KR20080108487A - 대사 조절인자 및 그의 용도 - Google Patents

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KR20080108487A
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켄네트 왈쉬
노리유끼 오우찌
링 젱
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트르스티스 오브 보스톤 유니버시티
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Abstract

본 발명은 대사 기능에 영향을 미치는 대사 조절인자, 예를 들어 근 질량, 근육 재생, 근육 비대, 지방량, 인슐린 및 당 감수성, 혈관신생 및 심혈관 기능에 영향을 미치는 대사 조절인자에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 대사 조절인자의 활성 및/또는 유전자 발현을 활성화시키거나 억제하는 물질을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여함으로써, 대사 기능을 조정하는 것에 관한 것이다. 본 발명의 대사 조절인자는 예를 들어 MSP1 (2160028F08Rik; 서열 16); MSP2 (2310043I08Rik; 서열 17); MSP3 (NM_026754; 1110017I16Rik; 서열 1); MSP4 (4732466D17Rik; 서열 18); MSP5 (NM_024237; 1600015H20Rik; 서열 12); Insl6 (AF_156094; 서열 20)이다. 본 발명은 또한 본 발명의 대사 조절인자에 영향을 미치는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다.
근육 분비형 단백질, 대사 조절인자, 대사 기능, 활성, 유전자 발현, 스크리닝

Description

대사 조절인자 및 그의 용도 {METABOLIC REGULATORS AND USES THEREOF}
관련 출원에 대한 교차 참조
본원은 그 전체 내용이 본원에 참고로 포함된, 2006년 2월 28일에 출원된 미국 특허 가출원 60/777,654에 기초한 35 U.S.C. 119(e) 하의 이익을 주장한다.
본 발명은 대사 조절인자 및 치료 용도를 포함한 그의 용도에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 대사 기능에 영향을 미치는 대사 조절인자, 예를 들어 근 질량 (muscle mass), 근육 재생, 근육 비대, 지방량 (fat mass), 인슐린 및 당 감수성, 혈관신생 및 심혈관 기능에 영향을 미치는 대사 조절인자의 용도를 제공한다. 특히, 본 발명은 대사 조절인자의 활성 및/또는 유전자 발현을 활성화시키거나 억제하는 물질 (agent)을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여함으로써, 대사 기능을 조절하는 것에 관한 것이다.
전신 근 위축은 절식 (fasting) 시에 및 악액질 (cachexia), 암, AIDS, 장기 병상 요양 (bed rest) 및 당뇨병과 같은 다양한 질병 (1) 및 근 위축에서 발생한다. 위축증의 치료를 위한 하나의 전략은 정상적으로 골격근 비대를 일으키는 경로를 유도하는 것이다.
특히, 근 질량의 감소, 즉 위축증은 다양한 생리학적 및 병리학적 상태와 연 관된다. 예를 들어, 근 위축은 신경 외상으로 인한 탈신경; 퇴행성, 대사 또는 염증성 신경병증, 예를 들어 길랑-바레 (Guillian-Barre) 증후군; 말초 신경병증; 또는 환경 독소 또는 약물에 의해 유발된 신경 손상으로부터 발생할 수 있다. 근 위축은 또한 예를 들어, 성인 운동 뉴런 질병, 예를 들어 근위축성 측삭 경화증 (ALS 또는 루 게릭 (Lou Gehrig)병); 영아 및 소아 척수성 근 위축; 및 다초점성 전도체 차단 (conductor block)을 갖는 자가면역 운동 신경병증을 포함하는 운동 신경병증으로 인한 탈신경으로부터 발생할 수 있다. 근 위축은 또한 예를 들어, 뇌졸중 또는 척수 손상으로 인한 마비; 외상, 예를 들어, 골절, 인대 또는 힘줄 손상, 염좌 또는 탈구로 인한 골격 고정; 또는 장기 병상 요양으로부터 일어나는 만성 질병으로부터 발생할 수 있다. 또한 근 위축을 일으킬 수 있는 대사 스트레스 또는 영양 부족은 특히 암 및 다른 만성 병, 예를 들어 AIDS, 절식 또는 횡문근융해의 악액질, 및 내분비 질환, 예를 들어 갑상선 질환 및 당뇨병을 포함한다. 근 위축은 또한 근육 퇴행 위축 증후군, 예를 들어 뒤시엔느 (Duchenne), 베커 (Becker), 근긴장성, 안면견갑상완, 에머리-드레이푸스 (Emery-Dreifuss), 안구인두, 견갑상완, 지대 (limb girdle), 및 선천성 유형뿐만 아니라 유전 원위성 근육병증으로 알려진 위축증에 기인할 수 있다. 근 위축은 또한 선천성 근육병증, 예를 들어 양성 선천성 근긴장저하, 중심핵병, 네말렌 (nemalene) 근육병증 및 근세관성 (중심핵) 근육병증에 기인할 수 있다. 근 위축은 또한 노화 과정 동안 일어난다.
골격근 비대는 정상 생후 발육, 및 신체 운동에 대한 적응 반응에서 중요한 역할을 한다 (2). 상기 과정은 혈관 동원과 연관되어, 성장하는 근육에서 모세혈 관 밀도가 유지되거나 증가한다 (3-6). 이와 반대로, 노화, 불용 및 근육병증 질병으로 일어나는 근섬유 위축증은 모세혈관 손실과 연관된다 (7, 8). 혈관신생 및 보충적인 근육 비대가 일시적으로 연결되는 것으로 나타났고, 이는 상기 2가지 과정이 공통 조절 메카니즘에 의해 제어될 수 있다는 것을 제안한다 (9).
근육 축적은 지방량과 역상관관계이다. 예를 들어, IGF-1 (10), ski (11) 또는 Akt1 (12)의 골격근-특이적 발현. 그러나, 골격근이 지질분해, 및 지방산 이동과 근육에 의한 섭취를 제어하는 호르몬 조절 메카니즘은 잘 알려지지 않았다. 또한, 적합한 골격 기능은 정상 포도당 대사의 유지에 또한 중요하다 (13-15). 인슐린-자극된 포도당 섭취에 대한 골격근 저항은 인슐린-비의존 (2형) 당뇨병의 가장 일찍 알려진 소견이다 (16, 17). 골격근 활성을 증가시키면 대부분의 2형 당뇨 환자에서 인슐린 감수성을 개선시키고, 손상된 인슐린 내성으로부터 진행을 방지할 수 있다 (18).
따라서, 개별적으로든 함께이든 상기 질병들을 표적으로 하는 유용한 치료 전략은 각종 질병 및/또는 질환의 치료 또는 예방을 위해 근육 비대, 혈관신생을 증가시키고, 지방량을 감소시키고, 인슐린 감수성을 개선하기 위해 근육에서 내부 분비되는 분자를 이용하는 것이다.
<발명의 개요>
본 발명은 근육-소모 질병, 인슐린-관련 질환, 비만, 당뇨병, 조직 허혈 및 뼈 질병, 및 근육 퇴행 질병을 포함한 많은 병리학적 상태의 치료를 위한, 근육으로부터의 대사 조절인자를 발견한 것에 관한 것이다.
골격근에서 Akt를 과다발현하는 트랜스제닉 (transgenic) 마우스 모델을 사용함으로써, 본 발명자들은 대사 기능에 영향을 미치는, 본원에서 "대사 조절인자"로 부르는 몇몇 근육 분비형 단백질, 예를 들어 근 질량, 근육 비대, 근육 재생, 인슐린 감수성과 당 감수성, 혈관신생 및 지방량에 영향을 미치는 대사 조절인자를 발견하기에 이르렀다. 본 발명자들은 대사 기능에 영향을 미치는 다음 대사 조절인자, 예를 들어 근육 분비형 단백질 (MSP); MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및 인슐린 유사 단백질 6 (Insl6)을 발견하기에 이르렀다. 따라서, 본 발명은 본 발명의 대사 조절인자를 표적으로 하는 물질의 유효량을 투여함으로써 대사 기능을 조정하는 방법을 제공한다.
따라서, 본 발명은 본 발명의 대사 조절인자를 표적으로 하는 물질의 치료 유효량을 함유하는 조성물을 투여하는 것을 포함하는, 근육 관련 질병, 혈관신생, 비만, 당불내성과 인슐린-의존 질환 및 근육 퇴행과 연관된 질병 및/또는 질환을 치료하는 방법을 제공한다.
특히, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 대사 조절인자를 표적으로 하는 물질, 예를 들어 대사 조절인자 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및 인슐린 유사 단백질 6 (Insl6)의 기능을 활성화시키거나 억제하는 물질을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여함으로써, 대사 기능을 조정하는 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 물질은 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및 Insl6의 단백질을 활성화시키고/시키거나 유전자 발현을 증가시키는 작용제 (agonist)이고, 일부 실시태양에서 물질은 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6 또는 그의 상동체 또는 변이체 또는 단 편을 코딩하는 핵산 또는 폴리펩티드이다. 다른 실시태양에서, 물질은 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및 Insl6의 단백질을 억제하고/하거나 유전자 발현을 감소시키는 길항제이고, 일부 실시태양에서 물질은 억제 폴리펩티드, 예를 들어 우성 음성 폴리펩티드 또는 중화 항체 또는 억제 핵산, 예를 들어 비제한적으로 안티센스 핵산 및/또는 RNAi이다.
본 발명자들은 또한 MSP3이 혈관신생을 조정하고 당 감수성을 조정하는 두 가지 기능을 하는 것을 발견하였고, 따라서, 본 발명자들은 MSP3이 혈관 형성을 촉진하는 2기능성 미오카인 (myokine)으로서 및 감수성을 증가시키는 대사 조절인자로서 기능하는 것을 발견하기에 이르렀다. 따라서, 본 발명은 MSP3의 작용제로서 기능하는 물질, 예를 들어 MSP3의 활성 및/또는 발현에 영향을 미치는 물질의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 혈관 손실과 연관된 질환, 예를 들어 비제한적으로 허혈의 치료에 관한 것이다. 상기 MSP3의 작용제의 한 예는 예를 들어 비제한적으로 MSP3을 코딩하는 핵산, 또는 MSP3 단백질 또는 그의 단편 또는 기능적 유도체 또는 MSP3에 대한 작용제를 포함하는 물질이다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 MSP3의 작용제, 예를 들어 MSP3 또는 그의 상동체 또는 변이체를 코딩하는 핵산, MSP3 단백질 또는 그의 단편 또는 기능적 유도체 또는 MSP3에 대한 작용제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 인슐린 불내성과 연관된 질환, 예를 들어 비제한적으로 당뇨병 및 비만의 치료에 관한 것이다.
본 발명자들은 또한 MSP5가 혈관신생 및 근육 비대와 근 질량을 조정하는 기능을 하는 것을 발견하였고, 따라서 본 발명자들은 MSP5가 또한 혈관 형성을 촉진 하고 근육 비대 인자를 촉진하는 2기능성 미오카인으로서 기능하는 것을 발견하기에 이르렀다. 따라서, 본 발명은 MSP5의 작용제로서 기능하는 물질, 예를 들어, MSP5의 활성 및/또는 발현에 영향을 미치는 물질의 치료 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 혈관 손실과 연관된 질환의 치료에 관한 것이다. 상기 물질의 한 예는 예를 들어 비제한적으로 MSP5를 코딩하는 핵산, MSP5 단백질 또는 그의 단편 또는 기능적 유도체 및/또는 MSP5에 대한 작용제이다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 MSP5에 대한 작용제로서 기능하는 물질, 예를 들어 MSP5의 활성 및/또는 발현에 영향을 미치는 물질, 예를 들어 MSP5 또는 그의 기능적 유도체를 코딩하는 핵산, MSP5 단백질 또는 그의 단편 또는 기능적 유도체 또는 MSP5에 대한 작용제의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 근 위축과 연관된 질환 또는 근 질량의 증가가 요구되는 경우의 치료에 관한 것이다.
본 발명자들은 또한 인슐린 유사 단백질 6 (Insl6)이 근원섬유로의 위성 (satellite) 세포 동원의 양을 조정함으로써 근육 재생을 조절하는 기능을 하는 것을 발견하였다. 따라서, 본 발명은 Insl6의 작용제로서 기능하는 물질, 예를 들어 Insl6의 활성 및/또는 발현을 증가시키는 물질의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 근육 퇴행과 연관된 질환, 예를 들어 비제한적으로 근 위축의 치료, 또는 근 질량의 증가가 요구되는 경우의 질환, 예를 들어 노화 관련 위축증의 치료에 관한 것이다. 상기 물질의 한 예는 Insl6 또는 그의 상동체 또는 유도체를 코딩하는 핵산, Insl6 단백질 또는 그의 단편 또는 기능적 유도체, 또는 Insl6에 대한 작용제인 작용제이지만 그로 제한되지 않는다.
한 측면에서, 본 발명은 본 발명의 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6 유전자를 코딩하는 핵산, 또는 그의 기능적 유도체 또는 변이체를 코딩하는 핵산을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 그를 필요로 하는 대상, 또는 질병 또는 병태에 걸릴 위험이 있는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 질병 또는 병태의 치료 방법을 제공한다. 일부 실시태양에서, 제약 조성물은 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6의 단백질 또는 폴리펩티드, 다른 실시태양에서 그의 단편 또는 유도체인 물질을 포함한다. 다른 실시태양에서, 제약 조성물은 작용제로서 기능하는 물질, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6의 유전자 발현을 활성화시키거나 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6의 전사후 유전자 산물 및/또는 펩티드를 활성화시키는 물질을 포함한다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 방법은 근육 관련 병태를 치료하기 위해 사용될 수 있다. 질병 또는 병태가 근육 관련 병태 또는 질환, 예를 들어 위축증인 실시태양에서, 본 발명의 방법은 본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어, 본 발명의 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6, 또는 그의 기능적 유도체 또는 변이체의 활성 및/또는 발현에 영향을 미치는 물질을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 근육-관련 질병 또는 병태는 개선되거나 억제된다. 본 발명의 제약 조성물에 의해 치료되는 근육-관련 병태 또는 질환은 많은 원인, 예를 들어 비제한적으로 탈신경; 퇴행성, 대사 또는 염증성 신경병증; 영아 및 소아 척수성 근 위축; 자가면역 운동 신경병증으로부터; 만성 질병, 예를 들어 암, AIDS, 절식 또는 횡문근융해로부터 일어나는 악액질로부 터; 및 근육 퇴행 위축 증후군, 예를 들어 뒤시엔느로부터 발생할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 본 발명의 적어도 하나의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6의 적어도 하나의 결핍으로부터 발생하거나, MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6의 증가된 활성 및/또는 유전자 발현에 의해 개선될 수 있는 임의의 병태, 예를 들어 왜소증 및 심장 질병, 예를 들어, 심근경색 후 개선된 심장 조직 생존을 치료하기 위해 유용하다.
본 발명의 한 측면은 유기체에서 근 질량을 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 근 위축을 발병할 위험이 있거나 근 위축이 있는 대상, 또는 근육 비대를 필요로 하는 대상을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 일부 실시태양에서, 방법은 작용제, 즉, 본 발명의 적어도 하나의 대사 조절인자의 활성을 증가시키고/시키거나 그의 유전자 발현을 증가시키는 작용제인 물질, 예를 들어 비제한적으로 MSP5 및/또는 Insl6 또는 그의 기능적 유도체 또는 상동체를 활성화시키는 작용제로서 기능하는 물질을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 제약 조성물은 본 발명의 적어도 하나의 대사 조절인자의 작용제, 예를 들어, MSP5 및/또는 Insl6의 작용제를 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 적어도 하나의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP5 (서열 12) 및/또는 Insl6 (서열 20) 또는 그의 상동체 또는 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 제약 조성물을 대상에게 투여함으로써, 근 위축이 있거나 근 위축의 위험이 있는 대상을 치료하기 위한 수단을 제공한다. 따라서, 본 발명은 그를 필요로 하는 대상에서 근육 비대를 증가시키거나 위축증을 억제함으로써 근육 성장을 증가시키는 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 대상에게 길항제로서 기능하는 물질, 예를 들어 억제제, 예를 들어 비제한적으로 MSP5의 억제제를 투여함으로써, 근육 비대를 방지하고 근 질량을 감소시키고/시키거나 체중을 감소시킬 수 있다. 상기 억제제의 예는 예를 들어, MSP5의 우성 음성 형태, 또는 MSP5에 대한 억제 핵산, 예를 들어 MSP5 RNAi 또는 MSP5 안티센스 올리고뉴클레오티드를 포함한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 유기체에서 근육 재생 및 근 질량을 조정하는 방법을 제공한다. 한 실시태양에서, 본 발명은 대상에서 근육 재생 및/또는 근 질량을 증가시키는 방법 및 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 근육 퇴행을 발병할 위험이 있거나 근육 퇴행이 있는 대상, 또는 근육 재생을 필요로 하는 대상을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 실시태양에서, 방법은 작용제로서 기능하는 물질, 예를 들어 비제한적으로 본 발명의 적어도 하나의 대사 조절인자의 유전자 발현을 활성화시키고/시키거나 증가시키는 물질, 예를 들어 비제한적으로 Insl6 또는 그의 기능적 유도체를 활성화시키는 물질을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 제약 조성물은 본 발명의 적어도 하나의 대사 조절인자의 작용제, 예를 들어 Insl6의 작용제를 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 적어도 하나의 대사 조절인자, 예를 들어 비제한적으로 Insl6 (서열 20) 또는 그의 상동체 또는 변이체 또는 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 제약 조성물을 대상에게 투여함으로써, 근육 퇴행이 있거나 근육 퇴행을 발병할 위험이 있는 대상을 치 료하기 위한 수단을 제공한다. 따라서, 본 발명은 그를 필요로 하는 대상에서 예를 들어, 위성 세포 동원을 증가시키고 근육 재생을 증가시킴으로써 근 질량을 증가시키는 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 대상에게 예를 들어 Insl6의 길항제 또는 억제제로서 기능하는 물질을 투여함으로써, 과도한 근 질량을 방지하고 근 질량을 감소시키고/시키거나 체중을 감소시키기 위해 사용될 수 있다. 상기 길항제는 예를 들어, Insl6의 우성 음성 형태, 또는 Insl6에 대한 억제 핵산, 예를 들어 Insl6 RNAi 또는 Insl6 안티센스 올리고뉴클레오티드이다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 유기체에서 당 및/또는 인슐린 감수성을 조정하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 인슐린 및/또는 당 불감증을 발병할 위험이 있거나 인슐린 및/또는 당 불감증이 있는 대상, 또는 포도당 조절 또는 대사 조절을 필요로 하는 대상, 예를 들어 인슐린-관련 질환 또는 인슐린 저항성을 포함한 질환에 걸린 대상을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 실시태양에서, 방법은 작용제로서 기능하는 물질, 예를 들어 본 발명의 적어도 하나의 대사 조절인자의 활성화를 증가시키거나 그의 유전자 발현을 증가시키는 물질, 예를 들어 비제한적으로 MSP3 또는 그의 기능적 유도체를 활성화시키는 물질을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 제약 조성물은 본 발명의 대사 조절인자의 작용제, 예를 들어 MSP3의 작용제를 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 대사 조절인자를 코딩하는 핵산, 예를 들어 MSP3 (서열 1) 또는 그의 상동체 또는 변이체 또는 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 제약 조성물을 대상에게 투여함으로써, 인슐린- 의존 질환 또는 비만이 있거나 그의 위험이 있는 대상을 치료하기 위한 수단을 제공한다. 따라서, 본 발명은 그를 필요로 하는 대상에서 당 감수성을 증가시키고/시키거나 인슐린 감수성을 증가시키거나 비만을 치료하는 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 대상에게 길항제로서 기능하는 물질, 예를 들어 MSP3의 억제제를 포함하는 제약 조성물을 투여함으로써 지방량을 증가시키고/시키거나 체중을 증가시킬 수 있다. 상기 길항제의 예는 MSP3의 우성 음성 형태, 또는 MSP3의 억제 핵산, 예를 들어 MSP3 RNAi 또는 MSP3 안티센스 올리고뉴클레오티드 및/또는 MSP3의 중화 항체를 포함하고 이로 제한되지 않는다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 유기체에서 혈관신생을 조정하는 방법에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 본 발명은 대상에서 혈관신생을 증가시키는 방법 및 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 허혈이 발생할 위험이 있거나 혈관신생 및/또는 혈관 형성이 결핍된 대상, 또는 혈관신생 증가를 필요로 하는 대상을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 실시태양에서, 방법은 작용제로서 기능하는 적어도 하나의 물질, 예를 들어 본 발명의 적어도 하나의 대사 조절인자의 활성을 증가시키고/시키거나 그의 유전자 발현을 증가시키는 물질, 예를 들어 비제한적으로 MSP3 및/또는 MSP5 또는 그의 기능적 유도체를 활성화시키는 물질을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 제약 조성물은 본 발명의 적어도 하나의 대사 조절인자의 작용제, 예를 들어 MSP3 및/또는 MSP5 또는 그의 상동체의 작용제인 물질을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 혈관신생을 증가시키는 방법은 본 발명의 적어도 하나의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP3 (서열 1) 및/또는 MSP5 (서열 12) 또는 그의 상동체 또는 변이체 또는 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 제약 조성물을 대상에게 투여하는 것이다. 따라서, 본 발명은 그를 필요로 하는 대상에서 혈관신생을 증가시키는 방법을 제공한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 혈관신생 감소를 필요로 하는 대상 또는 과도한 혈관신생이 발생할 위험이 있는 대상, 예를 들어 암에 걸리거나 암을 발병할 위험이 있는 대상을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 실시태양에서, 방법은 본 발명의 적어도 하나의 대사 조절인자에 대해 길항제 또는 억제제로서 기능하는 물질, 예를 들어 비제한적으로 MSP3의 억제제 및/또는 MSP5 또는 그의 기능적 유도체의 억제제를 포함하는 제약 조성물의 유효량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 혈관신생을 억제하기 위해 유용한 대사 조절인자의 상기 억제제의 예는 예를 들어 비제한적으로 MSP3 및/또는 MSP5의 우성 음성 형태, 또는 MSP3 및/또는 MSP5의 억제 핵산, 예를 들어 MSP3 RNAi 또는 MSP5 RNAi 또는 MSP3 또는 MSP5 안티센스 올리고뉴클레오티드 또는 MSP3 및/또는 MSP5의 중화 항체이다. 따라서, 본 발명은 그를 필요로 하는 대상에서 혈관신생을 감소시키는 방법을 제공한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 유기체에서 비만을 조절하기 위한 방법에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 본 발명은 대상에서 비만을 감소시키고/시키거나 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 예를 들어, 본 발명의 방법은 비만이 발생할 위험이 있는 대상 또는 비만 대상을 치료하기 위한 조성물을 제공한다. 상 기 실시태양에서, 방법은 작용제로서 기능하는 적어도 하나의 물질, 예를 들어 본 발명의 적어도 하나의 대사 조절인자의 활성을 증가시키고/시키거나 그의 발현을 증가시키는 물질, 예를 들어 비제한적으로 MSP3 또는 그의 기능적 유도체를 활성화시키는 물질을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 제약 조성물은 본 발명의 대사 조절인자의 작용제, 예를 들어 MSP3의 작용제를 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 대사 조절인자 또는 그의 상동체를 코딩하는 핵산, 예를 들어 MSP3 (서열 1) 또는 그의 상동체 또는 변이체 또는 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 제약 조성물을 대상에게 투여함으로써, 인슐린-의존 질환 또는 비만이 있거나 그의 위험이 있는 대상을 치료하기 위한 수단을 제공한다. 따라서, 본 발명은 그를 필요로 하는 대상에서 비만을 치료하고 체중을 감소시키기 위한 방법을 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 대상에게 예를 들어 MSP3, MSP5 및/또는 Insl6의 길항제 또는 억제제로서 기능하는 물질을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여함으로써, 지방량을 증가시키고/시키거나 체중을 증가시킬 수 있다. 상기 길항제의 예는 예를 들어 비제한적으로 MSP3, MSP5 및 Insl6의 우성 음성 형태, 또는 MSP3, MSP5 및 Insl6의 억제 핵산, 예를 들어 MSP3, MSP5 및/또는 Insl6에 대한 RNAi 또는 안티센스 올리고뉴클레오티드 분자, 및/또는 MSP3, MSP5 및/또는 Insl6에 대한 중화 항체이다.
다른 목적 및 잇점은 다음의 상세한 설명을 살펴보면 명백해질 것이다.
도 1A-C는 골격근-특이적 조건화 Akt1 TG 마우스의 생성을 도시한 것이다. (도 1A) 2원적 (binary) TG 시스템의 개략적 설명. 도 1B는 Akt1 트랜스젠 (transgene)의 DOX-의존 발현을 도시한 것이다. 상부: DOX 처리의 일시적 프로필. 하부: 장딴지 근육에서 트랜스젠 발현의 웨스턴 블롯 (Western blot) 분석. 도 1C는 상이한 조직에서 트랜스젠 발현의 웨스턴 블롯 분석을 도시한 것이다.
도 2A-D는 골격근에서 Akt1의 조건적 활성화가 가역적 근육 비대를 유발하였음을 보여준다. 도 2A 상부는 DOX 처리의 일시적 프로필을 도시한 것이다. 도 2A 하부는 DTG 마우스의 대표적인 육안적인 외관을 도시한 것이다. 도 2B 상부는 트랜스젠 발현의 시간 경로를 도시한 것이다. 도 2B 하부는 장딴지 근육 중량의 시간 경로를 도시한 것이다. 결과를 평균±SEM (각각 n=4-12)으로 제시한다. *P< 0.05 대 0일; #P<0.05 대 14일. 도 2C는 조직학적 분석을 도시한 것이다. 상부: 장딴지 근육 절편의 H&E 염색. 스케일 바 (scale bar): 100 ㎛. 하부 좌측: 근육 섬유의 평균 단면적의 분포. 우측: 근육 섬유의 평균 단면적. 결과를 평균±SEM (n=6)으로서 제시한다. *P< 0.05 대 대조군. 도 2D 상부는 Akt1 활성화의 2 또는 6주 후 DTG에서 장딴지 근육의 대표적인 웨스턴 블롯 및 조직학적 분석을 도시한 것이다. 스케일 바: 100 ㎛. 하부: 장딴지 근육 중량 및 근육 섬유의 평균 단면적. 결과를 평균±SEM (n=6)으로서 제시한다. *P< 0.05 대 대조군.
도 3A-C는 피크 힘 출력 (force output)을 증가시키는 Akt1-매개된 타입 II 근육 성장을 보여준다. 도 3A는 항-HA 항체 및 MHC 이소형 항체, 예를 들어 MHC 타입 I, MHC 타입 IIa 및 MHC 타입 IIb를 사용하여 염색한, Akt1 활성화 2주 후에 대조군 및 DTG 마우스로부터의 장딴지 절편의 대표적인 영상을 도시한 것이고, 여기서 도 1A는 Akt1 트랜스젠 발현이 MHC 타입 IIb 섬유의 성장 및 비대를 유도하는 (패널) 것을 보여주고 막대그래프로 정량한다. 도 3B는 전완 그립 (forearm grip) 강도 측정을 도시한 것이다. 결과를 평균±SEM (n=6)으로서 제시한다. *P< 0.05 대 대조군. 도 3C는 강제 트레드밀 (treadmill) 운동 시험을 도시한 것이고, 여기서 좌측 그래프는 달리기 시간을 보여주고, 우측은 달리기 거리를 보여준다. 결과를 평균±SEM (n=4)으로서 제시한다. *P< 0.05 대 대조군.
도 4A-D는 Akt1-매개된 타입 II 근육 성장이 식이-유도 비만을 복귀시켰음을 보여준다. 도 4A 좌측은 대조군 및 HF 식이를 급식한 DTG 마우스의 대표적인 육안적인 외관 및 배쪽 도면을 도시한 것이고, 도 4A 우측은 대조군 및 DTG 마우스 (n=12)의 체중을 도시한 것이다. 도 4B 좌측은 우측 신우 (renal pelvis) 수준에서 도시된 각각의 군의 마우스의 대표적인 MRI 영상을 도시한 것이고, 도 4B 우측은 총 지방 부피 (n=4)의 정량화된 측정치를 도시한 것이다. 도 4C는 조직학적 분석을 도시한 것이다. H&E 염색된 장딴지 근육 (상부) 및 백색 지방 조직 (하부) 절편. 스케일 바: 200 ㎛. 도 4D는 장딴지 근육 및 서혜부 (inguinal) 지방 패드 (pad) 중량을 도시한 것이다. 결과를 평균±SEM (n=6)으로서 제시한다. *P< 0.05.
도 5A-D는 Akt1-매개된 타입 II 근육 성장이 식이-유도 중증 인슐린 저항성을 개선하였음을 보여준다. 도 5A는 절식 (좌측) 및 급식 (우측) 기간에 혈당 수 준을 도시한 것이다. 도 5B는 공복 혈청 인슐린 수준을 도시한 것이다. (도 5C) 당내성 시험. (도 5D) 생체내 골격근에서 포도당 섭취. 결과를 평균±SEM (n=8)으로서 제시한다. *P< 0.05 대 HF 식이를 급식한 대조 마우스.
도 6A-C는 Akt1-매개된 타입 IIb 근육 성장이 음식 섭취 또는 활동 수준에 무관하게 에너지 소비를 증가시켰음을 보여준다. (도 6A) 음식 소비는 골격근에서 Akt1 활성화 후 6주에 걸쳐 측정하였다 (각 군에서 n=12). (도 6B) 보행 활동 수준 (각 군에서 n=6). (도 6C) 좌측: O2 소모 (VO2), 우측: DOX 처리 4주 후의 대조군 (흰색 막대) 및 DTG (흑색 막대) 마우스에서 음식 없이 24시간 동안 대사 측정 시스템에 의해 측정된 호흡 교환비 (각 군에서 n=6). 결과를 평균±SEM으로서 제시한다. DTG = MyoMouse.
도 7A-D는 Akt1-매개된 타입 II 근육 성장이 간에서 지질 산화를 증가시켰음을 보여준다. 도 7A: 조직학적 분석. 오일 레드 (oil red)-O 염색된 간 절편. 스케일 바: 200 ㎛. 도 7B는 간에서 팔미트산의 총 지방산 β-산화를 도시한 것이다. 도 7C는 공복 혈청 케톤체 수준을 도시한 것이다. 도 7D는 간에서 정량적 실시간 PCR 분석을 도시한 것이다. 결과를 평균±SEM으로서 제시한다 (n=6).
도 8은 미오카인의 단리를 위한 대안적인 방안을 도시한 것이다: 활성화 형태의 Akt로 형질도입시킨 근원 (myogenic) 세포주.
도 9는 음용수 내에서 Dox의 투여에 의한 Akt1 유도가 주로 해당/속근 (fast twitch)을 특징으로 하는 타입 IIb 근육 섬유의 비대를 일으킴을 보여준다. 산화 적/속근 근육 섬유 (타입 I, 타입 IIa)의 성장이 보다 적은 것이 명백하다.
도 10A-F는 근육에서는 아니고 간에서 Akt-매개된 타입 IIb 근육 비대가 지질 산화를 증가시켰음을 보여준다. 도 1OA는 장딴지 골격근에서 지방산 산화 및 미토콘드리아의 생성 (biogenesis)과 연관된 상대적 mRNA 발현을 도시한 것이다 (각 군에서 n=4. *P< 0.05 대 HF/HS 식이를 급식한 대조군. ~0.05 대 정상 식이를 급식한 대조군). 도 1OB는 조직학적 분석이다. 오일 레드-O 염색된 간 절편. 스케일 바: 100 pm. 도 1OC는 간에서 팔미트산의 총 지방산 β-산화이다 (각 군에서 n=8). 도 1OD는 간에서 지방산 β-산화와 연관된 유전자의 발현을 도시한 것이다 (각 군에서 n=4). 도 10E는 혈청 (좌측) 및 뇨 (우측) 케톤체 수준 (각 군에서 n=9 내지 12). 도 1OF는 혈청 락테이트 수준 (각 군에서 n=6)을 도시한 것이다. 결과를 평균±SEM으로서 제시한다. DTG = MyoMouse.
도 11은 MyoMice에서 Akt1 활성화 후 위성 세포 증식에 대한 증거를 보여준다. 도 11은 트랜스젠 활성화의 2주 후 위성 세포 증식에 대한 증거를 보여준다. DNA 내로 BrdU 혼입이 Akt1의 활성화의 2, 4, 6, 8 및 10주 (w) 후에 MyoMice의 조직학적 절편에서 명백하였지만, 대조 (cont) 마우스에서는 없었다. 트랜스젠 도입의 2주 후 MyoMice에서 MyoD-양성 위성 세포 수의 증가에 대한 증가가 또한 검출되었다 (도시하지 않음).
도 12는 차별적인 유전자 발현 분석에 대한 조직의 개략도이다. Akt 트랜스젠 발현 전후에 식이-유도된 비만 Akt1-매개된 골격근 발현 (MyoMice)의 근육, 간 및 지방 조직에 대한 마이크로어레이 분석. 상기 조직의 분석으로 골격근 성장에 반응하여 간 및 지방 조직에서 분비된 잠재적인 수용체 및 단백질의 확인이 가능하다.
도 13A-C는 야생형 마우스에서 허혈-유도된 혈관신생 반응에 대한 MSP3을 발현하는 아데노바이러스의 영향을 보여준다. 도 13B는 마우스 뒷다리 허혈 모델을 도시한 것이고, 도 13A에 도시된 바와 같이 수술 직전에 및 수술후 0, 3, 7, 14 및 28일에 다리와 발에 대해 레이저 도플러 (Laser Doppler) 분석 (도 13B)에 의해 모니터링되는 바와 같이 아데노바이러스-발현된 MSP3은 허혈 다리에서 혈관 성장을 촉진한다. 도 13C는 MSP3을 발현하는 아데노바이러스 벡터의 근육내 주사가 레이저 도플러 분석에 의해 평가할 때 마우스의 허혈 뒷다리에서 재관류를 자극하지만, MSP6 (FGF-21) 또는 β-갈락토시다제를 발현하는 것은 그렇지 않음을 보여준다.
도 14는 WT 마우스에서 모세혈관 밀도에 대한 Adv-MSP3의 영향을 보여준다. 아데노바이러스-발현된 클론 2 (MSP3)는 허혈 다리로부터의 조직학적 절편에서 CD31-염색에 의해 평가할 때 미세혈관 형성을 촉진한다. FGF21을 발현하는 아데노바이러스 벡터는 이러한 활성을 나타내지 않는다.
도 15A-D는 당내성 시험을 도시한 것이다. MSP3은 후보 대사 조절인자이다. 아데노-MSP3의 근육내 주사는 식이-유도 비만 마우스 모델에서 당 감수성을 개선시킨다. 도 15A 및 15B는 아데노바이러스-코딩된 MSP3이 아데노바이러스-전달된 FGF-21 (MSP6으로도 알려짐)과 기능상 동등한 것으로 나타나는 것을 보여준다. 도 15C 및 15D는 MSP3이 당 감수성 및 대사 반응을 개선시키고, 이는 다른 MSPS; 즉 MSP5, MSP2, MSP4 및 MSP1에 대해서는 관찰되지 않음을 보여준다. β-gal은 음성 대조군이다.
도 16은 MSP3의 전장 뉴클레오티드 서열을 도시한 것이다. MSP3의 뉴클레오티드 서열은 "긴" (서열 1) 및 "짧은" (서열 2) 선택적-스플라이싱된 형태를 보여준다.
도 17은 염색체 2 상에서 MSP3 긴 (서열 1) 및 짧은 (서열 2) 형태의 위치를 도시한 것이다.
도 18은 마우스 (서열 3), 래트 (서열 4) 및 인간 (서열 5) 사이의 MSP3 아미노산 서열의 정렬을 도시한 것이다. 마우스와 래트 사이의 아미노산 서열 동일성은 94%이고, 마우스와 인간 사이의 서열 동일성은 79%이다. 박스로 표시한 영역은 예측 신호 서열이다.
도 19는 MSP3의 총 발현을 검출하기 위한 (즉, MSP3의 긴 (서열 1) 및 짧은 (서열 2) 이소형을 검출하기 위한) PCR 프라이머 (전방향 프라이머 3의 위치는 서열 10이고, 역방향 프라이머 3은 서열 11임)를 서열 1 및 서열 2 상에 나타낸 것을 도시한 것이다.
도 20A-B는 성체 마우스 조직에서 MSP3의 조직-특이적 발현 프로필을 도시한 것이다. 도 2OA은 RT-PCR에 의한 총 MSP3 (긴 및 짧은 형태를 합한)의 발현 프로필을 도시한 것이다. 심장, 뇌, 폐, 흉선, 림프절, 눈 및 골격근에서 발현. C2C12 근원 세포에서 Akt 발현의 상향조절. 도 2OB는 RT-PCR에 의한 성체 마우스 조직에서 MSP3의 긴 및 짧은 형태의 발현 프로필을 도시한 것이다.
도 21은 선택적 스플라이스 (alternative splice) 이소형 특이적 PCR 프라이머: MSP3의 긴 및 짧은 형태를 차별적으로 검출하기 위한 PCR 프라이머의 디자인을 보여준다. (MSP3) 클론 2의 긴 및 짧은 형태를 검출하기 위한 프라이머의 위치 및 디자인이 도시되고, MSP3의 긴 형태 (서열 1) 및 짧은 형태 (서열 2) 상에서 전방향 프라이머 1 (서열 6), 전방향 프라이머 2 (서열 8), 역방향 프라이머 1 (서열 9) 및 역방향 프라이머 2 (서열 10)의 위치가 도시된다.
도 22A-D는 MSP5가 레이저 도플러 분석에 의해 도 22D에 나타낸 바와 같이 허혈 뒷다리 복구에서 혈관신생을 촉진하는 것을 보여준다. 야생형 마우스에서 허혈-유도된 혈관신생 반응에 대한 MSP5를 발현하는 아데노바이러스 (클론 5)의 영향. 도 22D는 MSP5를 발현하는 아데노바이러스 벡터의 근육내 주사가 레이저 도플러 분석에 의해 평가할 때 마우스의 허혈 뒷다리에서 재관류를 자극하지만, MSP1 또는 β-갈락토시다제를 발현하는 것은 그렇지 않음을 보여준다.
도 23A-B는 MSP5가 근섬유 비대를 촉진하는 것을 보여준다. 도 23A는 C2C12 근세포 분화의 4일 후 MSP5 또는 MSP3 또는 MyrAkt 또는 β-gal을 발현하는 아데노바이러스로 형질감염시킴으로써 수행되는 시험관 내에서 C2C12 근세포의 MSP5-매개 비대를 평가하기 위한 프로토콜을 약술하고, 도 23B는 형질감염 4일 후 세포의 형태를 도시한 것이다. 도 23C는 MSP5, MSP3, MyrAkt 또는 β-gal을 발현하는 아데노바이러스를 사용하는 형질감염의 4일 후 근섬유 폭을 현미경으로 검사한 정량 분석을 도시한 것이다 (도 23B에 도시된 바와 같이). MSP5 또는 myrAkt를 사용하는 형질도입은 근관 (myotube) 크기에서 검출가능한 증가를 일으키지만, MSP3 또는 β -갈락토시다제를 발현하는 아데노바이러스 벡터는 어떠한 영향도 보이지 않는다.
도 24는 MSP5 또는 myrAkt1을 발현하는 아데노바이러스 벡터를 사용하여 형질도입시키면 바이러스의 부재 하의 기저선 혼입 또는 β-gal 또는 MSP3을 발현하는 아데노바이러스로 형질감염된 C2C12 세포에 비해 단백질 내로 3H-류신의 혼입을 촉진하는 것을 보여준다. 이중 실험 (좌측 및 우측 패널)로부터의 대표적인 결과가 도시된다.
도 25는 MSP5 형질감염된 C2C12 세포가 VEGF 발현을 촉진하는 것을 보여준다. C2C12 세포를 MSP5 또는 myrAkt1을 발현하는 아데노바이러스 벡터로 형질도입시키면 C2C12 세포에서 VEGF 발현을 활성화시키지만, MSP3 (클론 2)의 경우는 그렇지 않았다.
도 26A-B는 인슐린-유사 6이 시험관 내에서 (도 26B) 및 생체 내에서 (도 26A) 근육에서 Akt에 의해 조절되는 것을 보여준다. 도 26A는 인슐린-유사 6 전사체 (transcript)가 트랜스젠 유도의 2주 후 MyoMice에서 극적으로 24배 상향조절되는 것을 보여주고, 도 26B는 아데노-myrAkt1로 형질도입한 후 C2C12 세포에서 10배의 상향조절을 보여준다.
도 27A-D는 전사체 발현 수준을 RT-PCR에 의해 결정할 때 다른 릴랙신 패밀리 멤버, 예를 들어 Insl3, Insl5, 릴랙신, Insl7(릴랙신 3)은 MyoMice에서 Akt 트랜스젠 유도 후 조절되지 않음을 보여준다.
도 28A-B는 인슐린-유사 6 (Insl6) 전사체가 전경골 (TA) 근육에 심독소 (cardiotoxin) 투여 후 근육 재생 동안 상향조절되는 것을 보여준다. 도 28A는 Akt가 또한 상기 손상에 의해 상향조절되는 반면, VEGF-A 전사체는 하향조절되는 것을 보여준다 (상부 패널). 도 28B는 다른 릴랙신 패밀리 멤버, 예를 들어 Insl3, Insl5, 릴랙신, Insl7 (릴랙신 3)은 심독소-손상된 마우스 근육에서 조절되지 않음을 보여준다 (하부 패널).
도 29A-D는 인슐린-유사 6 (Insl6)을 발현하는 아데노바이러스가 C2C12 분화 또는 비대에 영향을 미치지 않음을 보여준다. 도 29A는 240 감염 다중도 (MOI)로 Adv-Insl6 또는 βgal (Gal)로 형질감염된 C2C12 세포 및 형태를 도시한 것이고, 도 29B는 다핵 근관의 수를 도시한 것이고, 도 29E는 근관 폭이 Adv-Insl6을 사용한 형질도입에 의해 영향을 받지 않음을 보여준다. 도 29C는 크레아틴 키나제 수준을, 도 29D는 류신 혼입을 Adv-Insl6 또는 Adv-βgal 대조군 (Gal)으로 형질감염된 C2C12 세포에서 비교한 것을 도시한 것이다.
도 30A-B는 인슐린-유사 6을 발현하는 아데노바이러스가 래트 골격근 위성 세포의 증식을 자극하는 것을 보여준다. 도 30A는 티미딘 (3H-티미딘) 혼입이 β-gal 대조군 형질감염된 세포에 비해 Adv-Insl6 형질감염된 세포에서 증가되는 것을 보여준다. 도 30B는 위성 세포 증식의 활성화가 Rb 단백질 (p-Rb) 증식의 증가와 동반되는 것을 보여주는 웨스턴 블롯 (WB)을 도시한 것이다.
도 31A-B는 Insl6이 심독소 (CTX) 손상 후 TA 근육 재생을 촉진하는 것을 보여준다. 도 31A는 심독소 투여의 4일 후 아데노-Insl6을 투여하면 β-gal 대조군에 비해 전경골 (TA) 근육 재생을 개선시키는 것을 보여준다. 재생 개선은 조직학 적 절편에서 7 및 14일에 가장 두드러진다 (도 31A). 도 31B는 7일에 Insl6 과다발현이 혈청 내로 크레아틴 키나제의 방출을 억제하였음을 보여주고 (하부 좌측 패널), 이는 14일에는 관찰되지 않았다 (하부 우측 패널).
도 32는 도 31A와 유사하고, 여기서 심독소 (CTX) 투여 3일 후에 아데노-Insl6을 투여한 경우에 Insl6은 β-gal 대조군에 비해 손상 1주 후 전경골 (TA)의 근육 재생을 유의하게 촉진하였다.
도 33A-D는 Insl6이 TNFα 및 TNFβ1의 발현을 감소시키고 콜라겐 3 발현을 촉진하는 것을 보여준다. 아데노-Insl6을 투여하면 근육에서 Insl6 발현을 200배 증가시키고 (도 33A), TNFα (0.2배, p<0.03) (도 33B) 및 TNFβ1 (0.9배, p>0.8) (도 33D)을 감소시키고, 손상 후 근육에서 콜라겐 3 (1.8배, p>0.6) (도 33D)을 증가시킨다. Insl6 및 TNFα는 Adv-Insl6 주사 1주 후에 투여한다 (n=2).
