KR20090043559A - 중간엽 줄기세포 조절배지 - Google Patents

중간엽 줄기세포 조절배지 Download PDF

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Abstract

본 발명자들은 조절화된 세포 배양 배지를 제조하는 방법, 하기의 단계를 포함하는 방법을 기술한다: (a) 중간엽 줄기세포(MSC), 이들의 후손 또는 세포 배양배지에서 이들로부터 유래된 세포주를 배양; 및 (b) 선택적으로 세포 배양 배지를 분리; 여기서 중간엽 줄기세포(MSC)는 FGF2를 포함하는 무혈청배지에서 공동배양의 부재시 배아줄기(ES)세포 콜로니 또는 이들의 후손을 분산시켜 수득된 세포를 증식시킴으로써 수득된다.
Figure 112009015038987-PCT00001
조절배지, 배아줄기세포, 배양, 중간엽 줄기세포, 배상체, 질병

Description

중간엽 줄기세포 조절배지{MESENCHYMAL STEM CELL CONDITIONED MEDIUM}
참고문헌은 2006년 8월 15일에 출원된 국제 출원번호 PCT/SG2006/000232를 포함하고 있으며 미국을 지정국으로 하였으며(출원인: Agency for Science, Technology and Research) 발명자 림(Lim)은 공동 발명자이다. 또한 참고문헌은 2007년 1월 3일에 출원된 미국 잠정출원번호 제60/878,222호를 포함하고 있다.
전술한 출원, 현재 및 전술한 출원으로부터 인용되거나 참고된 각각의 문헌, 전술한 출원 각각의 실행(prosecution)을 포함("출원 및 문서에서 인용된 조항") 및 각각의 전술한 출원 및 조항 및 문헌에서 인용된 본 출원 및 조항 중에서 인용되거나 언급된 생산품에 대한 제조업자의 지침 또는 카탈로그는 이로써 참고문헌으로 본 명세서에 포함되어 있다. 더욱이 본 명세서에서 인용된 모든 문헌, 본 명세서에서 인용된 문헌에서 인용되거나 참고된 모든 문헌, 본 명세서 또는 어떤 문헌에서 인용되거나 언급된 생산품에 대한 제조업자의 지침 또는 카탈로그는 이로써 참고문헌으로 본 명세서에 포함되었다. 본 명세서 또는 지침서(teachings) 내에서 참고문헌으로 포함된 문헌은 본 발명의 실행을 위해 사용될 것이다. 본 명세 서 내에서 참고문헌으로 포함된 문헌은 선행 기술로 인정되지는 않을 것이다.
본 발명은 세포 생물학, 분자생물학 및 유전학의 개발 분야에 관한 것이다. 특히 본 발명은 배아줄기세포(embryonic stem cells)로부터 중간엽 줄기세포(mesenchymal stem cell)를 유도하는 방법에 관한 것이다.
분화된 세포와는 달리 줄기세포는 분열능을 지니며 자가 갱신(self-renew) 또는 표현형 및 기능면에서 상이한 딸세포로의 분화능을 지닌다(Keller, Genes Dev. 2005;19:l 129-1155; Wobus and Boheler, Physiol Rev. 2005;85:635-678; Wiles, Methods in Enzymology. 1993;225:900-918; Choi et al, Methods MoI Med. 2005;105:359-368).
중간엽 줄기세포(MSCs)는 근육골격 손상의 치료, 심장혈관계 질환에서 심장 기능의 개선 및 이식편대숙주질환(GVHD)의 중증도의 개선에 관한 치료 효과의 문헌에 의해 입증된 증거를 지니는 다능성 줄기세포(multipotent stem cells)이다(Le Blanc and Pittenger, 2005). 계통에 의해 한정되기는 하나, 중간엽세포 타입, 예를 들면 지방세포(adipocytes), 연골세포(chondrocytes) 및 골세포(osteocytes)를 분화시키는 강한 잠재성을 지니며, 기형종(teratoma) 형성의 위험성이 크지는 않다. 이식된 MSCs의 주 면역 거부는 자가 또는 동종이형 이식을 통해 일상적으로 회피된다. MSCs는 골수(BM), 지방조직(ad), 제대혈액을 포함하는 여러 개의 성체 조직으로부터 분리될 수 있으며, 생체 밖에서 증식될 수 있다.
그러나 이들의 분리에 대한 조직의 유효성은 제한성을 남기며 위험한 관혈적 시술을 요구로 하고 생체 밖에서의 MSCs의 증식 동안 제한된다.
임상적 및 전-임상적 적용에 대한 광범위한 질병 치료, 근골격 조직 생체공학[A3,A4] 및 심장병[A5,A6]에 대한 광범위한 질병 [Al, A2] 예를 들면 GVHD [Al]를 치료하는 MSCs의 치료 능력은 많은 상이한 수복성 세포 타입을 분화시키는 잠재능력에 기여해왔다.
그러나 손상된 조직 또는 기관, 치료상의 관련된 수에서 기능적인 수복성 세포를 분화시키는 이식된 MSCs의 효율성은 적절하게 문서에 의해 입증되거나 증명되지는 않았다.
본 발명은 당분야의 방법과 함께 이와 관련된 문제들의 해결책을 강구하는 것이다.
발명의 요약
본 발명에 따르면, 줄기세포를 사용하는 대신에 손상되거나 손실된 조직은 MSCs 그 자체 또는 이에 첨가하여 MSCs로부터의 분비물을 적용시킴으로써 내부 조직의 복구 향상을 통해 재생되거나 복구된다.
구체적으로, 본 발명자들은 인간배아줄기세포로부터 유도된 MSCs의 질병 치료용 배양을 위한 조절배지를 제공한다. 따라서 조절배지는 질병의 치료에 사용되며 ES 세포, 구체적으로 MSCs는 적절한 처리에 의해 처방된다.
본 발명자들은 MSCs에 의해 분비된 폴리펩티드의 동일성 확인을 기술하며, 이는 조절배지의 성분으로부터 확인된다. MSCs 분비물 내의 하나 또는 그 이상의 특이한 생물학적 활성 성분을 포함하는 특히 하나 또는 그 이상의 794 폴리펩티드의 화합물인 조성물은 이러한 치료시 조절배지를 사용하는 것이 명백해질 것이다.
이러한 접근을 통해, 세포 기반 치료법 예를 들면 면역 적합성, 종양면역법(tumorigenicity), 제노주틱(xenozootic) 감염, 비용 및 대기 시간과 같은 현재의 혼란을 주는 이슈는 자가세포 준비의 사용으로 제거될 것이다.
이러한 접근은 더 우수한 품질관리 및 일관성과 함께 적절한 가격으로 잠재적으로 MSC-기반 치료법의 "오프-더-셀프" 개선을 제공한다.
다른 지시사항이 없으면 화학의 통상적인 기술, 분자 생물학, 미생물학, 재조합 DNA 및 면역학으로 당업자의 능력 내에서 본 발명의 실행이 수행될 것이다. 이러한 기술은 본 문헌 내에서 기술된다. 예를 들면 J. Sambrook, E. F. Fritsch, and T. Maniatis, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Second Edition, Books 1-3, Cold Spring Harbor Laboratory Press; Ausubel, F. M. et al. (1995 and periodic supplements; Current Protocols in Molecular Biology, ch. 9, 13, and 16, John Wiley & Sons, New York, N. Y.); B. Roe, J. Crabtree, and A. Kahn, 1996, DNA Isolation and Sequencing: Essential Techniques, John Wiley & Sons; J. M. Polak and James O'D. McGee, 1990, Oligonucleotide Synthesis: A Practical Approach, IrI Press; D. M. J. Lilley and J. E. Dahlberg, 1992, Methods ofEnzymology: DNA Structure Part A: Synthesis and Physical Analysis of DNA Methods in Enzymology, Academic Press; Using Antibodies : A Laboratory Manual : Portable Protocol NO. I by Edward Harlow, David Lane, Ed Harlow (1999, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-544-7); Antibodies : A Laboratory Manual by Ed Harlow (Editor), David Lane (Editor) (1988, Cold Spring Harbor Laboratory Press, ISBN 0-87969-314-2), 1855; and Lab Ref: A Handbook of Recipes, Reagents, and Other Reference Tools for Use at the Bench, Edited Jane Roskams and Linda Rodgers, 2002, Cold Spring Harbor Laboratoiy, ISBN 0-87969-630-3을 참고하라. 각각의 일반적인 문헌은 참고문헌으로 본 명세서에 포함된다.
실시예는 인간 ESC-유래 MSCs(hESC-MSCs)의 프로테옴을 분석하는 실험을 기술한다.
실시예 7∼15에 나타난 바와 같이, 상기 hESC-MSCs는 성체 골수 유래 MSCs(BM-MSCs)와 유사한 발현 프로파일을 지닌다. 이 결과는 본 명세서에 기술된 방법에 의해 유래된 MSCs는 이의 골수 유래 대응체와 생물학적 유사성을 나타내는 것으로, 예를 들면 측분비(paracrine) 인자를 분비하는 능력을 지닌다는 것을 증명한다. 따라서 상기 hESC-MSCs는 BM-MSCs가 적합한 경우에는 어떤 목적이든 사용할 수 있다.
더욱이 본 발명자들은 hESC-MSCs의 배양에 적합한 조절배지를 제공한다. 이러한 조절배지는 독특한 유전자 산물을 포함하며, hESC-MSC에 의해 분비된 분자를 포함한다. 특별한 단백질 또는 폴리펩티드를 포함하는 이러한 조절배지 및 그것에 포함된 분자들의 결합은 질병의 치료에 사용된다. 이들은 질병의 치료 또는 예방을 위한 목적으로 hESC-MSCs의 활성 보충제로 사용될 수 있다.
조절배지는 미리 정해진 시간동안 세포 배양 배지와 같은 배지에서 MSCs를 배양함으로써 제조된다. 특히 상기 MSCs는 본 명세서에 기술된 방법에 의해 제조된 산물을 포함한다. 상기 조절배지는 실시예에 기술된 바와 같이 MSCs에 의해 분비된 폴리펩티드를 포함할 것이다.
상기 조절배지는 그대로 치료법에 사용되거나, 하나 또는 그 이상의 치료 단계 후에 사용된다. 예를 들면 상기 조절배지는 UV 처리, 필터 살균 등등 처리된다. 하나 또는 그 이상의 정제 단계가 포함된다.
특히 상기 조절배지는 농축 예를 들면 투석 또는 한외여과된다. 예를 들면 상기 배지는 실시예 3K의 공칭 분자량 제한(NMWL)으로 한외여과막을 사용하여 농축된다.
또한 본 발명자들은 실시예에 기술된 폴리펩티드를 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 전부를 포함하는 성분을 제공하거나 이러한 조절배지의 보충제를 제공한다.
MSC 조절배지에 의해 치료할 수 있는 질병
hESC-MSCs의 프로테옴의 분석은 발현된 단백질이 하기를 포함하는 많은 생물학적 공정과 관련된다는 것을 나타낸다: 혈관형성, 조혈 및 골격 발달을 포함하는 대사, 방어반응 및 조직 분화. 따라서 본 발명자들은 하기에 기술된 생물학적 공정의 조절에 관하여 일반적으로 hESC-MSCs의 용도 또는 hESC-MSCs에 의해 조절배지를 제공한다.
본 발명자들은 하기의 하나 또는 그 이상을 포함하는 경로의 조절에 관하여 hESC-MSCs의 용도 또는 hESC-MSCs에 의해 조절배지를 제공한다: Rho GTPase에 의한 세포골격 조절, 세포 주기, 인테그린 신호 경로, 케모카인 & 사이토카인 신호 경로에 의해 매개된 염증, FGF 신호 경로, EGF 수용체 신호 경로, 혈관형성, 플라미스노겐 활성 케스케이드, 혈액 응고, 해당작용, 유비퀴틴 프로테아좀 경로, 신생 퓨린 생합성, TCA 회로, 페닐알라닌 생합성, 헴 생합성 등이다.
또한 본 발명자들은 하기의 하나 또는 그 이상을 포함하는 공정의 조절에 관하여 hESC-MSCs의 용도 또는 hESC-MSCs에 의해 조절배지를 제공한다: 세포 구조 및 운동성, 세포 구조, 세포 커뮤니케이션, 세포 운동성, 세포 유착, 엔도사이토시스, 마이토시스, 엑소사이토시스, 세포질분열, 세포 주기, 면역 및 방어, 사이토카인/케모카인 매개 면역, 대식세포-매개 면역, 과립백혈구-매개 면역, 리간드-매개 신호, 사이토카인 및 케모카인 매개 신호 경로, 신호전달, 세포외 기질 단백질-매개 신호, 성장인자 항상성, 수용체 단백질 티로신 키나아제 신호 경로, 세포 유착-매개 신호, 세포 표면 수용체 매개 신호전달, JAK-STAT 케스케이드, 항산화 및 자유 라디칼 제거, 항상성, 스트레스성 반응, 혈액응고, 발달공정, 중배엽 발달, 골격 발달, 혈관형성, 근육발달, 근수축, 단백질 대사 및 변이, 단백질 분해, 단백질 접기, 단백질 복합 어셈블리, 아미노산 활성, 세포내 단백질 트래픽, 그 밖의 단백질 타겟팅 및 국소화, 아미노산 대사, 단백질 생합성, 단백질 황화물이성질화효소 반응, 탄수화물 대사, 해당작용, 오탄당-인산 션트(shunt), 그 밖의 다당류 대사, 퓨린 대사, 인산 대사의 조절, 비타민 대사, 아미노산 생합성, 전-mRNA 공정, 유전암호해독 조절, mRNA 스플라이싱 등이다.
더욱이 본 발명자들은 하기의 하나 또는 그 이상을 포함하는 기능의 공급에 관하여 hESC-MSCs의 용도 또는 hESC-MSCs에 의해 조절배지를 제공한다: 신호분자, 케모카인, 성장인자, 사이토카인, 인터루킨, 그 밖의 사이토카인, 세포외 기질, 세포외 기질 구조 단백질, 그 밖의 세포외 기질, 세포외 기질 당단백질, 프로테아제, 메탈로프로테아제, 그 밖의 프로테아제, 프로테아제 저해제, 메탈로프로테아제 저해제, 세린 프로테아제 저해제, 산화환원효소, 탈수소효소, 과산화효소, 샤페론, 샤페로닌, Hsp 70과 샤페론, 그 밖의 샤페론, 합성효소, 신타아제 및 합성효소, 선택 칼슘 결합 단백질, 아미노아실-tRNA 합성효소, 분해효소, 이성화효소, 그 밖의 이성화효소, ATP 신타아제, 수화효소, 아미노전이효소, 그 밖의 분해쇼소, 그 밖의 효소 조절자, 선택 조절 분자, 액틴 결합 세포결합 단백질, 세포결합 단백질, 비-운동 액틴 결합 단백질, 액틴 및 액틴 관련된 단백질, 아넥신, 튜불린, 세포 유착 분자, 액틴 결합 운동 단백질, 매개 필라멘트, 리보핵산단백질, 라이보솜 단백질, 유전암호해독 인자, 그 밖의 RNA- 결합 단백질, 히스톤, 칼모듈린 관련된 단백질, 소낭 코트 단백질(vesicle coat protein) 등이다.
더욱이 상기 hESC-MSCs는 질병의 치료에 사용된다. 이 기능은 질병의 치료의 역할을 지니거나 질병의 회복 또는 치료는 생물학적 공정의 하나 또는 그 이상과 관련된다. 유사하게 hESC-MSCs에 의해 발현되는 상기 단백질은 단독으로 또는 조합으로 바람직하게는 조절배지의 형태로 질병의 치료 또는 예방을 위한 목적으로 hESC-MSCs의 활성 또는 보충제로 사용된다.
hESC-MSCs에 의해 발현되는 상기 유전자 산물은 Jak-STAT, MAPK, Toll-유사 수용체, TGF-베타 신호 및 mTOR 신호 경로와 같은 심장혈관 생물학, 골 발생 및 조혈에 관한 중요한 신호 경로를 활성화시키기 위해서 나타난다. 따라서 이들에 의해 발현되는 단백질 즉 hESC-MSCs는 질병의 예방 또는 치료에 사용된다. 이들 신호 경로는 연관되어 있거나 병인은 하나 또는 그 이상의 신호 경로에 있어서 하나 또는 그 이상의 결함에 관련된 것이다.
따라서 이러한 조절배지는 심부전증, 골수 질병, 피부병, 화상을 포함하며, 또한 당뇨병, 알츠하이머 병, 파킨슨 병 및 암과 같은 퇴행성 질병의 치료에 사용된다.
또한 이런 조절배지는 심근경색증, 피부 상처, 피부 장애, 피부 손상, 피부염, 건선, 콘딜로마, 사마귀, 혈관종, 켈로이드, 피부암, 아토피피부염, 베체트병, 만성육아종병, 피부 T 세포 림프종, 궤양형성, 섬유증 및 기능의 손실을 포함하는 만성 조직 리모델링을 일으키는 염증 및 면역조절 곤란을 유도하는 초기 손상에 의해 특성화된 병리학적인 상태, 신장 허혈 부상, 낭성섬유증, 축농증 및 비염 또는 정형외과적 질병의 치료에 사용된다.
상기 조절배지는 개별적으로 상처 치료 보조(aid wound healing), 흉터 감소, 골 형성, 골 이식편 또는 골수 이식에 사용된다.
특히 조절배지는 혈관형성, 혈액학(구체적으로는 면역 과정) 또는 근골격 발달 등에 관련된 과정의 조절에 사용된다.
더욱이 조절배지의 형태를 포함하는 본 명세서에 기술된 MSCs로부터 분비된 하나 또는 그 이상의 단백질은 본 명세서에 기술된 BM-MSCs와 동일한 목적을 위해 사용된다. 따라서 본 발명자들은 조절배지에 존재하는 폴리펩티드를 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 전부를 포함하는 성분을 제공한다. 구체적으로 본 발명자들은 실시예 9, 실시예 13, 실시예 14 또는 실시예 14A를 포함하는 실시예에 개시된 폴리펩티드를 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 전부를 포함하는 성분을 제공한다.
이러한 성분은 조절배지가 사용되는 목적을 위해 사용된다. 한편 문맥에 기술되어 있지 않으면 "조절배지"라는 용어는 MSCs에 노출된 세포 배양 배지뿐만 아니라 조절배지에 존재하는 폴리펩티드를 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 전부를 포함하는 이러한 성분을 포함하는 것을 나타낸다.
또한 hESC-MSCs는 실시예 10∼14를 포함하는 실시예, 특히 표에 기술된 것과 같이 hESC-MSCs에 의해 분비되거나 발현되는 단백질을 위한 원재료(source)로 사용된다. 특히 hESC-MSCs는 조절배지의 원재료로 사용된다. 따라서 본 발명자들은 실시예 10∼14를 포함하는 실시예 중 어느 하나에 나타난 것과 같이 폴리펩티드를 제조하는 방법, 기술된 바와 같이 중간엽 줄기세포를 수득, 중간엽 줄기 세포를 배양 및 중간엽 줄기세포로부터 바람직하게는 중간엽 줄기세포가 성장하는 배지로부터 폴리펩티드를 분리하는 것을 포함하는 방법을 제공한다.
중간엽 줄기세포(MSC)를 수득
조절배지의 제조시 사용에 대해 적절한 MSCs는 당분야에 공지된 어느 하나의 방법에 의해 제조된다. 특히 MSCs는 FGF2를 포함하는 무혈청배양기(serum free medium)에서 공동배양의 결핍시 배아줄기(ES)세포 콜로니 또는 파생(descendent) 배아줄기세포 콜로니의 분산에 의해 수득된 세포를 증식시킴으로써 제조된다. 이는 하기에 상세히 기술된다.
hESCs로부터의 중간엽 줄기 세포(MSC) 또는 MSC-유사 세포를 수득하는 선행 기술은 분화하는 hESCs으로 인간 텔로머라제 역전사효소(hTERT) 유전자(Xu et al, 2004)를 트랜스펙션하거나 마우스 OP9 세포주를 지니는 공동배양(Barberi et al., 2005) 중 어느 하나와 관련된 것이다. 이들 유도 프로토콜에서 외인성 유전 물질 및 마우스 세포의 사용은 종양면역법의 용인할 수 없는 위험 또는 제노주틱 감염원의 감염을 유도한다.
대조적으로 본 발명자들의 방법은 분화하는 hESCs로부터 유사하거나 동일한(바람직하게는 상동성을 지닌) MSC 모집단을 분리하기 위한 임상적으로 적절하고 재현 가능한 프로토콜을 제공한다. 일반적으로 본 발명자들의 방법은 세포로 배아줄기(ES) 세포 콜로니를 분산시키는 것을 포함한다. 그 다음 상기 세포는 플레이트 밖에서 증식된다. 상기 세포는 중간엽 줄기 세포(MSCs)를 수득하기 위해서 섬유모세포 성장인자 2(FGF2)를 포함하는 무혈청배양기에서 공동배양의 결핍시 증식된다.
따라서 본 발명자들의 프로토콜은 혈청, 마우스 세포의 사용 또는 유전적 조작을 필요로 하지 않으며 조작 및 시간을 필요로 하지 않고 따라서 이것은 확장적용할 수 있다. 실시예는 두 개의 상이한 hESC 라인, HuES9 및 H-I 및 세 번째, Hes-323으로부터 MSCs의 분리를 기술하며, 프로토콜의 확고함을 증명한다.
본 명세서에 기술된 방법 및 성분에 의해 수득된 인간 ES 세포 유도 MSCs(hESC-MSCs)는 골수 유도 MSCs(BM-MSCs)와 매우 유사하다.
바람직한 실시태양에서 배아줄기세포 배양은 인간 태아줄기세포(hESC) 배양을 포함한다.
하나의 실시태양에서, CD105+CD24-세포를 분류하기 전에 중간엽 줄기세포(MSC)를 제조하는 방법은 FGF2 및 선택적으로 PDGF AB를 지닌 추가된 배지에서 영양 지원없이 hESCs를 트립신화 및 증식시키는 것을 포함한다.
바람직한 실시태양에서 상기 방법은 CDl 05+를 분류하는 것을 포함하며, 무영양 증식 일주일 후 FGF2 및 선택적으로 PDGF AB를 지닌 추가된 배지에서 트립신화된 hESCs로부터의 CD24-세포는 hESC-MSC 세포 배양을 제조할 것이며, 여기서 적어도 일부, 바람직하게는 대체로 전부, 더욱 바람직하게는 모든 세포는 서로 유사하거나 동일하다(바람직하게는 상동하다).
BM-MSCs와 물리학적, 생물학적 및 기능적으로 유사한 임상적으로 관련된 hESCMSC 배양의 제조에 관해 본 명세서에 기술된 방법은 많은 임상적 및 전-임상적 동물 조사10'25에서 치료 효능이 증명된 BM-MSCs의 분리에 관한 BM의 한계 공급을 경감시킬 수 있다. 또한 이는 위험한 침습 BM 흡인 절차에 대한 필요를 제거하며, 대기시간 및 BM-MSCs 준비 비용을 경감시키고 배치 투 배치(batch to batch) 변이를 경감시킬 것이다. 더욱이 hESC와 같이 정의된 세포 타입으로부터 MSCs의 강한 변이는 MSC의 변이 및 생물학을 더 잘 이해하기 위한 유용한 모델을 제공한다. 현재 널리 보급된 임상전 및 전-임상적 적용9에도 불구하고 MSC의 수수께끼를 풀 수 있는 단서를 제공한다.
상기의 과정에 의해 제조된 중간엽 줄기 세포의 추가적인 사용은 임상적 또는 치료 적용시 성체 조직 유도 MSCs의 대체를 포함한다: 인간 ESCs와 같은 그 밖의 세포 타입의 증식을 위한 영양으로서 성체 조직 유도 MSCs의 대체, 제대혈 또는 골수 줄기 세포 모집단의 팽창; 및 심장혈관계 질환 치료용 MSC-조절배지의 제조 등이다.
분해되는 배아줄기세포 콜로니
중간엽 줄기 세포를 제조하는 본 발명자들의 방법은 세포로 배아줄기세포 콜로니를 분산 또는 분해시키는 것을 포함한다.
배아줄기세포 콜로니는 huES9 콜로니(Cowan CA, Klimanskaya I, McMahon J, Atienza J, Witmyer J, et al. (2004) Derivation of embryonic stem-cell lines from human blastocysts. N Engl J Med 350: 1353-1356) 또는 Hl ESC 콜로니(Thomson JA, Itskovitz-Eldor J, Shapiro SS, Waknitz MA, Swiergiel JJ, et al. (1998) Embryonic Stem Cell Lines Derived from Human Blastocysts. Science 282: 1145- 1147.)를 포함한다.
바람직하게는 콜로니에서 상기 세포는 분해되거나 상당한 크기로 즉 적어도 클럼프(clump)로 분산된다. 더욱 바람직하게는 상기 콜로니는 콜로니에서 상기 모든 세포가 단독으로 즉 상기 콜로니가 완전히 분해되는 정도로까지 분해되거나 분산된다.
상기 분해는 분산제(dispersing agent)와 함께 수행된다.
상기 분산제는 각각의 콜로니에서 적어도 약간의 배아줄기세포를 분리하는 것이 가능한 것을 가리킨다. 바람직하게 상기 분산제는 콜로니의 세포들 사이 또는 세포 및 기질 사이 또는 둘 모두의 부착을 분리시키는 시약을 포함한다. 바람직하게는 상기 분산제는 프로테아제를 포함한다.
바람직한 실시태양에서 상기 분산제는 트립신을 포함한다. 트립신 처리는 예를 들면 3분 또는 37℃ 근처에서 지속된다. 그 다음에 상기 세포는 밖으로 플레이트되기 전에 배지에서 중화, 원심분리 및 재현탁된다.
바람직한 실시태양에서 상기 방법은 트립신과 함께 인간 배아줄기세포의 융합성 플레이트를 분산시키며, 세포 밖으로 플레이팅하는 것을 포함한다.
상기 응집분해는 적어도 하기의 단계 순서를 포함한다; 흡인, 헹굼, 트립신화, 배양, 탈착(dislodging), ??칭(quenching), 재-파종(re-seeding) 및 분취(aliquoting)이다. 하기의 프로토콜은 Hedrick Lab, UC San Diego (http://hedricldab.ucsd.edu/Protocol/COSCell.html)로부터 변형되었다.
흡인(aspiration) 단계에서, 상기 배지는 플라스크와 같은 용기로부터 일반적으로 흡인되거나 제거된다. 린싱(rinsing) 단계에서, 상기 세포는 완충 배지 5∼10 ml 정도의 부피로 헹궈지며, 바람직하게는 Ca2+ 및 Mg2+로부터 유리된다. 예를 들면 칼슘 및 마그네슘 유리 PBS와 함께 헹궈진다. 트립신화 단계에서, 완충액에서 상당한 양의 분산제는 용기에 첨가되며, 상기 용기는 분산제 용액과 함께 표면 성장을 통한 코팅을 위해 회전된다. 에를 들면 Hank's BSS에서 트립신 1 ml는 플라스크에 첨가된다.
배양단계에서, 상기 세포는 유지된 온도에서 약간의 시간 동안 방치된다. 예를 들면 상기 세포는 약간의 시간 동안 37℃에 방치된다(예를 들면 2∼5 분). 탈착(dislodging) 단계에서, 상기 세포는 기계적 동작에 의해 탈착되며, 예를 들면 찰과되거나 손으로 용기면을 때림으로써 탈착된다. 상기 세포는 시트에 떨어지며, 표면을 미끄러져 내려간다.
??칭 단계에서, 배지는 플라스크에 첨가된다. 상기 배지는 바람직하게는 분산제의 작용을 중단시키는 중화제를 포함한다. 예를 들면 분산제가 트립신과 같은 프로테아제이면 상기 배지는 혈청 단백질과 같은 단백질을 포함할 것이며, 이는 프로테아제의 활성을 중단(mop up)시킬 것이다. 특별한 예에서, 세포 배양 배지를 포함하는 혈청 3ml는 전체 4ml로 구성된 플라스크에 첨가된다. 상기 세포는 제거 또는 세포를 분산시키기 위해서 피펫으로 옮겨진다.
재-파종(seeding) 단계에서, 상기 세포는 새로운 배양 용기 및 첨가된 신선한 배지 내로 재-파종(seeding)된다. 다수의 재-파종(seeding)은 상이한 분열 비율로 만들어진다. 예를 들면 상기 세포는 1/15 희석물 및 1/5 희석물에 재-파종(seeding)된다. 특별한 예에서, 상기 세포는 25cm2 플라스크로 세포 1방울을 첨가하거나 또 다른 재-파종(seeding)된 배양액으로 3 방울을 첨가함으로써 재-파종(seeding)되며. 그 다음에 7∼8 ml 배지는 75cm2 플라스크에 각각 1/15 희석물 및 1/5 희석물을 제공하기 위해서 첨가된다. 분취(aliquoting) 단계에서, 상기 세포는 새 접시로 나누어지거나, 원하는 분배비율로 배지에 첨가된다.
구체적인 실시태양에서, 상기 방법은 하기의 단계를 포함한다: 먼저 인간 ES 세포는 배상체(embryoid bodies, EBs) 형태로 현탁되어 비-부착성 방식으로 성장된다. 그 다음 5∼10일 된 EBs는 조직 배양 플레이트가 코팅된 젤라틴 상에서 부착 세포로서 플레이팅되기 전에 트립신화된다.
세포 배양으로서 유지
상기 분해된 세포는 플레이트되며 세포 배양으로서 유지된다.
상기 세포는 배양용기 또는 젤라틴화 플레이트와 같은 기질 상으로 플레이트된다. 결정적으로 상기 세포는 성장되며, 공동배양의 존재 없이도 예를 들면 영양 세포의 결핍시에도 증식된다.
세포 배양에서 상기 세포는 섬유모세포 성장인자 2(FGF2) 및 선택적으로 혈소판-유래 성장인자 AB(PDGF AB)와 같은 하나 또는 그 이상의 성장인자 5ng/ml에 의해서 보충되는 무혈청배양기에서 성장된다. 바람직하게는 세포 배양에서 상기 세포는 트립신 처리, 세척 및 재-플레이팅에 의해 융합시 1 :4로 분열되거나 계대배양된다.
공동배양(co-culture)의 부재
더욱 바람직한 실시태양에서, 본 발명자들의 발명은 공동배양의 부재시 배양하는 세포에 관한 것이다. "공동배양"이라는 용어는 함께 성장하는 세포의 두가지 또는 그 이상의 상이한 종류의 혼합물에 관한 것이며, 세포의 예로는 간질 영양 세포(stromal feeder cells)이다.
따라서 전형적인 ES 세포 배양에서, 배양 접시의 내부 표면은 보통 처리되어서 분할되지 않을 마우스 배아 피부 세포의 양양층에 코팅된다. 상기 영양층은 ES 세포에 부착 및 성장을 가능케 하는 부착 표면을 제공한다. 더욱이 상기 영양 세포는 ES 세포 성장을 요구로 하는 배양 배지로 영양소를 방출시킨다. 본 명세서에 기술된 상기 방법 및 성분에서 ES 및 MSC 세포는 이러한 공동배양의 부재시 배양된다.
바람직하게는 상기 세포는 단층으로서 또는 영양세포의 부재시 배양된다. 본 명세서에 기술된 방법의 바람직한 실시태양에 따르면, 배아줄기세포는 중간엽 줄기세포(MSC)를 확립하는 영양세포의 부재시 배양된다.
바람직한 실시태양에서, 해리 또는 분해된 배아줄기세포는 즉시 배양 기질 위에 플레이트된다. 상기 배양 기질은 페트리 접시와 같은 조직 배양 용기를 포함한다. 상기 용기는 전-처리된다. 바람직한 실시태양에서 상기 세포는 젤라틴화된 조직 배양 플레이트 위에 플레이트되고, 그 위에서 성장된다.
접시의 젤라틴 코팅에 관한 프로토콜의 예는 하기를 따른다. 증류수에서 0.1% 젤라틴의 용액이 제조되고, 살균된다. 이것은 실온에서 저장된다. 조직 배양 접시의 바닥에 젤라틴 용액을 입히고, 5∼15분 동안 배양시킨다. 젤라틴 제거 및 플레이트는 사용을 위해 준비된다. 배지는 저장성 용해를 예방하기 위한 세포를 첨가하기 전에 첨가된다.
무혈청배지
해리 또는 분해된 배아줄기세포는 배지에서 배양되며, 배지는 바람직하게는 무혈청배지이다.
"무혈청배지"라는 용어는 혈청 단백질이 없는 예를 들면 우태아혈청인 세포 배양 배지를 포함한다. 무혈청배지는 당분야에 잘 공지되어 있으며, 예를 들면 미국 특허 제5,631,159호 및 제5,661,034호에 기술되어 있다. 무혈청배지는 상업적으로 사용가능하며 예를 들면 Gibco-BRL(Invitrogen)가 있다.
무혈청배지는 단백질이 없거나, 단백질이 결핍되어 있으며, 가수분해물 및 알려지지 않은 성분으로 구성되어있다. 상기 무혈청배지는 합성배지를 포함하며, 여기서 컴포넌트는 공지된 화학적 구조를 지닌다. 합성 무혈청배지는 완전히 정의된 시스템을 제공하기 때문에 유리하며, 정의된 시스템은 변이성이 개선된 재현성 및 일관적인 수행을 허용하는 것을 제거하며, 부정(adventitious) 작용제에 의한 오염 가능성을 감소시킨다.
바람직한 실시태양에서 무혈청배지는 Knockout DMEM 배지(Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York)를 포함한다.
무혈청배지는 예를 들면 5%, 10%, 15%, 등의 농도에서 혈청대체물 배지와 같은 하나 또는 그 이상의 성분과 함께 보충된다. 무혈청배지는 바람직하게는 Invitrogen- GibcoGrand Island, New York)로부터의 10% 혈청대체물 배지와 함께 보충된다.
성장인자
해리 또는 분해된 배아줄기세가 배양된 무혈청배지는 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 성장인자를 포함한다. PDGF, EGF, TGF-a, FGF, NGF, 에리트로포이에틴(Erythropoietin), TGF-b, IGF-I 및 IGF-Ⅱ를 포함하는 상당수의 성장인자는 당분야에 공지되어 있다.
성장인자는 섬유모세포 성장인자 2(FGF2)를 포함한다. 또한 상기 배지는 혈소판-유래 성장인자 AB(PDGF AB)와 같은 그 밖의 성장 인자를 포함한다. 이들 성장인자 모두는 당분야에 공지되어 있다. 더욱 바람직한 실시태양에서, 상기 방법은 FGF2 및 PDGF AB를 포함하는 배지에서 배양 세포를 포함한다.
또한 또는 이외에, 상기 배지는 표피성장인자(EGF)를 포함하거나 추가적으로 포함한다. EGF의 사용은 MSCs의 성장을 증진시킨다. EGF는 적절한 농도 예를 들면 5∼10 ng/ml EGF에서 사용된다. EGF는 PDGF 대신에 사용된다. EGF는 당분야에 잘 공지된 단백질이며, 심볼 EGF, Alt. Symbols URG, Entrez 1950, HUGO 3229, OMIM 131530, RefSeq NM_01963, UniProt P01133에 관한 것이다.
따라서 본 발명자들은 (i) FGF2, (ⅱ) FGF2 및 PDGF 및 (ⅲ) FGF2 및 EGF 및 그 밖의 결합을 포함하는 배지의 사용을 기술한다.
FGF2는 많은 조직 및 세포타입에서 낮은 농도에서 발현되며 뇌 및 뇌하수체에서 높은 농도에 도달케 하는 광범위한 분열촉진인자, 혈관형성인자 및 신경영양(neurotrophic)인자이다. 사지(limb) 발달, 혈관형성, 상처치유 및 종양 성장을 포함하는 FGF2는 수많은 생리적 및 병리학적 과정과 관련된다.
혈소판-유래 성장인자(PDGF)는 섬유모세포, 평활근 및 결합조직을 포함하는 광범위한 범위의 세포 타입에 관한 강력한 마이토겐이다. A 사슬 및 B 사슬이라고 일컬어지는 두 사슬의 이합체로 구성된 PDGF는 AA 또는 BB 동종 이합체로서 또는 AB 이종 이합체로서 존재한다. 인간 PDGF-AB는 13.3 kDa A 사슬 및 12.2 B 사슬로 구성된 25.5 kDa 동종 이합체 단백질이다. PDGF AB는 상업적으로 예를 들면 Peprotech (Rocky Hill, New Jersey)로부터 얻어진다.
바람직하게는 FGF2 및 선택적으로는 PDGF AB인 성장인자는 약 100pg/ml, 바람직하게는 약 500pg/ml, 바람직하게는 약 lng/ml, 바람직하게는 약 2ng/ml, 바람직하게는 약 3ng/ml, 바람직하게는 약 4ng/ml, 가장 바람직하게는 약 5ng/ml의 농도의 배지에서 존재한다. 바람직한 실시태양에서, 상기 배지는 약 5ng/ml에서 FGF2를 포함한다. 또한 상기 배지는 바람직하게는 약 5ng/ml에서 PDGF AB를 포함한다.
세포 분할(splitting)
접촉 저해가 세포 분열 및 성장의 중지를 야기할 때, 배양시 세포는 일반적으로 융합할 때까지 성장을 계속한다. 그 다음에 이러한 세포는 기질 또는 플라스크로부터 해리되며, 조직 배양 배지로 희석 및 리플레이팅됨에 의해 "분할", 계대배양 또는 계대접종된다.
따라서 본 명세서에 기술된 방법 및 성분은 배양하는 동안 계대접종 또는 분할되는 것을 포함한다. 바람직하게는 세포 배양에서 상기 세포는 1 :2 또는 그 이상, 바람직하게는 1 :3, 더욱 바람직하게는 1 :4, 1 :5 또는 그 이상의 비율로 분할된다. "계대접종"이라는 용어는 세포주 융합성 배양의 분취(aliquot), 새로운 배지로의 접종 및 융합 또는 포화될 때가지 상기 라인을 배양하는 것으로 구성된 과정을 나타낸다.
단계 선택, 스크리닝 또는 분류
매우 바람직한 실시태양에서, 더욱이 상기 방법은 단계 선택 또는 분류, 더욱이 중간엽 줄기세포에 대한 분리 또는 선택을 포함한다.
단계 선택 또는 분류는 하나 또는 그 이상의 표면 항원 마커 방법에 의한 세포 배양으로부터 중간엽 줄기세포(MSC)를 선택하는 것을 포함한다. 더욱이 단계 선택 또는 분류의 사용은 MSCs에 관한 특이성 분류 또는 선택의 설득력을 증진시키며 게다가 잠재적으로 개시 물질로부터의 hESCs 및 그 밖의 hESC-유도체와 같은 배아줄기세포로부터의 가능한 오염을 감소시킨다. 더욱이 이것은 기형종 형성의 위험성을 감소시키며, 본 발명자들이 기술한 프로토콜의 임상적 관련성을 증가시킨다.
많은 방법이 항원 발현을 기반으로 한 선택 또는 분류에 관하여 공지되었으며, 이들 방법 중 어느 하나는 본 명세서에 기술된 단계의 선택 또는 분류에 사용된다. 특히 바람직한 실시태양에서, 상기 선택 또는 분류는 형광표지세포분리(FACS) 방법에 의해 실시된다 따라서 당 분야에 공지된 FACS는 표지된 항체와 같은 리포터로 세포를 노출하는 것과 관련되며, 이는 세포에 의해 발현된 항체와 결합하고 항체를 표지한다. 형성 리포터(form reporter)에 그것의 항체 및 표지를 제조하는 방법은 당 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면 Harlow and Lane에 기술되어 있다. 그 다음 세포는 FACS 머신을 통해 통과되며, 이는 표지를 기초로 하여 세포 서로 서로를 분류한다. 또한 또는 이외에 자성세포분리(MACS)는 세포를 분류하기 위해서 사용된다.
본 발명자들은 MSCs와 연관된 것으로 알려진 많은 표면항원 후보 예를 들면 CD 105, CD73, ANPEP, ITGA4 (CD49d), PDGFR과 표면항원과 연관된 몇몇의 MSC 예를 들면 CD29 및 CD49e는 hESCs와 같은 ES 세포에서 매우 발현된다는 것을 깨달았으며 이들의 발현은 FACS 분석에 의해 입증되었다. MSCs를 지닌 표면항원의 연합은 hESC와 같은 ES 세포로부터 MSCs를 분리하기 위한 선별용 마커로서 항원에 자격을 주기에 충분하다. 따라서 단계 선택 또는 분류는 바람직하게는 MSCs 및 ES 세포 사이에서 별개로 발현되는 항원을 사용한다.
본 발명자들의 방법의 단계 선택 또는 분류는 항원 발현을 기초로 하여 중간엽 줄기세포를 확실히 선택한다. 이러한 항원은 예를 들면 실시예에 기술된 바와 같이 hESCs 및 hESCMSCs의 유전자 발현 프로파일을 비교함으로써 확인된다. 특별한 실시태양에서, 선택 또는 분류는 구체적으로 표 ElA 및 ElB에 나타난 항원 중 어느 하나를 사용한다.
바람직한 실시태양에서, 본 발명자들의 방법의 단계 선택 또는 분류는 MSCs 상에서 발현됨으로서 확인되나 hESCs와 같은 ES 세포 상에서는 발현되지 않는 항원 발현을 기초로 하여 확실히 중간엽 줄기세포를 선택한다.
따라서 실시예에 나타난 바와 같이, 본 발명자들은 CD73이 MSCs3 상에서는 크게 발현되는 반면, hESCs 상에서는 크게 발현되지 않는 다는 것을 설명한다(도 4A). 더욱이 CD73 및 CD 105 모두는 MSCs에서 크게 발현된 표면항원이며, hESC(도 3, 표)와 관련된 hESC-MSCs에서 크게 발현된 표면항원 상위 20 중에 하나이고, 추정 MSCs용 선별용 마커로서 CD73 또는 CD 105(또는 둘 모두)의 사용은 분화하는 hESCs에 의해 제조된 추정 MSCs에 대해 분류를 효과적이게 한다는 것을 실시예에서 설명한다.
또한 또는 이외에, 단계 선택 또는 분류는 표면항원을 기초로 한 항원에 반하여 소극적으로 선택하며, 표면항원은 hESCs와 같은 배아줄기세포(ES 세포) 상에서 표면항원으로서 크게 발현되나 hESC-MSC와 같은 중간엽 줄기세포 상에서는 발현되지 않는다. 선택 또는 분류는 MIBP, ITGB 1BP3 및 PODXL22, 및 CD24와 같은 공지된 또는 이전에 확인된 hESC-특이적 표면항원을 기반으로 한다.
실시예는 FACS 분석은 hESC 상에서는 CD24의 발현이 확인되나 그러나 hESC-MSCs 상에서는 CD24의 발현이 확인되지 않는다는 것을 나타낸다. 따라서 CD24는 단독으로 네가티브 선택 또는 분류 마커로서 사용되거나, 분화하는 hESC 배양으로부터 추정 MSCs를 분리하기 위한 포지티브 선별용 마커로서 CD 105와의 결합으로 사용된다.
중요하게는, 중간엽 줄기세포는 형질전환에 대한 요구 없이 자가-재생을 유지할 수 있다. 따라서 예를 들면 종양 세포 또는 종양 세포주와 같은 불멸화된 세포와 함께 융합하는 것과 같은 공지된 형질전환 처리, SV40, EBV, HBV 또는 HTLV-I 과 같은 형질전환 바이러스를 지닌 세포주의 바이러스 감염, 인간 유두종바이러스(papillomavirus)의 DNA 서열(미국 특허 제5,376,542호)을 포함하는 큰 T-항원 (R. D. Berry et al, Br. J. Cancer, 57, 287-289, 1988), 텔로머라제(Bodnar-A-G. et.al., Science (1998) 279: p. 349-52) 또는 벡터의 서열을 포함하는 SV40 벡터와 같은 특별히 적응된 벡터를 지닌 트랜스펙션, 암억제효과(dominant oncogene) 또는 변이에 의한 도입은 중간엽 줄기세포 발생에 대한 본 명세서에 기술된 방법을 요구로 하지 않는다.
