KR20090023621A - 9-하이드록시 엘립티신 유도체를 이용한 악성 표현형의 복구 - Google Patents

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KR20090023621A
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크리스티안 오클레어
발레리 폴라드
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비오알리앙스 파르마
에꼴 노말르 수뻬리에르 드 까샹
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Abstract

본 발명은 암 치료를 위한 9-하이드록시 엘립티신 유도체의 농도에 관한 것이다. 9-하이드록시 엘립티신 유도체는 전이성 암 또는 전형적인 세포독성 화학요법을 회피하는 종양의 치료에 특히 유용할 수 있다.
9-하이드록시 엘립티신 유도체, 항암제, 악성 표현형

Description

9-하이드록시 엘립티신 유도체를 이용한 악성 표현형의 복구 {REVERSION OF MALIGNANT PHENOTYPE WITH 9-HYDROXY ELLIPTICINE DERIVATIVES}
이 출원은 2006년 8월 21일에 출원한 미국 가출원 제 60/838,860호를 우선권으로 하면, 상기 미국 출원은 원용에 의해 그 전문이 본 명세서에 포함된다.
본 발명은 암 치료를 위한 9-하이드록시 엘립티신 유도체의 용도에 관한 것이다. 상기 9-하이드록시 엘립티신 유도체는 전이암 또는 전형적인 세포독성 화학요법을 회피하는 종양의 치료에 특히 유용할 수 있다.
비종양 세포에서, 세포외 기질 및 주변 세포로의 부착은 세포 생존, 성장, 분화 및 운동성에 중요한 역할을 한다 (K.A. Beningo et al., J. Cell Biol. 153 (2001), pp. 881-888; S.M. Frisch and R.A. Screaton, Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2001), pp. 555-562 and F.M. Watt, EMBO J. 21 (2002), pp. 3919-3926). 종양 형질전환(oncogenic transformation)에 따라, 세포 운동성 및 성장 인자- 또는 부착-의존성 세포 증식에서, 세포 형태 및 세포골격의 조직에 큰 변화가 일어난다 (G. Pawlak and D.M. Helfman, Curr. Opin. Genet. Dev. 11 (2001), pp. 41-47을 참조함). 액틴 세포골격의 붕괴 및 국소 부착(focal adhesion) 빈도의 동반 감소가, 다양한 종양유전자에 의해 유도되는 세포 형질전환에 수반되는 일반적인 특성 이다. 형질전환된 세포에서 관찰되는 비부착 증식(anchorage-independent growth) 및 발암성과 액틴 섬유 네트워크의 재배열 간의 관련성은, 액틴 세포골격이 종양에서 필수적인 역할을 한다는 것을 시사한다 (P. Kahn et al., Cytogenet. Cell Genet. 36 (1983), pp. 605-611). 부착성 상호작용은, 연접 플라크 단백질을 통해 세포골격에 연결되는 특정 막관통 수용체에 영향을 미친다 (Nagafuchi, Curr. Opin. Cell Biol. 13 (2001), pp. 600-603 참조). α-액티닌, 빈쿨린(vinculin), 트로포미오신(tropomyosin) 및 프로필린(profilin)을 포함하는 몇몇 액틴-결합 단백질의 합성이 형질전환 세포에서 저하되며, 종양 세포에서 이들 단백질의 과발현은 형질전환 표현형을 억제하여, 상기 단백질들이 종양 억제자로 인식되도록 한다.
엘립티신은 하기 식 (I)을 가지는, 협죽도과(Apocynaceae)의 상록수에서 분리된 천연 식물 알칼로이드 산물이다:
Figure 112008087888607-PCT00001
엘립티신은 세포독성 및 항암 활성을 가지는 것으로 확인되었다 (Dalton et al., Aust. J. Chem.,1967. 20, 2715).
9번 위치에서 하이드록실화된 엘립티신 유도체 (9-하이드록시엘립티시늄)가 다수의 종양 실험에서 엘립티신보다 더 큰 항암 활성을 가지는 것으로 밝혀졌지만 (Le Pecq et al., Proc. Natl. Acad, Sci., USA, 1974, 71, 5078-5082), 인간 암의 치료에서는 제한된 활성만을 나타내는 것으로 알려져 있다 (Le Pecq et al., Cancer Res., 1976, 36, 3067).
인간 치료에 적합한 엘립티신 유도체를 확인하기 위해 수행된 연구의 결과로서, 일부 인간 암, 특히 유방암의 골 전이의 치료에 사용되는 셀립튬(셀립튬), 또는 N2-메틸-9-하이드록시엘립티시늄 (NMHE)을 제조하기에 이르렀다.
따라서 하기 식 (II)를 가진, 9-하이드록시 엘립티신에서 유래된 일련의 화합물이 개발되었다:
Figure 112008087888607-PCT00002
상기 식에서, R 및 R1은 수소 또는 알킬기이고, R2는 선택적으로 치환된 알킬기이며, X-은 4차(quaternizing) 음이온이다. 이 화합물들은 미국 특허 제4,310,667호에 기재되어 있다.
상기 화합물의 2차원적 다환 구조는 DNA 삽입을 통하여 DNA와 상호작용하는 것으로 밝혀졌다. 또한, 이들 화합물은 DNA 결합, 산화성 산소종의 생성 및 효소, 특히 토포아이소머라제 II 및 텔로메라제 기능의 변형을 포함하는 다양한 작용에 적용될 수 있는 것으로 밝혀졌다 (예컨대, Auclair, 1987, Achives of Biochemistry and Biophysics, 259, 1-14 참조).
약리학적으로, 많은 독성 부작용이 문제를 일으키는 것으로 알려져 있다. 특히 셀립튬(셀립튬)은 신 독성을 유발하는 것으로 밝혀졌다. 그러나, 2-(디에틸아미노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄-클로라이드와 같은 일부 엘립티신 유도체 (Auclair et al., 1987, Cancer Research, 47, 6254-6261)는 동물에서 항암 활성 및 개선된 안정성을 가지는 것으로 확인되었다. 비록 2-(디에틸아미노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄-클로라이드의 개선된 특성으로 임상 I 시험을 수행하기에 이르렀으나, 그 후 이 화합물의 개발이 포기되었다.
2-(디에틸아미노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 아세테이트, 2-(디이소프로필아미노-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 아세테이트 및 2-(베타 피페리디노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄과 같은 다른 9-하이드록시 엘립티신 유도체가 미국 특허 제4,310,667호에 예시되어 있다.
인간 암에 효과적이면서 제한된 독성 부작용을 가진 약물의 개발은 여전히 필요하다. 특히 비-독성 과정을 통하여 주로 작용하는 항암제를 확인하기 위한 시도가 계속되고 있다. 개발 분야에서 본 발명자들은, 암 진행의 기초가 되는 주된 분자적 메카니즘 중 하나인, 세포 표현형, 더욱 특히 세포골격 구조의 변화가 지속적으로 개발의 표적이 될 수 있다고 가정하였다.
본 발명자들은 예상치 못하게도 제한된 수의 9-하이드록시 엘립티신 유도체가, 액틴 네트워크 재배열을 유도하여, 부착성의 구제(rescue) 및 운동성 조절로 인해서 암 세포의 표현형의 복구를 유도하는 비-세포독성 과정(즉, 세포의 생물학적 손상과 직접적으로 연관되지 않은 과정)에 의하여 조절되는, 항암 활성을 가진다는 점을 증명하였다. 또한, 표현형의 복구가 비-세포독성 농도, 즉, 세포 증식 및 세포 생존 모두에 심각한 영향을 초래하지 않는 농도로 달성된다.
따라서, 본 발명자들에 의해 확인된 9-하이드록시 엘립티신 유도체는 주로 비-세포독성 과정을 통하여 작용하는 항암제로서 제공된다.
엘립티신 유도체
비-세포독성 농도에서 악성 표현형의 복구를 유도하는 것으로 확인된, 선택적으로 산 부가염의 형태인, 9-하이드록시 엘립티신 유도체는 하기 식(III)을 가진다:
Figure 112008087888607-PCT00003
상기 식에서,
X는 OH, NRR', CN, OR, COOR(여기서, R 및 R'은 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬기임)에 의해 선택적으로 치환되고, 선택적으로 측쇄형인, 2 또는 3개의 탄소원자를 가지는 알킬기이고;
Y는 -NR1R2이며, 여기서 R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬기이거나, R1 및 R2는 연결된 N 원자와 함께 포화 또는 불포화 5- 또는 6-원 헤테로사이클을 형성하고, -NR1R2는 약제학적으로 허용되는 무기 또는 유기산의 부가로부터 생성된 4급 암모늄염 형태를 이룰 수 있어, 식 (I)의 화합물은 산 부가염 형태일 수 있으며;
또는 Y는 벤질, 페닐 또는 C5 또는 C6 아릴 또는 5- 또는 6-헤테로아릴 기이고;
Z-는 약제학적으로 허용되는 무기 또는 유기산의 음이온이며;
-X-Y 측쇄는 필요에 따라 T, U, V 또는 W 중 하나에 결합되고;
T, U, V 및 W는 C 원자 또는 N 원자로서, 피리딜 환을 형성하며, 나머지 T, U, V 및/또는 W는 C 원자이고,
단 -X-Y 측쇄는 N 원자를 나타내는 T, U, V 및 W 중 하나에 결합하며,
Figure 112008087888607-PCT00004
는 필요에 따라 단일결합 또는 이중결합을 나타내어, 그 결과 융합 피리딜 환으로 형성된 시스템은 방향성이며, 양이온
Figure 112008087888607-PCT00005
또는
Figure 112008087888607-PCT00006
이 생성되는 것으로 이해된다.