본 발명은 성장하는 골격근이 근육 성장, 혈관신생, 비만, 인슐린 감수성, 당 감수성, 체중, 지방량, 근 질량 및 심혈관 기능에 영향을 미치는 대사 조절인자를 분비한다는 발견에 기초한다. 본 발명자들이 발견한 대사 조절인자는 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및 Insl6이다. 따라서, 본 발명은 상기 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6을 활성화시키거나 억제하는 물질의 유효량을 투여함으로써 대사 기능을 조정하는 방법을 제공하고, 이는 다양한 질병 또는 질환, 예를 들어 비제한적으로 근육 성장, 근육 퇴행, 근 위축, 혈관신생, 비만, 인슐린-의존 질병 및 심혈관 기능과 연관된 질환의 치료에 유용하다.
<정의>
본원에서 정의되지 않으면, 본원에서 사용되는 용어는 그의 통상적인 의미를 갖고, 명세서의 문맥에서 보다 잘 이해될 수 있다.
"트랜스제닉 동물" (예를 들어, 마우스 또는 래트)은 출생 전에, 예를 들어 배아 단계에서 트랜스젠이 동물 또는 동물의 조상 내에 도입된, 그의 세포의 일부 또는 전부에 트랜스젠을 갖는 동물이다. "트랜스젠"은 트랜스제닉 동물이 그로부터 발생하는 세포의 게놈 내로 통합되는 DNA이다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "작동가능하게 연결된"은 2개 이상의 핵산 (예를 들어, DNA) 세그먼트 사이의 기능적 관계를 나타낸다: 예를 들어, 프로모터 또는 인핸서는 적절한 숙주 세포 또는 다른 발현계에서 서열의 전사를 자극할 경우에 코딩 서열에 작동가능하게 연결된 것이다. 일반적으로, 작동가능하게 연결된 서열은 인접하여 위치한다. 그러나, 인핸서는 그 전사를 향상시키는 코딩 서열에 근접하여 위치할 필요는 없다. 또한, 제2 프로모터에 의해 전사되는 인자에 의해 트랜스로 (in trans) 조절되는 프로모터로부터 전사되는 유전자는 제2 프로모터에 작동가능하게 연결되었다고 말할 수 있다. 상기 경우에, 제1 유전자의 전사는 제1 프로모터에 작동가능하게 연결된 것으로 언급되고, 제2 프로모터에 작동가능하게 연결된 것으로도 언급된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "근육" 또는 "근육 세포"는 근육 조직에 기여하는 임의의 세포를 나타낸다. 근육모세포, 위성 세포, 근관, 및 근원섬유 조직은 모두 용어 "근육 세포"에 포함된다. 근육 세포는 골격근, 심장근 및 평활근 내의 세포를 포함할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "물질" 또는 "화합물"은 질병 또는 병태를 치료하거나 예방하거나 제어하기 위해 대상에게 투여되는 화학적 실체 (entity) 또는 생물학적 산물, 또는 화학적 실체 또는 생물학적 산물의 조합물을 의미한다. 화학적 실체 또는 생물학적 산물은 반드시는 아니지만, 바람직하게는 저분자량 화합물이고, 보다 큰 화합물, 또는 임의의 유기 또는 무기 분자, 예를 들어 변형 및 비변형 핵산, 예를 들어 안티센스 핵산, RNAi, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA, 펩티드, 펩티드 모방체 (peptidomimetic), 수용체, 리간드, 및 항체, 앱타머 (aptamer), 폴리펩티드, 핵산 유사체 또는 그의 변이체일 수 있다. 예를 들어, 핵산, 아미노산, 또는 탄수화물의 올리고머, 예를 들어 단백질, 올리고뉴클레오티드, 리보자임, DNAzyme, 당단백질, siRNA, 지단백질, 앱타머 및 이들의 변형 및 조합물을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 특정 항원에 특이적으로 결합하는 능력을 갖는 면역글로불린 분자 또는 면역글로불린 분자의 단편을 의미한다. 항체는 면역학의 통상의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 무손상 항체 분자뿐만 아니라, 항원 결합 능력을 보유하는 항체 분자의 단편도 의미한다. 상기 단편은 또한 당업계에 공지되어 있고, 시험관내 및 생체내 모두에서 통상적으로 사용된다. 특히, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "항체"는 임의의 이소형 (IgA, IgG, IgE, IgD, IgM)의 무손상 면역글로불린 분자뿐만 아니라 잘 공지된 활성 단편 F(ab') (2), Fab, Fv, scFv, Fd, V(H) 및 V(L)을 의미한다. 항체 단편에 대해서는 예를 들어 문헌 ["Immunochemistry in Practice" (Johnstone and Thorpe, eds., 1996; Blackwell Science), p. 69]을 참조한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "근육 성장과 연관된 인자"는 본 발명의 방법에 의해 확인된 유전자 또는 유전자 산물을 나타낸다. 유전자 산물은 단백질, 예를 들어, 분비형 단백질, 막 결합 단백질 등일 수 있다. 별법으로, 유전자 산물은 기능적 RNA, 예를 들어 마이크로RNA, 리보자임 등일 수 있다.
용어 "핵산"은 당업계에 잘 공지되어 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이 "핵산"은 일반적으로 핵염기를 포함하는 DNA, RNA 또는 그의 유도체 또는 유사체의 분자 (즉, 스트랜드)를 의미할 것이다. 핵염기는 예를 들어 DNA에서 발견되는 천연 발생 퓨린 및 피리미딘 염기 (예를 들어 아데닌 "A", 구아닌 "G", 티민 "T" 또는 시토신 "C") 또는 RNA에서 발견되는 천연 발생 염기 (예를 들어 A, G, 우라실 "U" 또는 C)를 포함한다. 용어 "핵산"은 각각 용어 "핵산"의 하위군으로서 용어 "올리고뉴클레오티드" 및 "폴리뉴클레오티드"를 포함한다. 용어 "올리고뉴클레오티드"는 길이가 약 3 내지 약 100개의 핵염기인 분자를 의미한다. 용어 "폴리뉴클레오티드"는 길이가 약 100개 핵염기를 초과하는 적어도 하나의 분자를 의미한다. 또한, 용어 "핵산"은 폴리뉴클레오티드, 예를 들어 데옥시리보핵산 (DNA), 및, 적절한 경우, 리보핵산 (RNA)을 의미한다. 또한, 상기 용어는 동등물로서 뉴클레오티드 유사체로부터 제조된 RNA 또는 DNA의 유사체, 및 본원에서 설명되는 실시태양에 적용가능한 것으로서 단일가닥 (센스 또는 안티센스) 및 이중가닥 폴리뉴클레오티드를 포함하는 것으로서 이해되어야 한다. 용어 "폴리뉴클레오티드 서열" 및 "뉴클레오티드 서열"은 또한 본원에서 상호 교환가능하게 사용된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자"는 엑손 및 (임의로) 인트론 서열을 모두 포함하는, 폴리펩티드를 코딩하는 개방 판독 프레임을 포함하는 핵산을 나타낸다. "유전자"는 유전자 산물의 코딩 서열, 및 유전자 산물의 5'UTR 및 3'UTR 구역, 인트론 및 프로모터를 포함하는 유전자 산물의 비-코딩 구역을 의미한다. 상기 정의는 일반적으로 단일가닥 분자를 나타내지만, 특정 실시태양에서는 단일가닥 분자에 부분적으로, 실질적으로 또는 완전히 상보성인 추가의 스트랜드를 포함할 것이다. 따라서, 핵산은 이중가닥 분자, 또는 분자를 포함하는 특정 서열의 하나 이상의 상보성 스트랜드(들) 또는 "보체(들)"을 포함하는 이중가닥 분자를 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 단일가닥 핵산은 접두사 "ss"로 표시되고, 이중가닥 핵산은 접두사 "ds"로, 삼중가닥 핵산은 접두사 "is"로 표시될 수 있다. 용어 "유전자"는 폴리펩티드 사슬 생산에 관여하는 DNA의 세그먼트를 나타내고, 코딩 구역의 선행 구역 및 후행 구역 및 개개의 코딩 세그먼트 (엑손) 사이에 존재하는 서열 (인트론)을 포함한다. "프로모터"는 전사의 개시 및 속도가 제어되는 핵산 서열의 구역이다. 유전자는 핵산 서열의 특이적인 전사를 개시시키기 위해 조절 단백질 및 분자, 예를 들어 RNA 중합효소 및 다른 전사 인자가 결합할 수 있는 성분을 포함할 수 있다. 용어 "인핸서"는 핵산 서열의 전사 활성화에 관여하는 시스 작용성 (cis-acting) 조절 서열을 의미한다. 인핸서는 임의의 배향에서 기능할 수 있고, 프로모터의 상류 또는 하류에 위치할 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "유전자 산물(들)"은 유전자로부터 전사된 RNA, 또는 유전자에 의해 코딩되거나 또는 RNA로부터 번역된 폴리펩티드를 포함하는 의미로 사용된다.
용어 "폴리펩티드" 및 "단백질"은 아미노산 잔기의 중합체를 나타내기 위해 상호 교환가능하게 사용되고, 최소 길이로 제한되지 않는다. 따라서, 생물학적으로, 재조합 방식으로, 또는 합성에 의해 생산되었는지, 천연 발생 또는 비-천연 발생 아미노산으로 구성되었는지에 상관 없이 펩티드, 올리고펩티드, 이량체, 다량체 등이 상기 정의에 포함된다. 전장 단백질 및 그의 단편 모두가 상기 정의에 포함된다. 또한, 상기 용어는 폴리펩티드의 동시-번역 (예를 들어, 신호 펩티드 절단) 및 번역후 변형, 예를 들어, 디술파이드-결합 형성, 당화, 아세틸화, 포스포릴화, 단백질 분해 절단 (예를 들어, 푸린 또는 메탈로프로테아제에 의한 절단) 등을 포함한다. 또한, 본 발명의 목적에서, "폴리펩티드"는 단백질이 목적하는 활성을 유지하는 한 천연 서열에 대한 변형, 예를 들어 결실, 부가, 및 치환 (일반적으로 당업자에게 알려진 바와 같이 사실상 보존적임)을 포함하는 단백질을 의미한다. 상기 변형은 부위-지정 돌연변이 생성을 통해서와 같이 인위적일 수 있거나, 또는 예를 들어 단백질을 생산하는 숙주의 돌연변이, 또는 PCR 증폭 또는 다른 재조합 DNA 방법에 의한 오류를 통해서와 같이 우연히 발생할 수 있다. 핵산 분자를 설명하기 위해 본원에서 사용되는 재조합은 그의 기원 또는 조작에 의해, 본래 자연에서 회합되는 폴리뉴클레오티드의 전부 또는 일부와 회합되지 않은 게놈, cDNA, 바이러스, 반합성, 및/또는 합성 기원의 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 단백질 또는 폴리펩티드에 대해 사용된 용어 재조합은 재조합 폴리뉴클레오티드의 발현에 의해 생산된 폴리펩티드를 의미한다. 숙주 세포에 대해 사용된 용어 재조합은 재조합 폴리뉴클레오티드가 그 내부에 도입된 숙주 세포를 의미한다.
용어 "단백질 단편"은 본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6의 천연 발생 아미노산 서열로부터 유도가능한 합성 및 천연 발생 아미노산 서열을 모두 포함하는 의미이다. 단백질은 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6의 선택된 천연 발생 서열을 단편화함으로써 얻을 수 있는 경우에, 또는 천연 발생 아미노산 서열의 서열 또는 그 서열을 코딩하는 유전 물질 (DNA 또는 RNA)의 서열에 대한 지식을 기초로 하여 합성될 수 있는 경우에 "MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6의 천연 발생 아미노산 서열로부터 유도가능한" 것으로 말해진다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "근육 성장의 양성 조절인자"는 그의 발현이 근육 성장을 유도하고, 그의 발현의 결여가 근육 성장을 유도하지 않는 유전자 및/또는 유전자 산물을 의미한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "근육 성장의 음성 조절인자"는 그의 발현이 근육 성장을 유도하지 않고, 그의 발현의 결여가 근육 성장을 유도하는 유전자 및/또는 유전자 산물을 의미한다.
용어 분자의 "우성 음성 형태"는 야생형 단백질에 비해 세포에 대해 반대되는 표현형 작용을 보이는 구조적으로 변경된 단백질이다. 예를 들어, MSP3의 우성 음성 형태는 이 분자의 정상 신호전달을 억제할 수 있는 MSP3의 변이체이다.
용어 "기능적 유도체" 및 "모방체"는 상호 교환가능하게 사용되고, 실체 또는 분자의 생물학적 활성에 실질적으로 유사한 생물학적 활성 (기능상 또는 구조상)을 갖는 화합물을 의미한다. 용어 기능적 유도체는 분자의 단편, 변이체, 유사체 또는 화학적 유도체를 포함하는 것으로 의도된다.
용어 "기능적 유도체"는 분자의 "단편", "변이체", "유사체" 또는 "화학적 유도체"를 포함하는 것으로 의도된다. 분자의 "단편"은 분자의 임의의 폴리펩티드 하위세트를 의미한다. 활성을 갖고 가용형인 (즉, 막 결합되지 않은) 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6의 단편도 본 발명에 사용하기 위해 포함된다. 분자 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6의 "변이체"는 전체 분자, 또는 그의 단편에 구조 및 기능이 실질적으로 유사한 분자를 의미한다. 두 분자가 실질적으로 유사한 구조를 갖거나 또는 두 분자가 유사한 생물학적 활성을 가질 경우, 분자는 다른 분자와 "실질적으로 유사한" 것으로 언급된다. 따라서, 2개의 분자가 유사한 활성을 가질 경우, 한 분자의 구조가 다른 분자에서 발견되지 않거나, 또는 아미노산 잔기의 서열이 동일하지 않은 경우에도 변이체라는 용어가 본원에서 사용되기 때문에 두 분자는 변이체로서 간주된다. 분자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6의 "유사체"는 전체 분자 또는 그의 단편과 그 기능이 실질적으로 유사한 분자를 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 분자는 정상적으로는 분자의 일부가 아닌 추가의 화학 모이어티 (moiety)를 포함할 때 다른 분자의 "화학적 유도체"로 언급된다. 상기 모이어티는 분자의 용해도, 흡수, 생물학적 반감기 등을 개선할 수 있다. 모이어티는 별법으로 분자의 독성을 감소시키거나, 분자의 임의의 바람직하지 않은 부작용을 제거하거나 약화시킬 수 있다. 상기 효과를 매개할 수 있는 모이어티는 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 18th edition, A. R. Gennaro, Ed., MackPubl., Easton, PA(1990)]에 개시되어 있다.
용어 "대상" 및 "개체"는 본원에서 상호 교환가능하게 사용되고, 본 발명에 따른 제약 조성물을 사용하여 예방적 처치를 포함하는 치료가 시행되는 동물, 예를 들어 인간을 의미한다. 본원에서 사용되는 바와 같이 용어 "대상"은 인간 및 비-인간 동물을 의미한다. 용어 "비-인간 동물" 및 "비-인간 포유동물"은 본원에서 상호 교환가능하게 사용되고, 모든 척추동물, 예를 들어, 포유동물, 예를 들어 비-인간 영장류 (특히 고등 영장류), 양, 개, 설치류 (예를 들어 마우스 또는 래트), 기니아피그, 염소, 돼지, 고양이, 토끼, 소, 및 비-포유동물, 예를 들어 닭, 양서류, 파충류 등을 포함한다. 한 실시태양에서, 대상은 인간이다. 다른 실시태양에서, 대상은 실험 동물 또는 질병 모델로서의 동물 대용물이다. 이 용어는 특정 연령 또는 성별을 나타내지 않는다. 따라서, 암수 불문하고 성인 및 신생아 대상, 및 태아를 포함하는 것이다. 대상의 예는 인간, 개, 고양이, 소, 염소 및 마우스를 포함한다. 용어 대상은 추가로 트랜스제닉 종을 포함하는 것이다.
용어 "조직"은 무손상 세포, 혈액, 혈액 제제, 예를 들어 혈장 및 혈청, 뼈, 관절, 근육, 평활근, 및 장기를 포함하는 것이다.
용어 "질병" 또는 "질환"은 본원에서 상호 교환가능하게 사용되고, 신체 또는 일부 장기의 임의의 변경, 기능의 수행의 방해 또는 교란 및/또는 이환된 사람에게 또는 이환된 사람과 접촉시에 신체 또는 일부 장기의 상태의 임의의 변경, 불안, 기능 장애, 고통 또는 심지어 사망과 같은 증상의 유발을 의미한다. 질병 또는 질환은 또한 불안, 고통, 괴로움, 결함, 장애, 건강치 못함, 증상 호소, 감정에 관련될 수 있다.
"조성물" 또는 "제약 조성물"은 본원에서 상호 교환가능하게 사용되고, 대체로 부형제, 예를 들어 당업계에 통상적이고 세포 투여에 적합한 제약상 허용되는 담체를 포함하는 조성물을 의미한다. 세포는 예를 들어 치료, 진단 또는 예방을 위한 대상의 일부일 수 있다. 또한, 세포는 배양될 수 있고, 예를 들어 잠재적인 제약 조성물의 스크리닝을 위한 분석의 일부로서의 세포일 수 있고, 세포는 연구를 위한 트랜스제닉 동물의 일부일 수 있다. 조성물은 또한 세포 배양액일 수 있고, 여기서 폴리펩티드 또는 본 발명의 대사 조절인자를 코딩하는 폴리뉴클레오티드가 세포 및/또는 배양 배지 내에 존재한다. 또한, 국소 (예를 들어, 경구 점막, 호흡기 점막) 및/또는 경구 투여를 위한 조성물은 당업계에 공지되고 본원에 기재한 바와 같이 용액, 현탁액, 정제, 알약, 캡슐, 지효성 제형, 구강세정제, 또는 분말을 형성할 수 있다. 또한, 조성물은 안정화제 및 방부제를 포함할 수 있다. 담체, 안정화제 및 어쥬번트 (adjuvant)의 예에 대해서는 문헌 [University of the Sciences in Philadelphia (2005) Remington: The Science and Practice of Pharmacy with Facts and Comparisons, 21st Ed]을 참조한다.
본원에서 사용되는 용어 "유효량"은 질병 또는 질환의 적어도 하나 또는 일부의 증상을 완화시키기 위한 제약 조성물의 치료제의 양을 의미한다.
"인슐린-저항 질환"은 외인성 인슐린의 작용에 대한 말초 조직의 정상 대사 반응의 실패 (불감증)에 의해 발생하는 질병, 병태 또는 질환이다. 즉, 이 질환은 인슐린의 존재가 정상 미만의 생물학적 반응을 유발하는 병태이다. 임상 측면에서, 인슐린 저항성은 정상 또는 상승된 수준의 인슐린에도 불구하고 정상 또는 상승된 혈당 수준이 유지될 때 존재한다. 이것은 본질적으로 기저 글리코겐 합성 또는 인슐린 자극된 글리코겐 합성, 또는 둘 모두가 정상 수준 미만으로 감소되는 글리코겐 합성 억제를 나타낸다. 인슐린 저항성은 2형 당뇨병에 존재하는 고혈당증이 때때로 외관상 인슐린에 대한 말초 조직의 감수성을 회복하기에 충분한 식이 또는 체중 감소에 의해 역전될 수 있다는 사실에 의해 입증된 바와 같이 2형 당뇨병에서 중요한 역할을 수행한다. 이 용어는 비정상 당내성, 및 인슐린 저항성이 중요한 역할을 수행하는 많은 질환, 예를 들어 비만, 당뇨병, 난소 남성호르몬 과다증, 및 고혈압을 포함한다. "당뇨병"은 인슐린 작용의 상대적 또는 절대적 결여에 의해 발생하는 만성 고혈당증, 즉, 혈액 내에 과량의 당이 존재하는 상태를 의미한다. 당뇨병의 3가지 기본형, 즉, I형 또는 인슐린-의존 당뇨병 (IDDM), II형 또는 인슐린-비의존 당뇨병 (NIDDM), 및 A형 인슐린 저항성이 존재하지만, A형은 비교적 드물다. I형 또는 II형 당뇨병의 환자는 다양한 메카니즘을 통한 외인성 인슐린의 효과에 대해 불감증으로 될 수 있다. A형 인슐린 저항성은 인슐린 수용체 유전자의 돌연변이 또는 포도당 대사에 중요한 수용체 후 (post-receptor) 작용 부위의 결함에 의해 발생한다. 당뇨병 대상은 의사가 쉽게 알 수 있고, 고혈당증, 손상된 당내성, 당화 헤모글로빈 및 일부 경우에 외상 또는 병과 연관된 케톤산증이라는 특징을 갖는다.
용어 "인슐린-비의존 당뇨병" 또는 "NIDDM"은 II형 당뇨병을 나타낸다. NIDDM 환자는 절식시에 비정상으로 높은 혈당 농도를 갖고 식사 후에 또는 당내성 시험으로 알려진 진단 시험 후에 세포의 포도당 섭취가 지연된다. NIDDM은 승인된 기준에 기초하여 진단된다 (American Diabetes Association, Physician's Guide to Insulin-Dependent (Type I) Diabetes, 1988; American Diabetes Association, Physician's Guide to Non-Insulin-Dependent (Type II) Diabetes, 1988).
본원에서 사용되는 용어 "암"은 인간 또는 동물 대상에서 세포 증식성 질병을 의미한다. 본원에서 상호 교환가능하게 사용되는 용어 "종양" 또는 "종양 세포"는 조절되지 않은 증식을 보이는 조직 덩어리 또는 조직 유형 또는 세포 유형을 의미한다.
용어 "길항제" 또는 "억제제"는 본원에서 상호 교환가능하게 사용되고, 단백질, 그의 폴리펩티드 부분, 또는 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 활성을 억제할 수 있는 임의의 물질 또는 실체를 의미한다. 따라서, 길항제는 전사, 번역, 전사후 또는 번역후 프로세싱을 억제하거나 또는 직접 또는 간접 작용을 통해 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 활성을 임의의 방식으로 억제하도록 작용할 수 있다. 길항제는 예를 들어 핵산, 펩티드, 또는 임의의 다른 적합한 화학적 화합물 또는 분자 또는 이들의 임의의 조합물일 수 있다. 추가로, 단백질, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드의 활성을 간접적으로 손상시킬 때, 길항제는 조절인자로서 작용할 수 있는 세포성 분자 또는 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 자체의 활성에 영향을 미칠 수 있음이 이해될 것이다. 이와 유사하게, 길항제는 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 의해 그 자체가 조절 또는 조정되는 분자의 활성에 영향을 미칠 수 있다.
본원에서 사용되는 용어 "억제"는 반드시 발현 및/또는 활성의 완전한 억제를 의미하는 것은 아니다. 대신에, 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 또는 핵산의 발현 또는 활성은 목적하는 효과 생성에 충분한 정도로 및/또는 충분한 시간 동안 억제된다.
용어 "작용제"는 단백질, 그의 폴리펩티드 부분, 또는 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 활성을 활성화시키거나 향상시킬 수 있는 임의의 물질 또는 실체를 의미한다. 따라서, 작용제는 유전자 발현을 촉진하도록, 예를 들어 유전자 전사, 번역, 전사후 또는 번역후 프로세싱을 촉진하거나 또는 직접 또는 간접 작용을 통해 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 활성을 임의의 방식으로 활성화시키도록 작용할 수 있다. 작용제는 예를 들어 핵산, 펩티드, 또는 임의의 다른 적합한 화학적 화합물 또는 분자 또는 이들의 임의의 조합물일 수 있다. 추가로, 단백질, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드의 활성을 간접적으로 촉진시킬 때, 작용제는 조절인자로서 작용할 수 있는 세포성 분자 또는 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 자체의 활성에 영향을 미칠 수 있음이 이해될 것이다. 이와 유사하게, 작용제는 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 의해 그 자체가 조절 또는 조정되는 분자의 활성에 영향을 미칠 수 있다. 작용제는 또한 그 첨가 전에 세포에 존재하거나 존재하지 않았는지에 무관하게, 세포에서 유전자 및/또는 유전자 산물의 활성의 증가를 유도할 수 있는 임의의 물질을 의미한다. 예를 들어, MSP1을 활성화시키는 물질 또는 MSP1의 작용제는 세포 내에 이미 존재하는 MSP1 핵산의 발현을 활성화시킬 수 있는 물질이거나, 물질은 MSP1 또는 그의 기능적 유도체를 코딩하는 핵산일 수 있거나, 물질은 MSP1이 세포 내에 이미 존재하는지에 무관하게 MSP1의 폴리펩티드일 수 있거나, 물질은 MSP1 모방체 또는 MSP1의 기능적 유도체, 예를 들어 MSP1의 유사체일 수 있다.
용어 "활성화시키는" 또는 "활성화시키다"는 본원에서 상호 교환가능하게 사용되고, 단백질, 그의 폴리펩티드 부분, 또는 폴리뉴클레오티드 또는 본 발명의 대사 조절인자의 활성의 전반적인 증가를 의미한다. 활성화는 반드시 대사 조절인자의 발현의 완전한 활성화 및/또는 활성을 의미하는 것은 아니고, 목적하는 효과 생성에 충분한 정도로 및/또는 충분한 시간 동안 활성화되는 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 발현 또는 활성의 전반적인 또는 총 증가를 의미한다.
용어 "실체"는 임의의 구조 분자 또는 분자의 조합물을 의미한다.
본원에서 사용되는 용어 "RNAi"는 유전자 발현을 억제하는 RNA-기재의 RNA 간섭 (RNAi) 분자를 의미한다. RNAi는 작은 간섭 RNA 분자 (siRNA)에 의한 특이적 mRNA의 파괴에 의한 선택적인 전사후 유전자 침묵화 (silencing) 수단을 의미한다. siRNA는 일반적으로 한 스트랜드가 불활성화되는 메신저 RNA와 동일한 이중가닥 RNA의 절단에 의해 생성된다.
본원에서 사용되는 용어 "shRNA"는 RNAi 및/또는 siRNA 종으로서 기능하는 짧은 헤어핀 RNA를 나타내지만, shRNAi 종이 증가된 안정성을 위해 이중가닥 헤어핀-유사 구조를 갖는다는 점에서 상이하다.
용어 "항체"는 항원에 결합할 수 있는 면역글로불린 단백질을 의미한다. 본원에서 사용되는 항체는 관심 있는 항원 또는 항원성 단편에 결합할 수 있는 항체 단편, 예를 들어 F(ab')2, Fab', Fab를 포함하는 의미이다. 용어 "인간화 항체"는 본원에서 2개의 완전 경쇄 및 2개의 완전 중쇄로 이루어진 완전 항체 분자, 및 항체 단편, 예를 들어 Fab, Fab', F(ab')2, 및 Fv로만 이루어진 항체를 설명하기 위해 사용되고, 여기서 CDR은 비-인간 공급원으로부터 유래되고 Ig 분자 또는 그의 단편의 나머지 부분은 바람직하게는 인간 항체를 코딩하는 핵산 서열로부터 생산된 인간 항체로부터 유래된다. 용어 "인간 항체" 및 "인간화 항체"는 본원에서 항체 분자의 모든 부분이 인간 항체를 코딩하는 핵산 서열로부터 유래되는 항체를 설명하기 위해 사용된다. 상기 인간 항체는 상기 항체가 인간 환자에서 면역 반응을 거의 또는 전혀 유발하지 않을 것이기 때문에 항체 요법에 사용하기에 가장 바람직하다.
용어 "키메라 항체"는 상기 용어 "인간화 항체"의 정의에서 설명한 바와 같은 항체 분자 및 항체 단편을 설명하기 위해 사용된다. 용어 "키메라 항체"는 인간화 항체를 포함한다. 키메라 항체는 제1 포유동물 종으로부터 유래된 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열의 적어도 하나의 부분 및 제2의 상이한 포유동물 종으로부터 유래된 중쇄 또는 경쇄 아미노산 서열의 다른 부분을 갖는다.
본원에서 사용되는 용어 "세포"는 임의의 세포, 원핵세포 또는 진핵세포, 예를 들어 식물, 효모, 벌레, 곤충 및 포유동물을 의미한다. 포유동물 세포는 영장류, 인간 및 마우스, 햄스터, 토끼, 개, 고양이, 가축, 예를 들어 말, 소, 뮤린, 양, 개, 고양이 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 관심 있는 임의의 동물로부터의 세포를 포함한다. 세포는 근육 세포, 간장 세포, 간 세포, 지방 세포, 조혈, 신경, 중간엽, 피부, 점막, 간질, 근육, 비장, 세망내피, 상피, 내피, 간, 신장, 위장관, 폐, T-세포 등 (이로 제한되지 않음)과 같은 매우 다양한 조직 유형일 수 있다. 조혈, 신경, 간질, 근육, 심혈관, 간, 폐, 위장관 줄기 세포 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 줄기 세포, 배아 줄기 (ES) 세포, ES-유래 세포 및 줄기 세포 전구세포도 포함된다. 효모 세포도 본 발명에서 세포로서 사용될 수 있다. 세포는 또한 자손체가 사실상 모 세포와 동일하지 않을 수 있도록 하는 특정 변형 또는 환경적인 영향, 예를 들어 분화 때문에 특정 대상 세포뿐만 아니라 상기 세포의 자손체 또는 잠재적인 자손체를 의미하고, 본 발명의 범위에 포함된다.
본 발명에서 사용되는 세포는 또한 예를 들어 시험관내 또는 생체 외에서 배양된 세포일 수 있다. 예를 들어, 세포는 배양 배지에서 시험관 내에서 배양된다. 별법으로, 생체 외에서 배양된 세포의 경우, 세포는 건강하고/하거나 질병에 걸린 경우에 대상으로부터 얻을 수 있다. 세포는 비제한적인 예로서 생검 또는 당업자에게 알려진 다른 수술 방법에 의해 얻을 수 있다. 본 발명에서 사용되는 세포는 대상에, 예를 들어 생체 내에 존재할 수 있다. 본 발명에서 생체내 세포에 대해 사용하기 위해, 세포는 바람직하게는 대상에서 발견되고, 질병, 질환 또는 악성 병리학적 특성을 보인다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "치료"는 부적절한 증식과 연관된 병태, 질병 또는 질환, 예를 들어 암의 적어도 하나의 유해한 효과 또는 증상의 감소 또는 완화를 포함한다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "투여" 및 "도입"은 본원에서 상호 교환가능하게 사용되고, 대사 조절인자에 영향을 미치는 물질을 목적하는 부위에 적어도 부분적으로 위치시키는 방법 또는 경로에 의해 본 발명의 대사 조절인자에 영향을 미치는 물질을 대상 내에 위치시키는 것을 의미한다. 본 발명의 화합물은 대상을 효과적으로 치료하는 임의의 적절한 경로로 투여될 수 있다.
본원에서 사용되는 구문 "비경구 투여" 및 "비경구 투여되는"은 소화관내 및 국소 투여 이외의 다른, 대체로 주사에 의한 투여 방식을 의미하고, 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 뇌실내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 거미막하, 척수내, 뇌척수내, 및 흉골내 주사 및 주입을 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 본원에서 사용되는 구문 "전신 투여", "전신 투여된", "말초 투여" 및 "말초 투여된"은 동물 시스템 내에 도입되어 대사 및 다른 유사한 과정을 거치도록 심혈관 줄기 세포 및/또는 이들의 자손체 및/또는 화합물 및/또는 다른 물질을 중추신경계 내로 직접적으로 투여하는 것 이외의 다른 방식으로 투여하는 것, 예를 들어 피하 투여를 의미한다.
구문 "제약상 허용되는"은 본원에서 올바른 의료적 판단 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응, 또는 다른 문제 또는 합병증을 야기하지 않으면서 인간 및 동물의 조직과 접촉하여 사용하기 적합하고 합리적인 유익/위험 비가 적당한 화합물, 물질, 조성물, 및/또는 투여 형태를 의미하기 위해 사용된다.
본원에서 사용되는 구문 "제약상 허용되는 담체"는 대상 물질을 하나의 장기 또는 신체의 일부로부터 다른 장기 또는 신체의 일부로 운반 또는 수송하는데 관련되는 제약상 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예를 들어 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분과 상용성이라는 의미에서 "허용가능"해야 한다.
용어 "재생"은 세포 집단, 장기 또는 조직의 재성장을, 일부 실시태양에서는 질병 또는 외상 후의 재성장을 의미한다.
"플라스미드"와 상호 교환가능하게 사용되는 용어 "벡터"는 자체에 연결된 다른 핵산을 수송할 수 있는 핵산 분자를 의미한다. 작동가능하게 연결된 유전자 및/또는 핵산 서열의 발현을 지시할 수 있는 벡터는 본원에서 "발현 벡터"로 언급된다. 일반적으로, 재조합 DNA 기술에서 유용한 발현 벡터는 종종 이들의 벡터 형태로 염색체에 결합되지 않은, 환상 이중가닥 DNA 루프로 언급되는 "플라스미드" 형태이다. 다른 발현 벡터, 예를 들어 플라스미드, 에피좀, 박테리오파지 또는 바이러스 벡터 (이로 제한되지 않음)가 본 발명의 상이한 실시태양에서 사용될 수 있고, 상기 벡터는 숙주의 게놈 내로 통합되거나 또는 특정 세포 내에서 자가 복제될 수 있다. 동등한 기능을 하는 당업자에게 공지된 다른 형태의 발현 벡터가 또한 사용될 수 있다. 발현 벡터는 DNA를 코딩하는 안정한 또는 일시 발현을 위한 발현 벡터를 포함한다.
용어 "바이러스 벡터"는 핵산 구성체의 세포 내로의 운반체로서의 바이러스, 또는 바이러스-연관 벡터를 의미한다. 구성체는 세포 내로의 감염 또는 형질도입을 위한 레트로바이러스 및 렌티바이러스 벡터를 포함하여 아데노바이러스, 아데노-연관 바이러스 (AAV), 또는 단순 포진 바이러스 (HSV) 등과 같은 비-복제성의 결함있는 바이러스 게놈 내로 통합되어 패키징될 수 있다. 벡터는 세포 게놈 내로 통합되거나 되지 않을 수 있다. 구성체는 원하는 경우 형질감염을 위한 바이러스 서열을 포함할 수 있다. 별법으로, 구성체는 에피좀 복제가 가능한 벡터, 예를 들어 EPV 및 EBV 벡터 내로 통합될 수 있다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 본원에서 상호 교환가능하게 사용되는 "프로모터" 또는 "프로모터 구역" 또는 "프로모터 요소"는 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사를 조절하는 핵산 서열, 일반적으로 DNA 또는 RNA 또는 그의 유사체 (이로 제한되지 않음)의 세그먼트를 의미한다. 프로모터 구역은 RNA 중합효소 인식, 결합 및 전사 개시에 충분한 특이적 서열을 포함한다. 상기 프로모터 구역 부분은 프로모터로서 언급된다. 또한, 프로모터 구역은 RNA 중합효소의 상기 인식, 결합 및 전사 개시 활성을 조정하는 서열을 포함한다. 상기 서열은 시스 작용성일 수 있거나 또는 트랜스활성 인자에 대해 반응성일 수 있다. 조절 특성에 따라, 프로모터는 구성적 (constitutive)이거나 또는 조절될 수 있다.
용어 "조절 서열"은 본원에서 "조절 요소"와 상호 교환가능하게 사용되고, 작동가능하게 연결된 핵산 서열의 전사를 조정하여 전사 조정인자로서 작용하는 핵산, 일반적으로 DNA 또는 RNA 또는 그의 유사체 (이로 제한되지 않음)의 세그먼트의 요소를 의미한다. 조절 서열은 작동가능하게 연결된 유전자 및/또는 핵산 서열의 발현을 조정한다. 조절 서열은 종종 전사 결합 도메인인 핵산 서열이고 전사 단백질의 핵산-결합 도메인 및/또는 전사 인자, 리프레서 또는 인핸서 등에 의해 인식되는 "조절 요소"를 포함한다. 전형적인 조절 서열은 전사 프로모터, 유도가능 프로모터 및 전사 요소, 전사를 조절하는 임의의 오퍼레이터 서열, 적합한 mRNA 리보솜 결합 부위를 코딩하는 서열, 및 전사 및/또는 번역의 종결을 제어하는 서열을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
조절 서열은 단일 조절 서열 또는 다수 조절 서열, 또는 변형된 조절 서열 또는 그의 단편일 수 있다. 변형된 조절 서열은 핵산 서열이 몇몇 수단, 예를 들어 돌연변이, 메틸화 등 (이로 제한되지 않음)에 의해 변화 또는 변형된 조절 서열이다.
본원에서 사용되는 용어 "작동가능하게 연결된"은 핵산 서열과 뉴클레오티드의 조절 서열, 예를 들어 프로모터, 인핸서, 전사 및 번역 중지 부위, 및 다른 신호 서열과의 기능적 관계를 나타낸다. 예를 들어, 핵산 서열, 대개 DNA의 조절 서열 또는 프로모터 구역에 대한 작동가능한 연결은 DNA를 특이적으로 인식하고 결합하여 전사하는 RNA 중합효소에 의해 조절 서열 또는 프로모터로부터 상기 DNA의 전사가 개시되도록 하는, DNA와 조절 서열 또는 프로모터 사이의 물리적 및 기능적 관계를 나타낸다. 발현 및/또는 시험관내 전사를 최적화하기 위해서, 그들이 발현되는 세포 종류 내에서 핵산 또는 DNA의 발현을 위한 조절 서열을 변형시키는 것이 필요할 수 있다. 상기 변형의 바람직한 정도 또는 필요성은 실험에 의해 결정할 수 있다.
부정관사 ("a" 및 "an")는 본원에서 물품의 하나 또는 하나 초과의 (즉, 적어도 하나의) 문법적 대상을 의미하기 위해 사용된다. 예로서, "요소"는 하나의 요소 또는 하나 초과의 요소를 의미한다.
대사 조절인자
본 발명은 대사 기능을 조정하는 대사 조절인자, 예를 들어 근 질량, 지방량, 혈관신생, 인슐린 감수성과 당 감수성 및 심혈관 기능에 영향을 미치는 대사 조절인자의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 대사 조절인자는 아래에서 보다 상세하게 설명되는 MSP1 (서열 16), MSP2 (서열 17), MSP3 (서열 1 및 서열 2), MSP4 (서열 18), MSP5 (서열 12) 및 인슐린-유사 단백질 6 (Insl6) (서열 20)의 군으로부터 선택되는 적어도 하나이다.
한 실시태양에서, 본 발명의 대사 조절인자는 근육 분비형 단백질 1 (MSP1)이고, 이는 RefSeq ID: BC52844 또는 Rikin 클론 2160028F08Rik (서열 16)으로서 확인될 수 있다. 일부 실시태양에서, MSP1은 MSP1의 인간 상동체 또는 MSP1의 인간 동족체 (cognate)이고, 일부 실시태양에서, MSP1은 MSP1의 설치류 이소형 또는 MSP1의 임의의 포유동물 이소형, 예를 들어 영장류 MSP1이다. 또한, 용어 MSP1에는 MSP1의 모든 변이체 및 상동체, 및 MSP1의 기능적 유도체, 예를 들어 MSP1의 돌연변이체 변이체 및/또는 대안적인 이소형, 예를 들어 MSP1의 선택적 스플라이싱된 이소형, MSP1의 단편 또는 MSP1의 재조합 형태가 포함된다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 대사 조절인자는 근육 분비형 단백질 2 (MSP2)이고, 이는 RefSeq ID: AK009779 또는 Rikin 클론 2310043I08Rik (서열 17)로서 확인될 수 있다. 일부 실시태양에서, MSP2는 MSP2의 인간 상동체 또는 MSP2의 인간 동족체이고, 일부 실시태양에서, MSP2는 MSP2의 설치류 이소형 또는 MSP2의 임의의 포유동물 이소형, 예를 들어 영장류 MSP2이다. 또한, 용어 MSP2에는 MSP2의 모든 변이체 및 상동체, 및 MSP2의 기능적 유도체, 예를 들어 MSP2의 돌연변이체 변이체 및/또는 대안적인 이소형, 예를 들어 MSP2의 선택적 스플라이싱된 이소형, MSP2의 단편 또는 MSP2의 재조합 형태가 포함된다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 대사 조절인자는 근육 분비형 단백질 3 (MSP3)이고, 이는 RefSeq ID: NM_026754 또는 Rikin 클론 1110017I16Rik (서열 1) 또는 아미노산 서열 NP_660357 (서열 5)로서 확인된다. 일부 실시태양에서, MSP3은 MSP3의 인간 상동체 또는 MSP3의 인간 동족체이고, 일부 실시태양에서, MSP3은 MSP3의 설치류 이소형, 예를 들어 아미노산 서열 Refseq ID: NP_O81030 (서열 3) 또는 XP_001066258 (서열 4) 또는 MSP3의 임의의 포유동물 이소형, 예를 들어 영장류 MSP3이다. 또한, 용어 MSP3에는 MSP3의 모든 변이체 및 상동체, 및 MSP3의 기능적 유도체, 예를 들어 MSP3의 돌연변이체 변이체 및/또는 대안적인 이소형, 예를 들어 MSP3의 선택적 스플라이싱된 이소형, 예를 들어 도 16에 도시된 바와 같은 MSP3의 긴 이소형 (서열 1) 또는 MSP3의 짧은 이소형 (서열 2), 또는 MSP3의 단편, 예를 들어 신호 펩티드가 결핍된 MSP3, 또는 MSP3의 재조합 형태가 포함된다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 대사 조절인자는 근육 분비형 단백질 4 (MSP4)이고, 이는 RefSeq ID: BC025830 또는 기탁 번호 AK028883 (서열 18) 또는 Rikin 클론 4732466D17Rik (서열 18)로서 확인될 수 있다. 일부 실시태양에서, MSP4는 MSP4의 인간 상동체 또는 MSP4의 인간 동족체이고, 일부 실시태양에서, MSP4는 MSP4의 설치류 이소형 또는 MSP4의 임의의 포유동물 이소형, 예를 들어 영장류 MSP4이다. 또한, 용어 MSP4에는 MSP4의 모든 변이체 및 상동체, 및 MSP4의 기능적 유도체, 예를 들어 MSP4의 돌연변이체 변이체 및/또는 대안적인 이소형, 예를 들어 MSP4의 선택적 스플라이싱된 이소형, MSP4의 단편 또는 MSP4의 재조합 형태가 포함된다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 대사 조절인자는 근육 분비형 단백질 5 (MSP5)이고, 이는 RefSeq ID: AK005465 또는 NM_024237 또는 Rikin 클론 1600015H20Rik (서열 12) 또는 아미노산 서열 NP_694946 (서열 15)으로서 확인된다. 일부 실시태양에서, MSP5는 MSP5의 인간 상동체 또는 MSP5의 인간 동족체이고, 일부 실시태양에서, MSP5는 MSP5의 설치류 이소형, 예를 들어 아미노산 서열 Refseq ID: XP_001081124 (서열 13) 또는 NP_077199 (서열 14) 또는 MSP5의 임의의 포유동물 또는 비-포유동물 이소형, 예를 들어 무척추동물 MSP5 또는 영장류 MSP5이다. 또한, 용어 MSP5에는 MSP5의 모든 변이체 및 상동체, 및 MSP5의 기능적 유도체, 예를 들어 MSP5의 돌연변이체 변이체 및/또는 대안적인 이소형, 예를 들어 MSP5의 선택적 스플라이싱된 이소형, 또는 MSP5의 단편, 예를 들어 신호 펩티드가 결핍된 MSP5, 또는 MSP5의 재조합 형태가 포함된다.
다른 실시태양에서, 본 발명의 대사 조절인자는 인슐린-유사 단백질 6 (Insl6)이고, 이는 릴랙신 패밀리의 멤버이고, RefSeq ID: NM_007179 (서열 20) 또는 기탁 번호 AF_156094 (서열 20) 또는 아미노산 서열 NP_009110 (서열 21)으로서 확인된다. 일부 실시태양에서, Insl6은 Insl6의 인간 상동체 또는 Insl6의 인간 동족체이고, 일부 실시태양에서, Insl6은 Insl6의 설치류 이소형, 또는 Insl6의 임의의 포유동물 또는 비-포유동물 이소형, 예를 들어 무척추동물 Insl6 또는 영장류 MSP5이다. 또한, 용어 Insl6에는 Insl6의 모든 변이체 및 상동체, 및 Insl6의 기능적 유도체, 예를 들어 Insl6의 돌연변이체 변이체 및/또는 대안적인 이소형, 예를 들어 Insl6의 선택적 스플라이싱된 이소형, 또는 Insl6의 단편, 예를 들어 신호 펩티드가 결핍된 Insl6, 또는 Insl6의 재조합 형태가 포함된다.