바람직한 실시태양에서, 중간엽 줄기 세포 및 세포주(또는 이들로부터 유래된 분화하는 세포)는 하나 또는 그 이상의 배아줄기세포 특성을 나타내지 않는다. 바람직한 이러한 특성은 OCT4 유전자 및 알칼리성 인산분해효소 활성의 발현을 포함하지 않는다. 바람직하게는 중간엽 줄기세포는 하나 또는 그 이상의 다능성 특성 마커의 감소된 발현을 나타낸다. 이러한 다능성 마커는 하기에서 추가적으로 상세히 설명한다. 그러나 Nanog, BMP4, FGF5, Oct4, Sox-2 및 Utfl를 포함하다.
본 명세서에 기술된 방법으로 제조된 중간엽 줄기세포는 바람직하게는 비-발암성이다. 바람직하게는 중간엽 줄기세포는 면역저항력저하 또는 면역결핍 숙주 동물로 이식할 때, 종양 형성을 초래하는 부모 배아줄기세포의 이식과 비교시 종양을 초래하지 않는다. 바람직하게는 면역저항력저하 또는 면역결핍 숙주 동물은 SCID 마우스 또는 Ragl -/- 마우스이다. 바람직하게는 중간엽 줄기 세포는 이식 지속기간 바람직하게는 2주보다 오래, 더욱 바람직하게는 2달보다 오래 , 가장 바람직하게는 9달보다 오래 후에도 종양을 형성하지 않는다. 종양면역법 테스트에 관한 상세한 프로토콜이 실시예에 개시된다.
또한 본 명세서에 기술된 방법으로 제조된 중간엽 줄기 세포는 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 하기의 특징을 나타낸다. 이들은 바람직하게는 적어도 10 세대 동안 세포 배양이 유지될 때 염색체수에 의해 평가된 것과 같은 충분히 적절한 핵형을 지닌다. 또한 이들은 바람직하게는 여러 세대에 걸쳐 충분히 적절한 유전자 발현 패턴을 나타낸다. 이에 의해 본 발명자들은 유전자의 선택된 세트의 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 전부의 발현 수준이 1 세대의 중간엽 줄기세포 및 다음 세대의 중간엽 줄기 세포의 사이에서 변화되지 않는다는 결과를 도출했다.
바람직하게는 유전자 세트는 하나 또는 그 이상의 서브세트 또는 서브세트 전부, 하기를 포함한다: cerberus(GenBank 수탁번호: NM_009887, AF031896, AF035579), FABP (GenBank 수탁번호: NM_007980, M65034, AY523818, AY523819), Foxa2 (GenBank 수탁번호: NM_010446, X74937, L10409), Gata-1 (GenBank 수탁번호: NM_008089, Xl 5763, BC052653), Gata-4 (GenBank 수탁번호: NM_008092, AF179424, U85046, M98339, AB075549), Hesxl (GenBank 수탁번호: NM_010420, X80040, U40720, AK082831), HNF4a (GenBank 수탁번호: NM_008261, D29015, BC039220), c-kit (GenBank 수탁번호: NM_021099, Y00864, AY536430, BC075716, AK047010, BC026713, BC052457, AK046795), PDGFRα (NMJ)11058, M57683, M84607, BC053036), Oct4 (GenBank 수탁번호: NM_013633, X52437, M34381, BC068268), Runxl (GenBank 수탁번호: NM_009821, D26532, BC069929, AK051758), Soxl7 (GenBank 수탁번호: NM_011441, D49474, L29085, AK004781), Sox2 (GenBank 수탁번호: NM_011443, U31967, AB108673), Brachyury (NM_009309, X51683), TDGFl (GenBank 수탁번호: NM_011562, M87321) 및 Tie-2 (GenBank 수탁번호: NMJU3690, X67553, X71426, D13738, BC050824)이다.
본 명세서에 기술된 방법은 분화하는 세포뿐만 아니라 중간엽 줄기 세포의 제조를 가능케 하며, 이는 중간엽 줄기세포의 클론 후손(clonal descendants)을 포함한다. 세포의 "클론 후손"이라는 용어는 형질전환 처리 또는 유전적 변형을 겪지 않은 세포의 후손에 관한 것이다. 이러한 클론 후손은 중요한 게놈 변화를 겪지 않으며, 게놈 변화는 부모 세포 또는 원종(ancestor), 바람직하게는 배아줄기세포(감소된 잠재력을 저장)와 유전적으로 대체로 동일하다. 또한 "중간엽 줄기세포"라는 용어는 바람직하게는 중간엽 줄기 세포 즉 중간엽 줄기세포주 및 그 반대의 경우로부터 유도된 세포주를 포함한다.
전구세포의 유도
바람직한 실시태양에서, 본 명세서에 기술된 방법은 중간엽 줄기세포에 대한 선택 또는 스크린하기 위해서 추가 단계를 사용한다.
이러한 추가 단계는 상술된 단계에 앞서서, 이러한 단계 사이에, 또는 이들 단계 이후에 실시된다. 추가 단계는 사실상 독립적으로 실시되며, 구체적으로는 하나 또는 그 이상의 ES 세포로부터의 전구세포 또는 세포주를 유도하는 것을 포함한다.
따라서 본 발명자들은 중간엽 줄기세포를 유도하는 대안적인 방법을 기술한다. 상기 방법은 하기를 포함한다: (a) 배아줄기(ES)세포를 제공; 및 (b) 배아줄기세포로부터의 전구세포를 확립; 여기서 전구 세포주는 이들의 자가-갱신(self-renew) 능력을 기초로 하여 선택된다.
그러나 바람직하게는 상기 방법은 함께 실시된다. 따라서 예를 들면 본 발명자들의 방법은 분산 단계 또는 증식 단계이전, 동안, 이후에 배아줄기세포로부터의 전구세포 또는 전구 세포주를 유도하는 것을 포함한다. 따라서 방법은 예를 들면 배아줄기세포 콜로니 또는 이들의 후손을 분산, 배아줄기세포로부터 하나 또는 그 이상의 전구세포 또는 전구 세포주를 유도 및 FGF2를 포함하는 무혈청배지에서 공동배양의 부재시 세포를 증식시켜 수득된 세포를 제공함으로써 중간엽 줄기세포(MSC)를 수득하는 것을 포함한다.
바람직하게는 전구 세포주는 자가-갱신 능력을 기초로 하여 선택되거나, 방법은 자가-갱신 무능력 또는 둘 모두를 기초로 하는 체세포에 반하여 선택한다.
바람직한 실시태양에서 전구 세포주는 공동배양의 결핍시, 바람직하게는 영양세포의 부재시 유도되거나 확립된다. 바람직하게는 공동배양의 부재는 배아줄기세포에 반하여 선택한다.
바람직한 실시태양에서, 전구 세포주는 형질전환 없이 확립된다. 전구 세포주는 추정 전구세포의 자가-재생을 촉진시키는 조건에 배아줄기세포 또는 이들의 후손을 노출시킴으로써 확립된다. 바람직하게는 자가-재생-촉진 조건은 배아줄기세포의 증식을 방해한다.
자가-갱신-촉진 조건은 풍부한 배지에서의 성장을 포함한다. 더욱 바람직하게는 자가-갱신-촉진 조건은 LIF의 결핍시 성장하는 세포를 포함한다. 바람직하게는 자가-갱신-촉진 조건은 연속계대(serial passages)를 포함한다. 바람직하게는 자가-갱신-촉진 조건은 적어도 12 연속계대를 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 전구 세포주는 배아줄시세포와 비교시 잠재능이 감소된다. 바람직하게는 전구 세포주는 제한된 계통, 바람직하게는 비-다능성(non-pluripotent)을 지닌다. 바람직하게는 전구 세포주는 비-발암성이다.
바람직하게는 전구 세포주를 유도하는 단계는 특이적 계통으로 분화를 증진시키는 조건에서 배아줄기세포를 노출시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는 분화 증진-조건은 배아줄기세포로부터의 배상체를 발생시키는 것을 포함한다. 바람직하게는 세포는 다능성을 잃으면 분화 증진-조건으로부터 제거된다.
바람직하게는 계통 제한-촉진 조건으로부터 세포 제거는 배상체를 분화시키는 것을 포함한다. 바람직하게는 방법은 약 3∼6일 사이에 성장되는 배상체를 분화시키는 것을 포함한다.
바람직한 실시태양에서, 전구 세포주는 OCT4 및 알칼리성 인산분해효소 활성 둘 중 하나 또는 둘 모두의 감소된 발현을 나타내거나 실질적으로 발현되지 않는다.
바람직하게는 전구 세포주는 유도된 배아줄기세포와 비교시 다능성 마커의 감소된 발현을 나타내며, 바람직하게는 다능성 마커는 하기로 구성된 군으로부터 선택된다; Nanog,BMP4, FGF 5, Oct4, Sox- 2 및 Utfl이다.
바람직한 실시태양에서, 전구 세포는 하나 또는 그 이상의 하기의 특성을 나타난다: (a) 40 세대보다 더 오래 동안 세포 배양시 유지 가능하다; (b) 적어도 10 세대 동안 세포 배양시 유지될 때 충분히 적절한 핵형 또는 염색체수를 지닌다; (c) 여러 세대에 걸쳐서 충분히 적절한 유전자 발현 패턴을 지닌다.
바람직하게는 전구 세포주는 수령 동물, 바람직하게는 면역 저항력저하 수령 동물, 바람직하게는 3주 후, 더욱 바람직하게는 2∼9 달 후에 이식될 때 기형종 형성을 실질적으로 유도하지 않는다.
바람직하게는 배아줄기세포 또는 전구 세포주는 포유류, 바람직하게는 마우스 또는 인간, 배아줄기세포 또는 전구 세포주이다.
바람직하게는 전구 세포주는 내피 전구 세포주, 바람직하게는 E-RoSH 세포주를 포함한다. 또한 또는 이외에, 전구 세포주는 중간엽 전구 세포주, 바람직하게는 huES9.El 세포주를 포함한다.
어떤 실시태양에서, 더욱이 방법은 전구 세포주로부터 분화하는 세포를 유도하는 단계 (d)를 포함한다.
바람직하게는 전구 세포주는 분화 이전에 적어도 5 세대 동안 증식된다.
본 발명자들은 배아줄기(ES) 세포, 하기를 포함하는 방법으로부터 분화된 세포를 발생시키는 방법을 제공한다; (a) 배아줄기세포로부터 전구 세포주를 유도; (b) 전구 세포주를 증식; 및 (c) 전구 세포주로부터 분화된 세포를 유도하기이다.
하기를 포함하는 방법이 제공된다: (a) 배아줄기(ES) 세포를 제공; (b) 배아줄기세포로부터 전구세포를 유도; 및 (c) 전구세포로부터 전구 세포주를 확립, 여기서 전구세포는 이들의 자가-갱신 능력을 기초로 하여 선택된다.
구체적으로 상기 방법은 배아줄기(ES) 세포로부터 분화된 세포를 발생시키기 위해 사용된다. 바람직하게는 분화된 세포는 내피 세포 또는 중간엽 세포이다. 더욱 바람직하게는 분화된 세포는 지방세포 또는 골세포이다.
본 발명자들은 본 발명의 전술한 관점의 어느 하나에 따른 방법에 의해 제조된 전구 세포주를 제공한다.
또한 본 명세서에 기술된 방법 및 성분은 더욱이 그 밖의 인자 또는 선택 또는 스크리닝 또는 둘 모두에 대한 MSCs의 특성을 사용하는 추가 단계를 포함한다.
편재 분화(Biasing Differentiation)
바람직한 실시태양에서, 특이적 계통의 배아줄기세포-유래 전구 세포를 발생시키기 위한 방법은 바람직하게는 더욱이 특이적 요구 계통 또는 관심 계통을 향한 배아줄기세포의 첫 번째 편재 분화 단계를 포함한다. 또한 본 발명자들의 방법은 추정 전구 세포의 자가-재생을 촉진 및 배아줄기세포의 증식을 억제하는 두 번째 단계를 포함한다.
첫 번째 단계는 특이적인 관심 계통의 성장 또는 증식을 촉진시키는 것을 포함한다. 특이적인 관심 계통의 상이한 전구 세포주는 이들의 관심 계통의 분화를 촉진시키는 조건에서 세포를 노출시킴으로써 제조된다. 예를 들면 배아줄기세포는 성장인자 또는 분화를 촉진 또는 가능케 하는 리간드와 같은 작은 분자에 노출된다.
따라서 본 명세서에 기술된 특이적인 계통의 배아줄기세포-유래 세포주를 확립하기 위한 방법은 바람직하게는 특이적인 계통을 향한 배아줄기세포의 분화를 증진시키는 단계를 포함한다. 바람직하게는 분화-증진 단계는 미리 정해진 시간 동안 실시된다. 따라서 바람직하게는 배아줄기세포 또는 이들의 후손은 분화-증진 환경에 일시적으로 노출된다.
분화를 증진 또는 편재시키는 방법의 선택은 전구세포를 제조하기를 원하기 때문에 관심있는 특이적 세포 계통에 의존할 것이다. 당업자는 상이한 세포를 사용하는 다양한 방법을 인지하고 있을 것이다.
내배엽 전구세포
조직의 내배엽 타입으로 배아줄기세포의 편재 분화를 원하는 경우에 예를 들면 배상체는 형성 및 분해될 것이다(후기 참고). 분해된 배상체는 내배엽 분화를 유도하는 성장인자 또는 약제 또는 이들의 결합에 노출된다. 이러한 성장인자 및 약제의 예는 액티빈 A, FGF4, 덱사메타손 및 레티노산을 포함한다.
조혈 및 내피 전구세포
한편, 조혈 또는 내피 계통으로 배아줄기세포의 편재 분화를 원하는 경우에, 분해된 배상체는 조혈 또는 내피 분화를 유도하는 성장인자 또는 약제 또는 이들의 결합에 노출된다. 이러한 성장인자 및 약제의 예는 GM-CSF, G-CSF5 SCF, PDGF, IL-3, 에리트로포이에틴, 트롬보포이에틴, TNFα 및 라파마이신을 포함한다.
심장 중배엽 및 근육모세포(Skeletal Myoblast) 전구세포
한편, 심장 중배엽 또는 근육모세포 계통으로 배아줄기세포의 편재 분화를 원하는 경우에, 분해된 배상체는 심장 중배엽 또는 근육모세포 분화를 유도하는 성장인자 또는 약제 또는 이들의 결합에 노출된다. 이러한 성장인자 및 약제의 예는 덱사메타손, PPARγ의 억제제 및 테스토스테론 또는 이의 유사체를 포함한다.
두 번째 단계는 풍부한 배지에서 분화하는 세포를 플레이팅하는 것을 포함한다. 이러한 실시태양에서, 계속된 증식은 클론화될 수 있는 전구세포를 선택적으로 강화시킨다.
배상체의 형성
몇몇의 실시태양에서, 분화-증진 단계는 배아줄기세포로부터 배상체의 형성을 포함한다. 배상체 및 이들을 제조하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. "배상체"라는 용어는 현탁액(suspension)에서 배아줄기세포의 성장에 의해 제조된 배지에서 나타난 구상(spheroid) 콜로니에 관한 것이다. 배상체는 혼합된 세포 타입들이며 특이적 세포 타입의 분배 또는 출현 시간은 관찰된 배아 내에서 상응한다. 바람직하게는 배상체는 세미-고체 배지, 바람직하게는 Lim et al, Blood. 1997;90: 1291-1299에 기술된 바와 같은 메틸셀룰로스 배지 위로 배아줄기세포를 플레이팅 아웃함으로써 발생된다. 바람직하게는 상기 배상체는 3∼6일 된 것이다.
이러한 실시태양에서 배상체는 서로 성분을 분리 예를 들면 계통 제한-촉진 조건으로부터 세포를 제거하기 위해서 콜라겐분해효소 또는 트립신 처리에 의해 분해된다.
바람직한 실시태양에서 상기 방법은 원하는 특이적 계통에 대한 추정 전구세포를 선택하는 단계를 포함한다. 선택은 세포 형태학을 기초로 하여 발현 또는 발현 등에 의해 수행된다. 또한 유전자 발현 프로파일링 또는 항원 프로파일링은 원하는 계통의 특이적 전구세포를 선택하기 위해 사용된다. 그 다음에 원하는 특이적 계통에 대해여 선택된 추정 전구세포는 배양 또는 그 후에 추가 선택 단계가 수행된다.
바람직한 실시태양에서 분화-증진 단계는 추정 전구 세포의 자가-재생을 촉진 및 배아줄기세포의 증식을 억제시키는 조건에서 분화하는 세포를 노출시킴으로써 수행된다. 이러한 조건은 바람직하게는 공동배양 또는 영양세포의 결핍시 배양을 포함한다(상기 참고).
풍부한 배지
또한 또는 이외에 이러한 조건은 풍부한 배지에서 플레이팅 하는 것을 포함한다. 본 명세서에서 사용된 "풍부한 배지"라는 용어는 영양이 풍부한 배지를 나타내는 것이다. 바람직하게는 이러한 배지는 관련된 세포의 성장에 요구로 되는 필수적인 영양소를 포함한다. 바람직하게는 상기 풍부한 배지는 혈청을 포함한다. 더욱 바람직하게는 이것은 이러한 성장에 요구로 되는 대체로 모든 영양소를 포함한다. 가장 바람직하게는 상기 풍부한 배지는 관련된 세포의 성장을 지원, 촉진 및 장려한다. 매우 바람직한 실시태양에서, 관련된 세포는 관심있는 전구세포 또는 추정 전구세포이다. 풍부한 배지의 예로는 4500 ㎎/l D-글루코스를 지닌 DMEM, 20% 우태아혈청을 지닌 보충제, 비-필수 아미노산, L-글루타민 및 β-메르캅토에탄올이다.
바람직한 실시태양에서, 이러한 풍부한 배지는 백혈병 저해 인자(LIF)와 같은 배아줄기세포의 성장을 허용, 촉진 또는 장려하는 추가 성장 조절자 또는 호르몬을 포함하지 않는다.
이러한 실시태양에 따르면, 계속된 증식은 클론화될 수 있는 전구세포를 선택적으로 강화시킨다.
배양시 장기간 유지
바람직하게는 본 명세서에 기술된 방법은 배아줄기세포 또는 한 세대 이상의 이들의 후손을 배양하는 것을 포함한다. 바람직하게는 세포는 5 세대 이상, 10 세대 이상, 15 세대 이상, 20 세대 이상, 25 세대 이상, 50 세대 이상, 40 세대 이상, 45 세대 이상, 50 세대 이상, 100 세대 이상, 200 세대 이상, 500 세대 또는 800 세대 이상 동안 배양된다. 특히 상기 세포주는 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45, 50, 75, 100, 200, 500 또는 그 이상의 세대 동안 유지된다.
접촉저해가 세포 분열 또는 성장의 중단을 야기시킬 때 배양시 세포는 일반적으로 융합할 때까지 성장을 계속할 것이다. 그 다음에 이러한 세포는 조직배양배지로 희석 및 리플레이팅시킴으로써 기질 또는 플라스크로부터 해리, "분할" 또는 계대접종된다. 따라서 전구세포는 배양하는 동안 계대접종 또는 분할된다: 바람직하게는 이들은 1 :2 또는 그 이상, 바람직하게는 1 :3, 더욱 바람직하게는 1 :4, 1 :5 또는 그 이상의 비율로 분할된다. "계대접종"이라는 용어는 세포주 융합성 배지의 분취(aliquot), 새로운 배지로 접종 및 융합 또는 포화가 얻어질 때까지 라인을 배양하는 것으로 구성된 단계를 나타낸다.
그러나 본 명세서에 기술된 방법에 따르는 유래된 전구세포는 이들의 자가-갱신 능력을 기초로 하여 많은 수의 세대동안 유지된다. 한편 이것은 유기체로부터 바로 유래된 "정상"(즉 형질전환되지 않은 체세포) 세포는 사멸하게 된다는 것을 밝혔다. 다시 말하면 이러한 체세포는 배양시 한정된 수명을 지닌다(이들은 사망한다). 이들은 무한정 성장을 계속하지는 않으나 어느 정도의 세대 후에 결국에는 증식 또는 분할하는 능력을 잃는다. "위기 단계"에 도달하자마자 이러한 세포는 약 50 세대 후에 사멸한다. 따라서 이러한 체세포는 제한된 횟수만큼 단독으로 계대접종된다.
중요하게는, 전구세포는 형질전환에 대한 요구 없이도 자가-갱신을 유지할 수 있다. 따라서 예를 들면 종양 세포 또는 종양 세포주와 같은 불멸화된 세포와 함께 융합하는 것과 같은 공지된 형질전환 처리, SV40, EBV, HBV 또는 HTLV-I 과 같은 형질전환 바이러스를 지닌 세포주의 바이러스 감염, 인간 유두종바이러스(papillomavirus)의 DNA 서열(미국 특허 제5,376,542호)을 포함하는 큰 T-항원 (R. D. Berry et al, Br. J. Cancer, 57, 287-289, 1988), 텔로머라제(Bodnar-A-G. et.al., Science (1998) 279: p. 349-52) 또는 벡터의 서열을 포함하는 SV40 벡터와 같은 특별히 적응된 벡터를 지닌 트랜스펙션, 암억제효과(dominant oncogene) 또는 변이에 의한 도입은 전구 세포주를 제조하기 위하여 본 명세서에 기술된 방법을 요구로 하지는 않는다.
본 명세서에 기술된 방법의 바람직한 실시태양에 따르면, 전구세포는 50 세대보다 그 이상 동안 형질전환 없이 증식된다. 바람직한 실시태양에서 전구세포는 전구 세포주로서 무한정 및 형질전환 없이도 증식된다. 전구세포 및 전구 세포주는 바람직하게는 이들의 부모 배아줄시세포와 비교시 제한된 계통을 지닌다. 특히 이들은 세 배엽 모두를 발생시키는 것은 불가능하다. 더욱 바람직한 실시태양에서 전구 세포는 바람직하게는 비-다능성을 지닌다.
전구세포의 특성
바람직한 실시태양에서, 전구 세포 및 세포주(또는 이들로부터 유래된 분화된 세포)는 하나 또는 그 이상의 배아줄기세포의 특성을 나타내지 않는다. 바람직한 이러한 특성은 OCT4 유전자 및 알칼리성 인산분해효소 활성의 발현을 포함한다. 바람직하게는 전구 세포주는 하나 또는 그 이상의 다능성 특성 마커의 감소된 발현을 나타낸다. 이러한 다능성 마커는 하기 상세하게 기술되어 있으나 Nanog, BMP 4, FGF 5, Oct4, Sox-2 및 Utfl를 포함한다.
본 명세서에 기술된 방법에 의한 전구세포는 바람직하게는 비-발암성이다. 바람직하게는 전구세포는 면역저항력저하 또는 면역결핍 숙주 동물로 이식할 때, 종양 형성을 초래하는 부모 배아줄기세포의 이식과 비교시 종양을 초래하지 않는다. 바람직하게는 면역저항력저하 또는 면역결핍 숙주 동물은 SCID 마우스 또는 Ragl -/- 마우스이다. 바람직하게는 전구세포는 이식 지속기간 바람직하게는 2주보다 오래 더욱 바람직하게는 2달보다 오래 가장 바람직하게는 9달보다 오래 후에도 종양을 형성하지 않는다. 종양면역법 테스트에 관한 상세한 프로토콜이 실시예에 개시된다.
또한 본 명세서에 기술된 방법에 의해 제조된 전구세포는 바람직하게는 하나 또는 그 이상의 하기의 특성을 나타낸다. 이들은 바람직하게는 적어도 10 세대 동안 세포 배양이 유지될 때 염색체수에 의해 평가된 것과 같은 충분히 적절한 핵형을 지닌다. 또한 이들은 바람직하게는 여러 세대에 걸쳐 충분히 적절한 유전자 발현 패턴을 나타낸다. 이에 의해 본 발명자들은 유전자의 선택된 세트의 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 전부의 발현 수준이 1 세대의 전구세포 및 다음 세대의 전구세포의 사이에서 변화되지 않는다는 결과를 도출했다.
바람직하게는 유전자 세트는 하나 또는 그 이상의 서브세트 또는 서브세트 전부, 하기를 포함한다: 세르베러스(cerberus)(GenBank 수탁번호: NM_009887, AF031896, AF035579), FABP (GenBank 수탁번호: NM_007980, M65034, AY523818, AY523819), Foxa2 (GenBank 수탁번호: NM_010446, X74937, L10409), Gata-1 (GenBank 수탁번호: NM_008089, Xl 5763, BC052653), Gata-4 (GenBank 수탁번호: NM_008092, AF179424, U85046, M98339, AB075549), Hesxl (GenBank 수탁번호: NM_010420, X80040, U40720, AK082831), HNF4a (GenBank 수탁번호: NM_008261, D29015, BC039220), c-kit (GenBank 수탁번호: NM_021099, Y00864, AY536430, BC075716, AK047010, BC026713, BC052457, AK046795), PDGFRα (NMJ)11058, M57683, M84607, BC053036), Oct4 (GenBank 수탁번호: NM_013633, X52437, M34381, BC068268), Runxl (GenBank 수탁번호: NM_009821, D26532, BC069929, AK051758), Soxl7 (GenBank 수탁번호: NM_011441, D49474, L29085, AK004781), Sox2 (GenBank 수탁번호: NM_011443, U31967, AB108673), Brachyury (NM_009309, X51683), TDGFl (GenBank 수탁번호: NM_011562, M87321) 및 Tie-2 (GenBank 수탁번호: NMJU3690, X67553, X71426, D13738, BC050824)이다.
본 명세서에 기술된 방법은 분화하는 세포뿐만 아니라 전구세포의 제조를 가능케 하며, 이는 전구세포의 클론 후손(clonal descendants)을 포함한다. 세포의 "클론 후손"이라는 용어는 형질전환 처리 또는 유전적 변형을 겪지 않은 세포의 후손에 관한 것이다. 이러한 클론 후손은 중요한 게놈 변화를 겪지 않으며, 게놈 변화는 부모 세포 또는 원종(ancestor), 바람직하게는 배아줄기세포(감소된 잠재력을 저장)와 유전적으로 대체로 동일하다. 또한 "전구세포"라는 용어는 바람직하게는 전구세포 즉 전구 세포주 및 그 반대의 경우로부터 유도된 세포주를 포함한다.
자가-재생 및 분화의 조절자
또한 본 발명자들의 방법은 자가-재생 및 분화의 추정 조절자의 확인에 사용된다. 상기 방법은 후보 분자의 존재 및 부재시 전구 세포주 또는 분화된 세포의 제조에 대해 기술된 방법의 수행 및 분자의 존재가 과정에서 어떤 영향을 미치는지 확인하는 것을 포함한다. 예를 들면 전구세포 또는 분화된 세포의 제조를 가속시키는 분자는 분화의 포지티브 조절자로서 사용된다(또는 자가-재생의 억제제로서). 반대로 과정을 지연시키는 분자는 자가-재생의 분화억제제 또는 촉진제로서 간주된다.
바람직한 실시태양에서, 또한 본 발명자들은 상기 방법에 따라 수득할 수 있는 선택된 계통의 세포, 바람직하게는 전구세포를 제공한다. 지금까지는 선택된 세포가 전구세포인지 확실히 하기에는 전구세포의 제제가 너무 불순하다. 본 발명에 따르는 배양은 대체로 전구세포의 100% 순도 제제를 발생시키며, 달성된 단일 전구세포의 분리를 가능케 한다.
더욱이 바람직한 실시태양에서 본 발명자들은 다수의 세포를 포함하는 성분을 제공하며, 그 점에서 대다수의 세포는 선택된 계통의 전구세포이다. 바람직하게는 적어도 세포의 60%는 선택된 계통의 전구세포이다. 더욱 바람직하게는 적어도 세포의 60%는 전구세포이다. 더욱이 본 발명은 분리된 전구세포를 제공한다. 바람직하게는 세포주라는 용어는 배지에서 유지 및 성장할 수 있는 세포에 관한 것이며, 세포주는 불사멸 또는 무한정의 수명을 나타낸다.
본 명세서에 기술된 방법은 미국 특허 제60/609,216호, 참고문헌으로 포함된 본 명세서에 기술된 바와 같이 분화를 촉진하는 mTOR의 활성 감소와 결합된다.
전구세포의 용도
본 발명자들의 방법은 다양한 타입의 전구세포 및 세포주를 제조하는 것이 가능하다.
예를 들면, 본 발명자들은 말초혈 전구세포(PBPC), 신경세포 전구세포, 조혈 전구세포, 골수(myeloid)전구세포, 상피 전구세포, 골수 간질세포, 골격근 전구세포, 이자섬 전구세포, 중간엽 전구세포, 심장 중배엽 줄기세포, 허파 상피 전구세포, 간 전구 및 내배엽 전구세포의 제조 방법을 기술한다.
본 명세서에 기술된 방법에 따라 제조된 전구세포는 상업적으로 중요한 다양한 연구, 진단 및 치료 과정에 사용될 수 있다. 이들의 용도는 일반적으로 당분야에 잘 공지되어 있으나 여기서 간단하게 기술할 것이다.
예를 들면 줄기세포는 재생 치료용 전구세포 모집단 발생에 사용된다. 전구세포는 체외증폭(ex vivo expansion)에 의해 제조되거나 환자에게 바로 투여된다. 또한 이들은 외상에 따른 손상된 조직의 재-증식(re-population)을 위해 사용된다.
따라서 조혈 전구세포는 골수 대체를 위해 사용되고, 심장 전구세포는 심부전(cardiac failure) 환자를 위해 사용된다. 피부 전구세포는 성장 피부 이식, 환자 및 내피 전구세포, 스텐트 또는 인공심장과 같은 인공 내피를 위해 사용된다.
배아줄기세포 및 이들의 조직줄기세포 유도체는 당뇨병, 알츠하이머 병, 파킨슨 병등과 같은 퇴행성 질병의 치료에 관한 전구세포의 원재료(sources)로서 사용된다. 예를 들면 줄기세포는 NK 또는 암에 대한 면역요법에 관한 가지세포용 전구세포의 원재료로서 사용되며, 여기서 전구세포는 본 명세서에 기술된 방법 및 성분에 의해 제조된다.
본 명세서에 기술된 방법 및 성분이 전구세포의 생성을 가능케 한다는 것이 명백하며, 물론 이는 당분야에 공지된 방법을 사용하여 분화시켜 제조된다. 따라서 분화된 세포의 용도는 이들의 전구세포를 균등하게 부착시킬 것이며, 분화된 세포는 전구세포용 원재료이다.
본 명세서에 기술된 방법 및 성분에 의해 제조된 전구세포는 제약성분, 질병의 치료를 위해 사용된다. 이러한 질병은 재생치료에 의한 치료 가능한 질병을 포함하며, 심부전, 골수질병, 피부병, 화상을 포함하며 또한 당뇨병, 알츠하이머 병, 파킨슨 병 및 암과 같은 퇴행성 질병을 포함한다.
따라서 본 발명자들은 하기를 포함하는 질병의 치료 방법을 기술한다: (a) 배아줄기(ES)를 제공; (b) 배아줄기세포로부터 전구 세포주를 확립, 여기서 전구 세포주는 이들의 자가-갱신 능력을 기초로 하여 선택된다; (d) 전구 세포주로부터 분화된 세포를 선택적으로 유도 ; 및 (e) 환자에게 전구 세포주 또는 분화된 세포를 투여이다.
수득된 MSCs의 특성
본 명세서에 기술된 방법 및 성분에 의해 수득된 MSCs는 당분야에 공지된 것과 같은 일반적으로 MSCs 9 확인에 사용되는 형태, 표현형 및 기능적 기준을 만족시킨다. 참고문헌의 용이함을 위해, 본 명세서에 기술된, 바람직하게는 인간 배아줄기세포로부터 유래된 것과 같은 방법 및 성분에 의해 수득된 줄기세포는 "hESC-MSC"s에 관한 것이다.
따라서 본 명세서에 기술된 방법 및 성분에 의해 수득된 MSCs는 바람직하게는 중간엽 줄기세포의 하나 또는 그 이상의 형태적 특성을 나타낸다. 예를 들면 수득된 MSCs는 섬유모세포 표현형을 지닌 유착성 단층을 형성한다.
더욱이 수득된 MSCs는 바람직하게는 중간엽 줄기세포와 유사하거나 동일한 표면항원 프로파일을 나타낸다. 따라서 수득된 MSCs의 표면항원 프로파일은 CD29+, CD44+, CD49a 및 e+, CDl 05+, CD 166+ 및 CD34-, CD45-9~11을 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 전부를 포함한다.
수득된 MSCs는 당분야에 공지 및 하기에 기술된 방법을 사용하여 중간엽 계통으로 분화된다. 따라서 본 명세서에 기술된 방법 및 성분에 의해 수득된 MSCs는 지방형성, 연골형성 및 골발생9을 포함하는 분화 가능성을 나타낸다.
기술된 바와 같이 수득된 중간엽 줄기세포, 예를 들면 hESC-MSCs는 시험관 내에서 중요한 증식능을 지닌다. 몇몇의 실시태양에서, 수득된 중간엽 줄기세포는 정상 이배체 핵형(diploid karyotype)을 유지하는 동안 적어도 10 모집단 배가(population doubling)를 겪는다. 그러나 바람직하게는 MSCs는 정상 이배체 핵형(diploid karyotype)을 유지하는 동안 적어도 20∼30 모집단 배가를 할 수 있다. 바람직한 실시태양에서, MSCs는 이 기간동안 적절한 유전자 발현 및 표면항원 프로파일을 나타낸다.
바람직하게는 수득된 MSCs는 유전자 발현시 염색체 이상 및/또는 변형과 같은 어떤 결함도 나타내지 않는다. 바람직한 실시태양에서 이러한 결함은 10 계대접종 후, 바람직하게는 12 계대접종 후, 더욱 바람직하게는 15 계대접종 후에 이르기까지 명백하지는 않다.
상동성
바람직한 실시태양에서, 본 명세서에 기술된 방법에 의해 제조된 중간엽 줄기세포는 자연물과 유사 또는 동일(바람직하게는 상동성)하다. 즉, 프로토콜에 의해 분리된 중간엽 줄기 세포(MSC) 클론은 표현형적으로 또는 다르던 간에 서로 높은 유사성 또는 동일성을 나타낸다.
유사성 또는 동일성은 많은 방법 및 하나 또는 그 이상의 특성에 의해 측정된다. 바람직한 실시태양에서, 클론은 유전자 발현시 유사하거나 동일하다. 바람직하게는 방법은 상기 방법에 의해 선택된 둘 또는 그 이상의 중간엽 줄기세포가 동일하거나 유사한 유전자 발현 프로파일, 즉 발현된 유전자 동일성 결합 및 이들의 발현 수준을 나타낸다는 것이다. 바람직하게는 분리된 중간엽 줄기세포의 대체로 전부는 실질적으로 동일 또는 유사한 유전자 발현 프로파일을 나타낸다.
유전자 발현의 상동성은 많은 방법에 의해 측정된다. 바람직하게는 게놈-와이드 유전자 프로파일링은 실시예에 기술된 것과 같은 추출 RNA의 어레이 혼성을 사용하여 수행된다. 전체 RNA는 cDNA에서 추출 및 전환되며, 이는 관련된 게놈으로부터 다수의 유전자 서열을 포함하는 어레이 칩에 혼성화된다. 바람직하게는 어레이는 NCBI 참고 서열(RefSeq) 유전자를 포함하며, 이는 미국의 국립생물정보센터(NCBI)의 직원 및 협력자에 의해 지속적으로 확인, 부연설명 및 보좌하는 유전자를 특성화한다.
샘플간의 유전자 발현은 분석 소프트웨어를 사용하여 비교된다. 바람직한 실시태양에서, 유전자 발현의 유사성 또는 동일성은 "상관계수"로서 발현되었다. 이러한 측정시, 두 샘플간의 큰 상관계수는 두 샘플의 유전자 발현 패턴간의 높은 유사성을 나타낸다. 반대로 두 샘플간의 작은 상관계수는 두 샘플의 유전자 발현 패턴간의 적은 유사성을 나타낸다. 정상화는 이전 데이터 분석의 계통 변화 또는 편재 (강도 편재, 공간 편재, 플레이트 편재 및 배경기술 편재를 포함)를 제거하기 위해 수행된다.
상관 테스트는 당분야에 공지되어 있으며, Hill, T. & Lewicki, P. (2006). Statistics: Methods and Applications. StatSoft, Tulsa, OK, ISBN: 1884233597 (also StatSoft, Inc. (2006). Electronic Statistics Textbook. Tulsa, OK: StatSoft. WEB: http://www.statsoft.com/textbook/stathome.html)에 기술된 것과 같이 T-test 및 피어슨 테스트를 포함한다. 참고문헌은 Khojasteh et al., 2005, A stepwise framework for the normalization of array CGH data, BMC Bioinformatics 2005, 6:274로 구성되어 있다. 또한 Intra-class 상관계수(ICC)는 Khojasteh et al, supra에 기술된 것과 같이 수행된다.
바람직한 실시태양에서, 피어슨 테스트는 피어슨 상관계수를 생성하기 위해서 수행된다. 1.0 상관계수는 동일한 유전자 발현 패턴을 나타낸다.
바람직한 실시태양에서, cDNA는 Sentrix HumanRef-8 Expression BeadChip에 혼성화되고, Illumina BeadStation 50Ox을 사용하여 스캔된다. 바람직하게는 데이터는 Illumina BeadStudio (Illumina, Inc, San Diego, CA, USA)를 사용하여 추출, 정상화 및 분석된다. 그러나 판독자들에게는 적절한 칩 및 스캐닝 하드웨어 및 소프트웨어(상관 측정을 출력하는)가 유전자 발현 프로파일의 유사성 분석에 사용된다는 것이 확실하게 여겨진다.
바람직하게는 상기 방법으로 측정된 두 분리체(isolate)간의 유전자 발현 상관계수는 0.65 보다 크며, 바람직하게는 0.70 보다 크며, 더욱 바람직하게는 0.80 보다 크며, 더욱 바람직하게는 0.85 보다 크며, 더욱 바람직하게는 0.90 보다 크며, 가장 바람직하게는 0.95 보다 크다.
몇몇의 실시태양에서, 본 명세서에 기술된 방법은 중간엽 줄기세포를 생성하며, 이렇게 수득된 중간엽 줄기세포의 둘 또는 그 이상의 분리체간의 중간엽 줄기세포의 유전자 발현 상관 계수는 동일한 RNA 샘플의 기술적 사본(replicate)간의 상관계수와 동일하거나 약간 작으며, 한 달간 분리된 것 같은 시간간격으로 수행된다. 그 밖의 실시태양에서 중간엽 줄기세포의 둘 또는 그 이상의 분리체간의 유전자 발현 상관계수는 0.90 보다 크며, 바람직하게는 0.95 보다 크다.
바람직하게는 유전자 발현 상관계수는 상술한 선택 또는 분류 과정을 겪은 세포에 대해서 이러한 범위에 있다. 바람직하게는 분리체 대다수, 바람직하게는 모든 분리체간의 유전자 발현 상관계수는 이러한 범위에 있다.
따라서, 실시예에 나타난 바와 같이 상관계수는 수득된 5개의 중간엽 줄기세포 배양간의 높은 유사성을 나타내며, 상관계수는 4개의 라인은 0.96, 1개의 라인은 0.90인 사이에 있다; 대조적으로 한 달간 분리되어 분석된 RNA 샘플의 기술적 사본간의 상관계수는 0.97과 0.98 사이에 있다.
따라서 본 발명자들은 대체로 서로 유사하거나 동일한(바람직하게는 상동한) 중간엽 줄기세포를 생성하는 방법을 제공한다. 분리체는 바람직하게는 거의 동일한 유전자 발현 프로파일을 나타낸다.
더욱이 상술한 "내부" 상동성(즉 방법으로부터 MSCs 분리체 간의 상동성), 상동성은 이러한 분리체와 그 밖의 세포 또는 세포타입 사이에서 평가된다. 특히 비교는 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSCs)와 같은 다른 방법으로 유래된 중간엽 줄기세포와 함께 실시된다. 바람직한 실시태양에서 본 명세서에 기술된 방법 및 성분으로 수득된 MSCs는 BM-MSC와 유사, 상동 또는 동일한 유전자 발현 프로파일을 나타낸다. 따라서 수득된 MSCs는 BM-MSCs와 함께 0.5 보다 큰, 바람직하게는 0.6 보다 큰, 바람직하게는 0.7보다 큰 유전자 발현 상관계수를 나타낸다.
따라서 실시예에 나타난 바와 같이, 3개의 독립적으로 유도된 hESC-MSC 모집단과 3개의 BM-MSC 샘플 사이의 페어와이즈 비교는 상관계수 0.72와 유사한 것으로 밝혀졌다.
중간엽 줄기세포 형성의 조절자
또한 본 발명자들의 방법은 배아줄기세포로부터 중간엽 줄기게포의 추정 조절자를 확인하는데 사용된다.
상기 방법은 후보 분자의 존재 및 결핍시 중간엽 줄기세포의 생성을 위해 기술된 방법을 수행하는 것 및 분자의 존재가 과정에 어떤 영향을 끼치는지 확인하는 것을 포함한다. 예를 들면 중간엽 줄기세포의 생성을 가속시키는 분자는 중간엽 줄기세포 형성의 포지티브 조절자로서 사용된다. 반대로 과정을 억제시키는 분자는 중간엽 줄기세포 형성의 저해제로 간주된다.
바람직한 실시태양에서, 또한 본 발명자들은 상기 방법에 따라 수득할 수 있는 세포, 바람직하게는 중간엽 줄기세포를 제공한다. 지금까지는 이들이 공동배양 또는 혈청의 존재를 포함하는 방법에 의해 제조될 때, 중간엽 줄기세포의 제조는 너무 불순하기 때문에 대체로 표현형적으로 유사하지 않거나 동일하지 않거나(예를 들면 유전자 발현을 중요시한다), 임상적 과정에 적절하지 않거나 둘 중 하나이다. 본 발명에 따르는 배양에 대해서, 이것은 실질적으로 100% 순도의 서로 유사하거나 동일한(바람직하게는 상동한) 중간엽 줄기세포를 발생시킬 수 있다.
더욱이 본 발명자들은 분화된 세포를 제조하는 과정, 본 명세서에 기술된 방법에 의해 중간엽 줄기세포를 수득하는 것 및 중간엽 줄기세포를 분화시키는 것을 포함하는 방법을 기술한다. 예를 들면 본 발명자들은 지방세포, 연골세포 및 골세포 등으로 분화시키는 방법을 제공한다. 더욱이 본 발명자들은 이러한 방법에 의해 수득할 수 있는 분화된 세포를 제공한다. 또한 이러한 중간엽 줄기세포 및 분화된 세포로부터 구성된 세포주가 제공된다. 바람직하게는 세포주라는 용어는 배양시 유지 및 성장될 수 있는 세포에 관한 것이며 불멸 또는 무한정의 수명을 나타낸다.
본 명세서에 기술된 방법은 미국 특허 제60/609,216호, 참고문헌으로 포함된 본 명세서에 기술된 바와 같이 분화를 촉진하는 mTOR의 활성 감소와 결합된다.
중간엽 줄기세포로부터의 조절배지의 용도
본 명세서에 기술된 방법 및 성분은 중간엽 줄기세포로부터 조절배지의 생성을 가능케 한다는 것이 확실하다. 따라서 중간엽 줄기세포의 용도는 중간엽 줄기세포로부터의 조절배지를 균등하게 부착시킬 것이다.