한 구현예에 따라, 본 발명의 9-하이드록시 엘립티신 유도체는 하기 식 (IV)를 가진다:
Figure 112008087888607-PCT00007
상기 식에서,
X는 OH, NRR', CN, OR, COOR(여기서, R 및 R'은 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬기임)에 의해 선택적으로 치환되고, 선택적으로 측쇄형인, 2 또는 3개의 탄소원자를 가지는 알킬기이고;
Y는 -NR1R2이며, 여기서 R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬기이거나, R1 및 R2는 연결된 N 원자와 함께 포화 또는 불포화 5- 또는 6-원 헤테로사이클을 형성하고, -NR1R2는 약제학적으로 허용되는 무기 또는 유기산의 부가염으로부터 생성된 4급 암모늄염 형태를 이룰 수 있어, 식 (I)의 화합물은 산 부가염 형태일 수 있으며;
또는 Y는 벤질, 페닐 또는 C5 또는 C6 아릴 또는 5- 또는 6-헤테로아릴 기이고;
Z-는 약제학적으로 허용되는 무기 또는 유기산의 음이온이다.
본 명세서에서, "알킬"은 약 1 내지 20개의 탄소원자를 가지는 직쇄 또는 측쇄형일 수 있는 지방족 탄화수소기를 의미한다. 바람직한 알킬기는 1 내지 약 12개의 탄소원자, 더욱 바람직하게는 1 내지 6개의 탄소원자를 가진다. 측쇄형은 메틸, 에틸 또는 프로필과 같은 저급 알킬이 직쇄형 알킬쇄에 결합된 형태를 의미한다. ≪저급 알킬≫은 직쇄형 또는 측쇄형일 수 있는 쇄에 약 1 내지 약 4개의 탄소원자를 가지는 것을 의미한다. 알킬은 예를 들어, 할로, 사이클로알킬, 하이드록시, 알콕시, 아미노, 아실아미노, 아로일(aroyl)아미노, 카르복시를 포함하는, 동일하거나 상이한 하나 이상의 ≪알킬 치환기≫로 치환될 수 있다.
"아릴"은 약 5 내지 약 14개의 탄소원자, 바람직하게는 약 6 내지 약 10개의 탄소원자의 방향족 모노사이클 또는 멀티사이클 환 시스템을 의미한다. 아릴은 본 명세서에 정의된 동일하거나 상이한 하나 이상의 치환기로 선택적으로 치환될 수 있다. 아릴기의 예는 페닐 또는 나프틸, 또는 치환된 페닐 또는 치환된 나프틸을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "헤테로아릴"은 하나의 수소 원자를 제거하여 형성된, 5 내지 14, 바람직하게는 5 내지 10 원 방향족 헤테로, 모노-, 바이- 또는 멀티사이클 환을 의미한다. 그 예는 피롤릴, 피리딜, 피라졸릴, 티에닐, 피리미디닐, 피라지닐, 테트라졸릴, 인돌릴, 퀴놀리닐, 퓨리닐, 이미다졸릴, 티에닐, 티아졸릴, 벤조티아졸릴, 퓨라닐, 벤조퓨라닐, 1,2,4-티아디아졸릴, 이소티아졸릴, 트리아조일, 테트라졸릴, 이소퀴놀릴, 벤조티에닐, 이소벤조퓨릴, 피라졸릴, 카르바졸릴, 벤즈이미다졸릴, 이속사졸릴 등을 포함한다.
"약제학적으로 허용되는"은 정상적인 의학적 판단 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알러지 반응 등을 유발하지 않고, 인간 및 하등 동물의 세포와 접촉시키기에 적합하고, 합리적인 이익/위험 비율을 만족시키는 것을 의미한다.
약제학적으로 허용되는 무기 또는 유기산은 염산, 브롬화수소산, 요오드화수소산, 황산, 인산, 헥사플루오로인산, 질산, 탄산, 시트르산, 살리실산, 메탄설폰산, 아세트산, 옥살산, 말레산, 푸말산, 숙신산, 타르트르산, 아스파르트산, 글루탐산, 락트산, 말론산, 벤조산, 사이클로헥산설팜산, 및 신남산으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있다 (예를 들어 S. M. Berge, et al., ≪Pharmaceutical Salts,≫J. Pharm. Sci., 66: p.1-19 (1977) 참조). 상기 식 (III) 및 (IV)에서:
- Z-는 상기 산 유래의 대응되는 1차(single charged) 음이온이다.
바람직하게는, 상기 식 (III) 및 (IV)에서, Z-는 메탄설포네이트(또는 메실레이트, CH3SO3 -라고도 칭함); 및 부가적으로
- -NR1R2는 상기 정의된 약제학적으로 허용되는 무기 또는 유기산, 바람직하게는 메탄설폰산의 추가에 의해 생성되는 4급 암모늄염 형태일 수 있으며, 그 결과 식 (I)의 화합물은 2개의 양전하를 가질 수 있다.
상기 9-하이드록시 엘립티신 유도체에서, X는 바람직하게는 에틸 또는 프로필이다.
Y가 아릴기일 때, Y는 피리딘 및 피리미딘으로 이루어진 군으로부터 바람직하게 선택될 수 있다.
Y가 -NR1R2일 때, 바람직하게는, R1 및 R2 각각이 에틸기일 수 있거나, Y는 피페리딘 또는 피롤리딘기일 수 있다.
특정 구현예에 따라, X는 에틸이고 Y는 디에틸아미노, 피롤리디닐, 벤질, 페닐, 피페리딘, 피리딘 및 피리미딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
또한 특정 구현예에서, X는 프로필이고 Y는 디에틸아미노, 피롤리디닐, 벤질, 페닐, 피페리딘, 피리딘 및 피리미딘으로 이루어진 군으로부터 선택된다.
바람직한 9-하이드록시 엘립티신 유도체는 다음과 같다:
Figure 112008087888607-PCT00008
및
Figure 112008087888607-PCT00009
및 이들로부터 생성된 4급 암모늄염으로서,
상기 식에서 Z-는 상기 1차 음이온으로부터 선택된다.
더욱 구체적으로, 본 발명에서 사용할 목적으로, 9-하이드록시 엘립티신 유도체는 2-(디에틸아미노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 클로라이드, 2-(디에틸아미노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 메탄설포네이트, 2-(베타 피페리디노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 클로라이드, 2-(베타 피페리디노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 메탄설포네이트 및 이들로부터 생성된 4급 암모늄염일 수 있다.
또한, 바람직한 9-하이드록시 엘립티신 유도체는 2-(디에틸아미노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 메탄설포네이트, 2-(베타 피페리디노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 클로라이드, 및 2-(베타 피페리디노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 메탄설포네이트 및 이들로부터 생성된 4급 암모늄염일 수 있다.
더욱 바람직하게는, 본 발명에 따른 9-하이드록시 엘립티신 유도체는
Figure 112008087888607-PCT00010
이다.
9-하이드록시 엘립티신 유도체를 제조하는 방법은 예를 들어 미국 특허 제4,310,667호에 기재되어 있다.
치료 방법
상기 9-하이드록시 엘립티신 유도체는 암 세포에서 액틴 세포골격의 리모델링을 유도하여, 세포 운동성의 감소와 세포 부착성의 회복을 일으킨다. 이 과정은, TCL 독성 효과를 포함할 가능성이 있는 숙주의 면역반응을 궁극적으로 포함하는, 다양한 메커니즘으로부터 생체내에서 암 세포의 선택적인 아폽토시스를 유발한다.
따라서, 본 발명은, 암 치료를 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 식 (III) 또는 (IV)의 9-하이드록시 엘립티신 유도체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 정의된 9-하이드록시 엘립티신 유도체의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, 암 세포의 형질전환된 표현형을 복구함으로써, 암을 치료하는 방법에 관한 것이다. 그러나, 이러한 용도 및 방법에서, 바람직하게는 9-하이드록시 엘립티신 유도체는 2-(디에틸아미노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 클로라이드, 2-(디에틸아미노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 아세테이트, 2-(디이소프로필아미노-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 아세테이트, 또는 2-(베타 피페리디노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 아세테이트가 아니다.
본 발명은 또한 암 세포의 형질전환된 표현형을 복구하기 위한 의약의 제조에 사용하기 위한 식 (III) 또는 (IV)의 9-하이드록시 엘립티신 유도체의 용도에 관한 것이다. 본 발명은 또한, 상기 정의된 9-하이드록시 엘립티신 유도체의 치료학적 유효량을 이를 필요로 하는 개체에 투여하는 것을 포함하는, 암 세포의 형질전환된 표현형을 복구하는 방법에 관한 것이다.
본 명세서에서, 용어 "개체"는 설치류, 고양이류, 견치류, 및 영장류와 같은 포유동물을 의미한다. 바람직하게는 본 발명에 따른 개체는 인간이다.
본 명세서에서, 용어 "치료하는" 또는 "치료"는 질병 또는 그러한 용어가 적용되는 상태, 또는 그러한 질병 또는 상태의 하나 이상의 증상을 예방 또는 그의 진행을 저해, 복구, 또는 경감하는 것을 의미한다.
"치료학적 유효량"은 특정 질병 또는 질환의 증상을 경감시키는데 충분한 화합물의 양을 의미한다. 바람직하게는, 본 발명의 치료 방법은, 9-하이드록시 엘립티신 유도체의 비-세포독성량, 즉, 세포 증식 및 세포 생존 모두에 유의한 작용을 나타내지 않는 농도로 수행될 수 있다.
본 명세서에서, 용어 "형질전환된 표현형(transformed phenotype)"은 (i) 세포 형태, 및/또는 (ii) 세포골격의 조직, 및/또는 (iii) 세포 운동성 및/또는 (iv) 성장인자- 또는 부착-의존성 세포 증식에서 일어날 수 있는 변화를 의미한다. 상기 형질전환된 표현형은 암 세포의 특징이다.
세포 형태상의 변화의 예는 더욱 원형인 모양, 감소된 세포질 확장, 감소된 침범부(spreading area), 및 감소된 세포/세포 접촉을 나타내는 세포를 포함한다. 세포골격의 조직상의 변화는, 특히, 일반적으로 국소 부착수의 동반 감소와 관련이 있는 액틴 세포골격의 붕괴일 수 있다.
