KR20080060226A - 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 ｓｄｆ-1의 용도 - Google Patents

신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 ｓｄｆ-1의 용도 Download PDF

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제롬 오즈시크
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라보라토리스 세로노 에스.에이.
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Abstract

본 발명은 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 SDF-1, 또는 SDF-1 활성 작용제의 용도에 관계한다.
신경 질환

Description

신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 ＳＤＦ-1의 용도{USE OF SDF-1 FOR THE TREATMENT AND/OR PREVENTION OF NEUROLOGICAL DISEASES}
전반적으로, 본 발명은 신경-염증과 연관된 신경 질환 분야에 관계한다. 더욱 구체적으로, 본 발명은 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 SDF-1의 용도에 관계한다.
신경-염증과 연관된 신경 질환.
신경-염증은 대부분의 신경 질환에 공통적인 특징이다. 많은 자극이 신경-염증을 유인하는데, 상기 염증은 뉴런(neuronal) 또는 희소돌기아교세포(oligodendroglial) 손상에 의해 유발되거나, 또는 외상, 중추신경이나 말초신경 손상 또는 바이러스나 세균 감염의 결과일 수 있다. 신경-염증의 주요한 결과는 (i) 별아교세포(astrocyte) 또는 소교세포(microglia cell)에 의한 다양한 염증성 케모킨의 분비; 및 (ii) 별아교세포 또는 소교세포(microglia)를 더욱 자극하는 부가적인 백혈구의 동원이다. 만성 신경변성 질환, 예를 들면, 다발성 경화증(MS), 알츠하이머병(AD) 또는 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)에서, 지속적인 신경-염증의 존재가 이러한 질환의 진행에 관여하는 것으로 생각된다. 신경-염증과 연관된 신경 질환은 신경 염증 질환(neurological inflammatory disease)으로 지칭될 수도 있다.
만성 신경변성 질환
만성 신경변성 질환에서, 병리는 염증 반응과 연관된다. 최근의 증거는 전신 염증이 병든 뇌에서 국소 염증에 영향을 주고, 뇌에서 염증성 사이토킨과 다른 매개인자의 과도한 합성을 유도하며, 결과적으로, 행동에 영향을 준다는 것을 암시한다(Perry, 2004). 만성 신경변성 질환에는 특히, 다발성 경화증(multiple sclerosis, MS), 알츠하이머병(Alzheimer's disease, AD), 파킨슨병(Parkinson's disease, PD), 헌팅턴병(Huntington's disease, HD), 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS), 다발성 기관 위축(multiple system atrophy (MSA), 프리온 질환(prion disease), 다운 증후군(Down Syndrome)이 포함된다.
알츠하이머병(AD)은 뇌 조직에서 변화에 기인한 정신 기능에서 악화를 수반하는 질환이다. 여기에는 혈관의 질환에 의해 유발되지 않은 뇌 조직의 수축, 원발성 퇴행성 치매(primary degenerative dementia), 미만성 뇌 위축(diffuse brain atrophy)이 포함된다. 알츠하이머병은 알츠하이머형 노인성 치매(senile dementia/Alzheimer's type, SDAT)로 불린다. 과거 10년간 획득된 상당한 증거는 신경염증이 알츠하이머병(AD) 병리와 연관한다는 결론을 뒷받침하였다(Tuppo and Arias, 2005).
파킨슨병(PD)은 떨림(shaking) 및 보행(walking), 운동(movement)과 공동작용(coordination)의 어려움으로 특성화되는 뇌질환이다. 상기 질환은 근육 운 동(muscle movement)을 통제하는 뇌 부분에 손상과 연관된다. 이는 허둥대는 마비(paralysis agitans) 또는 떨리는 마비(shaking palsy)로 불린다. 인간과 동물 연구로부터 획득된 상당한 증거는 신경염증이 PD에서 뉴런 손실(neuronal loss)에 중요한 기여자임을 암시하였다(Gao et al., 2003).
헌팅턴병(HD)은 유전된 상염색체 우성 신경 염증 질환(autosomal dominant neurological inflammatory disease)이다. 상기 질환은 일반적으로, 50세가 될 때까지 임상적으로 분명하게 나타나지 않고, 심리학적 장애(psychiatric disturbance), 비자발적 운동 장애(involuntary movement disorder) 및 전형적으로, 발병후 17년 시점에 죽음에 이르는 치명적인 진행(inexorable progression)과 연관된 인식 감퇴(cognitive decline)를 유발한다.
근위축성 측삭 경화증(ALS)은 뇌와 척수 내에서 신경 세포의 파괴로 인한 자율근육(voluntary muscle)의 신경 통제(nervous control)의 점진적인 상실을 유발하는 질환이다. 루게릭병(Lou Gehrig's disease)으로 불리는 근위축성 측삭 경화증은 근육의 이용과 통제의 상실을 수반하는 질환이다. 이들 근육을 통제하는 신경이 수축하고 소멸되는데, 이는 신경 자극(nervous stimulation)의 부재로 인한 근육 조직의 상실을 유발한다. ALS의 근본 원인이 아직 밝혀지진 않았지만, 신경염증이 ALS에서 핵심적인 역할을 수행하는 것으로 생각된다(Consilvio et al., 2004).
다발성 기관 위축(MSA)은 병인이 불명한 산발성 성인-발병 신경변성 질환이다. 상기 질환은 만성 신경변성 질환 중에서, 병인 과정(pathogenetic process)에서 희소돌기아교세포(oligodendroglial cell)에 의해 수행되는 일차적이진 않지만 주도적인 역할에 의해 독특하다. 데이터는 MSA에 대한 위험에서 염증-관련된 유전자에 대한 역할을 뒷받침한다(Infante et al., 2005). 파킨슨병과 주요한 차이점은 MSA 환자가 L-도파 치료에 반응하지 않는다는 점이다.
다발성 경화증(MS)은 재발성-완화성 또는 진행성 과정을 거치는 중추신경계(CNS)의 염증성 탈수초 질환이다. MS가 유일한 탈수초 질환인 것은 아니다. 말초신경계(PNS)에서 이의 대응물은 만성 염증성 탈수초성 다발성신경병증(CIDP)이다. 이에 더하여, PNS에서 귈레인-바레 증후군(GBS)으로 불리는 염증성 탈수초성 다발성신경병증 및 CNS에서 급성 산재성 뇌척수염(acute disseminated encephalomyelitis, ADEM)과 같은 급성 단상(monophasic) 질환이 존재한다. MS와 GBS 둘 모두 이종성 증후군(heterogeneous syndrome)이다. MS에서, 유전 인자와 함께 상이한 외인성 공격은 이러한 진단 기준을 최종적으로 충족하는 질병 과정(disease course)을 유발할 수 있다. 양쪽 질환에서, 축색돌기 손상은 원발성 탈수초성 병소에 부가되고, 영구적인 신경 결함을 유발할 수 있다. MS는 면역계의 백혈구가 중추신경계(CNS)의 백색질(white matter)에 대한 공격을 시작하는 자가면역 질환이다. 회백질(grey matter) 역시 침범될 수도 있다. MS의 정확한 병인이 아직 밝혀지진 않았지만, 기여 인자(contributing factor)에는 유전자 감염(genetic infection), 세균 감염, 바이러스 감염이 포함된다. 고전적인 징후(manifestation) (모든 사례의 85%)에서, 이는 교대로 나타나는 재발성/완화성 단계로 특성화되는데, 이는 수주 동안 지속되는 신경 장애(neurological dysfunction)와 이후 실질적인 또는 완전한 회복의 현상(episode)에 부합한다(Noseworthy, 1999). 완 화(remission) 기간이 시간의 흐름에서 점점 짧아진다. 이후, 대부분의 환자들은 부분적인 회복과 함께 또는 이러한 회복 없이, 신경 기능의 점진적인 상실로 특성화되는 최종 질병 단계(final disease phase)에 들어간다. 이는 이차 진행성 MS라 한다. 일부 환자(전체 MS 환자의 ~15%)는 발병이후 신경 기능에서 점진적이고 중단없는 감퇴가 나타난다(일차 진행성 MS).
프리온 질환과 다운 증후군 역시 신경염증을 수반하는 것으로 밝혀졌다(Eikelenboom et al., 2002; Hunter et al., 2004).
감염이후 신경 염증 질환
일부 신경병증, 예를 들면, 급성 산재성 뇌척수염은 일반적으로, 바이러스 감염 또는 바이러스 예방접종(또는 매우 드물게, 세균 예방접종) 이후에 발생하는데, 이는 상기 질환에 대한 면역학적 원인(immunologic cause)을 암시한다. 바이러스 예방접종 이후에 급성 염증성 말초 신경병증 또는 귈레인-바레 증후군은 동일한 추정된 면역병인(immunopathogenesis)을 갖는 유사한 탈수초성 질환이지만, 말초 구조에만 영향을 준다.
인간 T-세포 림프영양성 바이러스(lymphotrophic virus)에 의한 감염과 연관된 느린 진행성 척수 질환, HTLV-연관된 골수증(myelopathy)은 양쪽 다리의 경련성 약화(spastic weakness)로 특성화된다.
중추신경계 감염은 극히 심각한 감염이다; 뇌막염(meningitis)은 뇌와 척수를 둘러싸는 막에 영향을 준다; 뇌염(encephalitis)은 뇌 자체에 영향을 준다. 중추신경계(뇌와 척수)에 영향을 주는 바이러스에는 포진바이러스(herpesvirus), 아 르보바이러스(arbovirus), 콕사키바이러스(coxsackievirus), 에코바이러스(echovirus), 엔테로바이러스(enterovirus)가 포함된다. 이들 감염 중에서 일부는 뇌막(meninges)(뇌를 덮는 조직)에 주로 영향을 주고 뇌막염을 유발한다; 이부 다른 감염은 뇌에 주로 영향을 주고 뇌염을 유발한다; 대부분의 감염은 뇌막과 뇌 모두에 영향을 주고 수막뇌염(meningoencephalitis)을 유발한다. 뇌막염은 뇌염보다 어린이에서 훨씬 빈번하게 발병한다. 바이러스는 2가지 방식으로 중추신경계에 영향을 준다. 이들은 급성 발병(acute illness) 동안 세포를 직접 감염시키고 파괴한다. 감염으로부터 회복후, 이러한 감염에 대한 신체의 면역 반응이 때때로, 신경 주변의 세포에 이차적인 손상을 입힌다. 이러한 이차적인 손상(감염후성 뇌척수염, postinfectious encephalomyelitis)은 급성 발병으로부터 회복으로부터 수주 후에 어린이에서 발생한다.
손상이후 신경 질환
외상, 저산소증(hypoxia), 허혈(ischemia)을 비롯한 급성 손상에 의해 유도된 CNS 손상은 회백질과 백색질에 영향을 줄 수 있다. CNS 손상은 신경-염증을 수반한다. 가령, 외상 또는 염증이후 CNS에서 백혈구 침윤은 별아교세포에서 MCP-1 케모킨의 상향-조절에 의해 부분적으로 유인된다(Panenka et al., 2001).
외상은 신경의 손상이다. 이는 척수 외상(이러한 외상은 근육 통제(muscle control)와 감각을 비롯한 손상의 수준 이하에서 통제되는 모든 신경 기능에 영향을 주는 척수에 대한 손상이다) 또는 뇌 외상(brain trauma), 예를 들면, 폐쇄성 뇌 손상(closed head injury)에 의해 유발된 외상이다.
뇌 저산소증(cerebral hypoxia)은 뇌 반구( cerebral hemisphere)에 국한된 산소 부족이고, 더욱 전형적으로, 상기 용어는 전체 뇌에 대한 산소 부족을 지칭한다. 저산소증의 심각도에 따라, 증상은 혼란에서부터 돌이킬 수 없는 뇌 손상, 혼수, 사망까지 다양하다.
발작은 일반적으로, 뇌의 감소된 혈류(허혈)에 의해 유발된다. 이는 뇌혈관 질환 또는 사고로 불린다. 이는 뇌의 임의의 일부분에 혈액 공급이 중단되면 발생하는, 뇌 기능의 상실을 수반하는 일군의 뇌 질환이다. 뇌는 체내에서 혈액의 순환 중에서 대략 20%를 필요로 한다. 뇌에 일차적인 혈액 공급은 목에서 2개의 동맥(경동맥(carotid artery))을 통하여 달성되는데, 이들 동맥은 뇌내에서 복수의 동맥으로 분기하고, 이들 동맥 각각은 뇌의 특정 부위에 혈액을 공급한다. 혈류의 짧은 중단조차도 뇌 기능에서 감소(신경 결함)를 유발할 수 있다. 이들 증상은 영향을 받는 뇌의 부위에 따라 달라지지만, 통상적으로, 시력에서 변화, 언어 변화(speech change), 신체 일부에서 감소된 운동(decreased movement) 또는 감각, 또는 의식 수준에서 변화와 같은 문제가 포함된다. 혈류가 수초 이상 동안 감소하면, 해당 부위에서 뇌 세포가 파괴되고(경색되고) 뇌의 상기 부위에 영구적인 손상 또는 심지어, 사망을 초래한다.
