 있으며, 먼저 바이러스 성장시에 사용할 수 있는 DNase(예컨대, 벤조나아제), 및 그 다음 비리온 붕괴시 사용될 수 있는 양이온 세정제(예컨대, CTAB) 사용의 두 단계 처리를 수반한다. β-프로피오락톤과 같은 알킬화제 처리를 숙주 세포 DNA의 제거에 사용할 수 있으며, 비리온 불활성화에 유리하게 사용될 수도 있다[69].

잔여 숙주 세포 DNA의 측정은 현재 생물학적으로 통상적인 조절 요건이며 당업자의 일반적인 능력의 범위 내에 존재한다. DNA 측정에 사용되는 분석은 일반적으로 입증된 분석일 것이다[70,71]. 입증된 분석의 성능 특성은 수학적 및 정량적인 용어로 설명될 수 있으며, 이들의 가능한 오차의 원인은 확인된다. 분석은 일반적으로 예컨대, 정확성, 정밀도, 특이성과 같은 특성에 대하여 시험된다. 분석이 조정(예컨대, 공지된 숙주 세포 DNA의 표준량에 대하여) 및 시험되면, 그 다음 정량적 DNA 측정을 통상적으로 수행할 수 있다. DNA 정량을 위한 3개의 주요 기술을 사용할 수 있다: 혼성화 방법, 예컨대 서던 블롯 또는 슬롯 블롯 [72]; 면역분석 방법, 예컨대, Threshold™ 시스템 [73]; 및 정량적 PCR [74]. 각 방법의 정확한 특성은 대상으로 하는 숙주 세포, 예컨대 혼성화용 프로브의 선택, 증폭을 위한 프라이머 및/또는 프로브의 선택 등에 달려있지만, 이들 방법은 당해 기술 분야의 숙련자에게 익숙한 것이다. Molecular Devices사의 Threshold™ 시스템은 총 DNA의 피코그램 수준에 대한 정량적 분석법이며, 생약학적 물질 내의 DNA 오염 수준을 모니터링하기 위하여 사용되어 왔다[73]. 일반적인 분석법은 바이오틴화 ssDNA 결합 단백질, 우레아제-컨쥬게이트 항-ssDNA 항체, 및 DNA 간의 복합 반응의 비-서열-특이적 형성을 수반한다. 모든 분석 성분은 제조자로부터 입수가능한 완전한 총 DNA 분석 키트 내에 포함되어 있다. 다양한 상업적 제조사들이 잔류 숙주 세포 DNA를 검출하기 위한 정량적 PCR 분석법을 제공한다. 예컨대, AppTec™ Laboratory Services, BioReliance™, Althea Technologies, 등. 인간 바이러스 백신의 숙주 세포 DNA 오염을 측정하기 위한 화학발광 혼성화 분석법 및 총 DNA Threshold™ 시스템의 비교는 참고자료 75에서 찾을 수 있다.

약학적 조성물

본 발명에 따라 제조된 백신 조성물은 약학적으로 허용가능하다. 이들은 일반적으로 인플루엔자 항원 이외에 성분들을 포함하며, 예컨대 이들은 일반적으로 하나 이상의 약학적 담체(들) 및/또는 부형제(들)을 포함한다. 후술하는 바와 같이, 보조제도 포함할 수 있다. 이러한 성분에 대한 면밀한 논의는 참고자료 76에서 찾을 수 있다.

백신 조성물은 일반적으로 수성형태일 것이다.

백신 조성물은 티오메살 또는 2-페녹시에탄올과 같은 보존제를 포함할 수 있다. 그러나, 백신은 실질적으로 수은성 물질이 없는 것(즉 5㎍/㎖ 미만), 예컨대 티오메살이 없는 것이 바람직하다[59, 77]. 수은을 함유하지 않은 백신이 더 바람직하다. 수은성 화합물에 대한 대안으로서 α-토코페롤 숙시네이트를 포함할 수 있다[59]. 보존제가 없는 백신이 특히 바람직하다.

등장성을 조절하기 위하여 나트륨염과 같은 생리학적 염을 포함하는 것이 바람직하다. 염화 나트륨(NaCl)이 바람직하며, 1 내지 20 ㎎/㎖로 존재할 수 있다. 존재할 수 있는 기타 염은 염화 칼륨, 인산 2수소 칼륨, 디나트륨 포스페이트 디하이드레이트, 염화 마그네슘, 염화 칼슘 등을 포함한다.

백신 조성물은 일반적으로 오스몰 농도가 200 mOsm/kg 내지 400 mOsm/kg, 바람직하게는 240-360 mOsm/kg이며, 더 바람직하게는 290-310 mOsm/kg의 범위에 있다. 오스몰 농도는 예방접종에 의하여 유발된 통증에 대한 영향이 사전에 보고된바 없지만[78], 그럼에도 이 범위의 오스몰 농도를 유지하는 것이 바람직하다.

백신 조성물은 하나 이상의 버퍼를 포함할 수 있다. 일반적인 버퍼는 포스페이트 버퍼; 트리스 버퍼; 보레이트 버퍼; 숙시네이트 버퍼; 히스티딘 버퍼(특히 알루미늄 히드록시드 보조제와 함께); 또는 시트레이트 버퍼를 포함한다. 버퍼는 일반적으로 5-2O mM의 범위로 포함된다.

백신 조성물의 pH는 일반적으로 5.0 내지 8.1, 더 일반적으로 6.0 및 8.0, 예컨대 6.5 내지 7.5, 또는 7.0 내지 7.8이다. 본 발명의 공정은 따라서 포장 전에 벌크 백신의 pH를 조절하는 단계를 포함한다.

백신 조성물은 바람직하게는 무균이다. 백신 조성물은 예컨대 투약량 당 < 1 EU(내부독소 단위, 표준 측정), 바람직하게는 투약량 당 < 0.1 EU을 함유하는 비-발열성인 것이 바람직하다. 백신 조성물은 바람직하게는 글루텐이 없다.

본 발명의 백신 조성물은 세정제, 예컨대 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제('Tweens'로서 알려짐), 옥토시놀(예컨대, 옥토시놀-9 (트리톤 X-100) 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올), 세틸 트리메틸 암모늄 브로마이드 ('CTAB'), 또는 나트륨 데옥시콜레이트을 포함할 수 있으며, 특히 분할 또는 표면 항원 백신용이다. 세정제는 단지 미량으로만 존재할 수 있다. 따라서 백신은 옥토시놀-10 및 폴리소르베이트 80 각각의 1 mg/㎖ 미만을 포함할 수 있다. 다른 미량의 잔여 성분은 항생제가 될 수 있다(예컨대 네오마이신, 카나마이신, 폴리마이신 B).

백신 조성물은 단일 예방접종용 물질을 포함할 수도 있으며, 다중 예방접종용 물질을 포함할 수도 있다(즉 '다중 투약' 키트). 보존제의 함유는 다중 투약 준비에 바람직하다. 다중 투약 조성물에 보존제를 함유하는 것의 대안으로서(또는 이와 함께), 조성물은 물질 제거용 무균 어댑터를 보유한 용기에 함유될 수 있다.

인플루엔자 백신은 일반적으로 약 0.5 ㎖의 투약 부피로 투여되지만, 어린이에게 그 절반 투약량(즉 약 0.25 ㎖)을 투여할 수 있다.

조성물 및 키트는 바람직하게는 2℃ 내지 8℃에서 저장된다. 이들이 동결되어서는 안된다. 이들은 직사광선을 피하여 보관되는 것이 이상적이다.

보조제

본 발명의 조성물은 보조제를 포함하는 것이 유리하며, 조성물을 투여한 환제에게서 유발되는 (체액성 및/또는 세포성) 면역 반응을 증진시키는 기능을 할 수 있다. 인플루엔자 백신과 함께 보조제를 사용하는 것은 전술하였다. 참고자료 79 및 80에서는 알루미늄 히드록시드를 사용하였으며, 참고자료 81에서는 알루미늄 히드록시드와 알루미늄 포스페이트의 혼합물을 사용하였다. 참고자료 82에는 알루미늄 염 보조제의 사용이 기술되어 있다. Chiron Vaccines사의 FLUAD™ 제품은 수중유 에멀젼을 포함한다.

본 발명에 사용될 수 있는 보조제는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다:

· 칼슘 염 및 알루미늄 염(또는 이들의 혼합물)을 포함하는 미네랄-함유 조성물. 칼슘 염은 칼슘 포스페이트(예컨대, 참고자료 83에 개시된 "CAP" 입자)를 포함한다. 알루미늄 염은 히드록시드, 포스페이트, 술페이트 등과 어떤 적합한 형태의 염(예컨대, 겔, 결정, 비결정형 등)을 포함한다. 이들 염의 흡착이 바람직하다. 조성물을 함유하는 미네랄은 금속염 입자로서 제형화될 수 있다[84]. 알루미늄 염 보조제는 아래에서 보다 상세하게 설명한다.

· 사이토카인-유도제 (상세는 하기 참조).

· 사포닌 [참고자료 112의 22장], 다양한 식물 종의 껍질, 잎, 줄기, 뿌리, 및 꽃에서 발견되는 스테롤 글리코사이드 및 트리테르페노이드 글리코사이드의 이종조직 그룹이다. 장미과 퀴라야(Quillaia saponaria Molina) 나무의 껍질의 사포닌이 보조제로서 많이 연구되어 왔다. 사포닌은 시밀렉스 오르나타(Smilax ornata) (sarsaprilla), 집소필라 파니쿨라타(Gypsophilla paniculata)(brides veil), 및 사포나리아 오피시아날리스(Saponaria officianalis)(soap root)에서 시중에서 획득할 수 있다. 사포닌 보조제 제형은 정제된 제형, 예컨대 QS21 및 지질 제형, 예컨대, ISCOMs을 포함한다. QS21은 Stimulon™으로 시판된다. 사포닌 조성물은 HPLC 및 RP-HPLC를 사용하여 정제된다. 이들 기술을 사용하여 특정 정제된 분획이 확인되었으며 QS7, QS17, QS18, QS21, QH-A, QH-B 및 QH-C를 포함한다. 바람직하게는 사포닌은 QS21이다. QS21의 제조 방법은 참고자료 85에 개시되어 있다. 사포닌 제형은 스테롤, 예컨대 콜레스테롤을 포함할 수 있다[86]. 사포닌과 콜레스테롤의 조합은 면역자극 복합체(ISCOMs)로 지칭하는 독특한 입자를 형성하기 위하여 사용될 수 있다[참고자료 112의 23장]. ISCOM은 일반적으로 인지질, 예컨대 포스파티딜에탄올아민 또는 포스파티딜콜린을 포함할 수 있다. 알려진 사포닌은 ISCOM에서 사용될 수 있다. 바람직하게는, ISCOM은 하나 이상의 QuilA, QHA & QHC를 포함한다. ISCOM는 참고자료 86-88에 더 설명되어 있다. 선택적으로, ISCOMS는 추가적인 세정제를 회피할 수 있다[89]. 사포닌 기반 보조제의 개발에 대한 연구는 참고자료 90 및 91에서 발견할 수 있다.

· 지방 보조제 (상세는 하기 참조).

· 박테리아 ADP-라이보실화 독소(예컨대, E.coli 열 불안정 엔테로톡신 "LT", 콜레라 독소 "CT", 또는 백일해 독소 "PT") 및 이들의 제독 유도체, 예컨대 LT-K63 및 LT-R72로 알려진 돌연변이 독소[92]. 제독 ADP-라이보실화 독소를 점막 보조제로 사용하는 것이 참고자료 93에 설명되어 있으며, 비경구용 보조제는 참고자료 94에 설명되어 있다.

· 생체접착제 및 점막접착제, 예컨대 에스테르화된 히알루론산 마이크로스피어[95] 또는 키토산 및 이들의 유도체[96].

· 마이크로입자 (즉 직경이 ~100nm 내지 ~150μm, 더 바람직하게는 ~200nm 내지 ~30μm, 또는 ~500nm 내지 ~10μm인 입자), 생분해성 및 무독성 물질 (예컨대, 폴리(α-히드록시산), 폴리히드록시부티르산, 폴리오르도에스테르, 폴리안하이드라이드, 폴리카프로락톤 등)인 물질로부터 폴리(락티드-코-글리콜리드)와 함께 형성되는 것이 바람직하며, 선택적으로 음성-대전 표면(예컨대, SDS로) 또는 양성-대전 표면(예컨대 CTAB와 같은 양이온 세정제로)을 보유하도록 처리된다.