"암 세포의 형질전환된 표현형의 복구(reversing)"는 암 세포를 정상적인 (즉, 비-종양성) 세포의 표현형으로 복구시키는 것을 의미한다. 9-하이드록시 엘립티신 유도체에 의한 형질전환된 표현형의 복구는 특히 액틴 네트워크 재배열에 의해 유도된다.
형질전환된 표현형의 복구는 당해 분야에서 이미 공지된 분석 방법을 이용하여 당업자에 의해 평가될 수 있다.
이 방법은 예를 들어 다음을 포함한다:
- 반고체 또는 반고형 한천 성장 분석 (클론원성 분석);
- 세포 운동성 분석;
- 국제 특허 출원 제2004/057337호에 개시된 바와 같은, 세포 용해질에서 고정적으로 중합된 액틴의 측정 방법. 이 방법은 암 공격성의 지표를 포함한다. 요약하면, 이 방법은 비 변성 상태에서 세포를 용해시키는 단계, 상기 용해물의 총 단백질 농도를 조절하는 단계, 내인성 액틴의 중합에 필요한 성분(예를 들어, ATP) 및 형광 표지된 액틴 모노머를 추가하는 단계, 및 중합된 액틴을 측정하는 단계를 포함한다.
- 통상적인 방법으로 현미경 관찰에 따라, 액틴, 자이신(zyxin), 액티닌 또는 B-카테닌 표지에 의한 세포의 형태적 변화 및 세포골격 조직화의 평가.
본 발명에 따른 의약 또는 방법은 암 세포의 선택적인 아폽토시스를 유도하여 비-세포독성 암 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따라, 암 세포는 임의의 암, 예컨대, 1차 또는 전이성 암, 고형암 또는 연조직 암, 또는 백혈병 유래의 세포일 수 있다. 고형 또는 연조직 암세포의 예는 대장, 유방, 골격, 뇌, 척수, 결장, 자궁내막, 신장, 간, 폐, 신경계, 난소, 전립선, 고환, 갑상선, 자궁, 췌장 및 피부 암세포를 포함한다. 백혈병은 예를 들어 만성 골수증식성 질환, 골수형성이상 증상, 급성 비-림프성 백혈병, B-세포 급성 림프성 백혈병, T-세포 급성 림프성 백혈병, 비-호지킨 림프종, 및 만성 림프증식성 질환을 포함한다.
9-하이드록시 엘립티신 유도체에 가장 반응성인 것으로 기대되는 암 세포는, 전이의 초기 단계에서 발생하는 표피-간엽성 변이 단계와 공격성 육종에서 관찰될 수 있는, 세포골격 파괴, 증가된 세포 운동성 및/또는 감소된 세포-세포 부착성과 관련된 침습성 표현형을 특징으로 한다.
세포의 악성 표현형을 복구하는 본 발명 화합물의 능력에 의해, 본 명세서에 기재된 9-하이드록시 엘립티신 유도체가 진정한 비-침습적 물질을 구성하게 된다는 점이 본 발명의 이점이다. 그래서, 일 구현예에서, 암 세포는 전이성 세포이다. 따라서, 본 발명에 따른 의약 또는 방법은 전이의 치료에 사용될 수 있다.
더욱이, 본 명세서에서 정의된 9-하이드록시 엘립티신 유도체는 비 세포독성 과정에 의해 조절되는 항암 활성을 가진다. 이들 화합물은, DNA 결합제, 특히, 알킬화제 또는 중격제(intercalating drug), DNA 폴리머라제 저해제와 같은 대사길항물질, 또는 토포아이소머라제 I 또는 II 저해제와 같은 DNA 복제 저해제와 함께, 또는 알칼로이드와 같은 항-분열유발제(mitogenic agent)와 함께, 전형적인 세포독성 화학요법을 회피하는 개체의 암을 치료하기 위해 바람직하게 투여될 수 있다. 이들 세포독성 화합물들은 예를 들어, 액티노마이신 D, 아드리아마이신, 블레오마이신, 카르보플라틴, 시스플라틴, 클로르암부실, 사이클로포스파미드, 독소루비신, 에토포사이드, 5-플루오로우라실, 6-메르캅토퓨린 멜팔란, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 탁소텔, 빈블라스틴, 및 빈크리스틴을 포함한다.
본 명세서에서, 용어 "세포독성 화학요법을 회피하는 개체(subjet escaping cytotoxic chemotherapy)"는 특히 세포독성 화학요법이 암 진행을 변화시키지 않는 개체를 의미한다.
본 명세서에서 정의된 하나 이상의 9-하이드록시 엘립티신 유도체는 치료되는 개체에 연속적이거나 동시에 투여될 수 있다.
또한, 상기 9-하이드록시 엘립티신 유도체는 분화 물질(differentiating agent), 특히 비타민 A, 그의 합성 유사체, 및 대사산물(레티노이드), 비타민 D 또는 그의 유사체, 또는 퍼옥시좀 증식자-활성 수용체 (PPAR) 리간드와 함께 조합하여 (즉, 동시에 또는 연속적으로) 투여될 수 있다.
레티노이드는 예를 들어, all-트랜스레티노산 (ATRA), N-(4-하이드록시페닐) 레틴아미드 (4HPR), 13-시스-레티노산 (13-CRA), 또는 9-시스-레티노산 (9-CRA)일 수 있다.
비타민 D 또는 그의 유사체는 특히, 비타민 D3로부터 정상적으로 형성된 디하이드록시화 대사산물인 25-디하이드록시비타민 D3 (1,25-(OH)2 D3), 또는 1알파-하이드록시-비타민 D3, 1알파-하이드록시비타민 D2, 1알파-하이드록시비타민 D5, 플루오르화 비타민 D 유도체를 포함한다.
PPAR 리간드는 특히 PPARα 또는 PPARγ 활성제이다. 선택적인 PPARγ작용제는 전형적인 TZDs (트로글리타존, 로시글리타존, 피오글리타존 및 시글리티존(ciglitizone); Forman et al., 1995, Cell, 83:803-812; Lehmann et al., 1995, J. Biol. Chem. 270:12953-12956 참조) 및 비-TZD-타입 작용제를 포함한다. 후자의 대표적인 예는 현재까지 확인된 가장 강력하고 선택적인 PPARγ작용제에 속하는, GW 1929, GI 262570, 및 GW 7845와 같은 N-(2-벤조일페닐)-L-타이로신 유도체를 포함한다 (Henke et al., 1998, J. Med. Chem., 41:5020-5036; Cobb et al., 1998, J. Med. Chem., 41:5055-5069 참조). GW 0207, 즉, 2,3-이치환된(disubstituted) 인돌-5-카르복실산도 강력하고 선택적인 PPARγ작용제이다 (Henke et al., 1999, Bioorg. Med. Chem. Lett., 9:3329-3334). 피브레이트 또는 파르네솔(farnesol)은 PPARα작용제의 예이다.
따라서, 본 발명에서 유용한 9-하이드록시 엘립티신 유도체는 다른 치료 화합물과 혼합되어 (희석제 또는 담체와 함께 또는 없이) 약제학적 조성물을 형성할 수 있고, 투여되었을 때, 활성 성분과 동시에 조합하여 투여되어 본 발명의 조합 요법을 제공한다. 특히 본 발명은 식 (III) 또는 (IV)의 9-하이드록시 엘립티신 유도체 및 상기 정의된 분화 물질을 포함하는 약제학적 조성물을 제공한다.
동시 투여 이외에, 본 발명에서 유용한 9-하이드록시 엘립티신 유도체는 또한, 다른 치료 화합물, 특히 상기 정의된 분화 물질과 별개로 또는 순차적으로 투여될 수 있다. 따라서, 본 발명은, 암 치료, 특히 암 세포의 형질전환된 표현형의 복구를 위해 동시에, 별개로 또는 순차적으로 사용되는 조합된 제제로서, 식 (III) 또는 (IV)의 9-하이드록시 엘립티신 유도체, 및 분화 물질을 포함하는 제품을 추가로 제공한다.
9-하이드록시 엘립티신 유도체는 단독으로 투여될 수 있지만, 바람직하게는 상기 유도체는 약제학적 조성물로서 존재한다. 본 발명에 따른 수의과 및 인간용 약제학적 조성물은 하나 이상의 약제학적으로 허용되는 담체와 함께, 상기 정의된 적어도 하나의 9-하이드록시 엘립티신 유도체, 및 선택적으로 다른 치료 성분을 포함한다.
특정 구현예에서, 조합 치료에 필요한 활성 성분은 동시 투여를 위한 약제학적 단일 조성물과 조합될 수 있다.
본 명세서에서, 조성물, 담체, 희석제 및 용제에 사용되는 용어 "약제학적으로 허용되는" 및 그의 유사어는 서로 호환되어 사용되며, 구역, 어지럼증, 급성위연동이상항진 등과 같은 생리적 부작용 없이 포유동물에 또는 포유동물 상에 투여될 수 있는 물질을 나타낸다.
활성 성분이 용해 또는 분산된 형태로 포함된 약리학적 조성물의 제조는 당업자가 용이하게 알 수 있으며, 제형을 기초로 제한될 필요는 없다. 일반적으로 그러한 조성물은 액체 용액 또는 현탁제와 같은 주입가능한 형태로 제조되나, 사용에 앞서, 액상인 용액 또는 현탁제에 적합한 고형으로 제조될 수 있다. 제제는 또한 에멀젼화될 수 있다. 특히, 약제학적 조성물은 고형 투여형태, 예를 들어, 캡슐제, 정제, 환제, 산제, 당의정 또는 과립제로 제형화될 수 있다.