외상성 신경 손상은 CNS 또는 PNS 모두에 관계된다. 외상성 뇌 손상, 또는, 간단히, 뇌 손상(head injury) 또는 폐쇄성 뇌 손상(closed head injury)은 머리에 대한 외부 타격으로 인한 뇌 손상을 지칭한다. 이는 대부분, 자동차 또는 자전거 사고 동안 발생하지만, 익수(near drowning), 심장 마비(heart attack), 발작, 감 염의 결과로써 발생할 수도 있다. 이러한 유형의 외상성 뇌 손상은 통상적으로, 뇌에 산소 또는 혈액 공급의 부족에 기인하여 발생하고, 이런 이유로, 무산소성 손상(anoxic injury)으로 지칭될 수도 있다. 뇌 손상 또는 밀폐된 뇌 손상은 자동차 사고 또는 추락에서처럼 머리에 대한 타격의 결과로써 발생한다. 외상 직후에 무의식 기간이 존재할 수도 있는데, 이러한 기간은 수분, 수주 또는 수개월 동안 지속된다. 일차적인 뇌 손상은 특히, 두개골 골절(skull fraction)이 존재하는 경우에, 주로 타격 부위에서 손상 시점에 발생한다. 대형 타박상(contusion)은 뇌내 출혈(intracerebral haemorrhage)과 연관되거나, 또는 피질 열상(cortical laceration)을 동반할 수 있다. 미만성 축색돌기 손상은 두개골 내에서 뇌의 회전 움직임(rotational movement)에 의해 유발된 뉴런 돌기(neuronal process)의 전단 변형(shearing strain)과 인장 변형(tensile strain)의 결과로써 발생한다. 축색돌기에 소형 출혈성 병소 또는 미만성 손상이 존재할 수 있는데, 이는 현미경으로만 탐지될 수 있다. 손상이후에 발생하는 합병증의 결과로써 이차적인 뇌 손상이 발생한다. 여기에는 뇌내 출혈(intracranial hemorrhage), 뇌외 동맥(extracerebral artery)에 외상성 손상, 뇌내 헤르니아 현상(intracranial herniation), 저산소성 뇌 손상(hypoxic brain damage) 또는 뇌막염(meningitis)이 포함된다.
척수 손상은 하반신 불수(paraplegia)와 사지마비(tetraplegia)에 대한 병원 입원의 대부분을 차지한다. 80% 이상이 도로 사고(road accident)의 결과로써 발생한다. 손상의 2가지 주요한 그룹이 임상적으로 인정된다: 개방성 손상(open injury)과 폐쇄성 손상(closed injury). 개방성 손상은 척수와 신경근(nerve root) 의 직접적인 외상을 유발한다. 관통상(perforating injury)은 광범위한 파괴와 출혈을 유발할 수 있다. 폐쇄성 손상은 대부분의 척추 손상을 차지하고, 통상적으로, 척주(spinal column)의 골절(fracture)/탈구(dislocation)와 연관하는데, 이는 방사성물질에 의해 확인될 수 있다. 척수에 손상은 뼈 손상의 정도에 좌우되고, 2가지 주요 단계에서 고려될 수 있다: 타박상, 신경 섬유 절단(nerve fibre transection)과 출혈성 괴사(hemorrhagic necrosis)가 나타나는 일차 손상 및 경막상 혈종(extradural heamatoma), 경색(infarction), 감염과 부종이 나타나는 이차 손상.
외상은 단일 신경에 대한 국소 손상의 가장 일반적인 원인이다. 격렬한 근육 활동 또는 관절의 강제적인 과대확장(overextension)은 반복된 소형 외상(가령, 작은 도구의 꽉 움켜지기(tight gripping), 공기 해머(air hammer)로부터 과도한 진동)에서처럼 국소 신경병증을 유발할 수 있다. 압력 마비(pressure paralysis) 또는 함정 마비(entrapment paralysis)는 통상적으로, 뼈 돌출(bony prominence)(가령, 깊은 수명 동안 또는 종종, 알코올 중독된 야윈 또는 악액질 개체에서 마취 동안)에서, 또는 좁은 도관(가령, 수근 터널 증후군(carpal tunnel syndrome))에서, 표면 신경(superficial nerve)(척골(ulnar), 요골(radial), 종아리뼈(peroneal))에 영향을 준다. 압력 마비는 또한, 종양, 골형성 과다증(bony hyperostosis), 석고붕대(cast), 목발(crutch), 또는 장기적인 불편한 자세(가령, 조경에서)로부터 발생할 수도 있다. 외상성 손상은 외과적 절차 동안 발생할 수도 있다.
말초 신경병증
말초 신경병증은 단독으로 또는 임의의 조합으로, 감각 상실(sensory loss), 근육약화와 위축, 감소된 심부건반사(deep tendon reflex), 혈관운동 증상(vasomotor symptom)의 증후군이다. 말초 신경병증은 왈러 변성(Wallerian degeneration)으로 지칭되는 과정인 축색돌기 변성(axonal degeneration)과 연관한다. 신경-염증은 왈러 변성에서 일정한 역할을 수행한다(Stoll et al., 2002).
상기 질환은 단일 신경(단일신경병증), 독립된 부위에서 2개 이상의 신경(다발성 단일신경병증), 또는 동시에 여러 신경(다발신경병증)에 영향을 준다. 축색돌기(가령, 당뇨병(diabetes mellitus), 라임병(Lyme disease) 또는 요독증(uremia)에서, 또는 독성 물질(toxic agent)에 의해), 또는 미엘린 수초(myelin sheath) 또는 슈반 세포(Schwann cell)(가령, 급성이나 만성 염증성 다발신경병증, 백색질장애(leukodystrophy), 또는 귈레인-바레 증후군에서)가 일차적인 영향을 받는다. 무수 섬유(unmyelinated fiber)와 수초화 섬유에 대한 손상은 일차적으로, 온도와 통증 감각의 상실을 유발한다; 대형 수초화 섬유에 대한 손상은 운동신경 또는 자기수용(proprioceptive) 결함을 유발한다. 일부 신경병증(가령, 납 독성(lead toxicity), 댑손(dapsone) 이용, 라임병(진드기 물림(tick bite)에 의해 유발됨), 포르피린증(porphyria), 또는 귈레인-바레 증후군에 기인함)은 일차적으로, 운동신경 섬유(motor fiber)에 영향을 준다; 다른 신경병증(가령, 암의 뒤뿌리 신경절염(dorsal root ganglionitis), 나병(leprosy), AIDS, 당뇨병, 또는 만성 피리독신 중독(chronic pyridoxine intoxication)에 기인함)은 일차적으로, 뒤뿌리 신경절(dorsal root ganglia) 또는 감각 섬유(sensory fiber)에 영향을 주고, 감각 증 상(sensory symptom)을 유발한다. 가끔, 뇌신경(cranial nerve) 역시 관련된다(가령, 귈레인-바레 증후군, 라임병, 당뇨병, 디프테리아에서). 관련된 양식의 확인은 원인을 결정하는데 도움이 된다.
다발성 단일신경병증은 통상적으로, 콜라겐 혈관 질환(collagen vascular disorder)(가령, 결절성 다발동맥염(polyarteritis nodosa), SLE, 쇼그렌 증후군, RA), 유육종증(sarcoidosis), 물질대사 장애(가령, 당뇨병, 아밀로이드증), 또는 감염성 질환(가령, 라임병, HIV 감염)에 종속적이다. 미생물이 신경의 직접적인 침입(가령, 나병에서)으로 다발성 단일신경병증을 유발할 수도 있다.
급성 열성 질환(acute febrile disease)에 기인한 다발신경병증은 독소(가령, 디프테리아에서) 또는 자가면역반응(가령, 귈레인-바레 증후군에서)으로부터 발생된다; 때때로, 면역접종(immunization) 이후에 발생하는 다발신경병증은 아마도, 자가면역성이다.
독성 물질은 일반적으로, 다발신경병증을 유발하지만 가끔, 단일신경병증을 유발한다. 여기에는 이메틴(emetine), 헥소바르비탈(hexobarbital), 바르비탈(barbital), 클로로부탄올(chlorobutanol), 설폰아마이드(sulfonamide), 페니토인(phenytoin), 니트로푸란토인(nitrofurantoin), 빈카 알칼로이드(vinca alkaloid), 중금속(heavy metal), 일산화탄소(carbon monoxide), 트리오르토크레실 포스페이트(triorthocresyl phosphate), 오르토디니트로페놀(orthodinitrophenol), 여러 용제, 다른 산업용 독물, 특정의 AIDS 약제(가령, 잘시타빈(zalcitabine), 디다노신(didanosine))가 포함된다.
화학요법-유도된 신경병증은 빈카 알칼로이드(빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine)), 백금-포함 약제(시스플라틴(cisplatin)), 탁산(Taxane)(파클리탁셀(paclitaxel))을 비롯한 통상적으로 이용되는 여러 화학요법제의 명백하고 심각한 부작용이다. 말초 신경병증의 유도는 화학치료제로 치료를 제한하는 공통 인자이다.
영양 결핍과 물질대사 장애는 다발신경병증을 유발할 수 있다. B 비타민 결핍이 종종, 원인이 된다(가령, 알코올중독, 각기(beriberi), 악성 빈혈(pernicious anemia), 이소니아지드(isoniazid)-유도된 피리독신 결핍, 흡수장애 증후군(malabsorption syndrome), 임신오조(hyperemesis gravidarum)에서). 다발신경병증은 갑상선기능저하증(hypothyroidism), 피린증(porphyria), 유육종증, 아밀로이드증, 요독증에서도 발생한다. 당뇨병은 감각운동 원위부 다발신경병증(대부분의 경우), 다발성 단일신경병증, 국소성 단일신경병증(가령, 안구운동(oculomotor) 신경 또는 외전 뇌(abducens cranial) 신경에서)을 유발할 수 있다.
물질대사 장애(가령, 당뇨병) 또는 신부전(renal failure)에 기인한 다발신경병증은 종종, 수개월 또는 수년에 걸쳐 느리게 진행된다. 이는 빈번하게, 근위보다는 원위에서 더욱 심한 하지(lower extremity) 감각 이상으로 시작된다. 말초 따끔거림(tingling), 무감각(numbness), 작열통(burning pain), 또는 관절 자기수용(joint proprioception)에서 결핍 및 진동 감각(vibratory sensation)이 종종, 현저하다. 통증은 종종, 야간에 더욱 심하고, 병든 부위를 접촉함으로써 또는 온도 변화에 의해 악화될 수 있다. 심한 경우에, 전형적으로 stocking-and-glove 분포로 감각 상실(sensory loss)의 객관적인 징후가 나타난다. 아킬레스(Achilles)와 다른 심부건반사(deep tendon reflex)는 감소하거나 부재한다. 감각 상실이 현저한 경우에 손가락 또는 샤르코 관절(Charcot's joint)에서 무통증 궤양이 발생할 수도 있다. 감각 또는 자기수용 결함은 걸음걸이 이상(gait abnormality)을 유발한다. 운동신경 침범(motor involvement)은 원위 근육 약화와 위축을 유발한다. 자율신경계(autonomic nervous system)는 부가적으로 또는 선택적으로 침범되고, 야행성 설사(nocturnal diarrhea), 대소변 실금(urinary and fecal incontinence), 불임(impotence), 또는 체위성 저혈압(postural hypotension)을 유발한다. 혈관운동 증상은 드물게 발생한다. 피부가 정상보다 더욱 창백해지고 건조되며, 때때로 거무스름한 변색(dusky discoloration)이 나타난다; 발한(sweating)이 과도할 수도 있다. 심한 장기적인 사례에서, 영양 변화(trophic change)(부드럽고 번들거리는 피부, 얽은 자국이 있거나 융기된 손발톱, 골다공증(osteoporosis))가 공통적으로 나타난다.
영양성 다발신경병증은 알코올중독자와 영양실조자에서 흔히 발생한다. 일차적인 축삭병증(primary axonopathy)은 가장 크고 긴 신경에서 이차적인 탈수초화와 축색돌기 파괴를 유발한다. 이의 원인이 티아민(thiamine) 또는 다른 비타민(가령, 피리독신(pyridoxine), 판토텐산(pantothenic acid), 엽산(folic acid))의 결핍인지는 분명하지 않다. 피리독신 결핍에 기이한 신경병증은 통상적으로, 결핵(tuberculosis) 치료를 위하여 이소니아지드를 복용하는 개체에서만 발생한다; 피리독신이 결핍되거나 이에 의존하는 유아는 경련을 보일 수도 있다. 원위 사지의 소모(wasting)와 대칭성 약화(symmetric weakness)는 통상적으로 잠행성(insidious)이지만 급속하게 진행될 수 있고, 때때로 감각 상실, 감각 이상(paresthesias), 통증을 동반한다. 치통(aching), 복통(cramping), 한기(coldness), 작열감(burning), 종아리와 발에서 무감각이 접촉에 의해 악화될 수 있다. 병인이 불명한 경우에 복합 비타민이 제공될 수 있긴 하지만, 이들의 효능은 입증된 바가 없다.