본 발명의 한 측면은 본 발명의 대사 조절인자를 활성화시키는 물질을 포함하는 조성물에 관한 것이다. 일부 실시태양에서, 상기 물질은 본 발명의 대사 조절인자를 코딩하는 핵산 서열이고, 예를 들어 물질은 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6, 또는 그의 변이체 또는 상동체 또는 단편 또는 기능적 유도체를 코딩하는 외인성 또는 내인성 유전자의 핵산이다. 일부 실시태양에서, 물질은 내인성 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6의 발현을 활성화한다. 다른 실시태양에서, 물질은 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6 또는 그의 기능적 유도체 또는 상동체 또는 변이체, 또는 대사 조절인자의 재조합 변이체의 펩티드 또는 폴리펩티드이다. 다른 실시태양에서, 물질은 대사 조절인자의 작용제, 예를 들어 대사 조절인자의 발현을 유도하는 물질 또는 대사 조절인자의 펩티드 또는 유전자 산물을 활성화시키는 물질, 예를 들어 비제한적으로 불활성 대사 조절인자 단백질을 활성화시키거나 대사 조절인자 단백질 전구체를 활성화시키는 물질, 또는 전사후 산물 또는 대사 조절인자 유전자를 활성화시키는, 예를 들어 전사체, 예를 들어 대사 조절인자를 코딩하는 mRNA 전사체를 활성화시키는 물질이다. 일부 실시태양에서, 물질이 대사 조절인자를 코딩하는 핵산인 경우에, 핵산은 대사 조절인자의 기능적 유도체 또는 변이체 또는 재조합 버전을 코딩할 수 있다.
일부 실시태양에서, 대사 조절인자를 코딩하는 핵산은 기능적 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6 (예를 들어, 전장 단백질), 또는 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6 단백질의 기능상 활성 단편을 코딩하는 게놈 DNA, cDNA, mRNA, RNA 또는 그의 단편의 일부이다. 용어 "기능상 활성"은 전장 (야생형) MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6 폴리펩티드와 연관된 하나 이상의 기능을 갖는 단편, 유도체 또는 유사체를 나타낸다.
일부 실시태양에서, 물질이 대사 조절인자를 코딩하는 핵산인 경우에, 대사 조절인자는 대사 조절인자를 코딩하는 물질이 투여되는 대상과 동일한 종으로부터 유래된 것이고, 예를 들어 대사 조절인자는 인간으로부터 유래된 것이고 대상은 인간이다. 다른 실시태양에서, 대사 조절인자를 코딩하는 핵산은 상이한 종으로부터 유래된 것이고, 예를 들어 핵산은 비-인간 포유동물, 예를 들어 영장류 또는 마우스로부터의 대사 조절인자를 코딩하고, 대상은 인간이거나, 다른 예는 핵산이 인간 대사 조절인자를 코딩하고, 대상은 비-인간 동물, 예를 들어 트랜스제닉 동물, 또는 설치류 또는 비-포유동물, 예를 들어 무척추동물, 예를 들어 제브라피쉬 (zebrafish)인 것이고, 일부 실시태양에서 대상은 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 마우스에서 과다발현된 마우스 대사 조절인자)인 동물이다. 일부 실시태양에서, 대사 조절인자는 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6의 동족체 이종 유전자이다. 동족체 이종 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6 유전자는 다른 종으로부터의 상응하는 유전자를 나타내고; 따라서, 뮤린 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6이 참조물이면, 인간 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6 유전자는 동족체 이종 유전자이다 (다른 종으로부터의 근육 관련 유전자와 함께, 관련된 돼지, 양, 또는 래트 근육에서처럼). 일부 실시태양에서, MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6 유전자는 인간 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6 또는 그의 기능상 활성 단편을 코딩할 수 있다.
대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6 단백질은 "상동성" 또는 "이종 폴리펩티드"일 수 있다. "이종발생 (xenogenic) 폴리펩티드"로도 언급되는 "이종 폴리펩티드"는 트랜스제닉 비-인간 동물을 구성하지 않는 유기체에서 발견되는 아미노산 서열을 갖는 폴리펩티드이다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "폴리펩티드"는 아미노산의 중합체 및 그의 동등체를 의미하고, 생성물의 특정 길이를 의미하지 않는다. 따라서, 펩티드, 올리고펩티드 및 단백질은 폴리펩티드의 정의에 포함된다. 유도체는 다른 서열에 비해 보존적 아미노산 치환을 갖는 폴리펩티드이다. 유도체는 예를 들어 당화, 아세틸화, 포스포릴화 등과 같은 변형을 포함하는 단백질의 다른 변형을 추가로 포함한다.
동족체 이종 단백질 서열을 코딩하는 상이한 유전자 세그먼트를 포함하는 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6 유전자는 트랜스제닉 동물 이외의 다른 유기체의 종으로부터, 예를 들어 혼성화 또는 DNA 서열결정에 의해 쉽게 확인될 수 있다. 일부 실시태양에서, 동족체 대사 조절인자는 상동성 근육 관련 트랜스젠과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 동일하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 2개 이상의 핵산 또는 폴리펩티드 서열에 대해서 용어 "동일한" 또는 "% 동일성"은 다음 서열 비교 알고리즘 중의 하나를 사용하여, 또는 시각적 검사에서 의해 측정시에 동일하거나 또는 최대 대응도로 정렬하여 비교할 때 동일한 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기의 특정 백분율을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 나타낸다. 2개의 핵산 또는 폴리펩티드에 대해서 구문 "실질적으로 동일한"은 다음 서열 비교 알고리즘 중의 하나를 사용하여, 또는 시각적 검사에서 의해 측정시에 최대 대응도로 정렬하여 비교할 때 적어도 60%, 일반적으로 80%, 가장 일반적으로 90-95%의 뉴클레오티드 또는 아미노산 잔기 동일성을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 나타낸다. 2개의 폴리펩티드 서열이 "실질적으로 동일하다"는 표시는 하나의 폴리펩티드가 제2 폴리펩티드에 대해 유도된 항체와 면역학상 반응성임을 의미한다.
일부 실시태양에서, 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6 단백질은 상동성 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6 단백질과 적어도 75%, 적어도 80%, 적어도 85%, 적어도 90% 또는 적어도 95% 유사하다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 2개 이상의 폴리펩티드 서열에 대해서 "유사성" 또는 "% 유사성"은 다음 서열 비교 알고리즘 중의 하나를 사용하여, 또는 시각적 검사에서 의해 측정시에 동일하거나 또는 최대 대응도로 정렬하여 비교할 때 동일한 아미노산 잔기 또는 그의 보존적 치환의 특정 백분율을 갖는 2개 이상의 서열 또는 하위서열을 나타낸다. 예로서, 제1 아미노산 서열은 제1 서열에 포함된 아미노산 개수와 동일한 개수를 비교하거나, 또는 아래에서 논의되는 당업계에 공지된 컴퓨터 유사성 프로그램에 의해 정렬된 폴리펩티드의 정렬을 비교할 때 제1 아미노산 서열이 제2 아미노산 서열과 적어도 50%, 60%, 70%, 75%, 80%, 90%, 또는 심지어 95% 동일하거나, 또는 보존적으로 치환될 때 제2 아미노산 서열과 유사한 것으로 간주될 수 있다.
폴리펩티드 서열에 대해서 용어 "실질적인 유사성"은 폴리펩티드가 참조 서열에 대해 적어도 60%의 서열 동일성, 또는 참조 서열에 대해 70%, 또는 80%, 또는 85%의 서열 동일성, 또는 가장 바람직하게는 약 10-20개 아미노산 잔기의 비교 영역에 걸쳐 90%의 동일성을 갖는 서열을 포함함을 나타낸다. 아미노산 서열에 대해서, "실질적인 유사성"은 추가로 아미노산의 보존적 치환을 포함한다. 따라서, 폴리펩티드는 예를 들어 2개의 펩티드가 하나 이상의 보존적 치환에 의해 상이할 경우 제2 폴리펩티드에 실질적으로 유사하다.
본 발명의 유전자의 인간 상동체의 결정은 당업자에 의해 쉽게 확인될 수 있다. "상동성" 또는 "동일성" 또는 "유사성"은 2개의 펩티드 사이의 또는 2개의 핵산 분자 사이의 서열 유사성을 의미한다. 상동성 및 동일성은 각각 비교 목적으로 정렬될 수 있는 각각의 서열 내의 위치를 비교함으로서 결정할 수 있다. 비교되는 서열 내의 동일한 위치에 동일한 염기 또는 아미노산이 존재할 때, 분자는 그 위치에서 동일하고; 동일한 부위에 동일한 또는 유사한 아미노산 잔기 (예를 들어, 입체 및/또는 전자 특성이 유사함)가 위치할 때, 분자는 그 위치에서 상동성인 (유사한) 것으로 언급될 수 있다. 상동성/유사성 또는 동일성의 백분율로서의 표현은 비교되는 서열에 의해 공유되는 위치에서 동일 또는 유사한 아미노산의 수의 함수를 의미한다. "비관련된" 또는 "비-상동성"인 서열은 본원의 서열과 40% 미만의 동일성, 바람직하게는 25% 미만의 동일성을 공유한다.
한 실시태양에서, 대사 조절인자와 회합하는 것으로 확인된 유전자 전사체에 대한 "인간 상동체"는 인간 또는 동물, 예를 들어 마우스 또는 트랜스제닉 동물의 게놈에 의해 코딩되는 MSP1. MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6 유전자 서열의 전장 뉴클레오티드 서열에 대해 적어도 약 55%의 상동성을 갖는 DNA 서열을 의미한다. 한 실시태양에서, MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6과 회합하는 것으로 확인된 단백질에 대한 "인간 상동체"는 본 발명의 트랜스제닉 동물의 게놈에 의해 코딩되는 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6과 회합하는 것으로 확인된 단백질의 전장 아미노산 서열에 대해 40%의 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 약 50%, 보다 더 바람직하게는, 적어도 약 60%의 상동성, 보다 더 바람직하게는, 적어도 약 70%의 상동성, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 75%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 80%의 상동성, 훨씬 더 바람직하게는 적어도 약 85%의 상동성, 보다 더 바람직하게는 적어도 약 90%의 상동성, 보다 바람직하게는 적어도 약 95%의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 의미한다. 상기 논의한 바와 같이, 상동성은 적어도 약 50% 내지 100% 및 그 사이의 모든 값 (즉, 55%, 60%, 70%, 75%, 80%, 85%, 90%, 95%, 98% 등)이다.
폴리펩티드를 설명할 때 용어 "보존적 치환"은 폴리펩티드의 활성을 실질적으로 변경시키지 않는 폴리펩티드의 아미노산 조성의 변화를 의미한다. 따라서, 특정 아미노산 서열의 "보존적 치환"은 폴리펩티드 활성에 중요하지 않은 상기 아미노산의 치환, 또는 중요한 아미노산의 치환도 활성을 실질적으로 변경시키지 않도록 아미노산을 유사한 특성 (예를 들어, 산성, 염기성, 양전하 또는 음전하를 띈, 극성 또는 비극성 등)을 갖는 다른 아미노산으로 치환하는 것을 의미한다. 기능상 유사한 아미노산을 제공하는 보존적 치환 표는 당업계에 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 다음 6개의 군은 각각 서로에 대해 보존적 치환인 아미노산을 포함한다: 1) 알라닌 (A), 세린 (S), 트레오닌 (T); 2) 아스파르트산 (D), 글루탐산 (E); 3) 아스파라긴 (N), 글루타민 (Q); 4) 아르기닌 (R), 라이신 (K); 5) 이소류신 (I), 류신 (L), 메티오닌 (M), 발린 (V); 및 6) 페닐알라닌 (F), 타이로신 (Y), 트립토판 (W) (또한, 문헌 [Creighton, Proteins, W. H. Freeman and Company (1984)] 참조). 또한, 코딩된 서열 내의 하나의 아미노산 또는 작은 비율의 아미노산을 변경, 부가 또는 결실시키는 개별적인 치환, 결실 또는 부가도 "보존적 치환"이다.
서열 비교를 위해, 대개 하나의 서열은 시험 서열이 비교되는 참조 서열로서 기능한다. 서열 비교 알고리즘을 사용할 때, 시험 및 참조 서열을 컴퓨터에 입력하고, 필요한 경우 하위서열 좌표 (coordinate)를 지정하고, 서열 알고리즘 프로그램 파라미터를 지정한다. 이어서, 서열 비교 알고리즘은 지정된 프로그램 파라미터를 기초로 하여 참조 서열에 대한 시험 서열(들)의 % 서열 동일성을 계산한다.
비교를 위한 서열의 최적 정렬은 예를 들어 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2:482 (1981)]의 국소 상동성 알고리즘에 의해, 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443-53 (1970)]의 상동성 정렬 알고리즘에 의해, 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-48 (1988)]의 유사성 탐색 방법에 의해, 상기 알고리즘의 컴퓨터 실행에 의해 (예를 들어, 미국 위스콘신주 매디슨 사이언스 드라이브 575 소재의 제네틱스 컴퓨터 그룹 (Genetics Computer Group)의 위스콘신 제네틱스 소프트웨어 패키지 (Wisconsin Genetics Software Package)의 GAP, BESTFIT, FASTA, 및 TFASTA), 또는 시각적 검사에 의해 수행하였다 (일반적으로 문헌 [Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, 4th ed., John Wiley and Sons, New York (1999)] 참조).
유용한 알고리즘의 한 예는 PILEUP이다. PELEUP은 % 서열 동일성을 제시하기 위해 단계적인 쌍 (pairwise) 정렬을 사용하여 일군의 관련 서열로부터 다수의 서열 정렬을 생성시킨다. 이것은 또한 정렬을 생성시키기 위해 사용된 클러스터링 관계를 보여주는 트리 (tree) 또는 덴도그램 (dendogram)을 작성한다. PELEUP은 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Feng and Doolittle, J. Mol. Evol. 25:351-60 (1987)]의 단계적인 정렬 방법의 단순화를 이용한다. 사용된 방법은 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Higgins and Sharp, Comput. Appl. Biosci. 5:151-53 (1989)]에 기재된 방법과 유사하다. 프로그램은 각각 최대 길이가 5,000 뉴클레오티드 또는 아미노산인 300개 이하의 서열을 정렬할 수 있다. 다수의 정렬 절차는 2개의 가장 유사한 서열의 쌍 정렬로 시작하고, 2개의 정렬된 서열 클러스터를 생성시킨다. 이어서, 상기 클러스터를 다음으로 가장 관련된 서열 또는 정렬된 서열의 클러스터에 정렬시킨다. 서열의 2개의 클러스터는 2개의 개별적인 서열의 쌍 정렬의 간단한 연장에 의해 정렬된다. 최종 정렬은 일련의 단계적인 쌍 정렬에 의해 달성한다. 프로그램은 서열 비교 구역에 대해 특이적 서열 및 이들의 아미노산 또는 뉴클레오티드 좌표를 지정하고 프로그램 파라미터를 지정함으로써 구동된다. 예를 들어, 참조 서열은 다음 파라미터를 사용하여 % 서열 동일성 관계를 결정하기 위해 다른 시험 서열과 비교될 수 있다: 디폴트 (default) 갭 (gap) 가중치 (3.00), 디폴트 갭 길이 가중치 (0.10), 및 가중 말단 갭.
% 서열 동일성 및 서열 유사성을 결정하기 위해 적합한 알고리즘의 다른 예는 BLAST 알고리즘이고, 이는 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Altschul et al., J. Mol. Biol. 215:403-410 (1990)]에 기재되어 있다 (또한 본원에 참고로 포함되는 문헌 ([Zhang et al., Nucleic Acid Res. 26:3986-90 (1998)]; [Altschul et al., Nucleic Acid Res. 25:3389-402 (1997)]) 참조). BLAST 분석을 수행하기 위한 소프트웨어는 내셔날 센터 포 바이오테크놀로지 인포메이션 (National Center for Biotechnology Information) 인터넷 웹 사이트로부터 공개적으로 입수가능하다. 상기 알고리즘은 먼저 데이타베이스 서열 내의 동일한 길이의 단어와 정렬시에 몇몇 양의 값의 역치 스코어 T에 일치하거나 이를 충족시키는 탐색 (query) 서열 내의 길이 W의 짧은 단어를 확인함으로써 높은 스코어의 서열쌍 (HSP)을 확인하는 것을 수반한다. T는 이웃 단어 스코어 역치로서 언급된다 (Altschul et al. (1990), 상기 문헌). 상기 초기 이웃 단어 히트 (hit)는 이들을 포함하는 보다 긴 HSP를 발견하기 위한 탐색을 개시하기 위한 출발점으로서 작용한다. 이어서, 단어 히트는 누적 정렬 스코어가 증가될 수 있는 최대 범위까지 각각의 서열을 따라 양 방향으로 연장된다. 각 방향에서의 단어 히트의 연장은 누적 정렬 스코어가 그의 최대 달성값으로부터 X만큼 저하되거나; 누적 스코어가 하나 이상의 음수의 스코어의 잔기 정렬 축적에 의해 0 이하로 되거나; 또는 서열 말단에 도달할 때 중지한다. BLAST 알고리즘 파라미터 W, T, 및 X는 정렬의 감도 및 속도를 결정한다. BLAST 프로그램은 디폴트로서 11의 단어길이 (W), 50의 BLOSUM62 스코어링 매트릭스 (본원에 참고로 포함되는 문헌 [Henikoff and Henikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:10915-9 (1992)] 참조) 정렬 (B), 10의 예상치 (E), M=5, N=-4, 및 두 스트랜드의 비교를 사용한다.
% 서열 동일성 계산에 추가로, BLAST 알고리즘은 또한 2개의 서열 사이의 유사성에 대한 통계학적 분석을 수행한다 (예를 들어 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Karlin and Altschul, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-77 (1993)] 참조). BLAST 알고리즘에 의해 제공되는 하나의 유사성 척도는 2개의 뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 사이의 일치가 우연히 발생할 확률을 제시하는 최소 총 확률 (P(N))이다. 예를 들어, 핵산은 시험 핵산을 참조 핵산에 비교할 때 최소 총 확률이 약 0.1 미만, 보다 일반적으로 약 0.01 미만, 가장 일반적으로 약 0.001 미만일 경우 참조 서열에 유사한 것으로 간주된다.
또한, 본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6의 상동체가 본 발명에서 사용하기 위해 포함되고, 예를 들어 발현 라이브러리로부터 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6의 발현에 의해 확인될 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Sambrook et al. (2001). Molecular cloning: a laboratory manual, 3rd ed. (Cold Spring Harbor, N.Y., Cold Spring Harbor Laboratory Press); Ausubel et al., 상기 문헌] 참조). 돌연변이된 내인성 유전자 서열은 이종 트랜스젠으로서 언급될 수 있다; 예를 들어, 천연 발생 뮤린 게놈에서 알려지지 않은 뮤린 근육 관련 유전자 내의 돌연변이를 코딩하는 트랜스젠은 뮤린 및 비-뮤린 종에 대한 이종 트랜스젠이다. MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6 유전자는 또한 변형된 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6 단백질, 예를 들어 그 개시 내용이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 출원 공개 2004/0048255 및 2004/0132156에 개시된 것을 코딩할 수 있다.
물질
본 발명에 유용한 물질은 본 발명의 대사 조절인자의 활성을 표적으로 하는 임의의 실체 (생물학적 또는 화학적)이다. 물질은 대사 조절인자를 활성화시키는 작용제로서, 또는 대사 조절인자의 활성을 억압하거나 억제하는 길항제로서 기능할 수 있다. 물질은 소분자, 단백질, 폴리펩티드, 핵산, 안티센스 핵산, RNAi, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA, 펩티드, 펩티드 모방체, 수용체, 리간드, 및 항체, 앱타머, 폴리펩티드, 핵산 유사체 또는 그의 변이체, 예를 들어 핵산, 아미노산, 또는 탄수화물의 올리고머, 예를 들어 단백질, 올리고뉴클레오티드, 리보자임, DNAzyme, 당단백질, siRNA, 지단백질, 앱타머, 및 이들의 변형체 및 조합물일 수 있다.
물질은 전사, 번역, 전사후 또는 번역후 프로세싱을 억제하거나 또는 직접 또는 간접 작용을 통해 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드의 활성에 임의의 방식으로 영향을 미치도록 작용할 수 있다. 물질은 예를 들어 핵산, 펩티드, 또는 임의의 다른 적합한 화학적 화합물 또는 분자 또는 이들의 임의의 조합물일 수 있다. 추가로, 물질이 단백질, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드의 활성에 간접적으로 영향을 미칠 수 있고, 예를 들어 물질이 조절인자로서 작용할 수 있는 세포성 분자 또는 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드 자체의 활성에 영향을 미칠 수 있음이 이해될 것이다. 이와 유사하게, 물질은 단백질, 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 의해 그 자체가 조절 또는 조정되는 분자의 활성에 영향을 미칠 수 있다.
일부 실시태양에서, 물질은 유전자 발현을 조정하기 위해 유전자 전사 수준에서 작용하고, 예를 들어 작용제는 유전자 발현을 활성화시키고 길항제는 유전자 전사를 억제하도록 작용할 것이다. 일부 실시태양에서, 물질은 단백질 기능을 조정하기 위해 단백질 수준에서 작용하고, 예를 들어 작용제는 단백질 활성을 활성화 및/또는 향상시킬 것이고, 길항제는 단백질의 활성을 억제 및/또는 억압할 수 있다. 다른 실시태양에서, 물질은 대사 조절인자를 코딩하는 핵산 또는 핵산 유사체이다. 또다른 실시태양에서, 물질은 펩티드 또는 폴리펩티드이고, 예를 들어 작용제는 단백질의 생물학적 활성 또는 기능적 유도체인 반면, 길항제는 예를 들어 억제성 폴리펩티드 또는 우성 음성 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명의 대사 조절인자의 폴리펩티드, 그의 단편 및 유도체는 임의의 적합한 방법에 의해 얻을 수 있다. 예를 들어, 폴리펩티드는 통상적인 재조합 핵산 기술, 예를 들어 DNA 또는 RNA, 바람직하게는 DNA를 사용하여 생산될 수 있다. 재조합 DNA 기술을 사용하는 폴리펩티드의 생산을 위한 방법 및 물질에 관한 지침 및 정보는 많은 논문 및 참고 매뉴얼에서 볼 수 있다 (예를 들어, 문헌 ([Sambrook et al, 1989, Molecular Cloning - A Laboratory Manual, 2nd Ed., Cold Spring Harbor Press]; [Ausubel et al. (eds.), 1994, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, Inc.]; [Innis et al. (eds.), 1990 PCR Protocols, Academic Press]) 참조).
별법으로, 본 발명의 대사 조절인자의 폴리펩티드 또는 그의 단편은 예를 들어 공급사의 지시에 따라 시판 펩티드 합성기를 사용하여 화학 합성에 의해 직접 얻을 수 있다. 폴리펩티드의 화학 합성을 위한 방법 및 물질은 당업계에 잘 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 [Merrifield, 1963, "Solid Phase Synthesis," J. Am. Chem. Soc. 83:2149-2154] 참조).
본 발명의 대사 조절인자의 폴리펩티드는 단백질을 무손상 세포 내로 수송하기 위한 통상적인 기술을 사용하여, 예를 들어 폴리펩티드를 안테나페디아 (Antennapedia)로부터 유도된 내재화 (internalization) 펩티드 서열 (Bonfanti et al., Cancer Res. 57:1442-1446)에 또는 핵 국재화 단백질, 예를 들어 HIV tat 펩티드 (미국 특허 5,652,122)에 융합시켜 세포 내로 도입될 수 있다.
별법으로, 본 발명의 대사 조절인자의 폴리펩티드는 단백질을 코딩하는 DNA, 예를 들어 대사 조절인자, 예를 들어 MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및 Insl6 또는 그의 상동체 또는 기능적 유도체를 코딩하는 핵산을 통상적인 발현 벡터에 도입한 후에 또는 카테터에 의해 또는 생체외 이식에 의해 세포 내에서 발현될 수 있다.
일부 실시태양에서, 본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및 Insl6의 폴리펩티드 또는 펩티드 또는 그의 단편 또는 상동체 또는 변이체인 물질은 절단가능한 펩티드이다. 절단가능한 펩티드는 세포에서 발현되고 주위 조직에서 발견되거나 또는 포유동물에서 감염을 확립할 수 있는 미생물에 의해 생산되는 프로테아제 또는 펩티다제 또는 다른 절단제에 의해 인식되는 아미노산 서열을 포함하는 펩티드이다. 효소-절단가능 펩티드는 반드시 요구되지는 않지만, 아미노산 인식 서열 이외에 하나 이상의 아미노산을 포함할 수 있고; 추가의 아미노산은 인식 서열의 아미노 말단, 카르복시 말단, 또는 아미노 및 카르복시 말단 모두에 부가될 수 있다. 예를 들어 자동 펩티드 합성기에서 아미노산을 아미노산 서열에 부가하는 수단, 및 예를 들어 상기 절단의 아미노산 산물에 대한 크로마토그래피 분석에 의한 펩티드의 절단을 검출하기 위한 수단은 당업자에게 잘 알려져 있다. 효소-절단가능한 펩티드의 길이는 대개 약 2 내지 20개의 아미노산이다.
본 발명에 유용한 펩티드 또는 폴리펩티드 물질은 예를 들어 이들의 친수성을 증가시키기 위해서 이들의 아미노 말단에서 변형될 수 있다. 증가된 친수성은 모 펩티드-지질 컨쥬게이트가 통합된 지질-기재 담체의 표면에 대한 펩티드의 노출을 향상시킨다. 친수성을 증가시키기 위해 펩티드에 부착하기에 적합한 극성기는 잘 알려져 있고, 예를 들어 비제한적으로 아세틸 ("Ac"), 3-시클로헥실알라닐 ("Cha"), 아세틸-세린 ("Ac-Ser"), 아세틸-세릴-세린 ("Ac-Ser-Ser-"), 숙시닐 ("Suc"), 숙시닐-세린 ("Suc-Ser"), 숙시닐-세릴-세린 ("Suc-Ser-Ser"), 메톡시 숙시닐 ("MeO-Suc"), 메톡시 숙시닐-세린 ("MeO-Suc-Ser"), 메톡시 숙시닐-세릴-세린 ("MeO-Suc-Ser-Ser") 및 세릴-세린 ("Ser-Ser-")기, 폴리에틸렌 글리콜 ("PEG"), 폴리아크릴아미드, 폴리아크릴로모르폴린, 폴리비닐피롤리딘, 폴리히드록실기 및 카르복시 당, 예를 들어 락토비온산, N-아세틸 뉴라민산 및 시알산기를 포함한다. 상기 당의 카르복시기는 아미드 연결을 통해 펩티드의 N-말단에 연결될 것이다. 현재, 바람직한 N-말단 변형은 메톡시-숙시닐 변형이다.
유전자 요법
특정 실시태양에서, 핵산 서열은 코딩되는 산물을 생성시키기 위해 발현되는 생체 내에 직접 투여된다. 이는 당업계에 공지된 임의의 수많은 방법에 의해, 예를 들어 이들을 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 제조하고, 벡터를 세포 내에 존재하도록 투여함으로써, 예를 들어 결손 또는 약화된 레트로바이러스 또는 다른 바이러스 벡터를 사용한 감염에 의해 (미국 특허 4,980,286 참조), 또는 네이키드 (naked) DNA의 직접 주사, 또는 미세입자 폭격 (bombardment) (예를 들어, 유전자 총; 바이오리스틱 (Biolistic), 듀퐁 (Dupont)), 또는 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질감염제를 사용한 코팅, 리포좀, 미세입자, 또는 미세캡슐 내의 캡슐화에 의해, 또는 핵에 도입되는 것으로 알려진 펩티드에 연결하여 투여함으로써, 수용체-매개된 세포내 이입 (endocytosis)에 적용되는 리간드에 연결하여 투여함으로써 (예를 들어, 문헌 [Wu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432 (1987)] 참조) (수용체를 특이적으로 발현하는 세포 유형을 표적화하기 위해 사용될 수 있는) 달성할 수 있다. 다른 실시태양에서, 리간드가 엔도좀 (endosome)을 붕괴시켜 핵산이 리소좀 분해를 방지하도록 하는 융합생성 (fusogenic) 바이러스 펩티드를 포함하는 핵산-리간드 복합체가 형성될 수 있다. 또다른 실시태양에서, 핵산은 특이적 수용체를 표적화함으로써 세포 특이적 섭취 및 발현에 대해 생체 내에서 표적화될 수 있다 (예를 들어 PCT 공개 WO 92/06180; WO 92/22635; WO92/20316; WO93/14188, WO 93/20221 참조). 별법으로, 핵산은 세포 내로 도입되어 상동성 재조합에 의해 발현을 위한 숙주 세포 DNA 내에 통합될 수 있다 (Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935 (1989); Zijlstra et al., Nature 342:435-438 (1989)).
특정 실시태양에서, 본 발명의 대사 조절인자의 인간 상동체를 코딩하는 핵산 서열을 함유하는 바이러스 벡터가 사용된다. 예를 들어, 레트로바이러스 벡터가 사용될 수 있다 (Miller et al., Meth. Enzymol. 217:581-599 (1993) 참조). 상기 레트로바이러스 벡터는 바이러스 게놈의 정확한 패키징 및 숙주 세포 DNA 내로의 통합에 필요한 성분을 포함한다. 유전자 요법에 사용되는 근육 성장과 연관된 인자의 인간 상동체를 코딩하는 핵산 서열을 유전자의 환자 내로의 전달을 용이하게 하는 하나 이상의 벡터 내로 클로닝한다. 레트로바이러스 벡터에 대한 보다 상세한 내용은 줄기 세포를 화학요법에 대해 보다 내성을 갖도록 만들기 위해 mdrl 유전자를 조혈 줄기 세포에 전달하기 위한 레트로바이러스 벡터의 용도를 기재하고 있는 문헌 [Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994)]에서 볼 수 있다. 유전자 요법에서 레트로바이러스 벡터의 용도를 제시하는 다른 문헌은 다음과 같다: [Clowes et al., J. Clin. Invest. 93:644-651 (1994)]; [Kiem et al., Blood 83:1467-1473 (1994)]; [Salmons and Gunzberg, Human Gene Therapy 4:129-141 (1993)]; 및 [Grossman and Wilson, Curr. Opin. in Genetics and Devel. 3:110-114 (1993)].
아데노바이러스가 유전자 요법에 사용될 수 있는 다른 바이러스 벡터이다. 아데노바이러스는 유전자를 호흡기 상피에 전달하기 위해 특히 매력적인 비히클이다. 아데노바이러스는 자연에서 호흡기 상피를 감염시키고 여기서 경증의 질병을 유발한다. 아데노바이러스-기반 전달계에 대한 다른 표적은 간, 중추신경계, 내피 세포 및 근육이다. 아데노바이러스는 비분할 세포를 감염시킬 수 있다는 잇점이 있다. 문헌 [Kozarsky and Wilson, Current Opinion in Genetics and Development 3:499-503 (1993)]에서는 아데노바이러스-기반 유전자 요법을 개괄하였다. 문헌 [Bout et al., Human Gene Therapy 5:3-10 (1994)]에서는 유전자를 붉은털 원숭이의 호흡기 상피로 전달하기 위한 아데노바이러스 벡터의 사용을 입증하였다. 다른 바람직한 바이러스 벡터는 폭스 바이러스, 예를 들어 우두, 예를 들어 약화된 우두, 예를 들어 변형 우두 바이러스 앙카라형 (Modified Virus Ankara; MVA) 또는 NYVAC, 조류 폭스, 예를 들어 계두 또는 카나리 폭스이다. 유전자 요법에 아데노바이러스를 사용하는 다른 예는 문헌 ([Rosenfeld et al., Science 252:431-434 (1991)]; [Rosenfeld et al., Cell 68:143-155 (1992)]; [Mastrangeli et al., J. Clin. Invest. 91:225-234 (1993)]; PCT 출원 공개 WO94/12649; 및 [Wang, et al., Gene Therapy 2:775-783 (1995)])에서 볼 수 있다. 하나의 바람직한 실시태양에서, 아데노바이러스 벡터가 사용된다. 다른 실시태양에서, 렌티바이러스 벡터, 예를 들어 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 6,143,520; 5,665,557; 및 5,981,276에 기재된 HIV 기반 벡터가 사용된다.
아데노-연관 바이러스 (AAV) 벡터의 용도가 또한 고려된다 (Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993); 미국 특허 5,436,146).
유전자 요법을 위한 다른 방안은 전기천공, 리포펙션 (lipofection), 인산칼슘 매개된 형질감염, 또는 바이러스 감염과 같은 방법에 의해 유전자를 조직 배양액 내에서 세포로 전달하는 것을 포함한다. 보통, 전달 방법은 선택가능 마커의 세포로의 전달을 포함한다. 이어서, 세포는 전달된 유전자를 흡수하여 발현하고 있는 세포를 단리하기 위해 선택 조건 하에 배치한다. 이어서, 상기 세포를 환자에게 전달한다.
미국 특허 5,676,954 (본원에 참고로 포함됨)에서는 양이온성 리포좀 담체와 복합체화된 유전 물질을 마우스에 주사하는 것을 보고한 바 있다. 미국 특허 4,897,355, 4,946,787, 5,049,386, 5,459,127, 5,589,466, 5,693,622, 5,580,859, 5,703,055 및 국제 특허 출원 공개 WO 94/9469 (본원에 참고로 포함됨)에서는 DNA를 세포 및 포유동물 내로 형질감염시키는데 사용하기 위한 양이온성 지질을 제공한다. 미국 특허 5,589,466, 5,693,622, 5,580,859, 5,703,055 및 국제 특허 출원 공개 WO 94/9469 (본원에 참고로 포함됨)에서는 DNA-양이온성 지질 복합체를 포유동물에 전달하기 위한 방법을 제공한다. 상기 양이온성 지질 복합체 또는 나노입자는 또한 단백질을 전달하기 위해 사용될 수 있다. 단백질은 바람직하게는 핵 국재화 서열을 함유할 것이다.
유전자 및 단백질 요법의 방법에 대한 전반적인 내용에 대해서는, 문헌 ([Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488-505 (1993)]; [Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95 (1991)]; [Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol. Toxicol. 32:573-596 (1993)]; [Mulligan, Science 260:926-932 (1993)]; 및 [Morgan and Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217 (1993)]; [May, TIBTECH 11(5):155-215 (1993)])을 참조한다. 사용될 수 있는, 당업계에 일반적으로 공지된 방법은 문헌 ([Ausubel et al. (eds.), Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY (1993)]; 및 [Kriegler, Gene Transfer and Expression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY (1990)])에 기재되어 있다.
유전자 또는 핵산 서열은 임의의 적합한 방법에 의해 표적 세포 내로 도입될 수 있다. 예를 들어, 대사 조절인자는 형질감염 (예를 들어, 인산칼슘 또는 DEAE-덱스트란 매개된 형질감염), 리포펙션, 전기천공, 미세주사 (예를 들어, 네이키드 DNA의 직접 주사에 의한), 바이오리스틱, 근육 관련 트랜스젠을 포함하는 바이러스 벡터를 사용한 감염, 세포 융합, 염색체-매개된 유전자 전달, 미세세포-매개된 유전자 전달, 핵 전달 등에 의해 세포 내로 도입될 수 있다. 대사 조절인자를 코딩하는 핵산 물질은 전기천공 (예를 들어 Wong and Neumann, Biochem. Biophys. Res. Commun. 107:584-87 (1982) 참조) 및 바이오리스틱 (예를 들어, 유전자 총; Johnston and Tang, Methods Cell Biol. 43 Pt A:353-65 (1994); Fynan et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90: 11478-82 (1993))에 의해 세포 내로 도입될 수 있다.
특정 실시태양에서, 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6 또는 그의 기능적 유도체를 코딩하는 유전자 또는 핵산 서열은 형질감염 또는 리포펙션에 의해 표적 세포 내로 도입될 수 있다. 형질감염 또는 리포펙션에 적합한 물질은 예를 들어 인간칼슘, DEAE 덱스트란, 리포펙틴, 리프펙타민, DIMRIE C, 수퍼펙트 (Superfect), 및 에펙틴 (Effectin) (퀴아겐 (Qiagen)), 우니펙틴, 맥시펙틴, DOTMA, DOGS (트랜스펙탐 (Transfectam); 디옥타데실아미도글리실스페르민), DOPE (1,2-디올레오일-sn-글리세로-3-포스포에탄올아민), DOTAP (1,2-디올레오일-3-트리메틸암모늄 프로판), DDAB (디메틸 디옥타데실암모늄 브로마이드), DHDEAB (N,N-디-n-헥사데실-N,N-디히드록시에틸 암모늄 브로마이드), HDEAB (N-n-헥사데실-N,N-디히드록시에틸암모늄 브로마이드), 폴리브렌, 폴리(에틸렌이민) (PEI) 등을 포함한다 (예를 들어, 문헌 ([Banerjee et al., Med. Chem. 42:4292-99 (1999)]; [Godbey et al., Gene Ther. 6:1380-88 (1999)]; [Kichler et al., Gene Ther. 5:855-60 (1998)]; [Birchaa et al., J. Pharm. 183:195-207 (1999)] 참조).
또한, 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6, 또는 그의 기능적 유도체를 코딩하는 유전자 또는 핵산 서열은 세포의 감염에 의해 세포 내로 또는 돌연변이체 유전자를 포함하는 감염성 바이러스와의 접합체의 세포 내로 도입될 수 있다. 적합한 바이러스는 레트로바이러스 (일반적으로 문헌 [Jaenisch, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 73:1260-64 (1976)] 참조); 결손 또는 약화된 레트로바이러스 벡터 (예를 들어, 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 4,980,286; 문헌 ([Miller et al., Meth. Enzymol. 217:581-99 (1993)]; [Boesen et al., Biotherapy 6:291-302 (1994)]) 참조), 렌티바이러스 벡터 (예를 들어, 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Naldini et al., Science 272:263-67 (1996)] 참조), 아데노바이러스 또는 아데노-연관 바이러스 (AAV) (예를 들어, 그 전문이 본원에 참고로 포함되는 문헌 ([Ali et al., Gene Therapy 1:367-84 (1994)]; 미국 특허 4,797,368 및 5,139,941; [Walsh et al., Proc. Soc. Exp. Biol. Med. 204:289-300 (1993)]; [Grimm et al., Human Gene Therapy 10:2445-50 (1999)]) 참조)를 포함한다.
바이러스 벡터는 예를 들어 배아 줄기 세포, 원시 생식 세포, 난모세포, 나자, 정모세포, 정자 세포, 수정란, 접합체, 할구, 또는 임의의 다른 적합한 표적 세포 내로 도입될 수 있다. 예시적인 실시태양에서, 분할하는 세포를 형질도입시키는 레트로바이러스 벡터 (예를 들어, 뮤린 백혈병 바이러스로부터 유래된 벡터; 예를 들어, 문헌 [Miller and Baltimore, Mol. Cell. Biol. 6:2895 (1986)] 참조)가 사용될 수 있다. 관심 있는 유전자를 갖는 재조합 레트로바이러스 벡터의 생산은 일반적으로 2개의 단계로 달성된다. 먼저, 대사 조절인자를, 대사 조절인자의 효율적인 발현에 필요한 서열 (바이러스 말단의 긴 반복서열 (LTR) 또는 내부 프로모터/인핸서에 의해 제공될 수 있는 프로모터 및/또는 인핸서 요소 및 관련 스플라이싱 신호 포함), 바이러스 RNA의 감염성 비리온으로의 효율적인 패키징에 요구되는 서열 (예를 들어, 패키징 신호 (Psi), tRNA 프라이머 결합 부위 (-PBS), 역전사에 필요한 3' 조절 서열 (+PBS)), 및 바이러스 LTR)을 포함하는 레트로바이러스 벡터 내에 삽입할 수 있다. LTR은 바이러스 게놈 RNA의 회합, 역전사효소 및 인테그라제 기능에 필요한 서열, 및 바이러스 입자 내에 패키징될 게놈 RNA의 발현 유도에 관련되는 서열을 포함한다.
재조합 벡터의 제조 후에, 벡터 DNA는 패키징 세포주 내로 도입된다. 패키징 세포주는 목적하는 숙주 범위를 갖는 바이러스 게놈 RNA의 바이러스 입자 내로의 패키징을 위해 트랜스로 요구되는 바이러스 단백질 (예를 들어, 바이러스-코딩 코어 (gag), 중합효소 (pol) 및 외피 (env) 단백질)을 제공한다. 숙주 범위는 부분적으로는 바이러스 입자의 표면 상에 발현되는 외피 유전자 산물의 유형에 의해 조절된다. 패키징 세포주는 동종숙주역 (ecotrophic), 양생 (amphotropic) 또는 친이종 (xenotropic) 외피 유전자 산물을 발현할 수 있다. 별법으로, 패키징 세포주에는 바이러스 외피 (env) 단백질을 코딩하는 서열이 결여될 수 있다. 이 경우에, 패키징 세포주는 바이러스 게놈을 막-회합된 단백질 (예를 들어, env 단백질)이 결여된 입자 내로 패키징할 수 있다. 바이러스의 세포 내로의 도입을 허용하는 막-회합된 단백질을 포함하는 바이러스 입자를 생성시키기 위해서, 레트로바이러스 서열을 포함하는 패키징 세포주를 막-회합된 단백질 (예를 들어, 소포 구내염 바이러스 (VSV)의 G 단백질)을 코딩하는 서열로 형질감염시킬 수 있다. 이어서, 형질감염된 패키징 세포는 형질감염된 패키징 세포주에 의해 발현되는 막-회합된 단백질을 포함하는 바이러스 입자를 생산할 수 있고; 다른 바이러스의 외피 단백질로 감싼 하나의 바이러스로부터 유도된 바이러스 게놈 RNA를 포함하는 상기 바이러스 입자는 의사형 (pseudotyped) 바이러스 입자로 언급된다.
대상에서 대사 기능을 조정하기 위해 본 발명의 폴리펩티드 또는 본 발명의 대사 조절인자를 코딩하는 핵산을 전달하기 위해, 단백질 및/또는 핵산과 같은 물질의 치료 목적의 전달을 위한 당업계에 공지된 방법, 예를 들어, 세포성 형질감염, 유전자 요법, 전달 비히클 또는 제약상 허용되는 담체와 함께 직접 투여, 본 발명의 표적화 융합 폴리펩티드를 코딩하는 핵산을 포함하는 재조합 세포의 제공에 의한 간접 전달이 사용될 수 있다.
다양한 전달 시스템이 공지되어 있고, 예를 들어, 리포좀 내의 캡슐화, 미세입자, 미세캡슐, 화합물을 발현할 수 있는 재조합 세포, 수용체-매개된 세포내 이입 (예를 들어, 문헌 [Wu and Wu, 1987, J. Biol. Chem. 262:4429-4432] 참조), 레트로바이러스 또는 다른 벡터의 일부로서의 핵산의 제조 등이 본 발명의 폴리펩티드를 투여하기 위해 사용될 수 있다. 도입 방법은 소화관내 또는 비경구 투여일 수 있고, 피내, 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 폐, 비내, 눈내, 경막외, 및 경구 경로를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. 물질은 임의의 편리한 경로, 예를 들어 주입 또는 볼러스 (bolus) 주사, 상피 또는 점막 피부 내막 (예를 들어, 경구 점막, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해 투여될 수 있고, 다른 생물학적 활성제와 함께 투여될 수 있다. 투여는 전신 또는 국소 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 제약 조성물을 임의의 적합한 경로, 예를 들어 뇌실내 및 경막내 주사에 의해 중추신경계 내로 도입하는 것이 바람직할 수 있고, 뇌실내 주사는 예를 들어 저장기, 예를 들어 오마야 (Ommaya) 저장기에 부착된 뇌실내 카테터에 의해 용이하게 수행될 수 있다. 또한, 폐 투여는 예를 들어 흡입기 또는 연무기, 및 에어로졸화 물질을 포함하는 제형을 사용하여 시행할 수 있다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 제약 조성물을 치료가 필요한 영역에 국소 투여하는 것이 바람직할 수 있고, 이것은 예를 들어 수술 동안 국소 주입, 국소 도포에 의해, 예를 들어 주사, 카테터, 또는 막, 예를 들어 실라스틱 막, 섬유, 또는 시판되는 피부 대용물을 포함하는 다공성, 비-다공성, 또는 젤라틴성 물질인 이식물에 의해 달성할 수 있다.