본 명세서에 기술된 방법 및 성분에 의해 제조된 중간엽 줄기세포 및 분화된 세포는 제약성분의 제조, 질병의 치료를 위해 사용된다. 이러한 질병은 재생치료에 의한 치료 가능한 질병을 포함하며, 심부전, 골수질병, 피부병, 화상을 포함하며, 또한 당뇨병, 알츠하이머 병, 파킨슨 병 및 암과 같은 퇴행성 질병을 포함한다. 따라서 MSCs로부터의 조절배지는 이러한 질병 치료에 사용된다.
본 명세서에 기술된 방법 및 성분에 따라 제조된 것과 같은 중간엽 줄기세포로부터의 조절배지는 상업적으로 중요한 다양한 연구, 진단 및 치료 과정에 사용될 수 있다.
특히 중간엽 줄기세포로부터의 조절배지는 제약성분의 제조, 질병의 치료를 위해 사용된다. 이러한 질병은 재생치료에 의한 치료 가능한 질병을 포함하며, 심부전, 골수질병, 피부병, 화상을 포함하며, 또한 당뇨병, 알츠하이머 병, 파킨슨 병 및 암과 같은 퇴행성 질병을 포함한다.
실시예에 나타난 바와 같이, 본 명세서에 기술된 방법 및 성분에 의해 제조된 중간엽 줄기세포는 골수 유래 중간엽 줄기세포(BM-MSCs)와 유사하거나 동일한 특징을 지닌다. 따라서 이들로부터 제조된 중간엽 줄기세포 및 분화된 세포뿐만 아니라 이들로부터 유래된 조절배지는 이용되는 것으로 공지된 BM-MSCs에 대한 적용 또는 이들의 사용을 가능케 하는 적용 중 어느 하나에 사용된다.
조절배지의 전달
본 명세서에 기술된 바와 같이 조절배지는 석절한 방법으로 인간 또는 동물의 몸에 전달된다.
따라서 본 발명자들은 목표 세포, 조직, 기관, 동물체 또는 사람의 몸으로 본 명세서에 기술된 조절배지를 전달하는 전달체계 및 목표에 조절배지를 전달하는 전달체계를 사용하는 방법을 기술한다.
전달체계는 조절배지를 포함하는 컨테이너와 같은 조절배지의 원재료를 포함한다. 전달체계는 목표에 조절배지를 투여하는 디스펜서(dispenser)를 포함한다.
따라서 본 발명자들은 조절배지를 전달, 목표에 조절배지를 전달하는 것이 가능한 디스펜서와 함께 본 명세서에 기술된 조절배지의 원재료를 포함하는 전달체계를 제공한다.
더욱이 본 발명자들은 목표에 조절배지를 제공하는 방법에 있어서 이러한 전달체계의 용도를 제공한다.
몸으로 용액을 전달하는 전달체계는 당분야에 공지되어 있으며, 미국 특허 제6,139,524호에 기술된 것과 같은 주사, 외과적 주입, 카테터(관류 카테터를 포함) 예를 들면 미국 특허 제7,122,019호에 기술된 것과 같은 약물 전달 카테터를 포함한다.
폐 또는 비강내로 전달하는 것을 포함하는 비강(nasal passage)으로의 전달은 당분야에 공지된 것과 같은 예를 들면 비내 분무, 퍼퍼(puffer), 흡입기 등을 사용하여 이루어진다(예를 들면 미국 의장 제D544,957호에 나타난 것과 같은).
신장으로의 전달은 미국 특허 제7,241,273호에 기술된 것과 같은 동맥내 신장 전달 카테터를 사용하여 이루어진다.
특이적 전달은 최적의 치료를 위해서 적절한 간격으로 조절배지의 요구량을 전달하는 것으로 구성될 수 있음이 명백하다.
예를 들면 조절배지는 죽상동맥경화증(atherosclerosis)의 치료 또는 예방을 위해 사용된다. 여기서, 조절배지의 관류는 죽상경화판을 안정화 또는 판(plaque)에서 염증을 감소시키기 위해서 정맥내에서 행해진다. 조절배지는 정맥내 관류에 의해 패혈성 쇼크를 치료 또는 예방하기 위해서 사용된다.
조절배지는 심부전을 치료 또는 예방하기 위해 사용된다. 이것은 재형성을 억제 또는 심부전을 억제하는 조절배지의 만성 관동맥내 또는 내부심근의 관류에 의해 달성된다. 조절배지는 비강내 전달에 의한 폐 염증의 치료 또는 예방을 위해 사용된다.
조절배지는 피부 상태, 예를 들면 건선의 치료 또는 예방에 사용된다. 조절배지의 장기간에 걸친 전달은 상태가 해결될 때까지 경피(transdermal) 미세주사 바늘을 이용하여 사용된다.
상기 전달 방법은 조절배지가 전달되는 특정 기관에 의존하는 것이 명백하며, 당업자가 사용할 방법을 결정할 수 있다.
심장 염증의 치료시 조절배지는 흉벽을 통해 직접 관동맥내 주사에 의해 또는 심근과 같은 조직으로 직접 주사 또는 신체의 루멘으로 삽입되는 스텐트 또는 카테터로부터 저해제를 주입하는 것에 관한 형광투시 지침서의 방법을 기초로 하여 기준 경피적 카테터를 사용하여 예를 들면 심장조직(즉 심근, 심장막, 또는 심장내막)으로 전달된다.
어떤 다양한 관상동맥 카테터 또는 관류 카테터는 조성물 투여에 사용된다. 또한 조절배지는 관상동맥 혈관에 놓은 스텐트 상에서 코팅되거나 스며든다.
조직 재생
또한 본 명세서에 기술된 방법 및 성분에 따라 제조된 중간엽 줄기세포 및 분화된 세포 및 이들로부터 유래된 조절배지는 조직 재구성 또는 재생을 필요로 하는 환자를 위해 사용된다. 세포의 계획된 조직 자리로 이식 및 기능적으로 불완전한 지역을 재구성 또는 재생을 허락하는 방식으로 세포에 투여된다.
예를 들면, 본 명세서에 기술된 방법 및 성분은 줄기세포 분화의 조절에 사용된다. 중간엽 줄기세포 및 분화된 세포 및 이들로부터 유래된 조절배지는 피부이식 성장과 같은 조직공학에 사용된다. 줄기세포 분화의 모듈레이션은 인공기관 또는 조직의 생체공학 또는 스텐트와 같은 보철학에 사용된다.
암(Cancer)
본 명세서에 기술된 방법 및 성분에 의해 제조된 중간엽 줄기세포 또는 분화된 세포 및 이들로부터 유래된 조절배지는 암의 치료에 사용된다.
"암(cancer)" 및 "암종(cancerous)"이라는 용어는 조절되지 않은 세포 성장에 의해 일반적으로 특성화되는 포유류의 생리적 조건에 관한 것이거나 이것을 기술한 것이다. 암의 예는 암종(carcinoma), 림프종, 모세포종(blastoma), 육종(sarcoma) 및 백혈병을 포함하나 이것에 제한되는 것은 아니다.
이러한 암의 더욱 특별한 예는 편평세포(squamous cell)암, 소세포폐암, 비-소세포폐암, 위암, 췌장암, 아교모세포종 및 신경섬유종증과 같은 아교세포 종양, 자궁경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간세포암(hepatoma), 유방암, 결장암, 결장직장암(colorectal cancer), 자궁내막암종, 침샘암종(salivary gland carcinoma), 신장암, 신암(renal cancer), 전립선암, 외음암, 갑상선암, 감암종 및 다양한 타입의 두경부암을 포함한다. 추가적인 예는 결장암, 유방암, 폐암 및 포복성암(prostrate cancer), 백혈병 및 림프종을 포함하는 조혈암, 호지킨병, 재생불량빈혈, 피부암 및 가족성 대장폴립증을 포함하는 고형종양이다. 추가적인 예는 뇌종양(neoplasms), 결장직장 종양, 유방 종양, 자궁경부 종양, 눈 종양, 간 종양, 폐 종양, 췌장 종양, 난소 종양, 전립선 종양, 피부 종양, 고환 종양, 종양, 골 종양, 영양막 종양, 난관 종양, 직장 종양, 결장 종양, 신장 종양, 위 종양 및 부갑상선 종양을 포함한다. 또한 유방암, 포복성암(prostate cancer), 췌장암, 결장직장암, 폐암, 악성흑생종, 백혈병, 림프종, 난소암, 자궁경부암 및 쓸개암종이 포함된다.
또한 본 명세서에 기술된 방법 및 성분에 따라 제조된 중간엽 줄기세포 및 분화된 세포는 엔도스타틴 및 혈관생성억제인자(angiostatin) 또는 세포독성제 또는 화학요법제와 같은 항암제와 협력하여 사용된다. 예를 들면 아드리아마이신, 다우노마이신, 시스-플래티넘, 에포토사이드, 택솔, 택소티어 및 빈크리스틴과 같은 알칼로이드 및 메토트렉세이트와 같은 항대사물질과 같은 약제이다. 본 명세서에 사용된 "세포독성제"라는 용어는 세포의 기능을 억제 또는 예방 및/또는 세포의 파괴를 야기시키는 물질에 관한 것이다. 상기 용어는 박테리아, 진균, 식물 또는 동물 기원 또는 이들 단편의 독소를 효소에 의해 활성 시키는 것과 같은 방사성동위원소(예를 들면 I, Y, Pr), 화학요법제 및 독소를 포함하는 것을 의미한다.
또한 상기 용어는 하기와 같은 종양유전자(oncogene) 생성물/티로신 키나아제 억제제를 포함한다: WO 94/22867에 기술된 두고리 안사마이신; EP 600832에 기술된 l,2-비스(아릴아미노) 벤조산 유도체; EP 600831에 기술된 6,7-디아미노-프탈라진-1-온 유도체; EP 516598에 기술된 것과 같은 4,5-비스(아릴아미노)-프탈이미드 유도체; 또또는 SH2-함유 기질 단백질에 티로신 키나케의 결합을 억제하는 펩티드(예를 들면 WO 94/07913를 참고)이다. "화학요법제"는 암 치료에 유용한 화학 조성물이다. 화학요법제의 예는 아드리아마이신, 독소루비신, 5-플루오로우라실(5-FU), 사이토신 아라비노시드(Ara-C), 시클로포스파미드, 타이오테파(Thiotepa), 부설판, 사이토신, 택솔, 메토트렉세이트, 시스플라틴, 멜팔란, 빈블라스틴, 블레오마이신, 에토포사이드, 이포스파마이드. 미토마이신 C, 미톡산트론(Mitoxantrone), 빈크리스틴, VP-16m, 비노렐빈, 카보플라틴, 테니포사이드, 다우노마이신, 카르미노마이신, 아미노프테린, 닥티노마이신, 마이토마이신, 니코틴아미드, 에스페라미신(Esperamicins)(미국 특허 제4,675,187호 참고), 멜팔란 및 그 밖의 관련된 니트로젠 머스타드, 및 내분비샘 요법(디에틸스틸베스토롤(DES), 타목시펜, LHRH 중화제, 프로제스틴, 항-프로제스틴 등)이다.
줄기세포
본 명세서에 나타난 바와 같이 "줄기세포"라는 용어는 분열시 2개의 발달 선택에 직면한 세포에 관한 것이다: 딸세포는 원시세포(자가-재생)와 동일하거나 이들은 더욱 분화된 세포 타입(분화)의 전구세포이다. 따라서 줄기세포는 어떤 경로 또는 그 밖의 경로에 적용하는 것이 가능하다(추가 경로는 각각의 세포 타입 중 하나가 형성되는 곳에 존재한다). 따라서 줄기세포는 최종적으로 분화되지 않은 세포이며 다른 타입의 세포를 생성하는 것이 가능하다.
본 명세서에 언급된 줄기세포는 만능줄기세포(Totipotent stem cells), 전분화능 줄기세포(pluripotent stem cells) 및 다능성 줄기세포(multipotent stem cells)를 포함한다.
만능줄기세포(Totipotent Stem Cells)
"만능" 세포라는 용어는 성체에서 어떤 세포 타입으로도 또는 배외막의 어떤 세포(예를 들면 태반)로도 될 수 있는 잠재력을 지닌 세포에 관한 것이다. 따라서 만능세포는 수정란 및 첫번째 4기 정도의 난할에 의해 생성된 세포이다.
전분화능 줄기세포(Pluripotent Stem Cells)
"전분화능 줄기세포"는 개체에서 어떤 분화된 세포를 만들 수 있는 잠재력을 지닌 진짜 줄기세포이다. 그러나 이들은 영양막으로부터 유래된 배외막을 만드는데는 기여할 수 없다. 전분화능 줄기세포의 여러 타입이 알려져 있다.
배아줄기세포(Embryonic Stem Cells)
배아줄기(ES)세포는 영양막의 속세포덩이(ICM)으로부터 분리되며, 이는 이식할 때 배아 발달 단계이다.
배아생식세포(Embryonic Germ Cells)
배아생식(EG)세포는 유산된 태아의 생식샘의 전구물질로부터 분리된다.
배아종양세포(Embryonic Carcinoma Cells)
배아종양(EC)세포는 태아의 생식샘에서 때때로 발생하는 기형암종, 종양으로부터 분리된다. 처음 둘과 달리, 이들은 보통 홀배수체이다. 전분화능 줄기세포의 이들 타입의 세 개 모두는 배아 또는 태아 조직으로부터 분리되며, 배양시 성장될 수 있다. 분화로부터 이들 전분화능세포를 보호하는 방법은 당분야에 공지되어 있다.
성체줄기세포(Adult Stem Cells)
성체줄기세포는 골수이식시 활성 컴포넌트인 줄기세포를 형성하는 신경세포, 피부 및 혈액을 포함하는 다양한 타입을 포함한다. 또한 후자의 줄기세포 타입은 제대-유래 줄기세포의 중요한 특징이다. 세포 타입의 정확한 수치는 선택된 줄기세포의 타입에 의해 제한될지라도 성체줄기세포는 실험실 및 몸 안에서 모두 기능적으로, 더욱 특이적인 세포 타입으로 성숙될 수 있다.
다능성 줄기세포(Multipotent Stem Cells)
다능성 줄기세포는 진짜 줄기세포이나 제한된 타입의 수로만 분화될 수 있다. 예를 들면 골수는 혈액의 모든 세포를 발생시키나 세포를 다른 타입으로는 발생시키지 못하는 다능성 줄기세포를 포함한다. 다능성 줄기세포는 성체 동물에 알려져 있다. 개체에서 모든 기관(뇌, 간)은 죽은 또는 손상된 세포를 대체할 수 있는 다능성 줄기세포를 포함하는 것으로 여겨진다.
특성화된 줄기세포의 방법은 당분야에 공지되어 있으며, 클론에세이, 유식세포측정, 장기배양 및 분자생물학 기술, 예를 들면 PCR, RT-PCR 및 Southern blotting과 같은 표준 에세이의 사용을 포함한다.
형태 차이에 더하여, 인간 및 뮤린 전분화능 줄기세포는 많은 수의 세포표면항원(줄기세포마커) 발현과는 다르다. 단계-특이적 배아 항원 1 및 4 (SSEA-I 및 SSEA-4) 및 종양거부항원 1-60 및 1-81 (TRA-1-60, TRA-1-81)을 포함하는 줄기세포 마커의 확인에 관한 항체는 상업적으로 예를 들면 Chemicon International, Inc (Temecula, CA, USA)로부터 수득된다. 단일클론항체를 사용하는 이들 항원의 면역학적 검출은 전분화능 줄기세포를 특성화하는데 광범위하게 사용된다(Shamblott MJ. et. al. (1998) PNAS 95: 13726-13731; Schuldiner M. et. al. (2000). PNAS 97: 11307 - 11312; Thomson J.A. et. al. (1998). Science 282: 1145-1147; Reubinoff B.E. et. al. (2000). Nature Biotechnology 18: 399-404; Henderson J.K. et. al. (2002). Stem Cells 20: 329-337; Pera M. et. al. (2000). J. Cell Science 113: 5-10.).
줄기세포의 원재료
하기의 비-제한 예를 포함하는 다양한 타입의 줄기세포는 중간엽 줄기세포 및 분화된 세포를 생성하기 위한 본 명세서에 기술된 방법 및 성분에 사용된다.
미국특허 제5,851,832호는 뇌 조직으로부터 수득된 다능성 신경줄기세포를 공표하고 있다. 미국특허 제5,766,948는 신생아의 대뇌반구로부터의 신경모세포 생성을 공표하고 있다. 미국특허 제5,654,183호 및 제5,849,553호는 포유류의 신경능선줄기세포의 사용을 공표하고 있다. 미국특허 제6,040,180호는 포유류의 다능성 CNS 줄기세포로부터 분화된 신경세포의 시험관 내 발생을 공표하고 있다. WO 98/50526 및 WO 99/01159는 신경상피 줄기세포, 희소돌기교세포-별아교세포 전구체 및 계통-제한 신경세포 전구체의 생성 및 분리를 공표하고 있다. 미국특허 제5,968,829호는 배아전뇌로부터 수득되고 글루코스, 트랜스페린, 인슐린, 셀레늄, 프로게스테론 및 그 밖의 여러 성장 인자를 포함하는 배지에서 배양된 신경줄기세포를 공표하고 있다.
일차 간세포 배양은 인간 생검으로부터 수득될 수 있거나 콜라겐분해효소 및 히알루론산분해효소의 적절합 결합으로 관류에 의해 외과적으로 조직을 잘라낼 수 있다. 또한 EP 0 953 633 Al은 인간 간조직을 잘게 썰어 준비함으로써 간세포를 분리, 성장배지에서 농축된 조직세포를 재현탁 및 배양시 세포를 확장시키는 것에 대해 공표하고 있다. 성장배지는 글루코스, 인슐린, 트랜스페린, T3, FCS 및 악성세포전환 없이 성장하는 간세포를 허용하는 다양한 조직 추출물을 포함한다. 간에서 상기 세포는 간실질세포, 쿠퍼세포, 굴모양 내피(sinusoidal endothelium) 및 쓸개관 상피 및 또한 성숙 간세포 또는 담즙 상피세포(biliary epithelial cell)로 분화되는 능력을 지닌 전구세포("간모세포" 또는 "타원세포"와 관련된)를 포함하는 특이적 세포를 포함하는 것으로 여겨진다(L. E. Rogler, Am. J. Pathol. 150:591, 1997; M. Alison, Current Opin. Cell Biol. 10:710, 1998; Lazaro et al., Cancer Res. 58:514, 1998).
미국특허 제5,192,553호는 인간 신생아 또는 태아 조혈 줄기 또는 전구 세포를 분리하는 방법을 공표하고 있다. 미국특허 제5,716,827호는 Thy-1 포지티브 전구세포인 인간 조혈세포 및 시험관 내에서 이들을 재생시키는 적절한 성장배지를 공표하고 있다. 미국특허 제5,635,387호는 인간 조혈세포 및 이들의 전구체를 배양하는 방법 및 장치를 공표하고 있다. 미국특허 제6,015,554호는 인간 림프구 및 가지세포를 재구성하는 방법을 기술한다.
미국특허 제5,486,359호는 뼈, 연골, 힘줄, 인대 및 진피와 같은 많은 결합조직 타입의 세포로 분화될 수 있는 인간 중간엽 줄기세포의 상동한 모집단을 공표하고 있다. 이들은 골수 또는 골막으로부터 수득될 수 있다. 또한 공표하고 있는 것은 중간엽 줄기세포를 확장하는데 사용된 배양 조건이다. WO 99/01145는 G-CSF 또는 GM-CSF와 같은 성장인자로 처리된 각각의 말초혈로부터 분리된 인간 중간엽 줄기세포를 공표하고 있다. WO 00/53795는 실질적으로는 지방세포 및 적혈구가 없는 지방조직-유래 줄기세포 및 격자를 공표하고 있다. 이들 세포는 전하는 바에 의하면 호르몬 및 조절배양배지를 제조하기 위해 팽창 및 배양될 수 있다.
어떤 척추동물의 줄기세포라도 사용될 수 있다. 비-인간 영장류, 가축(domestic animals), 가축류(livestock) 및 설치류, 마우스, 래트 등과 같은 그 밖의 비-인간 표유류뿐만 아니라 인간으로부터의 줄기세포가 포함된다;
본 발명의 용도에 가장 적절한 줄기세포는 임신 동안 어느 정도의 시간이 지난 포배 또는 태아 또는 배아조직과 같은 임신 후에 형성된 조직으로부터 유도된 영장류의 전분화능 줄기(pPS)세포이다. 비-제한 예는 일차 배양 또는 배아줄기세포의 확립주(established line)이다.
배지 및 영양세포
전분화능 줄기세포를 분리 및 증식하기 위한 배지는 수득된 세포가 원하는 특성을 지니는 한 여러개의 상이한 포뮬라 중 무엇이든지 지닐 수 있으며, 뒤 따라 증식될 수 있다.
적절한 원재료는 하기와 같다: Dulbecco's modified Eagles medium (DMEM), Gibco#l 1965-092; Knockout Dulbecco's modified Eagles medium (KO DMEM), Gibco# 10829-018; 200 mM L-글루타민, Gibco# 15039-027; 비-필수 아미노산 용액 , Gibco 11140-050; β-메르캅토에탄올, Sigma#M7522; 인간 재조합 염기성섬유모세포성장인자(bFGF), Gibco#13256-029이다. 대표적인 혈청-함유 배아줄기(ES) 배지는 80% DMEM (통상적으로 KO DMEM), 열불활성화되지 않은 20% 한정 우태아혈청(FBS), 0.1 mM 비-필수 아미노산 용액 , 1 mM L-글루타민, and 0.1 niM β-메르캅토에탄올로 제조된다. 상기 배지는 2주 이내동안 4℃에서 여과 및 저장된다. 무혈청 배아줄기(ES) 배지는 80% KO DMEM, 20% 혈청 대체물, 0.1 mM 비-필수 아미노산, 1 mM L-글루타민, 및 0.1 mM β-메르캅토에탄올로 제조된다. 효과적인 혈청 대체물은 Gibco#10828-028이다. 상기 배지는 2주 이내동안 4℃에서 여과 및 저장된다. 사용하기 바로 전에, 인간 bFGF는 최종 농도 4 ng/mL에 첨가된다(Bodnar et al., Geron Corp, International Patent Publication WO 99/20741).
바람직한 실시태양에서, 상기 배지는 Knockout DMEM 배지(Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York), 10% 혈청 대체물 배지를 지닌 보충제(Invitrogen- Gibco, Grand Island, New York), 5ng/ml FGF2 (Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York) 및 5ng/ml PDGF AB (Peprotech, Rocky Hill, New Jersey)를 포함한다.
영양세포(본 명세서에서 사용된)는 90% DMEM (Gibco#l 1965-092), 10% FBS (Hyclone#30071-03), 및 2 mM 글루타민을 포함하며, mEF 배지에서 증식된다. mEFs는 트리십 처리 하루걸러 1 :2로 세포를 분열시키며, 세포 서브컨플런트(subconfluent)를 보유하며, Tl 50 플라스크(Coming#430825)에서 증식된다. 영양세포층을 제조하기 위해, 증식을 저해하나 인간 배아줄기세포를 지원하는 중요한 인자의 합성을 용인하기 위해서 세포에 방사선이 조사된다(약 4000 rads γ 방사선조사). 6-웰 배양 플레이트(Falcon#304와 같은)는 37℃에서 밤새 웰 당 1 mL 0.5% 젤라틴으로 배양함으로써 코팅되며, 웰 당 375,000 방사선 조사된 mEFs와 함께 플레이트된다. 영양세포층은 플레이팅 후 5시간 ∼4일에 통상적으로 사용된다. 배지는 pPS 세포를 뿌리기(seeding) 바로 전에 새로운 인간 배아줄기(hES) 배지로 대체된다.
그 밖의 줄기세포 배양에 관한 조건이 공지되어 있으며, 이러한 조건은 세포 타입에 따라 적절하게 활용될 수 있다. 이전의 섹션에서 언급된 특이적 세포 타입에 관한 배지 및 배양기술이 인용된 참고문헌에 제공된다.
배아줄기세포
배아줄기세포는 영장류의 포배로부터 분리될 수 있다(Thomson et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92:7844, 1995). 인간 배아줄기(hES)세포는 Thomson et al. (미국특허 제5,843,780호; Science 282:1145, 1998; Curr. Top. Dev. Biol. 38:133 ff, 1998) 및 Reubinoff et al, Nature Biotech. 18:399,2000에 기술된 기술을 사용하여 인간 포배세포로부터 제조될 수 있다.
간락하게, 인간 포배는 착상적 인간의 배낭으로부터 수득될 수 있다. 또한 체외수정(IVF) 배낭이 사용될 수 있거나, 또는 하나의 세포 인간 배낭은 포배단계에서 팽창된다(Bongso et al., Hum Reprod 4: 706, 1989). 인간 배낭은 Gl.2 및 G2.2 배지에서 포배단계에 배양된다(Gardner et al., Fertil. Sterol. 69:84, 1998). 발달하는 포배는 배아줄기세포 분리를 위해 선택된다. 투명대는 프로나제(Sigma)에 단시간 노출됨으로써 포배로부터 제거된다. 속세포덩이는 면역외과학에 의해 분리되며, 여기서 포배는 30분 동안 래빗 항-인간 지라세포 항혈청의 1:50 희석물에 노출되며, 그 다음에 5분 동안 DMEM에서 3번 세척되고 3분 동안 기니피그 보체(Gibco)의 1 :5 희석물에 노출된다(Solter et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 72:5099, 1975 참고). DMEM에서 추가적인 두 번의 세척 후, 분해된 영양막 세포(trophectoderm cell)는 부드러운 피펫팅에 의해 무침습(intact) 속세포덩이(ICM) 및 mEF 영양층 상으로 플레이트된 ICM으로부터 제거된다.
9∼15일 후, 속세포덩이-유래 증식물(outgrowth)은 1 mM EDTA를 지닌 칼슘 및 마그네슘-유리 PBS에 노출되거나, 디스파제 또는 트립신에 노출되거나, 또는 마이크로피펫으로 기계적으로 해리됨으로써 클럼프(clump)로 해리된다; 그 다음에 새로운 배지의 mEF 상으로 재-플레이트 된다. 해리된 세포는 새로운 배아줄기(ES)배지의 mEF 영양층 위로 재-플레이트 되며, 콜로니 형성을 위해 관찰된다. 미분화된 형태를 나타내는 콜로니는 마이크로피펫에 의해 개별적으로 선별되며, 클럼프(clump)로 기계적으로 해리되며, 및 재-플레이트 된다. 배아줄기세포-유사 형태는 세포질 비해 외관상으로 큰 핵 및 두드러진 핵소체를 지니는 컴팩트 콜로니로서 특성화된다. 다음에 이렇게 만들어진 배아줄기세포는 간단한 트립신화, Dulbecco's PBS (칼슘 또는 마그네슘은 없고 2 mM EDTA를 지닌)에 노출, type IV 콜라겐 분해효소(약 200 U/mL; Gibco)에 노출됨으로써 또는 마이크로피펫으로 각각의 콜로니를 선별함으로써 정기적으로 1∼2주마다 분열된다. 약 50∼100개의 세포의 클럼프 사이즈가 최적이다.
배아생식세포
인간 배아생식(hEG)세포는 마지막 월경 주기 후에 약 8∼11 지나서 인간 태아 물질의 존재시 원시생식세포로부터 제조된다. 적절한 제조 방법은 Shamblott et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 95:13726, 1998 및 미국특허 제6,090,622호에 기술된다.
간략하게 생식융기는 등장성 완충액으로 헹궈지며, 그 다음에 0.1 mL 0.05% 트립신/0.53 mM 나트륨 EDTA 용액(BRL)으로 이동되고, 1 mm3 보다 작은 조작으로 절단된다. 그 다음에 상기 조직은 더욱이 세포를 분해하기 위해서 100/μL 팁(tip)을 통해 피펫으로 옮겨진다. 이것은 5분 동안 37℃에서 배양되며, 그 다음에 약 3.5 EG 성장 배지가 첨가된다. EG 성장 배지는 DMEM, 4500 mg/L D-글루코스, 2200 mg/L mM 중탄산염나트륨; 15% 배아줄기(ES) 한정된 우태아혈청(BRL); 2 mM 글루타민(BRL); 1 mM 나트륨 피루베이트(BRL); 1000-2000 U/mL 인간 재조합 백혈병 저해 인자(LIF, Genzyme); 1-2 ng/ml 인간 재조합 염기성섬유모세포성장인자(bFGF, Genzyme); 및 10 μM 포르스콜린(10% DMSO)이다. 다른 접근법에 있어서, EG 세포는 히알루론산분해효소/콜라겐분해효소/DNA분해효소를 사용하여 분리된다. 장간막을 지닌 생식샘 원기(gonadal anlagen) 또는 생식융기는 태아 물질로부터 분리되며, 생식융기는 PBS에서 헹궈지며, 그 다음에 0.1 ml HCD 소화용액(0.01% 히알루론산분해효소 type V, 0.002% DNA분해효소 I, 0.1% 콜라겐분해효소 type IV, EG 성장 배지에서 제조된 Sigma로부터의 모든 것)으로 이동된다. 조직은 잘게 썰어지며, 37℃에서 1시간 또는 밤새 배양되며, EG 성장 배지1∼3 mL에서 재현탁되며, 영양층위에 놓여진다.
96 웰 조직 배양 플레이트는 LIF, bFGF 또는 포르스콜린이 없는 변이된 EG 성장 배지에서 3일 동안 배양된 영양세포의 서브-컨플런트 층과 함께 제조되며, 5000 rad y-방사선조사로 불활성화된다. 적절한 영양세포는 STO 세포(ATCC 수탁번호 CRL 1503)이다. 일차생식세포(PGC) 현탁액 0.2 mL이 각각의 웰에 첨가된다. 첫 번째 계대접종은 EG 성장 배지에서 7∼10일 후에 실시되며, 방사선조사된 STO 마우스 섬유모세포와 함께 미리 제조된 24-웰 배양 접시의 하나의 웰에서 각각의 웰로 전달된다. 세포 형태가 EG 세포와 동일하게 관찰될 때까지, 통상적으로 7∼30일 또는 1∼4 계대접종 후 상기 세포는 배지의 데일리 대체물과 함께 배양된다.
자가-재생 및 분화
자가-재생
자가-재생되는 줄기세포는 당분야에 공지된 다양한 방법 예를 들면 형태학, 면역조직화학, 분자생물학 등에 의해 확인된다.
이러한 줄기세포는 바람직하게는 Oct4 및/또는 SSEA-I의 증가된 발현을 나타낸다. 바람직하게는 FIk-I, Tie-2 및 c-키트의 어느 하나 또는 그 이상의 발현이 감소된다. 자가-재생되는 줄기세포는 바람직하게는 자가-재생되지 않는 줄기세포와 비교시 짧은 축된 세포주기를 나타낸다.
예를 들면 이차원 표준 현미경 이미지에서, 인간 배아줄기세포는 평면 이미지에서 높은 핵/세포질 비율, 두드러진 핵소체 및 디스셈버블(discemable) 세포 연결이 불완전한 컴팩트 콜로니 형성을 나타낸다. 세포주는 표준 G-블랜딩 기술(Oakland Calif에 있는 세포유전학 실험실과 같은 일상적인 핵형화 서비스를 제공하는 많은 임상적 진단 실험실에서 가능함)을 사용하여 핵형화될 수 있으며 공표된 인간 핵형과 비교된다.
또한 인간 배아줄기 및 인간 배아생식세포는 발현된 세포 마커에 의해 특성화된다. 일반적으로 본 명세서에 기술된 조직-특이적 마커는 막-결합 마커에 대한 유식세포측정, 세포내 마커에 관한 면역조직화학 및 배지로 분비되는 마커에 관한 효소-결합 면역분석법과 같은 적절한 면역학-기술을 이용하여 검출될 수 있다. 또한 단백질 마커의 발현은 마커-특이적 프라이머를 사용하여 역전사효소-PCR에 의해 mRNA 농도에서 검출될 수 있다. 추가 세부사항에 대해서는 미국특허 제5,843,780를 참고하라.
단계-특이적 배아항원(SSEA)는 확실한 배아 세포 타입의 특성을 지닌다. SSEA 마커에 관한 항체는 Developmental Studies Hybridoma Bank (Bethesda Md.)로부터 사용가능하다. 그 밖의 유용한 마커는 Tra-1-60 및 Tra-1-81 (Andrews et al., Cell Linesfrom Human Gern Cell Tumors, in E. J. Robertson, 1987, supra)에 명시된 항체를 이용하여 검출가능하다. 인간 배아줄기세포는 일반적으로 SSEA-I 네가티브 및 SSEA-4 포지티브이다. hEG 세포는 일반적으로 SSEA-I 포지티브이다. 시험관내 pPS 세포의 분화는 SSEA-4, Tra-1-60, 및 Tra-1-81 발현 감소와 SSEA-I의 증가된 발현을 초래한다. 또한 pPS 세포는 알칼리성 인산분해효소 활성의 존재에 의해 특성화되며, 이는 4% 파라포름알데하이드로 세포를 고정시킴으로써 검출될 수 있으며 그 다음에 제조업자에 의해 기술된 것 같은 기질로서 Vector Red를 발달시킬 수 있다(Vector Laboratories, Burlingame Calif.).
또한 배아줄기??는 일반적으로 텔로머라아제 포지티브 및 OCT-4 포지티브이다. 텔로머라아제 활성은 TRAP 활성 에세이(Kim et al., Science 266:2011, 1997), 상업적으로 이용 가능한 키트(TRAPeze.RTM. XK Telomerase Detection Kit, Cat. s7707; Intergen Co., Purchase N. Y.; or TeloTAGGG.TM. Telomerase PCR ELISA plus, Cat. 2,013,89; Roche Diagnostics, Indianapolis)를 사용하여 측정될 수 있다. 또한 hTERT 발현은 RT-PCR에 의해 mRNA 농도에서 측정될 수 있다. LightCycler TeloTAGGG.TM. hTERT 정량 키트(Cat. 3,012,344; Roche Diagnostics) 연구 목적으로 상업적으로 이용 가능하다.
분화
중간엽 줄기세포 및 이들로부터 유래된 분화된 세포를 포함하는 분화하는 세포는 바람직하게는 4E-BP1 및/또는 S6K1의 증진된 탈인산화를 나타낸다. 이들은 바람직하게는 Oct4 및/또는 SSEA-I의 감소된 발현을 나타낸다. 바람직하게는 FIk-I, Tie-2 및 c-kit의 어느 하나 또는 그 이상의 발현이 증가된다. 바람직하게는 Brachyury, AFP, nestin 및 nurrl 발현의 어느 하나 또는 그 이상의 발현이 증가된다. 자가-재생되는 줄기세포는 자가-재생되지 않는 줄기세포와 비교시 바람직하게는 길어진 세포주기를 나타낸다.
분화하는 줄기세포 즉 분화경로를 시작하거나 분화 경로로 인도되는 세포는 특이적 전사 변화를 포함하는 많은 표현형기준에 따라 특성화될 수 있다. 상기 기준은 형태적 특성, 발현된 세포 마커 및 효소 활성의 검출 및 정량, 유전자 발현 , 및 생체 내에서 세포의 기능적 특징의 분화의 특성을 포함하나 이에 제한되는 것은 아니다. 일반적으로 분화하는 줄기 세포는 분화 과정의 최종 산물인 세포 타입 즉 분화된 세포의 특징을 하나 또는 그 이상 포함한다. 예를 들면 목표 세포 타입이 근육세포이면, 이러한 세포로 분화하는 공정에 있는 줄기세포는 예를 들면 마이오신 발현의 특징을 지닌다.
따라서 많은 점에서 상기 기준은 분화하는 줄기세포의 운명에 의존하며, 많은 세포 타입의 일반적인 설명은 하기에 기술된다.
분화된 또는 분화하는 신경 세포에 대한 관심(interest) 마커는 신경세포의 특성인 β-튜불린 EIII 또는 신경미세섬유; 성상교세포에 존재하는 신경교원섬유산단백질(glial fibrillary acidic protein, GFAP); 갈락토세레브로시드(GaIC) 또는 마이엘린 염기성 단백질(MBP); 아교세포(oligodendrocytes)의 특성; 미분화된 인간 줄기세포의 특성인 OCT-4; 신경 전구체 및 그 밖의 세포의 특성인 nestin을 포함한다. A2B5 및 NCAM은 아교세포 전구세포 및 신경 전구세포 각각의 특성을 지닌다. 또한 세포는 생물학적 활성 기질 특성의 분비에 대해 테스트될 수 있다. 예를 들면 GABA-분비 신경세포는 글루탐산 탈카르복실효소 또는 GABA의 생성으로 확인될 수 있다. 도파민 신경세포는 도파 카르복실효소, 도파민 또는 티로신 수산화효소의 생성으로 확인될 수 있다.
분화된 또는 분화하는 간세포에 대한 관심(interest) 마커는 α-태아단백(간 전구세포); 알부민, α1-항트립신, 글루코스-6인산분해효소, 사이토크롬 p450 활성, 트랜스페린, asialoglycoprotein 수용체 및 글루코겐 저장(간세포); CK7, CK19, 및 γ-글루타민 전이효소(쓸개즙 상피)를 포함한다. 간세포 분화는 전이 인자 BNF-4 α(Li et al., Genes Dev. 14:464, 2000)를 요구로 한다는 것이 공표되었다. HNF-4 α 발현에 독립적인 마커는 α1-항트립신, α-태아단백, apoE, 글루코키나아제, 인슐린 성장인자 1 및 2, IGF-I 수용체, 인슐린 수용체 및 렙틴을 포함한다. HNF-4 α 발현에 의존적인 마커는 알부민, apoAI, apoAII, apoB, apoCIII, apoCII, 알돌라아제 B, 페닐알라닌 수산화효소, L-타입 지방산 결합 단백질, 트랜스페린, 레티놀 결합 단백질, 및 에리트로포이에틴(EPO)를 포함한다.
pPS 세포로부터 유래된 혼합된 세포 모집단에서 세포 타입은 특성 형태학 및 이들이 나타내는 마커에 의해 인식될 수 있다. 골격극 세포에 관해서는: myoD, myogenin, 및 myf-5이다. 내피세포에 관해서는: PECAM (혈소판 내피세포 부착 분자), FIk-I, tie-i, tie-2, 혈관내피(VE) 카드헤린, MECA-32, 및 MEC- 14.7이다. 평활근 세포에 관해서는: 특이적 마이오신 중쇄이다. 심장근세포(cardiomyocyte)에 관해서는: GATA- 4, Nkx2.5, 심장 트로포닌 I, α-마이오신 중쇄, 및 ANF이다. 췌장 세포에 관해서는 pdx 및 인슐린 분비이다. 조혈세포 및 이들의 전구세포에 관해서는 GATA-I, CD34, AC 133, β-major 글로불린, 및 유전자 PHl 유사 β -major 글로불린이다.
본 명세서에 기술되거나 당분야에 공지된 어떤 조직-특이적 마커는 세포-표면 마커에 관한 유식면역세포화학, 세포내 또는 세포-표면 마커에 관한 면역세포화학(예를 들면 고정된 세포 또는 조직 섹션), 세포 추출물의 웨스턴 블롯 분석, 및 배지로 분비되는 세포 추출물 또는 생성물에 관한 효소-결합 면역분석법과 같은 면역학-기술에 의해 검출될 수 있다. 또한 조직-특이적 유전자 산물의 발현은 기준 증폭 방법으로 서열-특이적 프라이머를 사용하여 노던 블롯 분석, 도트-블롯 혼성화 분석 또는 RT_PCR의해 mRNA 농도에서 검출될 수 있다. 본 명세서에 기술된 특이적 마커에 관한 서열은 GenBank (URL www.ncbi.nlm.nih.gov:80/entrez)와 같은 공용 데이터베이스로부터 얻을 수 있다.
(실시예 1) 방법
hESC-MSC(중간엽 줄기세포)의 유도
Hues9 및 Hl hESCs는 이전에 기술된6'7 바와 같이 성장된다.
hESCs를 분화시키기 위해서, hESCs의 융합성 6 cm 판은 3분 동안, 37℃에서 트립신화될 수 있으며, Knockout DMEM 배지(Invitrogen- Gibco, Grand Island, New York)에서 중화, 원심분리 및 재현탁될 수 있으며 젤라틴화된 10 cm 판 상에서 10% 혈청 대체 배지(Invitrogen- Gibco, Grand Island, New York), 5ng/ml FGF2 (Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York), 및 5ng/ml PDGF AB (Peprotech, Rocky Hill, New Jersey)로 보충될 수 있다. 상기 세포는 융합시 트립신화되고 1:4로 분열된다.
CD 105+ 및 CD24-에 관한 분류는 hESCs가 트립신화되고 일주일 후 수행된다. 분화하는 hESCs는 3분 동안 배양 배지에서 트립신화, 중화, 원심분리, 재현탁되고, 그 다음에 세균 배양 접시 상으로 플레이트 된다. CO2 배양기에서 37℃에서 2시간 후에, 상기 세포가 수확되고, PBS로 세척되며, 실온에서 90분 동안 CD24-PE 및 CD105-FITC (PharMingen, San Diego, California)로 배양된다.
그 다음에 상기 세포는 PBS로 세척되며, FACS Diva 소프트웨어(BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA)를 사용하여 FACS Aria 상에서 분류된다. BM MSCs는 이전에 기술된26 바와 같이 제조된다. 상기 세포는 페니실린-스트렙토마이신-글루타민, 비-필수 아미노산 및 10% 우태아혈청(Invitrogen- Gibco, Grand Island, New York)으로 보충된 DMEM에서 배양된다.
지방세포, 연골세포 및 골세포로의 분화는 이전에 기술된3 바와 같이 수행된다. 오일레드, 알시안 블루 및 본 코사 염색은 표준 기술을 사용하여 수행된다. 콜라겐 타입II에 관한 면역반응력은 고정된 파라포름알데하이드, 파라핀-함유 섹션 상에서 고우트 항-collagen al Type II 및 HRP(Santa Cruz, Santa Cruz, California)와 컨쥬게이트된 당나귀 항-염소 IgG 항체를 사용하여 수행될 수 있다.
핵형분석
페트리 접시에서 약 80% 융합성으로 받아들여지는 세포. 세포는 유사분열 정지(mitotic arrest) 동안 colcemid로 처리되며, 표준 저장성 처리 및 메탄올: 아세트산(3:1) 고정에 의해 수확된다. 슬라이드는 표준 바람말림(air drying) 방법으로 제조되고, SKY 페인트 프로브(ASI)로 혼성화된다. 후-혼성 세척은 제조업자에 의해 제공된 프로토콜에 따라 수행되며, 본 발명자들의 실험실에서 달성된다. 배양 당 20∼30 중기 세포가 있다. 각 배양의 핵형분석은 80% 이상의 중기 세포를 나타낸다.
이식 연구
2x106 세포는 식염수 30 μl에서 재현탁되며, 이전에 기술된27 바와 같이 신장 피막하 공간으로 이동된다. 4달 후에 마우스들을 희생시켜, 신장을 제거하고, 4% 포름알데하이드, 파라핀-함유에서 고정되고, 4 μM에서 섹션화되고, H&E.로 염색된다.
웨스턴 블롯 분석
표준 과정이 사용된다28. 간단하게 세포는 RIPA 완충용액에서 용해되고 4℃에서 15분 동안 14,000 rpm으로 원심분리된다. 20μg 상청액은 변성되고, 10 SDS-폴리아크릴아미드 겔 상에서 분리되며, 니트로셀룰로오스 막 위로 전기-블롯되며, 막은 일차 항체, 그 다음에는 HRP 컨쥬게이트된-이차 항체 또는 비오틴화된 이차 항체 어느 하나, 뒤 이어 뉴트로아비딘-HRP, 최종적으로는 HRP 증진된 화학발광법 기질, ECS(Pierce, Rockford, IL)와 함께 배양된다.
