CN105246918B - 一种生长激素促分泌激素受体相关蛋白、核酸、制备方法及其应用 - Google Patents

Abstract

胃饥饿素是一种多肽激素，它能与生长激素促分泌激素1a受体(GHS‑R1a，胃饥饿素受体)结合，促进哺乳动物发生肥胖和肥胖症。胃饥饿素与其受体作为治疗性干预的靶点，用于治疗与肥胖相关的疾病与癌症。本发明披露了一种可以在外周结合胃饥饿素的可溶性GHS‑R1a受体诱饵，能阻止胃饥饿素与细胞GHS‑R1受体结合以拮抗胃饥饿素的作用，达到了治疗肥胖有关的疾病和治疗癌症的目的。GHS‑R1a是一种跨膜蛋白，它由位于细胞膜外的N端(Nt)，7个跨膜结构和3个细胞外环状结构(EC1，EC2和EC3)连接而成。Nt、EC1和EC2连接在一起，当受体的跨膜结构缺失，并与免疫球蛋白的Fc片段融合后产生的GHS‑R1诱饵是一种新的融合蛋白GHSR‑Fc，它能对进食高脂肪饮食(HFD)的小鼠体重增加起抑制作用，并能预防其发生肥胖病，同时对Nt和ECs部分并无显著的影响。

Description

一种生长激素促分泌激素受体相关蛋白、核酸、制备方法及其 应用

本申请要求基于2013年3月14日提出的美国临时专利申请NO.61/748,267优先权的U.S.C.§119权益的PCT国际申请案，其全部内容在此并入本文作为参考。

技术领域

本发明涉及一种化合物及其应用，以用于遏制体重的过度增加、预防和治疗肥胖症及其相关疾病。

背景技术

过度肥胖是促成许多慢性疾病包括II型糖尿病、心血管疾病和癌症的危险因子(Wang&MecPherson 2011)。研究结果表明，适度地减轻体重对减轻心血管危险因子都有积极的作用(Blackburn 1995，Pi-Suneyer 1996)同时还减少了II型糖尿病及糖尿病并发症的危险(Bosello,Armellini et al 1997)。

干预生活方式是目前推荐的一线控制体重的方法，其目的是通过行为方式的改变减少卡路里的摄入和增加体力活动。但仅用这些方法与药物干预保持体重减轻相比(6-12个月)并不成功(Grey Cooper et al.2012)。很不幸，已经批准上市的大多数治疗肥胖病的这类药物由于其副作用而不再使用(Grey Cooper et al 2012)。最近，用于治疗肥胖病的肠激素获得了业界的关注(Neary&Batterham，2009)。的确，通过注射胰高血糖素类似肽-1(GLP-1)和YY肽(PYY)以作用于人类大脑进食中枢能够降低食欲(De Silva,Salem et al,2011)。另一个有前景的候选药物是来自胃的多肽激素胃饥饿素。体内循环的胃饥饿素在体内的峰值是发生在体内能量衰竭状态下，它能激活食欲、促进神经肽Y(NPY)和位于下丘脑弓状核的刺鼠基因相关多肽(AgRP)神经(Nakazato,Murakami et al.2001)。这一行为是通过胃饥饿素结合生长激素促分泌激素受体(GHS-R1a)而实现的(Kamegai,Tamura etal.2000)。除了影响食欲，胃饥饿素还能促进脂肪细胞的分化和在脂肪组织优先储存卡路里(Tschop，Smiley et al.2000,Rodriguez,Gomez-Ambrosi et al.2009)。

胃饥饿素多肽源自胃饥饿素前体，它是多肽前体通过降解产生乙酰化的胃饥饿素(AG)(Zhu，Cao et al.2006)、非乙酰化的胃饥饿素(UAG)和肥胖抑制素(Zhang，Ren etal.2005)。然而，体外实验研究表明，UAG(Kojima，Hosoda et al.1999)和肥胖抑制素(Zhang,Ren et al.2005)不能与GHS-R1a结合。GHS-R1a是G蛋白偶联的受体(Howard，Feighner et al.1996)，通过与其唯一的内源性配体AG结合而激活(Kojima,Hosoda etal.1999)。最近的一项研究表明AG与GHS-R1a受体的结合，发生于受***于细胞外的第二个环状结构(EC2)，形成的一个疏水性的口袋。胃饥饿素在与受体的结合过程中，其乙酰化疏水侧链能保持稳定(Pedretti,Villa et al.2006)。

发明内容

本发明披露了一种体内表达的GHS-R1a融合构建体，它是含有N端和细胞外结合结构域的环状结构1和环状结构2的融合蛋白(GHSR/Fc)，令人感兴趣的是它能引起AG的减少，但不影响UAG的水平，能使饮食高脂肪食物的小鼠避免体重增加，使小鼠的脂肪基因表达发生改变，葡萄糖清除率和胰岛素敏感性得到改善。观察到的这些现象表明：这种GHSR/Fc融合蛋白可能在治疗肥胖病及其相关疾病方面有临床应用价值。

一方面，本发明提供了一种可溶性的融合分子，其至少包括(a)生长激素促分泌素受体(GHS-R1a)的以下部分之一：i)N-端区域,ii)胞外环状结构1,iii)胞外环状结构2，与(b)连接到融合部分。

具体讲，可溶性的融合分子至少包含GHS-R1a的：i)N-端区域,ii)胞外环状结构1和iii)胞外环状结构2中的两个，连接到融合部分。换言之，可溶性的融合分子包含GHS-R1a的i)N-端区域，ii)胞外环状结构1和iii)胞外环状结构2连接到融合部分。更具体地讲，可溶性的融合分子是由GHS-R1a的i)N-端区域，ii)胞外环状结构1和iii)胞外环状结构2，连接到融合分子组成。

在一实施例中，GHS-R1a的N端的氨基酸序列如SEQ IDNO：4或13所示，或是其变异体。胞外环状结构1的氨基酸序列如SEQ ID NO：6或15所示，或是其变异体。胞外环状结构2的氨基酸序列如SEQ ID NO：8或17所示，或是其变异体。

在一实施例中，GHS-R1a的N端结构域由SEQ ID NO：4或13所示的核苷酸序列转录，或是由其变异体转录。胞外环状结构1的结构域由核苷酸序列SEQ ID NO：6或15转录，或是由其变异体转录。胞外环状结构2由核苷酸序列SEQ ID NO：7或16转录，或是由其变异体转录。

在一实施例中，融合分子是一段稳定性分子。该分子或为稳定性蛋白质分子或为聚合物。在一实施例中，稳定性蛋白质分子为免疫球蛋白的稳定结构域(Fc)或为白蛋白分子。在一实施例中，，Fc结构域是IgG的Fc结构域，优选IgG2或IgG4。在另一实施例中，稳定性聚合物为聚乙二醇。

本发明的可溶性融合分子可以直接或是通过一段连接肽连接不止一段的细胞外GHS-R1a的结构域，并且/或者GHS-R1a细胞外的结构域与融合结构的连接。

在一实施例中，可溶性融合分子具有如SEQ ID NO：2或11所示氨基酸序列，或是其变异体。由核苷酸序列SEQ ID NO：1或10转录，或为其变异体转录。

本发明同样提供了核苷酸分子编码的可溶性融合分子。其中a)和b)为蛋白质，由随意选取的连接肽连接。

在另一实施例中，本发明提供了通过分离提取得到的一段核苷酸序列，该序列编码GHS-R1a蛋白的N端结构域。在一实施例中，该提取的核苷酸包括核苷酸序列如序列SEQID NO：3或12所示，由其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：4或13所示。在另一实施例中，本发明提供了通过分离提取得到的一段核苷酸序列，该序列编码GHS-R1a蛋白的环状结构1的结构域。在一实施例中，该提取的核苷酸包括核苷酸序列如SEQ ID NO：5或14所示，或由其变异体组成，由其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：6或15所示，或由其变异体组成。进一步提供了通过分离提取得到的一段核苷酸序列，该序列编码GHS-R1a蛋白的环状结构2的结构域。在一实施例中，该核苷酸序列如SEQ ID NO：7或16所示，或由其变异体组成，由其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：8或17所示，或由其变异体组成。

本发明提供了一种宿主细胞含有披露的核苷酸分子

本发明进一步提供了一种药学上的组成，该组成为本发明披露的可溶性融合分子，该组成亦为本发明提供的核酸分子，该组成为本发明提供的宿主细胞，或是GHS-R1a的细胞外结构域，或是一种载体，一种药学上可接受的载体。在一实施例中，GHS-R1a的细胞外结构域可以是N端序列，也可以是环状结构1，环状结构2或是上述结构的集合。在另一实施例中，GHS-R1a的细胞外结构域是环状结构1和/或环状结构2。

另一方面，本发明提供了一种减轻过度肥胖的方法。即对有需要的动物中给以本发明提供的可溶性融合分子，给以本发明提供的核酸序列，给以本发明提供的宿主细胞，给以本发明提供的药学组成，或是给以GHS-R1a的胞外结构域以减轻过度肥胖。同样，提供如何应用本发明披露的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是应用GHS-R1a的细胞外结构域以减轻动物的过度肥胖。进一步，应用本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是应用GHS-R1a的细胞外结构域制造减少动物过度肥胖的药物。更进一步，用本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是应用GHS-R1a的细胞外结构域在有需要的动物中应用以减少动物的过度肥胖。在一实施例中，GHS-R1a的细胞外结构域是选自N端，环状结构1和/或环状结构2，或是选自上述结构的集合。在另一实施例中，GHS-R1a的胞外结构域是指环状结构2。