다른 실시태양에서, 활성제는 소포 (vesicle), 특히 리포좀으로 전달될 수 있다 (Langer (1990) Science 249:1527-1533 참조). 또다른 실시태양에서, 활성제는 제어 방출 시스템으로 전달될 수 있다. 한 실시태양에서, 펌프가 사용될 수 있다 (Langer (1990), 상기 문헌 참조). 다른 실시태양에서, 중합성 물질이 사용될 수 있다 (Howard et al. (1989) J. Neurosurg. 71: 105 참조). 다른 실시태양에서, 본 발명의 활성제가 단백질을 코딩하는 핵산인 경우에, 핵산은 이를 적절한 핵산 발현 벡터의 일부로서 제조하고, 벡터를 세포 내에 존재하도록 투여함으로써, 예를 들어 레트로바이러스의 사용에 의해 (예를 들어 미국 특허 4,980,286 참조), 또는 직접 주사, 또는 미세입자 폭격 (예를 들어, 유전자 총; 바이오리스틱, 듀퐁), 또는 지질 또는 세포-표면 수용체 또는 형질감염제를 사용한 코팅에 의해, 또는 핵에 도입되는 것으로 알려진 호메오박스 (homeobox) 유사 펩티드에 연결하여 투여함으로써 (예를 들어, 문헌 [Joliot et al., 1991, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:1864-1868] 참조), 그의 코딩되는 단백질의 발현을 촉진시키기 위해서 생체 내에 투여될 수 있다. 별법으로, 핵산은 세포 내로 도입되어 상동성 재조합에 의해 발현을 위한 숙주 세포 DNA 내에 통합될 수 있다.
항체. 일부 실시태양에서, 본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및 Insl6에 영향을 미치는 물질은 예를 들어 항체, 예를 들어 모노클로날, 키메라, 인간화 및 재조합 항체 및 그의 단편을 포함한다. 일부 실시태양에서, 중화 항체가 본 발명의 대사 조절인자의 길항제, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및 Insl6 또는 이들의 상동체의 억제제인 물질로서 사용될 수 있다. 불활성화될 때 항미생물제의 효과를 강화시키는 항체는 유전자 산물을 사용한 면역화에 의해 동물, 예를 들어 토끼 또는 마우스에서 쉽게 생성된다. 면역화시킨 마우스는 다량의 모노클로날 항체를 생산하기 위해 배양되는 하이브리도마의 제조를 위한 B 세포의 공급원의 제공에 특히 유용하다. 키메라 항체는 상이한 동물 종으로부터 유도된 2개 이상의 세그먼트 또는 부분이라는 특징을 갖는 면역글로불린 분자이다. 일반적으로, 키메라 항체의 가변 구역은 비-인간 포유동물 항체, 예를 들어 뮤린 모노클로날 항체로부터 유도되고, 면역글로불린 불변 구역은 인간 면역글로불린 분자로부터 유도된다. 바람직하게는, 두 구역 및 조합체는 통상적인 방식으로 결정할 때 낮은 면역원성을 갖는다. 인간화 항체는 뮤린 항원 결합 구역을 보유하면서 뮤린 불변 구역이 인간 대응물로 대체된, 유전공학 기술에 의해 생성된 면역글로불린 분자이다. 생성되는 마우스-인간 키메라 항체는 인간에서 감소된 면역원성 및 개선된 약동학을 가져야 한다. 본 발명의 방법에 유용한 고친화도 모노클로날 항체 및 그의 키메라 유도체의 일부 예는 유럽 특허 출원 EP 186,833; PCT 특허 출원 공개 WO 92/16553; 및 미국 특허 6,090,923에 기재되어 있다.
항체는 매우 다양한 표적 항원 및 합텐에 대한 높은 결합력 (avidity) 및 특유한 특이성을 제공한다. 본 발명의 실시에 유용한 모노클로날 항체는 전체 항체 및 그의 단편을 포함하고, 통상적인 기술, 예를 들어 하이브리도마 합성, 재조합 DNA 기술 및 단백질 합성에 따라 생성된다. 유용한 모노클로날 항체 및 단편은 임의의 종 (인간 포함)으로부터 유래할 수 있거나 또는 하나 초과의 종으로부터의 서열을 사용하는 키메라 단백질로서 형성될 수 있다. 인간 모노클로날 항체 또는 "인간화" 뮤린 항체도 본 발명에 따라 사용된다. 예를 들어, 뮤린 모노클로날 항체는 뮤린 Fv 구역 (즉, 항원 결합 부위를 함유하는) 또는 그의 상보성 결정 구역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열을 인간 불변 도메인 구역 및 Fc 구역을 코딩하는 뉴클레오티드 서열과 유전적으로 재조합하여 "인간화"시킬 수 있다. 인간화 표적 모이어티는 숙주 수여체에서 인식되어 항체 또는 폴리펩티드의 면역반응성을 감소시키고, 유럽 특허 출원 0,411,893 A2에 개시된 것과 유사한 방식으로 반감기의 증가 및 이상 면역 반응 가능성의 감소를 허용한다. 뮤린 모노클로날 항체는 바람직하게는 인간화 형태로 사용되어야 한다. 항원 결합 활성은 항체의 가변 부분 (Fv)의 경쇄 및 중쇄 상에 (각각 3개씩) 위치한 6개의 상보성 결정 구역 (CDR)의 아미노산의 서열 및 입체형태에 의해 결정된다. 짧은 펩티드 스페이서 서열을 통해 연결된 경쇄의 가변 구역 (VL) 및 중쇄의 가변 구역 (VH)으로 이루어진 25-kDa 단일쇄 Fv (scFv) 분자가 현재까지 개발된 최소 항체 단편이다. scFv의 유전자를 포함하는 필라멘트형 파지의 표면 상에 scFv 분자를 제시하는 기술이 개발되었다. 광범위한 항원-특이성을 갖는 scFv 분자가 scFv-파지 라이브러리의 하나의 큰 풀 (pool)에 존재할 수 있다.
scFv 분자의 하나의 제한은 표적 항원에 대한 이들의 1가 상호작용이다. scFv의 그의 표적 항원에 대한 결합을 개선시키기 위한 가장 쉬운 방법 중 하나는 다량체 생성을 통해 그의 기능적 친화도를 증가시키는 것이다. 디아바디 (diabody), 트리아바디 (triabody) 및 테트라바디 (tetrabody)를 형성하기 위해 동일한 scFv 분자의 회합은 많은 동일한 Fv 모듈을 포함할 수 있다. 따라서, 상기 분자는 다가이지만, 단일특이적이다. 각각 상이한 모 Ig로부터 유래한 VH 및 VL 도메인을 포함하는 2개의 상이한 scFv 분자의 회합은 충분히 기능적인 이중특이적 디아바디를 형성할 것이다. 이중특이적 scFv의 특유한 능력은 2개의 부위를 2개의 (인접한) 표면 에피토프를 통해 동시에 동일한 표적 분자 상에 결합시키는 것이다. 상기 분자는 단일 scFv 또는 Fab 단편에 비해 유의한 결합력을 갖는다는 잇점이 존재한다. 예를 들어, 미니항체, 이량체 미니항체, 미니체 (minibody), (scFv)2, 디아바디 및 트리아바디를 포함하여 많은 다가 scFv-기반 구조가 공학 처리되었다. 상기 분자는 일정 범위의 항체 결합가 (2개 내지 4개의 결합 부위), 크기 (50 내지 120 kDa), 가요성 및 생산 용이성을 포함한다. 단일쇄 Fv 항체 단편 (scFv)은 VH 및 VL 도메인이 적어도 12개 잔기의 폴리펩티드 링커에 의해 연결될 때 주로 단량체이다. 단량체 scFv는 모든 조건 하에서 12 및 25개 아미노산 길이의 링커에 의해 열역학적으로 안정하다. 비공유 디아바디 및 트리아바디 분자는 처리하기 쉽고, 단일 scFv 분자의 가변 중쇄 및 가변 경쇄를 연결하는 펩티드 링커를 단축시킴으로써 생산된다. scFv 이량체는 높은 수준의 가요성을 제공하는 양쪽성 (amphipathic) 나선에 의해 연결되고, 미니항체 구조는 이중 나선을 통해 연결된 2개의 미니항체 (4개의 scFv 분자)를 포함하는 이량체 이중특이적 (DiBi) 미니항체를 생성시키도록 변형될 수 있다. 유전자-융합된 또는 디술파이드 결합된 scFv 이량체는 중등도의 가요성을 제공하고, C-말단 Gly4Cys 서열을 부가하는 스트레이트포워드 (straightforward) 클로닝 기술에 의해 생성된다. scFv-CH3 미니체는 직접 (LD 미니체) 또는 가요성이 큰 힌지 구역 (Flex 미니체)를 통해 IgG CH3 도메인에 연결된 2개의 scFv 분자로 구성된다. 분자량이 약 80 kDa인 상기 2가 구성체는 항원에 대해 유의하게 결합할 수 있다. Flex 미니체는 마우스에서 인상적인 종양 국재화를 보인다. 이중- 및 삼중-특이적 다량체는 상이한 scFv 분자의 회합에 의해 형성될 수 있다. 기능적 친화도의 증가는 Fab 또는 단일쇄 Fv 항체 단편 (scFv) 단편이 이량체, 삼량체 또는 큰 응집체로 복합체화될 때 달성할 수 있다. 1가 scFv 및 Fab 단편과 비교할 때 다가 scFv의 가장 중요한 잇점은 표적 항원에 대한 기능적 결합 친화도를 갖는다는 것이다. 높은 결합력은 scFv 다량체가 별개의 표적 항원에 동시에 결합할 수 있을 것을 필요로 한다. scFv 단량체와 비교할 때 scFv 디아바디가 기능적 친화도를 갖는다는 것은 유의하고, 1차적으로 감소된 오프-레이트 (off-rate)에서 관찰되고, 이것은 2개 이상의 표적 항원에 대한 다중 결합 및 하나의 Fv가 해리될 때의 재결합에 기인한다. 상기 scFv 분자가 다량체로 회합할 때, 이들은 단일 표적 항원에 대한 높은 결합 또는 상이한 표적 항원에 대한 다중 특이성을 갖도록 설계될 수 있다. 항원에 대한 다중 결합은 Fv 모듈 내에서의 적정한 정렬 및 배향에 의존한다. 다가 scFv 표적에서 충분한 결합력을 위해, 항원 결합 부위는 동일한 방향을 가리켜야 한다. 다중 결합이 입체적으로 가능하지 않으면, 기능적 친화도의 외관상 획득은 증가된 재결합의 효과에 의한 것일 수 있고, 이것은 확산 속도 및 항원 농도에 의존한다. 항체의 특성을 개선시키는 모이어티와 컨쥬게이팅된 항체도 본 발명에서 고려된다. 예를 들어, 그들의 생체내 반감기를 증가시키는 PEG와 항체의 컨쥬게이트가 본 발명을 위해 사용될 수 있다. 면역 라이브러리는 미시험된 또는 면역화 동물 또는 환자의 B 림프구로부터의 가변 항체 단편을 코딩하는 유전자를 PCR로 증폭하여 제조한다. 면역글로불린 유전자 또는 면역글로불린 유전자 패밀리에 특이적인 올리고뉴클레오티드의 조합물이 사용된다. 면역글로불린 생식계열 유전자를 사용하여 반합성 항체 레퍼토리를 제조할 수 있고, 가변 단편의 상보성 결정 구역은 축퇴성 (degenerate) 프라이머를 사용하는 PCR에 의해 증폭된다. 상기 단일 포트 (single-pot) 라이브러리는 매우 많은 항원에 대한 항체 단편을 하나의 단일 라이브러리로부터 단리할 수 있다는 잇점을 갖는다. 항체 단편의 친화도를 증가시키기 위해 파지-디스플레이 기술이 사용될 수 있고, 새로운 라이브러리는 무작위, 코돈-기반 또는 부위-지정 돌연변이 생성에 의해, 개별 도메인의 사슬을 미시험된 레퍼토리로부터의 단편의 사슬로 셔플링 (shuffling)시키거나 또는 세균 변이체 균주를 사용하여 기존의 항체 단편으로부터 제조한다.
별법으로, SCID-hu 마우스, 예를 들어 겐팜 (Genpharm)에서 개발된 모델이 항체 또는 그의 단편을 생산하기 위해 사용될 수 있다. 한 실시태양에서, 다가 상호작용의 효과를 이용함으로써 생성된 새로운 유형의 고 결합력의 결합 분자 (펩타바디 (peptabody)로 칭함)가 고려된다. 짧은 펩티드 리간드를 반경질 힌지 구역을 통해 연골 올리고머성 매트릭스 단백질의 코일드-코일 (coiled-coil) 회합 도메인과 융합시켜 오량체 다가 결합 분자를 형성시켰다. 본 발명의 바람직한 실시태양에서, 리간드 및/또는 키메라 억제제는 예를 들어 항-리간드 항체 (Ab) 및 특이적 표적에 대해 작용하는 Ab의 화학적 연결에 의해 생성된 이중특이적 항체를 사용하여 조직- 또는 종양-특이적 표적을 표적으로 할 수 있다. 화학적 컨쥬게이트의 제한을 방지하기 위해, 항체의 분자 컨쥬게이트를 사용하여 세포 표면 분자에서 리간드 및/또는 키메라 억제제에 대해 작용하는 재조합 이중특이적 단일쇄 Ab를 생산할 수 있다. 별법으로, 표적화 모이어티에 부착된 2개의 활성제 및/또는 억제제가 투여될 수 있고, 여기서 각각의 컨쥬게이트는 표적화 모이어티, 예를 들어, 상이한 항체를 포함한다. 각각의 항체는 상이한 표적 부위 에피토프 (동일한 또는 상이한 표적 부위 항원과 회합함)와 반응성이다. 물질이 부착된 상이한 항체는 목적하는 표적 부위에 추가로 축적된다. 항체-기반 또는 비-항체-기반 표적화 모이어티는 아래에서 보다 상세하게 설명되는 바와 같이 물질을 표적 부위에 전달하기 위해 사용될 수 있다. 바람직하게는, 비조절된 항원에 대한 천연 결합제가 상기 목적을 위해 사용된다.
항체인 물질은 작용제 및/또는 길항제일 수 있다. 예를 들어, 작용제로서 기능하는 항체는 폴리펩티드의 활성 및/또는 유전자 발현을 증가시키는 한편, 길항제로서 기능하는 항체는 폴리펩티드의 활성 및/또는 유전자 발현을 감소시킨다. 길항제로서 기능하는 상기 항체의 예는 예를 들어 비제한적으로 중화 항체이다.
당업자는 본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및 Insl6 또는 이들의 상동체를 단백질의 아미노산 서열을 변경시키기 위해 쉽게 조작할 수 있음을 이해할 것이다. 본 발명의 대사 조절인자를 코딩하는 유전자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및 Insl6 또는 이들의 상동체는 본원에서 변이체 또는 뮤테인 (mutein)으로 언급되고 본 발명에 따라 사용될 수 있는, 천연 발생 인간 단백질의 변이체 또는 그의 단편을 생성시키기 위해 특히 시험관내 돌연변이 유발을 위한 다양한 공지된 기술에 의해 조작될 수 있다.
본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및 Insl6 또는 이들의 상동체의 변이체의 1차 구조의 변이는 본 발명에 유용하고, 예를 들어 결실, 부가 및 치환을 포함할 수 있다. 치환은 보존적 또는 비-보존적일 수 있다. 천연 단백질 (또는 야생형 단백질)과 변이체 사이의 차이는 일반적으로 목적하는 특성을 보존하고, 바람직하지 않은 특성을 완화하거나 제거하고 목적하는 특성 또는 새로운 특성을 추가한다. 예를 들어, 대사 조절인자의 변이체는 야생형 대사 조절인자에 비해 뛰어난 활성을 가질 수 있고, 작용제로서 기능하는 반면에, 야생형 대사 조절인자에 비해 활성을 감소시키거나 또는 억제하거나 반대 작용을 갖는 변이체는 길항제, 예를 들어 비제한적으로 대사 조절인자의 우성 음성 형태로서 기능한다.
길항제 물질. 이와 유사하게, 그들이 유래되는 보다 큰 단백질을 불활성화시키고(시키거나) 보다 큰 단백질의 우성 음성 버전 (즉 불활성 버전)으로 기능하는 작은 올리고펩티드 및 폴리펩티드를 제조하는 기술은 공지되어 있고, 당업계에 통상적인 기술이 되었다. 따라서, 본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및 Insl6 또는 이들의 상동체를 불활성화시키거나 억제하는 본 발명의 유전자 산물의 펩티드 유사체가 또한 본 발명에서 유용하다.
일부 실시태양에서, RNA 간섭 또는 "RNAi"는 본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및 Insl6 또는 이들의 상동체의 길항제로서 기능하는 물질로서 사용될 수 있다. 상기 실시태양에서, 본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어 본 발명의 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및 Insl6 또는 이들의 상동체의 발현을 음성 조절하는 RNAi 분자가 대사 기능을 조정하기 위해 사용될 수 있다. RNAi는 벌레 내에 도입될 때 이중가닥 RNA (dsRNA)가 유전자 발현을 차단할 수 있다는 관찰을 설명하기 위해 파이어 (Fire)와 그의 동료들에 의해 처음으로 사용된 용어이다 (Fire et al. (1998) Nature 391, 806-811). dsRNA는 척추동물을 포함하여 많은 유기체에서 유전자-특이적인 전사후 침묵화를 지시하고, 유전자 기능을 연구하기 위한 새로운 도구를 제공한다. RNAi는 표적 유전자의 mRNA 분해를 수반한다. 결과는 RNAi가 ATP-의존성이지만 mRNA 번역과 커플링되지 않았음을 보여주었다. 즉, 단백질 합성은 시험관 내에서 RNAi를 필요로 하지 않는다. RNAi 반응에서, dsRNA의 두 스트랜드 (센스 및 안티센스)는 약 21 내지 약 23개의 뉴클레오티드 (nt) 길이의 작은 RNA 단편 또는 세그먼트 (서열 결정 겔에서 21-23개 nt 길이의 마커에 대응하는 이동도를 갖는 RNA, 임의로 21-23 nt RNA로 칭함)로 프로세싱된다. dsRNA의 작은 RNA 단편으로의 프로세싱은 표적화된 mRNA를 필요로 하지 않고, 이것은 작은 RNA 종이 dsRNA-표적화된 mRNA 분해의 산물로서가 아니라 dsRNA의 프로세싱에 의해 생성됨을 입증한다. mRNA는 dsRNA와 동일성 구역 내에서만 절단된다. 절단은 21-23개의 뉴클레오티드만큼 떨어진 부위에서 발생하고, 동일한 간격이 dsRNA 자체에 대해서도 관찰되었고, 이것은 dsRNA로부터의 21-23개 뉴클레오티드의 단편이 mRNA 절단을 안내함을 시사한다. 약 21 내지 약 23개 뉴클레오티드의 단리된 RNA 분자 (이중가닥; 단일가닥)는 RNAi를 매개한다. 즉, 단리된 RNA는, 그로부터 mRNA가 전사되는 유전자의 mRNA의 분해를 매개한다 (표적 유전자로도 언급되는 유전자의 전사 산물인 mRNA의 분해를 매개한다). RNAi를 매개하는 G6PD mRNA에 특이적인 단리된 RNA 분자는 본 발명의 방법에 유용한 길항제이다. 다른 핵산 및 핵산 유사체, 예를 들어 올리고뉴클레오티드, 안티센스 핵산 구성체, siRNA, 마이크로RNA, shRNA 등은 항미생물 펩티드의 인핸서로서 사용될 수 있다.
본 발명의 일부 실시태양에서, 본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및 Insl6 또는 이들의 상동체의 길항제로서 기능하는 물질은 벡터로 대상에게 투여될 수 있다. 벡터는 플라스미드 벡터, 바이러스 벡터, 또는 외래 서열의 삽입 및 진핵 세포 내로의 도입에 적합한 임의의 다른 적합한 비히클일 수 있다. 벡터는 작용제 또는 길항제 핵산 분자의 DNA 서열의 RNA로의 전사를 지시할 수 있는 발현 벡터일 수 있다. 바이러스 발현 벡터는 예를 들어 레트로바이러스, 렌티바이러스, 엡스타인 바 (Epstein Barr) 바이러스-, 소 유두종 바이러스, 아데노바이러스- 및 아데노-연관 바이러스-기반 벡터 또는 상기 임의의 바이러스의 하이브리드 바이러스로 이루어지는 군 중에서 선택될 수 있다. 한 실시태양에서, 벡터는 에피좀이다. 적합한 에피좀 벡터의 사용은 작용제 또는 길항제 핵산 분자를 고 카피수의 염색체 외부의 DNA로 대상 내에 유지하여 잠재적인 염색체 통합 효과를 제거할 수 있는 수단을 제공한다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및 Insl6 또는 이들의 상동체의 길항제로서 기능하는 물질은 촉매활성의 안티센스 핵산 구성체, 예를 들어 RNA 전사체를 절단하여 야생형 단백질의 생산을 억제할 수 있는 리보자임을 도입함으로써 달성될 수 있다. 리보자임은 리보자임 촉매 부위에 바로 인접하는 표적에 상보성인 서열의 2개의 구역에 의해 특정 서열에 대해 표적화되고 이 서열을 어닐링시킨다. 결합 후, 리보자임은 표적을 부위 특이적 방식으로 절단한다. 본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및 Insl6 또는 이들의 상동체의 서열을 특이적으로 인식하고 절단하는 리보자임의 설계 및 시험은 당업계에 공지된 기술에 의해 달성할 수 있다 (예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Lieber and Strauss, (1995) Mol. Cell Biol 15:540.551] 참조).
표적화. 일부 실시태양에서, 본 발명의 물질은 표적화 리간드를 통해 근육에 표적화된다. 표적화 리간드는 예비-선택된 세포 상의 표적, 예를 들어 표면 단백질, 예를 들어 임의의 다른 신체 조직보다 예비-선택된 세포 표적에 보다 높은 수준으로 존재하는 수용체와 높은 친화도로 특이적으로 결합하는 분자, 예를 들어, 단백질 또는 그의 단편이다. 예를 들어, 미국 특허 5,814,478 및 6,413,740에 기재된 바와 같이, MuSK 수용체는 근육에 고도로 특이적이다. 따라서, 동족체 리간드 아그린 (agrin), 및 그의 MuSK 결합 부분은 물질을 근육에 표적화시키기 위해 유용한 표적화 리간드의 예이다. 일부 실시태양에서, 표적화 리간드는 본 발명의 물질, 예를 들어 본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6의 폴리펩티드, 또는 그의 상동체, 변이체 또는 단편에 융합된다. 일부 실시태양에서, 표적화 리간드는 본 발명의 뉴클레오티드 물질에 융합될 수 있다. 표적화 리간드의 다른 예는 인간 카드헤린으로부터의 일군의 카드헤린 도메인이다. 따라서, 예를 들어, 인간 근육 카드헤린으로부터의 인간 카드헤린 도메인이 근육 세포를 표적화하기 위한 본 발명의 물질, 예를 들어 비제한적으로, 본 발명의 폴리펩티드 물질의 표적화에 사용될 수 있다. 본 발명의 폴리펩티드 물질의 표적화 리간드 성분은 예비-선택된 표적 세포에 결합할 수 있는 천연 발생 또는 재조합 또는 공학적으로 처리된 리간드, 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 표적화 리간드는 동종친화성 (homophilic) 카드헤린을 발현하는 표적 세포에 특이적으로 결합할 수 있는 적어도 3, 4 또는 5개의 근육 카드헤린 (M-카드헤린) 도메인, 또는 그의 유도체 또는 단편으로 구성될 수 있다 ([Shimoyama et al. (1998) J. Biol. Chem. 273(16): 10011-10018]; [Shibata et al. (1997) J. Biol. Chem. 272(8):5236-5270]). 일부 실시태양에서, 표적화 리간드는 본 발명의 물질에 융합된, 인간 M-카드헤린의 세포외 도메인으로부터의 적어도 3개의 카드헤린 도메인 (또는 결합 동종친화성 M-카드헤린에 결합할 수 있는 그의 생물학적 활성 단편 또는 유도체)을 포함한다.
또한, 표적화 리간드의 추가의 예는 예비-선택된 세포 표면 단백질에 높은 친화도로 결합하는 항체 및 그의 일부를 포함하고, 이로 제한되지 않는다. "높은 친화도"는 당업계에 공지된 분석 방법, 예를 들어 BiaCore 분석에 의해 결정될 때 적어도 몰 (molar)의 평형 해리 상수를 의미한다. 한 실시태양에서, 표적화 리간드는 또한 선택된 조직-특이적 표면 단백질 또는 표적 조직-특이적 수용체에 대해 생성된 항체로부터 단리된 하나 이상의 면역글로불린 결합 도메인을 포함할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "면역글로불린 또는 항체"는 본 발명의 경우에 조직-특이적 표면 단백질, 표적 조직-특이적 수용체, 또는 그의 일부인 항원을 특이적으로 인식하여 결합하는 면역글로불린 유전자 또는 그의 단편으로부터의 프레임워크 구역을 포함하는, 인간을 포함하는 포유동물의 폴리펩티드를 의미한다. 의도된 표적화 융합 폴리펩티드가 포유동물 치료제로서 사용될 경우에, 면역글로불린 결합 구역은 상응하는 포유동물 면역글로불린으로부터 유래하여야 한다. 표적화 융합 폴리펩티드가 비-치료 용도, 예를 들어 진단 및 ELISA를 위해 의도되는 경우에, 면역글로불린 결합 구역은 인간 또는 비-인간 포유동물, 예를 들어 마우스로부터 유래하여야 한다. 인간 면역글로불린 유전자 또는 유전자 단편은 카파, 람다, 알파, 감마, 델타, 엡실론 및 뮤 불변 구역, 및 많은 면역글로불린 가변 구역 유전자를 포함한다. 경쇄는 카파 또는 람다로 분류된다. 중쇄는 감마, 뮤, 알파, 델타 또는 엡실론으로 분류되고, 이것은 다시 각각 면역글로불린 클래스인 IgG, IgM, IgA, IgD 및 IgE를 규정한다. 각각의 IgG 클래스 내에, 상이한 이소형 (예를 들어 IgG1, IgG2 등)이 존재한다. 일반적으로, 항체의 항원-결합 구역은 결합의 특이성 및 친화도 결정시에 가장 중요할 것이다.
인간 IgG의 예시적인 면역글로불린 (항체) 구조 단위는 사량체를 포함한다. 각각의 사량체는 폴리펩티드 사슬의 2개의 동일한 쌍으로 이루어지고, 각각의 쌍은 하나의 경쇄 (약 25 kD) 및 하나의 중쇄 (약 50-70 kD)를 갖는다. 각각의 사슬의 N-말단은 항원 인식을 1차적으로 담당하는 약 100-110개 또는 그 보다 많은 아미노산의 가변 구역을 규정한다. 용어 "가변 경쇄" (VL) 및 가변 중쇄 (VH)는 각각 상기 경쇄 및 중쇄를 의미한다. 항체는 무손상 면역글로불린으로서, 또는 상이한 펩티다제를 사용한 소화에 의해 생산된, 잘 특성화된 많은 단편으로서 존재한다. 예를 들어, 펩신은 힌지 구역 내의 디술파이드 연결 아래에서 항체를 소화시켜 그 자체가 디술파이드 결합에 의해 VH-CH에 연결된 경쇄인 Fab의 이량체인 F(ab)'2를 생성시킨다. F(ab)'2는 온건한 조건 하에서 환원되어 힌지 구역 내의 디술파이드 연결을 파괴하여 F(ab)'2 이량체를 Fab' 단량체로 전환시킨다. Fab' 단량체는 본질적으로 힌지 구역의 일부를 갖는 Fab이다. 다양한 항체 단편이 무손상 항체의 소화의 측면에서 규정되지만, 당업자는 상기 단편이 화학적으로 또는 재조합 DNA 방법을 사용하여 드 노보 (de novo)로 합성될 수 있음을 이해할 것이다. 따라서, 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 면역글로불린 또는 항체는 전체 항체의 변형에 의해 생산된 항체 단편 또는 재조합 DNA 방법을 사용하여 드 노보로 합성된 것 (예를 들어, 단일쇄 Fv) (scFv)) 또는 파지 디스플레이 라이브러리를 사용하여 확인된 것 (예를 들어, 문헌 [McCafferty et al. (1990) Nature 348:552-554] 참조)을 포함한다. 또한, 본 발명의 융합 폴리펩티드는 면역글로불린의 중쇄 (VH) 또는 경쇄 (VL)의 가변 구역, 및 그의 조직-특이적 표면 단백질 및 표적 수용체-결합 부분을 포함한다. 상기 가변 구역을 생산하는 방법은 문헌 [Reiter, et al. (1999) J. Mol. Biol. 290:685-698]에 기재되어 있다.
항체를 제조하는 방법은 당업계에 공지되어 있다 (예를 들어, 문헌 ([Kohler & Milstein (1975) Nature 256:495-497]; [Harlow & Lane (1988) Antibodies: a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY] 참조). 관심있는 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자는 세포로부터 클로닝될 수 있다. 예를 들어, 모노클로날 항체를 코딩하는 유전자는 하이브리도마로부터 클로닝되어 재조합 모노클로날 항체를 생산하기 위해 사용될 수 있다. 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄를 코딩하는 유전자 라이브러리는 또한 하이브리도마 또는 혈장 세포로부터 제조될 수 있다. 중쇄 및 경쇄 유전자 산물의 무작위 조합은 상이한 항원 특이성을 갖는 큰 항체 풀을 생성시킨다. 단일쇄 항체 또는 재조합 항체의 생산 기술 (미국 특허 4,946778; 미국 특허 4,816,567)이 본 발명의 융합 폴리펩티드 및 방법에 사용되는 항체를 생산하기 위해 적용될 수 있다. 또한, 트랜스제닉 마우스, 또는 다른 유기체, 예를 들어 다른 포유동물을 사용하여 인간 또는 인간화 항체를 발현시킬 수 있다. 별법으로, 선택된 항원에 특이적으로 결합하는 항체, 항체 단편, 예를 들어 가변 도메인, 및 헤테로머 (heteromeric) Fab 단편을 확인하기 위해 파지 디스플레이 기술이 사용될 수 있다.
바람직한 면역글로불린 (항체)의 스크리닝 및 선택은 당업계에 공지된 다양한 방법으로 수행될 수 있다: 조직-특이적 또는 표적 수용체에 특이적인 모노클로날 항체의 존재에 대한 초기 스크리닝은 예를 들어 ELISA-기반 방법 또는 파지 디스플레이의 사용을 통해 수행할 수 있다. 2차 스크리닝은 바람직하게는 본 발명의 조직-특이적 융합 폴리펩티드의 제조에 사용하기 위한 목적하는 모노클로날 항체를 확인하고 선택하기 위해 수행된다. 2차 스크리닝은 당업계에 공지된 임의의 적합한 방법으로 수행할 수 있다. "바이오센서 변형-보조 프로파일링 (Biosensor Modification-Assisted Profiling)" ("BiaMAP") (미국 특허 출원 공개 2004/101920)로 불리는 방법을 통해 목적하는 특징을 갖는 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마 클론을 신속하게 확인할 수 있다. 보다 구체적으로, 모노클로날 항체는 항체:항원 상호작용의 평가를 기초로 하여 별개의 에피토프-관련기로 분류된다.
질병 및 질환의 치료
본 발명의 방법은 많은 질환 및 질병, 예를 들어 비제한적으로, 근육 연관된 질병 또는 질환, 근육 성장, 혈관신생, 비만, 인슐린 감수성, 인슐린-의존 질병, 체중, 근 질량, 지방량 및/또는 심혈관 기능의 치료를 위한 대사 조절인자의 용도에 관한 것이다. 한 실시태양에서, 상기 질환을 치료하기 위한 방법은 본 발명의 대사 조절인자를 활성화시키거나 억제하는 물질, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6을 활성화시키거나 억제하는 물질의 유효량의 투여를 포함한다.
본 발명자들은 본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6이 (i) 근육 성장 (즉, 근육 비대) (예를 들어 MSP5 (실시예 6 참조)), (ii) 혈관신생 (예를 들어 MSP3 및 MSP5 (실시예 5 및 6 참조)), (iii) 당 감수성 및 인슐린 감수성 (예를 들어 MSP3 (실시예 5 참조)), 및 (iv) 근육 재생 및 위성 세포 동원 (예를 들어 Insl6 (실시예 7 참조))에 영향을 미침을 발견하기에 이르렀다.
따라서, 본 발명은 혈관신생, 인슐린 감수성, 근육 퇴행, 근 질량 및/또는 지방량과 연관된 질병 및/또는 질환의 치료를 위한 본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6 또는 그의 상동체 또는 변이체의 용도에 관한 것이다.
근 질량 및/또는 비대를 조정하기 위한 조성물.
본 발명자들은 근섬유의 크기를 생체 내에서 및 시험관 내에서 증가시키고, 근섬유 크기 및/또는 폭을 증가시키고, 실시예 6에 개시된 바와 같이 단백질 합성을 증가시키는 그의 능력에 기초하여, 대사 조절인자 MSP5가 근원 인자 및/또는 근육 비대 인자임을 밝혀내었다. 따라서, 본 발명은 대상에서 근육 비대 및 근 질량을 증가시키기 위해 MSP5의 작용제로서 기능하는 물질, 예를 들어 MSP5 발현을 활성화시키는 물질, 예를 들어 MSP5 또는 기능적 유도체를 코딩하는 핵산을 포함하는 물질을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
또한, 본 발명자들은 Insl6을 근육 조직에서 위성 세포의 수를 증가시키는 그의 능력을 기초로 하여 근육 재생 인자로서, 근원섬유 주위의 위성 세포 내의 BrdU의 혼입을 증가시키는 것으로서, 및 소염 인자로서 확인하였다. Insl6은 실시예 7에서 입증된 바와 같이 활성화된 위성 마커 MyoD에 대한 면역염색을 증가시키기 때문에 근육 재생을 증가시키는 것으로 추가로 특성화되었다. Insl6은 실시예 7에서 도 31 및 32에 도시된 바와 같이 심독소 (CTX)의 근육내 투여 후에 염증 세포의 수를 감소시키는 그의 능력에 기초하여 소염 인자로서 기능하는 것으로 밝혀졌다. 추가로, Insl6은 근육 성장을 촉진하는 유전자의 부재 하에서의 근육에 비해 근육 퇴행 손상 후에, 예를 들어 심독소 (CTX)의 근육내 투여 후에 근육 재생을 개선시킨다 (예를 들어 도 38 및 38 참조). 근육 조직에서 위성 세포의 활성화는 대상에서 새로운 근육 세포를 생성시킬 수 있다 (예를 들어 도 12, 30 및 40 참조). 본원에서 근육 재생으로도 언급되는 근육 성장은 근육 전구 세포로부터 새로운 근육 섬유가 형성되는 과정을 의미한다. 따라서, 본 발명은 대상에서 근육 재생 및 근 질량을 증가시키기 위한, Insl6 또는 그의 기능적 유도체 또는 작용제의 유전자 및/또는 유전자 산물 (즉, 단백질)을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
본 발명의 하나의 실시태양은 유기체에서 근 질량을 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 근 위축이 발병할 위험이 있거나 근 위축이 있는 대상 또는 근육 비대를 필요로 하는 대상을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 실시태양에서, 방법은 대사 조절인자 MSP5 또는 그의 기능적 유도체 또는 작용제를 표적으로 하는 물질을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 제약 조성물은 MSP5의 작용제를 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 MSP5의 작용제로서 기능하는 물질, 예를 들어 비제한적으로 MSP5 (서열 12) 또는 그의 상동체 또는 단편을 코딩하는 핵산인 물질을 포함하는 제약 조성물을 대상에게 투여함으로써, 근 위축이 있거나 근 위축의 위험이 있는 대상을 치료하기 위한 수단을 제공한다. 따라서, 본 발명은 그를 필요로 하는 대상에서 근육 비대를 증가시키거나 위축증을 억제함으로써 근육 성장을 증가시키는 방법을 제공한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 유기체에서 근육 재생을 증가시키기 위한 방법을 제공한다. 본 발명은 근육 퇴행이 발생할 위험이 있거나 근육 퇴행이 있는 대상 또는 근육 재생을 필요로 하는 대상을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 실시태양에서, 방법은 Insl6 또는 그의 기능적 유도체 또는 작용제의 유전자 및/또는 유전자 산물 (즉, 단백질)을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 제약 조성물은 Insl6의 작용제를 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 Insl6 (서열 20) 또는 그의 상동체 또는 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 제약 조성물을 대상에게 투여함으로써, 근 위축이 있거나 근 위축의 위험이 있는 대상을 치료하기 위한 수단을 제공한다. 따라서, 본 발명은 그를 필요로 하는 대상에서 위성 세포 동원을 증가시키고 근육 재생을 증가시킴으로써, 근 질량을 증가시키는 방법을 제공한다.
작용제로서 기능하는 물질 또는 MSP5 및/또는 Insl6 또는 그의 기능적 유도체 또는 작용제를 포함하는 제약 조성물은 근육 성장 및/또는 근육 재생을 유도할 것이다. Insl6의 존재 하의 새로운 섬유의 수는 Insl6의 부재시에 비해 적어도 1%, 보다 바람직하게는 적어도 20%, 가장 바람직하게는 적어도 50% 증가한다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "근육 성장"은 섬유 크기의 증가 및/또는 섬유 수의 증가를 나타낸다. 근육의 성장은 습식 중량의 증가, 단백질 함량의 증가, 근육 섬유의 수 증가; 근육 섬유 직경의 증가 등에 의해 측정할 수 있다. 근육 섬유의 성장에서 증가는 직경의 증가로서 정의될 수 있고, 여기서 직경은 단면의 단축으로서 정의된다.
일부 실시태양에서, Insl6 및/또는 MSP5에 의해 유도된 근육 성장은 양성 대조군과 연관된 근육 성장과 비교할 수 있다. 일부 실시태양에서, 양성 대조군은 미오스타틴의 억제제, 예를 들어 미오스타틴의 중화 항체 또는 미오스타틴의 억제 핵산, 예를 들어 미오스타틴의 RNAi 또는 미오스타틴의 우성 음성 형태이다.
근육 성장은 또한 근육의 유사분열 지수에 의해 모니터링할 수 있다. 예를 들어, 세포는 두 세대 시간에 해당하는 시간 동안 표지제에 노출시킬 수 있다. 유사분열 지수는 S기 동안에만 혼입되는 추적자 (즉, BrdU)의 존재 하에 성장할 때 표지된 핵을 갖는 배양액 내의 세포의 분획이고, 세대 시간은 배양액 내의 세포의 수를 2의 인수만큼 증가시키는데 필요한 평균 S 시간으로서 정의된다. 생산적인 근육 재생은 또한 근육 강도 및 민첩성의 증가에 의해 모니터링될 수 있다.
근육 성장은 또한 근육생성, 즉 근관을 생성시키는 근육모세포의 융합의 정량에 의해 측정할 수 있다. 근육생성에 대한 효과는 근육모세포 융합을 증가시키고 근육 분화 프로그램을 작동시킨다. 예를 들어, 근육생성은 존재하는 핵의 총수에 비해 다핵 세포 내에 존재하는 핵의 분획에 의해 측정될 수 있다. 근육생성은 또한 근관 내 면적당 핵의 수의 분석에 의해 또는 웨스턴 분석에 의한 근육 특이적 단백질 수준의 측정에 의해 결정될 수 있다.
근육 섬유의 생존율은 괴사 또는 세포자멸에 의해 제시되는 근육 섬유의 손실의 예방 또는 다른 메카니즘의 근육 섬유 손실의 예방을 나타낼 수 있다. 근육은 손상, 위축증 등에 의해 손실될 수 있고, 근육의 위축증은 근육 섬유 치수의 유의한 손실을 의미한다.
MSP3 및/또는 Insl6을 포함하는 제약 조성물의 투여가 유용한 상기 질환은 대상이 근육 비대를 증가시키거나 근육 재생을 증가시킴으로써, 또는 둘 모두에 의해 근 질량을 증가시키는 것을 필요로 할 때이고, 여기서 MSP3 및/또는 Insl6을 포함하는 제약 조성물은 질병 증상을 개선할 것이다. 상기 질병은 예를 들어, 대상이 근 위축 또는 근육 퇴행이 있는 경우를 포함한다. 예를 들어, 근 질량의 감소, 즉 위축증은 다양한 생리학적 및 병리학적 상태와 연관된다. 예를 들어, 근 위축은 신경 외상으로 인한 탈신경; 퇴행성, 대사 또는 염증성 신경병증, 예를 들어 길랑-바레 증후군; 말초 신경병증; 또는 환경 독소 또는 약물에 의해 유발된 신경 손상으로부터 발생할 수 있다.
근 위축은 또한 예를 들어 성인 운동 뉴런 질병, 예를 들어 근위축성 측삭 경화증 (ALS 또는 루 게릭병); 영아 및 소아 척수성 근 위축; 및 다촛점성 전도체 차단을 갖는 자가면역 운동 신경병증을 포함하는 운동 신경병증으로 인한 탈신경으로부터 발생할 수 있다. 근 위축은 또한 예를 들어 뇌졸중 또는 척수 손상으로 인한 마비; 외상, 예를 들어, 골절, 인대 또는 힘줄 손상, 염좌 또는 탈구로 인한 골격 고정; 또는 장기 병상 요양으로부터 일어나는 만성 질병으로부터 발생할 수 있다. 또한, 근 위축을 일으킬 수 있는 대사 스트레스 또는 영양 부족은 특히 암 및 다른 만성 병, 예를 들어 AIDS, 절식 또는 횡문근융해의 악액질, 및 내분비 질환, 예를 들어 갑상선 질환 및 당뇨병을 포함한다.
근 위축은 또한 근육 퇴행 위축 증후군, 예를 들어 뒤시엔느, 베커, 근긴장성, 안면견갑상완, 에머리-드레이푸스, 안구인두, 견갑상완, 지대, 및 선천성 유형뿐만 아니라 유전 원위성 근육병증으로 알려진 위축증에 기인할 수 있다. 근 위축은 또한 선천성 근육병증, 예를 들어 양성 선천성 근긴장저하, 중심핵병, 네말렌 근육병증, 및 근세관성 (중심핵) 근육병증에 기인할 수 있다. 근 위축은 또한 노화 과정 동안 일어난다. 각종 병리학적 상태에서의 근 위축은 향상된 단백질 분해 및 근육 단백질의 감소된 생산에 연관된다.
대상이 근 위축 또는 근육 퇴행을 갖는 상기 질병의 다른 예는 예를 들어 비제한적으로 근육 퇴행 위축, 뒤시엔느 위축증; 베커 근육 퇴행 위축; 선천성 근육병증, 예를 들어 네말렌 근육병증 또는 리아노딘 수용체의 유전자 돌연변이에 의해 야기되는 근육병증; 미토콘드리아 및 핵-코딩된 유전자 모두의 돌연변이에 의한 미토콘드리아성 근육병증, 예를 들어 진행성 외안근 마비, 컨스-세이어 (Kearns-Sayre) 증후군, MELAS, MERFF 증후군, 영아 근육병증; 근육의 글리코겐 저장 질병, 예를 들어 폼베 (Pompe) 질병; 채널병 (channelopathy); 근긴장성 위축증 (스타이너트 (Steinert) 질병); 선천성 근긴장증 (톰센 (Thomsen) 질병); 저칼륨혈성 (염색체 1q 상의 디히드로피리딘 수용체-연관 칼슘 채널 유전자의 돌연변이에 의한) 및 고칼륨혈성 형태 (염색체 17q 상의 SCN4A의 돌연변이에 의한)를 포함하는 가족성 주기성 마비를 포함한다.
MSP5 및/또는 Insl6에 대한 작용제로서 기능하는 물질을 포함하는 제약 조성물의 투여는 또한 대상이 악액질과 같은 보다 전반적인 체질량 소모 환경에서 근 질량을 증가시키는 것이 필요한 경우에 유용하다. 악액질은 근 질량을 포함하고 이로 제한되지 않는 체질량 손실을 야기하는 병태이다. 악액질 환경은 암-유발 악액질, Al OS-유발 악액질, 패혈증-유발 악액질, 신부전-유발 악액질, 및 울혈성 심부전을 포함한다. 또한, 작은 체격을 야기하는 지중해빈혈을 포함하는 많은 환경에서 성장 지연이 존재한다. 작은 체격은 일반적으로 MSP5 및/또는 Insl6에 대한 작용제로서 기능하는 물질을 포함하는 제약 조성물의 투여를 위한 환경일 것이다.