사용된 일체 항체는 항-OCT4, 항-SOX-2 및 β-액틴(Santa Cruz Biotechnology, CA)의 1:200 희석물이다. 이차 항체는 HRP-컨쥬게이트된 고우트 항-, 래빗 항-, 고우트 및 래빗 안티마우스이다.
PCR
마우스- 및 인간-특이적 반복 서열에 관한 게놈 PCR은 이전에 기술된8 바와 같이 수행된다. 실시간 RT-PCR은 High Capacity cDNA Archive Kit (Applied Biosystems, Foster City, CA)를 사용하여 전체 RNA의 1 μg을 역 전사함으로써 수행된다. cDNA는 물에서 1Ox 희석되고, 40 주기 동안 Taqman primers (Applied Biosystems, Foster City, CA)에 의해 증폭된다.
표면항원 분석
hESC-MSCs, 및 hESCs 상의 세표표면항원은 FACS를 시용하여 분석된다. 상기 세포는 5분 동안 트립신화, 원심분리, 배양 배지에서 재현탁되며, 37℃, 5% CO2 배양기에서 2∼3분 동안 세균 배양 접시에서 배양된다. hESC-MSCs 및 hESCs 상의 세포표면항원은 FACS에 의해 분석된다.
상기 세포는 1분 동안 트립신화, 원심분리, PBS로 세척, 실온에서 30분 동안 4% 포름알데하이드에서 고정, 교반으로 인해 실온에서 30분 동안 2% FCS에서 세척 및 블로킹된다. 그 다음에 1.5 x 105 세포는 실온에서 90분 동안 하기의 컨쥬게이트된 단일클론항체 각각과 함께 배양된다: CD24-PE, CD29-PE, CD44-FITC, CD49a-PE, CD49e-PE, CD105-FITC, CDl 66-PE, CD34-FITC, CD45-FITC (PharMingen, San Diego, CA)이다.
배양 후, 세포는 PBS에서 세척 및 재현탁된다. 비-특이적 형광은 동형-매치된 마우스 단일클론항체(PharMingen, San Diego, CA)와 함께 유사 세포 부분표본(aliquots)의 배양에 의해 측정된다. 자료는 WinMDI 소프트웨어를 사용하여 Cyan LX (Dako North America, Inc., Carpinteria, CA) 도구로 20,000 사건을 수집함으로써 분석된다. 비-특이적 형광은 동형-매치된 마우스 단일클론항체(PharMingen, San Diego, CA) 또는 단독으로 이차 항체와 함께 유사 세포 부분표본(aliquots)의 배양에 의해 측정된다
Illumina 유전자 칩 분석
HuES9.El, HuES9.E3, HuES9.El 및 3개의 미분화된 hESC 라인, Hl, Hes3 및 HuES9의 2개의 생물학적 사본(replicate)으로부터, 일차 BM 및 지방-유래 MSCs의 3개 샘플 각각으로부터의 전체 RNA(2 μg)는 제조업자의 지침에 따라 Illumina RNA 증폭 키트(Ambion, Inc., Austin, TX)를 이용하여 비오틴화된 cRNA로 전환된다.
샘플은 RNeasy 키트(Qiagen, Valencia, CA)를 이용하여 정제된다. Sentrix HumanRef-8 Expression BeadChip (Illumina, Inc., San Diego, CA)으로 혼성화, 세척 및 스캐닝은 Illumina BeadStation 50Ox 매뉴얼에 따라 수행된다. 상기 자료는 제조업자에 의해 제공된 Illumina BeadStudio를 사용하여 추출, 정상화 및 분석된다. 99% 컨피던스에서 하기의 검출한계(LOD)를 지닌 전사 신호는 발현되지 않은 유전자로서 제거된다.
(실시예 2) 인간 ES 세포주로부터 MSC 배양 생성
hESC 콜로니가 트립신에 의해 분산 그 다음에 영양 결핍시 혈청 대체 배지, FGF2 및 선택적으로 PDGF AB로 보충된 무혈청배지에서 젤라틴화된 조직 배양 판 위로 계대접종될 때, 각각과 유사하거나 동일한(바람직하게는 상동한) 섬유모세포-유사 세포의 배양이 2주 이내에 생성된다.
상기 배양은 BM-MSCs와 닮은 섬유모세포 세포 형태를 지닌다(도 IA). 콜라겐 분해효소로 분산시킨 hESC 콜로니가 이들 섬유모세포-유사 세포 생성에는 효과적이지 않다.
3번째 Hl.E2가 Hl ESC 라인으로부터 생성되는 동안huES9.El 및 huES9.E3인 두 개의 다클론 배양은 독립적으로 huES9 ESC 라인으로부터 생성된다. 많은 다능성-관련 유전자의 발현은 일반적으로 감소된다. 예를 들면 HESXl, POUFL5, SOX-2, UTF-I 및 ZFP42의 전사 수준은 하기의 hESCs에 101-5 배 이상이다(도 IB). 또한 OCT4, NANOG 및 SOX2의 단백질 농도는 감소된다(도 1C). huES9.El로 대표되는 이들 세포는 검출 가능한 알칼리성 인산분해효소 활성을 지니지 않는다(도 ID).
부모 HuES 9 세포와 같지 않은, 면역 저항력 SCID 마우스에서 1 xlO6 HuES9.El 세포의 신장 피막하 이식은 4달의 관찰 기간 동안 기형종(teratoma)의 형성을 유도하지 않는다.(도 1E). 이들 세포가 마우스의 영양 세포8과 함께 오염되거나 융합될 가능성을 평가하기 위해서, 이들 배양은 테스트되고, 인간-특이적 alu 반복 서열에 관한 포지티브를 제외한 마우스-특이적 c-mos 반복서열에 관한 네가티브를 나타낸다(도 IF).
HuES9.El, HuES9.E3 및 Hl. E2의 평균 모집단 배가시간은 각각 72, 72 및 120 시간이다. 모집단 배가시간은 세포 운명에 매우 의존하며, 30∼80% confluency 사이가 가장 최적이다. 약 80 모집단 배가 후, HuES9.El는 46 XX inv(9)(pl3ql2 핵형을 지닌다. 9번 염색체의 역위는 부모 huES9 hESC 라인6으로부터 기원된다. 또한 HuES9.E3는 46 XX inv(9)(pl3ql2 핵형을 지니며, 동시에 Hl. El은 32 및 36 모집단 배가시간 후 46, XY 핵형을 지닌다. 본 발명자들은 상기 세포가 35 모집단 배가(자료에는 나타나지 않음) 후에 세포의 ∼10∼30%에서 발현 이상, 비-클론성 염색체 이상을 일으킨다는 것과 세포는 35 모집단 배가후에 사용되지 않는다.
(실시예 3) 표면항원 프로파일
FACS 분석에 의한 HUES9.E1, HuES9.E3 and Hl. E2의 표면항원 프로파일링은 한정된 BMMSCs 즉 CD29+, CD44+, CD49a 및 e+, CD105+, CD166+ 및 CD34-, CD45- 9-11와 질적으로 유사한 표면항원 프로파일을 나타내었다(도2A). 표지된 세포의 형광 표지 및 분배의 세기는 hESC-MSC 배양 각각에 의하여 변하였다(도 2A).
BM-MSCs로 이들 세포의 표면항원 프로파일을 비교하기 위해서, HuES9.El, HuES9.E3 및 Hl. El는 2회의 계대접종 동안 10% 우태아혈청으로 보충된 동일한 BM-MSC 배양 배지에서 성장된다. 배양조건의 변화에도 불구하고, HuES9.El, HuES9.E3 및 H1.E1는 CD29+, CD44+, CD49a+, CD105+, CD166+ 및 CD34-, CD45- (도 2B; H1.E1에 대해서는 자료에 나타나지 않음)로 계속해서 되며, BM-MSCs의 그것과 매우 유사하다. 예외는 BM-MSCs에서 훨씬 낮은 발현을 나타내는 CD49a이다. 이들 자료는 hESC-MSCs가 특징적인 BM-MSC 표면항원 프로파일을 나타낸다는 것을 지시한다. 특징적인 BM-MSC 표면항원 프로파일은 적절하며 미세환경의 변화로 인해 상당한 영향을 받지는 않는다
(실시예 4) hESC-MSC의 분화 가능성: 지방형성, 연골형성 및 골발생
MSCs와 연관된 모든 표면항원이 그 밖의 많은 세포 타입으로 발현되고, 이들 표면항원의 발현이 변할 때, 추정 MSCs의 확인은 전통적으로 기능적 파라미터9에 의존하고 있다. 배양시 MSCs의 디폴트 분화 경로는 지방형성 및 연골형성9과 정도는 다르게 골발생되는 것으로 보고되었다.
따라서 HuES9.El 세포의 분화 가능성은 공표된 프로토콜3을 사용하는 지방형성 및 골발생에 관한 표준 분화 조건을 사용하여 테스트된다.
지방세포의 분화는 세포의 99% 이상에서 관찰된 액적(oil droplet)에 효과적이다(도 3A). 지방형성12에 중요한 전사 인자로서의 역할과 일치하는, hESC 유래 MSCs에서 PPARγ mRNA는 추가 2 배에 의해 증가된 각각의 부모 ESC 라인보다 높은 약 10∼100 배이다(도 3A).
연골의 연골형성 또는 형성은 알시안 블루 염색(도 3B)에 의해 검출되는 세포외 기질에서 프로테오글리칸을 생성하는 세포의 90% 이상과 콜라겐 Ⅱ에 대해 면 역반응성을 지닌 세포의 ∼20%에서 효과적이다. 또한 어그리칸(aggrecan), 연골-특이적 세포외 기질 단백질의 전사수준은 증가한다13(도 3B). 그러나 기질에서 콜라겐 II 면역반응성의 존재에도 불구하고 콜라겐 II, 또 다른 연골-특이적 세포외 기질 단백질의 전사 수준은 감소한다. 그 이유는 알려져 있지 않으나 번역14,15될 때 특히 AU-rich elements와 함께 몇몇 mRNAS는 불안정화되는 것으로 알려져 있다.
HuES9.El 세포가 뼈의 골발생 또는 형성을 유도할 때, 뼈-특이적 알칼리성 인산분해효소(ALP) 및 bone sialoprotein (BSP)의 발현은 2∼3 배에 의해 상위조절(upregulate)된다(도 3C). 그러나 무기질침착, 본 코사 염색으로 측정된 바와 같은 골 형성17의 더욱 진보된(advanced) 단계는 불충분하다(도 3C). 분화된 배양시 1% 이하로 포지티브 염색된다.
(실시예 5) 유전자 발현 프로파일
hESC-MSCs의 유전자 발현 프로파일링은 하기에 의해 수행된다: 1) 3개의 상이한 개체 및 3개의 인간 ESC 라인으로부터 BM-MSCs 및 지방-유래(ad)-MSCs를 사용하여 성체 조직-유래 MSCs와 함께 hESC-MSC 배양의 관계성을 평가; 2) 각각 3개의 hESC-MSC 배양 사이의 관계성을 평가; 3) hESC로부터 유래된 MSCs와 BM으로부터 유래된 이들 사이의 유사성 및 차이점을 비교한다.
전체 RNA RNA로부터 제조된 표지된 cDNA는 약 24,000 독특한 특징(feature)을 포함하는 Illumina BeadArray로 혼성화된다. hESC-MSC 배양에서 발현된 유전자 즉 HuES9.El, HuES9.E3 및 Hl. E2, 3개의 BM-MSC 샘플 및 3개의 지방 유래(ad)-MSC 샘플의 계층적 클러스터링은 hESC- MSCs의 유전자 발현 프로팔일이 성체 조직-유래 MSCs 즉 이들의 부모 hESCs보다 BM-MSC 및 ad-MSC와 밀접하게 관련되어 있다는 것을 밝혔다(도 4A).
흥미롭게도, MSCs는 이들의 조직 기원에 따라 군집화되며, 이것은 hESC-MSCs로부터 별개의 그룹으로서 ad- MSCs 및 BMMSCs의 클러스터링에 의해 제안된 성제 대 배아 조직으로 한정될 수 있다. hESC-MSCs 및 BM-MSCs 사이의 유전자 발현의 쌍대비교는 hESC-MSCs 및 BM-MSCs 모두에서 유전자 발현의 중요한 보존(conservation), 또한 중요한 차이를 나타내는 상관계수 0.72라는 것이 밝혀졌다(도 4B). hESC-MSCs 및 hESCs 사이의 쌍대비교는 0.65라는 작은 상관계수를 지니는 hESCs로부터 hESC-MSCs의 차이를 확인하였다(도 4C).
각각 3개의 hESC-MSC 배양 사이의 관계성을 평가하기 위해서, uES9.El, H1.E2 및 HuES9.E3은 HuES9.El, H1.E2 and HuES9.E3로 구성된 동일한 기준으로 각각 비교되었다. 동일한 기준으로 얻은 HuES9.El, H1.E2 및 HuES9.E3의 상관계수는 각각 0.93, 0.95 및 0.93으로 거의 동일하였으며, HuES9.El, H1.E2 및 HuES9.E3 가 매우 유사하다는 것을 나타낸다(도 4C).
각각 hESC-MSC 및 BM-MSC의 99% 신뢰 수준에서 검출 한계를 상기에 나타낸8699 및 8505 유전자, 6376 유전자는 2.0 배 이하 차이에서 hESC-MSCs 및 BM-MSCs 모두에서 발현되다. 이들 유전자이 MSCs의 기초생물학에 대한 통찰을 제공할 때, 본 발명자들은 이 유전자들에 의해 구동되는 생물학적 과정을 연구하였다. 일반적으로 발현된 유전자 6376, 4,064는 Panther classified gene list (March 2006; http://www.pantherdb.org/)에 기초하고 있다.
상이한 생물학적 과정으로 이 유전자들을 분류하는 것은 NCBI의 23481 유전자로 구성된 참고 목록과 비교시 몇몇 생물학적 과정의 유전자 빈도(frequency)는 과잉 또는 과소 표현된다(p<0.01): H. 사피언스 유전자 데이터베이스. 예를 들면 추정 줄기세포의 성장 및 자가-재생에 중요할 것 같은 대사과정에서 유전자의 과잉표현성이 나타난다. 이들 과정은 이화작용 및 동화 활성에 관한 기초대사과정, 광범위한 번역후 수식 예를 들면 당화를 요구로 하는 분비 산물의 생합성 및 세포 증식을 포함한다(도 4C).
일관된 이들의 중간엽 잠재력은 외배엽 분화 특히 신경 발달과 관련된 유전자의 과소-대표성을 나타낸다. 또한 유전자 발현 분석은 MAPKKK 신호가 BM- MSC 및 hESC-MSCs 모두에서 두드러진다는 것을 나타내고 있다. 적어도 3개의 아과로 구성된 MAPKKK 신호, 즉 고전적 MAPK(또한 ERK로 알려진), 스트레스-활성 단백질 키나아제/c-Jun N-터미널 키나아제(JNK) 및 p38 키나아제는 세포 스트레스, 세포주기, 사멸 및 생존18-21에 대한 반응으로 증식, 분화, 발달 조절에 관련되어 있다.
hESC-MSC 및 BM-MSC의 유전자 발현 프로파일의 추가적인 분석은 1142 및 1134 유전자가 각각 hESC-MSC 및 BM- MSC에서 2.0 배 이상에서 발현된다는 것을 밝혔다. 이들, 각각의 738 및 880 유전자는 Panther classified gene list (March 2006; http://www.pantherdb.org/)에 나타나져 있고, 생물학적 공정으로 분류되었다. 생물학적 과정은 NCBI의 23481 유전자의 참고 목록과 비교시 과잉 또는 과소 표현된다(p<0.01): H. 사이언스 유전자 데이터베이스가 선택된다.
우선적으로 발현된 hESC-MSC 유전자가 증식, 분화, 면역 및 신호 전달에 관련된 이들의 과정에서 군집화되는 동안, BM-MSCs에서 우선적으로 발현된 유전자는 대사과정, 세포 구조, 분화 및 신호와 관련된 생물학적 과정에서 군집화된다(도 3C). 증식과 관련된 생물학적 공정에서 유전자의 과잉-표현성은 BM-MSC에 걸쳐 hESC-MSC의 더 큰 증식 능력과 일치한다.
hESC-MSC 또는 BM-MSC의 둘 중 하나에서 더욱 발현된 유전자가 증식 및 신호의 일반적인 범주를 과잉-표현할지라도, 각 범주 내의 특이적 생물학적 과정이 hESC-MSC 및 BM-MSC에서 별도로 표현된다. 예를 들면, 골격 발달 및 근육 발달과 같은 말기배아 발달과 관련된 것이 BM-MSC에서 과잉-표현되는 동안, 배아발생 및 분할과 같은 초기배아 발달과 관련된 분화 과정이 hESC-MSC에서 과잉-표현된다. 유사하게, 세포외액 기질 단백질-매개 신호 및 MAPKKK 케스케이드는 BM-MSC에서 과잉-표현된다. 함께, 이 관찰은 hESC-MSC 및 BM-MSC에서 분화 가능성 및 신호 경로 활용률이 동일하지 않다는 것을 나타낸다.
(실시예 5) 단 세포-유래 MSC 모집단의 분리를 위한 hESCs 및 hESC-유래 MSCs에 대한 구별 표면 마커
genome-wide 유전자 발현은 분화하는 hESCs로부터 MSCs의 분리를 용이케 하는 막단백질을 암호화하는 hESC-MSC 또는 hESC 둘 중 하나에서 크게 발현된 유전자에 대해 의문을 가지게 된다. hESC-MSCs 또는 hESCs 둘 중 하나에서 추정 막 단백질을 암호화하는 크게 발현된 유전자의 탑 20개의 목록으로부터, 후보 유전자가 선택되며, 이는 이들의 유전자 산물에 대항하는 항체가 상업적으로 사용 가능하기 때문이다(하기의 표 lA 및 lB). hESC에서 크게 발현된 후보 유전자들 중에서 유래되었다.
상징 폴드변화 수탁번호 유의어
ANPEP 715.50 NM_001150.1 CD13;LAP1;PEPN,gp150
ENG 479.50 NM_000118.1 END;ORW;WHT1;ORW1;CD105
SCN9A 251.20 NM_002977.1 PN1;NE-NA
TRPV2 187.90 NM_016113.3 VRL;VRL1;VRL-1;MGC12549
RAMP1 182.30 NM_005855.1
F2RL2 152.03 NM_004101.2 PAR3
NTSR1 141.15 NM_002531.1 NTR
GABRA2 122.05 NM_000807.1
SLC16A4 106.60 NM_004696.1 MCT4
ITGA4 103.60 NM_000885.2 CD49D
NCAM2 93.31 NM_004540.2 NCAM21;MGC51008
IL1R1 86.80 NM_000877.2 P80;IL1R;IL1RA;CD121A;D2S1473;IL-1R-alpha
PDGFRA 80.25 NM_006206.2 CD140A;PDGFR2
VCAM1 71.30 NM_080682.1 INCAM-100
SSFA2 69.74 NM_006751.3 CS1;CS-1;KRAP;SPAG13;KIAA1927
TRHDE 58.63 NM_013381.1 PAP-Ⅱ
EDG2 55.82 NM_001401.3 LPA1;edg-2;vzg-1;Gper26;Mrec1.3;rec.1.3
NT5E 48.15 NM_002526.1 eN;NT5;NTE;eNT;CD73;E5NT
FLRT2 46.51 NM_013231.2 KIAA0405
FAP 44.43 NM_004460.2 FAPA;DPPIV;SEPRASE
표 1a. hESC에 걸쳐 hESC-유래 MSC에서 크게 발현 막 단백질
상징 폴드변화 수탁번호 유의어
ITGB1BP3 2642.33 NM_014446.1 MIBP
PTPRZ1 2126.50 NM_002851.1 PTPZ;HPTPZ;PTP18;PTPRZ;RPTPB
CNTN1 430.00 NM_175038.1 F3;GP135
PCDH1 342.08 NM_002587.3 PC42;PCDH42;MGC45991
PODXL 303.06 NM_005397.2 PCLP;Gp200
GPR64 217.67 NM_005756.1 HE6;TM7LN2
PROM1 209.04 NM_006017.1 AC133;CD133;PROML1
GPRC5C 205.00 NM_022036.2 RAIG3;RAIG-3
CD24 166.98 NM_013230.1 CD24A
CLDN3 166.42 NM_001306.2 RVP1;HRVP1;CPE-R2;CPETR2
TACSTD1 163.81 NM_002354.1 EFP;KSA;M4S1;MK-1;EGP40;MIC18;TROP1;Ep-CAM;hEGP-2;CO17-A;GA733-2
HTR3A 140.00 NM_000869.1 HTR3
FGFR4 139.96 NM_022963.1 TKF;JTK2
ADCY1 127.44 NM_021116.1
FGFR3 123.27 NM_022965.1 ACH;CEK2;JTK4;HSFGFR3EX
IL17RB 91.70 NM_018725.2 CRL4;EVI27;IL17BR;IL17고1;MGC5245
SORL1 66.79 NM_003105.3 LR11;LR9;SORLA;gp250;SorLA-1
GPM6B 60.70 NM_005278.2 M6B
KCNS3 35.26 NM_002252.3 KV9.3;MGC9481
FZD3 33.96 NM_017412.2 Fz-3;hFz3
표 lb. hESC-유래 MSC에 걸쳐 hESC에서 크게 발현 막 단백질
상기 표 1a 및 표 lb는 hESC-유래 MSCs(표 lA) 또는 이들의 부모 hESCs(표 lb)에서 유전자를 암호화하는 크게 발현된 표면항원을 나타낸다. microarray hybridization에 의한 유전자 발현 분석을 기초로 하여. 탑 20개의 유전자는 hESC-유래 MSCs(HuES9.El, HuES9.E3 및 Hl. E2) vs hESCs(HuES9, Hl 및 Hes3 hESCs)(표 la)에서 크게 발현되며, 반대도 또한 같다(표 lb).
MSCs는 성체 조직9-11으로부터 유래된 MSCs의 특징적인 표면 마커인 ENG(CD 105), ITGA4(CD49d), PDGFRA, NT5E(CD73)이며, hESC에서 크게 발현된 후보 유전자들 중에서 크게 발현된 hESC-특이적 유전자, ITGB1BP3 및 PODXL22 및 CD 24와 같은 것들이 이전에 확인되었다. hESC-특이적 유전자, ITGB1BP3 및 PODXL22 및 CD 24의 발현은 hESCs와 관련되지 않았다. 본 발명자들은 CD24가 hESC vs ITESC-MSC에서 크게 발현된다는 것을 확인하였다(도 5A).
(실시예 6) 상동한 hESC-MSC 모집단의 유래
그 다음에 본 발명자들은 hESC-MSCs의 상동성을 증진시키는 이들 마커의 유용성을 테스트했다. 트립신 및 혈청 대체 배지, FGF2, 및 선택적으로 PDGF AB로 보충된 배지에서 배양 일주일 후, 배양시 상기 세포는 CD 105에 대한 FACS에 의해 그리고 CD24에 대항하여분류된다.
CD 105+ 및 CD24- 세포는 배양의 ~5 %로 구성된다(도 5B). 분류된 세포는 1 세포/웰에서 10x96 웰 판, 100 세포/웰에서 1x24 웰 판, 및 1000세포/웰에서 3x6 웰 판 상으로 플레이트된다. 이들의, 18개의 1000 세포/웰 중에서 5개만이 배양이 단일세포로부터 일어날 것 같다는 것을 제안하는 MSC-유사 배양을 발생시킨다.
약 24,000 독특한 특징(feature)을 포함하는 Illumina BeadArray를 사용하는 이들 5개의 배양의 Genome-wide 유전자 발현 프로파일링, 즉 Q4.1∼Q4.5는 상관계수 0.96인 라인 4개와 나머지 상관계수 0.90인 라인 1개를 지닌 5개 배양의 높은 유사성을 지닌다(도 5C). 연구중인, 동일한 RNA 샘플을 사용하는 적어도 한달 정도 이후에 수행된 기술적 사본(technical replicates) 사이의 상관계수는 보통 0.97∼0.98의 범위에 있다. 또한 Q4.1∼Q4.5는 각각 0.87 및 0.81의 상관계수를 지닌huES9.El, Hl.E2 및 huES9.E3, 및 BM-MSCs를 포함하는 hESC-MSCs와 매우 유사하다(도 5D).
대조적으로, 이들의 부모 HuES9.El hESC 라인의 Q4.1∼Q4.5의 상관계수는 0.55보다 작다(도 5D). G 블랜딩 및 SKY를 사용하는 염색체 분석이 임으로 선택된 Q4.3 배양을 통해 수행된다. Q4.3은 부모 HuES9 hESC 라인으로부터 기원된 9번 염색체에 역위를 지닌 정상 핵형을 지닌다(도 5E)6. 계속해서, 이들 관찰은 높은 상동성 MSC 배양이 일주일 동안 bFGF2 및 선택적으로 PDGF BB로 보충된 배지에서 증식 후에 트립신화된 hESC 배양으로부터의 CD 105+ 및 CD24-를 분류함으로써 발생된다는 것을 나타낸다.
유도 프로토콜로 포지티브 및 네가티브 선택 가능한 마커의 결합은 각각과 거의 동일한 genome-wide 발현 프로파일을 지니는 5개의 단일클론 분리체의 유도를 야기하며, 선택 또는 분류 기준의 특이성을 확인해준다. 5개의 분리체 사이의 글로벌 페어와이즈 유전자 발현 비교는 동일한 RNA 샘플을 사용하는 기술적 사본에 대한 관찰을 비교할 수 있는 거의 동일한 유전자 발현 프로파일을 나타낸다.
실시예 7∼15는 인간 ESC-유래 MSCs(hESC-MSCs)의 프로테옴을 분석하는 실험을 기술한다. 이들 실험에서, 인간 ESC-유래 MSCs(hESC-MSCs)에 의해 조절화된 합성 무혈청 배양 배지는 임상적 컴플라이언트 프로토콜을 사용하여 분석되었다. 조절배지는 다차원 단백질 확인 기술(MuDPIT) 및 사이토카인 항체 어레이 분석에 의해 분석되며, 201개의 독특한 유전자 산물의 존재를 나타낸다.
이들 유전자의 86∼88%는 마이크로어레이 또는 qRT-PCR 분석에 의해 검출 가능한 전사 수준을 지닌다. 컴퓨터 분석은 이들 유전자 산물이 생물학적 과정의 3가지 주요 그룹을 실질적으로 구동시킨다는 것을 예측한다: 대사, 방어반응 및 혈관신생, 조혈 및 골격 발달을 포함하는 조직 분화이다. 또한 201 유전자 산물이 심장 생물학, 뼈 발달 및 조혈에서 Jak- STAT, MAPK, Toll-유사 수용체, TGF-베타 신호 및 mTOR 신호 경로와 같은 중요한 신호 경로를 활성화한다는 것을 예측한다.
(실시예 7) 인간 ESC-유래 MSCs(hESC-MSCs)의 프로테옴 분석: 재료 및 방법
조절배지의 제조
상기에 기술한 바와 같이 HuES9.El 세포가 배양된다. 80% 융합성 HuES9.El 세포 배양은 PBS로 3회 세척되고, 페놀 레드(Catalog 31053; Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York) 가 없는 DMEM 배지를 포함하는 합성배지에서 밤새 배양 되며, ITS(Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York), 5ng/ml FGF2 (Invitrogen-Gibco, Grand Island, New York), 5ng/ml PDGF AB (Peprotech, Rocky Hill, New Jersey) 글루타민-페니실린-스트렙토마이신 및 β-메르캅토에탄올로 보충된다. 그 다음에 배양은 PBS로 3회 린스되고, 그 다음에 새로운 한정 배지로 대체된다. 3일 후에, 상기 배지가 수집, 500xg에서 원심분리되고, 상청액을 0.2μ 여과한다. LC MS/MS분석에 대해, 조절배지는 MW cutoff of 3500 (Pierce Biotechnology, Rockford, IL)을 지닌 투석 카세트(dialysis cassette)에 놓여지며, 10 vol의 0.9% NaCl로 3회 투석되며, 그 다음에 Slide-A-Lyzer Concentrating Solution을 사용하여 20회 농축되고 , 0.2μ 필터로 여과하기 전에 100 vol의 0.9% NaCl로 10회 투석한다. 동일한 부피의 비-조절배지는 조절배지와 동시에 투석 및 농축된다.
투석에 의해 배지를 농축시키는 것 대신에, 상기 배지는 3K의 공칭 분자량 제한(NMWL)으로 막 한외여과를 사용하여 농축된다. 그렇게 만들어진 농축된 배지는 투석에 의해 농축된 배지에서 관찰된 단백질 및 생물학적 활성의 대부분을 보유하고 있다.
사이토카인 항체 블롯 분석
조건 또는 비-조절배지 1ml는 제조업자의 지시(RayBio Norcross,GA)dp 따르는 RayBio® Cytokine Antibody Arrays를 사용하여 사이토카인 및 그 밖의 단백질의 존재에 대해 분석된다.
LC MS/MS 분석
투석된 조건(CM) 또는 비-조절배지(NCM) 2ml에서 단백질이 감소, 알킬화 및 기술된 바와 같이{Washburn, 2001 #2997} 트립신 소화된다. 그 다음에 상기 샘플은 조절화된 Sep-Pak C-18 SPE 카트리지(Waters, Milford, MA, USA)를 통해 분해된 혼합물을 통과시킴으로써 제염되며, 3% 아세토나이트릴(ACN)(JT Baker, Phillipsburg, NJ) 및 0.1% 포름산(FA)완충용액으로 2번 세척되며, 70% ACN 및 0.1% FA 완충용액으로 녹여서 분리된다. 그 다음에 용출된(eluted) 샘플은 처음부피의 약 10%에 스피드백(speedvac)함으로써 탈수되며, 0.1% 포름산을 지닌 50 μl으로 변형된다. 상기 샘플은 LC-MS/MS 분석에 앞서 4℃에서 보관된다.
제염된 펩티드 혼합물은 LC-MS/MS 시스템(LTQ, ThermoFinnign, San Jose, CA, USA)으로 MudPIT에 의해 분석된다. 샘플은 strong cation exchange(SCX) 컬럼(Biobasic SCX, 5um, Thermo Electron, San Jose, USA)으로 운반되며, 첫 번째 영역에서 완충용액(5% ACN 및 0.1% FA에서 0, 2, 5, 10, 100, 및 1000 mM 의 암모늄 클로라이드) 50ul로 솔트(salt) 단계에 의해 분획된다. SCX 컬럼으로부터 용출된 펩티드는 농축되며, Zorbax 펩티드 트랩(Agilent, PoIa Alto, CA, USA)에서 제염된다. 두 번째 영역 크로마토그래피 분리는 홈-패키드(home-packed) 나노보레드(nanobored) C18 컬럼(75um i.d x 10cm, 5μm 입자)으로 실행되며, 피코-프릿 나노스프레이 팁(New Objective, Wubrun, MA, USA)으로 직접 실행되며, 120분 차로 200 nL/min 유속에서 작동된다.
LTQ는 각각 MS 스캔으로부터 가장 강한 피크 3개에 MS/MS 스캔을 수행함으로써 자료-의존 모드에서 실시된다. 각 실험에 대해, 6개의 솔트 단계의 ms/ms(dta) 스펙트럼은 home-written 프로그램에 의해 싱글 마스코트 포괄적 파일로 결합된다. 단백질 확인은 인-하우스 마스코트 서버를 통해 IPI 인간 단백질 데이터베이스에 대한 결합된 자료를 검색하여 달성된다. 탐색 파라미터는 트립신을 사용하여 최대 손실 난할(missed cleavages) 2개이며; 고정 변이는 카르보아미노메틸화이며 변이하기 쉬운 변이는 메티오닌 및 단백질 N-터미널 아세틸화이다. 분자량 오차범위는 각각 펩티드 전구물질 및 조각 이온에 대해 2.0 및 0.8로 나타난다. 단백질 확인은 2개의 상이한 펩티드가 스코어 50 또는 그 이상이면 트루 포지티브인 것으로 간주된다. 많은 성장인자 및 사이토카인이 작은 단백질/펩티드이며, 적은 양으로 분비되기 때문에, 상응하는 MS/MS 스펙트럼은 약할 것이며, 단백질 당 하나의 펩티드만이 확인될 것이다. 20 및 50 사이의 마스코트 스코어를 지닌 이들 펩티드에 대해, MS/MS 스펙트럼의 매뉴얼 확인이 수행된다.
생물정보학(Bioinformatic)
확인된 단백질은 비-조절배지에서 확인된 배경 단백질을 제거함으로써 수집된다. 그 다음에 각 단백질의 IPI 식별자는 단백질 전후참조 표를 사용하여 유전자 심볼로 변환된다. 유전자 산물은 상이한 생물학적 과정 또는 GeneSpring GX7.3 Expression Analysis (Agilent Technologies, Palo Alto, CA)상의 GO 분류체계 유전자 온톨리지(Gene Ontology, GO) 분류의 경로로 분류된다. 그 다음에 Genbank 인간 게놈 데이터베이스에서 각 과정 또는 경로의 유전자 빈도(frequency)를 포함하는 더 큰 유전자 빈도(frequency)(p<0.05)를 갖는 경로의 과정은 MSC의 분비에 의해 상당히 조절되는 것으로 추측된다.
qRT-PCR
전체 RNA는 Trizol Reagent (Gibco-BRL)로 HuES9.El 세포로부터 추출되며, 제조업자의 프로토콜에 따르는 스핀 컬럼(Nucleospin RNA II System, Macherey-Nagel GmbH &Co., D?ren, Germany)으로 정제된다. 전체 RNA 1μg은 High Capacity cDNA Archive Kit(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 50μl 반응 부피에서 임의의 프라이머로 변환된다. cDNA는 100μl 부피의 증류수로 희석된다. 1μl는 제조업자의 프로토콜에 따르는 경로-특이적 RT2 Profiler PCR Arrays(SuperArray, Frederick, USA)에 개시된 각 프라이머에 대해 사용된다. 분석을 위해 사용된 플레이트는: 케모카인 & 수용체 PCR 어레이(cat. no. APH-022), NFkB 신호경로 PCR 어레인(cat. no. APH-025), 염증성 케모카인 & 수용체 PCR 어레이(cat. no. APH-011), 일반 사이토카인 PCR 어레이(cat. no. APH-021), JAK/STAT 신호경로 PCR 어레이(cat. no. APH-039)이다.
(실시예 8) 인간 ESC-유래 MSCs(hESC-MSCs)의 프로테옴 분석: 조절배지(CM) 및 비-조절배지(NCM)의 제제
혈청 대체 배지와 같은 배지 보충제로 조절배지의 최소 오염을 확인하기 위해, HuES9.El MSCs는 약 80% confluency로 성장되며, PBS로 3회 세척되며, ITS (인슐린, 트랜스페린 및 셀레노프로테인), 5ng/ml FGF2, 5ng/ml PDGF AB, 글루타민-페니실린-스트렙토마이신 및 β-메르캅토에탄올로 보충된 DMEM로 구성된 합성배지에서 밤새 배양된다. HuES9.El MSCs는 적어도 일주일 동안 최소 배지에서 증식된다. 다음 날, 상기 세포배양은 다시 PBS로 3회 세척되며, 새로운 한정 배지로 배양된다.
조건화 3일 후, 상기 배지는 수집된다. 조절배지(CM)는 항상 비-조절배지(NCM)와 동일한 부피로 동시에 분석 또는 처리된다. LC MS/MS 분석에 관해서, 상기 배지는 재료 및 방법(materials and methods)에 기술된 0.9% 식염수로 광범위한 투석전에 ~10x 농축된다. 농축된 CM 및 NCM의 평균 단백질 농축은 각각 98.0 ± 17.9 μg/ml 및 41.6 ± 1.2 μg/ml (n=3)이다. MSCs에 의한 배지의 조건은 단백질 겔 상에서 배지의 러닝(running) 분취에 의해 모니터된다. 배지의 단백질 성분은 시간이 흐름에 따라 복합도를 증가시킨다(도 6). CM은 NCM보다 더 복잡한 단백질 성분을 지닌다.