在一实施例中，本发明对有需要的动物提供了一种可以减少体重增加的方法。该方法包含给予本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是GHS-R1a的细胞外结构域。具体说，本发明对有需要的动物应用了本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是应用了GHS-R1a的胞外结构域。同样，提供如何应用本发明披露的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是应用GHS-R1a的细胞外结构域以减轻动物的过度肥胖。进一步，应用本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是应用GHS-R1a的细胞外结构域制造减少动物过度肥胖的药物。更进一步，本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是GHS-R1a的细胞外结构域可以面向需要减少体重的动物制造药物。在一实施例中，GHS-R1a的胞外结构域是选自N端，环状结构1和/或环状结构2，或是选自上述结构的集合。在另一实施例中，GHS-R1a的细胞外结构域是指环状结构2。

在另一实施例中，本发明提供了一种在动物中治疗肥胖病和肥胖病相关疾病的方法。该方法是用本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是用GHS-R1a的细胞外结构域。同样，提供应用本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是用GHS-R1a的胞外结构域制造药物。进一步提供的就是本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是用GHS-R1a的细胞外结构域。更进一步提供的是本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是提供GHS-R1a的细胞外结构域对需要的动物治疗肥胖病及肥胖病相关的疾病。在一实施例中，GHS-R1a的细胞外结构域是选自N端，环状结构1和/或环状结构2，或是选自上述结构的集合。在另一实施例中，GHS-R1a的细胞外结构域是指环状结构2。

在一实施例中，肥胖病相关疾病是指II型糖尿病，心血管疾病和癌症。在各种形式的癌症中与肥胖病相关的部位包括食道、乳腺、子宫内膜、结肠直肠和胰腺。因此，在一实施例中，与肥胖相关的癌症是指食道癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌以及胰腺癌。在另一实施例中，与肥胖有关的状况是指以高胆固醇、高甘油三酯和高血压为代表的代谢综合症(高血糖、高血压、高胆固醇和高甘油三酯)或多发性***(PCOS)。

在进一步实施例中，本发明提供了一种改善动物的血糖平衡和/或提高胰岛素敏感性的方法。该方法对有需要的动物给以本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是给以GHS-R1a的细胞外结构域。对有需要的动物还提供本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是GHS-R1a的胞外结构域的应用。具体说，应用本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是GHS-R1a的胞外结构域制造药物用以治疗需要改善血糖平衡和/或提高胰岛素敏感性的动物。进一步提供的是本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是GHS-R1a胞外结构域制造药物用以治疗需要改善血糖平衡和/或提高胰岛素敏感性的动物。更进一步提供的是本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是GHS-R1a胞外结构域制造药物用以治疗需要改善血糖平衡和/或提高胰岛素敏感性的动物。在一实施例中，GHS-R1a的细胞外结构域是选自N端，环状结构1和/或环状结构2，或是选自上述结构的集合。在另一实施例中，GHS-R1a的细胞外结构域是指环状结构2。

本发明所指的动物可以是任何动物，如人类。在一实施例中，动物患有II型糖尿病。

本发明的其它特性和优点通过如下的详细说明是显而易见的。其很容易理解，但是揭露本实施例的详细描述和具体例子都只能通过图解的方式给出。本发明从详细描述中揭露的精髓和范围通过各种变化和修饰将明显成为一种技术。

附图说明

本发明将以图例的形式进行说明：

图1显示了GHSR相关结构的有效性。图示全长(WT)和胞外结构域(GHSR/Fc)构件。(A)结构域由N端(Nt)、胞外结构1和2(Ec1，Ec2)和鼠免疫球蛋白IgG1恒定区(Fc)组成。使用抗Myc标签的抗体对细胞裂解液(L)和L6细胞(L)培养基进行免疫印迹反应。用GHSR/Fc表达质粒转染CHO细胞。在L6肌肉细胞转染WT和GHSR/Fc表达质粒(D图中转染细胞呈现灰色)，用鼠抗IgG-Fc抗体进行免疫荧光反应。

图2显示GHSR/Fc对体重增加量和其它代谢参数的影响。小鼠肌肉注射3次所示表达质粒。第一次基因注射后次日起喂以高脂肪饮食(HFD)，整个进食过程监控体重的变化(A)。

图3显示用抗Myc标签的抗体对实验结束前腓肠肌组织裂解液(A)和血浆(B)进行免疫印迹反应的实验结果。研究结束前检测了总AG和UAG，乙酰化AG(C)和IGF-1(D)在血液循环中的水平。数据经统计学处理Mean土SEM，*P<0.05。

图4显示GHSR/Fc对脂肪组织的影响。实验结束后，观察了GHSR/Fc处理组和对照组小鼠的腹腔脂肪垫(A)。对脂肪垫质量(B)和腓肠肌组织质量(C)进行定量分析显示GHSR/Fc处理组和对照组小鼠的储存值(B)。用实时定量PCR和标准曲线法(D)对瘦素、激素敏感性脂肪酶(HSL)、PPARy、白介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子(TNFα)对18SrRNA的mRNA相对转录水平进行定量分析。数据经统计学处理Mean土SEM，*P<0.05,**p<.001,(n＝5)。

图5显示对腹膜内葡萄糖和胰岛素耐受性实验的结果。在HFD进食前和代谢笼实验前进行葡萄糖耐受实验(IPTGG)(A)。葡萄糖耐受实验比较了GHSR/Fc处理组和对照组小鼠的曲线下面积(AUC)(B)。在实验鼠处死前进行了胰岛素耐受实验(ITT)(C)。AUC结果显示为D。数据经统计学处理Mean土SE，*P<0.05,***p<.0001,(n＝5)。

具体实施方式

本项发明的GHS-R1a融合蛋白分子是一种诱饵蛋白，含有胃饥饿素受体配体结合结构域。肌肉注射GHSR/Fc质粒减少了体内循环中的乙酰化胃饥饿素水平。当施以高脂肪饮食(HFD)，诱饵蛋白处理组小鼠较对照组体重增加量降低，并伴有腹膜脂肪累积的减少但并无肌肉质量的降低。定量RT-PCR结果显示处理组小鼠脂肪组织中PPARy和激素敏感型脂肪酶的转录水平有所增加，表明脂肪的利用增加。在GHSR/Fc处理的小鼠中，腹膜内葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性指标都有改善。因此，体内表达以GHSR为基础的融合蛋白预防了饮食引起的体重增加，改变了脂肪基因的表达，改善了葡萄糖的耐受性。

本发明表明：体内表达含有细胞外环状结构1和2(GHSR/Fc)的GHS-R1a融合蛋白分子造成乙酰化胃饥饿素(AG)的减少。然而，令人感兴趣的是并不减少非乙酰化的胃饥饿素(UAG)的水平。保护动物免受高脂肪饮食所诱发的体重增加，并伴随着脂肪基因表达的改变，葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性的改善。这些结果表明GHSR/Fc融合蛋白分子可以在临床应用以治疗肥胖病和肥胖病相关的疾病。

因此，一方面，本发明提供了一种可溶性的融合分子，其至少包括(a)生长激素促分泌素受体(GHS-R1a)的以下部分之一：i)N-端区域,ii)胞外环状结构1,iii)胞外环状结构2，与(b)连接到融合部分。

术语“生长激素促分泌激素受体”或者说GHS-R1a是指任何物种种类和来源譬如说哺乳动物，有如人类或者老鼠，以及异构体或者类似物的全长GHS-R1a的生长激素促分泌激素受体。这种受体有细胞外和细胞内的结构，如图1A所示的折叠方式，包括1个N端结构域(NTD)，3个细胞外的环状结构(EC1，EC2，EC3)和跨膜结构域。人类GHS-R1a的核苷酸序列为SEQ ID NO：18所示，编码人类GHS-R1a蛋白，国际基因库序列号Q92847。鼠科动物的GHS-R1a核苷酸序列为SEQ ID NO：9，编码鼠类GHS-R1a蛋白，国际基因库序列号Q99P50。

术语“GHS-R1a细胞外结构域”是指GHS-R1a受体缺少跨膜结构域和胞内结构域的结构部分，但包括N端结构域，胞外环状结构1和胞外环状结构2。

术语“N端”是指一段分离提取的多肽，其氨基酸序列对应GHS-R1a受体的N端细胞外区域。具体地说，N端结构域是指在跨膜结构域氨基酸序列之前的，延伸到细胞外结构域的最后一个氨基酸之间的这段序列。

术语“胞外环状结构”是指一段分离提取的蛋白，包括GHS-R1a的部分序列，在细胞膜外侧形成细胞外环状结构。人类GHS-R1a受体的氨基酸序列的102-127位点之间，以及鼠类GHS-R1a受体的氨基酸序列101-126位点之间各形成第一个环状结构，而人类182-207位点之间和鼠类181-206位点之间各形成各自GHS-R1a受体的第二个环状结构。

在一实施例中，可溶性的融合分子至少包含GHS-R1a的：i)N-端区域,ii)胞外环状结构1和iii)胞外环状结构2中的两个，连接到融合部分。换言之，可溶性的融合分子包含GHS-R1a的i)N-端区域，ii)胞外环状结构1和iii)胞外环状结构2连接到融合部分。更具体地讲，可溶性的融合分子是由GHS-R1a的i)N-端区域，ii)胞外环状结构1和iii)胞外环状结构2，连接到融合分子组成。