· 리포좀 (참고자료 112의 13 및 14장). 보조제로서 사용하기에 적합한 리포좀 제형의 예는 참고자료 97-99에 설명되어 있다.

· 폴리옥시에틸렌 에테르 및 폴리옥시에틸렌 에스테르[100]. 이러한 제형은 추가로 옥토시놀과 조합된 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제 [101] 및 적어도 하나의 추가의 비-이온성 계면활성제 예컨대, 옥토시놀과 조합된 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 또는 에스테르 계면활성제[102]를 더 포함한다. 바람직한 폴리옥시에틸렌 에테르는 다음의 군으로부터 선택된다: 폴리옥시에틸렌-9-라우릴 에테르 (laureth 9), 폴리옥시에틸렌-9-스테로일 에테르, 폴리옥시데일렌-8-스테로일 에테르, 폴리옥시에틸렌-4-라우릴 에테르, 폴리옥시에틸렌-35-라우릴 에테르, 및 폴리옥시에틸렌-23-라우릴 에테르.

· 뮤라밀 펩티드, 예컨대 N-아세틸뮤라밀-L-트레오닐-D-이소글루타민 ("thr-MDP"), N-아세틸-노르뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타민 (nor-MDP), N-아세틸글루코사미닐-N-아세틸뮤라밀-L-Al-D-isoglu-L-Ala-디팔미톡시 프로필아미드 ("DTP-DPP", 또는 "Theramide™), N-아세틸뮤라밀-L-알라닐-D-이소글루타미닐-L-알라닌-2-(1'-2'디팔미토일-sn-글리세로-3-히드록시포스포릴옥시)-에틸아민 ("MTP-PE").

· 1차 그람-음성 박테리아로부터 제조된 외부 멤브레인 단백질 프로테오좀 제조물과 2차 그람-음성 박테리아로부터 유도된 리포사카라이드 제조물의 조합, 여기서 외부 멤브레인 단백질 프로테오좀 및 리포사카라이드 제조물은 안정적인 비-공유 보조제 복합체를 형성한다. 이러한 복합체는 "IVX-908"를 포함하며, 복합체는 네이세리아 메닝기티디스(Neisseria meningitidis) 외부 멤브레인 및 리포폴리사키라이드로 구성되어 있다. 이들은 인플루엔자 백신의 보조제로서 사용되어 왔다[103].

· 메틸 이노신 5'-모노포스페이트 ("MIMP") [104].

· 폴리히드록실화 피롤리지딘 화합물[105], 예컨대 하기 화학식을 갖는 것:

여기서 R은 수소, 선형 또는 가지형, 미치환 또는 치환, 포화 또는 불포화 아실, 알킬 (예컨대, 시클로알킬), 알케닐, 알키닐 및 아릴 기, 또는 약학적으로 허용가능한 염 또는 이들의 유도체를 포함하는 군으로부터 선택된다. 그 예에는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다: 카수아린, 카수아린-6-α-D-글루코피라노스, 3-epi-카수아린, 7-epi-카수아린, 3,7-디epi-카수아린 등.

· 감마 이눌린 [104] 또는 이들의 유도체, 예컨대 알가뮬린.

· CD1d 리간드, 예컨대 α-갈락토실세라마이드.

· 폴리옥시도늄 폴리머[107, 108] 또는 다른 N-산화 폴리에틸렌-피페라진 유도체.

이들 또는 다른 보조제-활성 물질은 참고자료 112 및 113에 상세하게 설명되어 있다.

조성물은 상기 보조제 중 2개 이상을 포함할 수 있다. 예를 들면, 이들은 수중유 에멀젼 및 사이토카인-유도제 모두를 유리하게 포함하며, 이로써 인플루엔자 백신, 예컨대 인터페론-γ 반응에 의하여 유발되는 사이토카인 반응을 개선시키며, 에멀젼 또는 제제가 그 자체로 사용되는 경우에 관찰되는 것보다 더 큰 개선이 있다.

조성물 내의 항원 및 보조제는 일반적으로 혼합물로 존재한다.

수중유 에멀젼 보조제

수중유 에멀젼은 특히 인플루엔자 바이러스 백신의 보조제용으로 사용되기 적합한 것으로 발견되었다. 다양한 이러한 에멀젼이 공지되어 있으며, 이들은 일반적으로 적어도 하나의 오일 및 적어도 하나의 계면활성제를 포함하며, 생분해성(대사가능한)이고 생체적합성인 오일(들) 및 계면활성제(들)을 포함한다. 에멀젼 내의 오일 액적은 일반적으로 직경이 5㎛ 미만이며, 서브-미크론 직경을 보유할 수도 있고, 이러한 작은 크기는 미세유동화기에 의하여 달성되어 안정한 에멀젼을 제공하게 된다. 220nm 미만 크기의 액적이 여과 멸균을 실시할 수 있어 바람직하다.

본 발명은 오일을 사용할 수 있으며, 예컨대 동물 (예컨대 생선) 또는 식물 공급원에서 유래한 것이다. 식물성 오일의 공급원은 견과류, 종자, 및 곡식을 포함한다. 땅콩유, 대두유, 코코넛유, 및 올리브유, 가장 일반적으로 이용가능한 것이 견과류 오일이다. 호호바(Jojoba) 오일이 사용될 수 있으며, 예컨대 이는 호호바 빈(jojoba bean)으로부터 얻을 수 있다. 종자유는 홍화씨유, 목화씨유, 해바라기씨유, 참깨 종자유 등을 포함한다. 곡식류에서는, 옥수수유가 가장 쉽게 이용가능하지만, 다른 시리얼 곡식의 오일, 예컨대 밀, 오트, 귀리, 쌀, 테프, 라이밀 등이 사용될 수도 있다. 종자유에서 자연 발생하지 않는 글리세롤 및 1,2-프로판디올의 6-10개 탄소 지방산 에스테르는 견과류 및 종자 오일에서 출발하는 적합한 물질의 가수분해, 분리 및 에스테르화에 의하여 제조될 수 있다. 포유류 모유로부터의 지방 및 오일은 대사가 가능하며, 따라서 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 동물 공급원으로부터의 순수 오일을 획득하기 위하여 필수적인 분리, 정제, 비누화 및 다른 수단에 대한 과정은 당해 기술 분야에 잘 알려져 있다. 대부분의 어류는 쉽게 회수할 수 있는 대사가능한 오일을 함유한다. 예를 들면, 간유, 상어간유, 및 고래유, 예컨대 경랍(spermaceti)은 본원에서 사용되는 여러 생선유를 예시한다. 다수의 분기쇄 오일은 5-탄소 이소프렌 유닛에서 생화학적으로 합성되며, 일반적으로 테르페노이드라고 한다. 상어간유는 스쿠알렌, 2,6,10,15,19,23-헥사메틸-2,6,10,14,18,22-테트라코사헥사엔으로서 알려진 분기형, 불포화 테르페노이드를 포함하며, 이는 특히 본원에서 바람직하다. 스쿠알란, 스쿠알렌의 포화 유사체는 바람직한 오일이다. 어류 오일은 스쿠알렌 및 스쿠알란을 포함하며 시중의 공급원으로부터 쉽게 이용가능하거나 업계 공지된 방법에 의하여 획득할 수 있다. 다른 바람직한 오일은 토코페롤이다(이하 참조). 오일의 혼합물을 사용할 수 있다.

계면활성제는 이들의 'HLB' (친수/친유 밸런스)에 의하여 분류될 수 있다. 본 발명의 바람직한 계면활성제는 HLB가 적어도 10, 바람직하게는 적어도 15, 더 바람직하게는 적어도 16이다. 본 발명은 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는 계면활성제와 함께 사용될 수 있다: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 계면활성제 (일반적으로 Tweens으로 지칭됨), 특히 폴리소르베이트 20 및 폴리소르베이트 80; 산화 에틸렌 (EO), 산화 프로필렌 (PO), 및/또는 산화 부틸렌 (BO)의 공중합체, 선형 EO/PO 블럭 공중합체와 같은 DOWFAX™ 상표하의 고체; 에톡시(옥시-1,2-에탄디일)기의 반복 수가 변할 수 있는 옥토시놀과 특정 대상 옥토시놀-9 (트리톤 X-100, 또는 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올); (옥틸페녹시)폴리에톡시에탄올 (IGEPAL CA-630/NP-40); 인지질, 예컨대 포스파티딜콜린 (레시틴); 노닐페놀 에톡시레이트, 예컨대 Tergitol™ NP 시리즈; 라우릴, 세틸, 스테아릴 및 올레일 알콜로부터 유도된 폴리옥시에틸렌 지방 에테르(Brij 계면활성제로서 알려짐), 예컨대 트리에틸렌글리콜 모노라우릴 에테르(Brij 30); 및 소르비탄 에스테르 (일반적으로 SPAN으로 알려짐), 예컨대 소르비탄 트리올레이트 (Span 85) 및 소르비탄 모노라우레이트. 비-이온성 계면활성제가 바람직하다. 에멀젼에 포함되는 바람직한 계면활성제는 Tween 80 (폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트), Span 85 (소르비탄 트리올레이트), 레시틴 및 트리톤 X-100이다.

계면활성제의 혼합물, 예컨대 Tween 80/Span 85 혼합물을 사용할 수 있다. 폴리옥시에틸렌 소르비탄 모노올레이트(Tween 80)와 같은 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르와 t-옥틸페녹시폴리에톡시에탄올(트리톤 X-100)과 같은 옥토시놀의 조합이 적합하다. 다른 유용한 조합은 laureth 9와 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 및/또는 옥토시놀을 포함한다.

바람직한 계면활성제의 양(중량%)은: 폴리옥시에틸렌 소르비탄 에스테르 (예컨대, Tween 80) 0.01 내지 1%, 특히 약 0.1%; 옥틸- 또는 노닐페녹시 폴리옥시에탄올 (예컨대, 트리톤 X-100, 또는 트리톤 시리즈의 다른 세정제) 0.001 내지 0.1%, 특히 0.005 내지 0.02%; 폴리옥시에틸렌 에테르 (예컨대, laureth 9) 0.1 내지 20 %, 바람직하게는 0.1 내지 10%, 특히 0.1 내지 1 % 또는 약 0.5%이다.

본 발명에 유용한 특정 수중유 에멀젼 보조제는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다:

· 스쿠알렌의 서브미크론 에멀젼, Tween 80 및 Span 85. 에멀젼의 조성은 부피로 약 5% 스쿠알렌, 약 0.5% 폴리소르베이트 80 및 약 0.5% Span 85가 될 수 있다. 중량 환산으로, 이들 비율은 4.3% 스쿠알렌, 0.5% 폴리소르베이트 80 및 0.48% Span 85가 된다. 이 보조제는 'MF59'로 알려져 있으며[109-111], 참고자료 112의 10장 및 참고자료 113의 12장에 상세하게 설명되어 있다. MF59 에멀젼은 시트레이트 이온, 예컨대 1O mM 나트륨 시트레이트 버퍼를 포함하는 것이 유리하다.

· 스쿠알렌, 토코페롤, 및 Tween 80의 에멀젼. 에멀젼은 인산 완충 식염수를 포함할 수 있다. 이는 Span 85 (예컨대, 1%) 및/또는 레시틴을 포함할 수도 있다. 이들 에멀젼은 2 내지 10% 스쿠알렌, 2 내지 10% 토코페롤 및 0.3 내지 3% Tween 80을 가질 수 있으며, 스쿠알렌:토코페롤의 중량비는 바람직하게는 ≤1 이며, 이로써 더욱 안정적인 에멀젼을 제공한다. 스쿠알렌 및 Tween 80은 약 5:2의 부피비로 존재할 수 있다. 이러한 에멀젼은 Tween 80 을 PBS에 용해시켜 2% 용액으로 제조하고, 그 다음 이 용액의 90㎖을 (5g의 DL-α-토코페롤 및 5㎖ 스쿠알렌)의 혼합물과 혼합한 뒤, 이 혼합물을 미세유동화시킴으로써 제조할 수 있다. 얻어진 에멀젼은 서브마이크론 오일 액적을 보유할 수 있으며, 예컨대 평균 직경이 100 내지 250nm, 바람직하게는 약 180nm이다.

· 스쿠알렌, 토코페롤, 및 트리톤 세정제(예컨대, 트리톤 X-100)의 에멀젼. 에멀젼은 3d-MPL을 포함할 수 있다(하기 참조). 에멀젼은 포스페이트 버퍼를 함유할 수 있다.