(실시예 9) 인간 ESC-유래 MSCs(hESC-MSCs)의 프로테옴 분석: LC MS/MS 및 항체 어레이에 의한 MSC 조절배지의 분석
LC MS/MS 분석은 CM의 독립적으로 제조된 2개의 배치에 존재하나 유사하게 처리된 NCM에는 존재하지 않는 250개의 단백질을 확인한다. 이들은 하기와 같다:
1. IPI00021428 액틴, α 골격근; 2. IPI00414057 액틴 알파 1 골격근 단백질; 3. IPI00008603 액틴, 대동맥 평활근; 4. IPI00021439 액틴, 세포질 1; 5. IPI00023006 액틴, α 심장; 6. IPI00021440 액틴, 세포질 2; 7. IPI00025416 액틴, γ-창자 평활근; 8. IPI00479925 아그린; 9. IPI00015102 CD166 항원 전구물질; 10. IPI00007423 산성 류신-풍부 핵 인단백질 32 패밀리 멤버 B; 11. IPI00413331 36 kDa 단백질; 12. IPI00412577 34 kDa 단백질; 13. IPI00413506 33 kDa 단백질; 14. IPI00418169 가상 단백질 DKFZp686P03159; 15. IPI00003815 Rho GDP-해리 저해제 1; 16. IPI00004656 β-2-마이크로글로불린 전구물질; 17. IPI00218042 뼈 형성 단백질 1 전구물질의 스플라이스 아이소형 BMP1-5; 18. IPI00009054 뼈 형성 단백질 1 전구물질의 스플라이스 아이소형 BMP1-3; 19. IPI00014021 뼈 형성 단백질 1 전구물질의 스플라이스 아이소형 BMPl-I; 20. IPI00218040 뼈 형성 단백질 1 전구물질의 스플라이스 아이소형 BMP 1-4; 21. IPI00006980 단백질 C14orfl66; 22. IPI00296165 보체 CIr 서브컴포넌트 전구물질; 23. IPI00152540 OTTHUMPOOOOOO 16748; 24. IPI00305064 CD44 항원 전구물질 스플라이스 아이소형 CD44; 25. IPI00297160 가상 단백질DKFZp451K1918; 26. IPI00293539 카드헤린-11 전구물질의 스플라이스 아이소형 2; 27. IPI00304227 카드헤린-11 전구물질의 스플라이스 아이소형 1; 28. IPI00386476 카드헤린 11, 타입 2, 아이소형 1프레프로단백질; 29. IPI00024046 카드헤린-13 전구물질;
30. IPI00290085 신경-카드헤린 전구물질; 31. IPI00029739 보체 인자 H 전구물질의 스플라이스 아이소형 1; 32. IPI00012011 코피린(Cofilin), 비-근육 아이소형; 33. IPI00007257 칼신테닌(calsyntenin) 1 아이소형 2; 34. IPI00218539 콜라겐 α-l(XI) 사슬 전구물질의 스플라이스 아이소형 B; 35. IPI00477350 콜라겐, 타입 XI, α 1; 36. IPI00329573 콜라겐 α-1(XII) 사슬 전구물질의 스플라이스 아이소형 롱(Splice Isoform Long); 37. IPI00221384 콜라겐 α-1(XII) 사슬 전구물질의 스플라이스 아이소형 쇼트(Splice Isoform Short); 38. IPI00400935 콜라겐 α-l(XVI) 사슬 전구물질; 39. IPI00297646 콜라겐 α-1(1) 사슬 전구물질; 40. IPI00164755 프레프로-α2(I) 콜라겐 전구물질; 41. IPI00304962 콜라겐 α-2(I) 사슬 전구물질; 42. IPI00021033 콜라겐 α-l(III) 사슬 전구물질; 43. IPI00167087 COL3A1 단백질; 44. IPI00021034 콜라겐 α-l(IV) 사슬 전구물질; 45. IPI00479324 α 2 타입 IV 콜라겐 프레프로단백질; 46. IPI00306322 콜라겐 α-2(IV) 사슬 전구물질; 47. IPI00303313 콜라겐 α-l(V) 사슬 전구물질; 48. IPI00477611 184 kDa 단백질; 49. IPI00293881 COL5A2 단백질; 50. IPI00018279 콜라겐 α-3(V) 사슬 전구물질; 51. IPI00291136 콜라겐 α-1(VI) 사슬 전구물질; 52. IPI00304840 콜라겐 α-2(VI) 사슬 전구물질의 스플라이스 아이소형 2C2; 53. IPI00220613 콜라겐 α-2(VI) 사슬 전구물질의 스플라이스 아이소형 2C2A; 54. IPI00022200 α 3 타입 VI 콜라겐 아이소형 1 전구물질; 55. IPI00072918 α 3 타입 VI 콜라겐 아이소형 4 전구물질; 56. IPI00220701 콜라겐 α-3(VI) 사슬 전구물질의 스플라이스 아이소형 2; 57. IPI00072917 α 3 타입 VI 콜라겐 아이소형 3 전구물질; 58. IPI00021828 시스타틴 B; 59. IPI00007778 Di-N- 아세틸키토비아제(acetylchitobiase) 전구물질; 60. IPI00295741 카텝신 B 전구물질;
61. IPI00299219 단백질 CYR61 전구물질; 62. IPI00514900 42 kDa 단백질; 63. IPI00333770 세포질분열 단백질 10의 데디케이터와 유사; 64. IPI00478332 세포질분열 단백질 9의 데디케이터와 유사; 65. IPI00000875 연장 인자 1-γ; 66. IPI00465248 α-에놀라아제; 67. IPI00013769 α-에놀라아제, 폐 특이적; 68. IPI00216171 γ-에놀라아제; 69. IPI00218803 피불린-1 전구물질의 스플라이스 아이소형 B; 70. IPI00296537 피불린-1 전구물질의 스플라이스 아이소형 C; 71. IPI00328113 피불린-1 전구물질; 72. IPI00019439 피불린 2 전구물질; 73. IPI00385645 섬유모세포 성장인자 17 전구물질의 스플라이스 아이소형 2; 74. IPI00216602 섬유모세포 성장인자 수용체 2 전구물질의 스플라이스 아이소형 5; 75. IPI00216604 S섬유모세포 성장인자 수용체 2 전구물질의 스플라이스 아이소형 8; 76. IPI00034099 가상 단백질 FLJ21918; 77. IPI00333541 필라민-A; 78. IPI00302592 필라민 A, α; 79. IPI00339227 가상 단백질 DKFZp68601166; 80. IPI00414283 섬유결합소 전구물질(FN) (냉-불용성 글로불린)(CIG). 스플라이스 아이소형 3; 81. IPI00339225 섬유결합소 전구물질의 스플라이스 아이소형 5 ; 82. IPI00339319 섬유결합소 전구물질의 스플라이스 아이소형 11 ; 83. IPI00556632 섬유결합소 전구물질의 스플라이스 아이소형 12; 84. IPI00411462 가상 단백질 DKFZp686B 18150; 85. IPI00029723 폴리스타틴-연관 단백질 1 전구물질; 86. IPI00005401 폴리펩티드 N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라제 5; 87. IPI00219025 글루타리독신-1; 88. IPI00171411 골지 인단백질 2; 89. IPI00026314 젤솔린 전구물질;
90. IPI00219757 글루타티온 S-트랜스퍼라제 P; 91. IPI00027569 비상동 핵 리보핵산단백 C-유사 1; 92. IPI00003881 HNRPF 단백질; 93. IPI00442294 스플라이스 아이소형 1 of 뉴트로트리민 전구물질; 94. IPI00003865 열 충격 인지체 71 kDa 단백질의 스플라이스 아이소형 1; 95. IPI00037070 열 충격 인지체 71 kDa 단백질의 스플라이스 아이소형 2; 96. IPI00220362 10 kDa 열 충격 단백질, 미토콘드리아; 97. IPI00024284 기저막-특이적 헤파란 설페이트 프로테오글리칸 핵심 단백질 전구물질; 98. IPI00297284 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질 2 전구물질; 99. IPI00297284 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질 2 전구물질; 100. IPI00029236 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질 5 전구물질; 101. IPI00029236 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질 5 전구물질; 102. IPI00029235 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질 6 전구물질; 103. IPI00029235 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질 6 전구물질; 104. IPIOOO16915 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질 7 전구물질; 105. IPIOOO 16915 인슐린-유사 성장인자 결합 단백질 7 전구물질; 106. IPI00328163 K-α-I 단백질; 107. IPI00021396 혈관내피 성장인자 수용체 2 전구물질; 108. IPI00298281 라미닌 γ-1 사슬 전구물질; 109. IPI00219219 갈렉틴-1; 110. IPI00023673 갈렉틴-3 결합 단백질 전구물질; 111. IPI00021405 라민-A/C의 스플라이스 아이소형 A ; 112. IPI00216953 라민-A/C의 스플라이스 아이소형 ADeltalO; 113. IPI00180173 PREDICTED: 트로포마이오신 4와 유사; 114. IPI00401614 PREDICTED: FKSG30와 유사; 115. IPI00374397 예측: 트로포마이오신 4와 유사; 116. IPI00374732 PREDICTED: PPIA 단백질과 유사; 117. IPI00402104 PREDICTED: 펩티딜프로필 이성질화효소 A 아이소형 1과 유사; 사이클로필린 A; 펩티딜-프로; 118. IPI00455415 PREDICTED: 비상동성 핵 리보핵산단백 C-유사 dJ845O24.4와 유사; 119. IPI00454722 예측: 포스파티딜에탄올아민-결합 단백질과 유사; 120. IPI00454852 PREDICTED: 기형암종(Teratocarcinoma)-유래 성장인자 1과 유사;
121. IPI00002802 단백질-라이신 6-옥시다제 전구물질; 122. IPI00410152 잠복 형질전환 성장인자 β 결합 단백질 1 아이소형 LTBP-IL; 123. IPI00220249 잠복 형질전환 성장인자 β-결합 단백질, 아이소형 IL 전구물질; 124. IPI00220249 잠복 형질전환 성장인자 β-결합 단백질, 아이소형 IL 전구물질"; 125. IPI00410152 잠복 형질전환 성장인자 β 결합 단백질 1 아이소형 LTBP-IL ; 126. IPI00020986 루미칸 전구물질; 127. IPI00291006 말레이트 탈수소효소, 미토콘드리아 전구물질; 128. IPI00005707 포식세포 만노오스 수용체 2 전구물질; 129. IPI00020501 마이오신-11; 130. IPIOOO 19502 마이오신-9; 131. IPI00604620 누클리올린; 132. IPI00220740 뉴클레오포스민의 스플라이스 아이소형 2; 133. IPI00219446 포스파티딜에탄올아민-결합 단백질; 134. IPI00299738 프로콜라겐 C-엔도펩티다아제 인핸서 1 전구물질; 135. IPI00015902 β 혈소판-유래 성장인자 수용체 전구물질; 136. IPI00216691 프로필린-1; 137. IPI00169383 포스포글리세레이트키나아제 1; 138. IPI00219568 포스포글리세레이트키나아제, 고환 특이적; 139. IPI00296180 우로키나아제-타입 플라스미노겐 활성제 전구물질; 140. IPI00215943 플렉틴 1의 스플라이스 아이소형 3; 141. IPI00215942 플렉틴 1의 스플라이스 아이소형 2; 142. IPI00014898 플렉틴 1의 스플라이스 아이소형 1; 143. IPI00398777 플렉틴 1 아이소형 8; 144. IPI00398776 플렉틴 1 아이소형 7; 145. IPI00186711 플렉틴 1 아이소형 6; 146. IPI00420096 플렉틴 1 아이소형 3; 147. IPI00398779 플렉틴 1 아이소형 11; 148. IPI00398778 플렉틴 1 아이소형 10; 149. IPI00398002 플렉틴 1 아이소형 1; 150. IPI00419585 펩티딜-프로필 cis-트랜스 이성질화효소 A;
151. IPI00472718 펩티딜프로필 이성질화효소 A 아이소형 2; 152. IPI00000874 페록시리독신(Peroxiredoxin)-1; 153. IPI00024915 페록시리독신-5, 미토콘드리아 전구물질; 154. IPI00375306 페록시리독신 5 전구물질, 아이소형 b; 155. IPI00012503 전활성체 폴리펩티드 전구물질의 스플라이스 아이소형 Sap- mu-0; 156. IPI00374179 프로테아좀 활성제 서브유닛 1 아이소형 2; 157. IPI00030154 프로테아좀 활성제 복합 서브유닛 1; 158. IPI00168812 PTK7 단백질 티로신키나아제 7 아이소형 d 전구물질; 159. IPI00419941 PTK7 단백질 티로신 키나아제 7 아이소형 a 전구물질; 160. IPI00003590 퀘이에스신(Quiescin) Q6, 아이소형 a; 161. IPIOOO 15916 뼈-유래 성장인자(단편); 162. IPIOOO 15916 뼈-유래 성장인자; 163. IPI00298289 레티쿨론(Reticulon)-4의 스플라이스 아이소형; 164. IPI00021766 레티쿨론(Reticulon)-4의 스플라이스 아이소형 1; 165. IPI00013895 칼지자린(Calgizzarin); 166. IPI00010402 가상 단백질; 167. IPI00218733 과산화물 디스무타제; 168. IPI00014572 SPARC 전구물질; 169. IPI00005614 스펙트린 β 사슬의 스플라이스 아이소형 롱, 뇌 1; 170. IPI00008780 스태니오칼신(Stanniocalcin)-2 전구물질; 171. IPI00301288 SEL-OB 단백질; 172. IPI00216138 트랜스젤린(Transgelin); 173. IPIOOO 18219 형질전환 성장인자-β-유도 단백질 ig-h3 전구물질; 174. IPI00304865 형질전환 성장인자, β 수용체 III "; 175. IPI00296099 트롬보스폰딘(Thrombospondin)-1 전구물질; 176. IPI00032292 금속단백분해효소 저해제 1 전구물질; 177. IPI00027166 금속단백분해효소 저해제 2 전구물질; 178. IPI00220828 타이모신 β-4; 179. IPI00180240 타이모신-유사 3;
180. IPI00299633 OTTHUMP00000031270(단편); 181. IPI00465028 트라이오스포스페이트 이성질화효소 1 변이(단편); 182. IPI00451401 트라이오스포스페이트 이성질화효소의 스플라이스 아이소형 2; 183. IPI00010779 트로포마이오신 4; 184. IPI00216975 트로포마이오신 α-4 사슬의 스플라이스 아이소형 2; 185. IPI00180675 튜불린 α-3 사슬; 186. IPI00218343 튜불린 α-6 사슬; 187. IPI00216298 타이오레독신; 188. IPI00472175 CDNA FLJ46672 fis, 클론 TRACH3009008, 타이오레독신 환원효소와 매우 유사; 189. IPI00450472 유비퀴틴-컨쥬게이팅 효소 E2I; 190. IPIOOOl 8352 유비퀴틴 카르복실-터미널 하이드롤레이스 아이소자임 Ll; 191. IPIOOO 10207 유비퀴틴-접힌 조절제 1 전구물질; 192. IPI00260630 URB; 193. IPI00021263 14-3-3 단백질 ζ/δ; 194. IPI00642991 가상 단백질 DKFZp686Fl 0164; 195. IPI00470919 가상 단백질 DKFZp686K08164; 196. IPI00719088 콜라겐, 타입 VI, α 1 전구물질; 197. IPI00654685 SPARC 전구물질과 유사; 198. IPI00641961 콜라겐, 타입 XII, α 1; 199. IPI00645849 세포외 기질 단백질 1; 200. IPI00554786 타이오레독신 환원효소 1; 201. IPI00645018 플라미스노겐 활성제, 우로키나아제; 202. IPI00552339 금속단백분해효소 1의 조직 저해제; 203. IPI00642997 액틴, 세포질 2; 204. IPI00719778 아넥신 A2와 유사; 205. IPI00647915 트랜스젤린(Transgelin) 2; 206. IPI00552815 콜라겐, 타입 V, α 1; 207. IPI00552981 CDNA PSEC0266 fis, 클론 NT2RP3003649, 호모 사피엔스 피불린-lD mRNA와 매우 유사; 208. IPI00180776 29 kDa 단백질; 209. IPI00552416 필라민 A, α;
210. IPI00640698 액틴 γ-창자 평활근; 211. IPI00514530 액틴, α 1, 골격근; 212. IPI00556442 인슐린-유사 성장인자-결합 단백질 2 변이(단편); 213. IPI00513782 겔솔린(Gelsolin); 214. IPI00478731 29 kDa 단백질; 215. IPI00396479 24 kDa 단백질; 216. IPI00334627 39 kDa 단백질; 217. IPI00555762 PTK7 단백질 티로신키나아제 7 아이소형 변이(단편); 218. IPI00658202 97 kDa 단백질; 219. IPI00006273 CYR61 단백질; 220. IPI00719405 TMSL6 단백질; 221. IPI00658096 타이모신 β-4; 222. IPI00376163 5 kDa 단백질; 223. IPI00556217 피브릴린 1 변이(단편); 224. IPI00514817 라민 A/C와 유사; 225. IPI00644087 프로게린; 226. IPI00655812 횡문근육종 항원 MU-RMS-40.12; 227. IPI00604517 누클리올린과 유사; 228. IPI00444262 CDNA FLJ45706 fis, 클론 FEBRA2028457, 누클리올린과 매우 유사; 229. IPI00412473 단백질; 230. IPI00414489 단백질; 231. IPI00411463 단백질; 232. IPI00556415 트랜스젤린(Transgelin) 변이(단편); 233. IPI00718825 칼모듈린; 234. IPI00478156 17 kDa 단백질; 235. IPI00386621 CALM3 단백질; 236. IPI00647001 산성; 237. IPI00642650 스타니오칼신 2 전구물질과 유사; 238. IPI00641471 콜라겐-유사 단백질; 239. IPI00514669 SH3 도메인 결합 글루탐산-풍부 단백질 유사 3; 240. IPI00719422 트라이오스포스페이트 이성질화효소 (단편); 241. IPI00003734 추정 SlOO 칼슘-결합 단백질 H_NHO456N16.1; 242. IPI00029574 11 kDa 단백질; 243. IPI00641047 겔솔린(Gelsolin); 244. EPI00647556 겔솔린(Gelsolin); 245. IPI00654821 가상 단백질 LOC54845 아이소형 1; 246. IPI00647572 Dickkopf 연관 단백질-3 전구물질; 247. IPI00639879 세포질분열 단백질 sepA 와 유사; 248. IPI00657746 세포질분열 단백질 8의 데디케이터와 유사 ; 249. IPI00555993 혈관내피 성장인자 수용체 3 변이; 250. IPI00552545 세포질분열 단백질 8의 데디케이터.
동시에, 이들 250개의 단백질은 공지된 특이적 유전자에 의해 암호화된다: ACTAl; COL5A2; HSPA8; PSAP; ACTA2; COL5A3; HSPEl; PSMEl; ACTB; COL6A1; HSPG2; PTK7; ACTC; COL6A2; IGFBP2; QSCN6; ACTGl; COL6A3; IGFBP5; RTN4; ACTG2; CSTB; IGFBP6; SlOOAI l; AGRN; CTBS; IGFBP7; SH3BGRL3; ALCAM; CTSB; K-ALPHA-I; SODl; ANP32B; CYR61; KDR; SPARC; ANXA2; DOCKlO; LAMCl; SPTBNl; ARHGDIA; DOCK8; LGALSl; STC2; B2M; ECMl; LGALS3BP; SVEPl; BMPl; EEFlG; LMNA; TAGLN ; C14orfl 66; ENOl; LOX; TAGLN2; ClR; ENOlB; LTBPl; TGFBI; CALMl; EN02; LUM; TGFBR3; CD109; FBLNl; MDH2; THBSl; CD44; FBNl; MRC2; TIMPl; CDHI l; FBN2; MYHI l; TIMP2; CDH13; FGF17; MYH9; TMSB4X; CDH2; FGFR2; NCL; TMSL3; CFH/HF1; FLJ21918; NPMl; TMSL6; CFLl; FLNA; PBP; TPIl; CLSTNl; FNl; PCOLCE; TPM4; COLI lAl; FSTLl; PDGFRB; TUBA3; COL12A1; GALNT5; PFNl; TUBA6; COL16A1; GLRX; PGKl; TXN; COLlAl; GOLPH2; PGK2; TXNRDl; COLl A2; GSN; PLAU; UBE2I; COL3A1; GSTPl; PLECl; UCHLl; COL4A1; HNRPCLl; PPIA; UFMl; COL4A2; HNRPF; PRDXl; URB; COL5A1; HNT; PRDX5; YWHAZ.
또한 32개의 알려지지 않은 단백질이 있다: IPI00642991 가상 단백질 DKFZp686F10164; IPI00470919 가상 단백질 DKFZp686K08164; IPI00654685 SPARC 전구물질과 유사; IPI00719778 아넥신 A2와 유사; IPI00552981 CDNA PSEC0266 fis, clone NT2RP3003649, 호모 사피엔스 피불린-lD mRNA와 매우 유사; IPIOO 180776 29 kDa 단백질; IPI00478731 29 kDa 단백질; IPI00396479 24 kDa 단백질; IPI00334627 39 kDa 단백질; IPI00658202 97 kDa 단백질; IPI00376163 5 kDa 단백질; IPI00514817 라민 A/C와 유사; IPI00644087 프로게린; IPI00655812 횡문근육종항원 MU-RMS-40.12; IPI00604517 누클리올린과 유사; IPI00444262 CDNA FLJ45706 fis, 클론 FEBRA2028457, 누클리올린과 매우 유사; IPI00412473 단백질; IPI00414489 단백질; IPI00411463 단백질; IPI00478156 17 kDa 단백질; IPI00386621 CALM3 단백질; IPI00647001 산성; IPI00642650 스타니오칼신 2 전구물질과 유사; IPI00641471 콜라겐-유사 단백질; IPI00514669 SH3 도메인 결합 글루탐산-풍부한 단백질 유사 3; IPI00003734 추정 SlOO 칼슘-결합 단백질 H_NHO456N16.1; IPI00029574 11 kDa 단백질; IPI00654821 가상 단백질 LOC54845 아이소형 1; IPI00647572 Dickkopf 연관 단백질-3 전구물질; IPI00639879 세포질분열 단백질 sepA와 유사; IPI00657746 세포질분열 단백질 8의 데디케이터와 유사; IPI00555993 혈관내피 성장인자 수용체 3 변이.
따라서 본 명세서에 기술된 MSCs는 이들 단백질 중 어느 하나 또는 전부, 또는 이들로부터 분비되거나 발현된 어떤 단백질 또는 그 밖의 분자의 원재료(source)로서 사용될 수 있다.
MSCs는 이들 주변8의 세포에 영향을 끼치는 사이토카인 및 성장인자의 광범위한 분비를 나타낸다. 이런 인자의 대부분은 샷-건 LC MS/MS 분석동안 쉽게 검출할 수 없는 작은 분자이다. 따라서 CM 및 NCM은 101개의 사이토카인/성장인자에 대한 항체를 함께 운반하는 5개의 상이한 항체 어레이로 혼성화시켜 분석된다(도 7을 참고).
항체 어레이의 레이아웃
RayBio® 혈관신생 어레이 I
A B C D E F G H
1 POS POS NEG 안지오제닌 EGF ENA-78 b FGF
2 POS POS NEG 안지오제닌 EGF ENA-78 b FGF
3 GRO IFN-□ TGF-I IL-6 IL-8 렙틴 MCP-1 PDGF-BB
4 GRO IFN-□ TGF-I IL-6 IL-8 렙틴 MCP-1 PDGF-BB
5 PIGF RANTES TGF-□1 TIMP-1 TIMP-2 트롬보포이에틴 VEGF VEGF-D
6 PIGF RANTES TGF-□1 TIMP-1 TIMP-2 트롬보포이에틴 VEGF VEGF-D
7 BLANK BLANK BLANK BLANK BLANK BLANK Neg POS
8 BLANK BLANK BLANK BLANK BLANK BLANK Neg POS
RayBio® 인간 케모카인 항체 어레이 I
A B C D E F G H I J K L
1 POS POS NEG NEG BLC CCL28 Ckβ8-1 CTACK CXCL16 ENA-78 에오탁신 에오탁신-2
2 POS POS NEG NEG BLC CCL28 Ckβ8-1 CTACK CXCL16 ENA-78 에오탁신 에오탁신-2
3 에오탁신-3 프랙탈카인 GCP-2 GRO GROα HCC-4 I-309 I-TAC IL-8 IP-10 림포탁신 MCP-1
4 에오탁신-3 프랙탈카인 GCP-2 GRO GROα HCC-4 I-309 I-TAC IL-8 IP-10 림포탁신 MCP-1
5 MCP-2 MCP-3 MCP-3 MDC MIG MIP-1α MIP-1β MIP-1δ MIP-3α MIP-3β MPIF-1 NAP2
6 MCP-2 MCP-3 MCP-3 MDC MIG MIP-1α MIP-1β MIP-1δ MIP-3α MIP-3β MPIF-1 NAP2
7 PARC PARC RANTES SDF-1β TARC TECK BLANK BLANK BLANK BLAND BLANK POS
8 PARC PARC RANTES SDF-1β TARC TECK BLANK BLANK BLANK BLAND BLANK POS
RayBio® 기질 Matrix 금속단백분해효소 항체 어레이 I
A B C D E F G H
1 POS POS NEG NEG MMP-1 MMP-2 MMP-3 MMP-8
2 POS POS NEG NEG MMP-1 MMP-2 MMP-3 MMP-8
3 MMP-9 MMP-10 MMP-13 TIMP-1 TIMP-2 TIMP-3 TIMP-4 POS
4 MMP-9 MMP-10 MMP-13 TIMP-1 TIMP-2 TIMP-3 TIMP-4 POS
RayBio® 인간 사이토카인 항체 어레이 I
A B C D E F G H
1 POS POS NEG NEG GCSF GM-CSF GRO GROα
2 POS POS NEG NEG GCSF GM-CSF GRO GROα
3 IL-1α IL-2 IL-3 IL-5 IL-6 IL-7 IL-8 IL-10
4 IL-1α IL-2 IL-3 IL-5 IL-6 IL-7 IL-8 IL-10
5 IL-13 IL-15 IFN-γ MCP-1 MCP-2 MCP-3 MIG RANTES
6 IL-13 IL-15 IFN-γ MCP-1 MCP-2 MCP-3 MIG RANTES
7 TGF-β1 TNF-α TNF-β BLANK BLANK BLANK BLANK POS
8 TGF-β1 TNF-α TNF-β BLANK BLANK BLANK BLANK POS
RayBio® 인간 사이토카인 항체 어레이 V
A B C D E F G H I J K L
1 POS POS POS POS NEG NEG ENA-78 GCSF CM-CSF GRO GRO-α POS
2 I-309 IL-1α IL-1β IL-2 IL-3 IL-4 IL-5 IL-6 IL-7 IL-8 IL-10 I-309
3 IL-12 p40p70 IL-13 IL-15 IFN-γ MCP-1 MCP-2 MCP-3 MCSF MDC MIG MIP-1β IL-12 p40p70
4 MIP-1δ RANTES SCF SDF-1 TARC TGF-β1 TNF-α TNF-β EGF IGF-1 안지오게닌 MIP-1δ
5 온코스타틴 M 트롬보포이에틴 VEGF PDGF- 렙틴 BDNF BLC Ckβ8-1 에오탁신 에오탁신-2 에오탁신-3 온코스탁신 M
6 FGF-4 FGF-6 FGF-7 FGF-9 Flt-3리간드 프랙탈카인 GCP-2 GDNF HGF IGFBP-1 IGFBP-2 FGF-4
7 IGFBP-3 IGFBP-4 IL-16 IP-10 LIF LIGHT MCP-4 MIF MIP-3α NAP-2 NT-3 TGFBP-3
8 NT-4 오스테오프로테게린 PARC PIGF TGF-β2 TGF-β2 TIMP-1 TIMP-2 NEG POS POS NT-4
72개의 사이토카인/성장인자는 독립적으로 제조된 4개의 CM 중에서 적어도 3개에서 HuES9.El MSCs에 의해 분비되는 것으로 알려졌으며, NCM에서는 아니다. 72개의 단백질이 항체 어레이(Name GeneSymbol GenelD)에 의해 확인되었다: 1. MDC ADAMl 1 GI_11496997-A; 2. 안지오제닌 ANG GI_42716312-S; 3. BDNF BDNF GI_34106709-A; 4. 1-309 CCLl GI_4506832-S; 5. 에오탁신 CCL11 GI_22538399; 6. MlP-lδ CCL15 GI_34335180-A; 7. HCC-4 CCL16 GI_22538800; 8. MCP-I CCL2 GI_22538812-S; 9. Ckβ8-1 CCL23 GI_22538807-A; 10. 에오탁신-2 CCL24 GI_22165426-S; 11. 에오탁신-3 CCL26 GI_22547151-S; 12. RANTES CCL5 GI_22538813; 13. MCP-3 CCL7 GIJ3435401-S; 14. MCP-2 CCL8 GI_22538815-S; 15. MCSF CSFl GI_27262666-I; 16. GM-CSF CSF2 GI_27437029-S; 17. GCSF CSF3 GI_27437048; 18. 프렉탈카인 CX3CL1 GI_4506856-S; 19. GRO-a CXCLl GI_4504152-S; 20. 1-TAC CXCLI l GIJ4790145-S; 21. SDF-I CXCL12 GI_40316923; 22. BLC CXCL13 GI_5453576-S; 23. ENA-78 CXCL5 GI_41872613-S; 24. IP-IO CXCR3 GI_4504098-S; 25. EGF EGF GI_6031163-S; 26. FGF-4 FGF4 GI_4503700; 27. FGF-6 FGF6 GI_10337586; 28. FGF-7 FGF7 GI_15147344; 29. FGF-9 FGF9 GI_4503706-S; 30. 피트(Fit) 3 리간드 FLT3LG GI_38455415- S; 31. GDNF GDNF GI_40549410; 32. GCP-2 GOLGA4 GI_45359854-S; 33. HGF HGF GI_33859834-S; 34. IFN-γ IFNG GI_10835170-S; 35. IGF-I IGFl GIJ9923111-S; 36. IGFBP-I IGFBPl GI_4504614-S; 37. IGFBP-2 IGFBP2 GI_10835156-S; 38. IGFBP-4 IGFBP4 GI_10835020-S; 39. IL-10 ILlO GI_24430216-S; 40. IL-12p40p70 IL12B GI_24497437-S; 41. IL-13 IL13 GI_26787977-S; 42. IL-16 IL16 GI_27262654-A; 43. IL-Ia ILlA GI_27894329-S; 44. IL-Iβ ILlB GI_27894305-S; 45. IL-2 IL2 GI_28178860-S; 46. IL-3 IL3 GI_28416914-S; 47. IL-6 IL6 GI_10834983-S; 48. IL-7 IL7 GI_28610152-S; 49. IL-8 IL8 GI_28610153-S; 50. SCF KITLG GI_4580419-A; 51. LEPTIN LEP GI_4557714-S; 52. LIF LIF GI_6006018-S; 53. MIF MIF GI_4505184-S; 54. MMP-I MMPl GIJ3027798-S; 55. MMP-10 MMPlO GI_4505204-S; 56. MMP-13 MMP13 GIJ3027796-S; 57. MMP 3 MMP3 GIJ3027803-S; 58. MMP-9 MMP9 GI_4826835-S; 59. PARC PARC GI_24307990; 60. PDGF-BB PDGFB GIJ5451785-A; 61. PIGF PIGF GI_27894289-A; 62. TGF-βl TGFBl GI_10863872; 63. TGF-β2 TGFB2 GI_4507462-S; 64. 트롬보포이에틴 THPO GI_40805871-S; 65. TIMP-I TIMPl GI_4507508-S; 66. TIMP-2 TIMP2 GI_9257247-S; 67. TIMP-3 TIMP3 GI_21536431 -S; 68. TIMP-4 TIMP4 GI_4507514-S; 69. TNF-α TNF GI_25952110; 70. 오스테오프로테게린(Osteoprotegerin) TNFRSFl IB GI_22547122-S; 71. VEGF VEGF GI_30172563-S; 72. 림포탁틴(Lymphotactin) XCLl GI_4506852-S.
29개의 단백질은 항체 어레이(Name GeneSymbol GenelD)에 의해 검출되지 않는다: b FGF CCL23 GI_22538807-A; MCP-4 CCL13 GI_22538799-S; TARC CCL17 GI_22538801- S; MIP-3b CCL19 GI_22165424-S; MIP-3a CCL20 GI_4759075-S; MPIF-I CCL23 GI_22538807-A; TECK CCL25 GI_22538797-A; CTACK CCL27 GI_22165428-S; CCL28 CCL28 GI_22538810-A; MIP-Ib CCL4 GI_4506844-S; SDF-Ia CXCL12 GI_40316923-1; SDF-Ib CXCL12 GI_40316923-1; CXCL16 CXCL16 GI_11545764-S; MIG CXCL9 GI_4505186-S; MIP-Ia CXCR6 GI_5730105-S; IGFBP-3 IGFBP3 GI_19923 HO-S; IL- 15 IL15 GI_26787979-A; IL-4 IL4 GI_27477091-A; IL-5 IL5 GI_28559032-S; TNF-b LTA GI_6806892-S; MMP-2 MMP2 GI_11342665-S; MMP-8 MMP8 GI_4505220-S; NAP-2 NAP1L4 GI_21327711-S; NT-3 NTF3 GI_45359869-S; NT-4 NTF5 GI_34328933-S; 온코스타틴(Oncostatin) M OSM GI_28178862-S; TGF-bl TGFBl GI_10863872-S; LIGHT TNFSF14 GI_25952146-A; VEGF-D VEGFD GI_19924297-S.
그러나 3개의 유전자 산물만이, 즉 IGFBP2, TIMPl 및 TIMP2는 LC MS/MS 분석에 의해 검출되나 아마 사이토카인 및 성장인자의 대부분이 작은 분자이기 때문에 전통적인 LC MS/MS 분석동안에는 검출 불가능하다.
132 및 72개의 유전자 산물 목록이 LC MS/MS에 의해 확인되었으며, 항체 어레이 분석은 각각 3개의 공통 유전자, 즉 IGFBP2, TIMPl 및 TIMP2를 지닌다. 따라서 최종 집계에 따르면, 전체 201개의 특이적 유전자 산물이 확인되었다(하기의 표 2)
ACTA1 CD44 CXCL5* GLRX IL16* PFN1 TIMP2
ACTA2 CD109 CXCL11* GOLGA4 K-ALPHA-1 PGK1 TIMP3
ACTB CDH2 CXCL12* GOLPH2 KDR PGK2 TIMP4
ACTC CDH11 CXCL13 ?? GSN KITLG PIGF TMSB4X
ACTG1 CDH13 CXCR3* GSTP1 LAMC1 PLAU TMSL3
ACTG2 CFH-HF1 CYR61 HGF LEP PLEC1 TMSL6
ADAM11 CFL1 DOCK8 HNRPCL1 LGALS1 PPIA TNF*
AGRN COLSTN1 DOCK10 HNRPF LGALS3BP PRDX1 TNFRSF11B*
ALCAM COL1A1 ECM1 HNT LIF PRDX5 TPI1
ANG COL1A2 EEF1G HSPA8 LMNA PSAP TPM4
ANP32B COL3A1 EGF HSPE1 LOX PSME1 TUBA3
ANXA2 COL4A1 ENO1 HSPG2 LTBP1 PTK7 TUBA6
ARHGDIA COL4A2 ENO1B IFNG ?? LUM QSCN6 TXN
B2M COL5A1 ENO2 IGF1 MDH2 R수4 TXNRD1
BDNF* COL5A2 FBLN1 IGFBP1 MIF* R100A11 UBE2I
BMP1 COL5A3 FBN1 IGFBP2 MMP1 SH3BGRL3 UCHL1
C14 또는 f166 COL6A1 FBN2 IGFBP4 MMP3* SOD1 UFM1
C1R COL6A2 FGF4 IGFBP5 MMP9 SPARC URB
CALM1 COL6A3 FGF6 IGFBP6 MMP10 SPTBN1 VEGF ??
CCL1 COL11A1 FGF7 IGFBP7 MMP13 STC2 XCL1
CCL2 COL12A1 FGF9 IL1A* MRC2 SVEP1 YWHAZ
CCL5 COL16A1 FGF17 IL1B* MYH11 TAGLN
CCL7 CSF1* FGFR2 IL2* MYH9 TAGLN2
CCL8 CSF2* FLJ21918 IL3* NCL TGFB1
CCL11 CSF3* FLNA IL6* NPM1 TGFB2*
CCL15 CSTB FLT3LG IL7* PARC TGFB1*
CCL16 CTBS FN1 IL8* PBP TGFBR3
CCL23 CTSB FSTL1 IL10* PCOLCE THBS1
CCL24 CX3CL1* GALNT5 IL12B* PDGFB THPO
CCL26 CXCL1* GDNF IL13* PDGFRB TIMP1
표 2. 201개의 특이적 유전자 산물의 알파벳순 목록이 LC-MS/MS 및 항체 어레이에 의해 확인되었다. LC-MS/MS 및 항체 어레이에 의해 확인된 단백질은 이들의 유전자 심볼에 의해 결합되고 표현된다. 각 유전자에 대한 전사수준은 큰 처리량을 지닌 Illumina BeadArray를 사용하여 측정된다.
29개의 이들 유전자 산물은 즉, ENA-78, FGF-4, FGF-7, FGF-9, GCP-2, G- CSF, GM-CSF, GRO-a, HCC-4, HGF, IGFBP-I, IGFBP-2, IGFBP-4, EL-I β, IL-6, IL-8, IP-IO, LIF, MCP-I3 MCSF, MIF, 오스테오프로테게린(Osteoprotegerin), PARC, PIGF, SCF, TGF- β2, TIMP-I, TIMP -2, VEGF는 성체 조직 유래 MSCs(13,16,19-21)에 의해 분비되는 것으로 이전에 보고되었다. 성체 조직 유래 MSCs에 의해 분비되는 것으로 보고된 4개의 그 밖의 단백질 즉, IGFBP-3, MIP-3α, 온코스타틴(Oncostatin) M 및 TGF-β3(상기 참고)는 본 발명자들의 201개의 유전자 산물 목록에는 포함되지 않는다.
(실시예 10) 인간 ESC-유래 MSCs(hESC-MSCs)의 프로테옴 분석: genome wide-유전자 발현 분석에 의한 검정
Illumina BeadArray로 전체 RNA를 혼성화시킴으로써 생성된 hESC-MSCs의 genome-wide 유전자 발현 프로파일에 따라 201개의 유전자 산물에 대한 비교는 유전자 산물 중 134개 또는 67%가 99% 컨피던스(confidence)를 지닌 상기 검출 한계(LOD)에 존재하는 유전자 전사 수준을 지닌다는 것으로 밝혀졌다(표 2). LC MS/MS에 의해 확인된 132개의 유전자 산물 중 115개 또는 88%는 검출 가능한 전사수준(표 2)을 지니며, 항체 어레이에 의해 확인된 72개의 유전자 산물 중 27개 또는 38%는 검출 가능한 전사 수준을 지니나, 72개의 유전자 산물 중 45 또는 62%는 검출 가능한 전사 수준을 지니지 않는다(표 E2). 유전자 산물 2개에 관한 프로브, ENOlB 및 SVEPl는 Illumina BeadArray 상에 존재하지 않는다. 사이토카인/케모카인을 암호화하는 mRNAs는 유전암호해독시 mRNA의 빠른 퇴화(degradation)를 야기 시키는 AU-풍부 구성요소를 포함하기 때문에 72개 유전자 대부분에 관한 전사 수준은 Illumina BeadArray에 의해 검출할 수 있는 풍부도(abundance)에 대해 너무 낮다 (22,23).
따라서 더 민감한 qRT-PCR 분석이 실시된다. 72개 유전자 산물 중 42는 임으로 선택되며 테스트된다. 42개 유전자 산물 중 36개 또는 86%는 35 이하의 정상화된 Ct 값을 지니는 한정된 검출 가능한 전사 수준을 지닌다(하기의 표 3). 이 빈도(frequency)는 LC MS/MS에 의해 확인된 유전자 산물에 대해 관찰된 88% 빈도(frequency)와 유사하며, 이의 유전자 전사는 Illumina BeadArray에 의해 검출 가능하다. 더욱이 Illumina BeadArray에 의해 검출 가능한 전사 수준을 지닌 15개 모두는 또한 qRT-PCR에 의해 검출 가능한 전사 수준을 지닌다(표 3). Illumina BeadArray에 의해 검출 가능한 전사 수준을 지니지 않는 27개(78%) 유전자 산물 중 21개는 qRT-PCR에 의해 검출 가능한 전사 수준을 지닌다(표 3).
상징 일루미나 베드 어레이 표준화된 Ct
1 BDNF >LOD 13.38
2 CCL2 >LOD 11.28
3 CCL7 >LOD 17.35
4 CCL8 >LOD 30.28
5 CXCL1 >LOD 14.09
6 CXCL12 >LOD 16.83
7 CXCL5 >LOD 19.93
8 IL1A >LOD 16.6
9 IL1B >LOD 11.44
10 IL6 >LOD 18.92
11 IL8 >LOD 8.53
12 MIF >LOD 16.23
13 MMP3 >LOD 15.96
14 TGFB2 >LOD 15.16
15 TNFRSF11B >LOD 12.28
16 CCL1 <LOD 34.67
17 CCL11 <LOD 26.13
18 CCL23 <LOD 37.33
19 CCL24 <LOD 10.82
20 CCL26 <LOD 30.38
21 CCL5 <LOD 27.97
22 CSF1 <LOD 14.35
23 CSF2 <LOD 23.92
24 CSF3 <LOD 32.47
25 CX3CL1 <LOD 25.04
26 CXCL11 <LOD 22.38
27 CXCR3 <LOD 28.41
28 IL10 <LOD 27.4
29 IL12B <LOD 22.17
30 IL13 <LOD 14.96
31 IL16 <LOD 32.98
32 IL2 <LOD 31.87
33 IL3 <LOD 32.24
34 IL7 <LOD 22.3
35 TGFB1 <LOD 10.63
36 TNF <LOD 31.72
37 CCL15 <LOD >35
38 CCL16 <LOD >35
39 CXCL13 <LOD >35
40 IFNG <LOD >35
41 VEGF <LOD >35
42 CXL1 <LOD >35
표 3. 전사의 존재에 대한 정량 RT-PCR 분석
항체 어레이에 의해 확인된 72개 유전자 산물 중 42개는 임의로 qRT-PCR 분석에 대해 선택된다. 12개 유전자 산물은 Illumina BeadArray, 큰 처리량을 지닌 genome-wide 유전자 발현 분석 상의 99% 컨피던스(confidence)에서 상기 검출한계(LOD)를 지니는 전사수준을 지닌다. 각 유전자에 대한 Ct 값은 β-액틴에 반해서 정상화된다.
(실시예 11) 인간-유래 MSCs(hESC-MSCs)의 프로테옴 분석: 분비된 단백질에 의해 조절되는 생물학적 과정
분비된 산물이 손상된 조직 또는 기관을 복구하는 잠재능을 지니는지 확인하기 위해서, 먼저 유전자 산물은 유전자 온톨리지(GO)에 따른 이들의 생물학적 과정 및 경로에 따라 분류된다. 그 다음에 각 과정 또는 경로와 연관된 분비된 MSC 프로테옴에서 특이적 유전자의 빈도(frequency)는 Unigene, Entrez 및 GenBank로부터 수집된 데이터베이스에서 각각의 경로 또는 과정에 관한 유전자-빈도(frequency)와 비교된다. 상당히 큰 유전자의 빈도(p<0.05)는 58개의 생물학적 과정 및 30개의 경로와 연관되어 있다.
GO에 의해 분류된 생물학적 과정은 201개의 특이적 유전자 산물에 의해 조절된다:
GO 생물학적 과정 # genes (ref) % (ref) # genes (expt) % (expt) p-value
1. GO:42221:화학적 자극에 대한 반응 130 0.53 23 11.56 2.50E-24
2. GO:42330:택시스 130 0.53 23 11.56 2.50E-24
3. GO:6935:케모택시스 130 0.53 23 11.56 2.50E-24
4. GO:9605:외부 자극에 대한 반응 157 0.65 24 12.06 9.45E-24
5. GO:50896:자극에 대한 반응 158 0.650 24 12.06 1.11E-23
6. GO:9628:비 생물학적 자극에 대한 반응 150 0.62 23 11.56 7.83E-23
7. GO:48513:장기 발달 116 0.48 11 5.53 3.06E-09
8. GO:7275:발달 827 3.40 23 11.56 3.27E-07
9. GO:16052:탄수화물 분해대사 51 0.21 6 3.02 3.66E-06
10. GO:19320:헥소오즈 분해대사 51 0.21 6 3.02 3.66E-06
11. GO:44248:세포 분해대사 51 0.21 6 3.02 3.66E-06
12. GO:44265:세포 고분자 분해대사 51 0.21 6 3.02 3.66E-06
13. GO:44275:세포 탄수화물 분해대사 51 0.21 6 3.02 3.66E-06
14. GO:46164:알코올 분해대사 51 0.21 6 3.02 3.66E-06
15. GO:46365:단당류 분해대사 51 0.21 6 3.02 3.66E-06
16. GO:6007: 포도당 분해대사 51 0.21 6 3.02 3.66E-06
17. GO:6096:글리콜라이시스 51 0.21 6 3.02 3.66E-06
18. GO:9057:고분자 분해대사 51 0.21 6 3.02 3.66E-06
19. GO:9056:분해대사 53 0.22 6 3.02 4.60E-06
20. GO:15980:유기화합물 산화에 의한 에너지 유도 65 0.27 6 3.02 1.53E-05
21. GO:19318:헥소오즈 대사 65 0.27 6 3.02 1.53E-05
22. GO:442625:세포 탄수??물 대사 65 0.27 6 3.02 1.53E-05
23. GO:5975:탄수화물 대사 65 0.27 6 3.02 1.53E-05
24. GO:5996:단당류 대사 65 0.27 6 3.02 1.53E-05
25. GO:6006:포도당 대사 65 0.27 6 3.02 1.53E-05
26. GO:6066:알코올 대사 65 0.27 6 3.02 1.53E-05
27. GO:6091:전구체 대사를 통한 에너지 발생 65 0.27 6 3.02 1.53E-05
28. GO:6092:탄수화물 대사의 주요 경로 65 0.27 6 3.02 1.53E-05
29. GO:43170:고분자 대사 571 2.35 16 8.04 2.03E-05
30. GO:1525:혈관신생 44 0.18 5 2.51 2.90E-05
31. GO:1568:혈관발달 47 0.19 5 2.51 4.02E-05
32. GO:1944:맥관류 발달 47 0.19 5 2.51 4.02E-05
33. GO:48514:혈관 모르포제네시스 47 0.19 5 2.51 4.02E-05
34. GO:6950:스트레스에 대한 반응 10 0.04 3 1.51 6.18E-05
35. GO:9611:상처에 대한 반응 10 0.04 3 1.51 6.18E-05
36. GO:1660:발열 2 0.01 2 1.01 6.64E-05
37. GO:31649:열 발생 2 0.01 2 1.01 6.64E-05
38. GO:43207:외부 생물학적 자극에 대한 반응 2 0.01 2 1.01 6.64E-05
39. GO:6952:저항 반응 2 0.01 2 1.01 6.64E-05
40. GO:6954:염증 반응 2 0.01 2 1.01 6.64E-05
41. GO:6955:면역 반응 2 0.01 2 1.01 6.64E-05
42. GO:9607:생물학적 자극에 대한 반응 2 0.01 2 1.01 6.64E-05
43. GO:9613:페스트 병원체 기생충에 대한 반응 2 0.01 2 1.01 6.64E-05
44. GO:9887:기관 모르포제네시스 53 0.22 5 2.51 7.23E-05
45. GO:1659:열 조절 3 0.01 2 1.01 1.98E-04
46. GO:30097:조혈 26 0.11 3 1.51 1.22E-03
47. GO:48534:조혈 또는 림프기관 발달 26 0.11 3 1.51 1.22E-03
48. GO:1501:골격 발달 38 0.16 3 1.51 3.67E-03
49. GO:1503:골형성 38 0.16 3 1.51 3.67E-03
50. GO:31214:바이오미네랄 형성 38 0.16 3 1.51 3.67E-03
51. GO:46849:골 리모델링 38 0.16 3 1.51 3.67E-03
52. GO:6793:인 대사 13 0.16 2 1.01 4.88E-03
53. GO:6796:인산 대사 13 0.16 2 1.01 4.88E-03
54. GO:9888:조직 발달 54 0.22 3 1.51 9.82E-03
55. GO:45045:배설 경로 34 0.14 2 1.01 3.14E-02
56. GO:6887:외포작용 34 0.14 2 1.01 E.14E-02
57. GO:46903:분비 36 0.15 2 1.01 3.49E-02
58. GO:1570:맥관형성 5 0.02 1 0.50 4.02E-02
GO 경로 p-value
1. 사이토카인-사이토카인수용체 상호반응 4.97E-47
2. ECM-수용체 상호반응 3.21E-17
3. Jak-STAT 시그널 경로 1.19E-10
4. MAPK 시그널 경로 1.19E-08
5. Toll-유사 수용체 시그널 경로 1.34E-05
6. TGF-베타 시그널 경로 0.000292
7. mTOR 시그널 경로 0.0143
8. Fc epsilon RI 시그널 경로 0.00267
9. 헬리코박터 파이로리 감염에 의한 상피세포 시그널 0.0183
10. 세포 커뮤니케이션 1.17E-17
11. 갭 정크션 0.00077
12. 타이트 정크션 0.0459
13. 포컬(focal) 부착 1.54E-21
14. 액틴 사이토스켈레톤 조절 2.65E-13
15. 루코사이트 트랜스엔도세미얼 이동 3.88E-05
16. 컴플리먼트와 코아규레이션 캐스케이드 0.0488
17. 항원 프로세싱 및 프레젠테이션 0.0102
18. 세포사멸 0.00648
19. 티세포 수용체 시그널 경로 0.000866
20. 조혈모세포 계열 3.32E-14
21. 1형 당뇨병 4.60E-06
22. 탄소고정 0.000257
23. 당화작용 또는 당원신생 0.00106
24. 스틸벤 쿠마린 및 리그닌 생합성 0.0348
25. 페닐알라닌 대사 0.00488
26. 페닐알라닌-타이로신 및 트립토판 생합성 0.00567
27. 메탄 대사 0.00739
28. 항원 카복실레이트 사이클 (CO2 고정) 0.00739
29. 이노시톨 대사 0.0163
30. 시트레이트 대사 (TCA 사이클) 0.0404
58개 생물학적 과정은 3개의 주요한 그룹과 거의 비슷하다: 대사, 방어 반응 및 조직 분화 동시에 30개 경로가 하기로 광범위하게 범주화된다: 수용체 결합, 신호 전달, 세포-세포 상호작용. 세포 이동, 면역 반응 및 대사이다(도 8, 도9). 언급된 생물학적 과정 및 경로는 분비된 단백질이 에너지 생성, 파괴, 생합성 및 분자 분비를 조절하는 세포 대사, 손상된 조직 및 새로운 조직의 재생의 제거에 필수적인 과정에 중요한 영향을 끼친다는 것을 나타낸다(도 8, 도9).