在一实施例中，GHS-R1a的N端氨基酸序列为SEQ ID NO：4或13,或其变异体。由核苷酸序列SEQ ID NO：3或12，或其变异体编码。胞外环状结构1的氨基酸序列为SEQ ID NO：6或15，或其变异体。由核苷酸序列SEQ ID NO：5或14，或其变异体编码。胞外环状结构2的氨基酸序列为SEQ ID NO：8或17，或其变异体。由核苷酸序列SEQ ID NO：7或16，或其变异体编码。

术语“融合分子”是指源自GHS-R1a结构域或细胞外结构域的多肽序列通过共价键或是非共价键的形式连接到融合结构。融合结构可以连接到源自GHS-R1a的多肽序列的N端或是C端。

术语“可溶性融合分子”是指融合分子缺乏任何跨膜结构域或是胞内结构域，如果在细胞内由核苷酸序列表达，该分子是分泌性蛋白。

在一实施例中，该分子是一个稳定的分子，如稳定的蛋白质或是多聚体。

术语“稳定分子”是指当该分子连接到细胞外结构域时能延长半衰期，与没有连接该分子的细胞外结构域相比，能/或减少免疫原性。

在一实施例中，稳定性蛋白为免疫球蛋白的恒定区(Fc)或是白蛋白。具体说，Fc区域是IgG的Fc结构域。如鼠IgG1,2或是4。在另一实施例中，稳定多聚体是聚乙烯醇或类似物。

在另一实施例中，可溶性融合分子由氨基酸序列SEQ ID NO：2或11，或其变异体组成。该序列由核苷酸序列SEQ ID NO：1或10，或其变异体编码。

本发明可溶性融合分子的结构域或区域可以直接或通过连接物如连接肽连接。连接肽可以是任意大小，以不影响连接区域的功能为限。在一实施例中，连接肽分子可以由1个到15个氨基酸残基组成。更具体地说可以由1到10个氨基酸组成，更明确地说，可以由1到6个氨基酸组成。当融合分子完全由多肽组成，它可以是连续序列的一部分，这样可以由编码序列翻译成单一多肽，该序列编码至少一段胞外结构域以及稳定蛋白。

在其他实施例中，本领域技术人员可以形成融合分子，例如，通过使用化学交联剂在体外连接至少2个蛋白质的结构域。

在此处，术语“蛋白质”或“多肽”是指核苷酸编码的氨基酸序列。在本专利的上下文中，本发明的多肽是指主要蛋白质的各种不同的结构形式。具体说，本发明的多肽可以是酸性盐、或是碱性盐、或是中性盐的形式。此外，每一个氨基酸残基可以通过氧化或还原的手段加以修饰。

本发明的蛋白质或是多肽可以有截断的、类似的和同系的蛋白质或多肽的形式，其基本上具有本发明披露的蛋白质或多肽的功能，即降低乙酰化胃饥饿素的能力。

这里所述的蛋白类似物可以包括，但不限于含有1个或多个氨基酸残基的置换物，***物和/或缺失物。氨基酸替换物的性质可以是保守的也可以是非保守的。保守的氨基酸替换物包括用类似性质电荷、大小和/或疏水性的氨基酸替代本发明披露的蛋白质的1个或多个氨基酸残基。当只有保守性的替换发生，得到的类似物具有相同的功能。非保守性的替换包括用电荷、大小和/疏水性不同的1个或多个氨基酸替代本发明氨基酸序列的1个或多个氨基酸残基。

保守性替代物在专利的文献中有描述。例如美国专利5264558，在中性的非极性的脂肪族氨基酸如甘氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸和异亮氨酸之间可以互换。同样，可以在中性的极性脂肪族氨基酸如丝氨酸、苏氨酸、蛋氨酸、天冬酰胺和谷氨酰胺之间进行替代。如同带电荷的碱性氨基酸赖氨酸和精氨酸可以互换一样，在带电的酸性氨基酸中天冬氨酸和谷氨酸可以互换。在芳香族氨基酸中如苯丙氨酸、组氨酸、色氨酸和酪氨酸可以互换。其它的互换也许都有可能。

这里所用的术语“变异体”是指与感兴趣的核苷酸或氨基酸序列有75％、80％、85％、90％、95％或99％的序列一致。

这里使用的术语“序列一致”是指2个氨基酸序列或者核苷酸序列一致性的百分比。确定2个氨基酸序列或核苷酸序列一致性的百分比，将2个序列最优化地对齐以进行比较。(比如，第一个氨基酸或核苷酸序列在最佳情况下比较第二个氨基酸或核苷酸序列时有可能引进间隙。)氨基酸残基或核苷酸在相对应位置的氨基酸残基或核苷酸就可以进行比较。当第一个序列的某位置与第二个序列上的相应位点被相同的氨基酸残基或是核苷酸所占据，于是在那一个位置的分子是一致的2个序列的一致性比例是指2个序列共享相同位点的数量的函数(一致性的百分比＝一致的位点数量/总的位点数量x100％)。在一实施例中，2个序列的长度是相同的。在2个序列间确定一致性的百分比同样可以运用数学法则。随意说，运用数学法则比较2个序列，Karlin&Altschul法则有无数案例(1990，PNAS，USA，87:2264-2268)，随后被Karlin&Altschul修订(1993，PNAS，USA，90:5873-5877)。这一法则已经合并到ALTSCHUL etal.的NBLAST和XBLAS程序中去(1990，J.Mol.Biol.215:403)。核苷酸BLAST检索可以用NBLAST程序，参数设定为score＝100,wordlength＝12，以获得本发明的核酸分子的核苷酸序列同系物。蛋白质的BLAST检索可以用XBLAST程序，参数设定为score＝50，wordlength＝3，以获得本发明的蛋白分子的氨基酸序列同系物。为进行比较而进行空位连配，可以利用ALTSCHUL etal.(1977，Nuecleic Acid Res.25:3389-3402)的GappedBLAST。作为一种选择，PSI-BLAST可以用来进行重复检索，该程序可以感知分子之间遥远的关系。当运用BLAST、Gapped BLAST和PSI-BLAST程序时，可以运用各个程序的默认参数(XBLAST和NBLAST)(可参考NCBI网站)。另一选择是用来对序列进行比较的数学法则是Myers&Miller(1988，CABIOS 4:11-17)，此间有无数案例。这一法则已经整合到ALIGNN程序中(2.0版)。它是GCG序列定位软件包的一部分。当使用ALIGN程序对氨基酸序列进行比较，需要使用PAM120残体重表，缺口长度12和差距分析4。运用上述的类似技术，可以确定2条序列的一致性比例。

所使用的术语“其中的片断”是指核酸或氨基酸序列由3,5,10,15,25,50,100,250,500,1000,2000,3000个感兴趣的核酸或氨基酸序列组成的连续残基。

在本专利的上下文中披露的蛋白可以包括保持生物活性的基础蛋白的各种结构形式。例如，本专利披露的蛋白可以有酸性的、碱性的和中性的形式。除此之外，个别氨基酸可以被氧化作用或是还原作用所修饰。

所引述的上述进行变更的典型方法是由Sambrook et al.(Molecular Cloning:ALaboratory Manual,2nd Ed.,Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989).所公开。

假若核酸分子编码本发明的可溶性融合分子，其中随意的分子通过连接肽将融合分子的各个结构域连接起来。

具体说，本发明披露了一种分离得到的核酸分子编码GHS-R1a的N端结构域。在一实施例中，分离得到的核酸分子如SEQ ID NO:3或12序列所示，其编码的氨基酸序列如SEQ1D NO:4或13序列所示。在另一实施例中，本发明披露了一种分离得到的核酸分子编码GHS-R1a的环状结构1结构域。分离得到的核酸分子如SEQ ID NO:5或14序列所示或是其变异体，由其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:6或15序列所示或是其变异体。本发明披露了一种分离得到的核酸分子编码GHS-R1a的环状结构2结构域。在一实施例中，分离得到的核酸分子如SEQ ID NO:7或16序列所示或是其变异体，由其编码的氨基酸序列如SEQ ID NO:8或17序列所示或是其变异体。

如同下文中应用的，术语“核酸分子”是指核苷或核苷单体序列，它们是由天然产生的碱基、核糖和糖骨架之间的连接物组成。该术语还包括由非天然发生的、经过修饰了的和替代了的序列。本发明披露的核酸序列可以是脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。并可以包括天然产生碱基腺嘌呤，鸟嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶。序列也可以含有经过修饰的碱基。经过修饰的碱基包括硫唑嘌呤、去氮腺嘌呤、去氮鸟嘌呤、去氮胞嘧啶、去氮胸腺嘧啶和去氮尿嘧啶，以及黄嘌呤和次黄嘌呤。

术语“分离得到的核酸序列”是指核酸序列不含有细胞物质或培养基成分，通过DNA重组技术得到，或者化学前体，或者通过化学合成技术获得。分离得到的核酸同样不含有与核酸两侧原本相接的原始序列(序列位于核酸的5’端和3’端)。术语“核酸”有意包括DNA和RNA，可以是双链或是单链，包括同义和反义链。进一步说，术语“核酸”包括互补核酸序列。

本发明披露的分离得到的核酸同样包括CDR序列的变异体和之前讨论过的序列的可变区部分。

变异体核酸序列包括杂交到本发明核酸序列上的核酸序列。至少适度严格的杂交条件下，核酸序列与核酸序列编码本发明披露的氨基酸序列有50％、60％、70％、80％、90％、95％、98％的同一性。