유전성 신경병증은 감각운동 신경병증 또는 감각 신경병증으로 분류된다. 샤르코-마리-투스병(Charcot-Marie-Tooth disease)은 가장 일반적인 유전성 감각운동 신경병증이다. 빈도가 덜한 감각운동 신경병증은 출생 시점에 시작되고 더욱 심한 무능력(disability)을 유발한다. 드물게 발생하는 감각 신경병증에서는 진동과 위치 감각의 상실보다 원위 통증과 온도 감각의 상실이 더욱 현저하다. 중요한 문제점은 빈번한 감염과 골수염(osteomyelitis)과 함께, 통증 무감각(pain insensitivity)에 기인한 수족 절단(pedal mutilation)이다. 유전성 신경병증에는 비후성 간질성 신경병증(hypertrophic interstitial neuropathy)과 데제린-소타스병(Dejerine-Sottas disease) 역시 포함된다.
악성 종양 역시 단클론성 감마병증(monoclonal gammopathy)(다발성 골수종(multiple myeloma), 림프종(lymphoma)), 아밀로이드 침입(amyloid invasion), 또는 영양 결핍을 통하여 또는 부종양성 증후군(paraneoplastic syndrome)으로서 다발신경병증을 유발할 수 있다.
다양한 병인, 예를 들면, 감염성 병원균 또는 자가면역 공격의 모든 신경 염 증 질환은 신경 기능의 상실을 유발하고, 마비와 죽음을 초래할 수도 있다. 일부 신경 염증 질환에서 염증 공격을 감소시키는 몇몇 치료제가 가용하긴 하지만, 신경 기능의 회복을 결과할 수 있는 새로운 치료제를 개발하는 것이 필요하다.
SDF-1
케모킨(주화성 사이토킨)은 basal trafficking과 염증 반응 모두에 관여하고, 일차적으로 백혈구 주화인자(chemoattractant)와 활성자로서 기능하는 7개의 막통과 G 단백질-결합된 수용체를 활성화시키는 소형(8-10 kDa) 사이토킨의 대과(superfamily)를 구성한다.
간질 세포(stromal cell)-유래된 인자-1α, SDF-1α 및 이의 2개의 동소체(β,γ)는 인터크린(intercrine) 계통에 속하는 소형 주화성 사이토킨인데, 이의 구성원들은 백혈구를 활성화시키고 종종, 리포폴리사카라이드, TNF, 또는 IL-1과 같은 친염증성 자극에 의해 유도된다. 이들 인터크린은 4개의 보존된 시스테인의 존재로 특성화되는데, 이들 시스테인은 2개의 이황화 결합을 형성한다. 이들은 2개의 소과(subfamily)로 분류될 수 있다. 베타 케모킨을 비롯한 CC 소과에서, 이들 시스테인 잔기는 서로 인접한다. 알파 케모킨을 비롯한 CXC 소과에서, 이들은 개재 아미노산(intervening amino acid)에 의해 독립된다. SDF-1 단백질은 후자 그룹에 속한다. SDF-1은 CXCR4(LESTR/fusin) 케모킨 수용체의 자연 리간드이다. 이들 알파, 베타, 감마 동소체는 단일 유전자의 대안적 절단접합의 결과이다. 알파 형태는 엑손 1-3으로부터 유래되는 반면, 베타 형태는 엑손 4로부터 부가적인 서열을 보유한다. SDF-1γ의 첫 3개의 엑손은 SDF-1α와 SDF-1β의 대응하는 엑손에 일치한다. SDF-1γ의 네 번째 엑손은 SDF-1 좌위(locus) 상에서 세 번째 엑손으로부터 3200 bp 하류에 위치하고, SDF-1β의 세 번째 엑손과 네 번째 엑손 사이에 존재한다.
3개의 새로운 SDF-1 동소체, SDF-1델타, SDF-1엡실론과 SDF-1파이가 최근에 보고되었다(Yu et al., 2006). SDF-1δ 동소체는 SDF-1α 개방해독틀(open reading frame)의 최종 코돈에서 대안적으로 절단접합되고, 731개의 염기쌍 인트론을 산출하며, SDF-1α의 말단 엑손이 2 부분으로 분할된다. SDF-1ε과 SDF-1φ의 첫 3개의 엑손은 SDF-1β와 SDF-1γ 동소체의 대응하는 엑손에 100% 일치한다.
SDF-1 유전자는 혈액 세포를 제외하고 편재적으로 발현되고, 시험관내에서 림프구와 단핵구에는 작용하지만 호중구에는 작용하지 않으며, 생체내에서 단핵 세포에 대한 매우 강력한 주화인자이다. 시험관내와 생체내에서, SDF는 또한, CD34를 발현하는 인간 조혈 전구체 세포(human hematopoietic progenitor cell)에 대한 주화인자로서 기능한다.
SDF-1과 이의 수용체, CXCR4는 조혈계(hematopoietic system)와 신경계(nervous system)에서 본질적인 기능을 수행하는데, 그 이유는 상기 리간드 또는 수용체의 결실이 비정상적인 CNS 발달로 인하여 태아에 치명적이기 때문이다(Ma et al., 1998; Zou et al., 1998).
SDF-1 α는 수용체 CXCR4와의 상호작용을 통하여, 인간 hNT 신경 세포주에서 아폽토시스(apoptosis)에 의한 세포 사멸을 직접적으로 유도할 수 있는데, 상기 세포주는 미성숙 유사분열후 콜린성 뉴런과 유사하고 다수의 뉴런 특성을 보유한다(Hesselgesser et al., 1998).
발달 중인 중추신경계와 성숙 중추신경계에서 SDF-1의 역할은 Lazarini 등(Lazarini et al., 2003)에 의해 검토되었다.
케모킨은 CNS 내에서 신경-염증에 명백하게 관여하지만, 이들의 활성은 신경상피 세포(neuroepithelial cell)(뉴런, 별아교세포, 희소돌기아교세포 포함)에 대해 직접적으로, 생물학적으로 중요한 펩티드로서 역할까지 확대된다. 특히, 케모킨은 예로써, GRO-α/CXCL1에 의해 예시되는 희소돌기아교세포 전구체(oligodendrocyte precursor, OLP)의 증식(Robinson et al., 1998), SDF-1α의 경우에 소뇌 과립 세포(cerebellar granule cell)의 조직화(Zhu et al., 2002), 프렉탈카인(fractalkine)/CX3CL1에 의해 예시되는 소교세포의 활성화 상태(Zujovic et al., 2000)에 영향을 준다. 따라서, 면역계와 신경계 패러다임 모두에서, 케모킨은 증식, 이동, 활성화, 차별화의 조절을 비롯한 넓은 범위의 유사한 활성을 수행할 수 있다.
대부분의 케모킨과 케모킨 수용체는 CNS 내에서, 본질적으로 발현되거나, 또는 염증 매개인자(inflammatory mediator)에 의해 유도된다. 이들은 다발성 경화증(MS)을 비롯한 다양한 신경병리학적 과정(neuropathological process)에 관여한다(Bajetto et al., 2001; Sorensen et al., 2002).
뇌 상피 세포에서 SDF-1의 발현은 면역 세포의 허혈성 CNS로의 동원에 긍정적인 것으로 밝혀졌는데(Stumm et al., 2002), 이는 신경염증에서 SDF-1의 유해한 역할을 암시한다. 후천성 면역결핍 증후군 치매(AIDS dementia)의 배경에서, SDF-1은 gp120 유도된 시험관내 신경염증 모형에서, 활성화된 소교세포에 의한 TNFα생 산 및 별아교세포에 의한 글루타민산염(glutamate) 방출을 촉진함으로써 신경독증(neurotoxicity)을 유도하는 것으로 보고되었다(Bezzi et al., 2001; Sorensen et al., 2002). 최근의 한 간행물에서는 별아교세포 내에서 MS 병소의 SDF-1α 발현을 기술하였다(Ambrosini et al., 2005).
쥐에서 실험적 알레르기 뇌척수염(experimental allergic encephalomyelitis, EAE)의 유도는 CXCR4를 비롯한 다양한 케모킨 수용체의 증가된 수준을 동반하였다(Jiang et al., 1998).
WO00/09152에서, CXCR4 길항제는 자가면역 질환의 치료, 다발성 경화증의 치료, 암의 치료, 혈관생성(angiogenesis)의 저해에 유용한 것으로 기술되었다.
WO99/50461에서는 CXCR4 활성을 촉진하거나 저해하는 화합물을 투여함으로써 비정상적인 세포 증식 또는 결함성 세포 증식을 수반하는 질환의 치료 방법을 기술한다.
CXCR4 기능의 저해물질은 암의 치료에 청구되고, 이들 수용체 작용제의 이용은 세포 증식이 결핍되거나 요구되는 질환의 치료에 청구되었다. 세포 증식이 결함되는 질환에는 신경계의 일부가 다발성 경화증을 비롯한 탈수초 질환에 의해 파괴되거나 손상되는 신경계의 탈수초성 병소 및 말초 신경계의 병소가 포함된다.
신경 질환에서 CXCR4/SDF-1 길항제의 치료적 이용 역시 제안되었다. EP657468B1에서, SDF-1의 이용이 조혈 세포(hematopoietic cell)의 과소 또는 병적 증식, 뉴런 강화 또는 우울증, 뉴런 손상의 예방 또는 치료에 관련된 질환의 치료에 제안되었다.
WO03/062273에서, SDF-1 신호전달 경로의 저해물질이 염증 치료에 제안되었다. 기술된 이러한 치료적 이용에는 CNS 또는 임의의 다른 장기에서, 면역 및/또는 염증 억제가 유익한 자가면역 질환 또는 이상 또는 장애, 만성 신경병증 또는 귈레인 바레 증후군(Guillain Barre syndrome)과 연관된 염증이 포함된다.
Gleichmann 등은 말초 신경 병소후 SDF-1-beta mRNA 발현에서 약간의 일시적인 증가를 보고하였다. 이들은 그들의 조사 결과가 신경계의 발달과 손상과 같은 상이한 생리 상태에서 SDF-1 동소체에 대한 차별적 발현 패턴을 최초로 증명한다고 결론하였다(Gleichmann et al., 2000).
SDF-1은 프로테오글리칸(proteoglycan, PG)으로 총칭되는 여러 단백질에 번역후 부가되는 매우 가변성의 분기된 당 기, 글리코사미노글리칸(GAG)과 상호작용할 수 있다. 이들 단백질은 세포막 상에, 세포외 기질(extracellular matrix) 내에, 그리고 혈류 내에 존재하는데, 여기에는 분리된 GAG 역시 존재할 수 있다. PG, 또는 분리된 GAG는 가용성 분자와 복합체를 형성하고, 아마도 세포외 환경(extracellular environment)에서 이들 분자를 단백분해(proteolysis)로부터 보호할 수 있다. 또한, GAG는 세포 신호전달 분자를 그들의 특이적인 수용체로 정확하게 전시하는데 도움을 주고, 궁극적으로, 표적 세포 활성화(target cell activation)를 조절하는데 도움을 주는 것으로 제안되었다.
케모킨의 경우에, 염증 부위에서 고정된 구배로의 농축 및 결과로써, 세포 수용체와의 상호작용과 그들의 활성화 상태는 상이한 형태의 GAG에 의해 조절되는 것으로 보인다(Hoogewerf et al., 1997). 이런 이유로, 이들 상호작용의 조절은 염 증 질환에서 치료적 접근을 대표하는 것으로 제안되었다(Schwarz and Wells, 1999).
변형된 SDF-1α, SDF-1 3/6은 잔기 Lys24, His25, Lys27의 염기성 클러스터(basic cluster)의 Ser에 의한 통합적 치환에 의해 산출되었다(Amara et al., 1999). 상기 돌연변이체는 헤파린 황산염(heparan sulfate)에 결합할 수 없었지만 CXCR4에 결합하고 이를 활성화시키는 능력을 유지하였다. 다른 연구에서는 동일한 도메인 내에서 단일 돌연변이의 효과를 조사하고, SDF-1α 헤파린 복합체를 특성화하였다(Sadir et al., 2001). Sadir 등은 또한, 글리코사미노글리칸 결합에서 잔기 Arg41과 Lys43의 관여를 제안하였다.
본 발명의 요약
본 발명의 목적은 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 신규한 수단을 제공하는 것이다.
본 발명의 배경에서, SDF-1α, Met-SDF-1α 또는 SDF-1α 변이체의 투여가 말초 신경 질환의 생체내 동물 모형에서 유익한 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다. SDF-1α과 이의 변이체는 또한, 염증 모형인 LPS 유도된 TNF-a 방출 동물 모형에서 TNF-a와 IL-6을 저해하는 것으로 밝혀졌다.
따라서, 본 명세서에 제시된 실험적 증거는 신경 질환, 특히, 뉴런과 신경교세포(glial cell) 기능에 연관된 신경 질환 및 신경-염증을 치료하는 새로운 가능성을 제공한다.