· 폴리소르베이트 (예컨대, 폴리소르베이트 80), 트리톤 세정제(예컨대, 트리톤 X-100) 및 토코페롤(예컨대, α-토코페롤 숙시네이트)을 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 이들 3성분을 약 75:11:10 (예컨대, 750㎍/㎖ 폴리소르베이트 80, 110㎍/㎖ 트리톤 X-100 및 100㎍/㎖ α-토코페롤 숙시네이트)의 질량비로 포함할 수 있으며, 이들 농도는 항원으로부터 이들 성분의 비율을 포함하여야 한다. 에멀젼은 스쿠알렌을 포함할 수 있다. 에멀젼은 3d-MPL을 포함할 수 있다(하기 참조). 수성상은 포스페이트 버퍼를 함유할 수 있다.

· 스쿠알렌, 폴리소르베이트 80 및 폴록사머 401("Pluronic™ L121")의 에멀젼. 에멀젼은 pH 7.4의 인산 완충 식염수에서 제형화될 수 있다. 이 에멀젼은 뮤라밀 디펩티드의 유용한 전달 매체이며, "SAF-I" 보조제 내에서 트레오닐-MDP와 함께 사용될 수 있다 [114] (0.05-1% Thr-MDP, 5% 스쿠알렌, 2.5% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80). 이는 "AF" 보조제에서 Thr-MDP없이 사용될 수도 있다 [115] (5% 스쿠알렌, 1.25% Pluronic L121 및 0.2% 폴리소르베이트 80). 미세유동화가 바람직하다.

·스쿠알렌, 수성 용제, 폴리옥시에틸렌 알킬 에테르 친수성 비이온성 계면활성제(예컨대 폴리옥시에틸렌 (12) 세토스테아릴 에테르) 및 소수성 비이온성 계면활성제(예컨대 소르비탄 모놀레이트 또는 'Span 80'와 같은 소르비탄 에스테르 또는 만니드 에스테르)를 포함하는 에멀젼. 에멀젼은 열가역적인 것이 바람직하고 및/또는 적어도 90%(부피)의 크기가 20nm 미만인 오일 액적을 갖는다[116]. 에멀젼은 알디톨; 동결억제제 (예컨대 도데실말토사이드 및/또는 수크로스와 같은 당); 및/또는 알킬폴리글리코사이드 중 하나 이상을 포함할 수도 있다. 이러한 에멀젼은 동결건조될 수 있다.

·스쿠알렌, 폴록사머 105 및 Abil-Care의 에멀젼[117]. 보조되는 백신 중의 이들 성분의 최종 농도(중량)는 5% 스쿠알렌, 4% 폴록사머 105 (플루로닉(pluronic) 폴리올) 및 2% Abil-Care 85 (비스-PEG/PPG-16/16 PEG/PPG-16/16 디메티콘; 카프릴릭/카프릭 트리글리세라이드)이다.

·0.5-50%의 오일, 0.1-10%의 인지질, 및 0.05-5%의 비-이온성 계면활성제를 함유하는 에멀젼. 참고자료 118에 설명되어 있는 바와 같이, 바람직한 인지질 성분은 포스파티딜콜린, 포스파티딜에탄올아민, 포스파티딜세린, 포스파티딜이노시톨, 포스파티딜글리세롤, 포스파타이드산, 스핀고마이에린 및 카디오리핀이다. 서브마이크론 크기의 액적이 바람직하다.

· 대사가 불가능한 오일의 서브마이크론 수중유 에멀젼(예컨대, 라이트 미네랄 오일) 및 적어도 하나의 계면활성제(예컨대 레시틴, Tween 80 또는 Span 80). 첨가제, 예컨대 QuilA 사포닌, 콜레스테롤, 사포닌-친유성 콘쥬게이트 (예컨대 GPI-0100, 참고자료 119에 설명되어 있음, 글루쿠론산의 카르복실기를 통하여 아디파틱 아민을 데사실사포닌에 첨가함으로써 제조), 디메틸디옥타데실암모늄 브로마이드 및/또는 N,N-디옥타데실-N,N-비스 (2-히드록시에틸) 프로판디아민을 포함할 수 있다.

·미네랄 오일, 비이온성 친유성 에톡시화 지방 알콜 및 비이온성 친수성 계면활성제를 포함하는 에멀젼(예컨대 에톡시화 지방 알콜 및/또는 폴리옥시에틸렌- 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체)[120].

·미네랄 오일, 비이온성 친수성 에톡시화 지방 알콜 및 비이온성 친유성 계면활성제를 포함하는 에멀젼(예컨대 에톡시화 지방 알콜 및/또는 폴리옥시에틸렌- 폴리옥시프로필렌 블록 공중합체)[120].

·사포닌 (예컨대, QuilA 또는 QS21) 및 스테롤 (예컨대, 콜레스테롤)이 나선형 미셀로 결합된 에멀젼 [121].

에멀젼은 전달시 즉석에서 항원과 혼합할 수 있다. 따라서 보조제 및 항원은 사용시 최종 제형화 준비로 패키지된 또는 배포된 백신에 별도로 보관할 수 있다. 항원은 일반적으로 수성형태이어서, 백신은 두 액체를 혼합함으로써 최종적으로 제조된다. 혼합을 위한 두 액체의 부피비는 변할 수 있지만(예컨대, 5:1 내지 1:5), 일반적으로 약 1:1이다.

항원과 보조제가 혼합된 후, 헤마글루티닌 항원은 일반적으로 수성 용액에 잔존할 것이지만 오일/물 경계 부근에서 스스로 분리된다. 일반적으로, 헤마글루티닌은 에멀젼의 오일상에 거의 침투할 수 없을 것이다.

조성물이 토코페롤을 포함하는 경우, α, β, γ, δ, ε 또는 ξ 토코페롤 중 어떤 것을 사용할 수 있으나, α-토코페롤이 바람직하다. 토코페롤은 여러 형태, 예컨대 상이한 염 및/또는 이성질체를 취할 수 있다. 염은 유기염, 예컨대 숙시네이트, 아세테이트, 니코티네이트 등을 포함한다. D-α-토코페롤 및 DL-α-토코페롤을 모두 사용할 수 있다. 토코페롤은 고령의 환자(예컨대, 60세 이상의 연령)에 사용하기 위한 백신에 포함되는 것이 유리하며, 이는 비타민 E가 이 환자군 내에서 면역 반응에 긍정적인 효과를 미친다고 보고되었기 때문이다[122]. 이들은 에멀젼을 안정화하는데 도움이 되는 항산화 특성을 보유한다[123]. 바람직한 α-토코페롤은 DL-α-토코페롤이며, 이 토코페롤의 바람직한 염은 숙시네이트이다. 숙시네이트 염은 생체 내에서 TNF-관련 리간드와 상호작용하는 것으로 발견되었다. 더욱이, α-토코페롤 숙시네이트는 인플루엔자 백신에 적합성이 있다고 알려져 있으며, 수은 화합물의 대안으로서 유용한 보존제가 된다[59].

사이토카인-유도제

본 발명의 조성물에 포함되는 사이토카인-유도제는 환자에 투여시 인터페론 및 인터류킨을 포함하는 사이토카인을 방출하는 면역 시스템을 유도할 수 있다. 사이토카인 반응은 인플루엔자 감염에 대한 숙주 방어의 초기 결정 단계에 수반되는 것으로 알려져 있다[124]. 바람직한 제제는 인터페론-γ; 인터류킨-1; 인터류킨-2; 인터류킨-12; TNF-α; TNF-β; 및 GM-CSF 중 하나 이상의 방출을 유도할 수 있다. 바람직한 제제는 Th1-타입 면역 반응, 예컨대 인터페론-γ, TNF-α, 인터류킨-2와 연관된 사이토카인의 방출을 유도한다. 인터페론-γ와 인터류킨-2 모두의 자극이 바람직하다.

본 발명의 조성물을 투여한 결과로서, 따라서 환자는 인플루엔자 항원으로 자극될 때 항원-특이적 방식으로 원하는 사이토카인(들)을 방출하는 T 세포를 보유할 것이다. 예를 들면, 시험관 내에서 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌에 노출되는 경우 혈액으로부터 정제된 T 세포는 γ-인터페론을 방출할 것이다. 말초 혈액 단핵 세포(PBMC) 내에서 이러한 반응을 측정하기 위한 공정이 기술 분야에 공지되어 있으며, ELISA, ELISPOT, 유동-세포측정 및 실시간 PCR을 포함한다. 예를 들면, 참고자료 125는 파상풍 톡소이드에 대한 항원-특이적 T 세포-매개 면역 반응, 구체적으로 γ-인터페론 반응을 관찰하였으며, ELISPOT이 자발적 반응으로부터 항원-특이적 TT-유도 반응을 구별하는 가장 민감한 방법이지만, 유동 세포측정에 의한 세포질내 사이토카인 검출이 재자극 효과를 검출하기 위한 가장 효율적인 방법이라는 것을 확인한 연구를 보고한다.

적합한 사이토카인-유도제는 다음을 포함하나 이에 한정되지 않는다:

·면역자극 올리고뉴클레오티드, 예컨대 CpG 모티프(구아노신에 결합된 포스페이트에 의해 연결된 비메틸화 사이토신을 함유하는 디뉴클레오티드 서열)를 함유하는 것, 또는 이중-나선 RNA, 또는 회문형 서열을 함유한 올리고뉴클레오티드, 또는 폴리(dG) 서열을 함유한 올리고뉴클레오티드.

·3-O-데아실화 모노포스포릴 지질 A ('3dMPL', 'MPL™'으로서도 알려짐) [126-129].

· 이미다조퀴놀린 화합물, 예컨대 이미퀴모드("R-837") [130,131], 레시퀴모드("R-848") [132], 및 이들의 유사체; 및 이들의 염(예컨대, 염화수소산염). 면역자극 이미다조퀴놀린에 대한 상세는 참고자료 133 내지 137에서 확인할 수 있다.

·티오세미카르바존 화합물, 예컨대 참고자료 138에 개시된 것. 활성 화합물의 제형화, 제조 및 선별 방법은 참고자료 138에 설명되어 있다. 티오세미카르바존은 사이토카인, 예컨대 TNF-α의 생성을 위한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 자극에 특히 효과적이다.

·트립탄트린 화합물, 예컨대 참고자료 139에 개시된 것. 활성 화합물의 제형화, 제조 및 선별 방법은 참고자료 139에 설명되어 있다. 티오세미카르바존은 사이토카인, 예컨대 TNF-α의 생산을 위한 인간 말초 혈액 단핵 세포의 자극에 특히 효과적이다.

· 뉴클리오사이드 유사체, 예컨대: (a) 이사토라빈 (ANA-245; 7-티아-8-옥소구아노신):

및 이들의 프로드러그; (b) ANA975; (c) ANA-025-1; (d) ANA380; (e) 참고자료 140 내지 142에 개시된 화합물; (f) 다음의 화학식을 갖는 화합물:

여기서:

R₁ 및 R₂는 각각 독립적으로 H, 할로, -NR_aR_b, -OH, C_1-6 알콕시, 치환 C_1-6 알콕시, 헤테로사이클릴, 치환 헤테로사이클릴, C_6-1O 아릴, 치환 C_6-10 아릴, C_1-6 알킬, 또는 치환 C_1-6 알킬이고;

R₃은 부재, H, C_1-6 알킬, 치환 C_1-6 알킬, C_6-10 아릴, 치환 C_6-10 아릴, 헤테로사이클릴, 또는 치환 헤테로사이클릴이고;

R₄ 및 R₅ 는 각각 독립적으로 H, 할로, 헤테로사이클릴, 치환 헤테로사이클릴, -C(O)-R_d, C_1-6 알킬, 치환 C_1-6 알킬이거나, 또는 R_4-5에서와 같이 함께 결합하여 5원 고리를 형성하고:

결합은 ~~로 나타낸 결합에서 이루어짐

X₁ 및 X₂ 는 각각 독립적으로 N, C, O, 또는 S이고;

R₈은 H, 할로, -OH, C_1-6 알킬, C_2-6 알케닐, C_2-6 알키닐, -OH, -NR_aR_b, -(CH2)_n-O-R_c, -0-(C_1-6 알킬), -S(O)_pR_e, 또는 -C(O)-R_d 이고;

R₉ 는 H, C_1-6 알킬, 치환 C_1-6 알킬, 헤테로사이클릴, 치환 헤테로사이클릴 또는 R_9a이고, 여기서, R_9a는:

결합은 ~~로 나타낸 결합에서 이루어짐

R₁₀ 및 R₁₁은 각각 독립적으로 H, 할로, C_1-6 알콕시, 치환 C_1-6 알콕시, - NR_aR_b, 또는 -OH 이고;

각 R_a 및 R_b 는 독립적으로 H, C_1-6 알킬, 치환 C_1-6 알킬, -C(O)R_d, C_6-10 아릴이고;

각 R_c 는 독립적으로 H, 포스페이트, 디포스페이트, 트리포스페이트, C_1-6 알킬, 또는 치환 C_1-6 알킬이며;

각 R_d 는 독립적으로 H, 할로, C_1-6 알킬, 치환 C_1-6 알킬, C_1-6 알콕시, 치환 C_1-6 알콕시, -NH₂, -NH(C_1-6 알킬), -NH(치환 C_1-6 알킬), -N(C_1-6 알킬)₂, -N(치환 C_1-6 알킬)₂, C_6-10 아릴, 또는 헤테로사이클릴이고;

각 R_e 는 독립적으로 H, C_1-6 알킬, 치환 C_1-6 알킬, C_6-10 아릴, 치환 C_6-10 아릴, 헤테로사이클릴, 또는 치환 헤테로사이클릴이고;

각 R_f 는 독립적으로 H, C_1-6 알킬, 치환 C_1-6 알킬, -C(O)R_d, 포스페이트, 디포스페이트, 또는 트리포스페이트이고;

각 n 은 독립적으로 0, 1, 2, 또는 3이고;

각 p 는 독립적으로 0, 1, 또는 2이고; 또는

또는 (g) (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 약학적으로 허용가능한 염, (a) 내지 (f) 중 어느 하나의 토토머, 또는 토토머의 약학적으로 허용가능한 염이다.