비히클의 선택 및 비히클 중에 활성 성분의 함량은, 활성 화합물의 용해성 및 화학적 특성, 투여의 특정 형태 및 약제학적 실시에서 준수되어야 할 규정에 따라 일반적으로 결정된다. 예를 들어, 락토스, 소듐 시트레이트, 칼슘 카르보네이트, 디칼슘 포스페이트와 같은 부형제 및 전분, 알긴산 및 특정 복합체 실리케이트와 같은 붕괴제가, 마그네슘 스테아레이트, 소듐 라우릴 설페이트 및 탈크와 같은 활택제와 조합하여, 정제의 제조에 사용될 수 있다. 캡슐제를 제조하기 위해서는, 락토스 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜을 사용하는 것이 바람직하다. 수성 현탁제가 사용되는 경우, 현탁제들은 유화제 또는 현탁을 용이하게 만드는 물질을 포함할 수 있다. 슈크로스, 에탄올, 폴리에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜, 글리세롤 및 클로로포름 또는 그의 혼합물과 같은 희석제가 또한 사용될 수 있다.
본 발명의 약제학적 조성물은 경구, 직장, 경비, 협측, 설하, 질내, 비경구 (피하, 근육내, 정맥내, 진피내, 경막내 및 경막외를 포함), 수조내(intracisternal) 및 복강내 경로를 포함하는 국소 또는 전신 투여에 의해 인간 및 동물에 적합한 제형으로 투여될 수 있다. 바람직한 경로는 예를 들어 수용자의 상태에 따라 달라질 수 있는 것으로 이해딜 것이다.
제형은 약학 분야에서 공지된 임의의 방법에 따라 단위 투여형으로 제조될 수 있다. 그러한 방법은, 활성 성분을 하나 이상의 부수적 성분을 구성하는 담체와 연합하는 단계를 포함한다. 통상 제형은, 활성 성분을 액체 담체 또는 미세하게 분해된 고체 담체, 또는 그 둘 모두와 함께 균일하고 밀접하게 연합하고, 필요에 따라, 제품의 형태를 만들어, 제조된다.
개체에 일회량 또는 분리된 양으로 투여되는 9-하이드록시 엘립티신 유도체의 1일 총투여량은 예를 들어, 1일 체중당 약 0.001 내지 약 100 mg/kg, 바람직하게는 0.01 내지 10 mg/kg/day, 더욱 바람직하게는 0.01 내지 1 mg/kg/day, 특히 0.1 내지 1 mg/kg/day, 또는 1 내지 10 mg/kg/day이 바람직하다. 1일 투여량의 예는 0.05 mg/kg, 0.125 mg/kg, 0.25 mg/kg, 0.5 mg/kg, 1 mg/kg, 1.25 mg/kg, 2.5 mg/kg, 5 mg/kg, 및 10 mg/kg이다. 단위 투여 조성물은 1회 투여량을 만다는데 사용될 수 있도록, 약수(submultiple) 양을 포함할 수 있다. 그러나, 임의의 특정 환자에 대한 특정 용량 수준은 체중, 일반적인 건강, 성, 식이, 시간 및 투여 경로, 흡수 및 배설률, 다른 약물과의 병용 및 치료되는 특정 질환의 중증도에 따라 변화될 수 있다.
본 발명은 하기 실시예에서 예를 들어 설명될 것이다.
도 1은 BA016DD537 (2-(β-피페리디노에틸)-9-하이드록시엘립티시늄 클로라이드)의 구조를 도시한 것이다.
도 2는 NIH 3T3 EF 추출물에서, BA016DD537에 의한 시간에 따른 액틴 안정화를 나타낸 것이다. BA016DD537는 중합 완충액 및 NIH 3T3 EF 추출물과 함께 0시간 에서 추가되었다. 반응 혼합물은 다음의 표시된 농도에서 BA016DD537을 포함하였다: 100 nM BA016DD537 (▲), 200nM BA016DD537 (◆), 대조 악성 NIH 3T3 EF 세포 (▼), 대조 정상 NIH 3T3 세포 (■). 데이터는 평균 표준편차 n = 3을 나타낸다.
도 3은 NIH 3T3 EF 추출물에서, 100 nM BA016DD537 (◆), 200 nM BA016CA107 (□) 및 200 nM BA016CA77 (*)에 의한 시간에 따른 액틴 안정화를 나타낸 것이다. 상기 약물은 중합 완충액 및 NIH 3T3 EF 추출물과 함께 0시간에서 추가되었다. 대조 악성 NIH 3T3 EF 세포 (△), 대조 정상 NIH 3T3 세포 (○)도 나타내었다. 데이터는 평균 표준편차 n = 3을 나타낸다.
도 4는 대조군 NIH 3T3 세포과 비교하여, BA016DD537 처리 또는 비처리된, NIH 3T3 EF 세포에서 액틴 섬유의 형광 현미경 시험 결과를 도시한 것이다. BA016DD537는 형질전환된 NIH 3T3 EF 세포에서 액틴 섬유를 증가시킨다. 정상 및 악성 NIH 3T3 세포는, 액틴 미세섬유를 가시화하기 위하여 FITC-팔로이딘를 사용하고, 핵을 가시화하기 위하여 Dapi를 사용하여, in situ 면역형광에 의해 분석되었다. (A) 대조 악성 NIH 3T3 EF 세포; (B) 대조 정상 NIH 3T3 세포　; (C) 100 nM BA016DD537로 처리된 악성 NIH 3T3 EF 세포; (D) 200 nM BA016DD537로 처리된 악성 NIH 3T3 EF 세포.
도 5는 BA016FZ539 (2-(베타 피페리디노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 메탄설포네이트)로 처리된 MIA PaCa-2 세포의 형태적 변화를 보여준다. A: 대조군, B: 3일간 4μM의 BA016FZ539로 처리한 세포 (x200).
도 6은 13CRA 및 ATRA의 존재 및 부재 하에서 BA016DD537 (2-(베타 피페리디 노-2-에틸)-9-하이드록시엘립티시늄 클로라이드)으로 처리한 B16BL6 세포의 증식성 시험 결과를 나타낸 것이다. 사용된 레티노산의 농도는 10 nM로 고정시켰다.
실시예 1: 액틴 동태( dynamics )의 조절
액틴 동태는 F-액틴 내지 G-액틴 비율의 감소를 수반하여, 암 세포를 손상시키는 것으로 알려져 있다. 액틴 동태는, F-액틴 신장의 속도상수 (k) 및 F-액틴의 항정상태 농도 (△ mA)를 입수할 수 있는, 형광 이방성(anisotropy) 분석을 이용하여 암 세포 추출물에서 측정되었다.
재료 및 방법:
모든 반응은 22℃에서 수행되었고, 형광 이방성 신호는, Beacon 2000 (Panvera) 중에서, 490 nm에서 여기 상태이고, 520 nm에서 회복되었다. 알렉타(Alexa) 488 액틴 (분자 프로브)은, Beckman L5-50B 초원심분리기로, 4℃에서 2시간 동안 35 000 rpm에서 원심분리하여, 잔류 액틴 폴리머를 침전시켰다. 상청액 중에 남아있는 형광은, 상술된 조건 하에서 침전물(pellet)이 되지 않는, 모노머 또는 소 액틴 미세섬유 (5-10 모노머)에 의한 것으로 간주되었다. 상청액의 80%는 제거되었다; 농도가 형광 측정법에 의해 정해졌다 (490 nm에서 여기상태 및 520 nm에서 신호 회복). 초원심분리된 액틴 농도를 표준액으로서 비-초원심분리된 알렉사 488 액틴을 이용하여 계산하였다. 상청액의 일정부분을 취하여(aliquoted), 액체 질소에서 냉동시키고 -80℃에서 보관하였다.
시험 전에, 초원심분리된 알렉사 488 액틴의 일정부분을 G 완충액 (5 mM 트 리스 pH 8.1, 2 mM CaCl2, 0.2 mM DTT, 0.2 mM ATP)에서 1 mg/ml 농도로 희석하였다. 33㎕의 희석된 알렉사 488 액틴을 168㎕의 G 완충액과 혼합하고, 액틴 모노머 이방성을, 4㎕의 중합 완충액 (2.5 M KCl, 50 mM MgCl2, 25 mM ATP), 화학 분자의 존재 또는 부재 하에 5㎕의 G 완충액, 및 정상 NIH 3T3 세포 또는 악성 NIH 3T3 EF 세포 2 mg/ml에서 20㎕의 세포 추출물의 추가 전에 측정하였다. 알렉사 488 액틴의 최종 농도는 4 nM였다. 표지된 액틴에 대한 비표지된 액틴의 비율은 약 140/4 nM였다. 200초 동안 10초 간격으로 측정이 이루어졌다. 액틴 모노머 이방율(이방성 value)이 감산되어, 비등방성 증가가 얻어졌다 (△ mA). 이 데이터는 식 Y = Ymax. [1-exp(- K.X)]에 부합하였다. 곡선은 0에서 시작하여, 속도 상수 K로, 항정 상태의 이방율 (△ mA eq)에 상응하는 Ymax까지 상승한다. Y는, 모노머의 이방율이 감산된 이방율이며, X는 시간이다.
결과:
이 파라미터에서 BA016DD537의 효과는 다음과 같다:
표 1: NIH 3T3 EF 추출물에서 이방성 증가에 대한 BA016DD537 농도의 효과
정상 NIH 3T3 세포 악성 NIH 3T3 EF 세포 100 nM에서 BA016DD537의 존재 하에서 악성 NIH 3T3 EF 세포 200 nM에서 BA016DD537의 존재 하에서 악성 NIH 3T3 EF 세포
△mA 59.46 40.47 52.38 61.17
k.sec-1 0.1225 0.0960 0.1636 0.1737
BA016DD537 부재 하에서 측정된 이방성과 비교하여, 2-(β-피페리디노에틸)- 9-하이드록시엘립티시늄 클로라이드(BA016DD537)의 존재 하에서 NIH 3T3 EF 추출물에 대해 이방성 증가가 관찰되었다 (도 2).