术语“序列杂交”是指在严格的杂交条件下，核酸序列可以杂交到本发明披露的核酸序列上。适度严格的杂交条件能促进杂交的发生是业内熟知的技术，对此或可以参阅Current Protocols in Molecular Biology,John Wiley&Sons,N.Y.(1989),6.3.1-6.3.6.一书。这里所谓“严格的杂交条件”是指一种选择的条件，它能选择性地促进溶液中2条互补的核酸序列发生杂交。所有或部分和核酸分子可以产生杂交。发生杂交的部分的至少50％的长度与编码多肽的多核苷酸序列发生杂交。就这一点而言，核酸双螺旋，或是杂交体的稳定性由Tm决定，该值在含有Na离子的缓冲液中是Na离子浓度、标记核酸的G/C含量、核酸探针的长度(I)以及温度(Tm＝81.50oC-16.6(Log10[Na+])+0.41(％(G+C)-600/1)的函数。因此，确定杂交稳定性的洗涤条件参数是Na离子浓度和温度两项。为识别那些相似，但不完全相同的分子，已知的核酸分子1％比例的不配对可以导致Tm值大约10C的降低。如果要找大于95％完全相同的核酸分子，最后一次漂洗温度应该降低5度。以这些考虑为基础，严格的杂交条件应定义为：在5x氯化钠/柠檬酸钠(SSC)/5x Denhardt's溶液/1.0％SDS，Tm(以上述反应式为基础)-50C，然后以0.2x SSC/0.1％SDS at 60oC.漂洗。

核酸修饰的一个例子是去准备一个类似物去替代一条序列中一个天然产生的碱基(腺嘌呤、鸟嘌呤、胞嘧啶和胸腺嘧啶)，此类似物为修改过的碱基，如黄嘌呤,次黄嘌呤、2-氨基嘌呤,6-甲基,2-丙基和其它烃基嘌呤,5-卤代嘧啶,5-环胞嘧啶,6-硫唑尿嘧啶,6-硫唑胞嘧啶和6-硫唑胸腺嘧啶、假尿嘧啶、4-硫脲嘧啶、8-卤代腺嘌呤、8-氨基腺嘌呤,8-硫羟嘌呤,8-硫羟烷基嘌呤、8-羟基嘌呤以及其它8-位取代的腺嘌呤,8-环鸟嘌呤,8-氨基鸟嘌呤、8-硫羟鸟嘌呤、,8-硫羟烷基鸟嘌呤、8-羟基鸟嘌呤，以及其它取代的鸟嘌呤、其它硫唑嘌呤的和去氮硫唑嘌呤的尿嘧啶、胸腺嘧啶、胞嘧啶、腺嘌呤或鸟嘌呤、5-三氟甲基尿嘧啶和5-氟胞嘧啶。.

修饰的另一个例子是在核酸分子之间，在其磷酸骨架中包括改良的磷酸和氧杂环分子、短链烷基、糖之间的环烷基连接、或短链的杂环原子、糖之间的杂环连接。例如，核酸序列可能含有硫代磷酸、磷酸三酯、甲基磷酸酯和二硫代磷酸酯。

修饰披露的核酸分子类似物的进一步的例子是在DNA或RNA的脱氧核糖(或核糖)的磷酸骨架中的肽核酸(PNA)被已经在多肽中发现的聚酰胺骨架取代(P.E.Nielsen,et alScience1991,254,1497)。已经显示PNA骨架对酶的降解有抵抗作用，其寿命无论在体内或体外都有延长。由于在PNA链和DNA链之间缺乏排斥作用，故PNA对互补DNA序列的会更紧密。其他的核酸类似物可能含有聚合物骨架的核苷酸、环状骨架和非环状骨架。例如，核苷酸可能含有吗啉基骨架结构(U.S.Pat.No.5,034,506)。类似物同样可以含有改善核酸序列药代动力学和药效性质的基团，如报告基团。

本发明披露的蛋白质，对技术熟练的专业人员可以用任何一种不同的方式包括可以通过无限制地使用重组技术来制备。

因此，披露的核酸分子可以以一种已知的方式结合到适宜的表达载体中以保证高表达。可能的表达载体包括但不限于粘粒、质粒和改造过的病毒(如复制有缺陷的逆转录病毒、腺病毒、腺病毒关联病毒)，只要载体与宿主细胞兼容。表达载体“适合宿主细胞转染”是指表达载体含有可用的核酸分子和以可以用来表达外源基因的宿主细胞为基础选定的调节序列，该序列已经通过操作连接到核酸分子上。操作连接是指核酸已经以一种可以表达的方式连接到调节序列上。

本发明预期重组表达质粒含有披露的核酸分子以及必要的调节序列以转录和翻译在表达质粒上的蛋白质序列。

可以从各种途径得到合适的调节序列。包括细菌、真菌、病毒、哺乳类或是***的基因(例如可以参阅Goeddel,Gene Expression Technology:Methods in Enzymology185,Academic Press,San 35Oiego,CA(1990)一书中对调节序列的描述)。选择合适的调节序列取决于选用的宿主细胞，及如以下所讨论的，并可以用本领域的常规技术完成。这种调节序列包括：转录启动子和增强子，RNA聚合酶结合序列、核糖体结合序列和翻译起始信号。此外，取决于选定的宿主细胞和表达质粒。其它序列如复制起点，附加的DNA限制性内切酶，增强子，可诱导翻译的序列也许已经整合到表达质粒上。

披露的重组表达质粒也许含有可选择的标志基因，它有助于筛选已经成功转化或转染重组分子的宿主细胞。选择性标志基因是编码像G418或潮霉素这类蛋白的基因，它们对某些特定的药物有抗药性。β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、萤火虫荧光素酶、或是免疫球蛋白、或是它的一部分，像免疫球蛋白的Fc部分，优选IgG。选择性标志基因的转录可以通过观察选择标志蛋白像β-半乳糖苷酶、氯霉素乙酰基转移酶、萤火虫荧光素酶浓度的变化。如果选择性标志基因编码的蛋白质对抗生素具有抗药性，像新霉素抗性转化株，就可以通过G418筛选得到。结合了选择性标志基因的细胞就活了下来，其他的细胞就会死亡。这就使得检测重组表达质粒的结果清晰可见。特别是要确定表达突变和显型的效果。可以引进不同的质粒表达选择性标志基因，这样就与表达感兴趣的核酸分开了。

重组表达质粒可以搭载编码融合组成成分的基因，其可以增加重组蛋白的表达量和可溶性，并在亲和层析过程中起到配体的作用有助于目标重组蛋白的纯化。例如，可以在目标重组蛋白上增加蛋白水解位点，可以使重组蛋白从融合组成成分中分离出来以便纯化重组蛋白。经典的融合表达质粒包括pGEX(Amrad Corp.,Melbourne,Australia),pMal(NewEngland Biolabs,Beverly,MA)和pRIT5(Pharmacia,Piscataway.NJ)，在重组蛋白上其各自融合了谷胱甘肽S-转移酶(GST)，麦芽糖E结合蛋白或是蛋白A。

可以将重组表达质粒引进宿主细胞产生转化了的宿主细胞。术语“转化了”、“转染了”、“转化”、“转染”都是通过业界已知的多种可能的技术完成将核酸(质粒)引入细胞的过程。这里使用的术语“转化了的宿主细胞”这里打算同样包括用发明的重组表达质粒转化可以进行糖基化的细胞。例如，将核酸转化到原核细胞是使用电转移或是氯化钙介导的转化法。例如，核酸转化到哺乳动物细胞可以通过传统技术如磷酸钙或者氯化钙共沉淀法。DEAE-右旋糖酐介导的转染、脂质体、电转移或者显微注射。转染或转化宿主细胞的合适方法可以在Sambrook et aL(Molecular Cloning:ALaboratory Manual,3rd Edition,ColdSpring Harbor Laboratory Press,2001),和其他的实验室教科书中找到。

合适的宿主细胞包括众多的真核细胞和原核细胞。例如，本发明披露的蛋白可以在酵母或是哺乳动物细胞中表达。其它适合的宿主细胞可以在Goeddel,Gene ExpressionTechnology:Methods in Enzymology 185,Academic Press,San Diego,CA(1991).一书中查找到。此外，披露的蛋白质也可以在原核细胞如大肠杆菌中表达(Zhang et al.Science303(5656):371-3(2004)).此外，以假单胞菌为基础的表达***如也可以使用荧光假单胞菌(US Patent Application Publication No.US 2005/0186666,SChneider,Jane C etal.)。

因此，这里提供的由披露的核酸分子作为组成成分的宿主细胞。

进一步提供的是本发明披露的由可溶性融合分子、或是核酸分子组成的药物组分，或是宿主细胞以及药学上可接受的载体。

可溶性的融合分子可随意地用一种有效剂量在需要的哺乳动物中减少过度肥胖。

这里使用的术语“有效剂量”是指有效的数量可以得到希望达到的效果。因此取决于组成部分和它期望的结果。虽然如此，一旦期望的结果已知，确定有效数量就是在业界专业人士的技能之内。

合适的药学上可接受的载体基本上包括化学上惰性、无毒性的物质。它不会影响药学组分生物学活性的有效性。合适的载体在Remington's Pharmaceutical Sciences(Remington's Pharmaceutical Sciences,20th ed.,Mack Publishing Company,Easton,Pa.,USA,2000)中已有阐述。适合的化学载体包括但不限于：水、生理盐水、甘油溶液、乙醇、DOTMA、DOPE、以及脂质体。这些组分含有药学有效数量的药品和适宜数量的载体可以直接提供给病人使用。