· 록소리빈 (7-알릴-8-옥소구아노신) [143].

· 다음을 포함하는 참고자료 144에 개시된 화합물: 아실피페라진 화합물, 인돌디온 화합물, 테트라히드라이소퀴놀린 (THIQ) 화합물, 벤조시클로디온 화합물, 아미노아자비닐 화합물, 아미노벤즈이미다졸 퀴놀리논 (ABIQ) 화합물 [145,146], 히드라프탈라미드 화합물, 벤조페논 화합물, 이속사졸 화합물, 스테롤 화합물, 퀴나질리온 화합물, 피롤 화합물 [147], 안트라퀴논 화합물, 퀴녹살린 화합물, 트리아진 화합물, 피라잘로피리미딘 화합물, 및 벤즈아졸 화합물 [148].

·참고자료 149에 개시된 화합물.

·아미노알킬 글루코사미니드 포스페이트 유도체, 예컨대 RC-529 [150,151].

·포스파젠, 예를 들면 참고자료 152 및 153에 기재된 바와 같은 폴리[디(카르복실레이토페녹시)포스파젠] ("PCPP").

· 소분자 면역강화제 (SMIPs) 예컨대:

N2-메틸-1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민

N2,N2-디메틸-1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민

N2-에틸-N2-메틸-1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민

N2-메틸-1-(2-메틸프로필)-N2-프로필-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민

1-(2-메틸프로필)-N2-프로필-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민

N2-부틸-1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민

N2-부틸-N2-메틸-1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민

N2-메틸-1-(2-메틸프로필)-N2-펜틸-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민

N2-메틸-1-(2-메틸프로필)-N2-프로프-2-에닐-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민

1-(2-메틸프로필)-2-[(페닐메틸)티오]-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민

1-(2-메틸프로필)-2-(프로필티오)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-4-아민

2-[[4-아미노-1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2-일](메틸)아미노]에탄올

2-[[4-아미노-1-(2-메틸프로필)-1H-이미다조[4,5-c] 퀴놀린-2-일](메틸)아미노]에틸 아세트산염

4-아미노-1-(2-메틸프로필)-1,3-디하이드로-2H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2-온

N2-부틸-1-(2-메틸프로필)-N4,N4-비스(페닐메틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민

N2-부틸-N2-메틸-1-(2-메틸프로필)-N4,N4-비스(페닐메틸)-1H-이미다조[4,5- c]퀴놀린-2,4-디아민

N2-메틸-1-(2-메틸프로필)-N4,N4-비스(페닐메틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민

N2,N2-디메틸-1-(2-메틸프로필)-N4,N4-비스(페닐메틸)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민

1-{4-아미노-2-[메틸(프로필)아미노]-lH-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일}-2-메틸프로판-2-올

1-[4-아미노-2-(프로필아미노)-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-1-일]-2-메틸프로판-2-올

N4,N4-디벤질-1-(2-메톡시-2-메틸프로필)-N2-프로필-1H-이미다조[4,5-c]퀴놀린-2,4-디아민.

본 발명에서 사용되는 사이토카인-유도제는 Toll-유사 수용체(TLR)의 조절제 및/또는 작용제일 수 있다. 예를 들면, 이들은 하나 이상의 인간 TLR1, TLR2, TLR3, TLR4, TLR7, TLR8, 및/또는 TLR9 단백질의 작용제가 될 수 있다. 바람직한 제제는 TLR7 (예컨대, 이미다조퀴놀린) 및/또는 TLR9 (예컨대, CpG 올리고뉴클레오티드)의 작용제이다. 이러한 제제는 선천성 면역 경로를 활성화시키는데 유용하다.

사이토카인-유도제는 제조시 여러 단계에서 조성물에 첨가될 수 있다. 예를 들면, 이는 항원 조성물 내에 존재할 수 있으며, 이 혼합물이 그 다음 수중유 에멀젼에 첨가될 수도 있다. 대안으로서, 이는 수중유 에멀젼에 존재할 수 있으며, 이 경우 제제는 에멀젼화되기 전에 에멀젼 성분에 첨가될 수 있거나, 또는 에멀젼화된 후에 에멀젼에 첨가될 수 있다. 이와 유사하게, 제제는 에멀젼 액적 내에 코아세르베이트화될 수 있다. 최종 조성물 내의 사이토카인-유도제의 위치 및 분포는 이들의 친수/친유 특성에 의존하며, 예컨대 제제는 수성상, 오일상, 및/또는 오일-물 경계에 위치할 수 있다.

사이토카인-유도제는 별도 제제, 예컨대 항원 (예컨대, CRM197)에 컨쥬게이트될 수 있다. 소분자의 컨쥬게이션 기술의 일반적인 개요는 참고자료 154에 제공되어 있다. 대안으로서, 보조제는 예컨대 소수성 또는 이온 상호작용에 의하여 첨가제에 비공유적으로 결합될 수 있다.

두개의 바람직한 사이토카인-유도제는 (a) 면역자극 올리고뉴클레오티드와 (b) 3dMPL 이다.

면역자극 올리고뉴클레오티드는 뉴클레오티드 변성체/유사체, 예컨대 포스포로티오에이트 변성체를 포함할 수 있으며, 이중-가닥 또는 (RNA 제외) 단일-가닥일 수 있다. 참고자료 155, 156 및 157에서는 가능한 유사체 치환, 예컨대 구아노신을 2'-데옥시-7-데아자구아노신으로 대체하는 것을 개시하고 있다. CpG 올리고뉴클레오티드의 보조제 효과는 참고자료 158-163에 더 설명되어 있다. CpG 서열은 TLR9, 예컨대 모티프 GTCGTT 또는 TTCGTT에 연결될 수 있다[164]. CpG 서열은 Th1 면역 반응, 예컨대 CpG-A ODN (올리고데옥시뉴클레오티드)을 유도하는데 특이적일 수 있거나, 또는 B 세포 반응, 예컨대 CpG-B ODN을 유도하는데 더욱 특이적일 수 있다. CpG-A 및 CpG-B ODN은 참고자료 165-167에 설명되어 있다. 바람직하게는, CpG는 CpG-A ODN이다. 바람직하게는, CpG 올리고뉴클레오티드는 5` 말단부가 수용체 인식 가능하도록 구성된다. 선택적으로, 두 CpG 올리고뉴클레오티드 서열은 이들의 3' 말단에 결합하여 "이뮤노머(immunomers)"를 형성할 수 있다. 예를 들면, 참고자료 164 및 168-170을 참고한다. 유용한 CpG 보조제는 ProMune™(Coley Pharmaceutical Group, Inc.)로서도 알려진 CpG7909이다.

CpG 서열을 사용하는 것의 대안으로서 또는 추가하여, TpG 서열이 사용될 수 있다[171]. 이들 올리고뉴클레오티드는 비메틸화 CpG 모티프가 없어도 좋다.

면역자극 올리고뉴클레오티드는 피리미딘이 풍부할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 연속적인 티미딘 뉴클레오티드(예컨대, TTTT, 참고자료 171에 개시됨)를 포함할 수 있으며, 및/또는 >25% 티미딘(예컨대, >35%, >40%, >50%, >60%, >80%, 등)을 보유한 뉴클레오티드 조성물을 함유할 수 있다. 예를 들면, 하나 이상의 연속적인 사이토신 뉴클레오티드 (예컨대, CCCC, 참고자료 171에 개시됨)를 포함할 수 있으며, 및/또는 >25% 사이토신(예컨대, >35%, >40%, >50%, >60%, >80% 등)을 보유한 뉴클레오티드 조성물을 함유할 수 있다. 이들 올리고뉴클레오티드는 비메틸화 CpG 모티프가 없어도 좋다.

면역자극 올리고뉴클레오티드는 일반적으로 적어도 20개 뉴클레오티드를 포함할 것이다. 100개 미만의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.

3dMPL (3 데-O-아실화 모노포스포릴 지질 A, 또는 3-O-데사실-4'-모노포스포릴 지질 A로서 알려짐)은 모노포스포릴 지질 A에서 환원 말단 글루코사민의 위치 3이 데-아실화된 보조제이다. 3dMPL은 살모넬라 미네소타(Salmonella Minnesota)의 헵토스가 없는 돌연변이로부터 제조되며, 지질 A와 화학적으로 유사하나 산-불안정 포스포릴기 및 염기-불안정 아실기가 부족하다. 이는 단핵구/대식세포 계통의 세포를 활성화시키고, IL-1, IL- 12, TNF-α 및 GM-CSF를 포함하는 여러 사이토카인의 방출을 자극한다 (참고자료 172 참조). 3dMPL의 제조는 참고자료 173에 본래 설명되어 있다.

3dMPL은 이들의 아실화에 의하여 변화하는 관련 분자의 혼합물의 형태를 취할 수 있다(예컨대, 서로 길이가 다른 3, 4, 5 또는 6개 아실쇄를 보유). 두 글루코사민(2-데옥시-2-아미노-글루코스로서도 알려짐) 단당류는 이들의 2-위치 탄소(즉, 위치 2 및 2')에서 N-아실화되며, 또한 3' 위치에서도 O-아실화된다. 탄소 2에 부착된 기는 화학식 -NH-CO-CH₂-CR¹R^1'이다. 탄소 2'에 부착된 기는 화학식 -NH-CO-CH₂-CR²R^2'이다. 탄소 3'에 부착된 기는 화학식 -0-CO-CH₂-CR³R^3'이다. 대표적인 구조는 다음과 같다:

기 R¹, R² 및 R³는 각각 독립적으로 -(CH₂)_n-CH₃이다. n값은 바람직하게는 8 내지 16, 더 바람직하게는 9 내지 12이며, 가장 바람직하게는 10이다.

기 R^1', R^2' 및 R^3'는 각각 독립적으로 (a) -H; (b) -OH; 또는 (c) -O-CO-R⁴가 될 수 있고, 여기서 R⁴는 -H 또는 -(CH₂)_m-CH₃이고, 여기서 m 값은 바람직하게는 8 내지 16, 더 바람직하게는 10, 12 또는 14이다. 2 위치에서, m은 바람직하게는 14이다. 2' 위치에서, m은 바람직하게는 10이다. 3' 위치에서, m은 바람직하게는 12이다. 따라서 기 R^1', R^2' 및 R^3'은 바람직하게는 도데칸산, 테트라데칸산 또는 헥사데칸산으로부터의 -O-아실기이다.

모든 R^1', R^2' 및 R^3'가 -H인 경우, 3dMPL은 3개 아실쇄(각각 위치 2, 2' 및 3'에 하나)만을 보유한다. R^1', R^2' 및 R^3' 중 둘만 -H인 경우, 3dMPL은 4개 아실쇄를 보유할 수 있다. R^1', R^2' 및 R^3' 중의 하나만 -H인 경우, 3dMPL은 5개 아실쇄를 보유할 수 있다. R^1', R^2' 및 R^3' 중의 어느 것도 -H 가 아닌 경우 3dMPL은 6개 아실쇄를 보유할 수 있다. 본 발명에 따라 사용되는 3dMPL 보조제는 3 내지 6개 아실쇄를 지닌 이들 형태의 혼합물이 될 수 있지만, 혼합물 내에 6개 아실쇄를 보유한 3dMPL를 포함하는 것이 바람직하며, 헥사아실쇄 형태가 총 3dMPL의 중량부로 적어도 10%, 예컨대, ≥20%, ≥30%, ≥40%, ≥50% 또는 그 이상을 차지하도록 확보하는 것이 특히 바람직하다. 6개 아실쇄를 보유한 3dMPL은 대부분의 보조제-활성 형태로 나타난다.