NIH 3T3 EF 세포는 음성 NIH 3T3 세포보다 낮은, 액틴 신장의 유사 1차 속도, 및 항정 상태에서 F-액틴 양을 나타낸다. 따라서, NIH 3T3 EF 세포로부터 제조된 세포질 분획은, BA016DD537과 같은, 액틴 미세섬유에 우선적으로 결합할 수 있는 분자를 포함하여, 액틴 동태를 조절할 수 있는 분자를 스크리닝하는데 편리한 물질인 것으로 추정되었다. BA016DD537은 분석 배지에 추가되어, 액틴-F 신장 속도 상수 및 액틴-F 항정 상태 값을 증가시킨다. 도 2는 BA016DD537을 증가된 농도로 추가함에 따른 전형적인 반응속도론(kinetic)을 나타낸 것이다. 200 nM의 BA016DD537의 존재 하에서, NIH 3T3 EF 세포질 분획의 액틴 동태는 NIH 3T3 세포질 분획을 이용하여 관찰된 액틴 동태와 유사한다. 따라서, BA016DD537은 액틴 중합 촉진제로서 사용될 수 있다.
실시예 2: 9- 하이드록시 -2(베타-에틸)- 엘립티시늄 아세테이트 ( BA016CA107 ) 및 9-하 이드록 시-2(베타- 메틸 )- 엘립티시늄 아세테이트 ( 셀립튬 , BA016CA77 )에 의한, 세포 운동성의 생체외 저해 및 액틴 동태의 조절
셀립튬은 항암제로 알려져 있다. 9-하이드록시-2(베타-에틸)-엘립티시늄 아세테이트 (BA016CA107) 및 셀립튬 (BA016CA77)의 활성 메커니즘을, 항정 상태 형광 이방성의 측정 분석(재료 및 방법은 실시예 1을 참조)에 의해 BA016DD537의 활성 메커니즘과 비교하였다. 세포 운동성을 저해하는 그들의 능력도 조사하였다 (재료 및 방법은 실시예 4를 참조).
결과:
도 3에 나타난 바와 같이, BA016CA77 및 BA016CA107은 액틴-F 신장 속도 상수 및 액틴-F 항정 상태 값을 증가시키지 않는다. 200 nM의 BA016CA77 또는 BA016CA107의 존재 하에서 NIH 3T3 EF 세포질 분획의 액틴 동태는, 비처리된 NIH 3T3 EF 세포질 분획을 이용하여 관찰된 액틴 동태와 유사하다. 따라서, BA016CA77 및 BA016CA107는 액틴 중합 촉진제로서 사용될 수 없다.
표 2: NIH 3T3 EF 추출물에서 이방성 증가에 대한 BA016DD537, BA016CA77 및 BA016CA107 농도의 효과
정상 NIH 3T3 세포 악성 NIH 3T3 EF 세포 200 nM에서 BA016DD537 존재 하의 악성 NIH 3T3 EF 세포 200 nM에서 BA016CA107 존재 하의 악성 NIH 3T3 EF 세포 200 nM에서 BA016CA77 존재 하의 악성 NIH 3T3 EF 세포
△mA 59.46 40.47 61.17 42.14 38.33
k.sec-1 0.1225 0.0960 0.1737 0.0280 0.0416
또한, BA016CA77 및 BA016CA107 약물로 처리된 악성 세포의 행동을, 상처 치유 분석법에 따라 비처리된 악성 세포의 행동과 비교하였다. 처리된 악성 세포는 상처의 가장자리를 넘어 전체 영역으로 이동하는 것이 발견되었다 (도 4). 비-세포독성 농도의 약물로 처리된 세포는 비처리된 악성 세포와 동일한 방식으로 이동한다.
결론적으로, 9-하이드록시-2(베타-에틸)-엘립티시늄 아세테이트, 및 9-하이 드록시-2(베타-메틸)-엘립티시늄 아세테이트 (셀립튬) 어느 것도 활성이 있는 것으로 밝혀졌으며, 이는 2번 위치의 측쇄의 특성이 액틴 동태를 조절하는 능력에 결정적인 역할을 함을 시사한다.
실시예 3: 암 세포에서 F- 액틴 네트워크의 구제
재료 및 방법:
악성 NIH 3T3 EF 세포를 2000 세포 per cm2 당 2000개 세포의 밀도로 유리 커버 슬립에 접종하였다. 다음날, BA016DD537를 다양한 비-세포독성 농도로(100 nM 및 200 nM) NIH 3T3 EF 세포에 적용하였다. 3일 후, 형광 현미경으로 관찰하기 전에, 4℃에서 3.7 % 포름알데히드를 포함하는 PBS에서 10분간 세포를 고정시켰다. 포름알데히드 용액을 50 mM NH4Cl로 중화시켰다. PBS 중 0.4% 트리톤 X-100에서 4분간 추출을 수행하였다. 세포를 블록킹 완충액(PBS 중 3% 소 혈청 알부민)으로 1시간 동안 배양한 후, 20분간 실온에서 FITC-팔로이딘(phalloidin) (Sigma)으로 배양하였다. 커버 슬립을 (Zymed)에 마운팅(mounting)하고, 형광 현미경(Nikon)으로 관찰하였다.
결과:
약물 BA016DD537은 도 4에 도시된 바와 같이, 비-세포독성 농도에서 암 세포 내 액틴 네트워크를 재건할 수 있다. 비-세포독성 BA016DD537 농도로 처리된 NIH 3T3 EF 세포는 NIH 3T3 세포의 형태(즉, 세포는 확산되고 다수의 세포내 접촉성을 가지며 액틴 세포골격은 스트레스 섬유 네트워크 내에 잘 조직화되어 있음)에 가깝게 액틴 형태를 회복시킨다.
유사한 시험 조건에서, 9-하이드록시-2에틸)-엘립티시늄 아세테이트 및 9-하이드록시-2(메틸)-엘립티시늄 아세테이트(셀립튬) 어느 것도 활성이 없는 것으로 확인되었다.
실시예 4 : 세포 운동성의 생체외 저해
암 진행의 후반기에 암 세포의 침입 및 전이는 명백히 세포 운동성과 관련이 있다. 세포 운동성 및 일반적인 세포 형태의 변화의 주된 원동력은 세포 골격이며, 동물 세포 이동(locomotion)과 관련된 세포골격의 주요 성분이 액틴이다. 따라서, 액틴 동태 조절은, 세포 운동성을 손상시킬 수 있으며, 바꾸어 말해서 침입 및 전이를 제약하여야 한다.
이러한 이유로 BA016DD537이 세포 운동성 분석에서 시험되었다.
재료 및 방법:
악성 NIH 3T3 EF 세포 및 흑색종 세포주 B16F10 및 B16BL6의 운동성에 대한 BA016DD537의 효과를 평가하기 위하여, 상처 치유 분석이 수행되었다. 5% CO2의 습윤 대기 중 37℃에서 모든 세포를 배양하였다. 약 100 000-200 000개의 세포를 6-웰 배양 플레이트에 접종시키고, 24시간 후에 BA016DD537를 상이한 농도로 가하였다. 3일간 세포를 성장시켜 약 90-95%를 융합하고, 피펫 끝으로 작은 할퀸 상처 (약 200 μm - 1 mm 넓이)를 만들었다. 세포 파편을 제거한 후, 배양물을, 동일한 농도의 BA016DD537 존재 하에서 10시간 동안 완전한 배지에서 배양하였다. 그리고 나서, 상기 세포를 4℃, 3.7 % 포름알데히드 함유 PBS에서 10분간 고정시켰다. Zeiss 소프트웨어를 이용한 위상차 광현미경(phase contrast light microscope)으로 회복을 관찰하였다.
결과:
융합 단백질 EWS-FLI-1을 발현하는 종양형성 NIH-3T3 EF 세포뿐만 아니라, 침습성 흑색종 세포 B16F10 및 B16BL6가 높은 운동성 표현형을 나타낸다. 그들의 운동 특성을 총괄적으로 평가하기 위해서, 본 발명자는 BA016DD537로 처리된 악성 세포의 행동을 상처 치유 분석법에 따라 비-처리딘 악성 세포의 행동과 비교하였다. 비-처리된 악성 세포는 상처의 가장자리를 넘어 전체 영역으로 이동한다. 이와는 대조적으로, BA016DD537로 처리된 악성 세포는 상처 쪽으로 전혀 이동하지 않는다. BA016DD537는 용량 의존적으로 악성 세포의 운동성을 저해하였다. 50 nM 만큼 낮은 농도의 BA016DD537로 세포를 처리하면, B16F10 흑색종을 완전히 저해하고, NIH 3T3 EF 세포를 이동시킨다. 또한, 비-세포독성 농도의 BA016DD537에 의해 B16BL6 세포 운동성의 저해가 관찰되었다. 따라서, 선택된 BA016DD537 약물의 효과는 독성 효과로 인한 것이 아니다.
실시예 5 : 9- 하이드록시 엘립티신 유도체의 생체외 항증식 활성
악성 세포는, 부착-비의존적(anchorage-independent) 방식으로, 메틸-셀룰로스와 같은 반고체 매질에서 성장하는 특성을 나타낸다.
표현형 복구와 관련된, 2-(베타 피페리디노-2-에틸)-9-하이드록시엘립티시늄 클로라이드 (BA016DD537) 및 2-(베타 피페리디노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 메탄설포네이트 (BA016FZ539)의 항암 활성이 반고체 매질에서 콜로니 형성을 저해함으로써 평가되었다. 몇몇 세포주를 조사하였다. 콜로니 형성의 저해가 MTT 환원능을 측정하여 세포 증식 저해와 비교되었다.
재료 및 방법:
클로닝 분석법
세포를 0.8% 메틸셀룰로스 (메토셀 MC4000, Sigma)로 보충된 완전 배양 배지에 첨가하고, 35-mm 디쉬 (Greiner Bio-one Ref 627102, Dominique Dutscher)에 3배로 접종시킨 후, 5% CO2 습윤 대기, 37℃ 조건에서 배양하였다. 접종된 세포수는 디쉬 당 1000개 세포였다. 1 내지 3주 후, 세포주에 따라 육안으로 클론을 세었다.
MTT 분석법
[3-(4,5 디메틸티아졸-2-일)-2.5-디페닐-2H-테트라졸리움 브로마이드] (Sigma) 비색분석법(colorimetric assay)을 이용하여, 성장 연구를 수행하였다.