근 위축은 또한 노화 과정 동안 발생한다. 각종 병리학적 상태에서의 근 위축은 향상된 단백질 분해 및 근육 단백질의 감소된 생산과 연관된다. 또한, MSP5 및/또는 Insl6을 포함하는 제약 조성물의 투여는 성장 호르몬 결핍, 조직 소모, 예를 들어 화상, 골격 외상, 감염, 암, 낭성 섬유증, 뒤시엔느 근육 퇴행 위축, 베커 위축증, 상염색체 열성 위축증, 다발근육염, 및 근육병증 및 AIDS로 고통받는 대상의 치료에 유용할 수 있다 (미국 특허 5,622,932).
당 및/또는 인슐린 감수성 및 체중을 조정하기 위한 조성물.
본 발명자들은 마우스 비만 모델에서 당 및/또는 인슐린 감수성을 조절하는 그의 능력을 기초로 하여 MSP3이 대사 조절인자, 예를 들어 당 감수성 및/또는 인슐린 감수성의 조절인자임을 발견하기에 이르렀다. 특히, MSP3은 마우스에게 고지방, 고수크로스 (HF/HS) 식이를 급식하여 비만을 유도하는 비만 마우스 모델에서 당내성 시험 (GTT)으로 혈당 및 인슐린 혈청 수준을 측정함으로써 결정할 때 당 및 인슐린에 대한 감수성을 증가시키는 것으로 나타났다. HF/HS 식이를 급식한, MSP3 처리된 마우스는 MSP3의 부재 하의 마우스에 비해 주사 후에 보다 낮은 혈당 수준 및/또는 감소된 공복 혈청 포도당 및/또는 인슐린 수준을 갖고, 이에 의해 예를 들어 실시예 1 및 도 5, 17 및 18에서 논의된 바와 같이 MSP3이 당 및/또는 인슐린에 대한 감수성을 증가시킨다는 사실이 밝혀졌다.
따라서, 본 발명은 대상에서 인슐린 불감증 또는 인슐린 내성을 감소시키기 위한, MSP3 또는 그의 기능적 유도체 또는 작용제의 유전자 및/또는 유전자 산물 (즉, 단백질)을 위한 물질을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 따라서, MSP3 또는 그의 기능적 유도체에 대한 작용제로서 기능하는 물질은 비만 및/또는 지방량 감소를 위해 본 발명에서 유용하다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 유기체에서 포도당 및/또는 인슐린 불감증을 조절하기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 인슐린 및/또는 포도당 불감증이 발생할 위험이 있거나 인슐린 및/또는 포도당 불감증이 있는 대상 또는 포도당 조절 또는 대사 조절을 필요로 하는 대상, 예를 들어 인슐린 저항성을 포함한 질환에 걸린 대상을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 실시태양에서, 방법은 작용제로서 기능하는 물질, 예를 들어 MSP3 또는 그의 기능적 유도체 또는 작용제의 유전자 및/또는 유전자 산물 (즉, 단백질)인 물질을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 일부 실시태양에서, 제약 조성물은 MSP3의 작용제를 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 MSP3 (서열 1) 또는 그의 상동체 또는 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 제약 조성물을 대상에게 투여함으로써, 근 위축이 있거나 근 위축의 위험이 있는 대상을 치료하기 위한 수단을 제공한다. 따라서, 본 발명은 그를 필요로 하는 대상에서 당 감수성을 증가시키고/시키거나 인슐린 감수성을 증가시키는 방법을 제공한다.
MSP3의 작용제로서 기능하는 물질을 포함하는 제약 조성물의 투여가 유용한 상기 질환은 대상이 인슐린-저항 질환이 있거나 이 질환이 발생할 위험이 있고/있거나 비정상적인 당불내성이 있는 경우이고, 여기서 MSP3을 포함하는 제약 조성물은 그 질병 증상을 개선할 것이다. 상기 질병은 예를 들어 외인성 인슐린의 작용에 대한 말초 조직의 정상 대사 반응의 실패 (불감증)에 의한 질병 (즉, 인슐린의 존재 하에 정상 수준 미만의 생물학적 반응을 생성시키는 병태임)을 포함한다. 임상 측면에서, 인슐린 저항성은 정상 또는 상승된 혈당 수준이 인슐린의 정상 또는 상승된 수준에도 불구하고 지속될 때 존재한다. 이것은 본질적으로 글리코겐 합성 억제를 나타내고, 이 글리코겐 합성 억제에 의해 기저 또는 인슐린 자극된 글리코겐 합성, 또는 둘 모두가 정상 수준 미만으로 감소된다. 인슐린 저항성은 명백하게 인슐린에 대한 말초 조직의 감수성 회복에 충분한 식이 또는 체중 감소에 의해 2형 당뇨병에 존재하는 고혈당증이 때때로 역전될 수 있다는 사실에 의해 입증되는 바와 같이 2형 당뇨병에서 중요한 기능을 수행한다.
일부 실시태양에서, MSP3의 작용제로서 기능하는 물질을 포함하는 제약 조성물은 대상이 인슐린 저항성이 중요한 역할을 수행하는 많은 질환, 예를 들어 비제한적으로 비만, 당뇨병, 난소 남성호르몬 과다증, 및 고혈압, 인슐린-의존 및 인슐린-비의존 당뇨병과 연관된 비정상적인 당불내성이 있거나 비정상적인 당불내성이 발생할 위험이 있을 경우에 유용하다.
일부 실시태양에서, MSP3의 작용제로서 기능하는 물질을 포함하는 제약 조성물은 당뇨병의 증상 및 합병증, 예를 들어 비제한적으로 고혈당증, 불만족스러운 혈당 제어, 케톤산증, 인슐린 저항성, 상승된 성장 호르몬 수준, 당화 헤모글로빈 및 진행된 당화 최종-산물 (AGE)의 상승된 수준, 새벽 현상, 불만족스러운 지질 프로필, 혈관 질병 (예를 들어, 죽상경화증), 미소혈관 질병, 망막 질환 (예를 들어, 증식 당뇨 망막병증), 신장 질환, 신경병증, 임신의 합병증 (예를 들어, 조기 임신 중절 및 출생 출샐 결함) 등이 존재하는 대상의 치료시에 유용하다. 치료의 정의에는, 예를 들어 인슐린 감수성 증가, 혈당 제어를 유지하면서 인슐린 투여 감소, HbA1c의 감소, 개선된 혈당 제어, 감소된 혈관, 신장, 신경, 망막 및 다른 당뇨병 합병증, "새벽 현상"의 예방 또는 감소, 개선된 지질 프로필, 임신의 합병증 감소, 및 케톤산증 감소와 같은 종료점이 포함된다.
혈관신생을 조정하기 위한 조성물.
본 발명자들은 마우스에게 한쪽 뒷다리 수술을 시행한 실시예 5 및 6 (또한 도 27 참조)에 개시된 바와 같이 허혈 마우스 모델에서 혈관재형성을 촉진하는 그들의 능력을 기초로 하여 MSP3 및 MSP5 둘 모두가 혈관신생을 촉진하는 것을 발견하기에 이르렀다 (J. Biol. Chem. 2004;279:28670-28674; Circ. Res. 2005; 96(8):838-846; Circ. Res. 2006; 98(2):254-61).
따라서, 본 발명은 그를 필요로 하는 대상에서 혈관신생을 촉진하기 위한, MSP3의 작용제로서 기능하고/하거나 MSP3 및/또는 MSP5 또는 그의 기능적 유도체 또는 작용제를 활성화시키는 물질을 포함하는 제약 조성물을 제공한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 그를 필요로 하는 대상에서 혈관신생을 억제하기 위해 MSP3 및/또는 MSP5 유전자 및/또는 유전자 산물 또는 그의 기능적 유도체에 대한 억제제 또는 길항제로서 기능하는 물질을 포함하는 제약 조성물을 제공한다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 유기체에서 혈관신생을 증가시키기 위한 방법에 관한 것이다. 본 발명은 허혈을 일으킬 위험이 있거나 혈관신생 및/또는 혈관 형성이 결핍된 대상 또는 혈관신생을 필요로 하는 대상을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 실시태양에서, 방법은 작용제로서 기능하는 물질, 예를 들어 비제한적으로 MSP3 또는 그의 기능적 유도체 또는 작용제의 유전자 및/또는 유전자 산물 (즉, 단백질)을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 다른 실시태양에서, 방법은 MSP5 또는 그의 기능적 유도체 또는 작용제의 유전자 및/또는 유전자 산물 (즉, 단백질)을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 추가의 실시태양에서, 제약 조성물은 MSP3 및 MSP5 또는 그의 기능적 유도체 또는 작용제의 유전자 및/또는 유전자 산물 (즉, 단백질)을 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 제약 조성물은 MSP3 및/또는 MSP5의 작용제를 포함한다. 다른 실시태양에서, 본 발명은 MSP3 (서열 1) 및/또는 MSP5 (서열 12) 또는 그의 상동체 또는 단편을 코딩하는 핵산을 포함하는 제약 조성물을 대상에게 투여함으로써, 근 위축이 있거나 근 위축의 위험이 있는 대상을 치료하기 위한 수단을 제공한다. 따라서, 본 발명은 그를 필요로 하는 대상에서 혈관신생을 증가시키는 방법을 제공한다.
혈관신생을 증가시키는 것이 바람직한 질병 또는 질환이 있는 대상, 따라서, 본 발명의 MSP3 및/또는 MSP5의 작용제로서 기능하는 물질을 포함하는 제약 조성물의 투여가 바람직한 대상은 예를 들어 비제한적으로 허혈 및/또는 급성 심근경색증이 존재하거나 발생할 위험이 있는 대상을 포함한다. MSP3 및/또는 MSP5의 작용제로서 기능하는 물질을 포함하는 제약 조성물을 허혈 및/또는 심근경색증 발생 전에, 발생과 동시에 또는 발생 후에 투여하면 심근의 괴사 및 염증이 감소하고 장기 기능이 유지된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, 용어 "허혈"은 혈액 유입의 감소로 인한 임의의 국지적인 조직 허혈을 나타낸다. 일부 실시태양에서, 허혈은 조직 허혈 또는 뇌 허혈, 예를 들어 조직 또는 뇌졸중의 경우 뇌의 혈전이다. 용어 "심근 허혈"은 관상동맥 죽상경화증 및/또는 심근에 대한 부적절한 산소 공급에 의해 발생되는 순환 장애를 의미한다. 예를 들어, 급성 심근경색증은 심근 조직에 대한 비가역적 허혈성 발작을 의미한다. 상기 발작은 관상동맥 순환에서 폐쇄성 (예를 들어, 혈전 또는 색전) 사건을 야기하고, 심근 대사 요구량이 심근 조직으로의 산소의 공급을 초과하는 환경을 생성시킨다. 심근경색증의 증상은 흉부의 통증, 충만도 및/또는 압박감, 턱 통증, 치통, 두통, 숨참, 구역질, 구토, 및/또는 전반적인 복벽 (상부 중앙 복부) 불쾌감; 발한, 속쓰림 및/또는 소화불량, 팔 통증 (보다 통상적으로는 좌측 팔이지만, 어느 한 쪽의 팔일 수 있음), 등 상부 통증, 및 전신 권태 (병이 있는 듯한 막연한 느낌)를 포함한다.
급성 심근경색증 (MI)은 대부분의 발병자에서 사전 경고 없이 임상적으로 검출가능한 소인성 위험 인자가 없는 상태에서 발생한다 (Braunwald E. Heart Disease: a Textbook of Cardiovascular Medicine. 1997). 급성 MI의 증상을 보이는 환자가 병원의 중환자실에 도착할 때, 급성 MI에 대한 진단은 (1) 심장 효소의 혈장 농도 증가, 및 (2) 전형적인 임상적 양상 및/또는 전형적인 ECG 변화를 모니터링함으로써 이루어질 수 있다. 다음 파라미터가 각각 심장 효소의 증가라는 요건을 충족시킬 것이다: 정상 범위의 상한의 적어도 2배의 총 크레아틴-키나제 (CK), 또는 정상 범위의 상한 및 정상 CK의 적어도 5%를 초과하는 큰 CK-MB (근육-뇌). 총 CK 또는 CK-MB가 이용가능하지 않으면, 다음 파라미터가 급성 MI의 기준을 충족시키는 것으로 허용될 것이다: 정상 범위의 상한의 적어도 3배의 트로포닌 T; 정상 범위의 상한의 적어도 3배의 트로포닌 I. 트로포닌 T의 MI에 대한 혈청 마커로서의 사용은 문헌 [V. V. Murthy and A. Karmen, J. Clin. Labor. Analys. 11:125-128 (1997)]에 개시되어 있다. 심장 트로포닌 I의 결정을 위한 민감한 면역 검정의 분석 성능 및 임상 효용은 문헌 [E. Davies et al. Clin. Biochem. 30: 479-490 (1997)]으로부터 볼 수 있다. 전형적인 ECG 변화는 2개 이상의 인접한 ECG 리드 (lead)에서 전개되는 ST-세그먼트 또는 T파 변화, 2개 이상의 인접한 ECG 리드에서 새로운 병리학적 Q/QS 파의 발생, 또는 새로운 좌각 차단 (left bundle branch block)의 발생을 포함한다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 혈관신생 감소를 필요로 하는 대상 또는 과도한 혈관신생이 발생할 위험이 있는 대상, 예를 들어 암이 존재하거나 암에 걸릴 위험이 있는 대상을 치료하기 위한 방법 및 조성물을 제공한다. 상기 실시태양에서, 방법은 MSP3 및/또는 MSP5 또는 그의 기능적 유도체의 유전자 및/또는 유전자 산물 (즉, 단백질)에 대한 길항제로서 기능하는 물질을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함한다. 따라서, 본 발명은 그를 필요로 하는 대상에서 혈관신생을 감소시키는 방법을 제공한다.
혈관신생을 감소시키는 것이 바람직한 질병 또는 질환이 있는 대상, 따라서, 본 발명의 MSP3 및/또는 MSP5에 대한 억제제로서 기능하는 물질을 포함하는 제약 조성물의 투여가 바람직한 대상은 예를 들어 비제한적으로 암 또는 종양이 존재하거나 발생할 위험이 있는 대상을 포함한다. MSP3 및/또는 MSP5의 활성 및/또는 발현을 억제하는 물질을 포함하는 제약 조성물의 투여가 혈관신생을 억제하는 다른 질병은 예를 들어 류마티스 관절염, 망막병증, 당뇨 망막병증, 염증성 질병, 재협착증 등을 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본 발명의 MSP3 및/또는 MSP5에 대한 억제제를 포함하는 제약 조성물의 투여가 혈관신생 감소에 유용한 다른 질병 및/또는 질환은 예를 들어 혈관신생 질병, 예를 들어 비제한적으로 염증성 질환, 예를 들어 면역 및 비-면역 염증, 만성 관절 류마티스 및 건선, 부적절한 또는 시기가 나쁜 혈관의 침습과 연관된 질환, 예를 들어 당뇨 망막병증, 신생혈관 녹내장, 재협착증, 죽상경화판에서 모세혈관 증식 및 골다공증, 및 종양 성장을 지지하기 위해 신생혈관 증식을 필요로 하는 암 연관 질환, 예를 들어 고형 종양, 고형 종양 전이, 혈관섬유종, 수정체후부 섬유증식증, 혈관종, 카포시 (Kaposi) 육종 등의 암을 포함한다.
비만 모델링을 위한 조성물
본 발명자들은 근 질량 및 인슐린 감수성에 영향을 미치는 많은 대사 조절인자, 예를 들어 비제한적으로 MSP5, Insl6 및 MSP3을 밝혀내었다. 따라서, 본 발명의 방법에서 길항제로서 기능하고/하거나 본 발명의 적어도 하나의 대사 조절인자의 활성을 억제하는 물질, 예를 들어 MSP5 및/또는 Insl6을 억제하는 기능을 하는 물질, 및/또는 MSP3의 작용제로서 기능하는 물질을 포함하는 제약 조성물을 대상에게 투여하는 것이 또한 고려되고, 여기서 대상은 근 질량 감소, 또는 체중 감소를 필요로 하는 대상이거나, 비만이거나 비만에 걸릴 위험이 있다.
본 발명의 적어도 하나의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6을 표적으로 하는 물질의 존재 또는 부재 하에 동물 비만 모델, 예를 들어 비만을 유도하기 위해 고지방, 고수크로스 (HF/HS) 식이를 급식한 마우스에서 총 체중의 평가, MRI에 의한 과도한 지방의 수준, 지방 세포 크기, 근육 중량, 및 서혜부 지방 패드 중량의 정량을 포함하여 체중 및 지방량을 감소시키는 물질의 능력을 분석하기 위한 예시적인 방법이 실시예 1에 기재되어 있다. 물질은 비만 동물 모델, 예를 들어 HF/HS 식이를 급식한 마우스에서 동물이, 예를 들어 실시예 1 및 도 4에서 논의되는 바와 같이, 당 및/또는 인슐린에 대한 감수성을 증가시키는 기능을 하는 유전자의 부재 하의 마우스에 비해 보다 낮은 체중 및/또는 예를 들어 MRI에 의해 검출시에 보다 낮은 과도한 지방, 및/또는 보다 작은 지방 세포 크기 및/또는 감소된 근육 중량 및/또는 감소된 서혜부 지방 패드 중량을 가질 경우에 체질량 및/또는 지방량을 감소시키는 것으로 확인된다. 체중을 감소시키고/시키거나 과도한 지방 축적을 역전시키는 물질의 능력을 평가하기 위한 추가의 특성화는 실시예 1에 기재되어 있고 (도 6 참조), 도 6에 논의된 바와 같이 유전자 또는 유전자 산물 (예를 들어 유전자의 바이러스 매개된 발현)의 존재 또는 부재 하에 동물 비만 모델, 예를 들어 비만을 유도하기 위해 고지방, 고수크로스 (HF/HS) 식이를 급식한 마우스에서 에너지 균형, 예를 들어 음식 섭취 및 에너지 소모를 분석함으로써 수행할 수 있다. 에너지 흡수, 예를 들어 음식 및 물 섭취, 전신 O2 소모 (VO2)에 의한 에너지 소모 및 탄수화물 대 지방산 산화의 비를 반영하는 호흡 교환비 (RER)의 측정, 및 정량 분석, 예를 들어 골격근 및/또는 간에서 지방산 산화 및 미토콘드리아의 생성과 연관된 유전자의 정량적 PCR 또는 QRT-PCR을 수행할 수 있다. 또한, 간 형태학 및 지질 산화 기능, 및 간에서 HF/HS 식이-유도 지질 침착의 효과, 및 간에서 합성되어 간 지방산 산화의 간접적 마커로서 사용될 수 있는 혈청 케톤체를 분석할 수 있고, 간에서 지방산 산화를 자극하는 분자, 예를 들어 HNF4α, L-CPT1 및 PGC1-α의 정량 분석을 분석할 수 있다. 유전자 및/또는 유전자 산물은 예를 들어 실시예 1 및 도 4에서 논의되는 바와 같이 당 및/또는 인슐린에 대한 감수성을 증가시키는 기능을 하는 유전자의 부재 하의 마우스에 비해 비만 동물 모델, 예를 들어 HF/HS 식이를 급식한 마우스에서 동물이 연료 공급원으로서 지방산의 보다 높은 사용 비율을 나타내는 증가된 VO2 및/또는 감소된 RER, 및/또는 간에서 감소된 지질 침착, 및/또는 증가된 지방산 산화 및/또는 증가된 혈청 케톤체 및 간 및/또는 골격근에서 지방산 산화에 대한 마커의 증가된 발현을 보일 경우 체질량 및/또는 지방량을 감소시킬 수 있는 것으로 확인된다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 유기체에서 비만을 치료하기 위한 방법에 관한 것이다. 이 방법은 본 발명의 적어도 하나의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6을 표적으로 하고 근 질량 및/또는 지방량을 감소시키고/시키거나 VO2를 증가시키고/시키거나 지방산을 증가시키는 기능을 수행하는 것으로 특성화된 물질을 포함하는 제약 조성물의 투여를 포함한다.
다른 측면에서, 본 발명은 본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어 본 발명의 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6 또는 그의 기능적 유도체 또는 변이체를 표적으로 하는 물질을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 그를 필요로 하는 대상, 또는 그 질병 또는 병태에 걸릴 위험이 있는 대상에게 투여하는 것을 포함하는, 질병 또는 병태의 치료를 위한 치료 방법을 특징으로 한다. 질병 또는 병태가 근육 병태, 예를 들어 위축증인 경우, 본 발명의 방법은 작용제로서 기능하는 물질, 예를 들어 MSP3, 및/또는 MSP5 및/또는 Insl6, 또는 그의 기능적 유도체 또는 변이체를 활성화시키는 물질을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 그를 필요로 하는 대상에게 투여하는 것을 포함하고, 여기서 근육-관련 질병 또는 병태는 개선되거나 억제된다. 본 발명의 제약 조성물에 의해 치료되는 근육-관련 병태 또는 질환은 많은 원인, 예를 들어 탈신경; 퇴행성, 대사 또는 염증성 신경병증; 영아 및 소아 척수성 근 위축; 자가면역 운동 신경병증으로부터; 만성 질병, 예를 들어 암, AIDS, 절식 또는 횡문근융해로부터 일어나는 악액질로부터; 및 근육 퇴행 위축 증후군, 예를 들어 뒤시엔느로부터 발생할 수 있다.
본 발명의 방법은 또한 본 발명의 대사 조절인자의 결핍으로 인해 발생하는 임의의 병태, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6의 결핍에 의한 임의의 병태 또는 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6의 증가된 수준에 의해 개선될 수 있는 임의의 병태를 치료하기 위해 유용하고, 상기 방법은 적어도 하나의 대사 조절인자의 작용제로서 기능하는 물질, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6 또는 그의 상동체의 적어도 하나를 활성화시키는 물질을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하고, 유효량은 대사 조절인자 중 하나의 결핍과 연관된 증상, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6의 결핍과 연관된 증상의 적어도 하나 또는 일부를 완화시키기에 충분한 양이다. 상기 질병은 예를 들어 왜소증 및 심장 질병, 예를 들어 비제한적으로 심근경색증 후 개선된 심장 조직 생존을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
또다른 실시태양에서, 본 발명은 또한 적어도 하나의 대사 조절인자의 길항제 또는 억제제로서 기능하는 물질, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6 또는 그의 상동체의 적어도 하나를 억제하는 물질을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 투여하는 것을 포함하는, 본 발명의 대사 조절인자의 상승된 수준으로부터 발생하는 임의의 병태, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6의 증가된 발현 및/또는 활성으로 인한 임의의 병태 또는 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6의 수준 감소에 의해 개선될 수 있는 임의의 병태의 치료에 유용한 방법을 포함하고, 여기서 유효량은 전사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6 중 하나의 증가된 발현 및/또는 활성과 연관된 증상의 적어도 하나 또는 일부를 완화시키기에 충분한 양이다. 상기 질병은 예를 들어 비제한적으로 비만 및 암을 포함한다.
제약 조성물의 투여
일부 실시태양에서, 본 발명의 대사 조절인자를 표적으로 하는 물질은 개별 환자의 임상 상태, 투여 부위 및 방법, 투여 스케쥴, 환자 연령, 성별, 체중 및 의료인에게 공지된 다른 인자를 고려하여 우수 의료 실무 (good medical practice)에 따라 적절한 투여량으로 투여된다. 따라서, 본원의 목적에서 제약상 "유효량"은 당업계에 공지되어 있는 상기 고려 사항에 의해 결정된다. 상기 양은 개선된 생존률 또는 보다 빠른 회복, 또는 증상의 개선 또는 제거 및 당업자에 의해 적절한 척도로서 선택되는 다른 지표를 포함하고 이로 제한되지 않는 개선을 달성하기에 효과적이어야 한다.
본 발명의 대사 조절인자를 표적으로 하는 물질은 화합물로서 또는 제약상 허용되는 염으로서 투여될 수 있고, 단독으로 또는 제약상 허용되는 담체, 희석제, 어쥬번트 및 비히클과 조합하여 활성 성분으로서 투여될 수 있음을 이해하여야 한다.
또한, 인간은 일반적으로 본원에서 예시된 마우스 또는 다른 실험 동물보다 긴 기간 동안 치료되고, 치료는 질병 과정의 기간 및 약물 유효성에 비례하는 기간 동안 실시됨을 이해하여야 한다. 투여는 단일 투여량 또는 수일에 걸친 다중 투여량일 수 있지만, 단일 투여량이 바람직하다.
본 발명의 대사 조절인자를 표적으로 하는 물질을 비경구로 투여할 때, 일반적으로 주사가능 단위 투여 형태 (예를 들어, 용액, 현탁액, 에멀젼)으로 제제화될 것이다. 주사에 적합한 제약 제형은 멸균 수성 용액 또는 분산액, 및 멸균 주사가능 용액 또는 분산액으로 재구성하기 위한 멸균 분말을 포함한다. 담체는 예를 들어 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어, 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 액체 폴리에틸렌 글리콜), 이들의 적합한 혼합물, 및 식물성 오일을 함유하는 용매 또는 분산 매질일 수 있다.
통상적인 지식을 가진 의사 또는 수의사는 필요한 제약 조성물의 유효량을 쉽게 결정하고 처방할 수 있다. 예를 들어, 의사 또는 수의사는 제약 조성물에 사용되는 본 발명의 화합물의 용량을 목적하는 치료 효과를 달성하기 위해 요구되는 것보다 더 낮은 수준으로 시작하여, 목적하는 효과가 달성될 때까지 투여량을 점차 증가시킬 수 있다.
적절한 제약상 허용되는 담체와 목적하는 투여량으로 제제화한 후에, 본 발명의 제약 조성물은 대상에게 투여될 수 있다. 본 발명의 제약 조성물은 대상에게 임의의 적합한 수단을 이용하여 투여될 수 있다. 일반적으로, 적합한 투여 수단은 국소, 경구, 비경구 (예를 들어, 정맥내, 피하 또는 근육내), 직장, 수조내 (intracisternal), 질내, 복강내, 눈, 또는 코 경로를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
본원에서 사용되는 구문 "비경구 투여" 및 "비경구 투여되는"은 대체로 주사에 의한, 소화관내 및 국소 투여 이외의 투여 방식을 의미하고, 비제한적으로 정맥내, 근육내, 동맥내, 경막내, 낭내, 안와내, 심장내, 피내, 복강내, 경기관, 피하, 표피하, 관절내, 피막하, 거미막하, 척수내 및 흉골내 주사 및 주입을 포함한다.
본원에서 사용되는 구문 "전신 투여", "전신 투여된", "말초 투여" 및 "말초 투여된"은 환자의 시스템 내에 도입되어 대사 및 다른 유사한 과정을 거치도록 화합물, 약물 또는 다른 물질을 중추신경계 내로 직접적으로 투여하는 것 이외의 다른 방식으로 투여하는 것, 예를 들어 피하 투여를 의미한다.
본 발명의 화합물, 예를 들어 화합물 (I)이 약품으로서 인간 및 포유동물에게 투여되는 경우, 그 자체로서 또는 예를 들어, 0.1 내지 99.5% (보다 바람직하게는 0.5 내지 90%)의 활성 성분, 즉, 적어도 하나의 화합물 I 및/또는 그의 유도체를 제약상 허용되는 담체와 조합하여 함유하는 제약 조성물로서 제공될 수 있다.
일반적으로, 본 발명의 화합물의 적합한 1일 용량은 치료 효과를 생성하기에 효과적인 최소 용량인 화합물의 양일 것이다. 상기 유효 용량은 일반적으로 상기 설명된 인자에 의해 결정될 것이다.
원하는 경우, 활성 화합물의 1일 유효 용량은 임의로 단위 투여 형태로 1일에 걸쳐 적절한 간격으로 별개로 투여되는 2, 3, 4, 5, 6회 이상의 하위 투여량으로서 투여될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물은 "치료 유효량" 또는 "예방 유효량"의 본 발명의 하나 이상의 레졸빈 및/또는 프로텍틴 또는 그의 유사체를 포함한다. "치료 유효량"은 필요한 투여량에서 및 기간 동안 목적하는 치료 결과, 예를 들어, 다양한 질병 상태 또는 병태와 연관된 효과의 감소 또는 예방을 달성하기 위해 효과적인 양을 나타낸다. 레졸빈 및/또는 프로텍틴 또는 그의 유사체의 치료 유효량은 대상의 질병 상태, 연령, 성별 및 체중, 및 대상에서 목적하는 반응을 일으키는 치료 화합물의 능력과 같은 인자에 따라 변할 수 있다. 치료 유효량은 또한 치료상 유익한 효과가 치료제의 임의의 독성 또는 유해 효과를 능가하는 양이다.
"예방 유효량"은 필요한 투여량에서 및 기간 동안 목적하는 예방 결과를 달성하기 위해 효과적인 양을 나타낸다. 일반적으로, 예방 용량은 질병 발생 전에 또는 질병의 초기 단계에서 대상에 사용되기 때문에, 예방 유효량은 치료 유효량보다 적을 수 있다. 예방 또는 치료 유효량은 또한 유익한 효과가 화합물의 임의의 독성 또는 유해 효과를 능가하는 양이다.
투여 요법은 최적의 목적하는 반응 (예를 들어 치료 또는 예방 반응)을 제공하기 위해 조정될 수 있다. 예를 들어, 단일 볼러스가 투여될 수 있거나, 수회의 분할 용량이 일정 시간에 걸쳐 투여될 수 있거나, 용량은 치료 상황의 긴급함에 따라 비례하여 감소 또는 증가될 수 있다. 비경구 조성물을 투여 용이성 및 투여량 균일성을 위해 투여 단위 형태로 제제화하는 것이 특히 유익하다. 본 발명의 제약 조성물 내의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 없으면서 특정 대상, 조성물, 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하기 위해 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위해 변할 수 있다.
본원에서 사용되는 "투여 단위" 형태는 치료되는 포유동물 대상을 위한 단일 투여량으로서 적합한 물리적으로 구분된 단위를 의미하고, 각각의 단위는 요구되는 제약상 담체와 함께 목적하는 치료 효과를 생성시키는 것으로 계산된 소정량의 활성 화합물을 함유한다. 본 발명의 투여 단위 형태는 (a) 화합물, 예를 들어 화합물 (I) 또는 그의 유도체의 특유한 특징 및 달성되는 특정 치료 또는 예방 효과, 및 (b) 개체에서 감수성의 치료를 위한 상기 활성 화합물의 배합 기술에 본래 존재하는 제한에 의해 결정되고 이에 직접적으로 의존한다.
치료 유효량은 초기에 세포 배양 분석에서 또는 동물 모델, 보통 마우스, 토끼, 개 또는 돼지에서 추정할 수 있다. 동물 모델은 또한 바람직한 농도 범위 및 투여 경로를 달성하기 위해 사용된다. 이어서, 상기 정보를 사용하여 다른 대상에서 유용한 용량 및 투여 경로를 결정할 수 있다. 일반적으로, 치료 유효량은 목적하는 치료 효과에 의존한다. 예를 들어, MSP3을 활성화시키는 물질의 치료 유효량은 예를 들어 실시예 5 및 6에 개시된 바와 같이 허혈 모델에서 혈관 성장 및/또는 혈관신생을 증가시키기에 충분하고/하거나, 예를 들어 실시예 5에 개시된 바와 같이 비만 모델에서 GTT 시험에서 당 감수성을 증가시키거나 비만 모델에서 체중을 감소시키기에 충분하다. 단지 예시적인 예로서, MSP5를 활성화시키는 물질의 치료 유효량은 예를 들어 실시예 5 및 6에 개시된 바와 같이 허혈 모델에서 혈관 성장 및/또는 혈관신생을 증가시키기에 충분하고/하거나, 실시예 1 및 실시예 6에 개시된 바와 같이 근 질량 및/또는 근육 비대를 증가시키기에 충분하다. 단지 다른 예시적인 예로서, Insl6을 활성화시키는 물질의 치료 유효량은 실시예 7에 개시된 바와 같이 근육 퇴행 모델, 예를 들어 근육내 CTX 주사에서, 또는 근육 퇴행 위축 모델에서 근 질량 및/또는 근육 재생을 증가시키기에 충분하다.
상기 화합물은 치료를 위해 임의의 적합한 투여 경로로, 예를 들어 경구로, 예를 들어, 스프레이에 의해 코로, 직장으로, 질 내로, 비경구로, 수조 내로 및 분말, 연고 또는 점적액 (drop)에 의해 국소로, 예를 들어 구강 내로 및 설하로 인간 및 다른 동물에게 투여될 수 있다.
본 발명의 제약 조성물 내의 활성 성분의 실제 투여량 수준은 환자에게 독성이 없으면서 특정 환자, 조성물, 및 투여 방식에 대해 목적하는 치료 반응을 달성하기 위해 효과적인 활성 성분의 양을 얻기 위해 변할 수 있다.
선택되는 투여량 수준은 사용되는 본 발명의 특정 화합물, 또는 그의 에스테르, 염 또는 아미드의 활성, 투여 경로, 투여 시간, 사용되는 특정 화합물의 배출 속도, 치료 기간, 사용되는 특정 화합물과 조합 사용되는 다른 약물, 화합물 및/또는 물질, 치료되는 환자의 연령, 성별, 체중, 상태, 전반적인 건강 및 이전 병력, 및 의료 분야에 잘 공지된 유사한 인자를 포함하여 다양한 인자에 따라 결정될 것이다.
투여량 값은 완화되는 병태의 유형 및 심도에 따라 상이할 수 있음을 이해하여야 한다. 또한, 임의의 특정 대상에 대해, 구체적인 투여 요법은 개체에 따라 및 조성물을 투여하거나 투여를 감독하는 사람의 전문적인 판단에 따라 시간에 걸쳐 조정되어야 하고, 본원에 제시된 투여량 범위는 단지 예시적인 것으로서 특허 청구된 조성물의 범위 또는 실시를 제한하고자 의도하는 것이 아님을 이해하여야 한다.
적절한 유동성은 예를 들어 코팅, 예를 들어 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다. 비수성 비히클, 예를 들어 면실유, 참기름, 올리브유, 대두유, 옥수수유, 해바라기유, 또는 땅콩유 및 에스테르, 예를 들어 이소프로필 미리스테이트를 화합물 조성물을 위한 용매계로서 사용할 수 있다. 추가로, 조성물의 물질, 멸균도, 및 등장성을 향상시키는 다양한 첨가제, 예를 들어 항미생물 방부제, 항산화제, 킬레이팅제, 및 버퍼가 첨가될 수 있다. 미생물 작용은 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 및 소르브산에 의해 확실하게 예방될 수 있다. 많은 경우에, 등장제, 예를 들어, 당, 염화나트륨 등을 포함하는 것이 바람직할 것이다. 주사가능 약품 형태의 장기 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어, 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 사용에 의해 유도될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따르면, 사용되는 임의의 비히클, 희석제, 또는 첨가제는 화합물과 상용성이어야 할 것이다.
멸균 주사가능 용액은 본 발명의 실행시에 이용되는 화합물을, 요구되는 다양한 다른 성분과 함께 요구되는 양의 적절한 용매 중에 혼입시켜 제조할 수 있다.
본 발명의 제약 제형은 임의의 상용성 담체, 예를 들어 다양한 비히클, 어쥬번트, 첨가제, 및 희석제를 함유하는 주사가능 제형으로 환자에게 투여될 수 있거나; 본 발명에서 사용되는 화합물은 서방형 피하 이식물 또는 표적화된 전달 시스템, 예를 들어 모노클로날 항체, 벡터 전달체, 이온 도입 (iontophoretic), 중합체 매트릭스, 리포좀, 및 미세구의 형태로 환자에게 비경구로 투여될 수 있다. 본 발명에 유용한 전달계의 예는 미국 특허 5,225,182; 5,169,383; 5,167,616; 4,959,217; 4,925,678; 4,487,603; 4,486,194; 4,447,233; 4,447,224; 4,439,196 및 4,475,196에 제시된 것을 포함한다. 상기 다른 이식물, 전달 시스템, 및 모듈은 당업자에게 잘 공지되어 있다.
본 발명에서 사용되는 화합물의 약물학적 제형은 경구로 환자에게 투여될 수 있다. 화합물을 정제, 현탁액, 용액, 에멀젼, 캡슐, 분말, 시럽 등으로 투여하는 것과 같은 통상적인 방법이 사용될 수 있다. 화합물을 경구로 또는 정맥 내로 전달하고 생물학적 활성을 유지하는 공지의 기술이 바람직하다.
다른 실시태양에서, 제약상 허용되는 제형은 지질-기반 제형을 포함한다. 임의의 공지의 지질-기반 약물 전달계가 본 발명의 실시에 사용될 수 있다. 예를 들어, 캡슐화된 활성 화합물의 지연 방출 속도를 확립할 수 있다면 다소포 (multivesicular) 리포좀, 다층 (multilamellar) 리포좀 및 단층 (unilamellar) 리포좀이 모두 사용될 수 있다. 방출 제어형의 다소포 리포좀 약물 전달계의 제조 방법은 그 내용이 본원에 참고로 포함되는 PCT 출원 공개 WO 9703652, WO 9513796 및 WO 9423697에 기재되어 있다.
합성 막 소포의 조성은 대체로 스테로이드, 특히 콜레스테롤과 조합된 인지질의 조합물이다. 다른 인지질 또는 다른 지질이 또한 사용될 수 있다. 합성 막 소포 생산에 유용한 지질의 예는 포스파티딜글리세롤, 포스파티딜콜린, 포스파티딜세린, 포스파티딜에탄올아민, 스핑고지질, 세레브로시드 및 강글리오시드를 포함하고, 바람직한 실시태양은 달걀 포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜콜린, 디스테아로일포스파티딜콜린, 디올레오일포스파티딜콜린, 디팔미토일포스파티딜글리세롤, 및 디올레오일포스파티딜글리세롤을 포함한다.
활성 화합물을 함유하는 지질-기반 소포의 제조시에, 활성 화합물 캡슐화의 효율, 활성 화합물의 불안정성, 소포의 생성되는 집단의 균일도 및 크기, 활성 화합물-대-지질 비, 투과도, 제제의 불안정성, 및 제형의 제약상 허용성과 같은 변수를 고려하여야 한다.
도입 전에, 제형은 당업계에서 이용가능한 많은 임의의 기술, 예를 들어 감마 방사선 또는 전자 빔 멸균에 의해 멸균시킬 수 있다.
물질은 환자에게 전달될 때 임의의 적합한 경로, 예를 들어 경구로 (예를 들어, 캡슐, 현탁액 또는 정제로) 또는 비경구 투여에 의해 투여될 수 있다. 비경구 투여는 예를 들어 근육내, 정맥내, 동맥내, 관절내, 경막내, 피하, 또는 복강내 투여를 포함할 수 있다. 물질은 또한 경구로, 경피로, 국소로, 흡입에 의해 (예를 들어, 기관지내, 비내, 경구 흡입 또는 점비액) 또는 직장으로 투여될 수 있다. 투여는 처방에 따라 국소 또는 전신 투여일 수 있다. 또한, 물질은 당업자에게 공지된 바이러스 벡터를 사용하여 전달될 수 있다.
제약상 허용되는 제형은 수성 비히클에 현탁되고, 통상적인 피하 주사 바늘 (hypodermic needle)을 통해 또는 주입 펌프를 사용하여 도입될 수 있다.
제약 조성물
본 발명의 다른 실시태양에서, 대사 조절인자를 표적으로 하는 하나 이상의 물질을 임의의 조합으로 임의의 다른 치료제와 함께 함유하는 제약 조성물이 개시된다. 투여의 목적으로, 대사 조절인자를 표적으로 하는 물질, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6 또는 그의 기능적 유도체를 표적으로 하는 물질은 바람직하게는 제약 조성물로서 제제화된다. 본 발명의 제약 조성물은 본 발명의 화합물 및 제약상 허용되는 담체를 포함하고, 여기서 화합물은 조성물 내에 관심있는 병태를 치료하기 위해 효과적인 양으로 존재한다. 적절한 농도 및 투여량은 당업자가 쉽게 결정할 수 있다.
제약상 허용되는 담체는 당업자가 잘 알고 있다. 액체 용액으로 제제화되는 조성물에서, 허용가능한 담체는 염수 및 멸균수를 포함하고, 임의로 항산화제, 버퍼, 정균제 및 다른 통상적인 첨가제를 포함할 수 있다. 또한, 조성물은 본 발명의 화합물에 추가로 희석제, 분산제 및 표면 활성제, 결합제, 및 윤활제를 함유하는 알약, 캡슐, 과립, 또는 정제로서 제제화될 수 있다. 당업자는 추가로 본 발명의 화합물을 적절한 방식으로, 승인된 기준, 예를 들어 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, Gennaro, Ed., Mack Publishing Co., Easton, Pa. 1990]에 개시된 바에 따라 제제화할 수 있다.
대사 조절인자를 표적으로 하는 물질, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6을 표적으로 하는 물질은 단독으로 투여하는 것이 가능하지만, MSP3 또는 MSP5 또는 Insl6 또는 기능적 유도체의 활성을 활성화시키고/시키거나 억제하는 물질을 제약 조성물로서 투여하는 것이 바람직하다.
본 발명의 제제는 당업자에게 공지된 많은 수단에 의해 제조할 수 있다. 일부 실시태양에서, 제형은 (i) 다수의 치료상 유효 용량을 제공하기에 충분한 양의 대사 조절인자를 표적으로 하는 물질, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6 또는 그의 기능적 유도체를 표적으로 하는 물질; (ii) 각각의 제형을 안정화시키기에 효과적인 양의 물; (iii) 에어로졸 통 (canister)으로부터 다수의 용량을 추진시키기에 충분한 양의 추진제; 및 (iv) 임의의 추가의 선택적인 성분, 예를 들어 공용매로서의 에탄올을 조합하고; 성분을 분산시킴으로써 제조할 수 있다. 성분은 통상적인 혼합기 또는 균질화기를 사용하여, 진탕에 의해, 또는 초음파 에너지에 의해 분산될 수 있다. 벌크 제형은 밸브 대 밸브 전달 방법을 사용하여, 압축 충전에 의해 또는 통상적인 냉장 주입 (cold-fill) 방법을 사용하여 보다 작은 개별적인 에어로졸 바이알로 전달될 수 있다. 현탁액 에어로졸 제형에 사용되는 안정화제가 추진제에 용해성일 필요는 없다. 용해성이 충분하지 않은 안정화제는 약물 입자 상에 적절한 양으로 코팅될 수 있고, 이어서 코팅된 입자는 상기 설명된 바와 같은 제형에 혼입될 수 있다.
본 발명의 조성물은 임의의 형태일 수 있다. 이 형태는 본 발명의 하나 이상의 레졸빈 및/또는 프로텍틴 또는 이들의 유사체를 포함하는 용액, 현탁액, 분산액, 연고 (경구 연고 포함), 크림, 페이스트, 겔, 분말 (가루 치약 포함), 치약, 로젠지, 연고, 씹는 껌, 구강 스프레이, 향정, 향낭, 구강세정제, 에어로졸, 정제, 캡슐, 경피 패치를 포함하고, 이로 제한되지 않는다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 대사 조절인자를 표적으로 하는 물질, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6을 표적으로 하는 물질, 예를 들어 핵산 물질 또는 폴리펩티드 물질은 대상에게 제약상 허용되는 담체와 함께 제약 조성물로서 투여된다. 특정 실시태양에서, 상기 제약 조성물은 임의로 하나 이상의 추가의 치료제를 추가로 포함한다. 특정 실시태양에서, 추가의 치료제(들)은 항-비만 약물, 인슐린 불감증에 대한 약물, 예를 들어 인슐린, 및 근 위축 및 퇴행을 예방하기 위해 투여되는 약물이다. 물론, 당업자에게 공지된 상기 치료제는 상기 나열된 것이 제한적인 것으로 간주되지 않아야 하기 때문에 쉽게 대체될 수 있다.
특정 실시태양에서, 내인성 화합물은 본원에서 설명되거나 당업자에게 공지된 하나 이상의 정제 방법에 의해 단리되고/되거나 정제되거나, 실질적으로 정제된다. 일반적으로, 순도는 적어도 90%, 특히 95% 및 종종 99% 초과이다. 특정 실시태양에서, 천연 발생 화합물은 보다 넓은 종류에 대한 일반적인 설명으로부터 제외된다.