在一些实施例中，药品经配方后用于人类使用。在特定实施例中，药品配方后可以口服或静脉注射。药品还可选择采用吸入方式、直肠或非消化道方式给药，包括皮肤、皮肤内、胃内、皮内、穿透、静脉注射、肌肉注射、腹膜内注射、鼻内、***内、颊内、经皮内、皮下注射、舌下、局部或者透皮治疗。

另一方面，本发明披露了一种在动物中减少过度肥胖的方法，该方法包括给需要的动物使用本发明的可溶性融合分子、核酸分子、宿主细胞、药学组成和促生长激素分泌素受体(GHS-R1a)细胞外结构域。本发明同样提供了对动物如何应用本发明的可溶性融合分子、核酸分子、宿主细胞、药学组成和促生长激素分泌素受体(GHS-R1a)细胞外结构域。本发明进一步提供了本发明的可溶性融合分子、核酸分子、宿主细胞、药学组成和促生长激素分泌素受体(GHS-R1a)细胞外结构域来制造药物用于在动物中减少过度肥胖。更进一步，提供了本发明的可溶性融合分子、核酸分子、宿主细胞、药学组成和促生长激素分泌素受体(GHS-R1a)细胞外结构域在需要的动物中减少过度肥胖。

短语“减少过度肥胖”是指在接受治疗的对象中采用同样饮食或是类似饮食减少至少1％,2％,5％,10％,15％,20％或以上的脂肪组织数量。

在一实施例中，本发明披露了一种在动物中减少过度肥胖的方法，该方法包括给需要的动物使用本发明的可溶性融合分子、核酸分子、宿主细胞、药学组成和促生长激素分泌素受体(GHS-R1a)细胞外结构域。本发明同样提供了对有所需要的动物如何应用本发明的可溶性融合分子、核酸分子、宿主细胞、药学组成和促生长激素分泌素受体(GHS-R1a)细胞外结构域以减轻体重。本发明进一步提供了运用本发明的可溶性融合分子、核酸分子、宿主细胞、药学组成和促生长激素分泌素受体(GHS-R1a)细胞外结构域来制造药物用于在动物中减少过度肥胖。更进一步，提供了本发明的可溶性融合分子、核酸分子、宿主细胞、药学组成和促生长激素分泌素受体(GHS-R1a)细胞外结构域在需要的动物中减少过度肥胖。

短语“减少体重增加”是指在接受治疗的对象中采用同样饮食或是类似饮食减少至少1％,2％,5％,10％,15％,20％或以上的质量。

在另一实施例中，本发明披露了一种在动物中治疗肥胖病及肥胖病相关疾病的方法，该方法包括给需要的动物使用本发明的可溶性融合分子、核酸分子、宿主细胞、药学组成和促生长激素分泌素受体(GHS-R1a)细胞外结构域。本发明同样提供了对有所需要的动物如何应用本发明的可溶性融合分子、核酸分子、宿主细胞、药学组成和促生长激素分泌素受体(GHS-R1a)细胞外结构域以治疗肥胖病及肥胖病相关疾病。本发明进一步提供了运用本发明的可溶性融合分子、核酸分子、宿主细胞、药学组成和促生长激素分泌素受体(GHS-R1a)细胞外结构域来制造药物用于在动物中治疗肥胖病和肥胖病相关疾病。更进一步，提供了本发明的可溶性融合分子、核酸分子、宿主细胞、药学组成和促生长激素分泌素受体(GHS-R1a)细胞外结构域在需要的动物中用于治疗肥胖病和肥胖病相关疾病。

这里所用的术语“肥胖病”是指这种情况即患者身体脂肪积累，并不限于此，还包括早期肥胖病其身体质量系数超过25，而肥胖病一般指身体质量系数超过30(一般称作肥胖)。

短语“治疗肥胖病”包括：在相同或类似的饮食条件下比较没有进行治疗者至少减少被治疗者的脂肪质量/瘦肉质量比5％,10％,15％,20％或以上。

此处所用的术语“治疗中”“治疗”业界对此含义很清楚，即一种操作以求获益或达到好的效果。获益或是期望的临床结果可以包括但不限于减轻或改善一种或多种症状或状况，现有疾病的消失，疾病状况的稳定(不发生恶化)，防止疾病的扩散，延缓或减慢疾病的进程，改善或缓解疾病的状况(部分或是全部)。无论可以察觉或是不可以察觉，“治疗中”和“治疗”都意味着与不经过治疗相比，预期的生存期延长。此处所说的“治疗中”“治疗”同样包括预防性治疗。治疗方法对患者给以有治疗效果计量的活性药物以及灵活的、持续的单一治疗，或者选择性地包含一系列应用。治疗的持续时间取决于一系列的因素，如病情的严重程度，患者的年龄，活性药物的浓度，组成成分的活性和/或是这些因素的综合。随着特别治疗或是预防性治疗过程用于治疗或是预防的药物的有效剂量可能增加或减少，通过业界熟知的标准进行诊断检验，剂量的变化可以导致结果明显。在有的情况下，也许需要慢性病治疗。例如，对患者的药物成分的数量和用药时间要足以满足治疗的需要。

在一实施例中，肥胖病相关的疾病是II型糖尿病、心血管疾病或是癌症。在一实施例中，癌症是食道癌、乳腺癌、子宫内膜癌、结肠直肠癌和胰腺癌。

在另一实施例中，肥胖相关的状况是高胆固醇、甘油三酯、高血压代谢综合症(高血糖、高血压、高甘油三酯和高胆固醇)和多囊卵巢综合症(PCOS)。

在进一步实施例中，本发明提供了一种改善动物的血糖平衡和/或提高胰岛素敏感性的方法。该方法对需要的动物给以本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核苷酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是给以GHS-R1a的细胞外结构域。同样对需要的动物提供本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核苷酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是GHS-R1a的细胞外结构域的应用来改善动物的血糖平衡和/或提高胰岛素敏感性。进一步，应用本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核苷酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是GHS-R1a的细胞外结构域制造药物用以治疗需要改善血糖平衡和/或提高胰岛素敏感性的动物。更进一步提供的是本发明提供的可溶性融合分子，本发明提供的核苷酸序列，本发明提供的宿主细胞，本发明提供的药学组成，或是GHS-R1a的细胞外结构域在需要的动物中改善葡萄糖耐受性和/或胰岛素敏感性。

这里应用的短语“改善葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性”是指改善的代谢状态包括降低血糖水平。结果是促进胰岛素的分泌和在体内的作用。这同样是在胰岛素反应组织如肌肉、脂肪和肝脏中葡萄糖的吸收或者是利用的例证。

这里所用的术语“对象”或者“动物”包括动物界的所有成员，也包括哺乳动物，也适合人类。在一实施例中，动物患有II型糖尿病。

术语“施加其中披露的蛋白质”在这里包括对动物或是对体内或体外的细胞施加披露的蛋白，也包括施加披露的编码蛋白的核酸序列。术语“施加”同样包括对表达抗体或是抗体片段的细胞。

术语“细胞”包括单一细胞也包括多个细胞或是群体细胞。对细胞施加是指对体内或是对体外的细胞。

活性药剂或是本发明披露的药物组成可以单独使用或是与其它已知能有效减少过度肥胖或减少体重增加的药物联合应用。例如，治疗肥胖或是肥胖相关的对象，在一实施例中，本发明披露的药物组分或是活性药物与其他药物联合使用时，要同时给药。正如这里所说对象“同时施加”2种物质意味着在相同时间提供这2种物质给对象，这两种物质都是有生物活性的。给药确切的细节取决于这2种物质共同存在时的药代动力学。这可以包括在几个小时内施加这两种物质，如果药代动力学合适，也包括在施加一种物质24小时内施加另一种物质。确定合适的给药方案对业界技术熟练的专业人员而言是常规工作。在具体的实施例中，2种物质可以同时给药，即可以在短时间内先后给药，或在一种单一组分中含有两种物质。在进一步实施例中，本发明活性药物的组成以及其它药物将会以一种不会引起争论的方式提供给患者。

组分的剂量或者本发明披露的活性药物可以变化，这取决于许多因子如组分的药代动力学性质，给药的方式、年龄、健康状况、以及患者的体重、症状的性质和延续时间，给药的频率以及同时治疗的形式，即使有的话，组分在体内的清除速度。业界的一项技术可以依据上述因子确定合适的剂量。本发明组分的给药可以根据临床反应先根据需要加以调整，可以以1日1次的剂量或每日总的用药量可以分为每日2、3、4次的剂量。

本专利上述的披露一般地描述了现在的应用。可以通过下述特殊的案例作为参考加深理解。这些案例仅仅为了说明情况的目的，而不是故意去界定本发明的使用范围。形式上的改变或等值的替代仅是作为权宜之计。尽管一直以来运用了一些特殊的形式，这些形式是用来作为一种描述，而没有限制的目的。

本发明用以下这些非限制的实施例来说明

实施例

循环中的胃饥饿素的衰减可能减少卡路里的摄入促进脂肪能量的利用。这样，构建了编码GHS-R1a配体结合区域的哺乳动物表达质粒，特别是N端(Nt)和/或胞外环状结构1和2(EC1，EC2)并与鼠IgG恒定区(Fc)融合，组成了GHSR/Fc(图1A)。通过肌肉间注射和随后在小鼠腓肠肌组织电转移成功使这些融合蛋白在体内表达。融合分子省略了对应受体的跨膜结构域的序列，使GHSR/Fc的产物可以分泌到胞外。