세포주에 따라, BA016DD537 또는 BA016FZ539의 농도를 증가하여 첨가하기 24시간 전에, 약 1500 내지 5000개의 세포를 96-웰 배양 플레이트에 접종하였다. 상기 플레이트를 3일간 37℃에서 배양하였다. 10 ml MTT 스톡(stock) 용액 (인산 완충액 식염수 중 5 mg/ml)을 각 웰의 완전 매질 90㎕에 첨가하고, 37℃에서 3시간 동안 배양을 지속하였다. 용해 완충액(10 % 소듐 도데실 설페이트, 1% HCl 1N; pH 4.7) 100 ㎕를 각 웰에 첨가하고, 밤새 플레이트를 배양하였다. 흡광도를 570 nm의 파장에서 Integrated EIA Management System (Labsystem)을 이용하여 측정하였다. 100% 비처리 세포를 이용하여 OD 리딩으로부터 증식율을 측정하였다.
수득된 일반적인 결과를 하기 표 3 내지 6에 나타내었다.
표 3: BA016DD537에 의한 세포 증식 및 콜로니 형성의 저해
세포독성 효과 (MTT) 콜로니 형성의 저해 (메틸셀룰로스)
NIH 3T3 EF IC50 = 400 nM IC50 = 30 nM
B16F10 IC50 = 500 nM IC50 = 35 nM
표 4: EWS/FLI-1 원종양유전자(proto-oncogen)를 발현하는 세포주에서 BA016FZ539에 의한 세포 증식 및 콜로니 형성의 저해
세포독성 효과 (MTT) 콜로니 형성의 저해 (메틸셀룰로스)
NIH 3T3 EF IC50 = 400 nM IC50 = 30 nM
SK-N-MC IC50 = 840 nM IC50 = 205 nM
표 5: BA016FZ539에 의한 인간 흑색종 세포 증식 및 흑색종 세포주 콜로니 형성의 저해
흑색종 세포주 세포독성 효과 (MTT) 콜로니 형성의 저해 (메틸셀룰로스)
B16F10 IC50 = 500 nM IC50 = 35 nM
B16BL6 IC50 = 212 nM IC50 = 29 nM
A375 IC50 = 2.9 μM IC50 = 97 nM
C9 IC50 = 2.1 μM IC50 = 132 nM
451 Lu IC50 = 4.2 μM IC50 = 2 μM
1205 Lu IC50 = 1.6 μM IC50 = 247 nM
SKMEL28 IC50 = 10.7 μM IC50 = 515 nM
HT144 IC50 = 9 μM IC50 = 125 nM
표 6: BA016FZ539에 의한 인간 췌장암 세포 증식 및 인간 췌장암 세포주 콜로니 형성의 저해
췌장 세포주 세포독성 효과 (MTT) 콜로니 형성의 저해 (메틸셀룰로스)
Mia Paca-2 IC50 = 7.6 μM IC50 = 640 nM
PANC-1 IC50 = 22 μM IC50 = 4.3 μM
따라서, BA016DD537 및 BA016FZ539는 반고체 매질 내 콜로니 형성에 대해 현저한 저해 활성을 나타내는 것으로 확인되었다. MTT 시험법을 이용해서 측정된 비증식성 농도에서, 콜로니 형성의 저해가 일어난다.
실시예 6 : 항암 활성
악성 세포의 복강내 이식 후, 잇달아 복강내 치료에 의해 마우스에서 B16 흑색종에 대한 항암 활성이 평가될 수 있다. 다양한 생물가용성(biodisponibility) 파라미터를 우회하는 이러한 종류의 프로토콜은, 대상 암에 대해 기대될 수 있는 최대 항암 활성에 대해 강력한 정보를 제공한다.
시험 프로토콜:
J0에서 흑색종 B16 세포 (4　x 105)를 복강내 경로로 B6D2F1 마우스에 주입시켰다. 멸균 증류수 (0.5 ml)에 용해된 약물을 J1 내지 J9에 이르는 다양한 농도에서 복강내 경로를 통해 매일 주입하였다. 대조군 마우스에는 동일한 프로토콜에 따라 증류수를 주입하였다.
매일 처리군 및 대조군 마우스의 수를 세었다. J9에서 T/C (처리군 마우스의 평균 생존률/대조군 마우스의 평균 생존률)를 계산하였다. T/C > 125%는 유의성 있는 항암 활성을 의미한다.
시험 결과를 하기 표 7에 요약하였다:
표 7: 대조군 마우스의 평균 생존률에 대한, 셀립튬 또는 BA016DD537로 처리된 마우스의 평균 생존률의 비율(T/C 비율)
약물 용량 (mg/kg/inj.) T/C (%)
메틸-2OH-9E 아세테이트 (셀립튬) 0.5 58
0.25 122
0.125 121
약물 용량 (mg/kg/inj.) T/C (%)
β-피페리디노에틸-2 OH-9E 아세테이트 (BA016DD537) 10 87
7.5 210
6.25 196
3.12 217
1.56 168
0.78 149
0.39 133
따라서, BA016DD537은 B16 흑색종에 대해 현저한 항암 활성을 나타낸다. 최적량 3.12 mg/kg에서 217%의 T/C가 산출된다. 참조 약물인 셀립튬은 이 프로토콜에서 유의성 있는 항암 활성을 나타내지 않는다.
실시예 7 : 항전이( Antimetastatic ) 활성
B16F10 마우스 흑색종 세포에 의해 나타난 침습성 표현형은, 정맥내 주사시 암 세포가 폐에서 효과적으로 전이되는 암 세포의 능력을 특징으로 한다. 항-침습 성 특성을 평가하기 위하여, 이 실시예에서 2-(베타 피페리디노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 메탄설포네이트의 효과를 시험하였다.
시험 프로토콜:
100 ml의 B16F10 세포 현탁액 (4.105 세포)을 마우스의 안와후방(retro-orbital)의 굴(sinus)에 정맥 주입하였다. 2-(베타 피페리디노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 메탄설포네이트 (BA016FZ539) 용액을, 세포 주입 24시간 후 및 72시간 후에 5 mg/Kg (1차 시험) 및 7.5 mg/kg (2차 시험) 용량으로, 마우스에 투여하였다. 대조군에서, 생리학적 혈청을 마우스에 정맥 주입하였다. 7일 후, 마우스를 희생시키고, 폐를 잘라내어, 해부 현미경 상에서 전이된 결절 수를 세었다.
표 8: BA016FZ539에 의한 B16F10 세포 폐 전이의 저해율
용량 J1, J3 (mg/kg/inj.) 폐 전이 발달의 저해 (대조군 값의 %)
시험 1 5 21% (p = 0.0904)
시험 2 7.5 39.6 % (p = 0.3269)
사용된 시험 조건에서, B16F10 흑색종 세포의 정맥 주입에 따른 폐 전이의 유의성 있는 감소에 의해 입증된 바와 같이, BA016FZ539는 유의성 있는 항-침습성 활성을 나타낸다.
실시예 8: 소세포 폐암 세포주에서 9- 하이드록시 엘립티신 유도체의 시험관 내 항증식성 효과
설포로다민(sulforhodamine) 시험으로 측정된 세포 증식 억제율로, BA016FZ539 (2-(베타 피페리디노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 메탄설포네이트)의 항암 활성을 평가하였다.
3개의 소세포 폐암 세포주를 조사하였다: NCI-H510, NCI-H446 및 NCI-H187.
소세포 폐암 (SCLC)은 매년 진단된 전체 폐암 중 15-25%의 원인이 된다 (Bonfill et al. 1975-1977 and 1987-1989. Int J Cancer 65: 751-754, 1996). SCLC 세포주는 다음과 같은 2개의 주요 분류로 나뉠 수 있다: 증가된 수준의 신경내분비 마커을 발현하는 전형적인 SCLC 세포주 (NCI-H187 및 NCI-H510), 및 하나 이상의 신경내분비 마커를 발현하지 못 하는 변이 SCLC 세포주.
일부 연구에서, 전형적인 세포주와는 상반되게, 변이 세포주는 시험관내 방사선저항성(radioresistant)이고, c-myc 종양유전자의 발현을 증가시키는 것으로 밝혀졌다 (Carney et al., Cancer Research 45, 2913-2923, June 1985).
재료 및 방법: SRB 분석법
설포로다민 B (SRB) 비색 분석법(Sigma)을 이용하여 성장 시험을 수행하였다.
세포 단백질 농도 측정치를 기초로 세포 밀도를 측정하기 위하여, SRB 분석법이 이용되었다. 이 방법은, 96-웰 포맷에서 부착성 세포 내 화합물의 독성 스크리닝을 위해 최적화되었다 (Skehan et al., Proc. Amer. Assoc. Cancer Res. 1989, 30:2436).
BA016FZ539의 농도를 증가시켜 첨가하면서, 약 50　000개의 NCI-H510, NCI-H446 또는 NCI-H187 세포를 96-웰 배양 플레이트에 접종시켰다.
배양 후, 세포 단층을 10 % (wt/vol) 트리클로로아세트산으로 고정하고, 30분간 염색시킨 후, 과잉 염료를 1 % (vol/vol) 아세트산으로 반복 세척하여 제거하였다. 마이크로플레이트 리더를 이용하여 510 nm에서 흡광도를 측정(OD)하기 위해, 단백질-결합된 염료를 10 mM 트리스 염기성 용액에서 용해시켰다.
증식율은 100 % 비처리된 세포를 이용하여 OD 리딩으로부터 계산하였다.
다양한 인간 소세포 폐암 세포주의 시험관내 화학감수성(chemosensitivity) 시험을 위해, SRB 단백질 염색 분석법을 테트라졸리움 (MTT) 비색 분석법과 비교하였다.
SRB 분석법은 MTT 분석법에 비해 몇 가지 장점을 가진다. 예를 들어, 일부 화합물은 세포 생존능에 아무런 영향을 미치지 않으면서 MTT 환원을 직접적으로 방해할 수 있는 반면, SRB 염색은 이러한 형태의 방해에 거의 영향을 받지 않는다. 또한, SRB 염색은 세포 대사 활성에 독립적이다.