본원에서 사용되는 구문 "제약상 허용되는 담체"는 본 발명의 화합물(들)을 그의 의도되는 기능을 수행할 수 있도록 대상 내에 또는 대상에게 운반 또는 수송할 때 수반되는 제약상 허용되는 물질, 조성물 또는 비히클, 예를 들어 액체 또는 고체 충전제, 희석제, 부형제, 용매 또는 캡슐화 물질을 의미한다. 용어 "제약상 허용되는 담체"는 목적하는 특정 투여 형태에 적합한 모든 용매, 희석제, 또는 다른 액체 비히클, 분산액 또는 현탁액 조제, 표면 활성제, 등장제, 비후제 또는 유화제, 방부제, 고체 결합제, 윤활제 등을 포함하고자 의도한 것이다. 일반적으로, 상기 화합물은 하나의 장기 또는 신체의 일부로부터 다른 장기 또는 신체의 일부로 운반 또는 수송된다. 각각의 담체는 제형의 다른 성분과 상용성이고 환자에게 유해하지 않다는 의미에서 "허용되는" 것이어야 한다. 제약상 허용되는 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 당, 예를 들어 락토스, 포도당 및 수크로스; 전분, 예를 들어 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 그의 유도체, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 분말화 트라가칸트; 맥아; 젤라틴; 탈크; 부형제, 예를 들어 코코아 버터 및 좌제 왁스; 오일, 예를 들어 땅콩유, 면실유, 홍화유, 참기름, 올리브유, 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜; 폴리올, 예를 들어 글리세린, 소르비톨, 만니톨 및 폴리에틸렌 글리콜; 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 아가; 완충제, 예를 들어 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 알긴산; 발열원 미함유 물; 등장 염수; 링거 (Ringer) 용액; 에틸 알콜; 인산염 버퍼 용액; 및 제약 제형에 사용되는 다른 비독성 상용성 물질을 포함한다.
특정 실시태양에서, 본 발명의 화합물, 예를 들어 본 발명의 대사 조절인자를 표적으로 하는 물질, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6 또는 그의 기능적 유도체를 표적으로 하는 물질, 예를 들어 핵산 물질 또는 폴리펩티드 물질은 하나 이상의 산성 관능기를 함유할 수 있고, 따라서 제약상 허용되는 염기와 제약상 허용되는 염을 형성할 수 있다. 본원에서 사용되는 용어 "제약상 허용되는 염, 에스테르, 아미드, 및 전구약물"은 올바른 의료적 판단 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등을 야기하지 않으면서 환자의 조직과 접촉하여 사용하기 적합하고, 합리적인 유익/위험 비가 적당하고, 본 발명의 화합물의 의도한 용도를 위해 효과적인, 본 발명의 화합물의 카르복실레이트 염, 아미노산 부가염, 에스테르, 아미드, 및 전구약물을 의미한다. 용어 "염"은 본 발명의 화합물의 비교적 비독성의 무기 및 유기 산 부가염을 의미한다.
상기 염은 화합물의 최종 단리 및 정제 동안 계내에서 제조되거나 또는 정제된 화합물을 그의 유리 염기 형태로 적합한 유기 또는 무기산과 별개로 반응시키고 형성되는 염을 단리하여 제조할 수 있다. 이들 염은 알칼리 및 알칼리토금속, 예를 들어 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 기재로 한 양이온, 및 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 에틸아민 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 비독성 암모늄, 4급 암모늄, 및 아민 양이온을 포함할 수 있다 (예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Berge S. M., et al., "Pharmaceutical Salts," J. Pharm. Sci., 1977; 66:1-19] 참조).
용어 "제약상 허용되는 에스테르"는 본 발명의 화합물의 비교적 비독성의 에스테르화 산물을 의미한다. 상기 에스테르는 화합물의 최종 단리 및 정제 동안 계내에서 제조되거나 또는 정제된 화합물을 그의 유리 산 또는 히드록실 형태로 적합한 에스테르화 물질과 별개로 반응시켜 제조할 수 있다. 카르복실산은 촉매의 존재 하에 알콜로 처리하여 에스테르로 전환시킬 수 있다. 이 용어는 생리학적 상태 하에서 용매화될 수 있는 보다 낮은 탄화수소기, 예를 들어, 알킬 에스테르, 메틸, 에틸 및 프로필 에스테르를 추가로 포함하는 것으로 의도된다.
본원에서 사용되는 바와 같이, "제약상 허용되는 염 또는 전구약물"은 올바른 의료적 판단 범위 내에서, 과도한 독성, 자극, 알레르기 반응 등을 야기하지 않으면서 환자의 조직과 접촉하여 사용하기 적합하고, 합리적인 유익/위험 비가 적당하고, 이들의 의도한 용도에 효과적인 염 또는 전구약물이다. 상기 화합물은 가능한 경우 본 발명의 화합물의 쌍성 이온 (zwitterion) 형태를 포함한다.
용어 "염"은 본 발명의 화합물의 비교적 비독성의 무기 및 유기산 부가염을 의미한다. 상기 염은 화합물의 최종 단리 및 정제 동안 계내에서 제조되거나 또는 정제된 화합물을 그의 유리 염기 형태로 적합한 유기 또는 무기산과 별개로 반응시키고 형성되는 염을 단리하여 제조할 수 있다. 이들 염은 알칼리 및 알칼리토금속, 예를 들어 나트륨, 리튬, 칼륨, 칼슘, 마그네슘 등을 기재로 한 양이온, 및 암모늄, 테트라메틸암모늄, 테트라에틸암모늄, 메틸아민, 디메틸아민, 트리메틸아민, 트리에틸아민, 에틸아민 등을 포함하고 이로 제한되지 않는 비독성 암모늄, 4급 암모늄, 및 아민 양이온을 포함할 수 있다 (예를 들어, 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Berge S. M., et al. (1977) J. Pharm. Sci. 66, 1] 참조).
용어 "전구약물"은 혈액 내에서 가수분해에 의해 활성화될 수 있는, 생체 내에서 신속하게 전환되어 본 발명의 화합물, 예를 들어 본 발명의 대사 조절인자를 표적으로 하는 물질, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6을 표적으로 하는 물질을 생성시키는 화합물 또는 물질을 의미한다. 충분한 설명은 둘 모두 본원에 참고로 포함되는 문헌 ([T. Higachi and V. Stella, "Pro-drugs as Novel Delivery Systems," Vol. 14 of the A.C.S. Symposium Series], 및 [Bioreversible Carriers in: Drug Design, ed. Edward B. Roche, American Pharmaceutical Association and Pergamon Press, 1987])에 제공되어 있다. 본원에서 사용되는 바와 같이, 전구약물은 생체 내에 투여시에 대사되거나 다른 방식으로 생물학상, 제약상 또는 치료상 활성 형태의 화합물로 전환되는 화합물이다. 전구약물은 화합물의 대사 안정성 또는 수송 특성을 변경시키거나, 부작용 또는 독성을 차단하거나, 화합물의 향미를 개선시키거나 또는 화합물의 다른 특징 또는 특성을 변경시키도록 설계될 수 있다. 생체 내에서의 약역학 과정 및 약물 대사를 알고 있기 때문에, 일단 제약 활성 화합물이 확인된 후에는, 제약업계의 당업자는 일반적으로 화합물의 전구약물을 설계할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Nogrady (1985) Medicinal Chemistry A Biochemical Approach, Oxford University Press, N. Y., pages 388-392] 참조). 적합한 전구약물의 선택 및 제조를 위한 통상적인 과정은 예를 들어 문헌 ["Design of Prodrugs," ed. H. Bundgaard, Elsevier, 1985]에 기재되어 있다. 전구약물의 적합한 예는 상응하는 산의 메틸, 에틸 및 글리세롤 에스테르를 포함한다.
본 발명의 다른 실시태양에서, 본 발명의 대사 조절인자를 표적으로 하는 물질, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6 또는 그의 기능적 유도체를 표적으로 하는 물질은 그들의 조직 특이성을 증가시키고 세포, 예를 들어 근육 세포를 표적으로 하는 다른 표적화 물질에 컨쥬게이팅되거나 공유 부착될 수 있다. 표적화 물질은 예를 들어 비제한적으로 "표적화" 섹션에서 논의된 바와 같이 항체, 시토킨 및 수용체 리간드를 포함할 수 있다. 일부 실시태양에서, 표적화 물질은 표적화되는 세포, 예를 들어 근육 세포 상에서 비-근육 세포에 비해 과다발현된다.
습윤제, 유화제 및 윤활제, 예를 들어 나트륨 라우릴 술페이트 및 마그네슘 스테아레이트, 및 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 향미제 및 방향제, 방부제 및 항산화제도 조성물 내에 존재할 수 있다.
제약상 허용되는 항산화제의 예는 수용성 항산화제, 예를 들어 아스코르브산, 시스테인 염산염, 나트륨 비술페이트, 나트륨 메타비술페이트, 나트륨 술파이트 등; 지용성 항산화제, 예를 들어 아스코르빌 팔미테이트, 부틸화 히드록시아니솔 (BHA), 부틸화 히드록시톨루엔 (BHT), 레시틴, 프로필 갈레이트, 알파-토코페롤 등; 및 금속 킬레이팅제, 예를 들어 시트르산, 에틸렌디아민 테트라아세트산 (EDTA), 소르비톨, 타르타르산, 인산 등을 포함한다.
본 발명의 제제는 정맥내, 경구, 코, 국소, 경피, 구강, 설하, 직장, 질 및/또는 비경구 투여에 적합한 것을 포함한다. 제형은 편리하게 단위 투여 형태로 제시될 수 있고, 약학 분야에 잘 공지된 임의의 방법에 의해 제조할 수 있다. 단일 투여 형태를 제조하기 위해 담체 물질과 조합될 수 있는 활성 성분의 양은 일반적으로 치료 효과를 생성시키는 화합물의 양일 것이다. 일반적으로, 100% 중에서, 상기 양은 약 1% 내지 약 99%의 활성 성분, 바람직하게는 약 5% 내지 약 70%, 가장 바람직하게는 약 10% 내지 약 30%일 것이다.
경구 투여에 적합한 본 발명의 제제는 캡슐, 카세제, 알약, 정제, 로젠지 (향미 베이스, 대체로 수크로스 및 아카시아 또는 트라가칸트를 사용), 분말, 과립의 형태이거나, 또는 수성 또는 비-수성 액체 중의 용액 또는 현탁액, 또는 수중유 또는 유중수 액체 에멀젼, 또는 엘릭시르 또는 시럽, 또는 향정 (불활성 베이스, 예를 들어 젤라틴 및 글리세린, 또는 수크로스 및 아카시아를 사용) 및/또는 구강 세정제 등일 수 있고, 이들은 각각 소정량의 본 발명의 화합물을 활성 성분으로서 함유한다. 본 발명의 화합물은 또한 볼러스, 연약 또는 페이스트로서 투여될 수 있다.
경구 투여를 위한 본 발명의 고체 투여 형태 (캡슐, 정제, 알약, 당의정, 분말, 과립 등)에서, 활성 성분은 하나 이상의 제약상 허용되는 담체, 예를 들어 시트르산나트륨 또는 인산이칼슘, 및/또는 충전제 또는 증량제, 예를 들어 전분, 락토스, 수크로스, 포도당, 만니톨, 및/또는 규산; 결합제, 예를 들어, 카르복시메틸셀룰로스, 알기네이트, 젤라틴, 폴리비닐 피롤리돈, 수크로스 및/또는 아카시아; 보습제, 예를 들어 글리세롤; 붕해제, 예를 들어 아가-아가, 탄산칼슘, 감자 또는 타피오카 전분, 알긴산, 특정 실리케이트, 및 탄산나트륨; 용해 지연제, 예를 들어 파라핀; 흡수 촉진제, 예를 들어 4급 암모늄 화합물; 습윤제, 예를 들어, 세틸 알콜 및 글리세롤 모노스테아레이트; 흡수제, 예를 들어 카올린 및 벤토나이트 점토; 윤활제, 예를 들어 탈크, 칼슘 스테아레이트, 마그네슘 스테아레이트, 고체 폴리에틸렌 글리콜, 나트륨 라우릴 술페이트, 및 이들의 혼합물; 및 착색제 중의 임의의 성분과 혼합된다. 캡슐, 정제 및 알약의 경우에, 제약 조성물은 완충제도 포함할 수 있다. 또한, 유사한 유형의 고체 조성물이 부형제, 예를 들어 락토스 또는 유당, 및 고분자량 폴리에틸렌 글리콜 등을 사용하여 연질 및 경질의 충전된 젤라틴 캡슐 내의 충전제로서 사용될 수 있다.
정제는 임의로 하나 이상의 보조 성분과 함께 압축 또는 몰딩에 의해 제조될 수 있다. 압축된 정제는 결합제 (예를 들어, 젤라틴 또는 히드록시프로필메틸 셀룰로스), 윤활제, 불활성 희석제, 방부제, 붕해제 (예를 들어, 나트륨 전분 글리콜레이트 또는 가교결합된 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스), 표면-활성제 또는 분산제를 사용하여 제조할 수 있다. 몰딩된 정제는 불활성 액체 희석제로 습윤화된 분말화된 화합물의 혼합물을 적합한 기계로 몰딩함으로써 제조할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물의 정제 및 다른 고체 투여 형태, 예를 들어 당의정, 캡슐, 알약 및 과립은 임의로 코팅 및 외피, 예를 들어 장용 코팅 및 약품-제제화 업계에 잘 공지된 다른 코팅을 사용하여 얻거나 제조할 수 있다. 이들 투여 형태는 또한 예를 들어 목적하는 방출 프로필을 제공하기 위한 상이한 비율의 히드록시프로필메틸 셀룰로스, 다른 중합체 매트릭스, 리포좀 및/또는 미세구를 사용하여 그 내부의 활성 성분의 느린 또는 제어된 방출을 제공하도록 제제화될 수 있다. 이들 투여 형태는 예를 들어 세균-보유 필터를 통한 여과에 의해, 또는 사용 직전에 멸균수, 또는 일부 다른 멸균 주사가능 매질에 용해될 수 있는 멸균 고체 조성물의 형태로 멸균제를 포함시킴으로써 멸균될 수 있다. 상기 조성물은 또한 임의로 불투명화제를 함유할 수 있고, 활성 성분(들)만을 방출하거나, 또는 임의로 지연된 방식으로 위장관의 특정 부위에서 우선적으로 방출하는 조성물일 수 있다. 사용될 수 있는 매몰 (embedding) 조성물의 예는 중합성 물질 및 왁스를 포함한다. 활성 성분은 또한 적절한 경우 하나 이상의 상기 설명된 부형제와 함께 미세캡슐화된 형태로 존재할 수 있다. 한 측면에서, 레졸빈 및/또는 프로텍틴 또는 그의 전구체 또는 유사체의 용액은 눈 신생혈관증식에 대한 점안제로서 또는 이염 (otitis)을 치료하기 위한 점이제 (ear drop)로서 투여될 수 있다.
본 발명의 화합물의 경구 투여를 위한 액체 투여 형태는 제약상 허용되는 에멀젼, 마이크로에멀젼, 용액, 현탁액, 시럽 및 엘릭시르를 포함한다.
활성 성분에 추가로, 액체 투여 형태는 당업계에서 통상적으로 사용되는 불활성 희석제, 예를 들어, 물 또는 다른 용매, 가용화제 및 유화제, 예를 들어 에틸 알콜, 이소프로필 알콜, 에틸 카르보네이트, 에틸 아세테이트, 벤질 알콜, 벤질 벤조에이트, 프로필렌 글리콜, 1,3-부틸렌 글리콜, 오일 (특히, 면실유, 낙화생유, 옥수수유, 배아유, 올리브유, 피마자유 및 참기름), 글리세롤, 테트라히드로푸릴 알콜, 폴리에틸렌 글리콜 및 소르비탄의 지방산 에스테르, 이들의 혼합물을 포함할 수 있다. 불활성 희석제 이외에, 경구 조성물은 또한 어쥬번트, 예를 들어 습윤제, 유화제 및 현탁제, 감미제, 향미제, 착색제, 방향제 및 방부제를 포함할 수 있다.
현탁액은 활성 화합물에 추가로 현탁제, 예를 들어, 에톡실화 이소스테아릴 알콜, 폴리옥시에틸렌 소르비톨 및 소르비탄 에스테르, 미정질 셀룰로스, 알루미늄 메타히드록시드, 벤토나이트, 아가-아가 및 트라가칸트, 이들의 혼합물을 함유할 수 있다.
일부 경우에, 본 발명의 대사 조절인자를 표적으로 하는 물질, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6 또는 그의 기능적 유도체의 적어도 하나를 표적으로 하는 물질은 본 발명의 하나 이상의 화합물을, 예를 들어 코코아 버터, 폴리에틸렌 글리콜, 좌제 왁스 또는 살리실레이트를 포함하는 하나 이상의 적합한 비자극성 부형제 또는 담체와 혼합하여 제조할 수 있고 실온에서 고체이지만 체온에서 액체이고, 따라서 활성 화합물을 방출하는, 직장 또는 질 투여에 적합한 제형, 예를 들어 좌제일 수 있다. 상기 투여에 적합한 담체 및 제형은 당업계에 공지되어 있다.
본 발명의 화합물의 국소 또는 경피 투여를 위한 투여 형태는 분말, 스프레이, 연고, 페이스트, 크림, 로션, 겔, 용액, 패치 및 흡입제를 포함한다. 활성 화합물은 멸균 조건 하에 제약상 허용되는 담체, 및 필요할 수 있는 임의의 방부제, 버퍼, 또는 추진제와 혼합될 수 있다.
연고, 페이스트, 크림 및 겔은 본 발명의 활성 화합물에 추가로 부형제, 예를 들어 동물 및 식물성 지방, 오일, 왁스, 파라핀, 전분, 트라가칸트, 셀룰로스 유도체, 폴리에틸렌 글리콜, 실리콘, 벤토나이트, 규산, 탈크 및 아연 산화물, 또는 그의 혼합물을 함유할 수 있다. 분말 및 스프레이는 본 발명의 화합물에 추가로 부형제, 예를 들어 락토스, 탈크, 규산, 수산화알루미늄, 규산칼슘 및 폴리아미드 분말, 또는 상기 물질의 혼합물을 함유할 수 있다. 스프레이는 추가로 통상적인 추진제, 예를 들어 클로로플루오로탄화수소 및 휘발성 비치환 탄화수소, 예를 들어 부탄 및 프로판을 함유할 수 있다.
경피 패치는 본 발명의 화합물 (레졸빈 및/또는 프로텍틴 및/또는 그의 전구체 또는 유사체)을 신체에 제어 방식으로 전달한다는 잇점을 추가로 갖는다. 상기 투여 형태는 화합물을 적절한 매질 내에 용해 또는 분산시킴으로써 제조할 수 있다. 또한, 피부를 통한 화합물의 유동을 증가시키기 위해 흡수 인핸서가 사용될 수 있다. 상기 유동 속도는 속도 제어 막을 제공하거나 또는 활성 화합물을 중합체 매트릭스 또는 겔에 분산시킴으로써 제어될 수 있다.
비경구 투여에 적합한 본 발명의 제약 조성물은 본 발명의 하나 이상의 화합물을 하나 이상의 제약상 허용되는 멸균 등장성 수성 또는 비수성 용액, 분산액, 현탁액 또는 에멀젼, 또는 사용 직전에 멸균 주사가능 용액 또는 분산액으로 재구성될 수 있는 멸균 분말과 함께 포함하고, 이는 항산화제, 버퍼, 정균제, 제형을 의도하는 피투여자의 혈액과 등장성으로 만드는 용질 또는 현탁제 또는 비후제 물질을 함유할 수 있다.
본 발명의 제약 조성물에 사용될 수 있는 적합한 수성 및 비수성 담체의 예는 물, 에탄올, 폴리올 (예를 들어 글리세롤, 프로필렌 글리콜, 폴리에틸렌 글리콜 등) 및 이들의 적합한 혼합물, 식물성 오일, 예를 들어 올리브유, 및 주사가능한 유기 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트를 포함한다. 적절한 유동성은 예를 들어 코팅 물질, 예를 들어 레시틴의 사용에 의해, 분산액의 경우에 요구되는 입자 크기의 유지에 의해, 및 계면활성제의 사용에 의해 유지될 수 있다.
상기 조성물은 또한 어쥬번트, 예를 들어 방부제, 습윤제, 유화제 및 분산제를 함유할 수 있다. 미생물 작용의 방지는 다양한 항균제 및 항진균제, 예를 들어, 파라벤, 클로로부탄올, 페놀 소르브산 등의 포함에 의해 보장될 수 있다. 또한, 등장제, 예를 들어 당, 염화나트륨 등을 조성물 내에 포함시키는 것이 바람직할 수 있다. 또한, 주사가능한 약품 형태의 장기 흡수는 흡수를 지연시키는 물질, 예를 들어 알루미늄 모노스테아레이트 및 젤라틴의 포함에 의해 일어날 수 있다.
일부 경우에, 약물의 효과를 연장하기 위해, 피하 또는 근육내 주사로부터 약물의 흡수를 느리게 하는 것이 바람직하다. 이는 수용해도가 불량한 결정질 또는 무정질 물질의 액체 현탁액을 사용하여 달성할 수 있다. 따라서, 약물의 흡수 속도는 그의 용해 속도에 좌우되고, 이는 다시 결정 크기 및 결정질 형태에 좌우될 수 있다. 별법으로, 비경구 투여된 약물 형태의 지연된 흡수는 약물을 오일 비히클 내에 용해시키거나 현탁시킴으로써 달성된다.
주사가능한 데포 형태는 생분해성 중합체, 예를 들어 폴리락티드-폴리글리콜리드 내에 대상 화합물의 미세캡슐화된 매트릭스를 형성함으로써 제조된다. 약물 대 중합체의 비와 사용된 특정 중합체의 성질에 따라, 약물 방출 속도가 제어될 수 있다. 다른 생분해성 중합체의 예는 폴리(오르토에스테르) 및 폴리(안히드라이드)를 포함한다. 주사가능한 데포 제형은 또한 약물을 신체 조직과 상용성인 리포좀 또는 마이크로에멀젼 내에 포획함으로써 제조된다.
선택된 투여 경로에 관계 없이, 적합한 수화 형태로 사용될 수 있는 본 발명의 화합물, 및/또는 본 발명의 제약 조성물은 당업자에게 공지된 통상적인 방법에 의해 제약상 허용되는 투여 형태로 제형화될 수 있다.
그 내용이 본원에 참고로 포함되는 문헌 [Remington's Pharmaceutical sciences Ed. Germany, Merk Publishing, Easton, PA, 1995]에서는 제약 조성물을 제조하는데 사용되는 다양한 담체 및 그의 제제화를 위한 공지의 기술을 개시한다. 제약상 허용되는 담체로서 작용할 수 있는 물질의 일부 예는 당, 예를 들어 락토스, 포도당 및 수크로스; 전분, 예를 들어 옥수수 전분 및 감자 전분; 셀룰로스 및 그의 유도체, 예를 들어 나트륨 카르복시메틸 셀룰로스, 에틸 셀룰로스 및 셀룰로스 아세테이트; 맥아; 젤라틴; 탈크; 부형제, 예를 들어 코코아 버터: 좌제 왁스; 오일, 예를 들어 땅콩유, 면실유; 홍화유; 참기름; 올리브유; 옥수수유 및 대두유; 글리콜, 예를 들어 프로필렌 글리콜; 에스테르, 예를 들어 에틸 올레에이트 및 에틸 라우레이트; 아가; 완충제, 예를 들어 수산화마그네슘 및 수산화알루미늄; 물; 등장 염수; 링거 용액, 에틸 알콜, 및 인산염 버퍼 용액, 및 다른 비독성 상용성 윤활제, 예를 들어 나트륨 라우릴 술페이트 및 황산마그네슘을 포함하고 이로 제한되지 않으며, 또한 착색제, 이형제, 코팅제, 감미제, 향미제 및 방향제, 방부제 및 항산화제가 또한 제형업자의 판단에 따라 조성물 내에 존재할 수 있다.
본 발명의 유전자의 다른 용도
본 발명은 또한 mRNA, 기능적 RNA, 예를 들어, 마이크로RNA의 확인을 포함하여, 근육 성장, 비만, 인슐린 감수성, 근 질량, 지방량, 근육 성장 및 심혈관 기능과 연관된 다른 인자를 확인하기 위해 본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6를 사용하기 위한 방법을 제공한다. 상기 방법은 당업자에게 공지되어 있고, 아래에 설명된 방법을 포함할 수 있다.
본 발명은 또한 대사 인자를 선택적으로 활성화하거나 억제하는 물질을 확인하기 위한, 예를 들어 본 발명의 방법에 의해 근육 성장, 비만, 인슐린 감수성 및 심혈관 기능과 연관된 질환 및 병태의 치료를 위해 사용될 물질을 확인하기 위한 분석에서 본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6을 사용하는 방법을 제공한다.
본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6 또는 그의 상동체는 근육 성장 및 생물학뿐만 아니라 혈관신생, 인슐린 감수성 및 지방량 감소/성장에 대한 확인된 유전자 및 유전자 산물의 효과를 검사하기 위한 추가의 특성화를 위해 유용하다.
본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6은 트랜스제닉 동물, 예를 들어, 낙-아웃 (knock-out) 동물, 예를 들어, 외인성 발현을 갖는 동물의 제조를 위해 사용될 수 있다. 또한, 낙-아웃 동물을 포함한 트랜스제닉 동물은 예를 들어 실시예에 개시된 방법을 사용하거나, 상기 질병의 트랜스제닉 마우스 모델을 사용하여 상기 마우스를 번식함으로써 질병 또는 질환의 동물 모델, 예를 들어 비만 모델, 근육 퇴행 위축 마우스 모델, AID 및 AID-관련 동물 모델, 포도당 불감증 및 인슐린 불감증에 대한 모델로서 사용될 수 있다.
예를 들어, 본 발명의 적어도 하나의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6의 적어도 하나에 대한 상기 트랜스제닉 동물, 예를 들어 적어도 하나의 대사 조절인자를 과다발현하고/하거나, 낙-인 (knock-in) 및/또는 낙-아웃시킨 동물은 관심 있는 표현형, 예를 들어, 비만, 당뇨병, 혈관신생 결함, 심혈관 결함을 갖는 동물을 포함하여 다양한 유전적 배경의 동물로 번식될 수 있다. 상기 동물은 당업자에게 공지되어 있고, 예를 들어, 마우스 게놈 데이타베이스 (Mouse Genome Database) ([Blake JA, Richardson JE, Bult CJ, Kadin JA, Eppig JT, and the members of the Mouse Genome Database Group. 2003. MGD: The Mouse Genome Database. Nucleic Res 31: 193-195]; [Eppig JT,. Blake, JA, Burkhart DL, Goldsmith CW, Lutz CM, Smith CL. 2002. Corralling conditional mutations: a unified resource for mouse phenotypes. Genesis 32:63-65]) 또는 오크 리지 내셔널 래보래토리 돌연변이체 마우스 데이타베이스 (Oak Ridge National Laboratory mutant mouse database)에서 찾을 수 있다.
다른 실시태양에서, 적어도 하나의 대사 조절인자의 세포 및/또는 트랜스제닉 동물, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6의 적어도 하나를 과다발현하고/하거나 낙-인 및/또는 낙-아웃시킨 동물은 근육 성장, 혈관신생, 비만, 인슐린 감수성 및/또는 심혈관 기능에 영향을 끼치는 단백질을 확인하기 위한 분석에 사용된다.
본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6은 관심있는 특징에 대해 컴퓨터에 의해 또는 실험에 의해 분석될 수 있다. 한 실시태양에서, 본 발명의 대사 조절인자와 연관된 것으로 확인된 유전자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6과 연관된 유전자는 유전자를 분비형 인자로서 확인하는 특징, 즉, 추정 신호 서열의 보유 및 추정 트랜스멤브레인 도메인의 결핍에 대해 컴퓨터에 의해 스크리닝된다. 관심 있는 임의의 다른 도메인 또는 서열 특징, 예를 들어, 핵산 또는 아미노산 서열이 본 발명의 적어도 하나의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6의 적어도 하나를 표적으로 하는 치료 용도에 적절한 물질을 설계하는데 사용될 수 있다.
대사 조절인자에 대한 트랜스제닉 동물, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6을 과다발현하고/하거나 낙-인 및/또는 낙-아웃시킨 동물은 또한 물질을 근육 발달, 근육 성장, 비만, 인슐린 감수성 및 심혈관 기능에 대한 효능에 대해 시험하기 위한 분석에서 사용될 수 있다. 일부 실시태양에서, 분석은 시험 동물, 또는 대사 조절인자에 대한 트랜스제닉 동물 또는 상기 트랜스제닉 동물로부터의 샘플 또는 시료 (예를 들어, 생검)에 대해 수행한다. 일부 경우에, 동물을 희생하지 않고 시험 동물로부터 얻을 수 있는 샘플, 예를 들어 혈액에서 근육 성장, 비만, 인슐린 감수성 및 심혈관 기능의 마커를 측정하는 것이 유익할 것이다.
본 발명의 대사 조절인자의 조절된 발현을 허용하는 선택된 시스템을 함유하는 트랜스제닉 동물, 예를 들어 트랜스제닉 비-인간 동물이 생산될 수 있고, 예를 들어 당업자에게 공지되어 있는 Cre/Lox 유도가능 발현 시스템을 사용할 수 있다.
트랜스제닉 동물, 예를 들어, 무척추동물, 예를 들어 초파리, 및 척추동물, 예를 들어 포유동물, 예를 들어 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트는 트랜스젠을 함유하는 세포를 갖는 동물이고, 상기 트랜스젠은 동물 또는 동물의 선조에게 출생 전에, 예를 들어, 배아 단계에 도입되었다. 트랜스젠은 DNA, 예를 들어, 본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6 또는 그의 상동체 또는 변이체이고, 이는 그로부터 트랜스제닉 동물이 개발되는 세포의 핵 게놈 내로 통합된다. 트랜스젠은 동물의 생식선 내로의 혼입을 포함하여 동물 내의 모든 세포 내로 통합될 수 있다. 별법으로, 동물은 트랜스젠에 대해 키메라일 수 있다. 트랜스제닉 동물, 특히 마우스 또는 래트와 같은 동물을 생성하는 방법은 당업계에서 통상적인 방법이 되었고, 예를 들어 문헌 [Ausubel et al. (eds) "Current Protocols in Molecular Biology" John Wiley & Sons, Inc., in Hogan, B., Manipulating the Mouse Embryo, (Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1986)]과 미국 특허 5,614,396 5,487,992, 5,464,764, 5,387,742, 5,347,075, 5,298,422, 5,288,846, 5,221,778, 5,175,384, 5,175,383, 4,873,191, 4,870,009, 4,736,866에 기재되어 있고, 또한 문헌 ([Burke and Olson, Methods in Enzymology, 194:251-270, 1991]; [Capecchi, Science 244:1288-1292, 1989]; [Davies et al., Nucleic Acids Research, 20(11) 2693-2698, 1992]; [Dickinson et al., Human Molecular Genetics, 2(8):1299-1302, 1993]; [Duff and Lincoln, "Insertion of a pathogenic mutation into yeast artificial chromosome containing the human APP genes and expression in ES cells", Research Advances in Alzheimer's Disease and Related Disorders, 1995]; [Huxley et al., Genomics, 9:742-750 1991]; [Jakobovits et al., Nature, 362:255-261 1993]; [Lamb et al., Nature Genetics, 5: 22-29, 1993]; [Pearson and Choi, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 1993, 90:10578-82]; [Rothstein, Methods in Enzymology, 194:281-301, 1991]; [Schedl et al., Nature, 362: 258-261, 1993]; [Strauss et al., Science, 259:1904-1907, 1993]), WO 94/23049, WO93/14200, WO 94/06908 및 WO 94/28123에서도 또한 정보를 제공한다.
본 발명은 특정 동물에 제한되지 않는다. 다양한 인간 및 비-인간 동물이 고려된다. 예를 들어, 일부 실시태양에서, 설치류 (예를 들어, 마우스 또는 래트) 또는 영장류가 지방 대사에서 변경 및 화합물의 스크리닝을 위해 동물 모델로서 제공된다.
다른 실시태양에서, 본 발명은 본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6에 대한 트랜스제닉인 상업적으로 유용한 트랜스제닉 동물 (예를 들어, 가축, 예를 들어 돼지, 소 또는 양), 즉, 예를 들어 본 발명의 적어도 하나의 대사 조절인자를 과다발현하고/하거나 낙-인 및/또는 낙-아웃시킨 동물을 제공한다. 상기 동물로부터의 식육 (meat)은 바람직한 특성, 예를 들어 보다 낮은 지방 함량과 보다 높은 근육 함량을 가질 것으로 고려된다. 트랜스제닉 가축을 생성하기 위한 임의의 적합한 기술이 사용될 수 있다. 일부 바람직한 실시태양에서, 레트로바이러스 벡터 감염이 사용된다 (예를 들어, 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 6,080,912와 WO/0030437 참조).
다른 트랜스제닉 동물의 생산을 위해 유사한 방법이 사용된다. 트랜스제닉 선구자 (founder) 동물은 그의 게놈 내에 트랜스젠의 존재 및/또는 동물의 조직 또는 세포 내에 트랜스제닉 mRNA의 발현에 기초하여 확인할 수 있다. 이어서, 트랜스제닉 선구자 동물은 트랜스젠을 갖고 있는 추가의 동물을 번식시키기 위해 사용될 수 있다. 또한, 트랜스젠을 보유하는 트랜스제닉 동물은 다른 트랜스젠을 갖고 있는 다른 트랜스제닉 동물로 추가로 번식될 수 있다.
동물의 포유동물주를 생산하기 위해 동물 내로 발현가능한 본 발명의 대사 조절인자를 코딩하는 핵산, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6 또는 그의 단편 또는 상동체를 코딩하는 핵산을 도입하기 위해 당업계에 공지된 임의의 기술이 사용될 수 있다. 상기 기술은 전핵 미세주사 (미국 특허 4,873,191); 생식계열 내로 레트로바이러스 매개된 유전자 전달 [Van der Putten, et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82, 6148-6152]; 배아 줄기 세포에서의 유전자 표적화, 예를 들어 상동성 재조합 매개된 유전자 표적화 (Thompson, et al., 1989, Cell 56, 313-321] 및 미국 특허 5,614,396); 배아의 전기천공 [Lo, 1983, Mol. Cell. Biol. 3, 1803-1814]; 및 정자-매개된 유전자 전달 ([Nakanishi and Iritani, Mol. Reprod. Dev. 36:258-261 (1993)]; [Maione, Mol. Reprod. Dev. 59:406 (1998)]; [Lavitrano et al. Transplant. Proc. 29:3508-3509 (1997)]; [Lavitrano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:14230-5 (2002)]; [Lavitrano et al., Mol. Reprod. Dev. 64-284-91 (2003)])를 포함하고 이로 제한되지 않는다. 유사한 기술은 또한 미국 특허 6,376,743; 미국 특허 출원 공개 20010044937, 20020108132 및 20050229263에 기재되어 있다. 트랜스제닉 동물을 제조하는 다른 방법은 예를 들어, 전문이 본원에 참고로 포함되는 미국 특허 5,633,076 또는 6,080,912; 및 국제 특허 출원 공개 WO 97/47739, WO 99/37143, WO 00/75300, WO 00/56932 및 WO 00/08132에 개시되어 있다.
본 발명의 대사 조절인자를 발현하는 세포 및/또는 트랜스제닉 동물, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6을 발현하는 세포 및/또는 트랜스제닉 동물에서 단백질 발현의 검사가 더욱 중요하고, 상기 세포 및/또는 트랜스제닉 마우스는 혈관신생, 당 감수성, 지방량 및 비대 및 근육 재생에 대한 그들을 효과를 분석하기 위해 대사 조절인자의 유도 (일시적 또는 구성적) 시에 세포에서 발현되는 단백질의 검사에 유용하다. 비-트랜스제닉 세포 및/또는 동물의 조직 및 세포의 단백질 발현의 분석을 본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6에 대해 동물 및/또는 트랜스제닉 세포와 비교한다. 상기 방법은 다른 대사 조절인자를 확인하기 위해 유용하고, 또한 본 발명에서 대사 조절인자로서 사용하기 위해 포함된다.
근육 성장과 연관된 인자를 조정하는 물질을 스크리닝하기 위한 방법.
본 발명은 본 발명의 대사 조절인자를 조정하는 물질, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 insl6 또는 이들의 상동체를 조정하는 물질을 스크리닝하는 방법을 제공한다. 대사 조절인자를 발현하는 트랜스제닉 동물 모델 및/또는 세포가 또한 시험 동물에서, 또는 시험 동물로부터의 샘플 또는 시료 (예를 들어, 생검)에서 근육 발달, 근육 성장, 비만, 인슐린 감수성 및 심혈관 기능에 대한 효능에 대해 시험 화합물 (예를 들어, 약물 후보)을 분석하기 위해 사용될 수 있다. 일부 경우에, 동물을 희생하지 않고 시험 동물로부터 얻을 수 있는 샘플, 예를 들어 혈액 내에서 근육 성장, 비만, 인슐린 감수성 및 심혈관 기능의 마커를 측정하는 것이 유익할 것이다.
시험 화합물
본원에서 명세서 전반에 걸쳐 사용되는 용어 "물질" 또는 "화합물"은 임의의 유기 또는 무기 분자, 예를 들어 변형 및 비변형 핵산, 예를 들어 안티센스 핵산, RNAi, 예를 들어 siRNA 또는 shRNA, 펩티드, 펩티드 모방체, 수용체, 리간드 및 항체를 의미한다.
본 발명의 방법에서, 다양한 원료로부터의 다양한 시험제 및 물리적 조건이 본 발명의 대사 조절인자의 활성 및/또는 발현을 변경시키는 물질, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6을 조정하는 물질의 능력에 대해 스크리닝될 수 있다.
일반적으로, 대사 조절인자에 있어서 세포 또는 트랜스제닉 세포 및/또는 동물에 대한 물질의 효과를 비교하기 위해, 동물은 시험 화합물(들)의 부재 하에 비교 세포 또는 동물과 비교된다. 동물이 희생되는 경우에, 기저선은 임의의 시험제를 투여하지 않은 대조군 동물(들)로부터의 평균 또는 대표값에 기초하여 확립될 수 있다. 일단 상기 기저선이 결정되면, 시험제는 추가의 세포 또는 시험 동물에 투여될 수 있고, 여기서 기저선으로부터의 편차는 시험제가 본 발명의 대사 조절인자의 활성 및/또는 발현에 대해 효과를 나타냈음을 나타낸다.
시험제는 임의의 분자, 물질, 또는 세포 또는 시험 동물에게 투여될 수 있는 다른 물질일 수 있다. 일부 경우에, 물질은 세포 또는 동물 내에서 대사 조절인자의 활성을 실질적으로 저해하지 않는다. 적합한 시험제는 소분자, 생물학적 중합체, 예를 들어 폴리펩티드, 다당체, 폴리뉴클레오티드 등일 수 있다. 시험제는 일반적으로 1 ng/kg 내지 10 mg/kg, 보통 10 ㎍/kg 내지 1 mg/kg의 투여량으로 동물에게 투여될 것이다. 본 발명의 치료 방법에서 유용한 시험제는 대사 조절인자의 발현 및/또는 활성의 목적하는 조정을 갖는, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6 중 적어도 하나에 대해 목적하는 효과를 갖는 물질로서 확인될 수 있다.
일부 실시태양에서, 시험제는 다양성 라이브러리, 예를 들어 무작위 또는 조합적 펩티드 또는 비-펩티드 라이브러리로부터 유래될 수 있다. 많은 라이브러리, 예를 들어 화학적으로 합성된 라이브러리, 재조합 파지 디스플레이 라이브러리 및 시험관내 번역-기반 라이브러리가 공지되어 있다.
화학적으로 합성된 라이브러리의 예는 문헌 ([Fodor et al., Science 251:767-73 (1991)], [Houghten et al., Nature 354:84-86 (1991)], [Lam et al., Nature 354:82-84 (1991)], [Medynski, Bio/Technology 12:709-10 (1994)], [Gallop et al., J. Med. Chem. 37:1233-51 (1994)], [Ohlmeyer et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-26 (1993)], [Erb et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11422-26 (1994)], [Houghten et al., Biotechniques 13:412-21 (1992)], [Jayawickreme et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:1614-18 (1994)], [Salmon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:11708-12 (1993)], 국제 특허 출원 공개 WO 93/20242 및 [Brenner and Lerner, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:5381-83 (1992)])에 기재되어 있다.
파지 디스플레이 라이브러리의 예는 문헌 ([Scott and Smith, Science 249:386-90 (1990)], [Devlin et al., Science 249:404-06 (1990)], [Christian et al., J. Mol. Biol. 227:711-18 (1992)], [Lenstra, J. Immunol. Meth. 152:149-57 (1992)], [Kay et al., Gene 128:59-65 (1993)]) 및 국제 특허 출원 공개 WO 94/18318에 기재되어 있다.
시험관내 번역-기반 라이브러리는 국제 특허 출원 공개 WO 91/05058 및 문헌 [Mattheakis et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022-26 (1994)]에 기재된 것을 포함하고 이로 제한되지 않는다. 비펩티드 라이브러리의 예로서, 벤조디아제핀 라이브러리 (예를 들어, 문헌 [Bunin et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:4708-12 (1994)] 참조)가 사용을 위해 채용될 수 있다. 펩티드 라이브러리 (예를 들어, 문헌 [Simon et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:9367-71 (1992)] 참조)가 또한 사용될 수 있다. 화학적으로 전환된 조합 라이브러리를 생성하기 위해 펩티드 내의 아미드 관능기가 과메틸화된, 사용될 수 있는 라이브러리의 다른 예는 문헌 [Ostresh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:11138-42 (1994)]에 기재되어 있다.
하기 예는 단지 본 발명의 다양한 측면의 예시로서 제공되고, 어떠한 방식으로도 본 발명을 제한하는 것으로 해석되어서는 안된다.
스크리닝될 물질은 자연 발생 또는 합성 분자일 수 있다. 스크리닝될 물질은 또한 천연 공급원, 예를 들어 해양 미생물, 조류, 식물 및 진균으로부터 얻을 수 있다. 시험제는 또한 광물 또는 올리고 물질일 수 있다. 별법으로, 시험제는 펩티드 또는 소분자를 포함하는 물질의 조합 라이브러리, 또는 예를 들어, 화학, 제약, 환경, 농업, 해양, 화장품, 약품 및 생명공학 산업에 의해 공업에서 합성된 화학 물질의 기존 레퍼토리로부터 얻을 수 있다. 시험제는 예를 들어 약품, 치료제, 농업 또는 공업 물질, 환경 오염물질, 화장품, 약물, 유기 및 무기 물질, 지질, 당코르티코이드, 항생제, 펩티드, 단백질, 당, 탄수화물, 키메라 분자 및 이들의 조합을 포함할 수 있다.
조합 라이브러리는 단계식으로 합성될 수 있는 많은 종류의 물질에 대해 생산될 수 있다. 그러한 물질은 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 베타-턴 (turn) 모방체, 다당체, 인지질, 호르몬, 프로스타글란딘, 스테로이드, 방향족 물질, 헤테로환 물질, 벤조디아제핀, 올리고머성 N-치환 글라이신 및 올리고카르바메이트를 포함한다. 본 발명의 방법에서, 바람직한 시험 물질은 소분자, 핵산 및 변형 핵산, 펩티드, 펩티드 모방체, 단백질, 당단백질, 탄수화물, 지질 또는 당지질이다. 바람직하게는, 핵산은 DNA 또는 RNA이다.
물질의 큰 조합 라이브러리는 각각 그 전문이 모든 목적으로 본원에 참고로 포함된 WO 95/12608 (아피맥스 (Affymax)), WO 93/06121 (아피맥스), WO 94/08051 (콜럼비아 유니버시티 (Columbia University), WO 95/35503 (파마코페이아 (Pharmacopeia)) 및 WO 95/30642 (스크립스 (Scripps))에 기재된 코딩된 합성 라이브러리 (ESL) 방법에 의해 작성할 수 있다. 펩티드 라이브러리는 또한 파지 디스플레이 방법 (예를 들어, WO 91/18980 (델빈 (Devlin)) 참조)에 의해 생성될 수 있다. 스크리닝될 물질은 또한 관영 또는 사설 공급원, 예를 들어, DIVERSet E 라이브러리 (16,320종의 물질) (켐브릿지 코퍼레이션 ChemBridge Corporation, 미국 캘리포니아주 샌디에고)), 미국 국립 암 협회 (NCI)의 내츄럴 프러덕트 레포지터리 (Natural Product Repository, 미국 매릴랜드주 베데스다), NCI 오픈 신테틱 컴파운드 컬렉션 (Open Synthetic Compound Collection, 미국 매릴랜드주 베테스다), NCI의 디벨롭멘탈 테라퓨틱스 프로그램 (Developmental Therapeutics Program) 등으로부터 얻을 수 있다.