따라서, 본 발명의 조성물 내에 포함되는 가장 바람직한 형태의 3dMPL는 하기 나타낸 화학식 (IV)이다.

3dMPL이 혼합물의 형태로 사용되는 경우, 본 발명의 조성물 내의 3dMPL 양 또는 농도에 대한 기준은 혼합물 내에 조합된 3dMPL종을 참조한다.

수성 상태에서, 3dMPL은 예컨대 입경이 <150nm 또는 >500nm인 서로 다른 크기의 미셀 응집체 또는 입자를 형성할 수 있다. 이들 각각 또는 모두를 본 발명에서 사용할 수 있으며, 더 나은 입자를 기존의 분석에 의하여 선택할 수 있다. 더 작은 입자(예컨대, 3dMPL 수성 현탁액에 투명성을 부여할 정도로 작은)가 본 발명에 따른 사용에 바람직하며, 이는 이들의 월등한 활성 때문이다[174]. 바람직한 입자는 평균 입경이 220nm 미만, 더 바람직하게는 200nm 미만 또는 150nm 미만 또는 120nm 미만이며, 100nm 미만의 평균 입경을 보유할 수도 있다. 대부분의 경우, 그러나 평균 입경이 50nm보다 작지 않다. 이러한 입자는 여과 멸균에 적합할 정도로 충분히 작다. 입경은 평균 입경을 측정하는 동적 광산란의 통상 기술로 측정할 수 있다. 입자의 직경을 x nm라고 하는 경우, 일반적으로 이 평균 부근에 입자가 분포할 것이며, 입자 수의 적어도 50% (예컨대, ≥60%, ≥70%, ≥80%, ≥90%, 또는 그 이상)는 직경이 x±25% 범위 내일 것이다.

3dMPL은 수중유 에멀젼과 조합하여 사용되는 것이 유리하다. 실질적으로 모든 3dMPL이 에멀젼의 수성상에 존재할 수 있다.

3dMPL은 그 자체로 사용할 수 있거나, 또는 하나 이상의 추가의 화합물과 조합하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 3dMPL은 QS21 사포닌 [175] (수중유 에멀젼 내에 포함 [176]), 면역자극 올리고뉴클레오티드, QS21와 면역자극 올리고뉴클레오티드, 알루미늄 포스페이트[177], 알루미늄 히드록시드[178], 또는 알루미늄 포스페이트 및 알루미늄 히드록시드와 조합하여 사용하는 것이 알려져 있다.

지방 보조제

본 발명에 사용될 수 있는 지방 보조제는 상술한 수중유 에멀젼을 포함할 수 있으며, 예를 들면 다음을 포함한다:

· 화학식 I, II 또는 III의 화합물, 또는 이들의 염:

참고자료 179에서 정의한 바와 같이, 예컨대 'ER 803058', 'ER 803732', 'ER 804053', 'ER 804058', 'ER 804059', 'ER 804442', 'ER 804680', 'ER 804764', 'ER 803022' 또는 'ER 804057' 예컨대:

·에셔리시아 콜리(Escherichia coli)로부터의 지질 A의 유도체, 예컨대 OM-174 (참고자료 180 및 181에 기재됨).

·양이온 지질 및 (일반적으로 중성) 보조-지질의 제형, 예컨대 아미노프로필-디메틸-미리스트올레일옥시-프로판아미니움 브로마이드-디피타노일포스파티딜-에탄올아민 ("Vaxfectin™") 또는 아미노프로필-디메틸-비스-도데실옥시-프로판아미니움 브로마이드-디올레오일포스파티딜-에탄올아민 ("GAP-DLRIE:DOPE"). (±)-N-(3-아미노프로필)-N,N-디메틸-2,3-비스(신-9-테트라데세닐옥시)-1-프로판아미니움 염을 함유한 제형이 바람직하다 [182].

·3-0-데아실화 모노포스포릴 지질 A (전술).

·포스페이트-함유 비환형 골격에 연결된 지질을 함유한 화합물, 예컨대, TLR4 길항제 E5564 [183,184]:

알루미늄 염 보조제

알루미늄 히드록시드 및 알루미늄 포스페이트로 알려진 보조제를 사용할 수 있다. 이러한 명칭은 통상적인 것이나 존재하는 실제 화학적 화합물의 정확한 설명이 아님에도 편의를 위하여 사용한다(예컨대, 참고자료 112의 9장 참조). 본 발명은 일반적으로 보조제로서 사용되는 어떤 "히드록시드" 또는 "포스페이트" 보조제 중 어떤 것을 사용할 수 있다.

"알루미늄 히드록시드"로 알려진 보조제는 일반적으로 알루미늄 옥시히드록사이드 염이며, 대개 적어도 부분적으로 결정체이다. 화학식 AlO(OH)로 표시될 수 있는 알루미늄 옥시히드록사이드는 적외선(IR) 분광법, 특히 1070cm^-1에서의 흡수밴드 및 3090-3100cm^-1에서의 스트롱 숄더(strong shoulder)의 존재에 의해 다른 알루미늄 화합물, 예컨대 알루미늄 히드록시드 Al(OH)₃ 등과 구별될 수 있다[참고자료 112의 9장]. 알루미늄 히드록시드 보조제의 결정도는 절반 높이에서의 회절폭(WHH)에 의하여 나타나며, 불충분한 결정 입자는 작은 결정크기에 기인하여 더 큰 선폭증가를 나타낸다. 표면적은 WHH가 증가함에 따라 증가하며, 높은 WHH 값의 보조제는 큰 항원 흡수능을 가지는 것으로 보인다. 섬유 형태(예컨대, 투과 전자 현미경으로 관찰)가 알루미늄 히드록시드 보조제에 일반적이다. 알루미늄 히드록시드 보조제의 pI는 일반적으로 약 11, 즉 보조제 자체는 생리학적 pH에서 양성 표면 전하를 띤다. 알루미늄 히드록시드 보조제에 대하여 pH 7.4에서 mg Al⁺⁺⁺ 당 1.8-2.6 mg 단백질의 흡수능이 보고되었다.

"알루미늄 포스페이트"로 알려진 보조제는 일반적으로 알루미늄 히드록시포스페이트이며, 때로는 소량의 술페이트(즉 알루미늄 히드록시포스페이트 술페이트)를 함유한다. 이들은 침전에 의하여 획득할 수 있으며, 침전시의 반응 조건 및 농도는 염 내의 히드록실에 대한 포스페이트의 치환도에 영향을 미친다. 히드록시포스페이트는 일반적으로 PO₄/Al 몰비가 0.3 내지 1.2이다. 히드록시포스페이트는 히드록실기의 존재에 의하여 완전한 AlPO₄와 구별될 수 있다. 예를 들어, 3164cm^-1에서의 IR 스펙트럼 밴드(예컨대, 200℃로 가열시)는 구조적 히드록실의 존재를 나타낸다[참고자료 112의 9장].

알루미늄 포스페이트 보조제의 PO₄/A1³⁺ 몰비는 일반적으로 0.3 내지 1.2이며, 바람직하게는 0.8 내지 1.2, 더 바람직하게는 0.95±0.1이다. 알루미늄 포스페이트는 일반적으로 무정형이며, 특히 히드록시포스페이트 염에서 그러하다. 일반적인 보조제는 무정형 알루미늄 히드록시포스페이트로서 PO₄/Al 몰비가 0.84 내지 0.92이며, 0.6㎎ Al³⁺/㎖를 포함한다. 알루미늄 포스페이트는 일반적으로 입자화된다(예컨대, 투과 전자 현미경으로 관찰시 판-유사 형태). 일반적인 입자의 직경은 어떠한 항원 흡착 후 0.5 내지 20㎛ (예컨대, 약 5 내지 10㎛) 범위 내이다. 알루미늄 포스페이트 보조제는 pH 7.4에서 ㎎ Al⁺⁺⁺ 당 0.7 내지 1.5 ㎎ 단백질의 흡착능이 보고되었다.

알루미늄 포스페이트의 제로 전하점(PZC)은 히드록실에 대한 포스페이트의 치환도에 밀접하게 연관되어 있으며, 이 치환도는 침전에 의한 염 제조시 사용되는 반응물의 반응 조건 및 농도에 의존하여 달라질 수 있다. PZC는 용액 내의 유리 포스페이트 이온의 농도를 변화시키거나(포스페이트 증가 = 산성 PZC 증가) 또는 히스티딘 버퍼와 같은 버퍼의 첨가(PZC를 더욱 염기성화)에 의해 변화된다. 본 발명에 따라 사용된 알루미늄 포스페이트는 일반적으로 PZC가 4.0 내지 7.0, 더 바람직하게는 5.0 내지 6.5, 예컨대 약 5.7이다.

본 발명 조성물의 제조에 사용된 알루미늄 염의 현탁액은 버퍼(예컨대, 포스페이트 또는 히스티딘 또는 트리스 버퍼)를 함유할 수 있지만 항상 요구되는 것은 아니다. 현탁액은 바람직하게는 무균 및 무발열원이다. 현탁액은 유리 수성 포스페이트 이온을 포함할 수 있으며, 예컨대 1.0 내지 2O mM, 바람직하게는 5 내지 15 mM, 더 바람직하게는 약 10 mM 농도로 존재한다. 현탁액은 염화 나트륨을 포함할 수 있다.

본 발명은 알루미늄 히드록시드와 알루미늄 포스페이트의 혼합물을 사용할 수 있다[81]. 이 경우 히드록시드보다 알루미늄 포스페이트가 더 존재할 수 있으며, 예컨대 중량비로 적어도 2:1, 예컨대, ≥5:1, ≥6:1, ≥7:1, ≥8:1, ≥9:1 등이다.

환자 투여용 조성물 내의 Al⁺⁺⁺의 농도는 바람직하게는 10㎎/㎖ 미만, 예컨대 ≤5 ㎎/㎖, ≤4 ㎎/㎖, ≤3 ㎎/㎖, ≤2 ㎎/㎖, ≤1 ㎎/㎖ 등이다. 바람직한 범위는 0.3 내지 1 ㎎/㎖이다. 최대 0.85㎎/투약량이 바람직하다.

하나 이상의 알루미늄 염 보조제를 포함할 뿐만 아니라, 보조제 성분은 하나 이상의 추가의 보조제 또는 면역자극제를 포함할 수 있다. 이러한 추가적인 성분은 3-O-데아실화 모노포스포릴 지질 A 보조제('3d-MPL'); 및/또는 수중유 에멀젼을 포함하나 이에 한정되지 않는다.

백신 조성물의 패키징

본 발명의 조성물(또는 키트 성분)에 적합한 용기는 바이알, 주사기(예컨대, 1회용 주사기), 비강 스프레이 등을 포함한다. 이들 용기는 멸균되어 있어야 한다.

조성물/성분이 바이알에 존재하는 경우, 바이알은 유리 또는 플라스틱 물질로 제조되는 것이 바람직하다. 바이알은 조성물이 첨가되기 전에 멸균되는 것이 바람직하다. 라텍스-민감성 환자의 문제를 피하기 위하여, 바이알은 라텍스가 없는 마개로 밀봉되는 것이 바람직하며, 모든 패키징 물질 내에 라텍스가 부재하는 것이 바람직하다. 바이알은 단일 투약량 백신을 포함할 수 있거나, 또는 1회 투약량 이상('다중투약' 바이알), 예컨대 10회 투약량을 포함할 수 있다. 바람직한 바이알은 무색 유리로 제조된다.

바이알은 캡(cap)(예컨대, Luer lock)을 구비하여 사전-충전 주사기가 캡에 삽입될 수 있고, 주사기의 성분이 바이알로 방출될 수 있으며(예컨대, 그 안에 동결건조된 물질의 재구성을 위해), 바이알의 성분이 주사기로 다시 이동될 수 있다. 바이알로부터 주사기 제거 후 바늘을 부착하여 조성물을 환자에게 투여할 수 있다. 캡은 밀봉부 또는 덮개 내부에 위치하여, 밀봉부 또는 덮개는 캡이 접근하기 전에 제거되어야 한다. 바이알은 이들 성분의 항균 제거를 허용하는 캡, 특히 다중투여 바이알용 캡을 구비할 수 있다.