MSC-조절배지에서 사이토카인 및 케모카인의 현저한 존재와 일치하여, 상기 분석은 분비된 인자가 많은 외부 자극, 예를 들면 화학주성, 주성 및 면역 반응에 의존하는 세포 반응을 유도한다는 것을 예측한다(도 8). 특히 조절배지는 조직분화 특히 혈관신생, 조혈 및 뼈 발달을 촉진하는 과정에 중요한 생물학적 과정을 유도한다(도 8).
분비된 프로테옴에 의해 조절되는 것으로 예측된 이들 경로에서, 사이토카인 및 ECM 경로의 수용체-매개 결합은 분비된 프로테옴에서 사이토카인 및 ECM 성분의 우세와 일치한다(도 9). 분비된 프로테옴에 의해 활성화될 수 있는 주 신호 전달 경로는 Jak-STAT 신호 경로, MAPK 신호 경로, 톨-유사(Toll-like) 수용체 신호 경로, TGF-β 신호 경로, mTOR 신호 경로, Fc ε RI 신호 경로 및 헬리코박터피로리감염시 상피세포 신호를 포함한다. 또한 분비된 프로테옴의 컴퓨터 분석은 MSC 분비가 세포-세포 상호작용, 이동 및 면역 반응을 증진시킨다는 것을 나타낸다.
(실시예 12) 인간 ESC-유래 MSCs(hESC-MSCs)의 프로테옴 분석: 디스커션
MSCs는 많은 질병을 치료하기 위한 전-임상적 및 임상적 시도에 사용된다(3-5,24-27). 그러나 근본적인 메커니즘은 명확하게 이해되지 않은 채로 남아 있다. 비록 MSCs가 잠재적으로 손상된 조직을 회복 또는 재생시킬 수 있는 수많은 세포 타입 예를 들면 내피 세포, 심장세포, 연골세포로 분화되는 가능성을 지니더라도, MSCs의 치료효과는 MSC-유래 회복 세포 타입의 발생에 의해 단독으로는 매개될 수 없다. 그 이유는 MSCs의 분화는 일반적으로 조직 회복 또는 조직 기능을 복구하는 것을 매개하는 효과가 없기 때문이다. MSCs의 일부 치료효과는 MSCs(8)에 의해 분비된 측분비 인자에 의해 매개되는 것을 더욱 더 제안하고 있다. 여기서 본 발명자들은 2개의 기술, LC-LC-MS 및 항체 어레이의 결합을 통해 hESC-MSCs의 분비된 프로테옴의 성분을 기술한다.
비록 LC-LC-MS에 의한 샷-건 프로테옴 분석은 민감한 기술이며, 높은 처리능력을 지니더라도, 사이토카인, 케모카인 및 성장인자 대부분을 포함하는 작은 단백질/펩티드를 검출하는 것은 어렵다. 이것은 항체 어레이의 사용에 의해 부분적으로 완화된다. 2개의 기술을 사용하는 MSC 분비의 정성 프로테옴 프로파일은 큰 재현성을 지닌다. LC MS/MS에 의해 확인된 단백질은 2개의 독립적으로 재조된 CM 배치에 존재하며, 동시에 항체 어레이에 의해 확인된 단백질은 4개의 독립적으로 제조된 CM 배치 중 적어도 3개에 존재한다. 이렇게 만들어진 hESC-MSCs에 의한 분비물의 프로테옴 프로파일은 이전의 보고에 따르면 성체 조직-유래 MSCs(13,16,19-21)뿐만 아니라 기술되지는 않았지만 그 밖의 많은 부분에서 분비되는 모든 인자를 거의 포함한다. 더욱이 프로테옴 프로파일링의 확고성은 높은 처리량을 지닌 마이크로어레이-기반 유전자 발현 분석을 사용하여 프로테옴 프로파일에서 유전자 산물의 86∼88%에 대한 전사 검출에 의해 입증된다.
세계적인 규모로 MSC 분비의 잠재적 기능을 평가 및 사정하기 위해서, 본 발명자들은 유전자 발현 분석에 관해서 손쉽게 사용 가능한 컴퓨터 도구를 이용하였으며. 번역후 변형된 단백질보다 유전자 산물을 기초로 한다. 분비시 사이토카인 및 케모카인의 우세와 일치하여, 화학주성, 주성 그리고 외부 자극, 파괴, 생합성 및 분자의 분비에 대한 세포 반응, 사이토카인-사이토카인 수용체 상호작용, 세포-세포 상호작용 및 글루코스 및 아미노산 대사와 같은 기초대사와 같은 사이토카인 및 케모카인의 기능과 연관된 컴퓨터 분석은 많은 과정 및 경로를 예측한다. 본 명세서에 기술된 MSCs는 질병을 치료하는 데 사용되며, 이들 기능은 질병 치료 역할을 한다.
비록 이들 과정 및 경로가 어떤 특정한 세포 또는 조직 타입의 부상, 회복 및 재생 과정에 대해 특이적이지 않으며, 부상위치로 면역 세포 이동을 촉진, ECM 리모델링 및 세포대사의 증가는 부상을 입거나 병에 걸린 조직 대부분에 회복효과를 나타낸다.
사이토카인 및 케모카인과 연관된 일반 경로를 제외하고, 컴퓨터 분석은 또한 분비된 단백질이 혈관신생, 조형 및 골격 발달과 관련된 많은 과정을 조절한다는 것을 예측한다. 일치하게는 대부분의 보고된 MSC-매개 조직 회복 또는 재생은 심장혈관, 조혈 및 근골격 조직과 연관되어 있다(3-5,24-27). 더욱이 경로 분석은 MSCs의 측분비 효과 매개와 연관된 후보경로를 나타낸다. 사실 대부분의 이들 후보 경로는 심장혈관, 조혈 및 근골격의 생물학적 측면에서 이미 공지되어 있다. 예를 들면, Jak-STAT 신호는 심장보호(28), 조혈(29,30) 및 골격 회복 및 리모델링(31,32)과 연관되어 있다; MAPK 신호는 심장혈관 반응(33,34), 골격 회복 및 리모델링(32,35) 및 조혈(36)의 여러 측면에서 중대한 역할을 한다; 톨-유사(Toll-like) 수용체 신호는 심장혈관 병리학의 개시 및 진행(37) 및 선천적 및 적응성 면역의 조절(38)을 나타낸다; TGF-β 신호는 정확한 심장 발달 심장 리모델링, 심장정지 및 혈관신생에 관한 진행(39-41), 조혈(42), 뼈 및 연골의 형성 및 리모델링(27,43)뿐만 아니라 일반적인 상처 치료(44)에 중요하다; 및 세포 성장 및 증식의 중요한 조절자로서 mTOR은 비-특이적이나, 정상 생리학 및 질병 모두에 중요한 중요한 역할을 한다(45-47).
결론적으로, 보고된 바에 따르면 성체 조직-유래 MSCs에 의해 분비된 많은 사이토카인을 포함하는 hESC-유래 MSCs에서 분비된 프로테옴의 분석은 분비된 프로테옴이 특히 심장혈관, 조혈 및 골격근 조직에서 조직 회복 및 재생에 조절 효과를 잠재적으로 나타낸다는 것을 제안하며, 따라서 MSC 이식 연구에서 조직 회복 및 재생시 MSC-매개 측분비 효과에 대한 분자 지지를 제공한다. 또한 이들 분비된 프로테옴은 MSC-매개 조직 회복 분자 메커니즘 및 조직 회복 및 재생을 조절하는 잠재적인 "끌어 당길 수 있는(draggable)" 타겟에 대해 많은 검증 가능한 가설을 나타낸다. hESC-유래 MSCs 및 성체 조직-유래 MSCs 사이의 유의미한 유사성은 MSC 배양 중 어느 하나의 조절배지가 유사한 생물학적 활성을 지닐 것 같다는 것을 제안한다.
따라서, 이것은 본 발명자들의 방법에 의해 유래된 MSCs가 골수유래 사본(counterpart)과 중요한 생물학적 유사성을 지닌다는 것을 나타낸다. 이러한 발견은 측분비 인자를 분비하는 능력에 있어서 성체 BM-유래 MSCs와 hESC-MSCs의 유사성을 나타낸다. 더욱이 조절배지의 형태를 포함하는 본 명세서에 기술된 MSCs로부터 분비된 하나 또는 그 이상의 단백질은 본 명세서에 기술된 MSCs로 동일한 과정을 위해 사용된다.
그러나 hESC-유래 MSCs는 성체 조직-유래 MSCs 이상으로 여러 가지 이점을 지닌다. MSC의 조직 원재료로서 hESC 세포주의 사용은 무한히 회복할 수 있고 팽창할 수 있는 조직 원재료를 구성하며, 재현성 있고 일관적인 MSCs 제조의 배치 투 배치(batch to batch) 및 따라서 임상적으로 준수하는 방식으로 CM을 증가시킨다. 또한 CM 제조의 확장성 및 낮은 cost off-자가 치료를 발달시킬 수 있는 잠재능을 증가시킨다. 더욱이 hESC-유래 MSC CM의 제조에 관한 무혈청 합성 배지의 발달은 혼란(confounding)을 감소시키고 혈청 또는 혈청 대체 배지와 같은 복합 배지 보충제와 관련된 가변성 오염물질을 감소시킨다. 따라서 본 발명자들의 CM에 관한 설명은 임상적 적용에 대한 MSC-기반 생물학적 유전암호해독과 관련되어 있다.
(실시예 13) 각각의 58개의 생물학적 과정에서 201개의 유전자의 목록화
알코올 대사
GI_16507966-S ENO2 엔올라제 2 (감마, 뉴로널)
GI_16507965-S ENO1 엔올라제 1 (알파)
GI_22095338-S PGK1 포스포글리세레이트키나제 1
GI_31543396-S PGK2 포스포글리세레이트키나제 2
GI_21735620-S MDH2 말레이트탈수소효소 2, NAD (미토콘드리아)
GI_26024330-S TPI1 트리오즈포스페이트 이성화제 1
혈관신생
GI_11321596-S KDR 키나제삽입도메인수용체 (Ⅲ형 수용체 타이로신 키나제)
GI_30172563-S VEGF 혈관내피증식인자
GI_28610153-S IL8 인터류킨 8
GI_42716312-S ANG 앤지오제닌, 리보뉴클레아제, RNase A 패밀리 5
GI_10337586-S FGF6 섬유아증식인자 6
바이오미네랄 형성
GI_27262662-A CDH11 캐드헤린 11, 2형, OB-캐드헤린 (조골세포)
GI_5902810-A BMP1 골모르포제네틱 단백질 1
GI_4507170-S SPARC 분비 단백질, 산성, 시스테인-풍부 (오스테오넥틴)
혈관발달
GI_11321596-S KDR 키나제삽입도메인수용체 (Ⅲ형 수용체 타이로신 키나제)
GI_30172563-S VEGF 혈관내피증식인자
GI_28610153-S IL8 인터류킨 8
GI_42716312-S ANG 앤지오제닌, 리보뉴클레아제, RNase A 패밀리 5
GI_10337586-S FGF6 섬유아증식인자 6
혈관형성
GI_11321596-S KDR 키나제삽입도메인수용체 (Ⅲ형 수용체 타이로신 키나제)
GI_30172563-S VEGF 혈관내피증식인자
GI_28610153-S IL8 인터류킨 8
GI_42716312-S ANG 앤지오제닌, 리보뉴클레아제, RNase A 패밀리 5
GI_10337586-S FGF6 섬유아증식인자 6
골 리모델링
GI_27262662-A CDH11 캐드헤린 11, 2형, OB-캐드헤린 (조골세포)
GI_5902810-A BMP1 골모르포제네틱 단백질 1
GI_4507170-S SPARC 분비 단백질, 산성, 시스테인-풍부 (오스테오넥틴)
탄수화물 대사
GI_16507966-S ENO2 엔올라제 2 (감마, 뉴로널)
GI_16507965-S ENO1 엔올라제 1 (알파)
GI_22095338-S PGK1 포스포글리세레이트키나제 1
GI_31543396-S PGK2 포스포글리세레이트키나제 2
GI_21735620-S MDH2 말레이트탈수소효소 2, NAD (미토콘드리아)
GI_26024330-S TPI1 트리오즈포스페이트 이성화제 1
분해대사
GI_16507966-S ENO2 엔올라제 2 (감마, 뉴로널)
GI_16507965-S ENO1 엔올라제 1 (알파)
GI_22095338-S PGK1 포스포글리세레이트키나제 1
GI_31543396-S PGK2 포스포글리세레이트키나제 2
GI_21735620-S MDH2 말레이트탈수소효소 2, NAD (미토콘드리아)
GI_26024330-S TPI1 트리오즈포스페이트 이성화제 1
세포 탄수화물 분해대사
GI_16507966-S ENO2 엔올라제 2 (감마, 뉴로널)
GI_16507965-S ENO1 엔올라제 1 (알파)
GI_22095338-S PGK1 포스포글리세레이트키나제 1
GI_31543396-S PGK2 포스포글리세레이트키나제 2
GI_21735620-S MDH2 말레이트탈수소효소 2, NAD (미토콘드리아)
GI_26024330-S TPI1 트리오즈포스페이트 이성화제 1
세포 탄수화물 대사
GI_16507966-S ENO2 엔올라제 2 (감마, 뉴로널)
GI_16507965-S ENO1 엔올라제 1 (알파)
GI_22095338-S PGK1 포스포글리세레이트키나제 1
GI_31543396-S PGK2 포스포글리세레이트키나제 2
GI_21735620-S MDH2 말레이트탈수소효소 2, NAD (미토콘드리아)
GI_26024330-S TPI1 트리오즈포스페이트 이성화제 1
세포 분해대사
GI_16507966-S ENO2 엔올라제 2 (감마, 뉴로널)
GI_16507965-S ENO1 엔올라제 1 (알파)
GI_22095338-S PGK1 포스포글리세레이트키나제 1
GI_31543396-S PGK2 포스포글리세레이트키나제 2
GI_21735620-S MDH2 말레이트탈수소효소 2, NAD (미토콘드리아)
GI_26024330-S TPI1 트리오즈포스페이트 이성화제 1
세포 고분자 분해대사
GI_16507966-S ENO2 엔올라제 2 (감마, 뉴로널)
GI_16507965-S ENO1 엔올라제 1 (알파)
GI_22095338-S PGK1 포스포글리세레이트키나제 1
GI_31543396-S PGK2 포스포글리세레이트키나제 2
GI_21735620-S MDH2 말레이트탈수소효소 2, NAD (미토콘드리아)
GI_26024330-S TPI1 트리오즈포스페이트 이성화제 1
케모탁시스
GI_27262654-A IL16 인터류킨 16 (림프구 화학유인물질 인자)
GI_22538807-A CCL23 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 23
GI_34335180-A CCL15 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 15
GI_40316922-I CXCL12 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 12 (스트로말세포 유래 인자 1)
GI_41872613-S CXCL5 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 5
GI_22538812-S CCL2 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 2
GI_4504098-S CXCR3 케모카인 (C-X-C 모티프) 수용체 3
GI_22538399-S CCL11 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 11
GI_5453576-S CXCL13 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 13 (B-세포 화학유인물질)
GI_22538815-S CCL8 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 8
GI_34222286-S CYR61 시스테인-풍부, 혈관형성 유도물질, 61
GI_4506832-S CCL1 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 1
GI_28610153-S IL8 인터류킨 8
GI_22538800-S CCL16 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 16
GI_14790145-S CXCL11 케모카인 (C--X-C 모티프) 리간드 11
GI_22165426-S CCL24 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 24
GI_22538813-S CCL5 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 5
GI_13435401-S CCL7 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 7
GI_4505862-S PLAU 플라스미노겐 활성제, 유로키나제
GI_4504152-S CXCL1 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1 (흑색종 성장자극 활성, 알파)
GI_27894329-S IL1A 인터류킨 1, 알파
GI_22547151-S CCL26 케모카인 (씨-씨 모티프) 리간드 26
GI_4506852-S XCL1 케모카인 (씨 모티프) 리간드 1
방어반응
GI_27894305-S IL1B 인터류킨 1, 베타
GI_27894329-S IL1A 인터류킨 1, 알파
발달
GI_42716312-S ANG 혈관신생, 리보뉴클레아제, RNase A 패밀리 5
GI_59028140-A BMP1 골 형성 단백질 1
GI_27262662-A CDH11 캐드헤린11, 2형, OB 캐드헤린 (조골세포)
GI_27262662-A CSF1 콜로니자극인자 1 (마크로파지)
GI_27437029-S CSF2 콜로니자극인자 2 (과립-마크로파지)
GI_27437048-A CSF3 콜로니자극인자 3 (과립구)
GI_34222286-S CYR61 시스테인-풍부 혈관신생 유도제 61
GI_24430140-S FBN1 피브릴닌 1 (마르판 증후군)
GI_4755135-S FBN2 피브릴닌 2 (선천구축거미가락증)
GI_10337586-S FGF6 섬유아증식인자 6
GI_24430216-S IL10 인터류킨 10
GI_28610153-S IL8 인터류킨 8
GI_11321596-S KDR 키나제삽입도메인수용체 (Ⅲ형 수용체 타이로신키나제)
GI_4580419-A KITLG KIT 리간드
GI_60060178-S LIF 백혈병 저해인자 (콜리너지 분화 인자)
GI_7262388-S PCOLCE 프로콜라겐 C-엔도펩티다제 증진제
GI_4507170-S SPARC 분비 단백질, 산성 시스테인-풍부 오스테오넥틴
GI_10863872-S TGFB1 변환증식인자 베타 1 (카무라티-엔젤만 병)
GI_4507470-S TGFBR3 변환증식인자 베타수용체 Ⅲ (베타글리칸, 300kDa)
GI_40317625-S THBS1 트롬보스폰딘 1
GI_40805871-S THPO 트롬보포이에틴 (골수증식 백혈병 바이러스 온코진 리간드, 거대핵세포 증식 및 발달인자)
GI_4507508-S TIMP1 TIMP메탈로펩티다제 저해제 1
GI_30172563-S VEGF 혈관내피증식인자
유기화합물의 산화에 의한 에너지 유도
GI_16507966-S ENO2 엔올라제 2 (감마, 뉴로널)
GI_16507965-S ENO1 엔올라제 1 (알파)
GI_22095338-S PGK1 포스포글리세레이트키나제 1
GI_31543396-S PGK2 포스포글리세레이트키나제 2
GI_21735620-S MDH2 말레이트탈수소효소 2, NAD (미토콘드리아)
GI_26024330-S TPI1 트리오즈포스페이트 이성화제 1
세포외유출
GI_22538815-S CCL8 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 8
GI_22538813-S CCL5 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 5
발열
GI_27894305-S IL1B 인터류킨 1, 베타
GI_27894329-S IL1A 인터류킨 1, 알파
전구체대사 및 에너지 발생
GI_16507966-S ENO2 엔올라제 2 (감마, 뉴로널)
GI_16507965-S ENO1 엔올라제 1 (알파)
GI_22095338-S PGK1 포스포글리세레이트키나제 1
GI_31543396-S PGK2 포스포글리세레이트키나제 2
GI_21735620-S MDH2 말레이트탈수소효소 2, NAD (미토콘드리아)
GI_26024330-S TPI1 트리오즈포스페이트 이성화제 1
포도당 분해대사
GI_16507966-S ENO2 엔올라제 2 (감마, 뉴로널)
GI_16507965-S ENO1 엔올라제 1 (알파)
GI_22095338-S PGK1 포스포글리세레이트키나제 1
GI_31543396-S PGK2 포스포글리세레이트키나제 2
GI_21735620-S MDH2 말레이트탈수소효소 2, NAD (미토콘드리아)
GI_26024330-S TPI1 트리오즈포스페이트 이성화제 1
포도당 대사
GI_16507966-S ENO2 엔올라제 2 (감마, 뉴로널)
GI_16507965-S ENO1 엔올라제 1 (알파)
GI_22095338-S PGK1 포스포글리세레이트키나제 1
GI_31543396-S PGK2 포스포글리세레이트키나제 2
GI_21735620-S MDH2 말레이트탈수소효소 2, NAD (미토콘드리아)
GI_26024330-S TPI1 트리오즈포스페이트 이성화제 1
당화작용
GI_16507966-S ENO2 엔올라제 2 (감마, 뉴로널)
GI_16507965-S ENO1 엔올라제 1 (알파)
GI_22095338-S PGK1 포스포글리세레이트키나제 1
GI_31543396-S PGK2 포스포글리세레이트키나제 2
GI_21735620-S MDH2 말레이트탈수소효소 2, NAD (미토콘드리아)
GI_26024330-S TPI1 트리오즈포스페이트 이성화제 1
열발생
GI_27894305-S IL1B 인터류킨 1, 베타
GI_27894329-S IL1A 인터류킨 1, 알파
조혈
GI_27262662-A CSF1 콜로니 자극인자 1 (마크로파지)
GI_4580419-A KITLG KIT 리간드
GI_24430216-S IL10 인터류킨 10
조혈 또는 림파기관 발달
GI_27262662-A CSF1 콜로니 자극인자 1 (마크로파지)
GI_4580419-A KITLG KIT 리간드
GI_24430216-S IL10 인터류킨 10
헥소즈 분해대사
GI_16507966-S ENO2 엔올라제 2 (감마, 뉴로널)
GI_16507965-S ENO1 엔올라제 1 (알파)
GI_22095338-S PGK1 포스포글리세레이트키나제 1
GI_31543396-S PGK2 포스포글리세레이트키나제 2
GI_21735620-S MDH2 말레이트탈수소효소 2, NAD (미토콘드리아)
GI_26024330-S TPI1 트리오즈포스페이트 이성화제 1
헥소즈 대사
GI_16507966-S ENO2 엔올라제 2 (감마, 뉴로널)
GI_16507965-S ENO1 엔올라제 1 (알파)
GI_22095338-S PGK1 포스포글리세레이트키나제 1
GI_31543396-S PGK2 포스포글리세레이트키나제 2
GI_21735620-S MDH2 말레이트탈수소효소 2, NAD (미토콘드리아)
GI_26024330-S TPI1 트리오즈포스페이트 이성화제 1
면역반응
GI_27894305-S IL1B 인터류킨 1, 베타
GI_27894329-S IL1A 인터류킨 1, 알파
염증반응
GI_27894305-S IL1B 인터류킨 1, 베타
GI_27894329-S IL1A 인터류킨 1, 알파
거대분자 대사
GI_5902810-A BMP1 골형성단백질 1
GI_31542249-S C1R 컴플리먼트 성분 1, r 보조성분
GI_22538429-A CTSB 카텝신 B
GI_16507965-S ENO1 엔올라제 1, (알파)
GI_16507966-S ENO2 엔올라제 2, (감마, 뉴로널)
GI_33859834-S HGF 간세포성장인자 (헤파포이에틴 A;스캐터 인자)
GI_21735620-S MDH2 말레이트탈수소효소 2, NAD (미토콘드리아)
GI_13027798-S MMP1 매트릭스 메탈로펩티다제 1 (세포간 콜라게나제)
GI_4505204-S MMP10 매트릭스 메탈로펩티다제 10 (스트로멜리신 2)
GI_13027796-S MMP13 매트릭스 메탈로펩티다제 13 (콜라게나제 3)
GI_13027803-S MMP3 매트릭스 메탈로펩티다제 3 (스트렙토멜리신 1, 프로젤라티나제)
GI_4826835-S MMP9 매트릭스 메탈로펩티다제 9 (젤라티나제 B, 92kDa 젤라티나제, 92kDa Ⅳ형 콜라게나제)
GI_22095338-S PGK1 포스포그리세레이트 키나제 1
GI_31543396-S PGK2 포스포그리세레이트 키나제 2
GI_4505862-S PLAU 플라스미노겐 활성제, 유로키나제
GI_26024330-S TPI1 트리오즈포스페이트 이성화제 1
거대분자 분해대사
GI_16507966-S ENO2 엔올라제 2 (감마, 뉴로널)
GI_16507965-S ENO1 엔올라제 1 (알파)
GI_22095338-S PGK1 포스포글리세레이트키나제 1
GI_31543396-S PGK2 포스포글리세레이트키나제 2
GI_21735620-S MDH2 말레이트탈수소효소 2, NAD (미토콘드리아)
GI_26024330-S TPI1 트리오즈포스페이트 이성화제 1
탄수화물 대사 주경로
GI_16507966-S ENO2 엔올라제 2 (감마, 뉴로널)
GI_16507965-S ENO1 엔올라제 1 (알파)
GI_22095338-S PGK1 포스포글리세레이트키나제 1
GI_31543396-S PGK2 포스포글리세레이트키나제 2
GI_21735620-S MDH2 말레이트탈수소효소 2, NAD (미토콘드리아)
GI_26024330-S TPI1 트리오즈포스페이트 이성화제 1
단당류 분해대사
GI_16507966-S ENO2 엔올라제 2 (감마, 뉴로널)
GI_16507965-S ENO1 엔올라제 1 (알파)
GI_22095338-S PGK1 포스포글리세레이트키나제 1
GI_31543396-S PGK2 포스포글리세레이트키나제 2
GI_21735620-S MDH2 말레이트탈수소효소 2, NAD (미토콘드리아)
GI_26024330-S TPI1 트리오즈포스페이트 이성화제 1
단당류 대사
GI_16507966-S ENO2 엔올라제 2 (감마, 뉴로널)
GI_16507965-S ENO1 엔올라제 1 (알파)
GI_22095338-S PGK1 포스포글리세레이트키나제 1
GI_31543396-S PGK2 포스포글리세레이트키나제 2
GI_21735620-S MDH2 말레이트탈수소효소 2, NAD (미토콘드리아)
GI_26024330-S TPI1 트리오즈포스페이트 이성화제 1
기관 발달
GI_27262662-A CSF1 콜로니 자극인자 1 (마크로파지)
GI_27262662-A CDH11 카드헤린 11, 2형, OB-카드헤린 (조골세포)
GI_4580419-A KITLG KIT 리간드
GI_5902810-A BMP1 골형성 단백질 1
GI_11321596-S KDR 키나제삽입도메인수용체 (Ⅲ형 수용체 타이로신 키나제)
GI_30172563-S VEGF 혈관내피증식인자
GI_28610153-S IL8 인터류킨 8
GI_4507170-S SPARC 분비 단백질, 산성, 시스테인-풍부 (오스테오넥틴)
GI_42716312-S ANG 앤지오제닌, 리보뉴클레아제, RNase A 패밀리 5
GI_24430216-S IL10 인터류킨 10
GI_10337586-S FGF6 섬유아증식인자 6
기관 형성
GI_11321596-S KDR 키나제삽입도메인수용체 (Ⅲ형 수용체 타이로신 키나제)
GI_30172563-S VEGF 혈관내피증식인자
GI_28610153-S IL8 인터류킨 8
GI_42716312-S ANG 앤지오제닌, 리보뉴클레아제, RNase A 패밀리 5
GI_10337586-S FGF6 섬유아증식인자 6
골 형성
GI_27262662-A CDH11 카드헤린 11, 2형, OB-카드헤린 (조골세포)
GI_5902810-A BMP1 골형성 단백질 1
GI_4507170-S SPARC 분비단백질, 산성, 시스테인-풍부 (오스테오넥틴)
인산 대사
GI_22095338-S PGK1 포스포글리세레이트키나제 1
GI_31543396-S PGK2 포스포글리세레이트키나제 2
인 대사
GI_22095338-S PGK1 포스포글리세레이트키나제 1
GI_31543396-S PGK2 포스포글리세레이트키나제 2
비생물적 자극에 대한 반응
GI_27262654-A IL16 인터류킨 16 (림프구 화학유인물질 인자)
GI_22538807-A CCL23 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 23
GI_34335180-A CCL15 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 15
GI_40316922-I CXCL12 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 12 (스트로말세포 유래인자 1)
GI_41872613-S CXCL5 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 5
GI_22538812-S CCL2 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 2
GI_4504098-S CXCR3 케모카인 (C-X-C 모티프) 수용체 3
GI_22538399-S CCL11 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 11
GI_5453576-S CXCL13 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 13 (B-세포 화학유인물질)
GI_22538815-S CCL8 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 8
GI_34222286-S CYR61 시스테인-풍부, 혈관형성 유도물질, 61
GI_4506832-S CCL1 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 1
GI_28610153-S IL8 인터류킨 8
GI_22538800-S CCL16 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 16
GI_14790145-S CXCL11 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 11
GI_22165426-S CCL24 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 24
GI_22538813-S CCL5 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 5
GI_13435401-S CCL7 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 7
GI_4505862-S PLAU 플라스미노겐 활성제, 유로키나제
GI_4504152-S CXCL1 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1(흑색종 성장자극 활성 알파)
GI_27894329-S IL1A 인터류킨 1, 알파
GI_22547151-S CCL26 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 26
GI_4506852-S XCL1 케모카인 (C 모티프) 리간드 1
생물적 자극에 대한 반응
GI_27894505-S IL1B 인터루킨 1, 베타
GI_27894329-S IL1A 인터루킨 1, 알파
화학적 자극에 대한 반응
GI_27262654-A IL16 인터류킨 16 (림프구 화학유인물질 인자)
GI_22538807-A CCL23 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 23
GI_34335180-A CCL15 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 15
GI_40316922-I CXCL12 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 12 (스트로말세포 유래인자 1)
GI_41872613-S CXCL5 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 5
GI_22538812-S CCL2 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 2
GI_4504098-S CXCR3 케모카인 (C-X-C 모티프) 수용체 3
GI_22538399-S CCL11 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 11
GI_5453576-S CXCL13 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 13 (B-세포 화학유인물질)
GI_22538815-S CCL8 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 8
GI_34222286-S CYR61 시스테인-풍부, 혈관형성 유도물질, 61
GI_4506832-S CCL1 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 1
GI_28610153-S IL8 인터류킨 8
GI_22538800-S CCL16 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 16
GI_14790145-S CXCL11 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 11
GI_22165426-S CCL24 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 24
GI_22538813-S CCL5 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 5
GI_13435401-S CCL7 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 7
GI_4505862-S PLAU 플라스미노겐 활성제, 유로키나제
GI_4504152-S CXCL1 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1(흑색종 성장자극 활성, 알파)
GI_27894329-S IL1A 인터류킨 1, 알파
GI_22547151-S CCL26 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 26
GI_4506852-S XCL1 케모카인 (C 모티프) 리간드 1
외부의 생물적 자극에 대한 반응
GI_27894505-S IL1B 인터루킨 1, 베타
GI_27894329-S IL1A 인터루킨 1, 알파
외부적 자극에 대한 반응
GI_27262654-A IL16 인터류킨 16 (림프구 화학유인물질 인자)
GI_22538807-A CCL23 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 23
GI_34335180-A CCL15 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 15
GI_40316922-I CXCL12 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 12 (스트로말세포 유래인자 1)
GI_41872613-S CXCL5 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 5
GI_22538812-S CCL2 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 2
GI_4504098-S CXCR3 케모카인 (C-X-C 모티프) 수용체 3
GI_22538399-S CCL11 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 11
GI_5453576-S CXCL13 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 13 (B-세포 화학유인물질)
GI_22538815-S CCL8 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 8
GI_34222286-S CYR61 시스테인-풍부, 혈관형성 유도물질, 61
GI_4506832-S CCL1 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 1
GI_28610153-S IL8 인터류킨 8
GI_22538800-S CCL16 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 16
GI_14790145-S CXCL11 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 11
GI_22165426-S CCL24 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 24
GI_22538813-S CCL5 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 5
GI_27894305-S IL1B 인터류킨 1, 베타
GI_13435401-S CCL7 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 7
GI_4505862-S PLAU 플라스미노겐 활성제, 유로키나제
GI_4504152-S CXCL1 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1 (흑색종 성장자극 활성, 알파)
GI_27894329-S IL1A 인터류킨 1, 알파
GI_22547151-S CCL26 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 26
GI_4506852-S XCL1 케모카인 (C 모티프) 리간드 1
페스트, 병원체, 기생충에 대한 반응
GI_27894505-S IL1B 인터루킨 1, 베타
GI_27894329-S IL1A 인터루킨 1, 알파
자극에 대한 반응
GI_27262654-A IL16 인터류킨 16 (림프구 화학유인물질 인자)
GI_22538807-A CCL23 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 23
GI_34335180-A CCL15 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 15
GI_40316922-I CXCL12 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 12 (스트로말세포 유래인자 1)
GI_41872613-S CXCL5 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 5
GI_22538812-S CCL2 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 2
GI_4504098-S CXCR3 케모카인 (C-X-C 모티프) 수용체 3
GI_22538399-S CCL11 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 11
GI_5453576-S CXCL13 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 13 (B-세포 화학유인물질)
GI_22538815-S CCL8 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 8
GI_34222286-S CYR61 시스테인-풍부, 혈관형성 유도물질, 61
GI_4506832-S CCL1 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 1
GI_28610153-S IL8 인터류킨 8
GI_22538800-S CCL16 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 16
GI_14790145-S CXCL11 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 11
GI_22165426-S CCL24 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 24
GI_22538813-S CCL5 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 5
GI_27894305-S IL1B 인터류킨 1, 베타
GI_13435401-S CCL7 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 7
GI_4505862-S PLAU 플라스미노겐 활성제, 유로키나제
GI_4504152-S CXCL1 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1 (흑색종 성장자극 활성, 알파)
GI_27894329-S IL1A 인터류킨 1, 알파
GI_22547151-S CCL26 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 26
GI_4506852-S XCL1 케모카인 (C 모티프) 리간드 1
스트레스에 대한 반응
GI_27894305-S IL1B 인터류킨 1, 베타
GI_4505862-S PLAU 플라스미노겐 활성제, 유로키나제
GI_27894329-S IL1A 인터류킨 1, 알파
상처에 대한 반응
GI_27894305-S IL1B 인터류킨 1, 베타
GI_4505862-S PLAU 플라스미노겐 활성제, 유로키나제
GI_27894329-S IL1A 인터류킨 1, 알파
분비
GI_22538815-S CCL8 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 8
GI_22538813-S CCL5 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 5
분비 경로
GI_22538815-S CCL8 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 8
GI_22538813-S CCL5 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 5
골격 발달
GI_27262662-A CDH11 카드헤린 11, 2형, OB-카드헤린 (조골세포)
GI_5902810-ABMP1 BMP1 골형성 단백질 1
GI_4507170-S SPARC 분비 단백질 , 산성, 시스테인-풍부(오스테오넥틴)
탁시스
GI_27262654-A IL16 인터류킨 16 (림프구 화학유인물질 인자)
GI_22538807-A CCL23 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 23
GI_34335180-A CCL15 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 15
GI_40316922-I CXCL12 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 12 (스트로말세포 유래인자 1)
GI_41872613-S CXCL5 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 5
GI_22538812-S CCL2 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 2
GI_4504098-S CXCR3 케모카인 (C-X-C 모티프) 수용체 3
GI_22538399-S CCL11 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 11
GI_5453576-S CXCL13 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 13 (B-세포 화학유인물질)
GI_22538815-S CCL8 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 8
GI_34222286-S CYR61 시스테인-풍부, 혈관형성 유도물질, 61
GI_4506832-S CCL1 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 1
GI_28610153-S IL8 인터류킨 8
GI_22538800-S CCL16 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 16
GI_14790145-S CXCL11 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 11
GI_22165426-S CCL24 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 24
GI_22538813-S CCL5 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 5
GI_13435401-S CCL7 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 7
GI_4505862-S PLAU 플라스미노겐 활성제, 유로키나제
GI_4504152-S CXCL1 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1 (흑색종 성장자극 활성, 알파)
GI_27894329-S IL1A 인터류킨 1, 알파
GI_22547151-S CCL26 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 26
GI_4506852-S XCL1 케모카인 (C 모티프) 리간드 1
체온조절
GI_27894305-S IL1B 인터류킨 1, 베타
GI_27894329-S IL1A 인터류킨 1, 알파
조직 발달
GI_27262662-A CDH11 카드헤린 11, 2형, OB-카드헤린 (조골세포)
GI_5902810-A BMP1 BMP1 골형성 단백질 1
GI_4507170-S SPARC 분비 단백질 , 산성, 시스테인-풍부(오스테오넥틴)
혈관 형성
GI_30172563-S VEGF 혈관내피성장인자
혈관 발달
GI_11321596-S KDR 키나아제 삽입 도메인 수용체 (3형 수용체 티로신 키아나제)
GI_30172563-S VEGF 혈관내피성장인자
GI_28610153-S IL8 인터류킨 8
GI_42716312-S ANG 안지오게닌, 리보뉴클레아제, RNase A 패밀리, 5
GI_10337586-S FGF6 섬유아세포 성장인자 6
(실시예 14) 각각의 30개의 경로에서 201개의 유전자의 목록화
항원 처리와 프레젠테이션 - 호모 사피엔스 (인간)
GI_22538429-A CTSB 카텝신 B
GI_37704380-S B2M 베타-2-마이크로글로불린
GI_24234685-A HSPA8 열충격 70kDa 단백질 8
GI_30581139-A PSME1 프로테아좀 (프로좀, 마크로페인) 활성제 서브유닛 1 (PA28 알파)
아폽토시스 - 호모 사피엔스 (인간)
GI_41281560-S CLSTN1 칼신텐닌 1
GI_28416914-S IL3 인터류킨 3 (콜로니자극인자, 다중)
GI_27894329-S IL1A 인터류킨 1, 알파
GI_27894305-S IL1B 인터류킨 1, 베타
GI_25952110-S TNF 종양괴사인자 (TNF 슈퍼패밀리, 멤버 2)
탄소 고정 - 호모 사피엔스 ( 인간)
GI_21735620-S MDH2 말산 탈수소효소 2, NAD (미토콘드리아)
GI_26024330-S TPI1 트리오즈포스페이트 이소머라제 1
GI_22095338-S PGK1 포스포글리세레이트키나제 1
GI_31543396-S PGK2 포스포글리세레이트키나제 2
세포 커뮤니케이션 - 호모 사피엔스 (인간)
GI_27436944-A LMNA 라민 A/C
GI_5016088-S ACTB 액틴, 베타
GI_10938011-S ACTC 액틴, 알파, 심근
GI_11038618-S ACTG1 액틴, 감마 1
GI_14719826-S COL1A1 콜라겐, 타입 Ⅰ, 알파 1
GI_21536289-S COL1A2 콜라겐, 타입 Ⅰ, 알파 2
GI_15149480-S COL3A1 콜라겐, 타입 Ⅲ, 알파 1 (에틀러-단로스 증후군 타입 Ⅳ, 오토소멀 우세)