추가로, 천연 및 합성적으로 생산된 라이브러리 및 물질은 통상적인 화학적, 물리적 및 생화학적 수단을 통해 쉽게 변형된다. 또한, 공지의 약물학적 물질은 직접적 또는 무작위 화학적 변형, 예를 들어 아실화, 알킬화, 에스테르화, 아미드화 등으로 변형시킬 수 있다.
물질 제형은 편리하게 단위 투여 형태로, 예를 들어 정제 및 지속 방출 캡슐로 및 리포좀 내에서 제공될 수 있고, 약학 분야에 잘 공지된 임의의 방법에 의해 제조할 수 있다 (예를 들어, 문헌 [Remington: The Science and Practice of Pharmacy by Alfonso R. Gennaro (Ed.) 20th edition, December 15, 2000, Lippincott, Williams & Wilkins]; ISBN: 0683306472 참조).
본 발명의 대사 조절인자의 전사 및/또는 단백질 발현을 조정하는데 잠재적인 유효성에 대해 물질, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6을 조정하는 물질을 스크리닝하는 것은 당업자에게 잘 공지된 다양한 수단으로 달성할 수 있다.
상기 설명된 물질을 본 발명의 대사 조절인자, 예를 들어, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6의 전사 및/또는 발현을 조정하는 능력에 대해 스크리닝하기 위해, 시험제는 시험 대상에게 투여되어야 한다. 하나의 실시태양에서, 시험 대상은 근육, 예를 들어, 골격근으로부터 유래된 세포로 이루어지는 세포의 배양액이다. 근육으로부터 유래된 세포는 정상 또는 종양성 근육으로부터의 일차 세포 배양액 또는 불멸화 세포주일 수 있다. 다른 실시태양에서, 시험 대상은 근육, 예를 들어 골격근이 있는 동물이다. 근육이 있는 동물은 과일 파리, 개구리, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트, 토끼, 비-인간 영장류 및 인간일 수 있고 이로 제한되지 않는다. 근육 유래된 세포는 과일 파리, 개구리, 설치류, 예를 들어 마우스 또는 래트, 토끼, 비-인간 영장류 및 인간을 포함하고 이로 제한되지 않는 동물의 근육으로부터 얻을 수 있다.
시험제는 예를 들어, 물질을 세포가 유지되는 배지 내로 희석시키고, 시험제를 근육이 있는 동물의 음식 또는 액체와 혼합하고, 물질을 제약상 허용되는 담체 내에서 근육이 있는 동물 상에 국소 투여함으로써, 시험제를 흡수시킨 3차원 기질, 예를 들어 서방형 비드 등을 사용하고 상기 기질을 동물 내로 매몰시킴으로써, 물질을 근육 내 투여함으로써, 물질을 비경구 투여함으로써 투여될 수 있다.
다양한 다른 시약이 또한 혼합물에 포함될 수 있다. 이들은 최적의 단백질-단백질 및/또는 단백질-핵산 결합을 용이하게 하고/하거나 비-특이적 또는 배경 상호작용을 감소시키기 위해서 등으로 사용될 수 있는 시약, 예를 들어 염, 버퍼, 중성 단백질, 예를 들어 알부민, 세제 등을 포함한다. 또한, 달리 분석의 효능을 개선하는 시약, 예를 들어 프로테아제 억제제, 뉴클레아제 억제제, 항미생물 물질 등이 사용될 수 있다.
표현 "제약상 허용되는 담체"는 물질과 동시-투여될 수 있고, 활성 성분이 신경계의 질병(들)을 예방, 개선, 정지 또는 제거하는 그의 의도된 기능을 수행하도록 하는 물질을 포함하는 것으로 의도된다. 상기 담체의 예는 용매, 분산 매질, 어쥬번트, 지연제 등을 포함한다. 제약 활성 물질에 대한 상기 매질 및 물질의 사용은 당업계에 잘 공지되어 있다. 물질과 상용성인 임의의 통상적인 매질 및 물질이 본 발명에서 사용될 수 있다.
물질은 선택된 투여 경로에 따라 제제화될 수 있다. 젤라틴, 향미제, 또는 코팅 물질의 첨가는 경구 용도에 사용될 수 있다. 일반적으로, 용액 또는 에멀젼을 위해, 담체는 수성 또는 알콜/수성 용액, 에멀젼 또는 현탁액, 예를 들어 염수 및 완충된 매질을 포함할 수 있다. 비경구 비히클은 특히 염화나트륨, 염화칼륨을 포함할 수 있다. 또한, 정맥내 비히클은 특히 유체 및 영양 보충제, 전해질 보충제를 포함할 수 있다.
방부제 및 다른 첨가제가 또한 존재할 수 있다. 예를 들어, 항미생물제, 항산화제, 킬레이팅제 및 불활성 기체가 첨가될 수 있다 (일반적으로 문헌 [Remington's Pharmaceutical Sciences, 16th Edition, Mack, 1980] 참조).
본 발명의 대사 조절인자의 전사 또는 단백질 발현을 증가시키는 물질, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6의 적어도 하나를 조정하는 물질에 대해 스크리닝하는 것은 관심있는 대사 조절인자의 유전자 전사의 측정 및/또는 단백질 발현의 측정을 이용하여 달성할 수 있다. 유전자 전사의 측정은 근육 성장과 연관된 인자의 유전자 전사의 직접 측정 또는 리포터 유전자의 측정을 포함할 수 있다. 이와 유사하게, 단백질 발현의 측정은 근육 성장과 연관된 인자의 단백질 발현의 측정 또는 리포터 유전자의 측정을 포함할 수 있다.
상기한 바와 같이, 스크리닝 분석은 일반적으로 시험관 내에서, 예를 들어, 배양된 세포에서, 생물학적 샘플, 예를 들어, 근육, 예를 들어, 골격근 또는 그의 분획 내에서 수행된다. 쉽게 설명하기 위해, 세포 배양액, 생물학적 샘플 및 분획을 이하에서 "샘플"로서 언급한다. 샘플은 일반적으로 동물 (예를 들어, 상기 언급한 임의의 연구 동물), 바람직하게는 포유동물, 보다 바람직하게는 인간으로부터 유래된다.
리포터 유전자 분석 (Tamura, et al., Transcription Factor Research Method, Yodosha, 1993)은 마커로서 리포터 유전자의 발현을 이용하여 유전자 발현의 조절을 분석하기 위한 방법이다.
근육 성장과 연관된 인자의 유전자 발현의 검출 및 정량은 근육 성장과 연관된 인자의 확인과 관련하여 상기 설명된 임의의 방법을 통해 수행한다. 당업자에게 공지된 임의의 유전자 전사 및 폴리펩티드 또는 단백질 발현 분석이 근육 성장과 연관된 인자의 전사 및/또는 발현을 검출하기 위해 사용될 수 있다. 별법으로, 리포터 유전자가 사용될 때, 근육 성장과 연관된 인자 대신에 리포터 유전자의 전사 및/또는 발현이 또한 증폭 기반, 혼성화 기반 및/또는 폴리펩티드 기반 분석을 이용하여 검출될 수 있다.
적합한 증폭 기반 방법은 중합효소 연쇄 반응 (PCR); 역전사 PCR (RT-PCR); 리가제 연쇄 반응 (LCR) (문헌 [Wu and Wallace (1989) Genomics 4: 560], [Landegren et al. (1988) Science 241: 1077] 및 [Barringer et al. (1990) Gene 89: 117] 참조); 전사 증폭 (Kwoh et al. (1989) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86: 1173), 자가유지 (self-sustained) 서열 복제 (Guatelli et al. (1990) Proc. Nat. Acad. Sci. USA 87: 1874); 도트 (dot) PCR 및 링커 어댑터 PCR 등을 포함하고 이로 제한되지 않는다.
핵산 혼성화 기술, 예를 들어, 노던 블롯을 사용하여 폴리뉴클레오티드를 검출 및/또는 정량하는 방법은 당업자에게 알려져 있다 (문헌 [Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2d Ed. vol. 1-3, Cold Spring Harbor Press, NY, 1989] 참조). 혼성화 기술은 일반적으로 문헌 ([Hames and Higgins (1985) Nucleic Acid Hybridization, A Practical Approach, IRL Press]; [Gall and Pardue (1969) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63: 378-383]; 및 [John et al. (1969) Nature 223: 582-587])에 기재되어 있다. 혼성화 조건을 최적화하는 방법은 예를 들어 문헌 [Tijssen (1993) Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology, Vol. 24: Hybridization With Nucleic Acid Probes, Elsevier, N.Y.]에 기재되어 있다.
대사 조절인자의 폴리펩티드는 당업자에게 잘 공지된 임의의 많은 방법에 의해 검출되고 정량화될 수 있다. 단백질을 검출하기 위해 적합한 분석적 생화학적 방법의 예는 전기영동, 모세혈관 전기영동, 고성능 액체 크로마토그래피 (HPLC), 박층 크로마토그래피 (TLC), 과다확산 (hyperdiffusion) 크로마토그래피 등, 또는 다양한 면역학적 방법, 예를 들어 유체 또는 겔 침전소 반응, 면역확산 (단일 또는 이중), 면역조직화학, 친화도 크로마토그래피, 면역전기영동, 방사면역검정 (RIA), 효소 결합 면역 측정법 (ELISA), 면역형광 분석, 웨스턴 블롯팅 등을 포함한다.
근육 성장과 연관된 인자에 대한 항체 (바람직하게는 항-포유동물; 보다 바람직하게는 항-인간)는 당업자에게 잘 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 근육 성장과 연관된 인자에 대한 항체의 단편은 당업계에 잘 공지된 방법에 따라 항체의 절단에 의해 생산할 수 있다. 예를 들어, 면역학상 활성 F(ab') 및 F(ab')2 단편은 항체를 펩신과 같은 효소로 처리함으로써 생성할 수 있다.
결합 파트너 확인
본 발명의 대사 조절인자를 조정하는 물질을 확인하기 위한 하나의 방법은 대사 조절인자에 대한 결합 파트너를 확인하는 것이다. 본 발명의 대사 조절인자에 결합하여 그의 활성을 조절하는 상기 단백질, 예를 들어 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6의 결합 파트너의 확인은 예를 들어, 라이브러리를 제공하고, 라이브러리로부터 대사 조절인자 항원에 결합하는 단백질을 코딩하는 하나 이상의 멤버를 선택하는 것을 포함한다. 선택은 많은 방식으로 수행할 수 있다. 예를 들어, 라이브러리는 디스플레이 라이브러리일 수 있다. 대사 조절인자는 태깅 (tagging)되고 재조합 발현될 수 있다. 대사 조절인자는 정제되고 지지체, 예를 들어, 친화도 비드, 또는 상자성 비드 또는 다른 자성 반응 입자에 부착된다. 대사 조절인자는 또한 세포의 표면 상에 발현될 수 있다. 세포에 특이적으로 결합하는 디스플레이 라이브러리의 멤버가 선택될 수 있다.
한 실시태양에서, 디스플레이 라이브러리는 본 발명의 대사 조절인자에 결합하는 단백질, MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 및/또는 Insl6에 결합하는 단백질을 확인하기 위해 사용된다. 디스플레이 라이브러리는 실체들의 집합체이고; 각각의 실체는 접근가능한 단백질 성분 및 단백질 성분을 코딩하거나 확인하는 회복가능한 성분 (예를 들어, 핵산)을 포함한다. 단백질 성분은 임의의 길이, 예를 들어 3개의 아미노산 내지 300개 초과의 아미노산일 수 있다. 선택 시에, 라이브러리의 각각의 멤버의 단백질 성분은 대사 조절인자 단백질로 프로빙되고, 단백질 성분이 대사 조절인자에 결합되면, 디스플레이 라이브러리 멤버가 예를 들어 지지체 상의 보유에 의해 확인된다. 디스플레이 라이브러리는 본 발명의 트랜스제닉 동물로부터 유래하는 조직으로부터 유래된 cDNA로부터 작성될 수 있고, 여기서 접근가능한 단백질 성분은 cDNA에 의해 코딩된다. 디스플레이 라이브러리 내에 함유된 cDNA는 cDNA 삭감 또는 상기 약술된 다른 cDNA 확인 절차의 결과일 수 있다. 따라서, cDNA는 비-유도된 트랜스제닉 동물에 비교한 유도된 트랜스제닉 동물의 결과, 또는 유전적 배경이 상이한 유도된 트랜스제닉 동물의 비교 또는 본 발명의 방법에 관련한 유전자 발현의 임의의 다른 비교의 결과일 수 있다.
보유된 디스플레이 라이브러리 멤버를 지지체로부터 회수하고 분석한다. 분석은 증폭 및 유사한 또는 유사하지 않은 조건 하에 후속적인 선택을 포함할 수 있다. 예를 들어, 양성 및 음성 선택이 교대될 수 있다. 분석은 또한 단백질 성분의 아미노산 서열의 결정 및 상세한 특성화를 위한 단백질 성분의 정제를 포함할 수 있다.
디스플레이 라이브러리를 위해 다양한 포맷이 사용될 수 있다. 그 예는 다음을 포함한다.
파지 디스플레이. 하나의 포맷은 바이러스, 특히 박테리오파지를 사용한다. 상기 포맷을 "파지 디스플레이"로 부른다. 단백질 성분은 대개 박테리오파지 코트 단백질에 공유 연결된다. 연결은 코트 단백질에 융합된 단백질 성분을 코딩하는 핵산의 번역으로부터 생성된다. 연결은 유연한 펩티드 링커, 프로테아제 부위, 또는 정지 코돈의 억제의 결과로서 포함된 아미노산을 포함할 수 있다. 파지 디스플레이는 예를 들어, 미국 특허 5,223,409 (라드너 (Ladner) 등); 문헌 [Smith (1985) Science 228:1315-1317]; WO 92/18619; WO 91/17271; WO 92/20791; WO 92/15679; WO 93/01288; WO 92/01047; WO 92/09690; WO 90/02809; [de Haard et al. (1999) J. Biol. Chem 274: 18218-30]; [Hoogenboom et al. (1998) Immunotechnology 4: 1-20]; [Hoogenboom et al. (2000) Immunol Today 2:371-8]; [Fuchs et al. (1991) Bio/Technology 9:1370-1372]; [Hay et al. (1992) Hum Antibod Hybridomas 3:81-85]; [Huse et al. (1989) Science 246:1275-1281]; [Griffiths et al. (1993) EMBO J. 12:725-734]; [Hawkins et al. (1992) J Mol Biol 226:889-896]; [Clackson et al. (1991) Nature 352:624-628]; [Gram et al. (1992) PNAS 89:3576-3580]; [Garrard et al. (1991) Bio/Technology 9:1373-1377]; [Rebar et al. (1996) Methods Enzymol. 267:129-49]; [Hoogenboom et al. (1991) Nuc Acid Res 19:4133-4137]; 및 [Barbas et al. (1991) PNAS 88:7978-7982]에 기재되어 있다.
파지 디스플레이 시스템은 필라멘트형 파지 (파지 fl, fd 및 M13)뿐만 아니라 다른 박테리오파지 (예를 들어, T7 박테리오파지 및 람도이드 파지; 예를 들어, 문헌 ([Santini (1998) J. Mol. Biol. 282:125-135]; [Rosenberg et al. (1996) Innovations 6:1-6]; [Houshmet al. (1999) Anal Biochem 268:363-370] 참조)에 대해 개발되었다. 필라멘트형 파지 디스플레이 시스템에서는 대개 마이너 (minor) 코트 단백질, 예를 들어 유전자 III 단백질 및 유전자 VIII 단백질, 메이저 (major) 코트 단백질에 대한 융합체를 사용하지만, 다른 코트 단백질, 예를 들어 유전자 VI 단백질, 유전자 VII 단백질, 유전자 IX 단백질 또는 그의 도메인에 대한 융합체가 또한 사용될 수 있다 (예를 들어 WO 00/71694 참조). 한 실시태양에서, 융합체는 유전자 III 단백질의 도메인, 예를 들어, 앵커 (anchor) 도메인 또는 "스텀프 (stump)"에 대한 것이다 (예를 들어, 유전자 III 단백질 앵커 도메인의 설명에 대해서는 미국 특허 5,658,727 참조). 디스플레이되는 단백질을 비-펩티드 연결, 예를 들어, 비-공유 결합 또는 비-펩티드 공유 결합을 사용하여 코트에 물리적으로 회합시키는 것이 또한 가능하다. 예를 들어, 디술파이드 결합 및/또는 c-fos 및 c-jun 코일드-코일이 물리적 회합에 사용될 수 있다 (예를 들어 문헌 [Crameri et al. (1993) Gene 137:69] 및 WO 01/05950 참조).
단백질 성분을 디스플레이하는 박테리오파지는 표준 파지 제조 방법, 예를 들어 성장 배지로부터 PEG 침전을 이용하여 성장 및 회수할 수 있다. 개별 디스플레이 파지의 선택 후에, 선택된 단백질 성분을 코딩하는 핵산은 세포를 선택된 파지를 사용하여 감염시킴으로써 제조할 수 있다. 개별 콜로니 또는 플라크를 집어, 핵산을 단리하고 서열결정할 수 있다.
세포-기반 디스플레이. 또 다른 포맷에서, 라이브러리는 세포-디스플레이 라이브러리이다. 단백질은 세포, 예를 들어 진핵 또는 원핵 세포의 표면 상에 디스플레이된다. 예시적인 원핵 세포는 이. 콜라이 (E. coli) 세포, 비. 섭틸리스 (B. subtilis) 세포 및 포자를 포함한다 (예를 들어, 문헌 [Lu et al. (1995) Biotechnology 13:366] 참조). 예시적인 진핵 세포는 효모 (예를 들어, 사카로마이세스 세레비지애 (Saccharomyces cerevisiae), 시조사카로마이세스 폼베 (Schizosaccharomyces pombe), 한세울라 (Hanseula), 또는 피키아 파스토리스 (Pichia pastoris))를 포함한다. 효모 표면 디스플레이는 예를 들어, 문헌 [Boder and Wittrup (1997) Nat. Biotechnol. 15:553-557] 및 WO 03/029456에 기재되어 있고, 여기서는 면역글로불린 단백질, 예를 들어 Fab 단편을 디스플레이하기 위해 사용될 수 있는 효모 디스플레이 시스템 및 중쇄 및 경쇄의 조합을 생성하기 위한 접합 (mating)의 용도를 설명한다.
한 실시태양에서, 다양한 핵산 서열이 효모 디스플레이를 위해 벡터 내로 클로닝된다. 클로닝은 다양화된 서열을 도메인 (또는 완전) 효모 세포 표면 단백질, 예를 들어, Aga2, Aga1, Flo1 또는 Gas1과 연결시킨다. 상기 단백질의 도메인은 다양화된 핵산 서열에 의해 코딩되는 폴리펩티드를 트랜스멤브레인 도메인에 의해 (예를 들어, Flo1) 또는 인지질 이중층에 공유 연결에 의해 (예를 들어, Gas1) 고정시킬 수 있다. 벡터는 세포 표면 상에 2개의 폴리펩티드 사슬을 발현하는 형상일 수 있어서, 사슬 중 하나는 효모 세포 표면 단백질에 연결된다. 예를 들어, 2개의 사슬은 면역글로불린 사슬일 수 있다.
리보솜 디스플레이. RNA, 및 RNA에 의해 코딩되는 폴리펩티드는 RNA를 번역하고 신생 폴리펩티드가 여전히 부착되어 있는 안정화 리보솜에 의해 물리적으로 회합될 수 있다. 일반적으로, 높은 2가 Mg2 + 농도 및 낮은 온도가 사용된다 (예를 들어, 문헌 ([Mattheakis et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:9022]; [Hanes et al. (2000) Nat Biotechnol. 18:1287-92]; [Hanes et al. (2000) Methods Enzymol. 328:404-30]; 및 [Schaffitzel et al. (1999) J Immunol Methods. 231(1-2):119-35] 참조).
폴리펩티드-핵산 융합체. 다른 포맷에서는 폴리펩티드-핵산 융합체를 사용한다. 폴리펩티드-핵산 융합체는 예를 들어, 문헌 [Roberts and Szostak (1997) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 94:12297-12302] 및 미국 특허 6,207,446에 기재된 바와 같이 공유 부착된 푸로마이신기를 포함하는 mRNA의 시험관내 번역에 의해 생성될 수 있다. 이어서, mRNA는 DNA로 역전사되고 폴리펩티드에 가교결합될 수 있다.
다른 디스플레이 포맷. 또 다른 디스플레이 포맷은 비-생물학적 디스플레이이고, 여기서 단백질 성분은 폴리펩티드를 확인하는 비-핵산 태그에 부착된다. 예를 들어, 태그는 폴리펩티드를 디스플레이하는 비드에 부착된 화학적 태그 또는 고주파 태그일 수 있다 (예를 들어, 미국 특허 5,874,214 참조).
ELISA. 디스플레이 라이브러리에 의해 코딩된 단백질은 또한 ELISA 분석을 이용하여 결합 특성에 대해 스크리닝될 수 있다. 예를 들어, 각각의 단백질은 그의 저면 표면에 표적, 예를 들어 제한량의 표적으로 코팅된 미세적정 플레이트에 접촉된다. 플레이트를 버퍼로 세척하여 비-특이적으로 결합된 폴리펩티드를 제거한다. 이어서, 플레이트에 결합된 단백질의 양은 플레이트를 폴리펩티드를 인식할 수 있는 항체, 예를 들어, 폴리펩티드의 불변 부분 또는 태그로 프로빙함으로써 결정된다. 항체는 효소, 예를 들어 알칼리성 포스파타제에 연결되고, 이는 적절한 기질이 제공될 때 발색 산물을 생산한다. 단백질은 세포로부터 정제되거나 디스플레이 라이브러리 포맷으로, 예를 들어, 필라멘트형 박테리오파지 코트에 대한 융합체로서 분석될 수 있다. 별법으로, 표적 분자, 예를 들어, 대사 조절인자 Akt1, 예를 들어, Akt1의 구성적 활성 이소형을 발현하는 세포 (예를 들어, 살아있는 또는 고정된)가 미세적정 플레이트에 플레이팅되고, 디스플레이 라이브러리 내에 존재하거나 디스플레이 라이브러리로부터의 선택에 의해 얻어진 펩티드/항체의 친화도를 시험하기 위해 사용될 수 있다.
ELISA 분석의 다른 버전에서, 다양성 표준 라이브러리의 각각의 폴리펩티드가 미세적정 플레이트의 상이한 웰을 코팅하기 위해 사용된다. 이어서, ELISA는 각각의 웰을 조사하기 위해 불변 표적 분자를 사용하여 진행한다.
균일 결합 분석. 후보 단백질과 표적의 결합 상호작용은 균일 분석을 사용하여 분석할 수 있고, 즉, 분석의 모든 성분이 첨가된 후, 추가의 유체 조작이 요구되지 않는다. 예를 들어, 형광 공명 에너지 전달 (FRET)을 균일 분석으로서 사용할 수 있다 (예를 들어 미국 특허 5,631,169 (Lakowicz 등); 미국 특허 4,868,103 (Stavrianopoulos) 참조). 제1 분자 (예를 들어, 분획에서 확인된 분자) 상의 형광단 표지는 제2 분자가 제1 분자에 근접하면 그의 방출된 형광 에너지가 제2 분자 (예를 들어, 표적) 상의 형광 표지에 의해 흡수될 수 있도록 선택된다. 제2 분자 상의 형광 표지는 전달된 에너지를 흡수할 때 형광을 낸다. 표지들 사이의 에너지 전달의 효율은 분자를 분리시키는 거리에 관련되므로, 분자들 사이의 공간적 관계가 평가될 수 있다. 분자들 사이에 결합이 일어나는 상황에서는, 분석에서 '억셉터 (acceptor)' 분자 표지의 형광 방출이 최대일 것이다. FRET에 의한 모니터링을 위하여 설정되는 결합 사건은 당업계에 잘 공지된 표준 형광 검출 수단을 통해 편리하게 측정할 수 있다 (예를 들어, 형광분석기를 사용하여). 제1 또는 제2 결합 분자의 양을 적정함으로써, 평형 결합 상수를 추정하기 위해 결합 곡선을 생성할 수 있다.
균일 분석의 다른 예는 Alpha Screen (패카드 바이오사이언스 (Packard Bioscience, 미국 커넥티컷주 메리덴)이다. Alpha Screen은 2개의 표지된 비드를 사용한다. 하나의 비드는 레이저에 의해 여기될 때 일중항 산소를 생성한다. 다른 비드는 일중항 산소가 제1 비드로부터 확산하여 그와 부딪칠 때 빛 신호를 생성한다. 신호는 2개의 비드가 근접한 경우에만 생성된다. 하나의 비드는 디스플레이 라이브러리 멤버에 부착되고, 다른 비드는 표적에 부착될 수 있다. 결합의 정도를 결정하기 위해 신호를 측정한다.
후보 단백질이 디스플레이 라이브러리 비히클, 예를 들어, 박테리오파지에 부착되어 있는 동안 또는 후보 단백질을 유리 분자로서 사용하여 균일 분석을 수행할 수 있다.
표면 플라즈몬 공명 (SPR). 디스플레이 라이브러리로부터 단리된 분자 및 표적의 결합 상호작용은 SPR을 이용하여 분석할 수 있다. SPR 또는 생체분자 상호작용 분석 (BIA)는 임의의 상호작용체를 표지하지 않으면서 생물특이적 상호작용을 실시간으로 검출한다. BIA 칩의 결합 표면에서 질량의 변화 (결합 사건의 표시)는 표면 부근에서 빛의 굴절률을 변경시킨다 (표면 플라즈몬 공명 (SPR)의 광학 현상). 굴절성의 변화는 검출가능한 신호를 생성하고, 이는 생물학적 분자 사이의 실시간 반응의 표시로서 측정된다. SPR을 사용하는 방법은 예를 들어, 미국 특허 5,641,640; 문헌 ([Raether (1988) Surface Plasmons Springer Verlag; Sjolander and Urbaniczky (1991) Anal. Chem. 63:2338-2345]; [Szabo et al. (1995) Curr. Opin. Struct. Biol. 5:699-705]) 및 비아코어 인터내서날 에이비 (BIAcore International AB, 스웨덴 웁살라)에서 제공되는 온-라인 정보에 기재되어 있다.
SPR로부터의 정보를 사용하여 표적에 대한 생체분자의 결합에 대해 평형 해리 상수 (Kd)의 정확한 정량적 측정, 및 운동학 파라미터, 예를 들어 Kon 및 Koff를 제공할 수 있다. 상기 데이타베이스는 상이한 생체분자를 비교하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 표적에 대해 높은 친화도를 갖거나 느린 Koff를 갖는 개체를 확인하기 위해, 다양성 스트랜드의 라이브러리로부터 선택된 핵산에 의해 코딩되는 단백질이 비교될 수 있다. 상기 정보는 또한 구조-활성 상관관계 (SAR)를 개발하기 위해 사용될 수 있다. 예를 들어, 모 단백질의 돌연변이된 버전의 운동학 및 평형 결합 파라미터를 모 단백질의 파라미터에 비교할 수 있다. 특정 결합 파라미터, 예를 들어, 높은 친화도 및 느린 Koff와 상관관계가 있는, 주어진 위치에서의 변이체 아미노산이 확인될 수 있다. 상기 정보는 구조적 모델링 (예를 들어, 상동성 모델링, 에너지 최소화, 또는 결정학 또는 NMR에 의한 구조 결정을 사용)과 조합될 수 있다. 그 결과로서, 단백질과 그의 표적 사이의 물리적 상호작용에 대한 이해가 체계화되고 다른 디자인 과정을 지도하기 위해 사용될 수 있다.
단백질 어레이. 디스플레이 라이브러리로부터 확인된 폴리펩티드는 고체 지지체, 예를 들어, 비드 또는 어레이 상에 고정될 수 있다. 단백질 어레이에 대해, 각각의 폴리펩티드는 지지체 상에 특유한 어드레스 (address)에서 고정된다. 일반적으로, 어드레스는 2차원 어드레스이다 (예를 들어, 문헌 ([MacBeath et al., 2000, Science, 289:1760-1763] 및 [Bertone et al. 2005, FEBS Journal, 272:5400-5411]) 참조).
세포성 분석. 후보 폴리펩티드는 라이브러리를 숙주 세포 내로 형질전환시킴으로써 라이브러리로부터 선택할 수 있다; 라이브러리는 디스플레이 라이브러리로부터 이전에 확인되었을 수 있다. 예를 들어, 라이브러리는 폴리펩티드를 코딩하고 발현을 지정하는 세그먼트를 포함하는 벡터 핵산 서열을 포함할 수 있어서, 예를 들어, 폴리펩티드는 세포 내에서 생산되거나, 세포로부터 분비되거나, 세포 표면에 부착된다. 세포는 예를 들어 세포성 표현형 또는 세포-매개된 활성의 변화에 의해 검출될 때, Akt1에 결합하는 폴리펩티드에 대해 스크리닝되거나 선택될 수 있다. 예를 들어, Akt1에 결합하는 항체의 경우에, 활성은 세포 침입에 대한 시험관내 분석일 수 있다. 한 실시태양에서, 항체는 침입 포유동물 세포, 예를 들어, 암종 세포, 예를 들어, JEG-3 (융모막암종) 세포에 접촉된다. 매트릭스를 침입하는 세포의 능력이 평가된다. 매트릭스는 인공 매트릭스, 예를 들어, 마트리겔 (Matrigel), 젤라틴 등, 또는 천연 매트릭스, 예를 들어 조직 샘플의 세포외 매트릭스, 또는 이들의 조합물일 수 있다. 예를 들어, 매트릭스는 세포의 층에 의해 시험관 내에서 생산될 수 있다.
본원에 제시된 실시예는 질병의 치료를 위한 MSP3, MP5 및/또는 Insl6 및 그의 유도체 및/또는 혈관신생, 근육 퇴행, 근 위축, 비만, 당불내성 및/또는 인슐린 불감증과 연관된 질병 또는 질환의 치료를 위한 그의 작용제 또는 길항제의 용도에 관한 것이다. MSP3, MP5 및/또는 Insl6 및 그의 유도체, 또는 작용제 및/또는 길항제는 단독으로 또는 임의의 조합으로 함께, 및 다른 치료제와 함께 사용될 수 있다. 공개문헌 및 상기 공개문헌에 인용된 참조문헌의 개시내용은 본 발명이 속하 는 기술 상태를 보다 충분히 설명하기 위해 전문이 본원에 참고로 포함된다. 다음 실시예는 본 발명을 청구의 범위로 제한하는 것을 의도하지 않고, 대신 특정 실시태양의 예시인 것으로 의도된다. 당업자가 행하는 예시된 방법의 임의의 변형은 본 발명의 범위 내에 있는 것으로 의도된다.
방법
골격근-특이적 조건화 Akt1 TG 마우스. MCK-rtTA TG 마우스 (Grill et al., 2003)를 Tet-myrAkt1 TG 마우스 (Shiojima et al., 2005)와 교배하여 DTG 마우스를 생성하였다. Akt1 트랜스젠 발현을 위해 DTG 마우스를 음용수 중의 DOX (0.5 mg/ml)로 처리하였고, 트랜스젠 발현을 억제하기 위해 DOX 물을 제거하였다. MCK-rtTA 단일 TG 한배 새끼를 대조군으로서 사용하고, DTG 마우스와 동일한 방식으로 DOX로 처리하였다.
동물 관리 및 식이 처리. 연구 프로토콜은 보스턴 대학의 동물 실험 위원회 (Institutional Animal Care and Use Committee at Boston University)에서 승인받았다. 마우스를 24℃에서 고정된 12-h 주야 사이클로 수용하였다. 마우스에게 정상 사료 식이 또는 고지방/수크로스 식이 (HF 식이: 식이 F1850, BIO-SERV) (Harte et al., 1999)를 지시된 대로 급식하였다. 개별적으로 수용한 마우스에서 음식 소비 및 체중을 매일 모니터링하였다.
생리학적 측정. O2 소비, CO2 방출 속도, 및 보행 활동 수준을 4-챔버 Oxymax 시스템 (콜럼부스 인스트루먼츠 (Columbus Instruments))을 사용하여 이전 에 설명된 바와 같이 (Yu et al., 2000) 챔버 당 1마리의 마우스를 사용하여 결정하였다. 강제 트레드밀 운동 시험을 트레드밀 (콜럼부스 인스트루먼츠)를 사용하여 이전에 설명된 바와 같이 (Shalom-Barak et al., 2004) 수행하였다. 마우스에서 근육 강도는 자동화 그립 강도 측정기 (콜럼부스 인스트루먼츠)를 사용하여 이전에 설명된 바와 같이 (Acakpo-Satchivi et al., 1997) 측정하였다.
MRI 측정. MRI를 영상화를 위해 구배 증폭기를 장착한 Bruker Avance 500 와이드 보어 (wide bore) 분광계 (11.7 T; 양성자에 대한 500 MHz) 상에서 수행하였다 (Viereck et al., 2005). 데이타는 판매자가 제공하는 Paravision 소프트웨어를 사용하여 처리하였다.
대사 측정. 혈당은 Accu-check 포도당 모니터 (로슈 다이아그노스틱스 코퍼레이션 (Roche Diagnostics Corp.))를 사용하여 분석하였다. 혈청 인슐린은 표준품으로서 마우스 인슐린 (크리스탈 켐 인크. (Crystal Chem Inc.))을 사용하는 효소 결합 면역 측정법에 의해 결정하였다. 당내성 시험 (GTT)은 6시간 절식시킨 마우스에 대해 수행하였다. 마우스에게 D-포도당 (1 g/kg 체중)을 복강내 주사하고, 주사 직전 및 주사의 30, 60, 90 및 120 분 후에 혈당 수준을 결정하였다. 생체내 골격근에서 포도당 섭취는 이전에 설명된 바와 같이 결정하였다 (Koh et al., 2006). 간에서 지방산 β-산화의 속도는 이전에 설명된 바와 같이 검사하였다 (Nemoto et al., 2000).
뒷다리 허혈 모델. 마우스를 케타민 (80 mg/kg) 및 자이알린 (10 mg/kg)의 혼합물로 마취하였다. 좌측 대퇴 동맥을 서혜부 인대를 통한 도입 지점에서, 오금 동맥의 기원에서, 및 복재 동맥을 통한 중도에서 결찰하였다. 작은 가지를 소작하고, 결찰부 사이의 동맥 부분을 제거하였다. 장딴지 근육 상에 직접 놓인 심부 관통 레이저 도플러 프로브 (페리메드 (Perimed))를 사용하여 혈액 유동을 측정하였다. 유동 측정은 대퇴 동맥절제의 직전, 직후 및 2 및 4주후에 이루어졌다. 대퇴 절제의 4주 후에, 허혈 및 대조 다리로부터의 장딴지 및 가자미 근육을 메탄올로 고정하고 파라핀 내에 매몰하였다. 5 미크론 절편을 TRITC-표지된 렉틴 (Bandeiraea Simplicifolia; 시그마-알드리치 (Sigma-Aldrich))으로 염색하였다.
조직학. 골격근 및 간 조직을 OCT 화합물 (사쿠라 파인테크 유에스에이 인크 (Sakura Finetech USA Inc)) 내에 매몰하고 액체 질소 내에서 급속 냉동하였다. 백색 지방 조직을 10% 포르말린으로 고정하고, 탈수시키고, 파라핀 내에 매몰하였다. 조직 절편을 표준 방법에 의해 전체 형태학에 대해 H&E로, 섬유증에 대해 마손-트리크롬 (masson-trichrome) (MT)로, 지질 침착에 대해 오일 레드-O로 염색하였다.
웨스턴 블롯팅. 웨스턴 블롯 분석은 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다 (Shiojima et al., 2002). 사용된 항체는 포스포-Akt(ser-473) (셀 시그널링 테크놀로지 (Cell Signaling Technology)); Akt1 및 VP16 (산타 크루즈 바이오테크놀로지 인크. (Santa Cruz Biotechnology Inc.)); HA (12CA5) (로슈 다이아그노스틱스 코퍼레이션); 및 튜불린 (칼비오켐 (Calbiochem))이었다.
정량적 실시간 PCR. 전체 장딴지 근육 및 간으로부터의 총 RNA는 제조사가 제공하는 프로토콜을 사용하여 퀴아겐에서 제조하였다. cDNA는 ThermoScript RT- PCR Systems (인비트로겐 (Invitrogen))을 사용하여 생산하였다. 실시간 PCR은 이전에 설명된 바와 같이 수행하였다 (Izumiya et al., 2006). 전사체 수준은 18S rRNA에 대한 전사체의 상대적인 수로서 결정하고, 대조군 샘플의 평균값에 대해 표준화하였다. 프라이머 서열은 요청시 이용가능하다.
통계학적 분석. 모든 데이타는 평균±SEM으로 제시한다. 2개의 실험군으로부터 데이타의 통계학적 비교는 스튜던트 (Student) t 테스트를 사용하여 이루어졌다. 다수 군으로부터의 데이타의 비교는 피셔 (Fisher) PLSD 테스트를 사용하여 ANOVA에 의해 이루어졌다. P<0.05의 수준이 통계상 유의한 것으로 용인된다.
실시예 1:
골격근-특이적 Akt1 트랜스제닉 마우스
골격근-특이적 유도가능 AKT1 TG 마우스의 생성: 2개의 TG 마우스 주 (Tet-myrAkt1 및 MCK-rtTA)를 사용하여 골격근-특이적 조건화 Akt1 TG 마우스를 생성하였다 (도 1A). Tet-myrAkt1 TG 주는 테트라사이클린 반응 요소 (TRE)의 제어 하에 활성형의 Akt1 (myrAkt1) 트랜스젠을 포함하고 (Shiojima et al., 2005), MCK-rtTA TG 주는 돌연변이된 MCK 프로모터에 의해 구동된 골격근에서 역 테트라사이클린 트랜스액티베이터 (transactivator) (rtTA: TRE 및 VP16 트랜스활성 도메인의 융합 단백질)을 발현한다 (Grill et al., 2003). DOX가 rtTA와 회합하여 TRE에 대한 결합을 가능하게 하므로, 2개의 트랜스젠을 모두 포함하는 이중 트랜스제닉 (DTG) 마우스를 독시사이클린 (DOX)으로 처리하면 myrAkt1 트랜스젠 발현을 일으킨다. 이와 달리, DOX의 중지는 rtTA가 TRE에 결합하는 것을 억제하였고, 골격근에서 myrAkt1 발현을 억제시켰다. Tet-myrAkt1 마우스와 MCK-rtTA 마우스를 교배시켜 4개의 상이한 유전형 (야생형 (WT), Tet-myrAkt1 TG 마우스, MCK-rtTA TG 마우스 및 DTG 마우스)을 예상된 빈도로 갖는 마우스를 생성하였다. Akt1 트랜스젠의 조절된 발현을 검사하기 위해, 상기 마우스를 DOX(-) 및 DOX(+) 군으로 나누었다: DOX(+) 군은 8주령까지 정상 물로 처리한 후, 2주 동안 DOX 처리하였고, DOX(-) 군은 10주령까지 정상 물로 처리하였다 (도 1B). 10주령에 회수한 장딴지 근육 용해물의 웨스턴 블롯 분석은 항-HA 블롯에 의해 검출된 트랜스젠 발현이 DOX를 사용하는 DTG 마우스에서만 관찰되었음을 밝혔고, 이는 골격근에서 Akt1 트랜스젠의 발현이 DOX-의존 방식으로 엄격하게 조절되는 것을 나타낸다. Akt1 트랜스젠의 유도된 발현은 Ser473에서 Akt의 포스포릴화 수준에서 현저한 증가, 총 Akt 단백질 수준에서 중정도 증가와 연관되었다 (도 1B). 도 1C에 도시된 바와 같이, Akt1 트랜스젠 발현은 골격근에서만 검출되었고, 이는 트랜스젠의 발현이 골격근-특이적 방식으로 조절되었음을 나타낸다. 본 발명자들은 또한 Akt1 트랜스젠의 비교적 보다 낮은 발현 수준을 나타내는 제2 Tet-myrAkt1 트랜스제닉 마우스 주 (line)를 확립하였다 (데이타 비제시). 제1 Tet-myrAkt1 주는 보다 강건한 성장 조절 효과를 나타내고, 골격근 성장 및 기능의 보다 우수한 평가를 허용하기 때문에, 상기 Tet-myrAkt1 마우스의 주를 사용하여 추가의 실험을 수행하였다.
골격근에서 AKT1 의 활성화는 기능적 타입 II 근섬유 비대를 일으킨다: 골격근에서 Akt1 트랜스젠 발현의 결과를 검사하기 위해, 마우스를 8주령에서 DOX로 처리하고, 트랜스젠을 2주 동안 유도시키고, DOX를 2주 동안 제거함으로써 트랜스젠 을 억제하였다. 도 2A에 도시된 바와 같이, 2주 동안 Akt1 신호전달의 활성화는 강건한 근육 성장을 유도하였다. Akt1-유도된 근육 성장은 DOX의 중지 2주 후에 완전히 역전되었다. 트랜스젠 발현 및 장딴지 근육 중량의 시간 경로를 검사하였다 (도 2B). Akt1 트랜스젠 발현을 먼저 제3일에 검출하였고, 이는 초기 트랜스젠 발현이 DOX 처리 직후에 일어났음을 나타낸다. 트랜스젠 발현은 제14일에 그의 최대 수준에 도달하였다. 트랜스젠 발현의 현저한 억제는 DOX의 중지의 2일 후로 일찍 관찰되었고, 트랜스젠 발현은 DOX의 중지 후 제14일에 완전히 억제되었다. 장딴지 근육 중량은 제7일에 유의하게 증가되었고, 이는 제14일에 더욱 증가하였다. DOX가 중지될 때, DOX의 중지 2일 후에 비대의 극적인 억제가 관찰되었다. 장딴지 근육 중량은 DOX의 중지 7일 후에 기저 수준으로 거의 완전히 역전되었다.
조직학적 분석으로 개별 근섬유 크기는 명백하게 증가하고, 트랜스젠 억제 후 역전되었음을 밝혔다 (도 2C). 개별 섬유 크기의 분석은 장딴지 근육에서 우측으로 유의한 이동을 입증한다. 평균 단면적은 Akt1 활성화의 2주 후에 약 2배 증가하였다 (2657±195 대 1338±80 μm2, p<0.01). 트랜스젠 발현을 6주 동안 유지시키면 추가로 골격근 비대를 유도하였다 (도 2D). Akt1 트랜스젠 발현의 수준은 유도 후 2주 내지 6주 사이에 유사한 정도였다. 장딴지 근육 중량은 두 시점에 대조군보다 유의하게 더 높았다. 조직학에 의해 밝혀지는 바와 같이, 골격근에서 장기 Akt1 활성화는 사이질 섬유증 또는 염증과 같은 임의의 병리학적 변화없이 보다 현저한 근육 비대를 유도하였다.
AKT - 매개된 비대화된 성인 골격근의 물리적 성능: 어떠한 근육 섬유가 Akt1 트랜스젠을 우선적으로 발현하는지 검사하기 위해, 장딴지 근육 절편을 항-HA 및 MHC 이소형 항체로 염색하였다. 도 3A에 도시된 바와 같이, 항-HA 항체에 의해 검출된 Akt1 트랜스젠은 타입 IIb 섬유에서 우선적으로 발현되었다. 타입 IIb 섬유는 힘 생성을 책임지는 속근/해당근으로 분류된다. Akt1 트랜스젠 발현 프로필과 일치하게, DTG에 대한 피크 그립력은 Akt1 유도의 2주 후에 대조군보다 약 50% 더 컸다 (104.7±3.7 대 69.8±0.8 g, p<0.05). 이와 달리, 강제 트레드밀 운동 시험으로는 DTG가 대조군보다 적은 달리기 능력을 갖는 것이 밝혀졌다 (도 3B). 상기 결과는 타입 II 근육 섬유에서 Akt1 활성화가 "저항성 훈련 (resistance training)" 표현형을 갖는 마우스 품종의 생성을 가능하게 하는 것을 보여준다.