성분이 주사기로 패키지되는 경우, 주사기는 이것에 부착된 바늘을 구비할 수 있다. 바늘이 부착되면, 별도의 바늘이 조립 및 사용을 위하여 주사기와 함께 공급될 수 있다. 이러한 바늘은 내장될 수 있다. 안전 바늘이 바람직하다. 1-인치 23-게이지, 1-인치 25-게이지 및 5/8-인치 25-게이지 바늘이 일반적이다. 주사기는 기록 유지를 용이하게 하기 위해 성분의 제품 번호, 인플루엔자 계절 및 유효 기간이 인쇄된 접착식 라벨과 함께 제공될 수 있다. 주사기의 플런저(plunger)는 흡인 동안 플런저가 사고로 제거되는 것을 예방하기 위하여 마개가 구비된 것이 바람직하다. 주사기는 라텍스 고무 캡 및/또는 플런저를 구비할 수 있다. 1회용 주사기는 단일 투약량의 백신을 함유할 수 있다. 주사기는 바늘 부착 전에 팁을 밀봉하기 위하여 팁 캡(tip cap)을 구비하는 것이 일반적이며, 팁 캡은 부틸 고무로 제조되는 것이 바람직하다. 주사기 및 바늘이 별도로 패키지되면, 이 후 바늘을 부틸 고무 차단재로 막는 것이 바람직하다. 바람직한 주사기는 상표 "Tip-Lok"™로 판매되는 것이다.

용기는 절반-투약량 부피을 표시하여 어린이에 대한 송달을 용이하게 할 수 있다. 예를 들면, 0.5㎖ 투약량를 함유하는 주사기는 0.25㎖ 부피를 나타내는 표시를 한다.

유리 용기(예컨대, 주사기 또는 바이알)가 사용되는 경우, 소다 라임 유리보다는 규산염 유리로 제조된 용기를 사용하는 것이 바람직하다.

키트 또는 조성물은 백신의 상세, 예컨대 투여 설명서, 백신 내의 항원의 상세 등을 포함하는 인쇄물을 (예컨대, 동일 박스에) 패키지할 수 있다. 설명서에는 경고문, 예컨대 예방접종 후 과민성 반응의 경우 쉽게 입수가능한 아드레날린 용액을 사용하라는 등의 경고문을 포함할 수 있다.

백신의 치료 및 투여 방법

본 발명은 본 발명에 따라 제조되는 백신을 제공한다.

본 발명에 따라 제조된 백신 조성물은 인간 환자로의 투여에 적합하며, 본 발명은 본 발명의 조성물을 환자에 투여하는 단계를 포함하는 환자에서 면역 반응을 일으키는 방법을 제공한다.

본 발명은 또한 의약품으로서 용도를 위한 본 발명의 조성물을 제공한다.

본 발명은 또한 환자에서 면역 반응을 일으키기 위한 의약품의 제조에서 본 발명에 따라 제조된 인플루엔자 바이러스 항원의 용도를 제공한다.

이들 방법 및 용도에 의하여 발생된 면역 반응은 일반적으로 항체 반응, 바람직하게는 보호성 항체 반응을 포함할 것이다. 항체 반응의 평가, 중화 능력 및 인플루엔자 바이러스 예방접종 후 보호에 대한 방법은 당해 기술 분야에 공지되어 있다. 인간 연구는 인간 인플루엔자 바이러스의 헤마글루티닌에 대한 항체 역가가 보호와 연관되어 있다는 것을 보여주었다(약 30-40의 혈청 시료 적혈구응집-억제 역가는 동종 바이러스에 의한 감염으로부터 약 50% 보호를 제공)[185]. 항체 반응은 일반적으로 적혈구응집 억제, 미세중화법, 일원 방사 면역확산(SRID), 및/또는 일원 방사 용혈(SRH)에 의하여 측정된다. 이들 분석 기술은 당해 기술 분야에 공지되어 있다.

본 발명의 조성물은 다양한 방식으로 투여될 수 있다. 가장 바람직한 예방접종 경로는 근육내 주입(예컨대 팔 또는 다리)에 의한 것이나, 다른 이용가능한 경로는 피하조직 주입, 비강내[186-188], 구강[189], 진피내[190,191], 경피, 피부[192] 등을 포함한다.

본 발명에 따라 제조된 백신은 성인 및 어린이 모두의 치료에 사용될 수 있다. 인플루엔자 백신은 현재 6개월령부터 소아 및 성인 면역에 사용되도록 제안되고 있다. 따라서, 환자는 1세 미만, 1 내지 5세, 5 내지 15세, 15 내지 55세, 또는 적어도 55세일 수 있다. 백신 투여에 바람직한 환자는 고령(예컨대 50세 이상, 60세 이상, 및 바람직하게는 65세 이상), 유아(예컨대 5세 이하), 입원 환자, 요양중인 작업자, 군인 및 군사 요원, 임산부, 만성 환자, 면역결핍 환자, 백신 투여 전 7일 이내에 항바이러스 화합물 (예컨대 오셀타미비르 또는 자나미비르 화합물; 하기 참조)을 투여한 환자, 난 알레르기가 있는 사람 및 해외 여행하는 사람이다. 백신은 이들 그룹에 단독으로 적합하지는 않지만, 그러나 집단적으로 보다 일반적으로 사용될 수 있다. 유행성 균주에 대해서는, 모든 연령의 그룹으로의 투여가 바람직하다.

바람직한 본 발명의 조성물은 효능에 대한 CPMP 기준 중 1, 2 또는 3을 만족한다. 성인의 경우(18-60세), 이들 기준은: (1) ≥70% 혈청방어율; (2) ≥40% 혈청전환율; 및/또는 (3) GMT의 ≥2.5배 증가이다. 고령자의 경우(>60세), 이들 기준은: (1) ≥60% 혈청방어율; (2) ≥30% 혈청전환; 및/또는 (3) GMT의 ≥2배 증가이다. 이들 기준은 적어도 50명의 환자를 대상으로 한 공개 표식 연구에 기초한다.

치료는 단일 투약 계획 또는 다중 투약 계획에 의할 수 있다. 다중 투약은 1차 면역 계획 및/또는 추가 면역 계획에 사용될 수 있다. 다중 투약 계획에서, 동일하거나 상이한 경로, 예컨대 비경구 프라임 및 점막 부스트, 점막 프라임 및 비경구 부스트 등에 의해 다양한 투약을 제공할 수 있다. 1회 투약 이상의 투여(일반적으로 2회 투약)는 특히 면역학적으로 미경험 환자, 예컨대 인플루엔자 백신을 전에 투여받은 경험이 없는 사람, 또는 신규의 HA 아형에 대한 접종(유행성 발병)에 유용하다. 다중 투약은 일반적으로 적어도 1주 간격(예컨대 약 2주, 약 3주, 약 4주, 약 6주, 약 8주, 약 10주, 약 12주, 약 16주 등)으로 투여될 것이다.

본 발명에 의하여 생산되는 백신은 다른 백신과 실질적으로 동시에, 예컨대 홍역 백신, 볼거리 백신, 풍진 백신, MMR 백신, 수두 백신, MMRV 백신, 디프테리아 백신, 파상풍 백신, 백일해 백신, DTP 백신, 컨쥬게이트된 H.인플루엔자 타입 b 백신, 불활성화 폴리오바이러스 백신, B형 간염 바이러스 백신, 수막구균 컨쥬게이트 백신 (예컨대 4가 A-C-W135-Y 백신), 호흡기 세포융합 바이러스 백신, 폐렴구균 컨쥬게이트 백신 등과 실질적으로 동시에(예컨대 동일한 의학적 자문 또는 의료 전문가나 예방접종 센터에 방문시에) 환자에 투여될 수 있다. 폐렴구균 백신 및/또는 수막구균 백신이 실질적으로 동시에 투여되는 것이 특히 노령의 환자에 유용하다.

이와 유사하게, 본 발명의 백신은 항바이러스 화합물, 특히 인플루엔자 바이러스에 대하여 활성인 항바이러스 화합물(예컨대, 오셀타미비르 및/또는 자나미비르)이 실질적으로 동시에(예컨대 동일한 의학적 자문 또는 의료 전문가 방문시에) 투여될 수 있다. 이들 항바이러스는 뉴라미다아제 억제제, 예컨대 (3R,4R,5S)-4-아세틸아미노-5-아미노-3(1-에틸프로폭시)-1-시클로헥센-1-카르복시산 또는 5-(아세틸아미노)-4-[(아미노이미노메틸)-아미노]-2,6-안하이드로-3,4,5-트리데옥시-D-글리세로-D-갈락토논-2-에논산 및 이들의 에스테르(예컨대 에틸 에스테르) 및 이들의 염(예컨대 포스페이트 염)을 포함한다. 바람직한 항바이러스는 (3R,4R,5S)-4-아세틸아미노-5-아미노-3(1-에틸프로폭시)-1-시클로헥센-1-카르복시산, 에틸 에스테르, 포스페이트(1:1)이며, 이는 오셀타미비르 포스페이트(TAMIFLU™)로도 알려져 있다.

일반

용어 "포함하는(comprising)"은 "포함(including)" 및 "이루어진(consisting)"을 포괄하며 예컨대 X를 "포함하는" 조성물은 배타적으로 X로 이루어질 수 있거나 또는 추가적인 무엇인가를 포함할 수 있으며, 예컨대 X + Y 이다.

단어 "실질적으로(substantially)"는 "완전히(completely)"를 배제하지 않으며, 예컨대 Y가 "실질적으로 없는" 조성물은 Y가 완전히 없을 수도 있다. 필요한 경우, 단어 "실질적으로"는 본 발명의 정의에서 생략될 수 있다.

수치 x에 관한 용어 "약"은, 예를 들어 x+10%를 의미한다.

특별한 언급이 없다면, 둘 이상의 성분이 혼합되는 단계를 포함하는 공정은 특정 혼합 순서를 요하는 것이 아니다. 따라서 성분들은 어떠한 순서로 혼합될 수도 있다. 세 성분이 존재하는 경우, 두 성분이 서로 결합될 수 있고, 그 후 제3 성분 등과 결합하여 조합될 수 있다.

동물(및 특히 소) 물질이 세포 배양에 사용되는 경우, 감염성 해면상뇌증(TSE), 및 특히 소 해면상뇌증(BSE)이 없는 공급원으로부터 획득하여야한다. 전체적으로, 동물-유래된 물질이 전부 부재인 배양 세포가 바람직하다.

화합물이 조성물의 일부로서 신체에 투여되는 경우, 그 화합물은 적합한 프로드러그로 대안적으로 대체될 수 있다.

도 1은 임상 표본으로부터 인플루엔자 바이러스의 분리의 도식을 나타낸다.

도 2는 MDCK-33016 세포에서 분리된 9개 바이러스 시료의 HA 역가를 비교한다. 각 시료에서 좌측 막대는 계대배양 2에서이고 우측 막대는 계대배양 5에서 이다.

도 3은 3개의 상이한 MDCK 세포 유형에서 성장된 인플루엔자 바이러스의 10개 시료의 HA 역가를 비교하였다. 각 시료에 대하여, 3개의 막대는 좌측, 현탁액 중의 33016; 중간, 점착성 33016; 및 우측, CCL-34 MDCK 세포이다.

도 4는 SNA 또는 MAA 렉틴에 대한 3개 바이러스의 결합을 나타낸다. 도 4A는 최초 분리체의 결합을 나타내고, 4B는 MDCK 33016 세포에서 성장 후 결합을 나타내고, 4C는 난에서 성장 후 결합을 나타낸다.

도 5 및 6은 3-SL 또는 6-SLN에 대한 바이러스의 결합을 나타낸다. 두 도면에 6개 군의 컬럼이 존재한다: 최좌측 3개는 상이한 농도(lμM, 0.5μM, 0.25μM)에서 3-SL에 대한 결합을 나타내고 최우측 3개는 상이한 농도(0.25μM, 0.125μM, 0.0625μM)에서 6-SLN에 대한 결합을 나타낸다. 6개군 각각에서, 각 컬럼은 상이한 바이러스를 나타낸다. 도 5에서, 3개의 컬럼은 좌측부터 우측으로 (i) 세포-분리된 바이러스; (ii) 난-분리된 바이러스; 및 (iii) 조류 바이러스이다. 도 6에서, 4개의 컬럼은 좌측부터 우측으로 (i) 난에서 2회 계대배양 후 바이러스; (ii) MDCK에서 2회 계대배양 후 바이러스; (iii) 난에서 5회 계대배양 후 바이러스; (iv) MDCK에서 5회 계대배양 후 바이러스이다.