결과:
표 9: SRB 또는 MTT 분석법 (Mean +/- SEM)으로 측정된 BA016FZ539에 의한 세포 증식의 저해
생존능 72h
IC50 (μM) SRB IC50 (μM) MTT
NCI-H510 5.8 +/- 1.9 14.8
NCI-H446 22.4 +/- 6.7 9.8+/- 0.2
NCI-H187 16.9 +/- 6.8 7.9
상기 표 9에서, 변이 SCLC 세포주(NCI-H446)가 전형적인 SCLC 세포주 (NCI-H510 및 NCI-H187)에 비해, BA016FZ539에 대해 더욱 양호한 저항성을 나타낸다고 말할 수 있다.
실시예 9: 췌장암 세포주에 대한 9- 하이드록시 엘립티신 유도체의 시험관내 항증식 효과
설포로다민(sulforhodamine) 시험으로 측정된 세포 증식 억제율로, BA016FZ539 (2-(베타 피페리디노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 메탄설포네이트)의 항암 활성을 평가하였다.
2개의 췌장암 세포주를 조사하였다: MIA PaCa-2 및 PANC-1.
재료 및 방법:
MIA PaCa-2 및 PANC-1 췌장 세포의 성장에 대한 BA016FZ539의 효과를 500 μM 내지 0.16 μM의 농도에 걸쳐 시험하고, SRB 비색 분석법으로 측정하였다.
BA016FZ539의 농도를 증가시켜 첨가하면서, 약 5000개의 MIA PaCa-2 또는 PANC-1 세포를 96-웰 배양 플레이트에 접종시켰다.
췌장 세포주의 형상 및 수의 변화를 현미경으로 관찰하였다 (도 5).
결과:
표 10: BA016FZ539에 의한 세포 증식의 저해 (Mean +/- SEM)
생존능 72h
IC50 (μM) SRB IC50 (μM) MTT
MIA PaCA-2 10.24 +/- 3.2 7.58 +/- 0.3
PANC-1 20.68 +/- 2.9 22.02
도 5는 MIA PaCa-2 세포주에서 BA016FZ539에 의한 형질전환된 표현형(도 5, A)에서 정상 표현형(도 5, B)으로의 복구를 나타낸 것이다.
이 효과는 MIA PaCa-2 세포주에서만 관찰되고 PANC-1 세포주에서는 관찰되지 않았다. 여기서 형질전환된 표현형의 복구는, 세포 확장 영역의 증가 및 세포질의 신장 증가를 포함하는 세포 형태의 변화와 관계가 있다. 따라서, BA016FZ539는 PANC-1 세포주보다 MIA PaCA-2 세포주에 대해 더욱 우수한 항암 활성을 나타낸다 (표 10).
결론적으로, 여기서 나타낸 데이터는, BA016FZ539가 인간 암 세포주에 대해 복합적인 항암 활성을 나타낸다는 점을 시사한다. BA016FZ539는 6 내지 20 μM의 IC50을 나타내어 SCLC 및 췌장 세포주에서 세포 성장을 유의성 있게 저해하는 것으로 확인되었다. 이러한 결과는 또한 췌장 세포주, MIA PaCa-2의 악성 표현형을 복구하는 능력을 시사한다. BA016FZ539로 처리된 세포들은, 세포골격 조직에서의 변화를 의미하는 형태적 변화를 보인다.
실시예 10: 세포 운동성의 생체외 저해
9-하이드록시 엘립티신 유도체를 분화 물질, 특히, 비타민 A, 그의 합성 유사체, 및 대사산물 (레티노이드), 비타민 D 또는 그의 유사체와 함께 조합하여 투여될 수 있다. 레티노이드는 예를 들어, all-트랜스레티노산 (ATRA), N-(4-하이드록시페닐) 레틴아미드 (4HPR), 13-시스-레티노산 (13-CRA), 또는 9-시스-레티노산 (9-CRA)일 수 있다.
본 실시예에서, BA016DD537 (2-(베타 피페리디노-2-에틸)-9-하이드록시엘립티시늄 클로라이드)와 상기 레티노이드와의 조합 효능을 시험하였다.
재료 및 방법:
레티노이드 13CRA 및 ATRA의 존재 하에서 BA016DD537에 의한 생체외 세포 생존능 저해율을, 3-(4,5 디메틸티아졸-2-일)-2.5-디페닐-2H-테트라졸리움 브로마이드 (MTT) 비색 분석법을 이용하여, B16BL6 흑색종 세포주에 대해 시험하였다.
10 nM의 레티노이드 부재 또는 존재 하에, 1 pM부터 100 pM으로 BA016DD537의 농도를 증가시켜 첨가하기 전에, 약 1000개의 세포를 24시간 동안 96-웰 배양 플레이트에 접종하였다. 플레이트를 3일간 37℃에서 배양하였다. 10㎕의 MTT 스톡 용액 (인산 완충 식염수 중에서 5 mg/ml)을 각 웰내 90㎕의 완전 배지에 첨가하고, 37℃에서 3시간 동안 배양을 지속하였다. 100㎕의 용해 완충액(20 % 소듐 도데실 설페이트, 10 mM HCl, 1x PBS)을 각 웰에 가하고, 플레이트를 밤새 배양하였다. 흡광도는 570 nm 파장에서 Integrated EIA Management System (Labsystem)을 이용하여 측정하였다.
결과
B16BL6 침습성 흑색종 세포는 높은 침습성 표현형을 나타낸다. 시너지(synergy) 분석법의 목적은 BA016DD537의 가장 낮은 농도에서 암세포 생존능을 저해하는 것이었다. 10 nM의 레티노이드 13CRA 및 ATRA만이 존재하는 경우, 세포 생존능 저해가 관찰되지 않았다. 10 nM 레티노이드의 존재 하에서 저용량의 BA016DD537로 세포를 처리할 경우, 암세포 생존능 저해율이 증가하였다 (도 6).
동시에 레티노이드의 부재시 가장 낮은 농도에서 BA016DD537의 시간-활성이 관찰되지 않았다. 100 nM에서 BA016DD537의 효능은, 10 nM의 ATRA 존재 시 1 pM에서의 BA016DD537 효능과 동일하였다. 따라서, 레티노이드와 조합할 경우 레티노이드가 없는 경우보다 BA016DD537의 용량을 100　000-배 낮추어, 동일한 결과를 얻을 수 있다.
실시예 11: 2가지 9- 하이드록시 엘립티신 유도체의 생물학적 활성의 비교: 모노메실레이트 및 비메실레이트
2가지 엘립티신 유도체, 즉, BA016FZ539 (2-(베타 피페리디노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 메탄설포네이트, 또는 "모노메실레이트") 및 다음 식의 비메실레이트 유도체:
Figure 112008087888607-PCT00011
(이하, "비메실레이트")의 항암 활성을 2개의 독립적인 시험으로 평가하였다. 첫째로, 반고체 매질에서의 콜로니 형성 저해율을, 마우스 흑색종 세포주 B16F10에서 클로닝 분석법으로 측정하였다.
둘째로, 2개의 인간 췌장 세포주 (MIA PaCA-2 및 PANC1) 및 1개의 마우스 흑 색종 세포주 (B16F10)의 세포 증식률을, SRB 및 MTT 시험을 이용하여, 모노메실레이트 및 비메실레이트 존재 하에서 측정하였다.
재료 및 방법:
클로닝 분석법
세포를 0.8% 메틸셀룰로스 (메토셀 MC4000, Sigma)로 보충된 완전 배양 배지에 첨가하고, 35-mm 디쉬에 3배로 접종시킨 후, 5% CO2 습윤 대기, 37℃ 조건에서 배양하였다. 접종된 세포수는 디쉬 당 1000개 세포였다. 9일 후, 마우스 흑색종 세포주 B16F10의 클론을 육안으로 세었다.
MTT 및 SRB 시험
MTT 및 SRB 비색분석법(Sigma) 모두를 이용하여, 성장 연구를 수행하였다. 모노메실레이트 및 비메실레이트의 농도를 증가시켜 첨가하기 전에, 약 1500개의 B16F10 또는 3000개의 췌장 세포 (MIA PaCa-2 및 PANC1)를 96-웰 배양 플레이트에 접종하였다.
상기 플레이트를 3일간 37℃에서 배양한 후, SRB 또는 MTT 프로토콜에 따라 처리하였다 (재료 및 방법 참조).
이들 2가지 경우에서, 100% 비처리 세포를 이용하여 OD 리딩으로부터 증식율을 계산하였다.
결과:
표 11: 세포 증식의 저해
세포주 IC50 (SRB 시험-72h) IC50 (MTT 시험-72h)
모노메실레이트 비메실레이트 모노메실레이트 비메실레이트
B16F10 4.3 μM 1.8 μM 2 μM 2.8 μM
Mia Paca-2 5.6 μM 2.5 μM nd nd
PANC-1 50.4 μM 37.6 μM nd nd
Nd: 비측정
B16F10은 SRB 및 MTT 분석법 모두를 이용하여 시험하였으나, PANC1은 SRB 분석법으로만 조사하였다. 모노메실레이트 및 비메실레이트의 IC50 간에 유의성 있는 차이는 없었다.
표 12: B16F10 콜로니 형성의 저해
B16F10 콜로니 형성의 저해
모노메실레이트 IC50 = 67 nM
비메실레이트 IC50 = 21 nM
모노메실레이트 및 비메실레이트 모두는, 반고체 매질에서 콜로니 형성에 대한 50 % 저해 농도 (IC50)가 각각 67 및 21 nM로, 유사한 IC50을 나타내었다.
이들 2가지 약물이 존재할 경우 메틸-셀룰로스에서, 침습성 마우스 흑색종 세포주 B16F10의 성장에 대한 현저한 저해 효과가 얻어졌다.