이런 이유로, 본 발명은 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조 에서 SDF-1 또는 SDF-1 활성 작용제의 용도에 관계한다.
본 발명에 따라, SDF-1은 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위하여 인터페론 또는 오스테오폰틴 또는 클루스테린과 병용될 수도 있다. 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 핵산 분자, SDF-1을 포함하는 발현 벡터, SDF-1을 발현하는 세포의 용도 역시 본 발명에 포함된다.
본 발명에서는 더 나아가, 선택적으로 하나이상의 제약학적으로 수용가능한 부형제와 함께, SDF-1 및 인터페론 또는 오스테오폰틴 또는 클루스테린을 함유하는 제약학적 조성물을 제시한다.
도 1에서는 37℃에서 3시간 동안 0.001, 0.1, 10 ng/㎖의 SDF-1α(1.A) 또는 SDF-1α 변이체(1.B)와 함께 배양되고, 이후 48시간 동안 5 ng/㎖의 LPS로 보충된 세포 배양액의 D14에서 혼합된 피질 배양액(cortical culture)의 TNF-α와 IL-6 함량(pg/㎖)을 도시한다. 상층액은 D16에서 수집되고, TNF-α와 IL-6의 특이적인 ELISA를 통하여 측정되었다. 양성 대조로서, 배양액은 25 pM의 덱사메타손(dexamethasone)(Dexa) 또는 10 ng/㎖의 IL-10으로 처리되거나, 또는 처리되지 않았다. 음성 대조로서, 배양액은 LPS 단독으로 처리되었다.
도 2에서는 200 ㎕ NaCl(0.9%, LPS 없음; 기선), 또는 200 ㎕ NaCl(0.9%, LPS 없음)에 희석된 4 ㎍의 SDF-1α 또는 SDF-1α 변이체의 복막내 주입(intraperitoneal injection)후 4시 시점에 복막 강(peritoneal cavity)에 동원 된 세포의 평균 총수 x 106 ㅁ s.e를 도시한다.
도 3에서는 처리되지 않은 생쥐(대조)와 비교하여, 만성 단계의 EAE를 앓는 생쥐로부터 절제된 척수 추출물의 전체 단백질(microgram)당 SDF-1α 함량(picogram)(pg/㎍)을 도시한다.
도 4에서는 좌골 신경 분쇄후, 운반제(식염수/0.02% BSA), 3, 10, 30, 또는 100 ㎍/㎏ s.c.의 SDF-1α 및 30 ㎍/㎏의 참고(양성) 대조 화합물(IL-6)로 치료된 생쥐의 전기생리학적(electrophysiological) 기록을 도시한다. 기선: 운반제 처리된 동물의 반대쪽에서 기록된 수치. 기록은 병소후 D7, D15, D22(dpl)에서 수행하였다.
4.A에서는 합근 활동 전위(compound muscle action potential)의 진폭(mV)을 도시한다.
4.B에서는 합근 활동 전위의 잠복(ms)을 도시한다.
도 5에서는 좌골 신경 분쇄후, 운반제(식염수/0.02% BSA) 또는 30 ㎍/㎏ s.c.의 SDF-1α 변이체로 치료된 생쥐의 전기생리학적 기록을 도시한다. 기선: 운반제 처리된 동물의 반대쪽에서 기록된 수치. 기록은 병소후 D7과 D22(dpl)에서 수행하였다.
5.A에서는 합근 활동 전위(compound muscle action potential)의 진폭(mV)을 도시한다.
5.B에서는 합근 활동 전위의 잠복(ms)을 도시한다.
5.C에서는 합근 활동 전위의 지속 기간을 도시한다.
도 6에서는 좌골 신경 분쇄후, 운반제(식염수/0.02% BSA), 또는 100, 30, 10 ㎍/㎏ s.c.의 Met-SDF-1α로 치료된 생쥐의 전기생리학적 기록을 도시한다. 기선: 운반제 처리된 동물의 반대쪽에서 기록된 수치. 기록은 병소후 D7과 D14(dpl)에서 수행하였다.
6.A에서는 합근 활동 전위의 잠복(ms)을 도시한다.
도 7에서는 당뇨성 신경병증(STZ)의 스트렙토조토신(streptozotocin) 모형에서, 100, 30, 10 ㎍/㎏ s.c. SDF-1α 치료의 결과를 도시한다. 양성 대조 분자는 10 ㎍/㎏ s.c에서 IL-6이다.
7.A에서는 D11 내지 D40에서 체중 치수를 도시한다.
7.B에서는 STZ-이후 D7에서 혈당증 수준을 도시한다.
7.C에서는 STZ-이후 D24와 40에서 측정된 합근 활동 전위의 잠복을 도시한다.
7.D에서는 감각 신경 전도 속도(sensory nerve conduction velocity)에 대한 SDF-1α의 효과를 도시한다.
7.E에서는 SDF-1α 치료와 함께 또는 이러한 치료 없이, STZ-이후 D40에서 상대적인 미엘린 두께(g-비율로 표시됨)를 도시한다.
7.F에서는 STZ-이후 D40에서 좌골 신경 내에 변성된 섬유의 숫자를 도시한다.
7.G에서는 STZ-이후 D40에서 표피내 신경 섬유의 밀도를 도시한다.
도 8에서는 당뇨성 신경병증(STZ)의 스트렙토조토신 모형에서, 기계적, 열적 이질통(allodynia) 판독에서 100, 30, 10 ㎍/㎏ s.c. SDF-1α 치료의 결과를 도시한다.
8.A에서는 STZ-이후 D20에서 Von Frey 필라멘트 검사에서 측정된 압력 역치(threshold pressure)를 도시한다.
8.B에서는 STZ-이후 D40에서 52℃ 열판 측정검사에서 잠복 치수를 도시한다.
도 9에서는 R<100에 대한 양성 마커 R의 숫자에 대비하여 좌표에 기입된, 이탈리아 일차 진행성 MS 집합에서 예상된 오류 발견율(false discovery rate)을 도시한다.
도 10에서는 SDF-1 유전자 내에서 SNP_A-2185631을 도시한다.
도 11에서는 인간 SDF-1 절단접합 변이체의 예측된 아미노산 서열을 도시한다.
도 12에서는 SNP_A-2185631이 SDF-1 유전자 내에서, SDF-1ε와 SDF-1φ의 최종 s인트론에 위치한다는 것을 도시한다.
본 발명의 배경에서, SDF-1의 투여는 말초 신경 질환의 생체내 동물 모형에서 유익한 효과를 나타내는 것으로 밝혀졌다. 좌골 신경 분쇄 유도된 신경병증의 뮤린 모형에서, 신경 재생(regeneration), 완전성(integrity)과 생명력(vitality)과 관련된 모든 생리학적 파라미터는 SDF-1α, Met-SDF-1α 또는 SDF-1α 변이체의 투여에 의해 긍정적인 영향을 받았다.
SDF-1α와 SDF-1α 변이체는 신경-염증의 포괄적 모형인 LPS 유도된 TNF-a 방출 동물 모형에서 TNF-α와 IL-6을 저해하는 것으로 밝혀졌다.
당뇨성 신경병증과 신경병증성 통증에서 SDF-1α의 보호 효과가 본 발명에서 확인된다.
더 나아가, SDF-1 유전자와 일차 진행성 MS 사이에 포괄적인 연관이 밝혀졌다.
따라서, 본 명세서에 제시된 실험적 증거는 신경 질환, 특히, 뉴런과 신경교세포(glial cell) 기능에 연관된 신경 질환 및 신경-염증을 치료하는 새로운 가능성을 제공한다.
이런 이유로, 본 발명은 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 SDF-1 또는 SDF-1 활성 작용제의 용도에 관계한다.
본 명세서에서, "SDF-1"은 SDF-1 활성, 예를 들면, CXCR4 수용체에 결합 활성을 보유하는 전장 성숙 인간 SDF-1α 또는 이의 단편에 관계한다. 인간 SDF-1α의 아미노산 서열은 본 명세서에 첨부된 서열 목록의 SEQ ID NO: 1로서 보고된다. 본 명세서에서, "SDF-1"은 또한, SDF-1 활성을 유지할 만큼 충분한 동일성이 존재한다면, 동물, 예를 들면, 뮤린, 소, 또는 쥐 SDF-1로부터 유래된 임의의 SDF-1에 관계한다.
본 명세서에서, "SDF-1"은 또한, SDF-1의 생물학적 활성 뮤테인과 단편, 예를 들면, 자연 발생 동소체(isoform)에 관계한다. SDF-1의 상이한 동소체를 인코딩하는 유전자의 6개 대안적으로 절단접합된 전사체 변이체가 보고되었다(SDF-1 동소체 α, β, γ, δ, ε, φ). 인간 SDF-1α, SDF-1β, SDF-1γ, SDF-1δ, SDF-1ε, SDF-1φ의 서열은 각각, 본 명세서에 첨부된 서열 목록의 SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 14, SEQ ID NO:15, SEQ ID NO:16으로서 보고된다.
본 명세서에서, "SDF-1"은 또한, 이의 동소체, 뮤테인, 융합 단백질, 기능 유도체, 활성 분획물, 단편 또는 염을 포괄한다. 이들 동소체, 뮤테인, 융합 단백질 또는 기능 유도체, 활성 분획물 또는 단편은 SDF-1의 생물학적 활성을 유지한다. 적절하게는, 이들은 야생형 SDF-1과 비교하여 향상된 생물학적 활성을 보유한다.
"SDF-1"은 특히, SEQ ID NO:1에 의해 확인되는 인간 성숙 동소체 SDF-1α, SEQ ID NO:2에 의해 확인되는 인간 성숙 SDF-1β, SEQ ID NO:3에 의해 확인되는 인간 성숙 SDF-1γ, SEQ ID NO:14에 의해 확인되는 인간 성숙 SDF-1-δ, SEQ ID NO:15에 의해 확인되는 인간 성숙 SDF-1ε, SEQ ID NO:16에 의해 확인되는 인간 성숙 SDF-1φ; 부가적인 N-말단 메티오닌을 보유하고 SEQ ID NO: 7에 의해 확인되는 인간 성숙 동소체 SDF-1α; SDF-1α의 절두된 형태, 예를 들면, 인간 성숙 SDF-1α의 아미노산 잔기 4-68에 상응하고 SEQ ID NO:8에 의해 확인되는 형태, 인간 성숙 SDF-1α의 아미노산 잔기 3-68에 상응하고 SEQ ID NO:9에 의해 확인되는 형태, 부가적인 N-말단 메티오닌을 보유하는 인간 성숙 SDF-1α의 아미노산 잔기 3-68에 상응하고 SEQ ID NO:10에 의해 확인되는 형태를 포괄한다. 또한, SDF-1은 이질성 도메인(heterologous domain), 예를 들면, 막-결합된 단백질의 세포외 도메인, 면역글로불린 불변 영역(Fc 영역), 다중화 도메인(multimerization domain), 이출 신호(export signal), 태그(tag) 서열(가령, 친화성(affinity)에 의한 정제를 보조하는 태그: HA 태그, 히스티딘 태그, GST, FLAAG 펩티드, 또는 MBP)에서 선택되는 하나이상의 아미노산 서열에 작동가능하게 연결된, 앞서 정의된 바와 같은 SDF-1 폴리펩티드를 포함하는 융합 단백질이다. SEQ ID NO: 13에 의해 정의되는 SDF-1α의 Fc-융합 단백질이 바람직하다.
본 명세서에서, "SDF-1α 변이체"는 감소된 GAG-결합 활성을 보유하는 SDF-1의 돌연변이체에 관계한다. "감소된 GAG-결합 활성" 또는 "GAG-결합 결함성"은 이들 CC-케모킨 돌연변이체가 GAG에 결합하는 감소된 능력을 보유한다는 것을 의미한다, 다시 말하면, 이들 각 돌연변이체는 이들을 기술하는 아래의 기존 문헌에서 언급된 측정검사법에 의한 측정에서, 상응하는 야생형 분자와 비교하여 낮은 비율로 GAG(유사 헤파린 황산염)에 결합한다. 특히, 이런 돌연변이체는 기존 문헌에 이미 기술된, Ser(Amara et al J Biol Chem. 1999 Aug 20;274(34):23916-25) 또는 Ala(SEQ ID NO: 4)에 의한 Lys24, His25, Lys27의 치환을 보유하는 돌연변이체다. 다른 GAG 결합 결함성 돌연변이체는 Ser 및/또는 Ala으로, 잔기 Lys24, His25와 Lys27의 염기성 클러스터(basic cluster) 및 글리코사미노글리칸 결합에 관여하는 임의의 다른 잔기, 예를 들면, Arg41과 Lys43의 통합적 치환으로 산출될 수 있다. 가능한 조합은 예로써, Lys24 Lys27, Lys24 His25, His25 Lys27, Lys24 Arg 41, His25 Arg41, Lys27 Arg41, Lys24 Lys43, His 25 Lys43, Lys27 Lys43, Arg41 Lys43일 수 있다.