환자 시료로부터 바이러스 분리

2006-2007 북반구 인플루엔자 계절 동안 인플루엔자 A 및/또는 B 바이러스 아형을 함유하는 임상 표본 (비강 또는 인후 스웝)을 어린이 및 성인으로부터 얻었다. 헤마글루티닌(HA) 역가의 측정, 중합효소 연쇄반응 (PCR) 및 바이러스 역가측정에 의해 무혈청 현탁 배양액에서 성장한 MDCK 33016 셀라인 (DSM ACC 2219)의 감수성 및 신뢰도를 수립된 MDCK CCL 34 셀라인(ATCC) 및 계란과 비교하였다.

248개 인플루엔자 양성 시료를 진단 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 식별하였다. 인플루엔자 바이러스 복제물과 분리물의 감수성 및 신뢰도를 MDCK 33016 셀 라인 및 계란에서 (i) 헤마글루티닌(HA) 역가; (ii) 바이러스 부하 측정을 위한 실시간 중합효소 연쇄 반응 (PCR); 및 (iii) 바이러스 역가에 의해 평가하였다. 최초 임상 표본과 MDCK 세포 및 계란에서 제2 계대배양으로부터의 분리체 내의 HA 유전자를 서열화함으로써 세포에서 이 복제 정확도를 평가하였다. 현탁액 MDCK 33016 세포에서 성장한 분리체로부터 얻어진 바이러스 역가를 플레이트에 점착된 MDCK 33016 세포로부터의 것과 비교하였다.

결과는 MDCK 33016 현탁액 셀라인의 분리능이 수립된 MDCK CCL 34 셀라인에 비해 우수하고, 계란의 것보다 매우 큰 것으로 나타났다. MDCK 33016 세포에서 바이러스 시료의 계대배양 후, 아미노산 치환이 분리체에서 확인되지 않았다. 반대로, 거의 모든 난-계대배양된 바이러스는 HA1 유전자에서 우세하게 하나 이상의 아미노산 치환을 함유하였다. 난에서 계대배양 후 관찰되는 HA 유전자의 항체 결합 부위에서의 돌연변이는 인플루엔자 바이러스의 항원성에 대한 변성을 초래할 수 있다.

급성 호흡기 질환이 있는 환자로부터 얻어진 임상 시료의 55%는 인플루엔자 양성으로 확인되었으며, 하기 바이러스 유형을 보유하였다: 79% A/H3N2; 12.5% A/H1N1; 1.6% B, 0.4% H3/B 및 6.5% 유형화불가. 임상 표본으로부터의 바이러스 분리는 MDCK 33016 세포를 사용하여 가능하였다(도 1). 반대로, 임상 표본으로부터 난으로 주입된 바이러스 중에서는 아무것도 성공적으로 분리되지 않았다. 새로 제조된 닭의 배아 섬유아세포(CEF)로 유사한 음성 결과가 얻어졌다. 난에서 인플루엔자 바이러스의 분리 및 수립은 오직 양성 HA 역가를 갖는 MDCK 33016 배양액의 상 청액을 사용하여 이루어질 수 있었다.

각 세포로부터의 제1 수확물은 참조 목적으로 난에 더 접종되었다. 각 접근을 사용하는 성공적인 바이러스 분리체의 수는 도 1에서 박스에 나타내며, 주입된 상이한 바이러스 유형의 수도 나타낸다. MDCK 33016 세포로부터 분리된 모든 3개의 바이러스 아형은 달갈에서 제2 계대배양 후 적당한 HA (>32) 및 바이러스 역가 (>1x10⁶)를 얻었으며, 두 역가는 추가의 계대배양으로 증가하였다(도 2).

현탁액에서 성장하는 MDCK 33016 세포는 모든 3개의 아형에 대한 임상 스웝으로부터의 인플루엔자 바이러스의 분리체에 대하여 점착된 셀라인(CCL-34)에 비하여 우수하였다. 현탁액 셀라인은 회수율로 입증된 바와 같이 양성 인플루엔자 스웝 물질에 대하여 높은 민감성을 나타내었다(표 1). 최초 분리체에 대하여 MDCK 33016 세포와 난에서의 상이한 계대배양 사이에 HA 서열을 비교하였고(표 2), 5회 계대배양 후에도 MDCK 33016 세포에서 분리된 인플루엔자 A 균주에 대하여 돌연변이가 발견되지 않은 반면, 난에서 분리된 인플루엔자 A 균주는 2회 계대배양 후 HA 단백질의 항체 결합 부위에서 돌연변이가 발견되었다. MDCK 33016 세포 또는 난에서 분리된 인플루엔자 B 균주에 대하여 돌연변이는 발견되지 않았다.

점착된 MDCK 33016 세포와 비교하여 현탁액 MDCK 33016 세포에서 분리체의 복제 후에 적어도 하나의 측정 수준 중 높은 바이러스 수율이 발견되었다(도 3).

따라서 MDCK 33016 현탁 셀라인은 계란과 비교하여 더 큰 분리능을 제공하므로 야생형 인플루엔자 균주의 분리 및 복제에 대하여 이상적인 시스템이다. 또한, 높은 복제 정확성 때문에, 인간 인플루엔자 백신의 생산을 위한 세포-기반 분리체의 사용은 더욱 확실한 백신을 유도할 수 있다. 순환하는 야생형 균주와 백신에 함유된 것 사이의 개선된 매치는 백신에 대하여 인플루엔자에 대한 더 큰 보호를 제공한다.

결론적으로 (a) 모든 바이러스 균주는 난에 비하여 MDCK 33016 세포에서 성공적으로 분리되었고; (b) MDCK 33016 세포로부터 분리된 바이러스 균주는 난에서 성공적으로 증식될 수 있었고; (c) 모든 3개의 인플루엔자 바이러스 아형의 회수율은 점착 세포와 비교했을 때 현탁액에서 성장한 MDCK 33016 세포보다 우수하고; 그리고 (d) 초기 물질과 비교했을 때 HA 유전자의 치환은 MDCK 33016 세포에서 성장한 분리체 중 어떤 것도 존재하지 않았지만, 난에서 제2 계대배양 후에 존재하였다. 따라서 MDCK 33016 현탁 셀라인은 임상 분리체로부터 야생형 인플루엔자 바이러스를 계대배양하는데 매우 신뢰할 수 있으며 야생형 바이러스의 확실한 특성을 보존하기 때문에 인간 인플루엔자 바이러스 아형의 분리 및 증식에 매우 적합한 기질이다.

수용체 결합

난-성장된 바이러스 및 MDCK-성장된 바이러스의 최초 분리된 바이러스의 수용체 선호를 조사하였다. 연구는 2,3-시알릴 연결 (MAA) 또는 2,6-시알릴 연결 (SNA), 또는 2,3-시알릴락토스 (3-SL, 난 수용체의 유사체) 및 2,6-시알릴-N-아세틸락토스아민 (6-SLN, 인간 수용체의 유사체) 시알릴글리코폴리머를 갖는 렉틴을 사용하였다[193].

도 4는 대표 연구 결과를 나타낸다. 라벨화된 피크는 SNA 또는 MAA 렉틴에 대한 결합을 나타낸다. 최초 바이러스 (4A) 및 MDCK 33016 (4B)에서 성장한 바이러스는 SNA 및 MAA에 대하여 뚜렷한 피크를 갖는 반면, SNA & MAA 피크는 난-성장된 바이러스(4C)에 대하여 실질적으로 오버랩된다. .

3-SL 및 6-SLN을 사용하여 그 후 실험에서 결합 특이성도 시험하였다. 실시예 결과를 도 5에 나타낸다. 그래프의 좌측 상의 결합은 조류 수용체 선호를 나타내는 한편, 우측 상의 결합은 인간 수용체 선호를 나타낸다. 도 5에서 볼 수 있듯이, 세포- 분리된 바이러스는 인간 수용체에 대하여 매우 우호적이다.

도 6은 현탁액에서 난 또는 MDCK 33016에서 2회 또는 5회 계대배양 후 Stuttgart 분리체 (A/H1N1)를 사용한 데이터를 나타낸다. MDCK-계대배양된 바이러스는 6-SLN에 대하여 강한 선호를 나타낸다.

결론적으로, 모든 MDCK-성장된 임상 인간 A 및 B 바이러스는 3-SL 보다도 6-SLN에 결합하며, 단 일부 분리체는 이 분석에서 어디에도 결합하지 않는 것으로 확인되었다. 최초 임상 분리체와 달리, 난-적응된 바이러스는 3-SL에 결합하거나 또는 3-SL에도 6-SLN에도 결합하지 않는다.

난에서 성장에 의한 변화

인플루엔자 A 및 B 바이러스의 여러 균주는 MDCK 세포에서 분리된 후 하기 기질 중 하나를 통해 5회 계대배양 된다: 난; MDCK 세포 CCL-34; MDCK 세포 33016; 베로 세포; 또는 HEK 293-T 세포. 바이러스의 HA 유전자는 각 계대배양 후 서열화되고 HA 역가가 측정된다.

일부 균주(예컨대 A/H1N1/Bayern/7/95)에 대한 HA 서열이 난 및 MDCK 33016을 통한 계대배양 동안 안정하였지만, 나머지는 그렇지 않았다. 예컨대, A/H1N1/Nordrhein Westfalen/1/05의 HA 서열은 난을 통한 2회 계대배양 후 항체 결합 부위 D에서 돌연변이 D203N를 획득하였고, 2회 이상의 계대배양 후 추가적으로 R329K을 획득하였다. 반대로, 서열은 MDCK 33016을 통해 동시 계대배양된 바이러스에서 변화되지 않았다.

이 A/HlNl/NRW/1/05 균주에 대하여, 베로 세포와 배양되었을 때 성장은 목격되지 않았다. 다른 4개 기질은 그것의 성장을 지원할 수 있었지만, HA 역가는 변하였다. 예컨대, 32-256의 역가가 난에서 목격되었지만, 293-T 세포는 낮은 역가(16-32)를 제공하였고 MDCK 33016은 높은 역가(32-512)를 제공하였다.

본 발명을 실시예에 의해서 설명하였고 본 발명의 범위 및 본질 내에서 변화가 이루어질 수 있다는 것으로 이해될 것이다.

Claims (51)