AKT1 - 매개된 타입 II 근육 섬유 성장은 식이-유도 비만 및 비만-관련 대사 질환을 복귀시킨다: 타입 II 근육 성장과 비만 사이의 관계를 조사하기 위해, 마우스에게 고지방/수크로스 (HF/HS) 식이를 급식하여 비만을 유도하였다. 억제된 Akt1 활성화의 조건 하에서는, HF/HS 식이를 급식시킨 대조군 및 DTG 마우스에서 체중 증가에 있어서 유의한 차이가 관찰되지 않았다 (도 4A). 그러나, 비만 마우스의 타입 II 골격근에서 일단 Akt1이 활성화되면, 대조 마우스에 비해 체중이 극적으로 감소하였다. MRI 분석으로 DTG 마우스에서 과량의 지방의 축적이 유의하게 감소되었음을 밝혔다 (도 4B). 조직학적 분석으로 DTG 마우스에서 근섬유 비대가 명백하였음을 밝혔다 (도 4C). 지방세포 크기는 대조 마우스에서 HF/HS 식이에 의해 커졌지만, DTG 마우스에서는 명백하게 더 작았다. 장딴지 근육 중량은 대조 마 우스에 비해 DTG 마우스에서 유의하게 증가하였다 (도 4D). 서혜부 지방 패드 중량은 대조 마우스에서 HF/HS 식이에 의해 증가하였지만, DTG 마우스에서는 극적으로 감소하였다 (도 4D).
이어서, 본 발명자들은 전신 포도당 대사에 대한 Akt1-매개된 타입 II 근육 성장의 효과를 검사하였다. 절식 기간에는 각 군에서 혈당 수준의 차이가 없었지만, 급식 기간에는 HF/HS 식이를 급식한 대조 마우스에서 유의하게 더 높았다 (도 5A). 공복 혈청 인슐린 수준은 HF/HS 식이를 급식한 대조 마우스에서만 유의하게 증가하였고, 이는 상기 마우스가 인슐린 저항성을 일으켰고 Akt1-매개된 타입 II 근육 성장은 인슐린 저항성을 개선시켰음을 나타낸다 (도 5B). 상기한 점을 추가로 조사하기 위해, 당내성 시험 (GTT)을 수행하였다. 도 5C에 도시된 바와 같이, HF/HS 식이를 급식한 DTG 마우스는 GTT 후 정상 식이의 마우스와 유사한 포도당 수준을 유지한 반면, HF/HS 식이를 급식한 대조 마우스는 주사 후 더 높은 포도당 수준을 보였다. 상기 결과는 HF/HS 식이-유도된 중증 당불내성이 타입 II 골격근에서 Akt1 활성화 후 명백하게 개선되었음을 나타낸다. 개선된 당내성이 골격근에서 증가된 포도당 처리로 인한 것인지 검사하기 위해, 생체 내에서 골격근 포도당 섭취를 측정하였고, 근육 포도당 섭취가 정상 식이 및 HF/HS 식이를 급식한 DTG에서 각각 1.6배 및 2.0배 더 높았음을 발견하였다 (도 5D).
과도한 지방 축적이 타입 II 근육 성장에 의해 역전되는 메카니즘을 조사하기 위해, 본 발명자들은 에너지 균형: 음식 섭취 및 에너지 소모를 검사하였다. 대조군 및 DTG 마우스가 모두 실험 기간 내내 유사한 음식 섭취를 보인다 (도 6A). HF/HS 식이를 급식한 DTG 마우스의 보행 활동 수준이 대조군 마우스보다 ~40% 더 낮지만 (도 6B), 전신 O2 소모 (VO2)에 의해 추정한 에너지 소모는 대조 마우스보다 유의하게 더 높았다 (도 6C). 탄수화물 대 지방산 산화의 비를 반영하는 호흡 교환비 (RER)는 HF/HS 식이를 급식한 DTG 마우스에서 유의하게 감소하였고, 이는 상기 마우스가 절식 기간 동안 보다 많은 비의 지방산을 연료 공급원으로 사용함을 나타낸다. 그러나, 정량적 실시간 PCR 분석으로 지방산 산화 및 미토콘드리아의 생성과 연관된 대부분의 유전자가 골격근에서 상향조절되지 않았음이 밝혀졌다 (표 1). 간은 대사적으로 활성 장기일 뿐만 아니라 골격근이므로, 간 형태학 및 지질 산화 기능을 검토하였다. 조직학에 의해 밝혀진 바와 같이, 간에서 HF/HS 식이-유도 지질 침착이 DTG 마우스에서 극적으로 분해되었다 (도 7A). 지질 침착이 DTG 마우스에서 감소한 이유를 조사하기 위해, 생체내 간에서 지방산 산화를 측정하였고, HF/HS 식이를 급식한 DTG 마우스에서 간에서 보다 많은 지방산이 산화되었음을 발견하였다 (도 7B). 간에서 합성되고 간의 지방산 산화의 간접적인 마커로서 사용될 수 있는 혈청 케톤체는 HF/HS 식이를 급식한 DTG 마우스에서 유의하게 증가하였다 (도 7C). 마지막으로, 정량적 실시간 PCR 분석은 HF/HS 식이를 급식한 DTG 마우스의 간에서 HNF4α, L-CPT1 및 PGC1-α의 발현의 유의한 증가를 보여주었고, 이는 Akt1-매개된 타입 II 근육 성장이 간에서 지방산 산화를 자극하는데 관여하는 분자를 활성화함을 제안한다.
Figure 112008067662470-PCT00001
요약하면, 비만 마우스에서 근원성 Akt 트랜스젠 활성화는 다음 표현형을 부여한다: 1) 증가된 근 질량 및 강도, 2) 감소된 지방량, 3) 감소된 체중, 4) 개선된 인슐린 감수성, 5) 감소된 지방증 (지방간), 6) 골격근에서 증가된 혈관신생 및 7) 위성 세포의 혼입을 통한 증가된 근육 성장 (도 11). 상기 효과는 일정 수준의 음식 섭취 및 신체 활성에도 불구하고 일어난다.
본 발명의 연구에서, 본 발명자들은 타입 II 골격근 성장이 비만 마우스에서 비만 및 비만-관련 대사 질환을 복귀시키는 것을 발견하기에 이르렀다. 타입 II 골격근에서 Akt1 활성화는 근육 비대를 극적으로 유도하였고, 여기에는 체중, 특히 지방량의 명백한 감소, 및 HF/HS 식이에 의해 유도된 당불내성의 개선이 동반된다. 상기 효과는 식이 및 활동 변경 없이 달성되었다. 또한, 타입 II 골격근 성장은 간에서 증가된 지방산 산화 및 감소된 지질 침착을 일으켰다. 타입 II 근육 섬유는 노화시에 극적으로 감소되고 (Larsson, 1983), 단면 연구에 의해서 근육 강도가 대사 증후군의 유병률과 역상관관계인 것으로 밝혀졌으므로 (Jurca et al., 2005; Jurca et al., 2004), 본 발명자들은 타입 II 근육 섬유를 증가시키는 것을 목적으로 하는 저항성 훈련이 비만 및 비만-관련 대사가 있는 환자, 특히 노인 환자에게 유익한 개입임을 발견하기에 이르렀다.
본 발명의 연구에서, 본 발명자들은 타입 II 근육 섬유 성장이 비만 마우스에서 신체 활동 수준에 무관하게 전신 에너지 소모를 증가시키는 것을 발견하기에 이르렀다 (도 6B, C). 상기 발견은 타입 II 근육을 만들고 유지하는 것 자체가 에너지 소모적임을 나타낸다. 큰 골격근으로부터 에너지 수요 증가의 결과로서 지방 조직으로의 에너지 공급의 감소는 비만의 복귀에 기여할 수 있다. 또한, 본 발명자들은 타입 II 근육 섬유에서 Akt1 활성화가 골격근 내로의 포도당 섭취를 유의하게 증가시키고, HF/HS 식이에 의해 유도된 손상된 당내성이 타입 II 근육에서 Akt1 활성화에 의해 극적으로 개선되었음을 발견하였다 (도 5). 따라서, 본 발명자들은 Akt1-매개된 타입 II 섬유 성장이 HF/HS 식이-유도 당불내성의 개선을 일으킴을 발견하기에 이르렀다. 본원에 개시된 다른 주목할 만한 발견은 HF/HS 식이-유도된 간 지방증이 극적으로 분해되고, DTG 마우스의 간에서 지방산 산화가 유의하게 증가한 것이고 (도 7), 이는 골격근에서 Akt1 신호전달의 활성화가 일부 분비형 인자를 생산하고, 측분비 (paracrine) 방식으로 간에 직접 영향을 미치는 것을 나타낸다. 이전의 연구에서, 본 발명자들은 골격근 또는 심장근에서 Akt1 활성화가 근육 비대를 유도하고, 근세포로부터 방출된 전-혈관신생 인자를 분비함으로써 혈관 동원을 조화시킨다는 것을 이전에 보고한 바 있다 (Shiojima et al., 2005; Takahashi et al., 2002). 본원의 발견은 Akt1-매개된 타입 II 근육 성장이 다른 장기와 함께 포도당/지질 대사의 조화된 조절을 유도함을 나타낸다.
결론을 내리면, 본 발명자들은 타입 II 골격근 성장이 간에서 지질 산화를 조정함으로써 비만-관련 대사를 개선하는 것을 처음으로 밝혀낸 것이다. 상기 발견은 타입 II 골격근 섬유가 먼 장기와 소통함으로써 포도당/지질 대사를 조절한다는 신규한 발상을 제공한다.
실시예 2
골격근에서 AKT1 활성화의 상세한 특성화
근육에서 Akt의 유도가능한 발현을 갖는 트랜스제닉 마우스를 도 9-12에 도시된 바와 같이 추가로 특성화하였다. Akt의 발현이 음용수로 DOX(DTG)의 투여에 의해 유도될 때, 야생형 마우스에 비해 타입 IIb 근육 섬유, 일반적으로 해당/속근 섬유의 비대가 관찰되고, 대조군에 비해 DOX 처리된 Akt 마우스에서 타입 I 및 타입 IIa 섬유는 덜 발생한다.
고지방 및 고당 (HF/HS)을 급식시킨 DOX 처리된 트랜스제닉 Akt 마우스는 또한 HF/HS 식이를 급식한 대조 마우스에 비해 간에서 지질 과산화가 증가하였지만 근육에서는 그렇지 않았고, 이는 지방산 산화 및 미토콘드리아의 생성과 연관된 많은 mRNA (도 10A), 및 팔미트산의 총 지방산 β-산화의 증가 (도 10C)에 대한 정량적 유전자 발현 분석, 및 또한 오일 레드-O 스테인을 사용하는 간의 형태학적 분석 (도 7A 및 10B)에 의해 검출하였다. HF/HS 식이를 급식한 Akt 트랜스제닉 마우스에서, HF/HS를 급식한 대조 마우스에 비해 PGC-1, HNF4-α 및 CPT-1 (지방산 산화와 연관된 유전자)가 증가하고 (도 10D), 또한 혈청 및 뇨 케톤체 (도 10E) 및 혈청 락테이트 수준 (도 10F)이 증가하였고, 이는 근육에서 Akt 활성화가 또한 간에서 지방산 대사를 증가시키는 것을 나타낸다.
다른 조직에 대한 근육에서 Akt 발현 유도의 효과 분석은 예를 들어 간, 지방 세포 및 다른 장기, 예를 들어 신장, 비장, 췌장, 신경계 조직 등의 조직을 사용하는 차별적인 유전자 발현 분석을 이용하여 평가할 수 있다 (도 12 참조)
실시예 3
시험관 내에서 AKT1 의 유도가능한 발현: 본 발명자들이 이전에 Akt2 (Fujio Y. et al. 2001 Cell Death Duff 8: 1207-1212), 및 Akt3 (Y. Taniyama 2005 J Mol Cell Cardiol 38:375-385)이 Akt1과 기능 특성을 공유함을 밝혔기 때문에, Akt1, Akt2 또는 Akt3 (구성적-활성 또는 우성-음성 형태)을 사용한 시험관 내 또는 생체 내 조직에서 세포의 형질도입은 전사체 수준의 유사한 변화를 일으켰다.
시험관 내에서 골격 세포에서 Akt의 활성화가 유전자 발현에서 유사한 변화를 일으키는지 검사하기 위해, 근원 세포주인 C2C12 세포에 Akt1을 발현하는 아데노바이러스 (Adv-myrAkt)를 형질도입시켰다. Adv-myrAkt 세포로 형질감염된 세포의 1일 후의 유전자 발현을 마우스의 골격근에서 골격근 세포의 Akt1의 유도된 발현과 비교하면 고도로 유사한 유전자 발현 프로필을 갖고, 이는 시험관내 배양된 Akt1을 발현하는 골격근 세포가 근육 분비형 단백질 (MSP) 또는 미오카인을 연구하기 위한 효과적인 도구임을 나타낸다.
도 8에 도시된 바와 같이, 골격근 세포주, 예를 들어 C2C12에서 myrAkt를 발현시킴으로써, 근육 분비형 단백질 (MSP)을 시험관내 분석으로 확인하기 위한 프로토콜을 고안하였다. 다른 골격근 세포주, 예를 들어 인간 골격근 세포주가 사용될 수 있다.
실시예 4
근육 성장, 혈관신생, 비만, 인슐린 감수성 및 심혈관 기능과 연관된 인자의 확인: 비제한적인 예로서, 증가된 당 감수성 및 인슐린 감수성, 감소된 지방량 및 감소된 지방 세포 크기, 감소된 간 침착, 증가된 모세혈관 밀도 및 증가된 위성 세포 동원 및 섬유로의 위성 세포의 혼입과 같은 표현형을 부여하는 신규한 근육 분비형 단백질 (MSP)을 확인하기 위한 프로토콜을 고안하였다. 먼저, 대조군 및 DTG 마우스의 근육에 대해 마이크로어레이 분석을 수행하였다. 유도가능 Akt 트랜스제닉 마우스 (3개 군; 트랜스젠 유도 없음 (대조군), 2주 유도 (2w 온 (on)), 및 2주 유도/2일 억제 (2w /2d 오프 (off))의 장딴지 근육으로부터 총 RNA를 Affymetrix GeneChip(등록상표) 마우스 발현 세트 430 마이크로어레이에 의해 분석하였다. Akt 유도에 의해 상향조절된 전사체 중에, NCBI 웹사이트에서 이용가능한 전장 개방 판독 프레임 cDNA를 갖는 미지의 유전자를 선택하였다. 이어서, Signal IP 소프트웨어를 사용하여 예측된 아미노산 서열을 추정 신호 서열에 대해 검사하였다. 이어서, 예측된 신호 서열을 갖는 미지의 전사체를 이들이 분비형 단백질 또는 통합 막 단백질을 코딩하는지 예측하기 위해 SOSUI 신호 베타 버전 소프트웨어를 사용하여 분석하였다. 이어서, cDNA의 상기 하위세트를 DTG 마우스의 장딴지 근육에서 DOX의 존재 또는 부재 하에 실시간 PCR에 의해 검정하였다.
상기 검사에 기초하여, 8개의 선택된 cDNA를 유전자 산물이 포유동물 세포에 의해 분비되는지 시험하기 위해 추가로 분석하였다. 전장 cDNA를 PCR에 의해 얻고, 검출을 위해 N-말단에서 V5 에피토프에 대한 및 C-말단에서 His 태그에 대한 융합체로서 미지의 단백질을 발현하는 pcDNA3.1/V5-His 내로 서브클로닝하였다. 이어서, 상기 발현 벡터를 HEK293 세포 내로 형질감염시켰다. 2일 후, 세포 펠렛 및 배지 분획을 수집하고 항-V5 항체를 사용하는 웨스턴 블롯에 의해 분석하였고, 여기서 재조합 단백질은 세포 펠렛 및 배지 내에서 모두 검출될 수 있고, 이는 상기 cDNA가 분비형 단백질을 코딩함을 나타낸다. 종합적으로, 8개의 cDNA 중 6개가 상기 HEK293 세포 형질감염 분석에 의해 평가할 때 분비형 단백질을 코딩한 반면, 2개의 cDNA는 그렇지 않았다 (즉, 단백질이 세포 펠렛에서 검출되지만 배지에서 검출될 수 없었다).
요약하면, 상기 설명한 마이크로어레이 분석 및 형질감염 분석에 기초하여, 본 발명자들은 Akt-매개 근육 성장 동안 상향조절되는 분비형 단백질을 코딩하는 6개의 신규한 cDNA를 확인하였다 (표 2). 이들 인자를 근육-분비형 단백질 1-6 (MSP 1-6)으로 칭한다. MSP 1-5에 대한 Riken 확인 번호 및 GenBank 기탁 번호를 표 2에 기재한다. MSP6은 당뇨병 및 비만에 유용성을 가질 수 있는 대사 인자인 FGF21이다 (J. Clin. Invest. 2005;115:1627-1635).
Figure 112008067662470-PCT00002
MSP1은 2160028F08Rik (GenBank 기탁 번호 BC052844) (서열 16)에 대응하고, MSP2는 2310043I08Rik (GenBank 기탁 번호 AK009779) (서열 17)에 대응하고, MSP3은 1110017I16Rik (GenBank 기탁 번호 NM_026754) (서열 1)에 대응하고, MSP4는 4732466D17Rik (GenBank 기탁 번호 BC025830, AK028883) (서열 18)에 대응하고, MSP5는 1600015H20Rik (GenBank 기탁 번호 AK005465) (서열 12)에 대응한다.
실시예 5
대사 조절인자로서의 MSP3 .
MSP 를 발현하는 아데노바이러스 벡터의 생산 및 허혈 뒷다리 혈관신생 분석에서의 효능: 6개의 모든 MSP cDNA에 대한 아데노바이러스 발현 벡터를 이전에 설명된 바와 같이 HEK 293 세포에서 상동성 재조합에 의해 생산하였다 (Mol. Cell. Biol. 2002;22:680-691). 간단히 설명하면, MSP cDNA를 아데노-MSP로 지정된 아데노바이러스 셔틀 (shuttle) 벡터 내로 서브클로닝하였다. MSP cDNA를 함유하는 셔틀 벡터를 선형화하고, 아데노바이러스 백본 플라스미드 pAdEasy-1과 함께 에스케리치아 콜라이 (Escherichia coli) 내로 동시형질감염시켰다. MSP cDNA를 갖는 생성되는 재조합 아데노바이러스 DNA를 패키징 세포주 293 세포 내로 형질감염시켜, 재조합 아데노바이러스 벡터를 생산하였다. 모든 바이러스 구성체를 293 세포에서 증폭시키고 실험실 내에 일상적인 CsCl 초원심분리에 의해 정제하였다 (Mol. Cell. Biol. 2002;22: 680-691; J. Biol. Chem. 2005;280:20814-20823).
MSP3은 1110017I16Rik (GenBank 기탁 번호 NM_026754) (서열 1)에 대응하고, 근육 관련 트랜스젠의 발현 및 근육 성장에 반응하여 차별적으로 조절되는 것으로 밝혀졌다. 생체 내에서 2개의 MSP, 즉, MSP3 및 MSP6 (FGF-21)의 잠재적인 혈관신생 특성을 평가하기 위해, 10주령의 마우스의 한쪽 뒷다리를 수술하였다 (J. Biol. Chem. 2004;279:28670-28674; Circ. Res. 2005;96(8):838-846; Circ. Res. 2006;98(2):254-61). MSP3 및 MSP6을 발현하는 아데노바이러스 벡터를 사용하여 아데노바이러스-매개된 유전자 전달을 수술 3일 전에 허혈 다리에서 모음근의 5개의 상이한 부위 내로 직접 주사함으로써 수행하였다. 혈관 성장을 수술 직전 및 수술 후 제0, 3, 7, 14 및 28일에 다리 및 발에서 레이저 도플러 분석에 의해 모니터링하였다 (도 13). 도 13에 도시된 바와 같이, 아데노-MSP3-처리된 마우스는 레이저 도플러 혈액 유동 분석에 의해 결정할 때 뒷다리 수술의 7, 14 및 28일 후에 유동 회복에서 유의한 증가를 보였다. 이와 달리, 아데노-MSP6은 대조 마우스에 비해 유동 회복에 영향을 미치지 않았다. 상기 결과는 MSP3은 혈관신생-조절 단백질로서 기능하지만 MSP6 (즉, FGF21)은 그렇지 않음을 제안한다. 이는 또한 도 14에 도시되어 있고, 여기서 Adv-MSP3은 Adv-FGF21 또는 대조군 Adv-β-gal 처리된 마우스에 비해 CD31 면역염색 및 모세혈관 밀도의 정량 분석에 의해 확인할 때 모세혈관 밀도 및 미세혈관 형성을 개선한다.
당 감수성의 대사 조절인자로서 MSP3 은 식이-유도 비만 및 비만-관련 대사 질환을 복귀시킨다:
MSP 대사 기능을 시험하기 위해 식이-유도 비만 모델을 평가하기 위한 프로토콜을 확립하였고, 여기서 고지방 고수크로스 식이를 급식한 마우스에게 MSP3을 발현하는 아데노바이러스 (Adv)를 근육내 주사하고 (1x1O10 pfu로), Adv-주사 후 7, 14, 21 및 28일에 체중을 평가하고, 14 및 28일에 혈당을 평가하였다.
아데노-MSP3의 근육내 주사 시에, 식이 유도 비만 마우스는 Adv-β-gal 주사한 마우스에 비해 대사 반응 및 당 감수성을 개선하였다 (도 15A 및 B). 아데노바이러스-코딩된 MSP3은 아데노바이러스-전달된 FGF-21 (MSP6으로도 알려짐)과 기능상 동등한 것으로 보이고, 여기서 혈당 (mg/dl)은 포도당 주사 후 120분에 Adv-MSP3 및 Adv-FGF21을 사용한 것과 동일한 수준으로 돌아간다. 또한, 상기 개선된 대사 반응 및 당 감수성은 다른 MSPS (MSP5, MSP2, MSP4 및 MSP1)에서는 관찰되지 않았다 (도 15D).
염색체 2 상에 위치하고 (도 17), 2개의 선택적 스플라이싱된 이소형; 즉, 긴 이소형 (서열 1) 및 짧은 이소형 (서열 2)으로서 존재하는 (도 16) MSP3의 발현 프로필을 분석하기 위해 정량적 RT-PCR을 수행하였고, 아미노산 서열의 분석을 통해 MSP3이 신호 서열을 갖고 설치류와 인간 이소형 사이에 높은 상동성을 갖는 것을 예측한다; 마우스 (서열 3)와 래트 (서열 4) 사이의 서열 동일성은 94%이고, 마우스와 인간 (서열 5) 사이의 서열 동일성은 79% (도 18)이다. 긴 및 짧은 이소형 (서열 10 및 11, 도 19)을 모두 검출하기 위해 설계된 프라이머를 사용하는 총 MSP3 발현의 분석은 MSP3이 심장, 뇌, 폐, 흉선, 림프절, 눈 및 골격근에서 제한된 발현을 갖는 것을 보여준다 (도 20A). 또한, MSP3은 C2C12 세포 (근세포 세포주)에서 발현되었고, 그의 발현은 구성적 활성 Akt (MyrAkt)를 발현하는 아데노바이러스로 C2C12 세포를 형질감염시킴으로써 추가로 유도되었다 (도 20A). MSP3의 긴 및 짧은 이소형의 발현의 분석은 긴 및 짧은 이소형 (서열 6-9, 도 21) 각각에 대한 이소형-특이적 프라이머를 사용하여 이루어졌고, 이는 짧은 형태 (하부 밴드)에 비해 MSP3의 긴 형태가 우세하게 발현되는 (상부 밴드) 것을 보여준다 (도 20B).
요약하면, 본 발명자들은 MSP3이 혈관신생 인자로서 기능하고 (도 13 및 14), 또한 비만 마우스 모델에서 당에 대한 감수성을 조절하므로 (도 15), MSP3은 FGF21과 공유되지 않는 대사 조절인자로서 이중 기능을 갖고, FGF21은 단지 당에 대한 감수성을 조절하는 기능을 수행함을 밝혀낸 것이다.
실시예 6
근육 비대 인자 (근원 인자)로서의 MSP5
MSP5는 근육 관련 트랜스젠의 발현 및 근육 성장에 반응하여 차별적으로 조절되는 것으로 밝혀졌다. MSP5는 1600015H20Rik (GenBank 기탁 번호 AK005465) (서열 12)에 대응한다.
MSP5의 잠재적인 혈관신생 특성을 평가하기 위해, 10주령의 마우스의 한쪽 뒷다리를 수술하였다 (J. Biol. Chem. 2004;279:28670-28674; Circ. Res. 2005;96(8):838-846; Circ. Res. 2006;98(2):254-61). MSP5 및 MSP1을 발현하는 아데노바이러스 벡터를 사용하여 수술 3일 전에 허혈 다리에서 모음근의 5개의 상이한 부위 내로 직접 주사함으로써 아데노바이러스-매개된 유전자 전달을 수행하였다. 혈관 성장을 선행 실험에서와 같이 수술 직전에 및 수술 후 제0, 3, 7, 14 및 28일에 다리 및 발에서 레이저 도플러 분석에 의해 모니터링하였고, Adv-MSP5 형질감염된 마우스는 β-gal 대조군 또는 Adv-MSP1 형질감염된 마우스에 비해 개선된 허혈/정상 LDBF 비를 가졌고 (도 22), 이는 MSP5가 혈관신생을 증가시키는 기능을 하지만 MSP1은 그렇지 않음을 나타낸다.
시험관 내에서 골격근 세포의 성장에 대한 MSP5의 효과를 평가하기 위해, 근세포로의 분화 4일 후에 C2C12 세포를 Adv-MSP5, Adv-MSP3, adv-βGal 또는 Adv-myrAkt로 형질감염시켰고, 이들의 형태학 및 근관 직경을 평가하였다. Adv-MSP5 또는 adv-myrAkt로 형질감염된 C2C12 세포는 Adv-MSP3 또는 대조군 Adv-β-gal 형질감염된 C2C12 세포에 비해 커졌고 (도 23B) 근관 직경이 증가하였다 (도 23C). 또한, 단백질 합성 및 근원섬유 성장의 지표로서 3H-류신 혼입을 평가함으로써, Adv-MSP3 및 Adv-β-gal 형질감염된 세포에 비해 Adv-MSP5 및 Adv-myrAkt로 형질감염된 C2C12 세포에서 단백질 합성이 증가함이 밝혀졌다 (도 24). Adv-MSP5 또는 Adv-myrAkt로 형질감염된 C2C12 세포는 혈관신생 인자인 VEGF 발현을 촉진하였고, 이는 Adv-MSP3 또는 Adv-β-gal로 형질감염된 세포에서는 관찰되지 않았다 (도 25).
요약하면, MSP5는 근육 비대 인자 또는 근원 인자로서 기능하고, 골격근에서 비대를 촉진한다. MSP5는 또한 허혈 다리에서 혈관신생을 촉진하고, C2C12 세포에서 VEGF의 발현을 증가시킨다. Adv-MSP5로 형질도입된 허혈 다리의 혈관재형성은 근육 성장 증가 및 VEGF 분비의 증가의 결과일 수 있다.
실시예 7
인슐린-유사 6 ( Insl6 )은 근육 재생을 촉진한다
인슐린-유사 6은 또한 근육 관련 트랜스젠의 발현 및 근육 성장에 반응하여 차별적으로 발현되는 것으로 확인되었다. 인슐린-유사 6 (Insl6)은 릴랙신 패밀리에 속하고, GenBank 기탁 번호 NM_007179 (서열 20)에 대응한다.
근육-관련 단백질의 유도가능 발현을 갖는 트랜스제닉 마우스, 예를 들어 근원섬유가 성장할 때 전구 세포 동원을 나타내는 근육 세포에서, 중심화 핵에 의해 결정될 때 구성적 활성을 발현하는 (이는 대조 마우스에서 관찰되지 않음 (도 11)) 마우스의 골격근에서 Akt1의 활성화의 2, 4, 6, 8 및 10주 (w) 후에 위성 세포 증식의 증가가 관찰되었다. 트랜스젠 활성화의 2주 후에 위성 세포 증식은, 유도된 Akt를 갖는 마우스로부터의 근육 조직학적 절편에서 명백하지만 대조 마우스 (cont)에는 보이지 않는, DNA 내로의 BrdU 혼입의 면역조직화학에서 나타난다. BrdU를 포함하는 세포는 다핵이고, 근세포 주위에 위치하고, 이는 근원섬유가 위성 세포를 동원하는 것을 나타낸다 (데이타 비제시). 활성화된 위성 마커 (myo-D)에 대한 면역염색에 의한 추가의 분석에서, 이중 (동종접합) Akt 트랜스제닉 마우스는 증가된 myoD 양성 위성 세포를 보이고, 이는 대조 마우스로부터의 근육에서 검출되지 않는다 (데이타 비제시). MyoMice에서 장딴지 근육의 단면 당 약 2-4개의 MyoD-양성 위성 세포가 나타났지만, 대조 마우스로부터의 근육에서는 MyoD 세포가 검출되지 않았다 (데이타 비제시).
Akt의 유도가능 발현을 갖는 트랜스제닉 마우스, 또는 Adv-Akt를 발현하는 아데노바이러스로 형질감염된 C2C12 세포를 사용하여, Insl6은 Akt의 유도 후 마우스에서 유의하게 약 9배 상향조절되고, 또한 Adv-Akt를 발현하는 C2C12 세포에서 상향조절됨이 밝혀졌고 (도 26), 이는 인슐린-유사 6이 시험관 내 및 생체 내 모두에서 근육에서 Akt에 의해 조절됨을 나타낸다. 흥미롭게도, 다른 릴랙신 패밀리 멤버, 예를 들어 Insl3, Insl5, 릴랙신 및 Insl7은 Akt에 의해 조절되지 않는다 (도 27). 또한, 인슐린-유사 6 전사체는 Akt 발현의 유도의 2주 후에 트랜스제닉 마우스에서 극적으로 24배 상향조절되고, 아데노-myrAkt1로 형질도입한 후 C2C12 세포에서 10배 상향조절된다 (도 26). 별도의 실험에서, Insl6 발현을 근육 재생의 모델에서 분석하였고, 여기서 전경골 (TA) 근육에 심독소를 투여하면 근육 재생 및 복구를 자극하였다. Akt 및 Insl6 전사체는 모두 전경골 (TA) 근육에 심독소를 투여한 후 근육 재생 동안 상향조절된 반면, VEGF는 하향조절되고, 릴랙신 패밀리의 다른 맴버 (도 41에 도시된 바와 같이), 예를 들어 Insl3, Insl5, 릴랙신, Insl7 (릴랙신 3)은 심독소-손상된 마우스 근육에서 조절되지 않는다 (도 28).
Insl6의 기능적 역할을 조사하기 위해, 본 발명자들은 Insl6을 발현하는 아데노바이러스를 생성하고, 시험관 내에서 C2C12 세포에 대한 그의 효과를 평가하였다. 도 36은 240 MOI (감염 다중도)로 Adv-Insl6 또는 Adv-βGal로 형질감염된 C2C12에서, Adv-β-gal 형질감염된 C2C12 세포에 비해 근원섬유 비대 또는 C2C12 세포의 분화와 같은 형태학의 변화가 일어나지 않거나 (도 29A 및 29E), 근세관의 수의 증가 또는 크레아틴 키나제 발현 또는 류신 혼입의 변화가 없음을 (도 29B-E) 보여준다. 흥미롭게도, Insl6을 사용하는 상기 결과는 MSP5에 대해 관찰된 것에 대조적이다 (상기 실시예 6). 추가의 실험에서, Adv-Insl6은 골격근에서 증가된 티미딘 (3H-티미딘) 혼입 (도 30A)에 의해 나타나는 바와 같이 골격근 세포에서 위성 세포의 증식을 자극하였고, 여기에 망막모세포종 (Rb) 단백질 및 포스포릴화 Rb (p-Rb)의 증가가 수반되었다 (도 30B).
심독소 (CTX)의 근육내 주사를 이용하는 근육 재생의 생체내 모델에서, Adv-Insl6은 Adv-βGal 대조군 주사 마우스에 비해 심독소 (CTX) 손상 후 TA 근육 재생을 촉진한다 (도 31 및 32). 개선된 재생은 조직학적 절편에서 7 및 14일에 가장 두드러진다 (또한 도 32에 도시된). 또한, Insl6은 또한 심독소 (CTX)의 근육내 투여 후 염증 세포의 수를 감소시키는 그의 능력 (도 31 및 32)에 기반하여 소염 인자로서 기능하는 것으로 밝혀졌다. 7일에, Insl6 과다발현은 혈청 내로의 크레아틴 키나제의 방출을 억제하였고 (하부 좌측 패널), 이는 14일에는 관찰되지 않는다 (하부 우측 패널). 심독소 매개된 근육 퇴행의 전사체 수준의 정량 분석에서는, Adv-Insl6 형질감염된 근육에서 Insl6이 200배 증가하고 (p<0.05), Adv-Insl6 발현이 TNFα (0.2배, p<0.03) 및 TNFβ1 (0.9배, p>0.8)을 감소시키고, 콜라겐 3의 발현을 증가시키므로 (1.8배, p>0.6) (도 33), Insl6이 일부 전사체 수준에서 변화를 매개하는 것을 나타낸다.
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tccctcctcc actcaccagg gattgaggtc ccaggaggaa agggagatga 1200 acagaatctg ccctgctgtc ctcctgacat ctgcgttctt cctctgagtg gcaactactg 1260 ccttctggtg tgtcctgcct gttggtctgt ctcacgccga ttattaacta ttccactttc 1320 ccagcctgtc ttaacaaata cagattttgg aaagacctca agcaggttta aatactagag 1380 tattgacttc aggtacctga ggctggactg tcttctagaa tgccctttct cctgtcttct 1440 ctccgactcg ggagctgccc cttggcctct ctcttcctgc ctctgcttcc ttcctccagt 1500 ctccagctca ttccacatct ggagttaaga ctcaaactta gaagctccca tgatcacagt 1560 caaatagaag ggcctgtgta atgaaaatgt cagctggtct ctgacaggtg agcttgaggt 1620 ggagactttg agagaacccc agaactcctg gttccagaga cttgggctct tgggactttg 1680 ttcccctgcc ctgccctgtt cctgccacct gctgtccggc cccaccccag gaagcattac 1740 tctacagaag catttccctg gcacagtgta cgggctgagc tcccaagaga ggaacactca 1800 aaatccagct tctcagcggt gcccagagcc agcagcgccc tggtcctcgt gtgtcccatt 1860 tcagaatgac caaggggaag tggaggacaa ggaggacaag agaagcaaag ggaggtagcg 1920 tccattaaag tatagcagag ctcctgtctt cgctctggac gtcaacccta ggctatttga 1980 atgtgcccag tagctgccag gtggcgggca ctgggaagca gcctttcttg gctcaagacc 2040 agcatctctg ctctgtggct cacaagggag tggaggtcac aaaggaagac acagaaatgg 2100 agcttggaag gctccgtctc ttcccctctc cagactagga ccttgtgtgt ctcccaaggc 2160 tttgacagtt ctaggtttgc ttgcctcctc ctcagagatc tccattctcc ctcactccca 2220 agtccttacc ttccccccag gatatgaacg gttccttgaa gctctggctt aatgggtaac 2280 gtttagaaac tgtggggatt attccagctt tttagctact cctgctaaga ttcacattcc 2340 ttccccgact ctcccttttt ggacaattca gtacttattc agccttcatt gaagggcaag 2400 cttaagaaca aaaatagtcc ttcacttttg tgcagagccc tacgagatag tcttatagac 2460 gcttcatctc agccctgtga acacgctatc attactcctt ctttcagaga tgggctcgat 2520 tctggaaaca gtgttcaaac cttcattact ttgttcccag cctcatcagt attctctgat 2580 cctgcatcac ctactcccca tcctacatca cctactcccc actgatttct tctttaattc 2640 tcatgactac tgaggcatga gtgtgtaatc acatgaggga agtattcaca gggagggaac 2700 atagccggct ggggcttgct tttgtagggt tattaggatt agacaaggaa tggggctgag 2760 ctccattaat taatggcttt ttaaggagag aatttgagaa aatagacaca tttaatctga 2820 tttggaaaat gtaccatgaa tacatgtgtc aaaatatcac agtacttcac taaattaagg 2880 ggaaaagaga acagaagaca gacgggttca tacatatatt ccctgtgtct tgccatgtga 2940 agtcctatac catctcttat gcgaggaaac ctattcatca gggggcaaac tagtgttccc 3000 cacatgattt taatgctcca gagctgtgag ccaaaataaa ccatgctcaa cccggaaaaa 3060 aaaaaaaaaa a 3071 <210> 23 <211> 703 <212> DNA <213> Homo sapiens <400> 23 gcctggggtc acagggatgc cgcggctcct ccgcttgtcc ctgctgtggc ttggactcct 60 gctggttcgg ttttctcgtg aactgagcga catcagcagt gccaggaagc tgtgcggcag 120 gtacttggtg aaagaaatag aaaaactctg cggccatgcc aactggagcc agttccgttt 180 cgaggaggaa acccctttct cacggttgat tgcacaggcc tcggagaagg tcgaagccta 240 cagcccatac cagttcgaaa gcccgcaaac cgcttccccg gcccggggaa gaggcacaaa 300 cccagtgtct acttcttggg aagaagcagt aaacagttgg gaaatgcagt cactacctga 360 gtataaggat aaaaagggat attcacccct tggtaagaca agagaatttt cttcatcaca 420 taatatcaat gtatatattc atgagaatgc attttttcag aagaaacgta gaaacaaaat 480 taaaacctta agcaatttgt tttgggggca tcatccccaa agaaaacgca gaggatattc 540 agaaaagtgt tgtcttacag gatgtacaaa agaagaactt agcattgcat gtcttccata 600 tattgatttt aaaaggctaa aggaaaaaag atcatcactt gtaactaaga tatactaacc 660 atcttagaat tttttctaac ctaataaaag cttaatacat tta 703 <210> 24 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Description of Artificial Sequence: Synthetic peptide <400> 24 Gly Gly Gly Gly Cys 1 5

Claims (32)

  1. MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6 또는 그들의 상동체, 또는 그들의 발현 산물 또는 그의 기능적 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 대사 조절인자의 활성 및/또는 발현에 영향을 미치는 물질을 포함하는 제약 조성물의 유효량을 대상에게 투여하는 것을 포함하고, 세포에서 대사 조절인자의 발현 또는 그의 수준을 변화시키면 적어도 하나의 대사 기능이 조정되는 것인, 대상에서 대사 기능을 조정하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 대사 기능이 근 질량 (muscle mass), 지방량 (fat mass), 혈관신생, 체중, 인슐린 및/또는 당 감수성 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 방법.
  3. 제1항에 있어서, 물질이 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6의 작용제인 방법.
  4. 제1항에 있어서, 물질이 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6의 길항제인 방법.
  5. 제1항에 있어서, 물질이 소분자, 핵산, 핵산 유사체, 펩티드, 단백질, 리보 솜, 항체, 억제 핵산, 안티센스 올리고뉴클레오티드, RNAi, shRNA, siRNA, miRNA, 및 그의 변이체 및 단편인 방법.
  6. 제1 또는 3항에 있어서, 물질이 MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6, 또는 그의 상동체 또는 변이체의 발현 산물인 방법.
  7. 제4항에 있어서, 길항제가 소분자, 핵산, 핵산 유사체, 펩티드, 단백질, 리보솜, 항체, 억제 핵산, 안티센스 올리고뉴클레오티드, RNAi, shRNA, siRNA, miRNA, 및 그의 변이체 및 단편인 것인 방법.
  8. 제1항에 있어서, 물질이 근육을 표적으로 하는 것인 방법.
  9. 제1항에 있어서, MSP1이 핵산 서열 16 또는 그의 단편 또는 기능적 변이체 또는 상동체에 의해 코딩되는 것인 방법.
  10. 제1항에 있어서, MSP2가 핵산 서열 17 또는 그의 단편 또는 기능적 변이체 또는 상동체에 의해 코딩되는 것인 방법.
  11. 제1항에 있어서, MSP3이 핵산 서열 1 또는 서열 2 또는 그의 단편 또는 기능적 변이체 또는 상동체에 의해 코딩되는 것인 방법.
  12. 제1항에 있어서, MSP4가 핵산 서열 18 또는 그의 단편 또는 기능적 변이체 또는 상동체에 의해 코딩되는 것인 방법.
  13. 제1항에 있어서, MSP5가 핵산 서열 12 또는 그의 단편 또는 기능적 변이체 또는 상동체에 의해 코딩되는 것인 방법.
  14. 제1항에 있어서, Insl6이 핵산 서열 20 또는 그의 단편 또는 기능적 변이체 또는 상동체에 의해 코딩되는 것인 방법.
  15. 제1항에 있어서, 대상이 근육 퇴행, 인슐린-관련 질환, 근 위축, 비만 또는 혈관 손실 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되는 병태 또는 질병에 걸린 것인 방법.
  16. 제15항에 있어서, 인슐린-저항 질환이 인슐린-비의존 당뇨병 (NIDDM) 또는 인슐린-의존 당뇨병 (IDD) 또는 비만인 방법.
  17. 제1항에 있어서, 대상이 눈 신생혈관증식, 종양 혈관신생, 관절염, 망막병증, 미숙아 망막병증, 노화-관련 황반 변성, 당뇨 관련 망막병증, 건선, 죽상경화판에서 모세혈관 증식과 연관된 혈관신생으로 고통받는 것인 방법.
  18. 제1항에 있어서, 조정되는 대사 기능이 인슐린 감수성 및/또는 당 감수성 또는 체중 또는 혈관신생 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되고, 물질이 MSP3에 대한 물질인 방법.
  19. 제18항에 있어서, 대사 기능이 증가된 인슐린 감수성 및/또는 증가된 당 감수성 또는 감소된 체중 또는 증가된 혈관신생 또는 이들의 조합이고, 물질이 MSP3에 대한 작용제인 방법.
  20. 제18항에 있어서, 대사 기능이 감소된 인슐린 감수성 및/또는 감소된 당 감수성 또는 증가된 체중 또는 감소된 혈관신생 또는 이들의 조합이고, 물질이 MSP3에 대한 길항제인 방법.
  21. 제1항에 있어서, 조정되는 대사 기능이 근 질량, 비대 또는 혈관신생 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되고, 물질이 MSP5에 대한 물질인 방법.
  22. 제21항에 있어서, 대사 기능이 증가된 근 질량 및/또는 증가된 비대 및/또는 증가된 체중 및/또는 증가된 혈관신생 또는 이들의 조합이고, 물질이 MSP5에 대한 작용제인 방법.
  23. 제21항에 있어서, 대사 기능이 감소된 근 질량 및/또는 감소된 비대 및/또는 감소된 체중 및/또는 감소된 혈관신생 또는 이들의 조합이고, 물질이 MSP5에 대한 작용제인 방법.
  24. 제1항에 있어서, 조정되는 대사 기능이 근 질량 또는 근육 재생 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군에서 선택되고, 물질이 Insl6에 대한 물질인 방법.
  25. 제24항에 있어서, 대사 기능이 증가된 근 질량 또는 증가된 근육 재생 또는 증가된 체중 감소 또는 이들의 조합이고, 물질이 Insl6에 대한 작용제인 방법.
  26. 제24항에 있어서, 대사 기능이 감소된 근 질량 또는 감소된 근육 재생 또는 감소된 체중 감소 또는 이들의 조합이고, 물질이 Insl6에 대한 길항제인 방법.
  27. 대상에서 적어도 하나의 대사 기능을 조정하기 위한, MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6 또는 그의 상동체, 또는 그들의 발현 산물 또는 그의 기능적 단편으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 물질의 용도.
  28. 대상에서 적어도 하나의 대사 기능을 조정하기 위한, MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6의 작용제인 물질의 용도.
  29. 대상에서 적어도 하나의 대사 기능을 조정하기 위한, MSP1, MSP2, MSP3, MSP4, MSP5 또는 Insl6의 길항제인 물질의 용도.
  30. 제29항에 있어서, 물질이 소분자, 핵산, 핵산 유사체, 펩티드, 단백질, 리보솜, 항체, 억제 핵산, 안티센스 올리고뉴클레오티드, RNAi, shRNA, siRNA, miRNA 및 그의 변이체 및 단편인 용도.
  31. 제27, 28 및 29항 중 어느 한 항에 있어서, 대사 기능이 근 질량, 지방량, 혈관신생, 체중, 인슐린 및/또는 당 감수성 또는 이들의 조합으로 이루어지는 군 중에서 선택되는 것인 용도.
  32. 제27, 28 및 29항 중 어느 한 항에 있어서, 물질이 근육에 표적화되는 것인 용도.
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