"SDF-1α 변이체"는 특히, 감소된 GAG 결합 활성을 보유하고 SEQ ID NO: 4에 의해 확인되는 SDF-1α의 돌연변이체(Lys24Ala, His25Ala, Lys27Ala을 보유하는 SDF-1α의 삼중 돌연변이체); 부가적인 최초 메티오닌 잔기를 보유하고 삼중 돌연변이 Lys25Ala, His26Ala, Lys28Ala을 보유하며 SEQ ID NO: 11에 의해 확인되는 SDF-1α의 돌연변이체; 단일 돌연변이 Lys27Cys를 보유하고 SEQ ID NO: 12에 의해 확인되는 감소된 GAG 결합 활성의 SDF-1α 돌연변이체를 포괄한다. 본 명세서에서 정의된 SDF-1α 변이체, 특히, SEQ ID NO: 12에 의해 확인되는 SDF-1α 변이체는 PEG(폴리에틸렌 글리콜)로 변형될 수 있는데, 이러한 과정은 "PEG화(PEGylation)"라고 한다. PEG화는 기존 문헌(가령, EP 0 154 316)에서 공지된 임의의 PEG화 반응으로 달성될 수 있다.
C-말단 아미노산의 결실을 보유하는 본 명세서에 정의된 바와 같은 SDF-1과 SDF-1α 변이체 역시 본 발명에 포함된다.
C-말단 아미노산의 결실을 보유하는 SDF-1의 특히 바람직한 형태는 인간 성숙 SDF-1α의 아미노산 잔기 3-67에 상응하고 SEQ ID NO:17에 의해 확인되는 형태 및 부가적인 N-말단 메티오닌을 보유하는 인간 성숙 SDF-1α의 아미노산 잔기 3-67에 상응하고 SEQ ID NO:18에 의해 확인되는 형태와 같은 SDF-1α의 절두된 형태(truncated form)이다.
본 명세서에서, "SDF-1 활성 작용제"는 SDF-1 활성을 촉진하거나 제한하는 분자, 예를 들면, SDF-1 수용체의 작용성 항체(agonistic antibody), 또는 SDF-1 수용체, 예를 들면, CXCR4 수용체를 통한 신호전달을 활성화시키는 소분자량 작용제를 지칭한다.
본 명세서에서, "SDF-1 활성 작용제"는 또한, SDF-1 매개된 활성, 예를 들면, 세포외 기질 성분에 세포 부착의 촉진, 희소돌기아교세포 계통 세포의 미엘린 생산 세포로의 형태형성(morphogenesis), 희소돌기아교세포 계통 세포(가령, 전구세포 또는 전구체 세포)의 동원(recruitment), 증식(proliferation), 분화(differentiation) 또는 성숙(maturation)의 촉진, 또는 희소돌기아교세포 계통 세포의 아폽토시스(apoptosis)와 세포 손상(cell injury)으로부터 보호의 촉진을 강화시키는 작동약(agent)을 지칭한다. SDF-1의 유사한 활성이 슈반 세포(Schwann cell)에도 적용된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, SDF-1은 SDF-1α이다.
본 발명의 더욱 바람직한 구체예에서, SDF-1은 SDF-1α 변이체이다.
본 명세서에서, "치료"와 "예방"은 신경 질환의 하나이상의 증상이나 원인 및 신경 질환에 동반되는 증상, 질환 또는 합병증을 예방, 저해, 약화, 완화 또는 반전시키는 것을 의미한다. 신경 질환을 "치료"할 때, 본 발명에 따른 물질은 발병이후에 제공되고, "예방"은 병의 징후가 환자에서 나타나기 이전에 치료 물질의 투여에 관계한다.
본 명세서에서, "신경 질환"은 "배경기술"에서 상세하게 기술된 것들을 비롯하여, 모든 공지된 신경 질환이나 장애, 또는 CNS 또는 PNS의 손상을 포괄한다.
신경 질환에는 CNS 또는 PNS의 기능장애에 관련된 질환, 예를 들면, 신경전달(neurotransmission)에 관련된 질환, 두통, 머리의 외상, CNS 감염, 신경안과적(neuro-ophthalmologic) 질환과 뇌신경 질환, 움직임의 뇌엽 장애(cerebral lobe)의 기능과 기능장애, 인사불성(stupor)과 혼수(coma), 탈수초 질환, 정신착란(delirium)과 치매(dementia), 두개경수 연접부 비정상(craniocervical junction abnormality), 발작성 장애(seizure disorder), 척수 질환, 수면 장애(sleep disorder), 말초 신경계 질환, 뇌혈관 질환, 또는 근육 질환이 포함된다. 이들 질환의 정의는 예로써, The Merck Manual for Diagnosis and Therapy, Seventeenth Edition, Merck Research Laboratories, 1999를 참조한다.
신경-염증은 별개의 신경 질환에서 발생한다. 많은 자극이 신경-염증을 유인하는데, 상기 염증은 뉴런(neuronal) 또는 희소돌기아교세포(oligodendroglial) 손상에 의해 유발되거나, 또는 외상, 중추신경이나 말초신경 손상 또는 바이러스나 세균 감염의 결과일 수 있다. 신경-염증의 주요한 결과는 (i) 별아교세포(astrocyte) 또는 소교세포(microglia cell)에 의한 다양한 염증성 케모킨의 분비; 및 (ii) 별아교세포 또는 소교세포(microglia)를 더욱 자극하는 부가적인 백혈구의 동원이다. 만성 신경변성 질환, 예를 들면, 다발성 경화증(MS), 알츠하이머병(AD) 또는 근위축성 측삭 경화증(amyotrophic lateral sclerosis, ALS)에서, 지속적인 신경-염증의 존재가 이러한 질환의 진행에 관여하는 것으로 생각된다. 신경-염증과 연관된 신경 질환은 신경 염증 질환(neurological inflammatory disease)으로 지칭될 수도 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 신경 질환은 염증, 특히, 신경-염증과 연관된다.
적절하게는, 본 발명의 신경 질환은 외상성 신경 손상, 발작, CNS 또는 PNS의 탈수초 질환, 신경병증, 또는 신경변성 질환에서 선택된다.
외상성 신경 손상은 PNS 또는 CNS에 관계하고, 상기 "배경기술"에서 기술된 바와 같이, 쌍마비(paraplegia)를 비롯한 뇌 또는 척수 손상일 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 외상성 신경 손상은 말초 신경의 외상 또는 척수의 외상을 포함한다.
발작은 뇌의 저산소증(hypoxia) 또는 허혈에 의해 유발될 수 있다. 이는 뇌혈관 질환 또는 사고로 불린다. 발작은 뇌 부위에 혈액 순환(blood circulation)의 상실에 의해 유발되는 뇌 기능의 상실(신경성 결손(neurological deficit))을 수반한다. 혈액 순환의 상실은 뇌에 형성되는 혈병(blood clot)(혈전(thrombus))에 기인하거나, 또는 다른 위치로부터 뇌로 이동하는 죽상경화반(atherosclerotic plaque) 또는 다른 물질의 조각(색전(emboli))에 기인할 수 있다. 뇌내 출혈(hemorrhage)은 발작과 유사한 증상을 유발한다. 발작의 가장 일반적인 원인은 죽상경화증에 종속되는 발작(뇌혈전증(cerebral thrombosis))이고, 따라서, 본 발명은 죽상경화증(atherosclerosis)의 치료에 관계한다.
말초 신경병증은 단독으로 또는 임의의 조합으로, 감각 상실(sensory loss), 근육약화와 위축, 감소된 심부건반사(deep tendon reflex), 혈관운동 증상(vasomotor symptom)의 증후군에 관련된다. 신경병증은 단일 신경(단일신경병증), 독립된 부위에서 2개 이상의 신경(다발성 단일신경병증), 또는 동시에 여러 신경(다발신경병증)에 영향을 준다. 축색돌기(가령, 당뇨병(diabetes mellitus), 라임병(Lyme disease) 또는 요독증(uremia)에서, 또는 독성 물질(toxic agent)에 의해), 또는 미엘린 수초(myelin sheath) 또는 슈반 세포(Schwann cell)(가령, 급성이나 만성 염증성 다발신경병증, 백색질장애(leukodystrophy), 또는 귈레인-바레 증후군에서)가 일차적인 영향을 받는다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 다른 신경병증은 예로써, 납 독성(lead toxicity), 댑손(dapsone) 이용, 진드기 물림(tick bite), 포르피린증(porphyria), 또는 귈레인-바레 증후군에 기인하고, 일차적으로, 운동신경 섬유(motor fiber)에 영향을 준다; 다른 신경병증, 예를 들면, 암의 뒤뿌리 신경절염(dorsal root ganglionitis), 나병(leprosy), AIDS, 당뇨병, 또는 만성 피리독신 중독(chronic pyridoxine intoxication)에 기인하는 신경병증은 일차적으로, 뒤뿌리 신경절(dorsal root ganglia) 또는 감각 섬유(sensory fiber)에 영향을 주고, 감각 증상(sensory symptom)을 유발한다. 뇌신경(cranial nerve) 역시 관련될 수 있다(가령, 귈레인-바레 증후군, 라임병, 당뇨병, 디프테리아에서).
알츠하이머병(AD)은 뇌 조직에서 변화에 기인한 정신 기능에서 악화를 수반하는 질환이다. 여기에는 뇌 조직의 수축, 원발성 퇴행성 치매(primary degenerative dementia), 미만성 뇌 위축(diffuse brain atrophy)이 포함된다. 알츠하이머병은 알츠하이머형 노인성 치매(senile dementia/Alzheimer's type, SDAT)로 불린다.
파킨슨병(PD)은 떨림(shaking) 및 보행(walking), 운동(movement)과 공동작용(coordination)의 어려움을 수반하는 뇌질환이다. 상기 질환은 근육 운동(muscle movement)을 통제하는 뇌 부분에 손상과 연관되고, 허둥대는 마비(paralysis agitans) 또는 떨리는 마비(shaking palsy)로 불린다.
헌팅턴병(HD)은 유전된 상염색체 우성 신경 염증 질환(autosomal dominant neurological inflammatory disease)이다. 이러한 유전적 비정상은 과도한 숫자의 앞뒤로 반복된 CAG 뉴클레오티드 서열에 있다. CAG 반복을 포함하는 다른 질환에는 예로써, 척수성 근위축증(spinal muscular atrophy, SMA), 예를 들면, 케네디병(Kennedy's disease) 및 유전학 명명법에서 척수소뇌성 실조증(spinocerebellar ataxia, SCA)으로 알려져 있는 대부분의 우성 유전성 소뇌 실조증(autosomal dominant cerebellar ataxia, ADCA)이 포함된다.
근위축성 측삭 경화증(ALS)은 뇌와 척수 내에서 신경 세포의 파괴를 비롯한 자율근육(voluntary muscle)의 신경 통제(nervous control)의 점진적인 상실을 유발하는 질환이다. 루게릭병(Lou Gehrig's disease)으로 불리는 근위축성 측삭 경화증은 근육의 이용과 통제의 상실을 수반하는 질환이다.
다발성 경화증(MS)은 재발성-완화성 또는 진행성 과정을 거치는 중추신경계(CNS)의 염증성 탈수초 질환이다. MS가 유일한 탈수초 질환인 것은 아니다. 말초신경계(PNS)에서 이의 대응물은 만성 염증성 탈수초성 다발성신경병증(CIDP)이다. 이에 더하여, PNS에서 귈레인-바레 증후군(GBS)으로 불리는 염증성 탈수초성 다발성신경병증 및 CNS에서 급성 산재성 뇌척수염(acute disseminated encephalomyelitis, ADEM)과 같은 급성 단상(monophasic) 질환이 존재한다. 다른 신경 질환에는 비정상적인 탈수초화를 나타내는 신경병증, 예를 들면, 상기 "배경 기술"에서 열거된 신경병증 및 수근 터널 증후군(carpal tunnel syndrome)이 포함된다. 외상성 신경 손상은 척주 정형외과적 합병증(spinal column orthopedic complication)을 동반할 수 있는데, 이들 역시 본 발명에 따른 질환에 포함된다.
덜 알려진 신경 질환, 예를 들면, 신경섬유종증(neurofibromatosis), 또는 다발성 기관 위축(Multiple System Atrophy, MSA) 역시 본 발명의 범위에 포함된다. 본 발명에 따라 치료될 수 있는 다른 질환은 상기 "배경 기술"에서 상세하게 기술되었다.
다른 바람직한 구체예에서, 신경 질환은 말초 신경병증, 가장 바람직하게는, 당뇨성 신경병증이다. 화학요법 연관된/유도된 신경병증 역시 본 발명에 따라 치료될 수 있다.
"당뇨성 신경병증"은 임의 형태의 당뇨성 신경병증, 또는 상기 "배경 기술"에서 상세하게 기술된 바와 같이 신경에 영향을 주는 당뇨성 신경병증 또는 당뇨 합병증을 동반하거나 이들에 의해 유발되는 하나이상의 증상이나 장애를 지칭한다. 당뇨성 신경병증은 다발신경병증일 수 있다. 당뇨성 다발신경병증에서, 여러 신경이 동시에 영향을 받는다. 당뇨성 신경병증은 단일신경병증일 수도 있다. 예로써, 국소성 단일신경병증에서, 상기 질환은 단일 신경, 예를 들면, 동안신경(oculomotor) 또는 외전뇌신경(abducens cranial nerve)에 영향을 준다. 이는 또한, 2개 이상의 신경이 독립된 부위에서 영향을 받는 다발성 단일신경병증일 수도 있다.