GI_45580690-S COL4A1 콜라겐, 타입 Ⅳ, 알파 1
GI_17986276-S COL4A2 콜라겐, 타입 Ⅳ, 알파 2
GI_16554578-S COL5A1 콜라겐, 타입 Ⅴ, 알파 1
GI_16554580-S COL5A2 콜라겐, 타입 Ⅴ, 알파 2
GI_15011912-S COL6A1 콜라겐, 타입 Ⅵ, 알파 1
GI_17402876-A COL6A2 콜라겐, 타입 Ⅵ, 알파 2
GI_17149810-A COL6A3 콜라겐, 타입 Ⅵ, 알파 3
GI_18375521-A COL11A1 콜라겐, 타입 XI, 알파 1
GI_16933543-A FN1 피브리오넥틴 1
GI_9845497-S LAMC1 라미닌, 감마 1 (이전 LAMB2)
GI_16554581-S COL5A3 콜라겐, 타입 Ⅴ, 알파 3
GI_40317625-S THBS1 트롬보스폰딘 1
시트르산 회로 (TCA 회로) - 호모 사피엔스 (인간)
GI_4504374-S CFH1/HF1 컴플리먼트 인자 H
GI_21735620-S MDH2 말산 탈수소효소 2, NAD (미토콘드리아)
컴플리먼트 및 응고 케스케이드 - 호모 사피엔스 ( 인간)
GI_4505862-S PLAU 플라스미노겐 활성제, 유로키나제
GI_4504374-S CFH1/HF1 컴플리먼트 인자 H
GI_31542249-S C1R 컴플리먼트 성분 1, r 보조성분
사이토카인-사이토카인 수용체 상호작용 - 호모사피엔스 (인간)
GI_4506832-S CCL1 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 1
GI_22538399-S CCL11 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 11
GI_34335180-A-A CCL15 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 15
GI_22538800-S CCL16 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 16
GI_22538812-S CCL2 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 2
GI_22538807-A CCL23 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 23
GI_22165426-S CCL24 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 24
GI_22547151-S CCL26 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 26
GI_22538813-S CCL5 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 5
GI_13435401-S CCL7 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 7
GI_22538815-S CCL8 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 8
GI_27262662-A CSF1 콜로니자극인자 1 (마크로파지)
GI_27437029-S CSF2 콜로니자극인자 2 (과립-마크로파지)
GI_27437048-A CSF3 콜로니자극인자 3 (과립구)
GI_4506856-S CX3CL1 케모카인 (C-X3-C 모티프) 리간드 1
GI_4504152-S CXCL1 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1(흑색종 성장자극 활성, 알파)
GI_14790145-S CXCL11 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 11
GI_40316922-I CXCL12 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 12(스트로말세포 유래인자 1)
GI_5453576-S CXCL13 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 13 (B-세포 화학유인물질)
GI_41872613-S CXCL5 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 5
GI_4504098-S CXCR3 케모카인 (C-X-C 모티프) 수용체 3
GI_6031163-S EGF 상피성장인자 (베타-유로가스트론)
GI_38455415-S FLT3LG fms-관련 타이로신 키나제 3 리간드
GI_33859834-S HGF 간세포 성장인자 (헤파포이에틴 A; 스캐터 팩터)
GI_10835170-S IFNG 인터페론, 감마
GI_24430216-S IL10 인터류킨 10
GI_24497437-S IL12B 인터류킨 12B (자연 킬러 셀 자극 인자 2, 세포독성 림프구 성숙 인자 2, p40)
GI_26787977-S IL13 인터류킨 13
GI_27894329-S IL1A 인터류킨 1, 알파
GI_27894305-S IL1B 인터류킨 1, 베타
GI_28178860-S IL2 인터류킨 2
GI_28416914-S IL3 인터류킨 3 (콜로니자극인자, 다중)
GI_10834983-S IL6 인터류킨 6 (인터페론, 베타2)
GI_28610152-S IL7 인터류킨 7
GI_28610153-S IL8 인터류킨 8
GI_11321596-S KDR 키나제삽입도메인수용체 (Ⅲ형 수용체 타이로신 키나제)
GI_4580419-A KIKLG KIT 리간드
GI_4557714-S LEP 렙틴 (비만 동족체, 마우스)
GI_6006018-S LIF 백혈병 저해인자 (콜리너지 분화 인자)
GI_15451785-A PDGFB 혈소판-유래 성장인자 베타 폴리펩티드 (시미안 사르코마 바이러스 (v-sis) 온코진 동족체)
GI_15451788-S PDGFRB 혈소판-유래 성장인자 수용체, 베타 폴리펩티드
GI_10863872-S TGFB1 변환증식인자 베타 1 (카무라티-엔젤만 병)
GI_4507462-S TGFB2 변환증식인자 베타 2
GI_40805871-S THPO 트롬보포이에틴 (골수증식 백혈병 바이러스 온코진 리간드, 거대핵세포 증식 및 발달인자
GI_4507508-S TIMP1 TIMP 메탈로펩티다제 저해제 1
GI_25952110-S TNF 종양 괴사 인자 TNF 슈퍼패밀리, 멤버 2)
GI_22547122-S TNFRSF11B 종양 괴사 인자 수용체 슈퍼패밀리, 멤버 11b (오스테오프로테게린)
GI_30172563-S VEGF 혈관내피증식인자
GI_4506852-S XCL1 케모카인 (C 모티프) 리간드 1
ECM-수용체 상호작용 - 호모사피엔스 (인간)
GI_9845497-S LAMC1 라미닌, 감마 1 (이전 LAMB2)
GI_14719826-S COL1A1 콜라겐, 타입 Ⅰ, 알파 1
GI_21536289-S COL1A2 콜라겐, 타입 Ⅰ, 알파 2
GI_15149480-S COL3A1 콜라겐, 타입 Ⅲ, 알파 1 (에틀러-단로스 증후군 타입 Ⅳ, 오토소멀 우세)
GI_45580690-S COL4A1 콜라겐, 타입 Ⅳ, 알파 1
GI_17986276-S COL4A2 콜라겐, 타입 Ⅳ, 알파 2
GI_16554578-S COL5A1 콜라겐, 타입 Ⅴ, 알파 1
GI_16554580-S COL5A2 콜라겐, 타입 Ⅴ, 알파 2
GI_15011912-S COL6A1 콜라겐, 타입 Ⅵ, 알파 1
GI_17402876-A COL6A2 콜라겐, 타입 Ⅵ, 알파 2
GI_17149810-A COL6A3 콜라겐, 타입 Ⅵ, 알파 3
GI_18375521-A COL11A1 콜라겐, 타입 XI, 알파 1
GI_16554581-S COL5A3 콜라겐, 타입 Ⅴ, 알파 3
GI_16933543-A FN1 피브리오넥틴 1
GI_40317625-S THBS1 트롬보스폰딘 1
GI_7427516-S HSPG2 황산헤파란 프로테오글리칸 2 (페를레칸)
GI_21361192-S CD44 CD44 항원 (호밍 기능 및 인디안 혈액 그룹 시스템)
헬리코박터 파이로리 감염 내 상피세포 신호 - 호모 사피엔스 ( 인간)
GI_22538813-S CCL5 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 5
GI_4504152-S CXCL1 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 1 (흑색종 성장자극 활성, 알파)
GI_28610153-S IL8 인터류킨 8
Fc 엡실론 RI 신호 경로 - 호모 사피엔스 (인간)
GI_25952110-S TNF 종양 괴사 인자 (TNF 슈퍼패밀리, 멤버 2)
GI_26787977-S IL13 인터류킨 13
GI_27437029-S CSF2 콜로니 자극인자 2 (과립구-마크로파지)
GI_41281560-S CLSTN1 칼신테닌 1
GI_28416914-S IL3 인터류킨 3 (콜로니-자극인자, 다중)
초점 부착 - 호모 사피엔스 ( 인간)
GI_5016088-S ACTB 액틴, 베타
GI_10938011-S ACTC 액틴, 알파, 심근
GI_11038618-S ACTG1 액틴, 감마 1
GI_41281560-S CLSTN1 칼신테닌 1
GI_18375521-A COL11A1 콜라겐, 타입 XI, 알파 1
GI_14719826-S COL1A1 콜라겐, 타입 Ⅰ, 알파 1
GI_21536289-S COL1A2 콜라겐, 타입 Ⅰ, 알파 2
GI_15149480-S COL3A1 콜라겐, 타입 Ⅲ, 알파 1 (에틀러-단로스 증후군 타입 Ⅳ, 오토소멀 우세)
GI_45580690-S COL4A1 콜라겐, 타입 Ⅳ, 알파 1
GI_17986276-S COL4A2 콜라겐, 타입 Ⅳ, 알파 2
GI_16554578-S COL5A1 콜라겐, 타입 Ⅴ, 알파 1
GI_16554580-S COL5A2 콜라겐, 타입 Ⅴ, 알파 2
GI_16554581-S COL5A3 콜라겐, 타입 V, 알파 3
GI_15011912-S COL6A1 콜라겐, 타입 Ⅵ, 알파 1
GI_17402876-A COL6A2 콜라겐, 타입 Ⅵ, 알파 2
GI_17149810-A COL6A3 콜라겐, 타입 Ⅵ, 알파 3
GI_6031163-S EGF 상피성장인자 (베타-유로가스트론)
GI_4503744-S FLNA 필라민 A, 알파 (액틴 결합 단백질 280)
GI_16933543-A FN1 피브리오넥틴 1
GI_33859834-S HGF 간세포 성장인자 (헤파포이에틴 A;스캐터 인자)
GI_19923111-S IGF1 인슐린-유사 성장인자 1 (소마토메딘 C)
GI_10834983-S IL6 인터류킨 6 (인터페론, 베타 2)
GI_11321596-S KDR 키나제삽입도메인수용체 (Ⅲ형 수용체 타이로신 키나제)
GI_9845497-S LAMC1 라미닌, 감마 1 (이전 LAMB2)
GI_15451785-A PDGFB 혈소판-유래 성장인자 베타 폴리펩티드 (시미안 사르코마 바이러스 (v-sis) 온코진 동족체)
GI_15451788-S PDGFRB 혈소판-유래 성장인자 수용체, 베타 리펩티드
GI_40317625-S THBS1 트롬보스폰딘 1
GI_30172563-S VEGF 혈관내피증식인자
갭 접합 - 호모 사피엔스 (인간)
GI_5174476-S K-ALPHA-1 튜불린, 알파, ubiquitous
GI_17986282-S TUBA3 튜불린, 알파 3
GI_31880337-S TUBA6 튜불린, 알파 6
GI_15451788-S PDGFRB 혈소판-유래 성장인자 베타 폴리펩티드
GI_6031163-S EGF 상피증식인자
GI_15451785-A PDGFB 혈소판-유래 성장인자 베타 폴리펩티드 (시미안 사르코마 바이러스 (v-sis) 온코진 동족체)
해당작용 또는 글루코네오제네시스 - 호모 사피엔스 (인간)
GI_16507965-S ENO1 엔올라제 1, (알파)
GI_16507966-S ENO2 엔올라제 2 (감마, 뉴로널)
GI_26024330-S TPI1 트리오즈포스페이트 이성화제 1
GI_22095338-S PGK1 포스포글리세레이트키나제 1
GI_31543396-S PGK2 포스포글리세레이트키나제 2
헤마토포이에틱 세포 계통 - 호모사피엔스 (인간)
GI_21361192-S CD44 CD44 항원 (호밍 기능 및 인디안 혈액 그룹 시스템)
GI_4503744-S FLNA 필라민 A, 알파 (액틴 결합 단백질 280)
GI_40805871-S THPO 트롬보포이에틴 (골수증식 백혈병 바이러스 온코진 리간드, 거대핵세포 증식 및 발달인자
GI_4507508-S TIMP1 TIMP 메탈로펩티다제 저해제 1
GI_25952110-S TNF 종양 괴사 인자 (TNF 슈퍼패밀리, 멤버 2)
GI_27262662-A CSF1 콜로니자극인자 1 (마크로파지)
GI_27437048-A CSF3 콜로니자극인자 3 (과립구)
GI_38455415-S FLT3LG fms-관련 타이로신 키나제 3 리간드
GI_10834983-S IL6 인터류킨 6 (인터페론, 베타2)
GI_27437029-S CSF2 콜로니자극인자 2 (과립-마크로파지)
GI_27894329-S IL1A 인터류킨 1, 알파
GI_27894305-S IL1B 인터류킨 1, 베타
GI_28416914-S IL3 인터류킨 3 (콜로니자극인자, 다중)
GI_28610152-S IL7 인터류킨 7
GI_4580419-A KIKLG KIT 리간드
이노시톨 대사 - 호모 사피엔스 (인간)
GI_26024330-S TPI1 트리오즈포스페이트 이성화제 1
인슐린 신호 경로 - 호모 사피엔스 (인간)
GI_31377794-S CALM1 칼모둘린 1 (포스포릴라제 키나제, 델타)
GI_41281560-S CLSTN1 칼신테닌 1
Jak-STAT 신호 경로 - 호모 사피엔스 (인간)
GI_41281560-S CLSTN1 칼시테닌 1
GI_27437029-S CSF2 콜로니 자극인자 2 (과립구-마크로파지)
GI_27437048-A CSF3 콜로니 자극인자 3 (과립구)
GI_10835170-S IFNG 인터페론, 감마
GI_24430216-S IL10 인터류킨 10
GI_24497437-S IL12B 인터류킨 12B (자연 킬러 셀 자극 인자 2, 세포독성 림프구 성숙 인자 2, p40)
GI_26787977-S IL13 인터류킨 13
GI_28178860-S IL2 인터류킨 2
GI_28416914-S IL3 인터류킨 3 (콜로니-자극인자, 다중)
GI_10834983-S IL6 인터류킨 6 (인터페론, 베타 2)
GI_28610152-S IL7 인터류킨 7
GI_4557714-S LEP 렙틴 (비만 동족체, 마우스)
GI_6006018-S LIF 백혈병 저해인자 (콜리너지 분화 인자)
GI_40805871-S THPO 트롬보포이에틴 (골수증식 백혈병 바이러스 온코진 리간드, 거대핵세포 증식 및 발달인자
GI_4507508-S TIMP1 TIMP 메탈로펩티다제 저해제 1
백혈구 내피전이 이동 - 호모 사피엔스 (인간)
GI_4826835-S MMP9 매트릭스 메탈로펩티다제 9 (젤라티나제 B, 92kDa 젤라티나제, 92kDa 타입Ⅳ 콜라게나제)
GI_5453576-S CXCL13 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 13 (B-세포 화학유인물질)
GI_28610153-S IL8 인터류킨 8
GI_40316922-I CXCL12 케모카인 (C-X-C 모티프) 리간드 12 (스트로멀세포-유도인자 1)
GI_41281560-S CLSTN1 칼신테닌 1
GI_5016088-S ACTB 액틴, 베타
GI_10938011-S ACTC 액틴, 알파, 심근
GI_11038618-S ACTG1 액틴, 감마 1
MAPK 신호 경로 - 호모 사피엔스 (인간)
GI_34106709-A BDNF 뇌-유도 향신경성 인자
GI_6031163-S EGF 상피성장인자 (베타-유로가스트론)
GI_4503692-S EGF17 섬유아세포성장인자 17
GI_4503700-S FGF4 섬유아세포성장인자 4(헤파린 분비 전환 단백질 1, 카포시 사르코마 온코진)
GI_10337586-S FGF6 섬유아세포 성장인자 6
GI_15147344-S FGF7 섬유아세포 성장인자 7 (케라티노사이트 성장인자)
GI_4503706-S FGF9 섬유아세포 성장인자 9 (아교세포-활성 인자)
GI_13186266-A FGFR2 섬유아세포성장인자수용체 2 (박테리아발현 키나제, 케라티노사이트 성장인자 수용체, 크레니오파시얼 다이소스토시스 1, 크로우존 증후군, 파이퍼 증후군, 잭슨와이스증후군)
GI_4503744-S FLNA 필라민 A, 알파 (액틴 결합 단백질 280)
GI_40549401-A GDNF 아교세포 유도된 향신경성 인자
GI_24234685-A HSPA8 열충격 70kDa 단백질 8
GI_27894329-S IL1A 인터류킨 1, 알파
GI_27894305-S IL1B 인터류킨 1, 베타
GI_15451785-A PDGFB 혈소판 유도 성장인자 베타 폴리펩티드 (시미안 사르코마 바이러스 (v-sis) 온코진 동족체)
GI_15451788-S PDGFRB 혈소판 유도 성장인자 수용체, 베타 폴리펩티드
GI_10863872-S TGFB1 변환증식인자, 베타 1 (카무라티-엔젤만 병)
GI_4507462-S TGFB2 변환증식인자, 베타 2
GI_25952110-S TNF 종양괴사인자 (TNF 슈퍼패밀리, 멤버 2)
메탄 대사 - 호모 사피엔스 (인간)
GI_40805871-S THPO 트롬보포이에틴 (골수증식 백혈병 바이러스 온코진 리간드, 거대핵세포 증식 및 발달인자)
GI_32455261-A PRDX5 페록시레독신 5
mTOR 신호 과정 - 호모 사피엔스 (인간)
GI_30172563-S VEGF 혈관내피성장인자
GI_41281560-S CLSTN1 칼신테닌 1
GI_19923111-S IGF1 인슐린-유사 성장인자 1 (소마토메딘 C)
페닐알라닌, 티로신, 트립토판 생합성 - 호모 사피엔스 (인간)
GI_16507965-S ENO1 엔올라제 1, (알파)
GI_16507966-S ENO2 엔올라제 2 (감마, 뉴로널)
페닐알라닌 대사 - 호모 사피엔스 (인간)
GI_4505184-S MIF 마크로파지 이동 저해 인자 (당화-저해 인자)
GI_40805871-S THPO 트롬보포이에틴 (골수증식 백혈병 바이러스 온코진 리간드, 거대핵세포 증식 및 발달인자)
GI_32455261-A PRDX5 페록시레독신 5
액틴 골격의 조절 - 호모 사피엔스 (인간)
GI_5016088-S ACTB 액틴, 베타
GI_10938011-S ACTC 액틴, 알파, 심근
GI_11038618-S ACTG1 액틴, 감마 1
GI_5031634-S CFL1 커필린 (비-근육)
GI_41281560-S CLSTN1 칼시텐닌 1
GI_6031163-S EGF 상피성장인자 (베타-유로가스트론)
GI_4503692-S FGF17 섬유아세포성장인자 17
GI_4503700-S FGF4 섬유아세포성장인자 4(헤파린 분비 전환 단백질 1, 카포시 사르코마 온코진)
GI_10337586-S FGF6 섬유아세포성장인자 6
GI_15147344-S FGF7 섬유아세포성장인자 7 (케라티노사이트 성장인자)
GI_4503706-S FGF9 섬유아세포성장인자 9 (글리아-활성인자)
GI_13186266-A FGFR2 섬유아세포성장인자 2 (박테리아발현 키나제, 케라티노사이트 성장인자 수용체, 크레니오파시얼 다이소스토시스 1, 크로우존 증후군, 파이퍼 증후군, 잭슨와이스증후군)
GI_16933543-A FNI 피브리오넥틴 1
GI_38044287-A GSN 젤솔린(아밀로이드증, 핀니쉬 형)
GI_22507396-S MYH9 미오신, 중 폴리펩티드 9, 비-근육
GI_15451785-A PDGFB 혈소판유래성장인자베타폴리펩티드 (시미안 사르코마 바이러스 (v-sis) 온코진 동족체)
GI_15451788-S PDGFRB 혈소판유래성장인자수용체, 베타폴리펩티드
GI_16753213-S PFN1 프로필린 1
GI_34328943-S TMSB4X 타이모신, 베타 4, 성염색체 연관
GI_34013529-S TMSL3 타이모신-유사 3
스틸벤, 쿠마린과 리그닌 생합성 - 호모 사피엔스 (인간)
GI_40805871-S THPO 트롬보포이에틴 (골수증식 백혈병 바이러스 온코진 리간드, 거대핵세포 증식 및 발달인자)
GI_32455261-A PRDX5 페록시레독신 5
T세포 수용체 신호 경로 - 호모 사피엔스 (인간)
GI_25952110-S TNF 종양 괴사 인자 (TNF 슈퍼패밀리, 멤버 2)
GI_27437029-S CSF2 콜로니 자극인자 2 (과립구-마크로파지)
GI_10835170-S IFNG 인터페론, 감마
GI_24430216-S IL10 인터류킨 10
GI_28178860-S IL2 인터류킨 2
GI_41281560-S CLSTN1 칼신테닌 1
TGF-베타 신호 경로 - 호모 사피엔스 (인간)
GI_4557730-S LTBP1 잠복 변환 성장인자 베타 결합 단백질 1
GI_40317625-S THBS1 트롬보스폰딘 1
GI_10863872-S TGFB1 변환증식인자 베타 1 (카무라티-엔젤만 병)
GI_4507462-S TGFB2 변환증식인자 베타 2
GI_25952110-S TNF 종양괴사인자 (TNF 슈퍼패밀리, 멤버 2)
GI_10835170-S IFNG 인터페론, 감마
치밀이음부 - 호모 사피엔스 (인간)
GI_5016088-S ACTB 액틴, 베타
GI_10938011-S ACTC 액틴, 알파, 심근
GI_11038618-S ACTG1 액틴, 감마 1
GI_22507396-S MYH9 미오신, 중 폴리펩티드 9, 비-근육
톨-유사 수용체 신호 경로 - 호모 사피엔스 (인간)
GI_14790145-S CXCL11 케모카인 (C--X-C 모티프) 리간드 11
GI_28610153-S IL8 인터류킨 8
GI_24497437-S IL12B 인터류킨 12B (자연 킬러 셀 자극 인자 2, 세포독성 림프구 성숙 인자 2, p40)
GI_27894305-S IL1B 인터류킨 1, 베타
GI_41281560-S CLSTN1 칼시텐닌 1
GI_10834983-S IL6 인터류킨 6 (인터페론, 베타 2)
GI_22538813-S CCL5 케모카인 (C-C 모티프) 리간드 5
GI_25952110-S TNF 종양괴사인자 (TNF 슈퍼패밀리, 멤버 2)
Ⅰ형 당뇨병 - 호모 사피엔스 (인간)
GI_24497437-S IL12B 인터류킨 12B (자연 킬러 셀 자극 인자 2, 세포독성 림프구 성숙 인자 2, p40)
GI_28178860-S IL2 인터류킨 2
GI_10835170-S IFNG 인터페론, 감마
GI_27894329-S IL1A 인터류킨 1, 알파
GI_27894305-S IL1B 인터류킨 1, 베타
GI_25952110-S TNF 종양괴사인자 (TNF 슈퍼패밀리, 멤버 2)
(실시예 14A) 593개의 추가 단백질
조절배지의 추가 분석은 배지가 794개 고유한 유전자 산물의 총합으로서 배지가 아래에 기재된 593개의 단백질을 함유하고 있다는 것을 나타낸다.
총 593개의 고유 유전자 산물 ; 201개의 공통 유전자를 제외한 세트 1~4
02-Sep CAND1 DDX17 H2AFY KRTHB4 PCBP2 QARS STC1
07-Sep CAP1 DES HADH LAMA4 PCDH18 QPCT STIP1
AARS CAP2 DLD HARS LAMB1 PCDHGB6 RAB11B SULF1
ACAA2 CAPG DNAJC3 HARS2 LANCL1 PCK2 RAB1A SYNCRIP
ACAT2 CAPN1 DPP3 hCG_1641617 LAP3 PCMT1 RAB6A TALDO1
ACO1 CAPN2 DPYSL2 hCG_2023776 LASP1 PCNA RAC1 TARS
ACTN1 CAPZA1 DPYSL3 HEXA LDHA PDCD61P RAN TCN2
ACTN2 CAPZA2 DSTN HEXB LDHAL6B PDGFC RANBP5 TCP1
ACTN3 CAPZB DYNLL1 HIBCH LDHB PDIA3 RARPES2 TFPI
ACTN4 CARS ECHS1 HINT1 LEPRE1 PDIA4 RARS THBS2
ACTR1A CBR1 EEF1A1 HIST1H4 LGALS3 PDIA6 RBMX THOP1
ACTR1B CBR3 EEF1A2 HIST1H4A LOC196463 PDLIM1 RHOA THY1
ACTR2 CCBL2 EEF1B2 HIST1H4B LOC283523 PDLIM5 RNASE4 TKT
ACTR3 CCDC19 EEF2 HIST1H4C LOC347701 PDLIM7 RNH1 TLN1
ACTR3B CCT2 EFEMP2 HIST1H4D LOC646821 PEPD RNPEP TMOD2
ADAM9 CCT3 EIF2S3 HIST1H4E LOC649125 PFN2 RPL10A TMOD3
ADSL CCT4 EIF3S9 HIST1H4F LOC653214 PGCP RPL11 TNC
ADSS CCT5 EIF4A1 HIST1H4H LOC654188 PGD RPL12 TNPO1
AEBP1 CCT6A EIF4A2 HIST1H4I LOC728378 PGLS RPL14 TP53I3
AGA CCT7 EMILIN1 HIST1H4J LOXL2 PGM1 RPL18 TPM1
AHCY CCT8 ENO3 HIST1H4K LRP1 PGRMC2 RPL22 TPM2
AK1 CD248 EPPK1 HIST1H4L LTA4H PHGDH RPL30 TPM3
AK2 CD59 EPRS HIST2H2AA3 LTB4DH PHPT1 RPL5 TRAP1
AKR1A1 CD81 ESD HIST2H2AA4 LTBP2 PICALM RPL7 TRHDE
AKR1B1 CD9 ETF1 HIST2H4A M6PRBP1 PKM2 RPL20 TROVE2
ALDH2 CDC37 ETFB HIST2H4B MACF1 PLEKHC1 RPLP1 TSKU
ALDH7A1 CDC42 ETHE1 HIST4H4 MAP1B PLOD1 RPLP2 TUBA1A
ALDOA CFL2 EXT1 HLA-A MAPK1 PLOD2 RPS10 TUBA8
ALDOC CHID1 FAH HLA-B MAPRE1 PLOD3 RPS15A TUBB
ANXA1 CLEC11A FAHD1 HMX1 MAT2A PLS1 RPS16 TUBB2C
ANXA5 CLIC1 FAM129B HNRPA1 MAT2B PLS3 RPS19 TUBB3
ANXA6 CLIC4 FAM3C HNRPA1L-2 MCTS1 PLSCR3 RPS2 TUBB4
AP1B1 CLTC FAM49B JMR[A2B1 MDH1 POSTN RPS20 TUBB6
AP1S1 CLTCL1 FAM62A HNRPC MFAP4 PPCS RPS23 TUBB8
AP2A1 CLU FBLN5 HNRPD MGAT5 PPIB RPS3 TWF1
AP2A2 CMPK FDPS HNRPDL MMP14 PPP2R1A RPS4X TXNL5
AP2B1 CNDP2 FH HNRPH2 MMP2 PPP2R4 RPS5 UBE1
AP3B1 CNN2 FKBP10 HNRPK MRLC2 PPP5C RPS7 UBE2L3
APEX1 CNN3 FKBP1A HNRPL MSN PPP6C RPS8 UBE2N
API5 COL18A1 FKBP3 HNRPR MTAP PRDX2 RPS9 UBE2V1
APOA1BP COL2A1 FLNB HNRPU MTPN PRDX3 RPSA UBE3B
APOE COL4A2 FLNC HSP90AB1 MVP PRDX4 RSU1 UCHL3
APP COL5A1 FLRT2 HSP90B1 MXRA5 PRDX6 S100A16 UGDH
APRT COL5A2 FLT1 HSPA1A MXRA8 PRG1 SARS UGP2
ARCN1 COL6A2 FSCN1 HSPA1B MYH14 PPKACA SDC4 UROD
ARHGAP1 COL7A1 FSTL5 HSPA1L MYL6 PPKCSH SDCBP USP14
ARPC1A COL7A1 FTL HSPA4 NAGK PRNP SEC22B USP5
ARPC1B COL7A1 G6PD HSPA5 NANS PROCR SEC23A VARS
ARPC2 COL7A1 GALNT2 HSPA6 NARS PROSC SEC31A VASN
ARPC3 COPA GANAB HSPB1 NEDD8 PRSS23 SEMA3C VAT1
ARPC4 COPG GAPDH HSPD1 NEFM PRSS3 SEMA7A VCL
ARTS-1 COPS3 GARS HSPH1 NIT2 PSAT1 SERPINB1 VCP
ATIC COPS4 GAS6 HTRA1 NME1 PSMA1 SERPINB6 VIL2
ATP5B COPS8 GBA IDH1 NPC2 PSMA2 SERPINE1 VIM
ATP6AP1 CORO1B GBE1 IGFBP3 NPEPPS PSMA3 SERPINE2 VPS26A
CORO1C BDF15 IGKC NQOI PSMA6 SERPINF1 VTN VPS35
COTL1 GDI1 ILF2 NRP1 PSMA7 SERPINH1 WARS VTN
CRIP2 GDI2 ILF3 NRP2 PSMB1 SERPINI2 WDR1 WARS
CS GLO1 INHBA NT5E PSMB2 SERP1 WNT5A WDR1
BASP1 CSE1L GLT8D3 IQGAP1 NUCB1 PSMB3 SIL1 WNT5A
BAT1 CSRP1 GLUD1 ISOC1 IKFNK3 PSMB4 SLC1A5 WNT5B
BBS1 CSRP2 GM2A ITGA2 P4HA1 PSMB5 SLC3A2 XPO1
BCAT1 CST3 GNPDA1 ITGB4BP P4HB PSMD11 SND1 YKT6
BGN CTGF GNPNAT1 KPNB1 PABPC1 PSMD13 SNRPD1 YWHAB
BLVRA CTHRC1 GOT1 KRT1 PABPC4 PSMD5 SNRPE YWHAE
BPNT1 CTSD GOT2 KRT14 PAFAH1B1 PSMD6 SPOCK YWHAG
BTD CTSZ GPC1 KRT2 PAFAH1B2 PSMD7 SPTAN1 YWHAH
CI4또는f141 CYCS GPI KRT27 PAFAH1B3 PSME2 SPTBN4 YWHAQ
CI9또는f10 D4ST1 GREM1 KRT4 PAICS PTBP1 SRP9
CI또는f58 DAG1 GRHPR KRT5 PAM PTPRCAP SRPX
CI또는f78 DCI GSR KRT6L PAPPA PTX3 SRPX2
CIQBP DCN GSS KRT7 PARK7 PURA SSB
CIS DDAH2 GSTK1 KRT75 PARP1 PXDN ST13
C2I또는f33 DDB1 GSTO1 KRT77 PARVA PYCR1 ST6GAL2
CALR DDT GTPBP9 KRT9 PCBP1 PYGB STAT1
(실시예 14B) 593개의 추가 단백질 분석
더욱이 분비단백질체(secretome)에 의해 조절되는 생물학적 과정 및 경로는 하기와 같이 분석된다.
본 발명자들은 자유 웹-기반 컴퓨터 프로그램(http://www.pantherdb.org/tools/genexAnalysis.jsp)을 사용하는 분석을 제공한다. 각 기능적 범주내의 유전자 빈도가 794개의 유전자 전체 목록 및 공적 데이터베이스(NCBI: 호모 사피엔스) 사이에서 비교된다.
본 발명자들은 상이한 GO(gene ontology) 경로, GO 생물학적 과정 및 GO 분자 기능에서 유전자의 빈도를 비교한다. NCBI 호모 사피엔스 데이터베이스 내의 유전자 빈도보다 높거나 낮은 유전자 빈도를 지니는(p<0.01) 이들의 GO 경로, GO 생물학적 과정 및 GO 분자 기능만이 본 발명자들의 분석에 사용되었다.
상기 결과는 도 12, 13 및 14에 나타난다.
도 12는 분비된 단백질에 의해 구동되는 예측된 경로를 나타낸다. 각 경로에서 유전자 빈도는 NCBI 호모 사피엔스 데이터베이스(p<0.01)의 그것보다 분비단백질체에서 상당히 더 높다.
도 13은 분비된 단백질에 의해 구동되는 예측된 과정을 나타낸다. 각 경로에서 유전자 빈도는 NCBI 호모 사피엔스 데이터베이스(p<0.01)의 그것보다 분비단백질체에서 상당히 더 높거나 낮다.
도 14는 분비된 단백질에 의해 구동되는 분자를 나타낸다. 각 경로에서 유전자 빈도는 NCBI 호모 사피엔스 데이터베이스(p<0.01)의 그것보다 분비단백질체에서 상당히 더 높다.
(실시예 15) 실시예 7∼14에 대한 참고문헌
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(실시예 16) ES 세포의 조절배지(CM)에서 생물학적 활성
주요한 연구는 MSCs로부터 생물학적 활성 분자 인자의 일관적이고 재현성있는 제조이다. 더욱이 분비 유전자 산물의 스펙트럼은 상이한 세포 체계 및 질병상에서 MSCs의 보고된 측분비 효과에 대한 분자 기초를 제공한다[A7-18].
HuES9.El MSC에 의해 조절된 합성 배양 배지 및 오직 합성 배양 배지만으로 구성된 대조군 배지 상에서 다차원 단백질 확인 기술(MuDPIT)[A23] 및 사이토카인 항체 어레이 분석을 실시함으로써, 본 발명자들은 201개의 특이적 유전자 산물을 확인하였다(상기 실시예 참고). 조절배지(CM)에서 생물학적 활성의 추정으로서, 본 발명자들은 프로테옴 분석에 의해 예측된 MMP 젤라틴분해효소에 대한 CM을 테스트하였다.
도 10은 ES 세포 조절배지에서 MMP 젤라틴분해효소 활성을 나타낸다. 0.1μg 단백질을 사용하여 zymography는 MMP 젤라틴분해효소 활성, 될 수 있는 한 MMP2 또는 MMP9가 CM에는 존재하지만 비-조절배지(NCM) 대조군에는 존재하지 않는 다는 것을 확인하였다[A24].
(실시예 16A) ES 세포의 조절배지(CM)에서 생물학적 활성
A. 본 발명자들은 분비단백질체(secretome )의 TGF-β 단백질이 생물학적으로 활성 된다는 것을 증명한다. 분비단백질체에 THP-1의 노출은 Smad2의 증가된 인산화, TGF-β 신호(Euler-Taimor, G., and J. Heger. 2006. The complex pattern of SMAD signaling in the cardiovascular system. Cardiovascular Research 69:15-25.)의 하위 표적(downstream target)을 유도한다. 이것은 도 15에 나타난다.
도 15는 30분 동안 lOOμg CM 단백질 또는 NCM 단백질 또는 PBS에 노출된 THP-1 세포를 나타낸다. 그 다음에 세포 용해질이 항-인 함유 Smad2 항체 및 화학발광-기반 검출 시스템을 사용하여 표준 웨스턴 블롯 혼성화에 의해 제조되며 분석된다. 상기 신호는 농도계(densitometry)에 의해 정량화되며, 신호의 상대적 세기가 측정된다.
B. 또한 본 발명자들은 조절배지가 세포 화학주성, CM에 의해 영향을 받는 컴퓨터 분석에 의해 예측된 과정을 유도한다는 것을 증명한다(실시예 11 및 실시예 13).
CM은 5μM 크기의 구멍을 지닌 막을 통해 인체 제대 정맥 내피세포(HUVECs)의 이동을 유도한다. 이것은 도 16에 나타난다. 또한 CM은 THPl, 단핵세포주 및 일차 인간 포식세포의 유사한 이동을 유도한다.
도 16은 5μM 크기의 막구멍을 지닌 Transwell® 플레이트의 상부 챔버로 놓여진 1x105 HUVECs를 나타낸다. 하부 챔버는 25x 농축된 CM 또는 NCM의 원액의 1Ox, 5Ox, lOOx 희석물을 지닌 RPMI 배지로 채워진다. 포지티브 및 네가티브 대조군은 각각 15% 및 0% 우태아혈청(FCS)을 지닌 RPMI이다. 37℃, CO2 배양기에서 24시간 후, 하부 챔버로 이동된 세포의 수가 카운트된다. 농축된 CM의 10x 희석물을 지닌 챔버에서 세포의 수가 100으로 표준화된다. 다른 챔버로 이동된 세포의 수가 농축된 CM의 10x 희석물에 관하여 발현되었다.
C. CM이 세포사멸(상기)에 대한 생물학적 효과를 지닌다는 예측이 CM 또는 NCM의 존재시 산화 스트레스-유도 세포사멸을 유도하는 과산화수소(H2O2)를 지니는CEM 세포를 배양함으로써 테스트되며, 12 또는 24시간 후 남아있는 생세포의 수가 측정된다. CM은 산화 스트레스-유도 세포사멸을 상당히 감소시킨다. 이것은 도 17에 나타난다.
도 17은 1xCM 또는 10xCM의 존재시 50 또는 500μM H2O2 둘 중 하나에서 배양된 6개의 CEM 세포를 나타낸다. 생세포의 상대적인 수는 12 및 24 시간에서 트립신 블루 염색에 의해 측정된다.
(실시예 17) 급성 심근경색증(AMI) 마우스 모델에서 심장보호 효과
AMI는 상기에 기술된 바와 같이 좌전하방 관상동맥(left anterior descending coronary artery)의 영구 결찰에 의해 마우스에 유도된다[A57].
그 다음에 상기에 기술된 바와 같이 제조된 10 X 농축된 CM 또는 NCM(대조군) 100μl은 다음 72 시간이 지나서 경정맥에 놓여진 삼투 펌프를 통해 마우스에 투여된다. 이들 마우스에서 심장 기능은 3주 지나서 평가된다. CM으로 처리된 마우스는 상당히 감소된 사망률(도 1 1A) 및 개선된 좌심실 박출 계수(도 1 1B)를 지닌다.
(실시예 18) 허혈-재관류 돼지(Porcine) 모델에서 심장보호 효과
조절배지는 임상적으로 더욱 적절한 허혈-재관류 돼지 모델의 심장에서 회복 효과를 지니며, 심장 기능을 개선시킨다. 이 모델 및 시간은 심근경색증 환자와 비교되며, 심근경색증 환자는 입원하여 경색증 후 평균 90분에 도달하며 차단된 동맥을 열고 스텐트가 삽입된다.
마취
야간 금식 후. 피그에 관을 삽입하여 산소 및 공기의 혼합물(1:1 v/v)로 간헐적 양압 환기법(intermittent positive pressure ventilation)을 위한 호흡기를 연결하기 전에 피그를 케타민(10 mg/kg i.m.)으로 안정시키고, 티오펜탈(4 mg/kg, i.v.)로 마취시킨다. 정맥 카테터는 식염수 및 마취제의 지속적 투여를 위해 귀 정맥에 놓여진다. 진통이 수펜타닐시트레이트(1 μg/kg/h, i.v.)의 지속적 주입에 의해 발생되며, 판큐로늄 브로마이드(0.1 mg/kg/h, i.v.)의 주입에 의해 근육 이 이완되는 동안 마취는 미다졸람(0.3 mg/kg/h, i.v.)의 지속적 주입에 의해 유지된다. 또한 수술에 앞서, 160 mg 소탈롤이 심장 부정맥을 보호하기 위해서 30분 내에 정맥내에 주입된다.
심근경색증 및 수술 절차
전체 수술중에, 심전도, 동맥압 및 호기말이산화탄소분압측정도(capnogram)는 지속적으로 모니터링된다. 정중 흉골 절개술 후에, 조율 도관(pacing lead)은 고정된 심장박동수 측정을 가능케 하는 오른쪽 귀바퀴에 작은 구멍을 통해 오른쪽 심장으로 삽입된다. 좌심실압(LVP)은 좌심실로 에이펙스(apex)를 통해 삽입된 Millar 카테터 끝의 압력을 사용하여 측정된다. transonic flow 프로브(Transonic Systems Inc, Ithaca, NY, USA)는 심장박출량을 측정하기 위해 몸쪽 대동맥(proximal aorta) 주변에 놓여진다. 경색증의 유도에 앞서, 심장초음파검사가 실시된다. 허혈성 재관류 모델에 관해서, 먼저 봉합은 발생된 재관류를 제거하기 전에 45분 동안 폐색을 유도하기 위해서 몸쪽 좌회선 관상동맥(LCx) 주변에 바싹 죄어진다. 10마리의 동물들 중에서 두 그룹이 사용된다. 실험군은 측분비성 분비 즉 hESC-MSCs에 의해 조절된 배지를 지닐 것이며, 대조군은 비-조절 대조 배지를 지닐 것이다. 각각의 피그에서, 상기 배지는 직접 3개의 주요한 관상동맥으로 운반된다. 90분 후 LCX 주변의 봉합을 제거하고 각각의 RCA 및 LAD에 1ml의 환약을 제거한 후, 1ml의 환약이 LCX에 주어진다. 각각 배지 2ml을 지닌 3개의 삼투 펌프(Alzec)가 가슴에 이식되며, 카테터는 펌프로부터 각각의 동맥으로 직접 왕복으로 수송된다(LCX, RCA 및 LAD). 펌프는 관상동맥으로 이식 후에 7일 동안 배지(10 ul/h)를 운송한다. 따라서 각각의 피그는 국지적으로 배지 9ml를 전달 받는다. 각각의 피그는 3주 동안 생존한다. 그 밖의 투여 경로는 하기와 같다: 1) 각각의 피그는 CM 또는 NCM 환약(3ml)을 허혈-재관류 뒤이어 다음 72시간 동안 IV 투여 후 즉시 주변-경색 지역에서 내부심근으로 전달받는다; 2) 허혈-재관류 뒤이어 다음 72시간 동안 IV 투여 후 즉시 카테터에 의해 CM 또는 NCM 3ml의 내부심근 투여이다. VF가 발생한다면 50 줄로 내부 세동제거가 사용된다. 이식시, 심장박출량 측정, 평균동맥압, 좌심실압 및 심장초음파 검사는 심근경색증 전 및 후에 실시된다. 종료시, 이것은 PV 루프로 확장되며, 경색 크기가 측정된다. 혈류역학 및 심장 박동의 안정화 후, 흉부가 닫히고 동물들은 안정 상태에서 회복될 수 있다.
평가
심근경색증 유도 후 3주에, 동물들은 다시 마취되고, 이들의 흉골은 재-열린다. 심장초음파검사 및 전도도 카테터 기반 압력-부피 레코딩은 심장의 기능 및 구조를 평가하기 위해서 측정된다. 기능 측정 후, 심장은 실험실 분석을 위해 체외 이식된다.
혈류역학
심전도, 동맥압, 심장박출량 및 좌심실압(LVP)는 300 Hz의 최소 샘플링률에서 디지털화되며, 오프-라인 분석(Sonometrics Corporation, Ontario, Canada)에 대해 저장된다.
심장초음파검사
짧은 축 심장외막 초음파(Prosound SSD-5000, 5 MHz probe UST-5280-5, Aloka Holding Europe AG, Zug, Switzerland)는 중기-유두상 수준에서 획득된다. 경색증 영역의 벽두께(WT) 및 좌심실 내부 영역(L Via)은 말기-이완기(ED) 및 말기-수축기(ES)에서 측정된다. 수축기 벽두께(SWT)는 (WT(ED)-WT(ES))/WT(ED) * 100(%) 으로서 프랙셔널 부위 감소 FAS는 (L Via(ED)-LVia(ES))/LVia(ED) * 100(%)으로서 측정된다.
전도도 카테터 프로토콜
전도도 카테터 방법은 LV 부피 및 LV 압력의 연속적인 온라인 측정을 제공하며, 상기에 기술된 바와 같이 실시된다[A58, A59]. 전도도 카테터로부터 유래된 연속적인 LV 압력 및 부피 신호는 Leycom CFL-512(CD Leycom, Zoetermeer, the Netherlands)를 사용하여 250Hz 샘플링률에서 나타나지며 획득된다. 자료는 정류상태 및 관자 caval 정맥 폐색 동안 말기-호기에서 꺼진 인공호흡기로 획득된다. 획득은 고정된 심방조율률 80 beats/min에서 실시된다. 압력 부피 루프의 분석은 관습적인 소프트웨어를 사용하여 실시된다. 말기-이완기는좌심실압의 신속한 증가의 시작(onset)으로서 말기-수축기는 좌심실압(dP/dtmin) 감소의 최대률에서 정의된다.
경색 크기
심장의 이식 후, LV는 분리되고, 꼭대기에서부터 바닥까지 5개의 슬라이스로 절단된다. 슬라이스는 1% 트리페닐테트라졸리움 클로라이드(TTC, Sigma- Aldrich Chemicals, Zwijndrecht, Netherlands), 37℃ Sorensen 완충용액(13.6 g/1 KH2PO4 + 17.8 g/1 Na2HPO4·2H2O, pH 7.4)에서 15분 동안 생존가능 심근으로부터 경색 조직을 구별하기 위해서 배양된다. 모든 슬라이스는 각각의 슬라이스의 모든 측면으로부터 스캔되며, 경색 영역은 디지털 면적측정 소프트웨어를 사용하여 전체 영역과 비교된다. 슬라이스의 무게에 대한 보정 후, 경색 크기는 LV의 백분율로 계산된다.
이식시, 심장 박출량의 측정, 평균 동맥압, 좌심실압 및 심장초음파검사는 심근경색증 전 및 후에 실시된다. 종료시, 이는 PV 루프 및 경색 크기의 크기로 확대된다.
(실시예 18B) 허혈-재관류의 돼지 모델에서 심장보호 효과
실시예 18의 "짧은 축된" 버전이 실시된다. 실험은 본질적으로는 종료점이 3주에서 4시간 정도 줄어든다는 것 이외에는 큰 차이가 없다. 상기 절차는 하기의 변화와는 별개로 동일하다:
심근경색증 및 수술 절차
전체 수술과정 동안, 심전도, 동맥압 및 호기말이산화탄소분압측정도은 지속적으로 모니터링된다. 정중흉골절개술 후에, 조율 도관(pacing lead)은 고정된 심장박동수 측정을 가능케 하는 오른쪽 귀바퀴에 작은 구멍을 통해 오른쪽 심장으로 삽입된다. 좌심실압(LVP)은 좌심실로 에이펙스(apex)를 통해 삽입된 Millar 카테터 끝의 압력을 사용하여 측정된다. transonic flow 프로브(Transonic Systems Inc, Ithaca, NY, USA)는 심장박출량을 측정하기 위해 몸쪽 대동맥(proximal aorta) 주변에 놓여진다. 경색증의 유도에 앞서, 심장초음파검사가 실시된다. 허혈성 재관류 모델에 관해서, 먼저 봉합은 발생된 재관류를 제거하기 전에 75분 동안 폐색을 유도하기 위해서 몸쪽 좌회선 관상동맥(LCx) 주변에 바싹 죄어진다. 동물들 중에서 3 그룹이 사용된다. 실험군은 측분비성 분비 즉 hESC-MSCs에 의해 조절된 배지를 지닐 것이며, 대조군은 비-조절 대조 배지 또는 식염수 둘중 하나를 지닐 것이다. 재관류의 시작 전에 5분에, 피그는 정맥내에 MSC-CM(2.0 mg 단백질, 1 ml), NCM 또는 식염수로 처리된다. 재관류 후 즉시, MSC-CM(4 ml, 8.0 mg 단백질, N=7), NCM(N=5) 또는 식염수(N=7)는 LCx 관상동맥으로 국지적으로 주입된다. 피그는 재관류 후 4시간에 희생된다. 위험 지역에서 상대적인 경색 크기는 Evans Blue 및 TTC 염색을 사용하여 측정된다. 이것은 CM으로 처리된 피그, NCM으로 처리된 피그(p= 0.024), 식염수로 처리된 피그(p=0.007)에서 현저히 감소된다(도 7). LV 부피 및 LV 압력의 연속적인 온라인 측정이 심전도 카테터 방법을 사용하여 측정되는 동안, 수축기 벽두께(SWT) 및 프랙셔널 부위 감소(FAS)와 같은 기능성 심장 기능은 심장초음파검사(도 8)에 의해 측정된다. 기저선에서 허혈 동안, 피그의 3개의 실험군에서 SWT 및 FAS는 거의 다르지 않다. 그러나, 재관류 후 4시간, CM-처리된 돼지의 SWT 및 FAS는 비-처리된 동물 및 식염수-처리된 동물보다 상당히 높다. 또한 CM-처리된 피그는 기절심근(stunned myocardium)을 검사하기 위한 βl-아드레날린 수용체 작용체 도부타민(2.5 및 5.0 microg/kg/min)의 정맥내 주입에 의해 약리학적으로 유도된 스트레스 하에서 더 강한 심장 기능을 나타낸다.
결과
짧은 축된 실험의 결과는 도 18, 19 및 20에 나타난다.
도 18은 CM, NCM 또는 식염수로 처리된 피그에서 급성 허혈-재관류후에 상대적인 경색 크기를 나타낸다. 급성 허혈은 75분 동안 LCx의 결찰, 뒤이어 재관류에 대한 결찰의 풀림에 의해 유도된다. 재관류 시작 전 5분, 상기 피그는 CM, NCM 또는 식염수로 정맥내에 처리된다. 재관류 후 즉시 CM, NCM 또는 식염수는 LCx 관상동맥으로 국지적으로 주입된다. 재관류 후 4시간, 위험 지역에서 상대적인 경색 크기가 측정된다.
도 19 및 20은 심장초음파검사를 나타낸 것이다.
도 19: 수축기 벽두께, 도 20: 분획 영역 쇼트닝을 나타낸 것이다.