结果

GHSR分子的有效性

首先通过质粒载体的瞬时表达(图1A)在体外条件下确认融合蛋白在大鼠骨骼肌细胞L6的表达和分泌。转染后48h，分别收获细胞及培养基并提取蛋白，使用带抗Myc标签的抗体和免疫印迹法分析。结果显示融合构建体(Nt-,Nt-EC1,and Nt-EC1-EC2,denoted asGHSR/Fc)的表达是始终在细胞裂解液和细胞培养基中检测到。而含有跨膜结构域作为对照的WT/Fc，只在细胞裂解液中发现(45kD)(图1B)。在CHO细胞中转染融合构建体在细胞培养基和细胞裂解液中也得到了相同的结果(图1C)。用抗IgG-Fc抗体的免疫细胞化学实验结果显示在转染的L6细胞中，可以检测到Nt-EC1-EC2(GHSR/Fc),Nt/Fc,EC1/Fc,和WT/Fc的表达(图1D),表明这些融合蛋白可以用哺乳动物表达***在体外表达。

在小鼠体内GHSR/Fc的效果

检查GHSR基因疗法对能量摄入和体重增加的影响，测量了注射GHSR为基础的构建物的小鼠的食物消耗和体重，并以注射Fc空载体的30只鼠作为对照。2组鼠都给以高脂肪饮食(HFD)。GHSR/Fc构建物处理组体重较对照组显著降低(图2A)，注射后30天体重开始出现差异(21.00.195g vs 23.80.433g in control,p<0.05)，直到注射后54天结束实验(23.51.36g vs 29.60.434g in control,p<0.001),(图2A)。接受Nt/Fc,Nt-EC1/Fc,或WT/Fc处理组显示体重增加有温和的减少并不足以达到统计学显著差异的程度。GHSR/Fc有N端，且具有胞外环状结构1和2，下面的分析主要集中于此。

因为之前已经证实胃饥饿素有很强的刺激食欲的作用，检测了每日食物和水的消耗，如图2B所示，GHSR/Fc处理组与对照组相比，在摄食方面没有区别，但是，GHSR/Fc处理组在饮水和排尿方面有所增加。

用免疫印迹反应检测了GHSR/Fc在体内表达的情况。在GHSR/Fc处理组每只小鼠的腓肠肌裂解液在55kDa处都检测到对应GHSR/Fc融合蛋白的条带(图3A)。更进一步，对GHSR/Fc处理鼠的细胞浆的检测也发现了55kDa的条带，但在对照组中没有检测到(图3B)。为证实胃饥饿素是否中和了处理的效应，体内循环中的AG和总胃饥饿素(主要是UAG)进行了测量。结果如图3C，GHSR/Fc的表达并没有改变总的胃饥饿素的水平(图2D处理组140.9±30.2pg/ml vs对照组140.8±37.94pg/ml)，但是显著地减少了AG的水平(图2D,处理组1.41±0.160pg/ml vs对照组2.25±0.240pg/ml,p<0.05)。最后，为强调如果减少了AG的水平是否能影响生长激素信号通道，对生长激素依赖性的***-1(IGF-1)在细胞浆内的水平进行了检测。GHSR/Fc处理组和对照组IGF-1的水平并无明显的差异(图3D)。

GHSR/Fc对脂肪组织的影响

为确定在处理组动物中重量减少的根源，检测了脂肪垫和瘦肉组织(腓肠肌和比目鱼肌)。处理组腹腔白色脂肪组织(WAT)的数量少于对照组(图4A).。通过称量各种脂肪垫定量检测了这一差异。处理组的脂肪储备明显少于对照组包括腹膜后(处理组0.476±0.12g vs对照组0.948±0.119g，p<0.001),肾周围(处理组0.44±0.19g vs对照组0.734±0.011g，p<0.05)和腹股沟脂肪垫(处理组0.396±0.067g vs对照组0.722±0.56g,p<0.05)(图4B).同等腓肠肌称重证明处理组的瘦肉质量并没有受到影响(处理组0.131±0.016gvs对照组0.109±0.011g)(图4C)。

因为减少卡路里的消耗并不影响WAT的减少,检测了上下文中几个与代谢相关基因以了解WAT mRNA表达的改变。用RT-PCR检测了内脏的WAT以考察脂肪因子瘦素(一种激素参与脂肪细胞增殖的信号),激素敏感型脂肪酶(HSL；一种催化甘油三酯转化为脂肪酸的酶)和PPARy(一种促进脂肪生成的核受体)mRNA。在WAT瘦素基因的表达水平较低(是对照组的0.10±0.14倍,p<0.05)，而HSLmRNA(是对照组的1.76±0.07倍,p<0.05)而PPARy mRNA(是对照组的3.91±0.378倍,p<0.05)表达量提高(图4D)。此外，已知在肥胖病人体内动物脂肪来源的促炎性细胞因子mRNA的水平会增高，因此在WAT中它的水平也进行了检测。在GHSR/Fc处理组白介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子α(TNFα)都较对照组减少(IL-1，2.9±1.6％,TNFα，15±7％，p<0.05)。

胃饥饿素对葡萄糖代谢的中和作用

胃饥饿素可以影响葡萄糖的稳态(Broglio,Arvat et al.2001)。为了确定GHSR/Fc对葡萄糖代谢的影响，在实验结束前对处理组和对照组小鼠进行了腹膜内的葡萄糖耐受性(IPGTT)和胰岛素耐受性实验(ITT)。处理组小鼠在注射葡萄糖10分钟(处理组14.5±1.52mmo/L vs对照组18.9±1.48mmol/L,p<0.01)和20分钟(处理组10.1±0.968mmo/L vs对照组14.2±0.989mmo/L,p<0.05)后表现葡萄糖耐受性得到了明显改善(图5B)。处理组IPGTT曲线下面积也显著地降低(处理组516±32.2vs对照组668±22.1,p<0.05)(图5C)。处理组ITT葡萄糖曲线下面积较对照组低(处理组180±19.1vs对照组230±20.3,p<0.05)。结果表明处理组增加了胰岛素的敏感性(图5D，图5E)。这些结果说明减少了进食高脂肪饮食的小鼠循环中的AG改善了胰岛素的敏感性和葡萄糖耐受性。

讨论

这项研究里，运用体内基因转移的方法使用GHSR1a为基础的融合蛋白作为”诱骗受体”促使AG在小鼠体内循环。设计了融合构建物结合了GHSR1a的胞外结构域，从而使其可以与乙酰化的胃饥饿素相互作用。该融合分子融合了IgG Fc以改善稳定性和增加复合物在循环中的半衰期(Soltani,Kumar et al.2007)。起初，用L6肌肉细胞和CHO细胞都证实了通过质粒转染，构建物在体内进行了表达并分泌。如我们期望的，在细胞培养基中没有检测到全长的WT/Fc，因为它带有疏水性跨膜结构域因此被细胞膜阻滞。进一步从注射了GHSR/Fc的动物证实了在肌肉和细胞浆内都有表达。为了证实处理组导致了体内胃饥饿素水平的变化，测量了循环中总的(AG+UAG)和乙酰化的(AG)水平。因为总的胃饥饿素水平并没有显著的不同，但处理组的AG水平却发生了显著的减少。在总胃饥饿素检测过程中AG(只占循环中的胃饥饿素的5％)都无法检测(Kokima，Hosoda et al.1999；Ariyasu,Takaya etal.2001)。在总胃饥饿素实验中没有检测到差异表明，GHSR/Fc只特异性地结合AG。

将实验动物置于高脂肪饮食来研究胃饥饿素失效对能量平衡的影响。高脂肪饮食后30天,经GHSR/Fc处理的动物与仅注射空载体的动物相比，其增重有显著的减少。GHSR/Fc处理减少的增重从74天之前做基因注射一直保持到研究结束，其增重减少超过20％。这些结果在GHSR/Fc处理的动物中增重的减少和循环中的AG的减少都与之前研究胃饥饿素的免疫中和反应实验结果相符(Zorrilla,Iwasaki et al.2006)。

编码GHSR1a(Nt/Fc)N端区域的或是环状结构1的构建体都进行了构建。这些构建体对重量能施加少许影响，与GHSR/Fc相比，影响有限。GHSR/Fc结合了GHSR1a的所有3个胞外结构域(Nt,EC1和EC2)。无需通过理论联系起来，胞外环状结构域(EC1和EC2)潜在的重要性，可以被认为是AG结合到GHS-R1a(Pedretti,Villa et al.2006)的结合位点。

尽管在体重增加方面显示了差异，但在整个研究饮食消耗的过程中，GHSR/Fc处理组和对照组并没有观察到差别。令人感兴趣的是GHSR/Fc处理组的小鼠表现了饮水量和排尿量增加。当GHSR1a结合到下丘脑弓状核，胃饥饿素对食欲的作用增加。(Cowley,Smith etal.2003)。当外周施加胃饥饿素可以观察到其透过血脑屏障(BBB)并刺激食欲(Banks,Tschop et al.2002),许多产生胃饥饿素的神经同样存在于弓状核(Kageyama,Kitamuraet al.2008)。在本项研究中,由于GHSR/Fc蛋白大小的关系,它不像是会透过血脑屏障并中和下丘脑胃饥饿素的作用。于是，无需同理论联系起来，本研究采取的战略可能仅仅去关注外周的胃饥饿素及其作用。与本研究的结果相吻合，胃饥饿素免疫中和反应研究同样发现其对食物的摄取没有影响(Zorrilla,Iwasaki et al.2006)。此外，研究胃饥饿素和GHSR1a都敲除小鼠同样发现对进食方式没有影响。相反，当喂以高脂肪食物却并不像要利用脂肪作为其能量底物(Wortley,Anderson et al.2004；Zigman,Nakano et al.2005)。与这些早期研究相一致，本研究发现脂肪垫的减少主要是发生在腹膜。