상기 결과들은 또한 콜로니 형성의 저해가, MTT 시험법을 이용하여 측정된 비-증식성 농도에서 일어난다는 점을 확인시켜 주었다 (표 12).
결론적으로, 모노메실레이트 및 비메실레이트는 클로닝 분석법 및 세포 증식성 시험의 결과와 관련하여 동일한 생물학적 활성을 가진다.
이와 동시에, 이들 데이터는 엘립티신 유도체가 항암제로서 개발될 가능성이 있음을 강하게 시사한다.

Claims (27)

  1. 암 치료용 의약의 제조를 위한, 선택적으로 산 부가염 형태인 하기 식(III)의 9-하이드록시 엘립티신 유도체의 용도:
    Figure 112008087888607-PCT00012
    상기 식에서,
    X는 OH, NRR', CN, OR, COOR(여기서, R 및 R'은 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬기임)에 의해 선택적으로 치환되고, 선택적으로 측쇄형인, 2 또는 3개의 탄소원자를 가지는 알킬기이고;
    Y는 -NR1R2이며, 여기서 R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬기이거나, R1 및 R2는 연결된 N 원자와 함께 포화 또는 불포화 5- 또는 6-원 헤테로사이클을 형성하고, -NR1R2는 약제학적으로 허용되는 무기 또는 유기산의 부가로부터 생성된 4급 암모늄염 형태를 이룰 수 있어, 식 (I)의 화합물은 산 부가염 형태일 수 있으며;
    또는 Y는 벤질, 페닐 또는 C5 또는 C6 아릴 또는 5- 또는 6-헤테로아릴기이고;
    Z-는 약제학적으로 허용되는 무기 또는 유기산의 음이온이며;
    -X-Y 측쇄는 필요에 따라 T, U, V 또는 W 중 하나에 결합되고;
    T, U, V 및 W는 C 원자 또는 N 원자로서, 피리딜 환을 형성하며, 나머지 T, U, V 및/또는 W는 C 원자이고,
    단 -X-Y 측쇄는 N 원자를 나타내는 T, U, V 및 W 중 하나에 결합하며,
    Figure 112008087888607-PCT00013
    는 필요에 따라 단일결합 또는 이중결합을 나타내어, 그 결과 융합 피리딜 환으로 형성된 시스템은 방향성이며, 양이온
    Figure 112008087888607-PCT00014
    또는
    Figure 112008087888607-PCT00015
    이 생성되는 것으로 이해된다.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 9-하이드록시 엘립티신 유도체는, 선택적으로 산 부가염 형태인 하기 식 (IV)를 가지는 것을 특징으로 하는 용도:
    Figure 112008087888607-PCT00016
    상기 식에서,
    X, Y 및 Z-는 제1항에서 정의된 바와 같다.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    X는 에틸 또는 프로필인 것을 특징으로 하는 용도.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    Y는 -NR1R2이고, 여기서 R1 및 R2 각각은 에틸기이며, -NR1R2는 약제학적으로 허용되는 무기 또는 유기산의 부가로부터 생성된 4급 암모늄염 형태를 이룰 수 있어, 식 (I)의 화합물은 산 부가염 형태일 수 있는 것을 특징으로 하는 용도.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    Y는 피페리딘, 피롤리디닐, 피리딘 및 피리미딘, 및 그들의 4급 암모늄 염으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  6. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 9-하이드록시 엘립티신 유도체는
    Figure 112008087888607-PCT00017
    또는 그로부터 생성된 4급 암모늄 염인 것을 특징으로 하는 용도.
  7. 제1항, 제2항, 제3항 또는 제5항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 9-하이드록시 엘립티신 유도체는
    Figure 112008087888607-PCT00018
    또는 그로부터 생성된 4급 암모늄 염인 것을 특징으로 하는 용도.
  8. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    Z-는 메탄설포네이트인 것을 특징으로 하는 용도.
  9. 제1항, 제2항, 제3항, 제5항 또는 제7항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 9-하이드록시 엘립티신 유도체는
    Figure 112008087888607-PCT00019
    인 것을 특징으로 하는 용도.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 의약은 암 세포의 형질전환된 표현형을 복구하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 암 세포는 침습성(invasive) 표현형을 특징으로 하는 용도.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 의약은 전이(metastasis)를 치료하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
  13. 제1항 내지 제12항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 의약은 세포독성 화학요법을 회피하는 개체에서 암을 치료하기 위한 것임을 특징으로 하는 용도.
  14. 제1항 내지 제13항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 의약은 분화 물질(differentiating agent)과 조합하여 투여되는 것을 특징으로 하는 용도.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 분화 물질은 비타민 A 및 그의 합성 유사체, 레티노이드, 비타민 D 및 그의 유사체, 및 퍼옥시좀 증식자-활성 수용체 (peroxisome proliferator-activated receptor; PPAR) 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  16. 약제학적으로 허용되는 담체 내에, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 식(III) 또는 (IV)의 9-하이드록시 엘립티신 유도체, 및 분화 물질을 포함하는 약제학적 조성물.
  17. 제16항에 있어서,
    상기 분화 물질은 비타민 A 및 그의 합성 유사체, 레티노이드, 비타민 D 및 그의 유사체, 및 퍼옥시좀 증식자-활성 수용체 (PPAR) 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 약제학적 조성물.
  18. 암 치료를 위해 동시에, 별개로 또는 순차적으로 사용되는 조합된 제제로서, 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 정의된 식(III) 또는 (IV)의 9-하이드록시 엘립티신 유도체, 및 분화 물질을 포함하는 제품.
  19. 제18항에 있어서,
    암 세포의 형질전환된 표현형을 복구하기 위해 동시에, 별개로 또는 순차적으로 사용되는 조합된 제제인 것을 특징으로 하는 제품.
  20. 제18항 또는 제19항에 있어서,
    상기 분화 물질은 비타민 A 및 그의 합성 유사체, 레티노이드, 비타민 D 및 그의 유사체, 및 퍼옥시좀 증식자-활성 수용체 (PPAR) 리간드로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 제품.
  21. 선택적으로 산 부가염 형태인 하기 식(III)의 9-하이드록시 엘립티신 유도체:
    Figure 112008087888607-PCT00020
    상기 식에서,
    X는 OH, NRR', CN, OR, COOR(여기서, R 및 R'은 독립적으로 H 또는 C1-C4 알킬기임)에 의해 선택적으로 치환되고, 선택적으로 측쇄형인, 2 또는 3개의 탄소원자를 가지는 알킬기이고;
    Y는 -NR1R2이며, 여기서 R1 및 R2는 독립적으로 H 또는 C1-C6 알킬기이거나, R1 및 R2는 연결된 N 원자와 함께 포화 또는 불포화 5- 또는 6-원 헤테로사이클을 형성하고, -NR1R2는 약제학적으로 허용되는 무기 또는 유기산의 부가로부터 생성된 4급 암모늄염 형태를 이룰 수 있어, 식 (I)의 화합물은 산 부가염 형태일 수 있으며;
    또는 Y는 벤질, 페닐 또는 C5 또는 C6 아릴 또는 5- 또는 6-헤테로아릴기이고;
    Z-는 약제학적으로 허용되는 무기 또는 유기산의 음이온이며;
    -X-Y 측쇄는 필요에 따라 T, U, V 또는 W 중 하나에 결합되고;
    T, U, V 및 W는 C 원자 또는 N 원자로서, 피리딜 환을 형성하며, 나머지 T, U, V 및/또는 W는 C 원자이고,
    단 -X-Y 측쇄는 N 원자를 나타내는 T, U, V 및 W 중 하나에 결합하며,
    Figure 112008087888607-PCT00021
    는 필요에 따라 단일결합 또는 이중결합을 나타내어, 그 결과 융합 피리딜 환으로 형성된 시스템은 방향성이며, 양이온
    Figure 112008087888607-PCT00022
    또는
    Figure 112008087888607-PCT00023
    이 생성되는 것으로 이해되되,
    단, 상기 9-하이드록시 엘립티신 유도체는 2-(디에틸아미노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 클로라이드, 2-(디에틸아미노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 아세테이트, 2-(디이소프로필아미노-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 아세테이트, 또는 2-(베타 피페리디노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 아세테이트가 아니다.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 9-하이드록시 엘립티신 유도체가, 선택적으로 산 부가염 형태인 하기 식 (IV)를 가지는 것을 특징으로 하는 9-하이드록시 엘립티신 유도체:
    Figure 112008087888607-PCT00024
    상기 식에서,
    X, Y 및 Z-는 제19항에서 정의된 바와 같되,
    단, 상기 9-하이드록시 엘립티신 유도체는 2-(디에틸아미노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 클로라이드, 2-(디에틸아미노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 아세테이트, 2-(디이소프로필아미노-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 아세테이트, 또는 2-(베타 피페리디노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 아세테이트가 아니다.
  23. 제22항에 있어서,
    X는 에틸이고 Y는 피페리딘이되, 단, 상기 9-하이드록시 엘립티신 유도체는 2-(베타 피페리디노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 아세테이트가 아닌 것을 특징으로 하는 9-하이드록시 엘립티신 유도체.
  24. 제21항 내지 제23항 중 어느 한 항에 있어서,
    2-(베타 피페리디노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 메탄설포네이트 또는 그로부터 생성된 4급 암모늄 염인 것을 특징으로 하는 9-하이드록시 엘립티신 유도체.
  25. 제21항 내지 제24항 중 어느 한 항에 있어서,
    하기 식의 화합물인 것을 특징으로 하는 9-하이드록시 엘립티신 유도체:
    Figure 112008087888607-PCT00025
  26. 제21항 또는 제22항에 있어서,
    2-(디에틸아미노-2-에틸)9-하이드록시엘립티시늄 메탄설포네이트 또는 그로부터 생성된 4급 암모늄 염인 것을 특징으로 하는 9-하이드록시 엘립티신 유도체.
  27. 약제학적으로 허용되는 담체 내에, 제21항 내지 제26항 중 어느 한 항에 따른 9-하이드록시 엘립티신 유도체를 포함하는 약제학적 조성물.
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