심장 측정은 허혈전, 동안 및 허혈 후 4시간에 실시된다. 허혈 후 4시간, 추가 측정은 검사를 위한 βl-아드레날린 수용체 작용체 도부타민(2.5 및 5.0 microg/kg/min)의 정맥내 주입에 의해 약리학적으로 유도된 스트레스 하에서 실시된다. 짧은 축 심장외막 초음파(Prosound SSD-5000, 5 MHz probe UST-5280-5, Aloka Holding Europe AG, Zug, Switzerland)는 중기-유두상 수준에서 획득된다. 경색증 영역의 벽두께(WT) 및 LV 내부 영역(L Via)은 말기-이완기(ED) 및 말기-수축기(ES)에서 측정된다. 수축기 벽두께(SWT)는 [(WT(ES)- WT(ED))/WT(ED)] * 100% 로서 프랙셔널 부위 감소 FAS는 [(LVia(ED)-LVia(ES))/로서 측정된다.
PV 루프를 측정하는 심전도 카테터 프로토콜
심전도 카테터 방법은 LV 부피 및 LV 압력의 연속적인 온라인 측정을 제공하며, 이는 이전에 기술된 바와 같이(Timmers, L., J. P. G. Sluijtør, C. W. J. Verlaan, P. Steendijk, M. J. Cramer, M. Emons, C. Strijder, P. F. Grundeman, S. K. Sze, L. Hua, J. J. Piek, C. Borst, G. Pasterkamp, and D. P. V. de Kleijn. 2007. Cyclooxygenase-2 Inhibition Increases Mortality, Enhances Left Ventricular Remodeling, and Impairs Systolic Function After Myocardial Infarction in the Pig. Circulation 115:326-332) 실시된다.
심전도 카테터로부터 유래된 LV 압력 및 부피 신호는 Leycom CFL-512 (CD Leycom, Zoetermeer, the Netherlands)로 250-Hz 샘플링률에서 나타나고 획득된다. 자료는 정류상태 및 관자 caval 정맥 폐색 동안 말기-호기에서 꺼진 인공호흡기로 획득된다. 압력-부피 루프의 분석은 관습적인 소프트웨어로 실시된다.
(실시예 19) 피부 장애에 있어서 조절배지의 치료효과
hESC-MSCs에 의한 CM의 분자 성분 및 CM의 집단 기능(collective functions)의 컴퓨터 예측은 CM은 피부염 또는 건선과 같은 피부 상처 또는 피부 손상 장애에 대하여 회복효과를 포함한다는 것을 나타낸다. CM에 의해 구동되는 대부분의 분자 성분 및 생물학적 과정은 피부상처 치료 및 피부 장애의 치료에 사용되거나 타겟팅된다.
구체적으로는, 인터페론-γ 및 인터루킨-2 및 -10과 같은 분비된 사이오카인(cyokine)은 콘딜로마 및 사마귀, 혈관종, 켈로이드, 피부암, 아토피 피부염, 건선, 베체트병, 만성육아종병, 상처 치료 및 피부 T-세포 림프종 치료에 사용된다[A60]. 콜라겐, ECM의 조정자 예를 들면 MMPs 및 이들의 저해제를 포함하는 ECM 단백질과 같은 그 밖의 분비된 단백질이 있다. 또한 TIMP, 혈관형성인자 예를 들면 VEGF, PIGF, 성장인자 예를 들면 TGF-β, EGF는 상처 치료 흉터 감소 궤양에 포함된다[A61-67]. hESC-MSC의 CM에 의해 조절되는 신호 경로의 일부는 많은 피부 장애 예를 들면 MAPK에 포함되며, 신호 경로는 건선[A68, A69], 건선의 IGF 및 IGFBPs을 통한 IGF 축의 조절[A70], 피부병의 Toll 신호[A71]에 포함된다.
따라서 피부염 또는 건선과 같은 피부 상처 또는 피부 손상 또는 장애에 대한 CM의 국소 적용은 치료를 개선시키며, 흉터를 감소시킨다. 또한 이것은 항상성을 유지시킨다. CM은 리포솜-기반 에멀젼, 겔 또는 크림 포뮬레이션에 운송되며, 표준 창상처치의 일부이다. 또한 CM은 피부 회복 및 치료를 촉진시키는 코스메틱 스킨케어 산물에 보충제로서 사용된다.
피부 장애에 대한 CM의 효능을 테스트하기 위한 적절한 동물 모델은 피부염에 걸린 마우스 모델이다. 마우스의 상표피 민감화는 상기에 기술한 바와 같이 실시된다[A72, A73]. 간단하게는 100μl의 PBS에 50μg의 BIo t 5 또는 단독 PBS는 lcm2 거즈에 발라지며, 투명 드레싱(Smith Nephew)으로 피부에 부착된다. 이 절차는 50일에 걸쳐 2번 반복된다. 그 다음에 CM 및 NCM은 lcm2 거즈에 발라지며, 상기에 기술된 바와 같이 시간에 따라 피부에 부착된다.
피부 염증의 조직검사에 관해서, 표본은 패치를 부착한 피부로부터 획득되며, 즉시 천연 포르말린 10% 완충용액에 고정된다
(실시예 20) 천식 및 알레르기에 있어서 조절배지의 효과
천식은 유전 및 환경 인자의 불완전하게 특성화된 세트에 의해 야기된 균등하게 복잡한 병인을 지니는 복합적 질병이다. 그 결과 병리학은 평활근 질량 증가시키는 것에 의해 특성화된 상피하 섬유증 및 기도의 만성 염증을 일으키는 면역 조절곤란이며 세포외기질 단백질의 침전을 증가시키며 이이서 폐 기능을 감소시킨다.
현재 치료는 일부 인자 또는 신호 경로 예를 들면 ECM, 인테그린 및 중간엽 세포 기능[A74], toll-유사 수용체[A75], TGF- β 및 EGF와 같은 성장인자[A76, A77] 및 IL6 경로[A78]를 조절하는 것을 포함한다. hESC-MSCs에 의한 CM은 타겟 지역 상에서 생물학적 효과를 지니는 것으로 예측되었으며, 본 발명자들은 CM이 천식에 걸린 폐의 면역조절의 복구 및 조직 회복 촉진 및 폐 조직의 흉터 최소화를 돕는다는 것을 예측한다.
만성 기도 염증 및 기도 상에서 CM 및 NCM의 효과를 연구하기 위해서, 마우스의 상표피 민감화는 상기에 기술한 바와 같이 수행된다[A72, A73] . 50일 후에, 패치가 부착된 마우스는 마취되었고, 3일 연속 동안 50μg의 BIo t 5로 비강내 검사를 실시하였다. 마지막 복용 후 24시간, 기도 과민성(hyperresponsiveness)(AHR)은 침습성 BUXCO을 사용하여 측정된다[A79]. 마우스는 마취되고 3일 연속 동안 비강내로 CM 또는 NCM이 주어진다. 마지막 복용 후 24시간, 기도 과민성(AHR)이 측정된다. BAL 용액은 그 후 24시간 후 수집된다. 기관지 폐포 세척 콜렉션 후, 폐는 10% 중성 포르말린에서 고정된다.
급성 기도 염증 및 기도 상에서 CM 및 NCM의 효과 연구.
높은 농도의 IL-4, IL-5, IL- 13 및 검출할 수 없는 농도의 IFN-를 분비하는Blot t 5 특이적 Th2 세포주는 마우스 알레르기 모델 확립을 위해 사용된다. 간략하게는, 어린 마우스의 민감화는 각 마우스에 정맥내로 2.5 x 106의 BIo t 5 특이적 Th2 세포의 면역 전달(adoptive transfer)에 의해 실시된다. 이들 마우스는 마취되고, 3일 연속 동안 50μg의 BIo t 5로 비강내(IN) 검사된다. 마지막 IN 검사 후 24시간, 기도 과민성(AHR)는 침습성 BUXCO을 사용하여 측정된다[A79]. 그 다음에 마우스는 마취되고 3일 연속 동안 비강내로 CM 또는 NCM이 주어진다. 마지막 BIo t 5 검사 후 BAL, 용액은 48시간에 수집된다. 기관지 폐포 세척 콜렉션 후, 폐는 histopathological 분석을 위해 10% 중성 포르말린에서 고정된다.
임상 실습에 있어서, 폐 질환을 치료하는 CM의 사용은 표준 에어로졸 치료를 사용하여 효과적으로 투여된다[A80-86].
(실시예 21) 그 밖의 질병에 있어서 조절배지의 치료효과
일반적으로, 본 발명자들은 hESC-MSCs의 CM이 초기부상이 염증을 유도한다는 병리조건에서 항상성을 복구 및 조직 회복 촉진에 유용하다는 것과 면역 조절 곤란은 섬유증 및 기능의 손실을 포함하는 만성 조직 리모델링을 유도한다는 것을 예측한다. 그 밖의 질병은 신장 허혈손상, 낭성섬유증, 동염 및 비염을 포함한다.
(실시예 22) 정형외과학에 있어서 조절배지의 치료효과
골격근 조직의 회복에 대한 현재 치료 전략은 기계적 지원을 제공할뿐만 아니라 세포 이동, 세포 부착, 증식 및 분화를 촉진, 혈관신생 및 궁극적으로 새로운 뼈의 형성을 일으키는 발판으로서 생체 적응 재료 (세라믹 또는 폴리머)의 사용을 포함한다[A87-90]. hESC-MSC에 의한 CM의 컴퓨터 분석을 기초로 하여, 비계(scaffold) 디자인으로 CM의 통합은 발판으로 세포 이동, 증식, 부착, 골격 분화 및 혈관신생을 증진시킨다.
결함 뼈 재생에 있어서 CM의 효과를 테스트하는 것은 다른 점에서 위축 불유합을 유도하며, 뉴질랜드 화이트 래빗은 반경 15-mm 결손부(critical size defect)를 얻으며[A91], 이는 콜라겐 스폰지 또는 CM 또는 NCM 둘 중 하나로 코팅된 수화겔과 같은 적절한 기질로 채워진다. 방사선 사진은 3주마다 획득된다. 6 또는 12주 후, 동물들은 희생된다. 새로운 뼈는 microCT 스캔에 의해 측정되며, 혈관분포상태는 이식시 내피세포를 염색하는 항-CD31을 사용하여 측정된다. 최소한 초기에 혈관분포상태를 증가시키고 또한 새로운 뼈 형성을 증가시킨다.
연골 회복에 CM 효과를 테스트하기 위해서, 골연골 부상을 입은 래빗 모델[A92]이 사용된다. CM은 콜라겐 또는 gydrogel과 같은 적절한 스캐폴드 상에서 코팅되며, 3-mm 골연골 무릎 결손부위로 이식된다[A93]. 임상 적용을 위해 CM은 기존 스캐폴딩 또는 뼈 이식편으로 CM을 포함시킴으로써 사용된다[A94].
(실시예 23) 골수 이식에 있어서 조절배지의 치료효과
MSCs는 골수 이식을 증진시킬 수 있으며[A95], 이식편대 숙주반응을 개선시킬 수 있다. MSCs의 이식은 조혈 착상[A96]을 촉진 및 GVHD [A97, A98]를 제한함으로써 알레르기성 이식 결과를 개선시킬 수 있다. 이는 MSCs가 조혈줄기세포 기생위치(niche)[A99]의 증진 및 내성 유도를 통해 이들 효과를 매개한다는 것과 GVHD, 알레르기 조직 이식의 거부반응 및 염증의 조절[A98]을 아마 수용성 인자의 분비[AlOO]를 통해 감소시킨다는 것을 주장한다.
MSCs에 의한 CM의 잠재적인 임상 응용 프로그램: 시험관내에서 CM과 배양 배지를 보충함으로써 또는 생체내에서 이식 동안 조혈줄기세포와 CM의 주입에 의해 조혈줄기세포의 팽창은 CM의 정맥내 주입 또는 전 및 후-이식 치료의 일부로서 CM의 정맥내 주입에 의해 이식된 세포 또는 조직으로 면역 내성의 유도에 의해 GVHD를 개선시킨다.
(실시예 24) 실시예 16∼22에 대한 참고문헌
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각각의 본 명세서에 언급된 출원 및 특허, 및 각각의 상기 출원 및 특허에 인용되거나 참고문헌된 각각의 문헌 각각의 출원 및 특허의 실행("문헌에 인용된 출원")을 포함 및 각각의 출원 및 특허 및 문헌에 인용된 출원 중 어느 하나에 인용되거나 언급된 생산품에 관한 제조업자의 지침서 또는 카탈로그는 이로써 참고문헌에 의해 본 명세서에 포함된다. 더욱이 본 명세서에 인용된 모든 문헌, 및 본 명세서에 인용된 문헌에 인용되거나 참고문헌된 모든 문헌, 및 본 명세서에 인용되거나 언급된 생산품에 관한 제조업자의 지침서 또는 카탈로그는 이로써 참고문헌에 의해 본 명세서에 포함된다.
본 발명의 기술된 방법 및 시스템의 다양한 변화 및 변형은 본 발명의 범위와 정신으로부터 벗어나지 않는 한 당업자에게 명백하다. 비록 본 발명이 구체적인 바람직한 실시태양과 관련하여 기술될지라도, 청구된 바와 같이 본 발명을 특정한 실시태양으로 지나치게 제한해서는 안되며, 많은 변형 및 추가는 본 발명의 범위 내에서 만들 수 있다는 것을 이해해야 한다. 실제로 분자 생물학 또는 관련 분야의 당업자에게 명백한 본 발명을 수행하기 위해 기술된 방법의 다양한 변형은 청구 범위 내에서 의도된다. 더욱이 하기 종속항의 특징의 다양한 결합은 본 발명의 범위로부터 벗어나지 않는 한 독립항의 특징으로 만들어질 수 있다.
도 1A-1G는 hESC-MSC 배양의 특성화(Characterisation)를 나타낸다.
도 1A는 위상차 하에서의 세포 형태학을 나타낸다.
도 1B는 hESC-MSC에서 다능성-연관된 유전자의 발현을 나타낸다. 전사 수준은 Taqman-기초 정량 RT-PCR에 의해 측정되며, hESC의 그것으로 표준화된다. hESC에서 전사 수준은 HuES9 및 Hl hESC 라인의 평균으로부터 유도된다.
도 1C는 HuES 9 및 Hl hESC 라인, HuES9.El HuES9.E3 및 Hl. E2 hESC-MSC 배양 및 E14 마우스 ESC 라인에서 다능성-연관 유전자에 관한 웨스턴 블롯 분석을 나타낸다.
도 1D는 HuES9 및 HuES9.El의 신장 피막밑 이식을 나타낸다. HuES9.El (정상) 또는 HuES9 (바닥)과 함께 이식된 후 4개월 후 파라핀-함몰, 신장의 H&E 스테인드 크로스 섹션을 나타낸다.
도 1E는 인간 HuES9 ESC 라인, 마우스 E14 ESC 라인, 마우스 배아 섬유모세포(MEF) 피더 및 HuES9.El에서의 알칼리성 인산분해효소 활성을 나타낸다.
도 1F는 인간 Alu 및 마우스 c-mos 반복서열의 존재에 관하여 PCR에 의한 게놈 DNA 분석을 나타낸다.
도 1G는 G-banding(정상 패널) 및 분광 핵형법(Spectral Karyotyping, SKY)(중간 패널)에 의한 HuES9.El의 염색체 분석을 나타낸다. 바닥 패널에서 나타난 9번 염색체 의 역위를 나타낸다.
도 2A-2B는 FACS 분석에 의한 표면항원의 프로파일링을 나타낸다.
도 2A는 HuES9.El HuES9.E3 및 Hl. E2 hESC-MSCs, HuES9 hESCs 및 뮤라인(murine) 배아 섬유모세포 영양세포는 WinMDI 소프트웨어를 이용하여 시안 LX (Dako North America, Inc., Carpinteria, CA) 도구 상에서 염색되고 분석된다. 비특이적 형광은 동형-매치된 마우스 단일클론항체와 함께 유사세포 일정부분의 배양에 의해 측정된다.
도 2B. FACS 분석에 의해 BM-MSCs와 함께 동시에 분석되기 전에 HuES9.El 및 HuES9.E3 hESC-MSCs는 혈청-포함 BM-MSC 배지에서 2번 통과된다.
도 3A-3C. HuES9.El. HuES9.El 세포의 분화는 표준 프로토콜을 이용하여 지방형성, 연골형성 및 골발생을 발생시키기 위해 유도된다.
도 3A. 지방형성. i) 지방형성 유도 14일 후에, 세포는 오일 레드에 의해 적하급유 동안 염색된다; ii) 7일 및 14일 되는 날, PPARγmRNA는 Taqman 정량 RT-PCR에 의해 측정된다. 모든 값은 HuES9.El의 그것으로 표준화된다; iii) Taqman 정량 RT-PCR에 의해 측정시 HuES9 및 HI hESCs, 이들의 유도 MSC 세포 배양(HuES9.El, HuES9.E3 및 Hl. E2) 및 성인 조직-유도된MSCs (BM-MSC 및 ad-MSC)에서 상대적인 PPARγmRNA 수준을 나타낸다. 모든 값은 HuES9.El의 그것으로 표준화된다.
도 3B. 연골형성. i)) 연골형성 유도 21일 후, 세포는 알시안 블루에 의해 프로테오글리칸(왼쪽) 및 HRP-기초 가시화 분석을 사용하여 콜라겐 타입 II 의 면역반응력을 나타낸다; ii) 7일 및 14일에, 아그레칸(Aggrecan) 및 PPARγmRNA는 Taqman 정량 RT-PCR에 의해 측정된다. 모든 값은 HuES9.El의 그것으로 표준화된다; iii) HuES9 및 HI hESCs에서 상대적인 PPARγmRNA 수준, 이들의 유도체 MSC 세포 배양(HuES9.El, HuES9.E3 및 Hl JE2) 및 성체 조직-유래 MSCs(BM-MSC 및 ad-MSC)는 Taqman 정량 RT-PCR에 의해 측정된다. 모든 값은 HuES9.El의 그것으로 표준화된다.
도 3C. 골발생. I) 연골형성 유도 후 21일, 세포는 본 코사 염색에 의해 무기질침착을 위해 염색된다. ii, iii) 7일 및 14일 뼈-특이적 알칼리성 인산분해효소(ALP) 및 본 시알로프로테인(BSP) mRNA는 Taqman 정량 RT-PCR에 의해 측정된다. 모든 값은 HuES9.El의 그것으로 표준화된다.
도 4A-4D는 유전자 발현 분석을 나타낸다.
도 4A는 HuES9.El, HuES9.E3, 및 H1.E2로 이루어진 3개의 hESC-MSC 배양, 3개의 BMMSC 샘플, 3개의 ad-MSC 샘플 및 HuES9, Hl 및 Hes3으로 이루어진 3개의 hESC 라인에서 발현된 유전자의 계통 작성을 나타낸다.
도 4B는 hESC-MSCs 및 BMMSCs(왼쪽)사이의 및 hESC-MSCs 및 hESCs(오른쪽)사이의 유전자 발현의 쌍대비교를 나타낸 것이다.
도 4C는 hESC-MSCs 및 BM-MSCs에서 일반적으로 발현된 유전자의 분석을 나타낸다(2배 이하 차이). 상기 유전자는 Panther 분류 시스템을 사용하여 생물학적 과정으로 분류된다. 각각의 생물학적 과정은 과잉- 또는 과소-표현 여부를 (p<0.01) CBI의 예측된 유전자 빈도로 관찰된 유전자 빈도를 비교함으로써 측정된 다: 각각의 생물학적 과정에 대한 23481개의 유전자의 H. 사피엔스 유전자 데이터베이스. 유의미하게 과잉- 또는 과소-표현된 과정은 그룹화되며 그래프로 표시된다.
도 4D는 hESC-MSCs 및 BM-MSCs에서 차별적으로 발현된 유전자(2배 이하 차이)의 분석을 나타낸다. hESC-MSCs 또는 BM-MSCs에서 고도로 발현된 유전자에 의해 상당히 과잉- 또는 과소-표현된 생물학적 과정은 그룹화되며 그래프로 표시된다.
도 5A-5D는 hESC-MSC의 발생에 관한 포지티브 및 네가티브 분류를 나타낸다.
도 5A. FACS 분석 HuES9.El HuES9.E3 및 Hl. E2 hESC-MSCs, HuES9 hESCs 및 뮤린 배아 섬유모 영양세포는 염색되고, WinMDI 소프트웨어를 사용하여 Cyan LX(Dako North America, Inc., Carpinteria, CA) 도구 상에서 CD24의 존재에 대해 분석된다. 비-특이적 형광은 아이소형-매치된 마우스 단일클론 항체와 유사한 세포 분취의 배양에 의해 측정된다.
도 5B는 PDGF와 FGFE를 보충시킨 배지 내에서 피더를 사용하지 않고 일주일간 트립신화 및 증식시킨 HuES9 세포로부터 CD105+, CD24- 세포를 분리한 것이다.
도 5C는 Q4.1 배양물과 Q4.2 내지 Q4.5인 Q4 배양물 간의 유전자 발현을 유전자 별로 비교한 도표이다.
도 5D는 HUES9.E1, HuES9.E3, 및 Hl. E2로 구성된 hESC-MSCs와 모든 Q4 배양물 간의 유전자 발현을 유전자 별로 비교한 것과 모든 G4 배양물과 BM-MSCs 간의 유전자 발현을 유전자 별로 나타낸 도표이다. Q4.3의 SKY 분석이다.
도 6은 HuES9.El MSC 배양에 의해 조절화된 배지의 단백질 분석이다. 80% 융합된 HuES 9. El 세포 배양물을 PBS로 3번 세척시키고 페놀레드를 포함하지 않고 ITS, 5ng/ml FGF2, 5ng/ml PDGF AB 글루타민-페니실린-스트렙토마이신 및 β-머캅토에탄올을 보충시킨 DMEM배지로 구성된 화학적으로 정의된 배지 내에서 하룻밤 배양시킨다. 배양물을 PBS로 세차례 세척 린스시킨 후 신선한 정의된 배지로 교환시킨다. 배지의 모든 알리코트는 0, 24, 48, 72시간 후에 제거시키고 500xg로 원심분리 시킨 후 상등액을 0.2μ로 여과시킨다. 10㎕의 배지는 4-12% SDS-PAGE 위에 분리시키고 은으로 염색시킨다.
도 7은 항체 어레이이다. 조절화(CM)되거나 조절화되지 않은(NCM) 배지의 1 ml를 RayBio® Cytokine Antibody Arrays를 사용하여 제조자 지침(RayBio Norcross, GA)에 의해 인큐베이션 시킨다. 각각의 어레이의 항체 맵은 실시예에 기재되어있다. 특정 항체의 리간드 결합은 HRP- 베이스화된 케밀루미니센스 에세이에 의해 시각화된다. 각각의 멤브레인의 다른 조사를 통해 분석되었다. 시그널이 존재하는 것은 CM과 하이브리드된 멤브레인 위에 존재하는 것이며 NCM과 하이브리드된 것의 부재를 나타낸다. 항체는 이와 같이 스코어링 시켰다. 4개의 독립된 CM 및 NCM 배치의 분석데이터는 실시예에 요약되어있다.
도 8은 생물학적 과정을 통한 201개 유전자 프로덕트의 분포도이다. 201개 유전자는 GO 분류 시스템에 의해 여러 종의 생물학적 과정으로 분류되었다. 58개의 생물학적 과정이 나타나있으며 Unigene, Entrez 및 GenBank와 같은 데이터베이스로부터 p-value <0.05의 구간에서 유전자의 빈도에 관련된 세크리토리 프로테옴으로 유전자의 빈도를 분석하였다. 크게 3개의 그룹으로 나누었으며 이는 대사, 방어반응 및 조직분화이다.
도 9는 201개 유전자 프로덕트를 경로별로 분포시킨 것이다. 201개의 유전자는 GO 분류시스템에 의해 서로 다른 경로로 분류되었다. 30개의 생물학적 과정이 나타나있으며 Unigene, Entrez 및 GenBank와 같은 데이터베이스로부터 p-value <0.05의 구간에서 유전자의 빈도에 관련된 세크리토리 프로테옴으로 유전자의 빈도를 분석하였다. 몇 개의 카테고리로 나누었으며 이는 수용체 결합, 시그널 변환, 세포-세포 상호작용, 세포 이동, 면역반응 및 대사반응이다.
도 10은 SDS 겔 전기영동을 나타낸 것으로, 조절배지(CM) 내의 ES 세포의 MMP 젤라티나제의 활성을 나타낸 것으로 비조절배지(NCM) 대조군은 나타내지 않았다.
도 11A는 급성심근경색증 (AMI)의 마우스 동물모델의 생존율을 나타낸 것이다. CM은 조절배지에서 ES 세포로 처치된 마우스를 나타내며 NCM은 비조절배지에서 처치된 마우스를 나타내며 대조군으로 나타낸 것이다.
도 11B는 급성심근경색증 (AMI)의 마우스 동물모델의 좌심실박출계수를 나타낸 것이다. CM은 조절배지에서 ES 세포로 처치된 마우스를 나타내며 NC은 비조절배지에서 처치된 마우스를 나타내며 대조군으로 나타낸 것이다.
도 12는 분비 단백질체의 예측 경로를 나타낸 것이다. 각각의 경로에 높은 빈도의 유전자는 세크리토메에 있어서 NCBI 인간 데이터베이스(p<0.01) 유전자 중에서 중요성을 나타낸다.
도 13은 분비 단백질체의 예측 과정을 나타낸 것이다. 각각의 경로에 빈도의 유전자는 세크리토메에 있어서 NCBI 인간 데이터베이스(p<0.01) 유전자 중에서 중요성이 높거나 낮음을 나타낸다.
도 14는 분비 단백질체의 예측 분자를 나타낸 것이다. 각각의 경로에 빈도의 유전자는 세크리토메에 있어서 NCBI 인간 데이터베이스(p<0.01) 유전자 중에서 중요성을 나타낸다.
도 15는 lOO㎍의 CM 단백질 또는 NCM 단백질 또는 PBS에 30분간 노출시켰을 때 THP-I 세포를 나타낸다. 세포 라이세이트는 준비되고 표준 웨스턴 블롯 하이브리다이제이션 법에 의해 분석되었다. 이때 항-포스포릴화된 Smad2 항체와 케밀루미니센스-베이스 검출 시스템을 사용하였다. 시그널의 상대 빈도를 측정하였다.
도 16은 멤브레인 포어 사이즈 5μM의 Trans well® 플레이트의 상부 챔버내의 보관된 1X105 HUVEC을 나타낸 것이다. 하부 챔버에는 25x 농축 CM 또는 NCM 스톡 용액의 1Ox, 5Ox, lOOx 로 희석된 RPMI 배지로 채워져있다. 양성 및 음성 대조군은 15%의 RPMI와 0%의 우태아혈청(FCS)을 각각 사용한다. 37℃에서 24시간 동안 이산화탄소 인큐베이터에서 인큐베이션 시킨 후 하부 챔버로 이동된 세포의 수를 측정하였다. 챔버 내의 세포의 수는 농축 CM의 10x 희석액을 사용하여 측정하였으며 100으로 표준화하였다. 다른 챔버로 이동된 세포의 수는 농축된 CM 10x 희석액의 그것과 비교하여 측정하였다.
도 17은 IxCM 또는 1OxCM 존재 하에서 50 또는 500 μM의 과산화수소수로 인큐베이션 시킨 CEM 세포를 나타낸 것이다. 생존하는 세포의 상대적인 수는 트리판 블루 염색법에 의해 12 및 24시간에 측정되었다.
도 18은 CM, NCM 또는 생리식염수로 처리한 돼지의 급성 허혈-재관류 후의 경색부위의 상대적인 크기를 나타낸다. LCx의 75분간 라이게이션에 의해 급성 허혈을 유발시킨 후 재관류를 위한 라이게이션의 분리를 행한다. 재관류 5분전에 돼지들은 정맥주사로 CM, NCM 또는 생리식염수를 처치한다. 재관류 후 바로 CM, NCM 또는 생리식염수는 LCx 관상동맥으로 국소적으로 부어넣는다. 재관류 후 4시간 후에 경색부위의 크기를 측정하였다.
도 19와 20은 초음파카디오그라피를 나타낸 것이다. 도 19는 수축기 혈관벽의 두꺼워짐이다. 도 20은 프랙셔널 부위 감소다. 심장 상태를 허혈전, 허혈시 및 허혈 4시간 후에 측정하였다. 허혈 4시간 후에 심근스턴을 촉진하기 위해 β 1 -아드레너직 수용체 어고니스트 도부타민(2.5 및 5.0 microg/kg/min)을 정맥주사로 투여한 후 추가적 측정을 행하였다. 짧은 축 에피카디얼 초음파 이미지(Prosound SSD- 5000, 5-MHz probe UST-5280-5, Aloka Holding Europe AG, Zug, Switzerland)를 미드파필러리 수준으로 측정하였다. 경색 부위의 벽 두께 (WT)와 LV 내부 부위(L Via)를 확장기 마지막(ED)과 수축기 마지막(ES)에 측정하였다. 수축기 벽의 두꺼워짐(SWT)는 [(WT(ES)- WT(ED))ZWT(ED)] * 100% 으로 계산되었으며 프랙셔널 부위 감소(FAS)는 [(LVia(ED)-LVia(ES))/ 로 측정하였다.

Claims (38)

  1. (a) 중간엽 줄기세포(MSC), 이들의 후손 또는 세포 배양배지에서 이들로부터 유래된 세포주를 배양; 및
    (b) 선택적으로 세포 배양 배지를 분리;
    로 구성된 조절화된 세포 배양배지를 제조하는 방법에 있어서,
    상기 중간엽 줄기세포(MSC)는 FGF2를 포함하는 무혈청배지에서 공동배양의 부재시 배아줄기(ES)세포 콜로니 또는 이들의 후손을 분산시켜 수득된 세포를 증식시킴으로써 수득됨을 특징으로 하는 조절화된 세포 배양배지의 제조하는 방법
  2. 제 1항에 있어서, 배아줄기세포 콜로니는 인간 배아줄기세포콜로니(hESC), 바람직하게는 배상체임을 특징으로 하는 방법.
  3. 제 1항 또는 제 2항에 있어서, 배아줄기세포콜로니는 트립신으로 분산됨을 특징으로 하는 방법
  4. 제 1항, 제 2항 또는 제 3항에 있어서, 상기 방법은 세포를 밖으로 플레이트 하기 전에 트립신으로 인간 배아줄기세포(hESC), 바람직하게는 배상체의 융합성 플레이트를 분산시킴을 포함함을 특징으로 하는 방법
  5. 제 1항 내지 제 4항 중 어느 한 항에 있어서, 공동배양의 부재는 영양세포층 없이 세포를 배양하는 것을 포함함을 특징으로 하는 방법
  6. 제 1항 내지 제 5항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 배양 기질, 바람직하게는 젤라틴화된 플레이트 상에서 증식됨을 특징으로 하는 방법
  7. 제 1항 내지 제 6항 중 어느 한 항에 있어서, 무혈청배지는 약 5ng/ml의 농도에서 FGF2를 포함함을 특징으로 하는 방법
  8. 제 1항 내지 제 7항 중 어느 한 항에 있어서, 무혈청배지는: (i) 바람직하게는 약 5ng/ml의 농도에서 PDGF AB, 및 (ii) 바람직하게는 약 5∼10ng/ml의 농도에서 EGF의 하나 또는 모두를 포함함을 특징으로 하는 방법
  9. 제 1항 내지 제 8항 중 어느 한 항에 있어서, 무혈청배지는 혈청 대체 배지로 보충됨을 특징으로 하는 방법
  10. 제 1항 내지 제 9항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 트립신화에 의해 융합시 1 :4 로 분열됨을 특징으로 하는 방법
  11. 제 1항 내지 제 10항 중 어느 한 항에 있어서, 더욱이 세포표면 마커의 발현을 기초로 하여 증식된 세포로부터 중간엽 줄기세포를 선별하는 단계를 포함함을 특징으로 하는 방법
  12. 제 11항에 있어서, 중간엽 줄기세포는: ANPEP(CD13;LAPl;PEPN;gpl50:NM_0Ol150.1); ENG(END;ORW;HHT1;ORW1;CD105:NM_OO0l18.1); SCN9A(PN1;NE-NA:NM_002977.1); TRPV2 (VPvL;VPvLl;VRL-1;MGC12549:NM_016113.3); RAMPl(:NM_005855.1); F2RL2(PAR3:NM_004101.2); NTSRl(NTR:NM_002531.1); GABRA2(:NM_000807.1); SLC16A4(MCT4:NM_004696.1); ITGA4(CD49D:NM_000885.2); NCAM2(NCAM21;MGC51008: NM_004540.2); ILlRl(P80;ILlR;ILlRA;CD121A;D2S1473;IL-lR-alpha:NM_000877.2); PDGFRA(CD140A;PDGFR2:NM_006206.2); VCAMl(INCAM-100:NM_080682.1); SSFA2 (CS1;CS-1;KRAP;SPAG13;KIAA1927:NM_006751.3); TRHDE(PAP-II:NM_013381.1); EDG2 (LPAl;edg-2;vzg-l;Gpcr26;Mrecl.3;rec.l.3:NM_001401.3); NT5E(eN;NT5;NTE;eNT;CD73;E5NT:NM_002526.1); 및 FLRT2(KIAA0405:NM_013231.2); FAP(FAPA;DPPIV;SEPRASE: NM_004460.2)로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 표면 마커의 상승된 발현으로 세포를 선별함으로써 수득됨을 특징으로 하는 방법
  13. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 표면 마커는 CD105를 포함함을 특징으로 하는 방법(수탁번호: NM_OO0l18.1)
  14. 제 11항 또는 제 12항에 있어서, 표면 마커는 CD73을 포함함을 특징으로 하는 방법(수탁번호: NM_002526.1)
  15. 제 11항 내지 제 14항 중 어느 한 항에 있어서, 중간엽 줄기세포는: ITGB1BP3(MIBP:NM_014446.1); PTPRZl(PTPZ;HPTPZ;PTP18;PTPRZ;RPTPB:NM_002851.1); CNTNl(F3;GP135:NM_1 75038.1); PCDHl(PC42;PCDH42;MGC45991:NM_002587.3); PODXL(PCLP;Gp200: NM_005397.2); GPR64(HE6;TM7LN2:NM_005756.1); PROMl(AC133;CD133;PROML1:NM_006017.1); GPRC5C(RAIG3;RAIG-3:NM_022036.2); CD24 (CD24A:NM_013230.1); CLDN3(RVP1;HRVP1;CPE-R2;CPETR2:NM_001306.2); TACSTDl(EGP;KSA;M4Sl;MK-l;EGP40;MIC18;TROPl;Ep-CAM;hEGP-2;CO17-lA;GA733-2:NM_002354.1); HTR3A(HTR3:NM_000869.1); FGFR4(TKF;JTK2:NM_022963.1); ADCYl(: NM_021116.1); FGFR3(ACH;CEK2;JTK4;HSFGFR3EX:NM_022965.1); IL17RB(CRL4;EVI27;IL17BR;IL17RH1;MGC5245:NM_018725.2); SORLl(LRl l;LRP9;SORLA;gp250;SorLA-l:NM_003105.3); GPM6B(M6B:NM_005278.2); KCNS3(KV9.3;MGC9481:NM_002252.3); 및 FZD3 (Fz-3;hFz3:NM_017412.2)로 구성된 군에서 선택된 하나 또는 그 이상의 감소된 발현을 지니는 세포를 선별함으로써 수득됨을 특징으로 하는 방법
  16. 제 11항 내지 제 15항 중 어느 한 항에 있어서, 표면 마커는 CD24를 포함함을 특징으로 하는 방법(수탁번호: NM_013230.1)
  17. 제 11항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 중간엽 줄기세포는 CD 105+ CD24-인 세포에 대해 선별됨으로써 수득됨을 특징으로 하는 방법
  18. 제 11항 내지 제 16항 중 어느 한 항에 있어서, 중간엽 줄기세포는 표면항원에 대항하는 항체로 세포를 표지함으로써 선택되며, 바람직하게는, 형광활성 세포분류기(FACS) 또는 자성세포분류기(MACS)에 의해 선택됨을 특징으로 하는 방법
  19. 제 1항 내지 제 18항 중 어느 한 항에 있어서, 세포는 35 세대보다 적게 계대접종되며, 바람직하게는 세포는 약 14일, 바람직하게는 약 7일 동안 증식됨을 특징으로 하는 방법
  20. 제 1항 내지 제 19항 중 어느 한 항에 있어서, 배아줄기세포(hESC) 콜로니는 huES9 콜로니 또는 Hl ESC 콜로니를 포함함을 특징으로 하는 방법
  21. 제 1항 내지 제 20항 중 어느 한 항에 있어서, 수득된 세포 배양은 huES9.El, huES9.E3 또는 Hl. E2를 포함함을 특징으로 하는 방법
  22. 제 1항 내지 제 21항 중 어느 한 항에 있어서, 조절화된 세포 배지는 하나 또는 그 이상, 바람직하게는 실시예 바람직하게는 실시예 9, 13, 14 또는 14A 중 어느 하나에 개시된 폴리펩티드의 전부를 포함함을 특징으로 하는 방법
  23. 제 1항 내지 제 22항에 따르는 방법에 의해 수득될 수 있는 조절배지
  24. 제 23항에 따르는 조절배지와 함께 약제학적으로 받아들일 수 있는 부형제, 희석제 또는 운반체를 포함하는 의약 성분
  25. 제 23항에 있어서, 질병 치료 방법의 사용에 관한 조절배지
  26. 질병 치료에 대한 의약 성분의 제조에 관한 제 23항의 조절배지의 사용
  27. 개체의 질병 치료의 방법에 관한 제 23항의 조절배지의 사용
  28. 실시예 바람직하게는 실시예 9, 13, 14 또는 14A 중 어느 하나에 개시된 폴리펩티드의 하나 또는 그 이상 또는 이들의 결합, 바람직하게는 대체로 전부를 포함하는 성분
  29. 개체의 질병 치료의 방법에 관한 제 28항의 성분의 사용
  30. 심부전증, 골수 질병, 피부병, 화상 및 당뇨병, 알츠하이머 병, 파킨슨 병 및 암과 같은 퇴행성 질병으로 구성된 군에서 선택된 질병을 위한 제 25항에 따르는 조절배지, 제 26항에 따르는 조절배지의 사용 또는 제 27항 또는 제 29항에 따르는 사용
  31. 심근경색증, 피부 상처, 피부 장애, 피부 손상, 피부염, 건선, 콘딜로마, 사마귀, 혈관종, 켈로이드, 피부암, 아토피피부염, 베체트병, 만성육아종병, 피부 T 세포 림프종, 궤양형성, 섬유증 및 기능의 손실을 포함하는 만성 조직 리모델링을 일으키는 염증 및 면역조절 곤란을 유도하는 초기 손상에 의해 특성화된 병리학적인 상태, 신장 허혈 부상, 낭성섬유증, 축농증 및 비염 또는 정형외과적 질병으로 구성된 군에서 선택된 질병을 위한 제 25항에 따르는 조절배지, 제 26항에 따르는 조절배지의 사용 또는 제 27항 또는 29항에 따르는 사용
  32. 개체의 상처 치료 보조(aid wound healing), 흉터 감소, 골 형성, 골 이식편 또는 골수 이식에 관한 제 23항 또는 제 28항의 조절 배지의 사용
  33. (ⅰ) 하기의 하나 또는 그 이상으로부터 선택된 경로 조절: Rho GTPase에 의한 세포골격 조절, 세포 주기, 인테그린 신호 경로, 케모카인 & 사이토카인 신호 경로에 의해 매개된 염증, FGF 신호 경로, EGF 수용체 신호 경로, 혈관형성, 플라미스노겐 활성 케스케이드, 혈액 응고, 해당작용, 유비퀴틴 프로테아좀 경로, 신생 퓨린 생합성, TCA 회로, 페닐알라닌 생합성, 헴 생합성
    (ii) 하기의 하나 또는 그 이상을 포함하는 과정의 조절:세포 구조 및 운동성, 세포 구조, 세포 커뮤니케이션, 세포 운동성, 세포 유착, 엔도사이토시스, 마이토시스, 엑소사이토시스, 세포질분열, 세포 주기, 면역 및 방어, 사이토카인/케모카인 매개 면역, 대식세포-매개 면역, 과립백혈구-매개 면역, 리간드-매개 신호, 사이토카인 및 케모카인 매개 신호 경로, 신호전달, 세포외 기질 단백질-매개 신호, 성장인자 항상성, 수용체 단백질 티로신 키나아제 신호 경로, 세포 유착-매개 신호, 세포 표면 수용체 매개 신호전달, JAK-STAT 케스케이드, 항산화 및 자유 라 디칼 제거, 항상성, 스트레스성 반응, 혈액응고, 발달과정, 중배엽 발달, 골격 발달, 혈관형성, 근육발달, 근수축, 단백질 대사 및 변이, 단백질 분해, 단백질 접기, 단백질 복합 어셈블리, 아미노산 활성, 세포내 단백질 트래픽, 그 밖의 단백질 타겟팅 및 국소화, 아미노산 대사, 단백질 생합성, 단백질 황화물이성질화효소 반응, 탄수화물 대사, 해당작용, 오탄당-인산 션트(shunt), 그 밖의 다당류 대사, 퓨린 대사, 인산 대사의 조절, 비타민 대사, 아미노산 생합성, 전-mRNA 과정, 유전암호해독 조절, mRNA 스플라이싱
    (ⅲ) 하기의 하나 또는 그 이상을 포함하는 기능의 공급: 신호분자, 케모카인, 성장인자, 사이토카인, 인터루킨, 그 밖의 사이토카인, 세포외 기질, 세포외 기질 구조 단백질, 그 밖의 세포외 기질, 세포외 기질 당단백질, 프로테아제, 메탈로프로테아제, 그 밖의 프로테아제, 프로테아제 저해제, 메탈로프로테아제 저해제, 세린 프로테아제 저해제, 산화환원효소, 탈수소효소, 과산화효소, 샤페론, 샤페로닌, Hsp 70과 샤페론, 그 밖의 샤페론, 합성효소, 신타아제 및 합성효소, 선택 칼슘 결합 단백질, 아미노아실-tRNA 합성효소, 분해효소, 이성화효소, 그 밖의 이성화효소, ATP 신타아제, 수화효소, 아미노전이효소, 그 밖의 분해쇼소, 그 밖의 효소 조절자, 선택 조절 분자, 액틴 결합 세포결합 단백질, 세포결합 단백질, 비-운동 액틴 결합 단백질, 액틴 및 액틴 관련된 단백질, 아넥신, 튜불린, 세포 유착 분자, 액틴 결합 운동 단백질, 매개 필라멘트, 리보핵산단백질, 라이보솜 단백질, 유전암호해독 인자, 그 밖의 RNA- 결합 단백질, 히스톤, 칼모듈린 관련된 단백질, 소낭 코트 단백질(vesicle coat protein)을 위한 제 23항 또는 제 28항의 조절배지의 사용
  34. 제 23항 또는 제 28항의 조절배지의 원재료와 함께 타겟으로 조절배지를 운송시키는 것이 가능한 디스펜서를 포함하는 조절배지 전달에 관한 전달체계
  35. 타겟으로 조절배지를 운송시키는 방법에 관한 제 34항의 전달체계의 사용
  36. 참고문헌으로 상기에서 기술되며, 첨부된 도면의 도 1 내지 도 11에 나타난 바와 같은 조절화된 세포 배지를 제조하는 방법
  37. 참고문헌으로 상기에서 기술되며, 첨부된 도면의 도 1 내지 도 11에 나타난 바와 같은 조절화된 세포 배지
  38. 참고문헌으로 상기에서 기술되며, 첨부된 도면의 도 1 내지 도 11에 나타난 바와 같은 조절화된 세포 배지의 사용
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