考虑到GHSR/Fc处理组小鼠的饮食摄取量并没有发生变化，脂肪质量的减少可能是AG减少的结果影响到组织的脂肪代谢。事情确实如此，最近的一项研究表明胃饥饿素直接作用于脂肪细胞以防止酯类降解(Davies,Kotokorpi et al.2009)。为确定循环中胃饥饿素水平的减少对脂肪组织所造成的影响，测量了WAT中脂肪代谢基因的mRNA表达情况。在脂肪累积过程和脂肪细胞分化的过程中产生了瘦素，GHSR/Fc处理的动物中瘦素水平较低，这一点不令人感到惊奇(Houseknecht,Baile et al.1998)。特别令人感兴趣的是HSL，在甘油三酯转变为脂肪酸的过程中起关键作用的一个酶，在处理组动物中有所增加(Yeaman2004)。脂肪酶表达的增加表明为了应对能量底物，增加了脂肪酸的动员。这支持了沃恩的发现：当处理组动物进食HFD食物时受到了保护，避免了发生肥胖症。这同样与先前对胃饥饿素KO鼠胃饥饿素所做的热量研究结果一致，小鼠优先利用脂肪作为它们的能量底物(Wortly，Anderson et al.2004)。

在处理组小鼠中同样发现PPARy mRNA的水平有所增高。这种核受体的激活能导致脂肪组织的分化与生长。有证据表明，PPARy的增加能将脂肪从内脏储备中分离出来(Laplante,Sell et al.2003)。确实如此，本研究的结果显示在GHSR/Fc处理组脂肪垫重量最显著的减少是发生在内脏储备方面。这一发现也受到其它研究的支持，即给以低剂量的胃饥饿素能引起脂肪垫重量的增加，改变脂肪细胞基因的表达，且不影响小鼠的进食(Tsubone,Masaki et al.2005)。总之，本研究的数据提示，伴随着GHSR-1a/Fc处理，循环中的AG的减少导致了脂肪储备的降低和脂肪细胞基因表达的改变。

随着GHSR/Fc处理AG的减少在进食HFD事物的小鼠中明显地改善了葡萄糖耐受性和胰岛素敏感性。这些发现与许多研究结果是一致的表明胃饥饿素能通过抑制胰脏胰岛素的释放而促进葡萄糖的稳态(Dezaki，Sone et al.2006；Dezaki，Sone et al.2008)。由于没有观察到在循环中的胰岛素水平有不同，葡萄糖清除率在GHSR/Fc处理的动物中的改善也许是由于肝脏减少了葡萄糖的产生。这一结果至少部分受到之前研究的支持，即胃饥饿素能促进肝细胞葡萄糖的产生(Gauna,Delhanty et al.2005)。此外，葡萄糖耐受性的改善也许是GHSR/Fc处理鼠内脏脂肪减少的次生效应。已知增加肥胖可以导致胰岛素抵抗，它是由脂肪储备发炎释放的促炎性细胞因子引起的(Oliver,McGillicuddy et al.2010)。

为了确定促炎性细胞因子是否介入，检测了内脏脂肪组织IL-1和TNFa的mRNA的表达情况。在GHSR/Fc处理组这两种基因的表达非常低，表明GHSR/Fc处理组胰岛素敏感性的改善与小鼠中促炎性细胞因子的减少有关。因此，以GHSR/Fc处理为例证涉及到中和循环中的胃饥饿素，以防止体重的增加和改善葡萄糖耐受性也许有助于治疗II型糖尿病。

本发明检测了GHSR/Fc处理下对其他代谢激素是否有影响。多种激素包括GLP-1,胰岛素,PYY,胰多肽和葡萄糖促胰岛素多肽在GHSR/Fc处理组都没有显著的改变。由于胃饥饿素是已知的生长激素促分泌激素(Kojima,Hosoda et al.1999)且生长激素对葡萄糖代谢和胰岛素敏感性都有影响(Moller and Jorgensen2009),研究了胃饥饿素对生长激素损耗的影响。由于生长激素在一天中都以脉动的形式发生变化，因此测量循环中的IGF-1量可以获取生长激素更稳定的数据。令人感兴趣的是，循环中的IGF-1水平并不受胃饥饿素中和的影响并看起来与体重减少和葡萄糖参数的改善无关。这与之前报告的进食HFD饮食的GHSR1a KO小鼠生长激素水平并未发生改变的结果是一致的(Zigman,Nakano etal.2005)。

总之，发明了一种新型的战略即用可分泌的以GHSR-1a为基础的融合蛋白去中和循环中的活性胃饥饿素，以降低由于进食高脂肪饮食而导致的体重增加。在这些融合构建物中，GHSR/Fc含有GHSR1a的Nt,EC1和EC2结构域，对进食高脂肪饮食的小鼠减少增重，改善胰岛素抵抗和葡萄糖耐受性方面非常有效。特别有益的是在降低脂肪和体重同时，并不影响食欲，也不影响瘦肉质量。这种处理同样改变了脂肪基因的表达，增加脂肪代谢，降低促炎症因子基因的表达。表明在鼠中将脂肪由储存转到利用。通过改善胰岛素敏感性和葡萄糖清除率，产生了次生的优异结果，因此GHSR/Fc融合蛋白可以应用到临床上治疗肥胖病和II型糖尿病。

方法

构建设计

所有胃饥饿素受体构建物都是以鼠生长激素促分泌素受体(Gene ID:208188)序列为基础设计的。用PCR扩增GHSR区域和鼠IgG Fc片段。所用引物如下：用于扩增N端区域的引物为(6mNtF)GCG GGG TAC CAT GTG GAA CGC GAC GCC A(SEQ 10NO:19)和(6mNtR)GCGAGT ACT CGC GGG GAA CAG TGG CAG CAG TTC(SEQ ID NO:20),胞外环状结构1引物(6mEC1F)GCG AAG CTT TTC CAG TTT GTC AGC GAG AGC TGC ACC TAC GCC CCC AGC GAGACC GTC ACC TGC(SEQ ID NO:21)和(6mEC1R)CGA AGC TTG CAG AGC AGG TCG CCG AAGTTC CAG GGC CGA TAC TGC CAG AGG CGC GCG GGG AAC AGT GGC AGC AGT TC(SEQ ID NO:22),胞外环状结构2(6mEC2F)GCG ACG GAT CCC CGG GAC ACC AAC GAG TGC CGC GCC ACCGAG TTC GCT GTG CGC TCT CCC AGC GAG ACC GTC ACC TGC AAC(SEQ ID NO:23)和(6mEC2R)GCGGGGATCCGTG CCG TTC TCG TGC TCC ACG CCC ACC AGC ACG GCG TAG GTG CAGCTC TCG CTG AC(SEQ ID NO:24)和鼠IgG Fc片段(mlgGF)GCG AGT ACT TGG CCC AGC GAGACC GTC ACC TGC AAC(SEQ ID NO:25)和(mlgGR)GCG CTC GAG CAG GGA AGA AGT CTG TTATCA TGC A(SEQ 10NO:26).每个胞外结构域GHSR的PCR产物用Kpnl和Scal酶切，鼠IgG Fc片段用Scal和Xhol酶切。用T4DNA连接酶将其克隆到pSecTag2B质粒(Invitrogen,ON Canada)酶切位点Kpn1和Xhol。.

类似的克隆策略用于构建含有N-端结构域、胞外环状结构1和环状结构2的鼠或人GHS-R1a质粒。

融合构建物的体外表达

为建立GHSR构建物的表达与分泌，将设计的质粒转染到鼠肌肉细胞系L6和中国仓鼠卵巢细胞系CHO。用标准方法收集40ug的细胞提取物和培养基，在12％的SDS PAGE胶进行电泳。实验结束后从处理鼠中收集和提取腓肠肌以检查基因表达情况。将蛋白质转移到PVDF膜上，用1:3000抗Myc抗体(Millipore)40C下和1:5000兔抗鼠HRP抗体于室温下处理1h。

免疫荧光显微观察

为确定转染的的GHSR蛋白的位置和表达情况，细胞系用检测Fc片段的抗IgG抗体进行免疫染色检测转染的蛋白质。将L6细胞培养在载玻片上，用4％多聚甲醛室温下固定1hr。然后用PBS漂洗3次，用5％常规马血清封闭15min，用生物素偶联的抗鼠Fc抗体室温下孵育2hr。然后漂洗细胞，用抗生物素偶联的Cy3抗体于室温下暗中孵育45min。用ZeissAxioplan 11型显微镜观察盖玻片上的细胞。

GHSR/Fc在小鼠体内的表达

C57/BI6鼠购自Jackson Laboratories(Bar Harbor,Me.,USA)。鼠饲养在控光(12h lightl12h dark)控温条件下自由进食(正常鼠粮或高脂肪鼠粮)和饮水。实验遵循加拿大动物保护协会指导原则进行并获得圣麦克医院动物关怀委员会批准。