다른 바람직한 구체예에서, 신경 질환은 탈수초 질환이다. 적절하게는, 탈수초 질환에는 CNS의 탈수초성 질환, 예를 들면, 급성 산재성 뇌척수염(ADEM)과 다발성 경화증(MS) 및 말초신경계(PNS)의 탈수초 질환이 포함된다. 후자에는 만성 염증성 탈수초성 다발성신경병증(CIDP) 및 급성 단상 질환, 예를 들면, 귈레인-바레 증후군(GBS)으로 불리는 염증성 탈수초성 다발성신경병증이 포함된다.
다른 바람직한 구체예에서, 탈수초 질환은 다발성 경화증이다.
본 발명의 특히 바람직한 구체예에서, 탈수초 질환은 일차 진행성 다발성 경화증이다.
본 발명의 다른 특히 바람직한 구체예에서, 탈수초 질환은 이차 진행성 다발성 경화증이다. 다른 바람직한 구체예에서, 탈수초 질환은 만성 염증성 다발성 경화증, 탈수초성 다발신경병증(CIDP), 또는 귈레인-바레 증후군(GBS)에서 선택된다,
본 발명의 다른 바람직한 구체예는 신경변성 질환의 치료 및/또는 예방에 관계한다. 이러한 신경변성 질환은 알츠하이머병, 파킨슨병, 헌팅턴병, 또는 ALS에서 선택된다.
적절하게는, SDF-1은 아래에서 선택되는 펩티드, 폴리펩티드 또는 단백질에서 선택된다:
(a) SEQ ID NO: 1의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
(b) SEQ ID NO: 4의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
(c) SEQ ID NO: 7의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
(d) 신호 서열, 바람직하게는, SEQ ID NO: 5의 아미노산을 더욱 포함하는 (a) 내지 (c) 중에서 하나의 폴리펩티드;
(e) (a) 내지 (d) 중에서 하나의 뮤테인, 여기서 아미노산 서열은 (a) 내지 (c)에서 서열 중에서 적어도 하나에 적어도 40% 또는 50% 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 동일성을 보유하고;
(f) 높은 엄밀도 조건 하에 (a) 내지 (d) 중에서 하나를 인코딩하는 고유 DNA 서열의 보체에 혼성화되는 DNA 서열에 의해 인코딩되는 (a) 내지 (d) 중에서 하나의 뮤테인;
(g) 아미노산 서열에서 변화가 (a) 내지 (d)에서 아미노산 서열에 보존성 아미노산 치환인 (a) 내지 (d) 중에서 하나의 뮤테인; 또는
(h) (a) 내지 (d) 중에서 하나의 염 또는 동소체, 융합 단백질, 기능 유도체, 또는 활성 분획물.
활성 분획물 또는 단편은 SDF-1 동소체의 임의의 일부분 또는 도메인, 예를 들면, 임의의 SDF-1 동소체의 N-말단 부분 또는 C-말단 부분을 포함할 수 있다.
당업자가 인지하는 바와 같이, SDF-1의 더욱 작은 일부분, 예를 들면, CXCR4 수용체에 결합과 같은 SDF-1 기능을 위하여 필요한 필수적인 아미노산 잔기를 포함하는 활성 펩티드가 그 기능을 발휘할 만큼 충분할 수 있다. 수용체 결합은 예로써, 고정된 수용체를 표지된 리간드와 표지되지 않은 검사 단백질에 노출시킴으로써 측정할 수 있는데, 여기서 대조와 비교하여 표지된 리간드 결합에서 감소는 검사 단백질에서 수용체-결합 활성을 지시한다. 다른 측정검사, 표면 플라즈몬 분광(Surface Plasmon Resonance Spectroscopy)에서, 분석되는 수용체 또는 단백질이 유동 챔버(flow chamber) 내에서 편평 센서 칩(flat sensor ship) 상에 고정하고, 이후 유망한 상호작용 대상물을 포함하는 용액을 연속 흐름(continuous flow)으로 첫 번째 단백질에 통과시키고, 칩을 가로질러 한정된 각도로 광을 지향시키고, 반사된 광의 공명 각도(resonance angle)를 측정한다; 단백질-단백질 상호작용의 확립은 이러한 각도에서 변화를 유도한다(가령, BIACoreㄾ, Biacore International AB). 단백질-단백질 상호작용을 분석하는데 적합한 다른 기술(가령, 친화성 크로마토그래피(affinity chromatography), 친화성 흡입(affinity blotting), 면역침전(coimmunoprecipitation)) 또는 결합 친화성(binding affinity)을 평가하는 기술(가령, 단백질 친화성 크로마토그래피(protein affinity chromatography), 침강(sedimentation), 겔 여과(gel filtration), 형광 방법, 평형 용액(equilibrium solution)의 고체-상 샘플링(solid-phase sampling), 표면 플라즈몬 공명(surface plasmon resonance))은 Phizicky and Fields, 1995; Sadir et al., 2001에서 검토되었다.
당업자가 인지하는 바와 같이, SDF-1의 뮤테인, 염, 동소체, 융합 단백질, 기능 유도체 또는 활성 분획물은 SDF-1의 생물 활성과 유사한 또는 이보다 더욱 우수한 생물 활성을 보유한다. SDF-1 및 이의 뮤테인, 동소체, 융합 단백질 또는 기능 유도체, 활성 분획물 또는 단편이나 염의 생물학적 활성은 세포 시스템(cellular system)을 이용한 생물평가(bioassay)로 측정될 수 있다.
바람직한 활성 분획물은 전장 SDF-1의 활성과 동등하거나 이보다 우수한 활성을 보유하고, 또는 더욱 우수한 안정성 또는 더욱 낮은 독성(toxicity)이나 면역원성(immunogenicity)과 같은 추가적인 이점을 보유하고, 또는 대량 생산하거나 정제하기가 더욱 용이하다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 뮤테인, 활성 단편 및 기능 유도체는 상응하는 cDNA를 적절한 플라스미드 내로 클로닝하고 이들을 앞서 언급된 바와 같은 세포 측정검사로 검사함으로써 산출될 수 있다.
본 발명에 따른 단백질은 당화되거나 비-당화될 수 있고, 자연 공급원, 예를 들면, 체액(body fluid)으로부터 유래되거나, 또는 적절하게는, 재조합 방식으로 산출될 수 있다. 재조합 발현은 원핵 발현 체계, 예를 들면, 대장균(E. coli), 또는 진핵 발현 체계, 예를 들면, 곤충 세포, 바람직하게는, 포유동물 발현 체계, 예를 들면, CHO-세포 또는 HEK-세포에서 수행된다. 더 나아가, 본 발명의 단백질은 신경보호 효과(neuroprotective effect)가 보존되는 조건에서, N-말단에서 메티오닌(Met) 또는 아미노옥시펜탄(AOP)을 제거하거나 부가함으로써, 변형되거나, 신장되거나, 또는 단축될 수 있다.
본 명세서에서 "뮤테인"은 SDF-1의 유사체를 지칭하는데, 여기서 고유 SDF-1의 아미노산 잔기 중에서 적어도 하나가 상이한 아미노산 잔기로 치환되거나 결실되고, 또는 대안으로 하나이상의 아미노산 잔기가 SDF-1의 고유 서열에 부가되는데, 이때 야생형 SDF-1과 비교하여 생성된 산물의 능력에는 큰 변화가 없어야 한다. 이들 뮤테인은 공지된 합성 방법이나 특정부위-돌연변이유발 기술, 또는 임의의 적합한 다른 공지된 기술을 활용하여 만들 수 있다.
본 발명에 이용될 수 있는 SDF-1의 뮤테인, 또는 이를 코딩하는 핵산은 본 명세서에 제공된 교시와 보도에 기초하여, 과도한 실험 없이 당업자에 의해 통상적으로 획득될 수 있는 치환 펩티드 또는 폴리뉴클레오티드로서 실질적으로 상응하는 서열의 한정된 세트를 포함한다.
본 발명에 따른 뮤테인에는 중간으로 또는 고도로 엄격한 조건하에 핵산, 예를 들면, 본 발명에 따른 SDF-1을 인코드하는 DNA 또는 RNA에 혼성화되는 DNA 또는 RNA에 의해 인코드되는 단백질이 포함된다. SDF-1α을 인코딩하는 cDNA는 SEQ ID 6으로 기술된다. "엄격한 조건"은 혼성화 및 후속 세척 조건을 의미한다(참조: Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, supra, Interscience, N.Y., &&6.3 and 6.4(1987, 1992); Sambrook et al. (Sambrook, J. C., Fritsch, E. F., and Maniatis, T. (1989) Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
제한없이, 엄격한 조건의 실례에는 조사 중인 하이브리드의 계산된 Tm보다 12-20℃ 낮은 세척 조건, 예를 들면, 5분간 2 x SSC와 0.5% SDS, 이후 15분간 2 x SSC와 0.1% SDS; 30-60분간 37℃에서 0.1 x SSC와 0.5% SDS, 이후 30-60분간 68℃에서 0.1 x SSC와 0.5% SDS가 포함된다. 당업자가 인지하는 바와 같이, 엄격한 조건은 DNA 서열, 올리고뉴클레오티드 프로브(가령, 10-40개 염기) 또는 혼성 올리고뉴클레오티드 프로브의 길이에도 좌우된다. 혼성 프로브가 이용되면, SSC 대신에 테트라메틸 염화암모늄(TMAC)을 이용하는 것이 바람직하다(Ausubel, supra.).
바람직한 구체예에서, 임의의 이와 같은 뮤테인은 첨부된 서열 목록 중에서 SEQ ID NO: 1 내지 4의 서열과 적어도 40% 동일성(identity) 또는 상동성(homology)을 갖는다. 더욱 바람직하게는, 상기 뮤테인은 이들 서열에 적어도 50%, 적어도 60%, 적어도 70%, 적어도 80% 또는, 가장 바람직하게는, 적어도 90% 동일성 또는 상동성을 보유한다.
동일성은 서열을 비교하여 확정된 2개 이상의 폴리펩티드 서열 또는 2개 이상 폴리뉴클레오티드 서열간의 상관관계를 반영한다. 일반적으로, 동일성은 비교되는 서열 범위에서 2개의 폴리뉴클레오티드 서열 또는 2개의 폴리펩티드 서열의 각각 정확한 뉴클레오티드 대 뉴클레오티드 대응 또는 아미노산 대 아미노산 대응을 의미한다.
정확하게 일치하지 않는 서열에서, "동일성 %"를 측정할 수 있다. 일반적으로, 비교되는 두 서열은 정렬시켜 서열간의 최대 상관을 제공한다. 정렬의 정도를 향상시키기 위하여 한 서열이나 양 서열에 "틈새(gap)"를 삽입할 수 있다. 동일성 %는 비교되는 각 서열의 전체 범위(소위, 전역정렬)(동일하거나 매우 유사한 길이의 서열에 적합), 또는 더욱 짧고 한정된 범위(소위, 국부정렬)(동등하지 않은 길이의 서열에 적합)에서 측정할 수 있다.
2개 이상 서열의 동일성과 상동성을 비교하는 방법은 당분야에 공지되어 있다. 가령, Wisconsin Sequence Analysis Package, version 9.1(Devereux J et al., 1984)에서 가용한 프로그램, 예를 들면, BESTFIT와 GAP 프로그램을 이용하여 두 폴리뉴클레오티드 서열간 동일성 % 및 두 폴리펩티드 서열간 동일성 %와 상동성 %를 측정할 수 있다. BESTFIT에서는 Smith와 Waterman의"국부 상동성(local homology)" 알고리즘(1981)을 이용하여 두 서열간 가장 유사한 단일 영역을 찾는다. 서열간 동일성 및/또는 유사성을 측정하는 다른 프로그램은 당분야에 공지되어 있는데, 예를 들면, BLAST 계통의 프로그램(Altschul S F et al., 1990, Altschul S F et al., 1997, NCBI 홈페이지: www. ncbi.nlm.nih.gov에서 접근가능)과 FASTA(Pearson W R, 1990; Pearson 1988)이다.
본 발명에 따른 뮤테인에 대한 바람직한 변화는"보존성"치환이다. SDF-1 폴리펩티드의 보존성 아미노산 치환에는 상기 분자의 생물학적 기능을 보존하면서 충분히 유사한 물리화학적 성질을 갖는 일군의 동질성 아미노산간 치환이 포함된다(Grantham, 1974). 기능의 변화 없는 아미노산의 부가와 결실이 상기 정의된 서열에서 실시될 수 있는데, 특히 30개 이하, 바람하게는 10개 이하의 아미노산이 부가 또는 결실되고 기능적 구조에 중요한 아미노산(가령, 시스테인 잔기)이 결실 또는 치환되지 않는 경우에, 기능의 변화 없는 아미노산의 부가 또는 결실이 가능하다. 이런 결실 및/또는 부가에 의해 만들어지는 단백질 및 뮤테인은 본 발명의 목적에 포함된다.