1. (i) 환자로부터 또는 일차 분리체로부터 직접 얻어진 인플루엔자 바이러스로 셀라인을 감염시키는 단계; (ii) 단계 (i)에서 얻어진 감염된 셀라인으로부터의 바이러스를 1회 이상 계대배양하는 단계; 및 (iii) 단계 (ii)로부터의 감염된 셀라인을 배양하여 종자 바이러스로서 사용하기 위한 인플루엔자 바이러스를 생산하는 단계를 포함하고, 단계 (ⅰ)에서 사용되는 인플루엔자 바이러스는 인플루엔자 B 바이러스이거나 또는 인플루엔자 A 바이러스의 H1 또는 H3 균주인, 백신 제조를 위한 인플루엔자 종자 바이러스의 제조방법.
2. (i) 환자로부터 또는 일차 분리체로부터 직접 얻어진 인플루엔자 바이러스로 셀라인을 감염시키는 단계; (ii) 단계 (i)에서 얻어진 감염된 셀라인에 의해 생산된 인플루엔자 바이러스의 하나 이상의 바이러스성 RNA 분절의 cDNA를 제조하고, 역유전학 과정에서 cDNA를 사용하여 단계 (i)의 인플루엔자 바이러스와 공통된 하나 이상의 바이러스성 RNA 분절을 갖는 신규 인플루엔자 바이러스를 제조하는 단계; 및 (iii) 신규 인플루엔자 바이러스로 셀라인을 감염시킨 후 이 셀라인을 배양하여 종자 바이러스로서 사용하기 위한 신규 인플루엔자 바이러스를 생산하는 단계를 포함하는, 백신 제조를 위한 인플루엔자 종자 바이러스의 제조방법.
3. 제1항에 있어서, 단계 (ⅱ)에서의 계대배양은 단계 (ⅰ)에서 사용한 것과 동 일한 유형의 세포에 의한 것을 특징으로 하는 방법.
4. 선행항 중 어느 한 항에 있어서, 단계 (ⅰ), (ⅱ) 또는 (ⅲ) 중 어느 것도 난에서 인플루엔자 바이러스의 성장 또는 계대배양을 수반하지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
5. 선행항 중 어느 한 항에 있어서, 셀라인은 비인간 포유류 셀라인인 것을 특징으로 하는 방법.
6. 선행항 중 어느 한 항에 있어서, 셀라인은 MDCK 셀라인인 것을 특징으로 하는 방법.
7. 선행항 중 어느 한 항에 있어서, 종자 바이러스는 서열화되는 것을 특징으로 하는 방법.
8. 선행항 중 어느 한 항에 있어서, 종자 바이러스는 항혈청을 도출하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
9. 선행항 중 어느 한 항에 있어서, 종자 바이러스는 제조용 종자를 다량으로 제조하는데 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
10. 선행항 중 어느 한 항에 있어서, 종자 바이러스는 백신 제조를 위해 사용되는 것을 특징으로 하는 방법.
11. 선행항 중 어느 한 항에 있어서, 종자 바이러스 게놈은 PR/8/34 분절을 갖지 않는 것을 특징으로 하는 방법.
12. 선행항 중 어느 한 항에 있어서, 종자 바이러스는 Sia(α2,3)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 비하여 Sia(α2,6)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 대한 결합을 선호하는 헤마글루티닌을 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
13. (i) 개체군에서 순환하거나 또는 개체군에서 순환하는 인플루엔자 바이러스의 항원 대표인 헤마글루티닌을 갖는 인플루엔자 바이러스를 얻는 단계; (ii) 단계 (i)에서 얻어진 인플루엔자 바이러스로 셀라인을 감염시키는 단계; (iii) 단계 (ii)에서 얻어진 감염된 셀라인으로부터의 바이러스를 1회 이상 계대배양하여 종자 균주를 제공하는 단계; 및 (iv) 단계 (iii)로부터의 종자 균주를 배양하여 인플루엔자 바이러스를 생산하는 단계를 포함하는, 백신 제조를 위한 인플루엔자 바이러스의 제조방법.
14. (i) 개체군에서 순환하거나 또는 개체군에서 순환하는 인플루엔자 바이러스 의 항원 대표인 헤마글루티닌을 갖는 인플루엔자 바이러스를 얻는 단계; (ii) 단계 (i)에서 얻어진 인플루엔자 바이러스로 셀라인을 감염시키는 단계; (iii) 단계 (i)에서 얻어진 감염된 셀라인에 의해 생산된 인플루엔자 바이러스의 하나 이상의 바이러스성 RNA 분절의 cDNA를 제조하고, 역유전학 과정에서 cDNA를 사용하여 단계 (i)의 인플루엔자 바이러스와 공통된 하나 이상의 바이러스성 RNA 분절을 갖는 인플루엔자 종자 바이러스를 제조하는 단계; 및 (iv) 인플루엔자 종자 바이러스로 셀라인을 감염시킨 후 단계 (iii)으로부터의 계대배양된 셀라인을 배양하여 인플루엔자 바이러스를 생산하는 단계를 포함하는, 백신 제조를 위한 인플루엔자 바이러스의 제조방법.
15. 제13항 또는 제14항의 단계 (ⅰ) 내지 (ⅳ), 및 그 다음 (ⅴ) 단계 (ⅳ)에서 얻어진 바이러스를 처리하여 백신을 제공하는 단계를 포함하는 인플루엔자 바이러스 백신의 제조방법.
16. 제15항에 있어서, 단계 (ⅴ)는 바이러스의 불활성화를 수반하는 것을 특징으로 하는 방법.
17. 제16항에 있어서, 백신은 완전한 비리온 백신인 것을 특징으로 하는 방법.
18. 제16항에 있어서, 백신은 분할 비리온 백신인 것을 특징으로 하는 방법.
19. 제16항에 있어서, 백신은 표면 항원 백신인 것을 특징으로 하는 방법.
20. 제16항에 있어서, 백신은 바이로좀 백신인 것을 특징으로 하는 방법.
21. 제15항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서, 백신은 투약량 당 10ng 미만의 잔류 숙주 세포 DNA를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
22. 다수의 개별 인플루엔자 바이러스 균주에 대하여 제15항 내지 제21항 중 어느 한 항의 방법을 행하는 단계, 및 개별 백신을 혼합하여 다가 인플루엔자 백신을 제조하는 단계를 포함하는 다가 인플루엔자 백신의 제조방법.
23. 제22항에 있어서, 다가 인플루엔자 백신은 두개의 인플루엔자 A 바이러스 균주 및 하나의 인플루엔자 B 바이러스 균주를 갖는 것을 특징으로 하는 방법.
24. 제15항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서, 백신은 실질적으로 수은이 없는 것을 특징으로 하는 방법.
25. 제15항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서, 백신은 보조제를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
26. (i) 동물에게 정제된 인플루엔자 바이러스 헤마글루티닌을 투여하는 단계; 및 그 다음 (ii) 동물로부터 헤마글루티닌을 인식하는 항체를 함유하는 혈청을 회수하는 단계를 포함하고, 단계 (i)에서 사용되는 헤마글루티닌이 셀라인에서 성장한 바이러스로부터 유래하는 것을 특징으로 하는, 동물로부터 항혈청을 제조하기 위한 방법.
27. (i) 셀라인에서 인플루엔자 바이러스를 성장시키는 단계; (ii) 단계 (i)에서 성장된 바이러스로부터 헤마글루티닌 항원을 정제하는 단계; (iii) 단계 (ii)로부터의 정제된 헤마글루티닌을 동물에게 투여하는 단계; 및 그 다음 (iv) 동물로부터 헤마글루티닌을 인식하는 항체를 함유하는 혈청을 회수하는 단계를 포함하는, 동물로부터 항혈청을 제조하기 위한 방법.
28. 제26항 또는 제27항에 있어서, 동물은 양인 것을 특징으로 하는 방법.
29. 제26항 내지 제 28항 중 어느 한 항에 있어서, 항혈청을 SRID 분석에 적합한 겔과 혼합하는 추가 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
30. 제26항 내지 제28항 중 어느 한 항의 방법에 의해 얻을 수 있는 항혈청.
31. (i) 셀라인에서 인플루엔자 바이러스를 성장시키는 단계; (ii) 단계 (i)에서 성장한 바이러스를 정제하는 단계; (iii) 바이러스를 불활성화시키는 단계; 및 (iv) 불활성화된 바이러스를 동결건조하는 단계를 포함하고, 단계 (i)에서 사용되는 인플루엔자 바이러스는 난에서는 성장시키지 않는 것을 특징으로 하는, 항원 표준 물질을 제조하기 위한 방법.
32. 현탁 배양액에서 성장하는 MDCK 세포와 함께 환자 시료를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 환자 시료로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 방법.
33. 무혈청 배지에서 성장하는 MDCK 세포와 함께 환자 시료를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 환자 시료로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 방법.
34. 무단백질 배지에서 성장하는 MDCK 세포와 함께 환자 시료를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 환자 시료로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 방법.
35. 비종양형성성 MDCK 세포와 함께 환자 시료를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 환자 시료로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 방법.
36. 중층 배지가 제공되지 않은 MDCK 세포와 함께 환자 시료를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 환자 시료로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 방법.
37. 무혈청 현탁 배양액에서 성장하는 MDCK 세포와 함께 환자 시료를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 환자 시료로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 방법.
38. 무단백질 현탁 배양액에서 성장하는 MDCK 세포와 함께 환자 시료를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 환자 시료로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 방법.
39. 현탁 배양액에서 성장하는 비종양형성성 MDCK 세포와 함께 환자 시료를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 환자 시료로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 방법.
40. 무혈청 현탁 배양액에서 성장하는 비종양형성성 MDCK 세포와 함께 환자 시료를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 환자 시료로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 방법.
41. 무단백질 현탁 배양액에서 성장하는 비종양형성성 MDCK 세포와 함께 환자 시료를 인큐베이션하는 단계를 포함하는 환자 시료로부터 인플루엔자 바이러스를 분리하는 방법.
42. 제32항 내지 제41항 중 어느 한 항의 방법에 의해 분리된 인플루엔자 바이러 스.
43. (i) 제1 세트의 게놈 분절을 갖는 인플루엔자 바이러스의 제1 균주와 제2 세트의 게놈 분절을 갖는 인플루엔자 바이러스의 제2 균주 모두로 셀라인을 감염시키는 단계로서, 이때 제1 균주는 원하는 헤마글루티닌을 인코딩하는 HA 분절을 갖는 단계; 및 (ii) 단계 (i)로부터 감염된 세포를 배양하여 제1 세트의 게놈 분절로부터 하나 이상의 분절 및 제2 세트의 게놈 분절로부터 하나 이상의 분절을 갖는 인플루엔자 바이러스를 생산하는 단계로서, 단 제1 세트의 게놈 분절로부터의 상기 하나 이상의 분절은 제1 균주로부터의 HA 분절을 포함하는 단계를 포함하는, 재배열 인플루엔자 바이러스의 제조방법.
44. (i) 난 기질에서 증식되지 않은 인플루엔자 바이러스를 수취하는 단계; (ii) 이 인플루엔자 바이러스로 셀라인을 감염시키는 단계; 및 (iii) 단계 (ii)로부터의 감염된 세포를 배양하여 인플루엔자 바이러스를 생산하는 단계를 포함하는, 백신에 사용하기 위한 인플루엔자 바이러스 항원의 제조방법.
45. (i) MDCK 33016 세포에서 분리된 인플루엔자 바이러스를 수취하는 단계; (ii) 이 인플루엔자 바이러스로 셀라인을 감염시키는 단계; 및 (iii) 단계 (ii)로부터의 감염된 세포를 배양하여 인플루엔자 바이러스를 생산하는 단계를 포함하는 백신에 사용하기 위한 인플루엔자 바이러스 항원의 제조방법.
46. (i) 혈청-함유 배지에서 성장한 기질에서 증식되지 않은 인플루엔자 바이러스를 수취하는 단계; (ii) 이 인플루엔자 바이러스로 셀라인을 감염시키는 단계; 및 (iii) 단계 (ii)로부터의 감염된 세포를 배양하여 인플루엔자 바이러스를 생산하는 단계를 포함하는, 백신에 사용하기 위한 인플루엔자 바이러스 항원의 제조방법.
47. (i) 역유전학 기술을 사용하여 발생한 인플루엔자 바이러스를 수취하는 단계; (ii) 이 인플루엔자 바이러스로 셀라인을 감염시키는 단계; 및 (iii) 단계 (ii)로부터의 감염된 세포를 배양하여 인플루엔자 바이러스를 생산하는 단계를 포함하는, 백신에 사용하기 위한 인플루엔자 바이러스 항원의 제조방법.
48. (i) PR/8/34 인플루엔자 바이러스로부터의 6개 미만의 바이러스성 분절을 갖는 인플루엔자 A 바이러스를 수취하는 단계; (ii) 이 인플루엔자 바이러스로 셀라인을 감염시키는 단계; 및 (iii) 단계 (ii)로부터의 감염된 세포를 배양하여 인플루엔자 바이러스를 생산하는 단계를 포함하는, 백신에 사용하기 위한 인플루엔자 바이러스 항원의 제조방법.
49. (i) AA/6/60 인플루엔자 바이러스로부터의 6개 미만의 바이러스성 분절을 갖는 인플루엔자 A 바이러스를 수취하는 단계; (ii) 이 인플루엔자 바이러스로 셀라 인을 감염시키는 단계; 및 (iii) 단계 (ii)로부터의 감염된 세포를 배양하여 인플루엔자 바이러스를 생산하는 단계를 포함하는, 백신에 사용하기 위한 인플루엔자 바이러스 항원의 제조방법.
50. (i) Sia(α2,3)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 비하여 Sia(α2,6)Gal 말단 이당류를 갖는 올리고당에 대한 결합을 선호하는 헤마글루티닌을 갖는 인플루엔자 바이러스를 수취하는 단계; (ii) 이 인플루엔자 바이러스로 셀라인을 감염시키는 단계; 및 (iii) 단계 (ii)로부터의 감염된 세포를 배양하여 인플루엔자 바이러스를 생산하는 단계를 포함하는, 백신에 사용하기 위한 인플루엔자 바이러스 항원의 제조방법.
51. (i) 계란에서 발견되지 않는 헤마글루티닌 및/또는 뉴라미니다아제 당형태를 갖는 인플루엔자 바이러스를 수취하는 단계; (ii) 이 인플루엔자 바이러스로 셀라인을 감염시키는 단계; 및 (iii) 단계 (ii)로부터의 감염된 세포를 배양하여 인플루엔자 바이러스를 생산하는 단계를 포함하는, 백신에 사용하기 위한 인플루엔자 바이러스 항원의 제조방법.

Images