体内表达GHSR/Fc是通过肌肉注射质粒并进行电转移进行(Soltani,Kumar etal.2007)。简言之，8周龄的C57/BI6鼠于腓肠肌注射总量50ug质粒DNA(25ug/每腿)，然后用卡钳电极(BTX,MA)施加电流：电压200V/cm 8脉冲(每脉冲20ms)间歇1s。用传导胶(aquasonic 100)传递电流。研究过程中，实验开始后的前3周每周进行一次质粒注射和电转移。

食物摄取和体重测量

从注射DNA第一天起给实验鼠喂养含有60％kCal的高脂肪食物(Research diets,North Brunswick,NJ,USA)直至54天实验结束为止。每3天称量每笼食物槽计算食物消耗量。每3天对每组实验鼠单个称重。

葡萄糖和胰岛素耐受性试验

高脂肪饮食饲养54天完成后腹膜内葡萄糖和胰岛素耐受实验。实验前动物禁食12hr。IPGTT采用快速灌注方式注射葡萄糖1.5mg/kg。ITT注射胰岛素,

0.75U/kg。经局部麻醉后(EMLA,ON Canada)每0,10,20,30,60min从鼠尾采血。Bayer Acensia Elite XL血糖仪(Bayer,ON Canada)对4-5ul的血样进行测量。

收集脂肪组织

收集双侧面的脂肪组织后立即称重来进行后期分析。腹膜的脂肪组织立即保存在液氮中以备后续提取RNA。

实时定量PCR

实验结束后收集内脏白色脂肪组织，用Trizol(Invitrogen,CA USA)提取，用酚氯仿沉淀法得到总RNA。样品用DNAase(Invitrogen)处理，依照标准方法用随机六聚体得到cDNA。使用Bio-Rad CFX热循环仪(Bio-Rad,CA USA)进行实时定量PCR。瘦素引物为(forward:CAAAACCCTCATCAAGACC(SEQ ID NO:27),reverse:TGTCTCCACCACCGAAACTC(SEQID NO:28)，激素敏感型脂肪酶(forward TGTCTCCACCACCGAAACTC(SEQ ID NO:29),reverseTCTCCAGTTGAACCAAGCAGGTCA(SEQ ID NO:30)PPARy(forward:GGAAAGACAACGGACAAATCAC(SEQ ID NO:31),reverse:ATCCTTGGCCCTCTGAGATG(SEQ ID NO:32)),IL-1(forward:TGTCTGAAGCAGCTATGGCAA(SEQ ID NO:33,reverse:TGCTGCGAGATTTGAAGCTG(SEQ ID NO:34))TNFa(forward:TGATCGGTCCCCAAAGGGAT(SEQ ID NO:35),reverse:TTGCTACGACGTGGGCTAC(SEQ ID NO:36))。用Bio-Rad CFX管理软件分析数据，以18S作为内参用标准曲线法确定相对表达量。

激素分析

实验结束时从随意喂食的小鼠中收集血样。血样盛于含有EDTA(Sarstedt,PQ)的毛细管中。用Milliplex激素分析板(Millipore,MA)测量血浆中涉及调节能量代谢的激素水平，包括；活性GLP-1,胰岛素,PYY,胰脏多肽，GIP(Millipore)。血浆中乙酰化胃饥饿素和IGF-1的水平用酶联免疫法测量(Cayman chemical,ON and Millipore,MArespectively)，总胃饥饿素水平用放射免疫法测量(Phoenix Pharmaceuticals,CA)。

统计学分析

时间跨度中增重的相对变化是采用two-way ANOVA结合Bonferroni效果测试将每组数据与对照组进行比较。多种激素试验分析每组数据并与one-way ANOVA进行比较。IPGTT和ITT的时间节点用two-way ANOVA分析。所有其它比较是将对照组与GHSR/Fc组用学生检验分析。

本发明揭示的内容以及其引用的参考文献旨在提呈作为一个例举，应该指出的是，本发明披露的内容不限于这些提呈的例证。相反，这些披露的内容旨在涵盖多样性的修饰包括如权利要求所声称范围的同等意义上的安排和内在旨意。

鉴于该申请所涉及的出版物,专利和专利申请都被特别地、或个体地引用，但真实和全面地体现了其被引用的出版物,专利或专利申请的整体观。

表一：序列

序列

鼠mNo6Nt-EC1-EC2-mIgG(核苷酸序列)(SEQ ID NO:1)

鼠mNo6Nt-EC1-EC2-mIgG氨基酸序列(SEQ ID NO:2)

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSNSESDTRRKRMWNATPSEEPEPNVTLDLDWDASPGNDSL

SDELLPLFPARLWQYRPWNFGDLLCKLFQFVSESCTVGVEHENGTDPRDTNECRATEFAV

RSGGGGSRKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDPLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEV

QFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIE

KTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKT

TPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK--RPRI

PRPRPLAN

鼠N-端区域核苷酸序列(SEQ ID NO:3)

鼠N-端区域(氨基酸序列)(SEQ ID NO:4)

MWNATPSEEPEPNVTLDLDWDASPGNDSLSDELLPLFPA

鼠EC1Domain(核苷酸序列)(SEQ ID NO:5)

鼠EC1Domain(氨基酸序列)(SEQ ID NO:6)

RLWQYRPWNFGDLLCKLFQFVSESCT

鼠EC2Domain(核苷酸序列)(SEQ ID NO:7)

鼠EC2Domain(氨基酸序列)(SEQ ID NO:8)

VGVEHENGTDPRDTNECRATEFAVRS

鼠胃饥饿素受体(核苷酸序列)(SEQ ID NO:9)

人源融合分子Human Fusion molecule(核苷酸序列)(SEQ ID NO:10)

人源融合分子Human Fusion molecule(氨基酸序列)(SEQ ID NO:11)

MDAMKRGLCCVLLLCGAVFVSNSESDTRRKRMWNATPSEEPGFNLTLADLDWDASPGNDS

LGDELLQLFPARLWQYRPWNFGDLLCKLFQFVSESCTVGVEHENGTDPWDTNECRPTEFA

VRSGGGGSRKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDPLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPE

VQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPI

EKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK

TTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK

人N-端区域(核苷酸序列)(SEQ ID NO:12)

人N-端区域(氨基酸序列)(SEQ ID NO:13)

MWNATPSEEPGFNLTLADLDWDASPGNDSLGDELLQLFPA

人EC1区域(核苷酸序列)(SEQ ID NO:14)

人EC1区域(氨基酸序列)(SEQ ID NO:15)

RLWQYRPWNFGDLLCKLFQFVSESCT

人EC2区域(核苷酸序列)(SEQ ID NO:16)

人EC2区域(氨基酸序列)(SEQ ID NO:17)

VGVEHENGTDPWDTNECRPTEFAVRS

人胃饥饿素受体(核苷酸序列)(SEQ ID NO:18)

参考文献

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Claims (12)

1.一种可溶性融合分子，从N端至C端包含：

a)由i)生长激素促分泌素受体1a的N-端区域，ii)生长激素促分泌素受体1a的胞外环状结构1和iii)生长激素促分泌素受体1a的胞外环状结构2组成，连接到

b)融合部分，其中所述融合部分为免疫球蛋白的恒定区(Fc)，

其中所述a)由序列SEQ ID NO:4、6和8组成；或者由序列SEQ ID NO:13、15和17组成；或者由序列SEQ ID NO:3、5和7所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列组成；或者由序列SEQ IDNO:12、14和16所示的核苷酸序列编码的氨基酸序列组成，

其中所述免疫球蛋白的恒定区是IgG2或IgG4的恒定区。

2.如权利要求1所述的可溶性融合分子，进一步包括连接a)和b)之间的一连接肽。

3.如权利要求1所述的可溶性融合分子，包括如SEQ ID NO:2或11所示的氨基酸序列，或者是由序列SEQ ID NO:1或10所示的核苷酸编码的氨基酸序列。

4.一种编码权利要求1-3中任一项所述的可溶性融合分子的核苷酸分子。

5.一种含有如权利要求4所述的核苷酸分子的寄主细胞。

6.一种药物组合物，包括如权利要求1-3中任一项所述的可溶性融合分子、权利要求4所述的核苷酸分子或权利要求5所述的寄主细胞、以及药学上可以接受的载体。

7.权利要求1-3中任一项所述的可溶性融合分子、权利要求4所述的核苷酸分子、权利要求5所述的寄主细胞或权利要求6所述的药物组合物在制备用于减轻动物过度肥胖的药物中的用途。

8.权利要求1-3中任一项所述的可溶性融合分子、权利要求4所述的核苷酸分子、权利要求5所述的寄主细胞或权利要求6所述的药物组合物在制备用于减少动物体重增加的药物中的用途。

9.权利要求1-3中任一项所述的融合分子、权利要求4所述的核苷酸分子、权利要求5所述的寄主细胞或权利要求6所述的药物组合物在制备用于治疗动物的肥胖症或肥胖症相关疾病的药物中的用途，其中所述肥胖症相关疾病是II型糖尿病，或是高胆固醇、高甘油三酯、高血压代谢综合症，或是多囊卵巢综合症。

10.权利要求1-3中任一项所述可溶性融合分子、权利要求4所述的核苷酸分子、权利要求5所述的寄主细胞或权利要求6所述的药物组合物在制备用于在动物中改善葡萄糖耐受性和/或胰岛素敏感性的药物中的用途。

11.如权利要求7-9中任一项所述的用途，其中所述动物罹患II型糖尿病。

12.如权利要求7-9中任一项所述的用途，其中所述动物为人类。