바람직한 동질성 아미노산 군은 표 1에 제시된다. 더욱 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 2에 제시된다; 가장 바람직한 동질성 아미노산 군은 표 3에 제시된다.
Figure 112008020893802-PCT00001
Figure 112008020893802-PCT00002
Figure 112008020893802-PCT00003
본 발명에 사용될 수 있는 SDF-1, 폴리펩티드 또는 단백질의 뮤테인을 수득하는데 이용될 수 있는, 단백질 내에서 아미노산 치환의 산출 방법의 실례에는 임의의 공지된 방법이 포함되는데, 이들 방법은 예로써, US 특허 4,959,314, 4,588,585, 4,737,462(Mark et al); 5,116,943(Koths et al.,), 4,965,195(Namen et al.,); 4,879,111(Chong et al.,); 5,017,691(Lee et al.,); US 특허 4,904,584(Shaw et al.,)(리신 치환된 단백질)에서 제시한다.
"융합 단백질"은 예로써, 체액에서 연장된 체류 시간(residence time)을 갖는 다른 단백질과 융합되는 SDF-1, 또는 이들의 뮤테인 또는 단편을 포함하는 폴리펩티드를 의미한다. 따라서, SDF-1은 다른 단백질, 폴리펩티드 등, 예를 들면, 면역글로불린이나 이의 단편에 융합될 수 있다.
본 명세서에서 "기능성 유도체"에는 SDF-1의 유도체 및 이들의 뮤테인과 융합된 단백질이 포함되고, 이들은 당분야에 공지된 수단으로 잔기 또는 N- 혹은 C-말단기에 측쇄로 생성되는 작용기로부터 만들 수 있는데, 이들이 제약학적으로 수용가능하면, 다시 말하면, SDF-1의 활성과 실질적으로 유사한 단백질의 활성을 파괴하지 않고 이를 함유하는 조성물에 독성을 공여하지 않는다면 본 발명에 포함된다.
가령, 이들 유도체에는 폴리에틸렌글리콜 측쇄가 포함되는데, 이는 항원성 부위를 감추고 체액 내에서 SDF-1의 체류를 연장시킨다. 다른 유도체에는 카르복실기의 지방족 에스테르; 암모니아 또는 일/이차 아민과의 반응에 의한 카르복실기의 아마이드; 아실 성분(가령, 알카노일 또는 카르보사이클릭 아로일 기)으로 형성된 아미노산 잔기의 유리 아미노기의 N-아실 유도체; 또는 아실 성분으로 형성된 유리 하이드록실기(가령, 세릴 또는 테레오닐 잔기)의 O-아실 유도체 등이 포함된다.
본 발명에서 SDF-1, 뮤테인, 융합 단백질의 "활성 분획물"에는 단독으로 또는 관련된 분자나 여기에 결합된 잔기(가령, 당이나 인산염 잔기, 또는 단백질 분자나 당 잔기 자체의 응집체)와 함께, 단백질 분자의 폴리펩티드 사슬의 임의 단편이나 전구물질이 포함되지만, 이런 분획물은 SDF-1과 실질적으로 유사한 활성을 보유해야 한다.
본 명세서에서 "염"은 SDF-1 분자 또는 이의 유사체의 카르복실기의 염과 아미노기의 산부가염을 의미한다. 카르복실기의 염은 당분야에 공지된 방법으로 생성될 수 있는데, 여기에는 나트륨, 칼슘, 암모늄, 철, 아연 염 등과 같은 무기 염기로 형성된 염 및 아민, 예를 들면, 트리에탄올아민, 아르기닌이나 리신, 피페리딘, 프로케인 등과 같은 유기 염기로 형성된 염이 포함된다. 산 부가염에는 예로써 무기산, 예를 들면, 염산이나 황산과의 염 및 유기산, 예를 들면, 아세트산이나 옥살산과의 염이 포함된다. 물론, 이들 염은 본 발명에 적합한 SDF-1의 생물학적 활성을 보유해야 한다, 다시 말하면, 신경 질환에서 신경보호 효과를 보유해야 한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, SDF-1은 뇌-혈관 장벽(blood brain barrier, "BBB")의 통과를 촉진하는 담체 분자, 펩티드 또는 단백질에 융합된다. 이는 CNS가 질환에 관련되는 사례에서 상기 분자의 작용 부위로의 적절한 표적화를 가능하게 한다. BBB를 통한 약제 전달의 양식은 삼투압 수단으로 또는 브래디키닌(bradykinin)과 같은 혈관작용 물질(vasoactive substance)의 이용에 의해 생화학적으로, BBB의 파괴를 수반한다. BBB를 통과하는 다른 전략은 글루코오스와 아미노산 담체와 같은 담체-매개된 수송체(carrier-mediated transporter); 인슐린 또는 트랜스페린에 대한 수용체-매개된 트랜스시토시스(transcytosis); p-글리코단백질과 같은 활성 유동 수송체(active efflux transporter); 안테나피디아 호메오프로테인(Antennapedia homeoprotein)의 세 번째 나선 도메인으로부터 유래된 페네트라틴(Penetratin), 16-mer 펩티드(pAntp)와 이의 유도체를 비롯한 내인성 수송 시스템(endogenous transport system)의 이용을 수반한다. BBB를 통한 약제 전달의 전략에는 뇌내 이식(intracerebral implantation) 역시 포함된다.
SDF-1의 기능성 유도체는 중합체에 공액시켜 상기 단백질의 특성, 예를 들면, 안정성, 반감기, 생체이용효율, 사람 신체에서 내약성, 또는 면역원성을 향상시킬 수 있다. 이를 달성하기 위하여, SDF-1은 예로써 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 결합시킨다. PEG화(PEGlaytion)는 WO 92/13095에 기술된 공지된 방법으로 실시할 수 있다. 가령, SDF-1α은 글리코사미노글리칸(glycosaminoglycan) 결합에 관여하는 잔기, 예를 들면, Lys24, His25, Lys27, Arg41 또는 Lys43에서 PEG화될 수 있다.
이런 이유로, 본 발명의 바람직한 구체예에서, SDF-1은 PEG화된다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 융합 단백질은 면역글로불린(Ig) 융합을 포함한다. 이러한 융합은 직접적으로, 또는 짧게는 1 내지 3개 아미노산 잔기 또는 이보다 더욱 긴, 예를 들면, 13개 아미노산 잔기의 링커 펩티드를 통하여 달성할 수 있다. 상기 링커는 트리펩티드 서열 E-F-M(Glu-Phe-Met), 예를 들면, SDF-1 서열과 면역글로불린 서열 사이에 도입된 Glu-Phe-Gly-Ala-Gly- Leu-Val-Leu-Gly-Gly-Gln-Phe-Met을 포함하는 13개 아미노산 링커 서열이다. 생성된 융합 단백질은 체액 내에서 체류 시간(반감기) 연장, 특이적 활성 증가, 발현 수준 증가 또는 융합 단백질의 용이한 정제와 같은 향상된 특성을 보유한다.
다른 바람직한 구체예에서, SDF-1은 Ig 분자의 불변 영역에 융합된다. 적절하게는, 이는 예로써, 사람 IgG1의 CH2와 CH3 도메인과 같은 중쇄 영역에 융합된다. Ig 분자의 다른 동등형은 본 발명에 따른 융합 단백질, 예를 들면, 동등형 IgG2 또는 IgG4, 또는 다른 Ig 종류(IgM)의 생산에도 적합하다. 융합 단백질은 단량체 또는 다량체(헤테로- 또는 동종-)일 수 있다. 융합 단백질의 면역글로불린 부분은 보체 결합(complement binding) 또는 보체 캐스케이드(complement cascade)를 활성화시키지 않거나 Fc-수용체에 결합하도록 하는 방식으로 더욱 변형될 수도 있다.
SDF-1의 다른 융합 단백질은 이량체(dimer), 삼량체(trimer) 등의 형성을 가능하게 하는, 다른 단백질로부터 분리된 도메인을 융합함으로써 제조된다. 본 발명의 폴리펩티드의 다량체화(multimerization)를 가능하게 하는 단백질 서열의 실례는 hCG(WO 97/30161), 콜라겐 X(WO 04/33486), C4BP(WO 04/20639), Erb 단백질(WO 98/02540), 또는 꼬인 나선 펩티드(WO 01/00814)와 같은 단백질로부터 분리된 도메인이다.
본 발명은 또한, 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서, 동시, 순차적, 또는 독립된 이용을 위한 SDF-1과 면역억제제(immunosuppressive agent)의 병용에 관계한다. 면역억제제는 스테로이드(steroid), 메토트렉세이트(methotrexate), 시클로포스파마이드(cyclophosphamide), 항-백혈구 항체(anti-leukocyte antibody)(가령, CAMPATH-1) 등이다.
본 발명은 또한, 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서, 동시, 순차적, 또는 독립된 이용을 위한 SDF-1과 인터페론 및/또는 오스테오폰틴 및/또는 클루스테린의 병용에 관계한다.
본 명세서에서 "인터페론"은 예로써, 상기 "배경기술" 섹션에서 언급된 임의 종류의 IFN을 포함하는, 기존문헌에서 이와 같이 정의된 임의의 분자를 포함한다. 인터페론은 가급적, 인간으로부터 유래되고, 생물학적 활성이 인간 인터페론과 유사하고 인간에서 면역원성을 나타내지 않는 경우에 다른 종으로부터 유래될 수도 있다.
특히, 임의 종류의 IFN-α, IFN-β, IFN-γ가 상기 정의에 포함된다. IFN-β는 본 발명에서 선호되는 IFN이다.
본 명세서에서 "인터페론-베타(IFN-β)"는 생물학적 유체로부터 분리에 의해, 또는 원핵 또는 진핵 숙주 세포로부터 DNA 재조합 기술에 의해 획득되는 인간 섬유아세포 인터페론 및 이의 염, 기능 유도체, 변이체, 유사체, 단편을 포함한다.
특히, 장기간 지속하도록 유도체화되거나 착화제(complexing agent)와 결합된 단백질이 중요하다. 가령, 앞서 언급된 바와 같은 PEG화 이형, 또는 체내에서 장기간 활성을 나타내도록 유전자 조작된 단백질이 본 발명에 이용될 수 있다.
"유도체"는 한 아미노산이 20개의 자연 발생 아미노산 중에서 다른 아미노산으로 치환되지 않은 유도체만을 포함한다.
인터페론 역시 단백질의 안정성을 향상시키기 위하여 중합체에 공액될 수 있다. 인터페론 β와 폴리올 폴리에틸렌글리콜(polyol Polyethlyenglycol, PEG) 사이의 공액체(conjugate)는 예로써, WO99/55377에서 기술되었다.
본 발명의 다른 바람직한 구체예에서, 인터페론은 인터페론-β(IFN-β), 더욱 바람직하게는, IFN-β1a이다.
적절하게는, SDF-1은 인터페론과 동시에, 순차적으로, 또는 독립적으로 이용된다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, SDF-1은 대략 0.001 내지 1 ㎎/체중 ㎏, 또는 대략 0.01 내지 10 ㎎/체중 ㎏ 또는 대략 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 ㎎/체중 ㎏ 또는 대략 0.1 내지 1 ㎎/체중 ㎏의 양으로 이용된다.
본 발명은 또한, 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 핵산 분자의 용도에 관계하는데, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 6의 핵산 서열 또는 아래에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함한다:
(a) SEQ ID NO: 1의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
(b) SEQ ID NO: 4의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
(c) SEQ ID NO: 7의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
(d) 신호 서열, 바람직하게는, SEQ ID NO: 5의 아미노산을 더욱 포함하는 (a) 내지 (c) 중에서 하나의 폴리펩티드;
(e) (a) 내지 (d) 중에서 하나의 뮤테인, 여기서 아미노산 서열은 (a) 내지 (c)에서 서열 중에서 적어도 하나에 적어도 40% 또는 50% 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 동일성을 보유하고;
(f) 높은 엄밀도 조건 하에 (a) 내지 (c) 중에서 하나를 인코딩하는 고유 DNA 서열의 보체에 혼성화되는 DNA 서열에 의해 인코딩되는 (a) 내지 (d) 중에서 하나의 뮤테인;
(g) 아미노산 서열에서 변화가 (a) 내지 (c)에서 아미노산 서열에 보존성 아미노산 치환인 (a) 내지 (d) 중에서 하나의 뮤테인; 또는
(h) (a) 내지 (d) 중에서 하나의 염 또는 동소체, 융합 단백질, 기능 유도체, 또는 활성 분획물.
핵산은 예로써, 근육내 주사(intramuscular injection)에 의해 나신 핵산 분자로서 투여된다.
핵산은 인체 내에서, 바람직하게는, 적절한 세포 또는 조직 내에서 핵산 분자에 의해 인코딩되는 유전자의 발현에 유용한 벡터 서열, 예를 들면, 바이러스 서열을 더욱 포함할 수 있다.
이런 이유로, 바람직한 구체예에서, 핵산 분자는 발현 벡터 서열을 더욱 포함한다. 발현 벡터 서열은 당분야에 널리 공지되어 있고, 목적 유전자의 발현을 가능하게 하는 구성요소를 더욱 포함한다. 이들은 조절 서열, 예를 들면, 프로모터와 인핸서 서열, 선별 마커 서열, 복제 기점 등을 더욱 포함한다. 따라서, 질병을 치료 및/또는 예방하는데 유전자 치료법이 이용된다. 유리하게는, SDF-1의 발현이 in situ 진행된다.
바람직한 구체예에서, 발현 벡터는 렌티바이러스 유래된 벡터이다. 렌티바이러스 벡터는 특히, CNS 내에서 유전자의 전달에 매우 효과적인 것으로 밝혀졌다. 다른 널리 확립된 바이러스 벡터, 예를 들면, 아데노바이러스 유래된 벡터 역시 본 발명에 이용될 수 있다.
뇌-혈관 장벽을 통한 SDF-1의 통과를 강화시키기 위하여 표적된 벡터가 이용된다. 이들 벡터는 예로써, 트랜스페린(transferrin) 수용체 또는 다른 내피 수송 기전(endothelial transport mechanism)을 표적한다.
본 발명의 바람직한 구체예에서, 발현 벡터는 근육내 주사로 투여된다.
정상 상태에서는 SDF-1의 발현이 중단되는 또는 충분한 양의 SDF-1을 발현하지 못하는 세포에서 SDF-1의 내생적 생산을 유도 및/또는 강화하기 위한 벡터의 용도 역시 본 발명에 포함된다. 상기 벡터는 SDF-1을 발현하도록 소요의 세포 내에서 작동하는 조절 서열을 포함한다. 이런 조절 서열은 예로써, 프로모터 또는 인헨서이다. 이후, 조절 서열은 동종 재조합(homologous recombination)으로 게놈의 정확한 좌위 내로 도입될 수 있는데, 여기서 이러한 조절 서열은 발현을 유도 또는 강화시켜야 하는 유전자에 작동가능하게 연결된다. 이러한 기술은 "내생적 유전자 활성화(EGA)"라 한다(WO 91/09955).
본 발명은 또한, 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 SDF-1을 생산하도록 유전자 조작된 세포의 용도에 관계한다.
본 발명은 또한, 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 SDF-1을 생산하도록 유전자 조작된 세포에 관계한다. 따라서, 인체의 적절한 부위로 약제를 전달하기 위하여 세포 치료법이 이용될 수 있다.
본 발명은 또한, 신경 질환의 예방 및/또는 치료에 특히 유용한 제약학적 조성물에 관계하는데, 이는 치료 효과량의 SDF-1 및/또는 치료 효과량의 인터페론 및/또는 오스테오폰틴 및/또는 클루스테린 및 선택적으로 치료 효과량의 면역억제제를 함유한다.
"제약학적으로 수용가능한"은 활성 성분의 생물학적 효능을 방해하지 않고 투여된 숙주에 독성을 보이지 않는 임의의 담체를 의미한다. 가령, 비경구 투여에서, 활성 단백질은 식염수, 덱스트로스 용액, 혈청 알부민, 링거액과 같은 운반제에 녹인 주사용 단위 약형(unit dosage form)으로 제조될 수 있다.
본 발명에 따른 제약학적 조성물의 활성 성분은 다양한 방법으로 개체에 투여할 수 있다. 투여 경로에는 피내, 경피(가령, 느린 방출 제형), 근육내, 복강내, 정맥내, 피하, 경구, 경막외, 국소, 수막강내, 직장, 비강내 경로가 포함된다. 임의의 다른 치료 효과적 투여 경로, 예를 들면, 상피나 내피 조직을 통한 흡수, 또는 활성 성분을 인코딩하는 DNA 분자를 환자에 투여하고(가령, 벡터를 통하여) 상기 DNA 분자가 생체내에서 활성 성분을 발현하고 분비하는 유전자 요법이 이용될 수 있다.
이에 더하여, 본 발명에 따른 단백질은 제약학적으로 수용가능한 계면활성제, 부형제, 담체, 희석제, 운반제와 같은 다른 생물학적 활성 성분과 함께 투여될 수 있다.
비경구(가령, 정맥내, 피하, 근육내) 투여에서, 활성 단백질은 제약학적으로 수용가능한 비경구 운반제(가령, 물, 식염수, 덱스트로스 용액) 및 등장성(가령, 만니톨) 또는 화학적 안정성(가령, 보존제와 완충제)을 유지시키는 첨가제와 혼합된 용액, 현탁액, 에멀젼 또는 동결건조된 분말 형태로 제조될 수 있다. 상기 제형은 통상의 기술로 멸균된다.
본 발명에 따른 활성 단백질의 생체이용효율은 인체 내에서 분자의 반감기를 증가시키는 공액 과정으로, 예로써, 상기 분자를 폴리에틸렌글리콜(PEG)에 연결함으로써 개선될 수 있다(PCT 특허 출원 WO 92/13095).
활성 단백질의 치료 효과량은 단백질의 유형, 단백질의 친화성, 길항물질에 의한 임의의 잔류 세포 독성, 투여 경로, 환자의 임상적 상태(내생적 SDF-1 활성의 비-독성 수준 유지 필요성 포함)를 비롯한 다양한 변수의 함수다.
"치료 효과량"은 신경 질환에 대한 유익한 효과를 나타내는 SDF-1의 투여량이다. 개체에 단일 또는 복수 투약으로 투여되는 용량은 SDF-1 약동학적 특성, 투여 경로, 환자 상태와 특성(성별, 연령, 체중, 건강, 크기), 증상의 정도, 병행 치료법, 치료 빈도, 소요 효과를 비롯한 다양한 인자에 따라 달라진다.
앞서 언급된 바와 같이, SDF-1은 대략 0.001 내지 1 ㎎/체중 ㎏, 또는 대략 0.01 내지 10 ㎎/체중 ㎏ 또는 대략 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 ㎎/체중 ㎏ 또는 대략 0.1 내지 1 ㎎/체중 ㎏의 양으로 이용된다.
본 발명에서 바람직한 투여 경로는 피하 경로에 의한 투여이다. 본 발명에서 다른 바람직한 투여 경로는 근육내 투여이다.
다른 바람직한 구체예에서, SDF-1은 매일 또는 격일로 투여된다.
일일 복용량은 분할 분량으로 또는 소요 결과를 달성하는데 효과적인 서방 형태로 제공된다. 2차 또는 후속 투여는 개체에 투여된 초기량 또는 이전 용량과 동일한, 이보다 적은 또는 이보다 많은 용량으로 실시될 수 있다.
본 발명에 따라, SDF-1은 예방이나 치료 목적으로, 치료 효과량의 다른 치료 섭생이나 약제(가령, 다중 약제 요법), 특히 인터페론에 앞서, 동시에 또는 순차적으로 개체에 투여될 수 있다. 다른 치료제와 동시에 투여되는 활성 약제는 동일하거나 상이한 조성물로 투여될 수 있다.
본 발명은 또한, 신경 질환을 치료하는 방법에 관계하는데, 상기 방법은 선택적으로 제약학적으로 수용가능한 담체와 함께, 효과량의 SDF-1, 또는 SDF-1 활성 작용제를 병든 환자에 투여하는 단계를 포함한다.
선택적으로 제약학적으로 수용가능한 담체와 함께, 효과량의 SDF-1 또는 SDF-1 활성 작용제 및 인터페론을 병든 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 신경 질환을 치료하는 방법 역시 본 발명에 속한다.
선택적으로 제약학적으로 수용가능한 담체와 함께, 효과량의 SDF-1 또는 SDF-1 활성 작용제 및 오스테오폰틴을 병든 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 신경 질환을 치료하는 방법 역시 본 발명에 속한다.
선택적으로 제약학적으로 수용가능한 담체와 함께, 효과량의 SDF-1 또는 SDF-1 활성 작용제 및 클루스테린을 병든 환자에 투여하는 단계를 포함하는, 신경 질환을 치료하는 방법 역시 본 발명에 속한다.
논문이나 초록, 공개되거나 공개되지 않은 특허 출원, 허여된 특허, 또는 임의 다른 자료를 비롯한 본 명세서에 언급된 모든 자료, 예를 들면, 모든 데이터, 표, 도면 및 언급된 자료에 제시된 참고문헌은 순전히 참조로서 편입된다.
공지된 방법 단계, 통상적인 방법 단계, 공지된 방법 또는 통상적인 방법에 대한 참조는 본 발명의 임의 측면, 설명 또는 구체예가 선행 기술에 개시, 교시 또는 제안되었음을 인정하는 것이 아니다.
특정 구체예의 전술한 설명에서는 본 발명의 전반적인 특성을 제시하는데, 당업자는 통상적인 지식을 활용하여 과도한 실험없이 본 발명의 기술적 사상과 범주를 벗어나지 않는 범위에서 이들 특정 구체예를 용이하게 개변할 수 있다. 이런 이유로, 이들 개변은 본원에 제시된 교시와 보도에 기초하여, 이들 개시된 구체예의 등가물 범위 내에 속한다. 본 명세서에 이용된 용어는 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이를 제한하지 않으며, 본원에 개시된 내용에 비추어 당업자가 통상적인 지식으로 이해할 수 있다.
본 발명을 특정 실시예와 연계하여 기술하였지만, 이들 실시예는 설명을 목적으로 하고, 본 발명을 제한하지 않는다.
인간 재조합 케모킨 SDF-1α와 SDF-1α 변이체는 사내에서 생산하였다. 코딩 서열(SDF-1α의 경우 SEQ ID NO: 1 및 SDF-1α 변이체의 경우 SEQ ID NO: 4)은 pET20b+ 벡터의 Nde1/BamHI 부위 내로 클론하고 대장균(E. coli) 세포 내에서 발현시켰다.
실시예 1: LPS로 처리된 SDF-1과 SDF-1 변이체 활성 혼합된 외피 배양액
도입
CNS는 면역학적으로 면제된 부위로 간주되긴 하지만, 현저한 염증 반응을 나타낼 수 있는데, 이는 다양한 신경 질환에서 중요한 역할을 수행한다. 소교세포(microglia)는 CNS 염증을 시작하고 지속시키는데 특히 중요한 것으로 보인다. 이들 세포는 정상 CNS에서 무활동 형태(quiescent form)로 존재하지만, 감염 또는 T 세포에 의한 자극이후 대식세포-유사 특성(활성 식세포작용(phagocytosis), 항원 제시(antigen presentation)에 필요한 단백질의 상향조절(upregulation), 친염증성 사이토킨의 생산)을 획득한다.
시험관내와 생체내에서 이러한 염증 환경은 그람 음성 세균(gram negative bacteria)의 외부막의 성분인 리포폴리사카라이드(lipopolysaccharide, LPS)에 의해 모방될 수 있다. LPS는 Toll 수용체4를 통하여 식세포(phagocytic cell)에 의한 폭발적인 염증 반응을 유발하는 선천성 인식(innate recognition)의 가장 특징적인 예이다. LPS는 순수한, 공동- 또는 혼합 배양액 내에서 소교세포를 활성화시키는 목적으로 폭넓게 이용되고 있다. 낮은 수준의 LPS는 세포 사멸을 유도하지 않으면서 사이토킨 방출(cytokine release)을 유도하지만, 높은 용량은 시험관내(Lehnardt et al., 2002; Sadir et al., 2001)와 생체내(Lehnardt et al., 2003; Sadir et al., 2001)에서 희소돌기아교세포(oligodendrocyte) 또는 신경 변성을 유발할 수 있다.
재료와 방법
일차 혼합된 외피 배양액 제조
일차 세포의 배양은 성교이후 16일 시점에 NMRI 생쥐로부터 분리된 배아로부터 뇌 조직을 이용하여 기존 문헌(Lubetzki et al., 1993)에 기술된 바와 같이 수행하였다. 대뇌반구(cerebral hemisphere)는 태아 뇌로부터 절개하고, 트립신 절단(trypsin digestion)을 통하여 분리하며, 단일 세포 현탁액은 BioCoatㄾ 폴리-L- 리신 코팅된 96-웰 평판(356516, Becton Dickinson)으로 웰당 50 ㎕ 수초화 배지(myelination medium)에 5x104개 세포로 접종하였다. 수초화 배지는 1% FCS, 1% 페니실린-스트렙토마이신 용액(Seromed), 10 ng/㎖에서 재조합 혈소판-유래된 성장 인자 AA(PDGF-AA, R&D Systems)로 보충된 Bottenstein-Sato 배지(Bottenstein and Sato, 1979; Sadir et al., 2001)로 구성되었다.
일차 혼합된 외피 배양액의 LPS로 처리: 검사 설정(set-up)
LPS로 자극된 일차 혼합된 외피 배양액으로부터 사이토킨 방출의 설정을 위하여, 배양액은 14일 동안 37℃와 10% CO2에서 성장시키고, 이후 증가하는 농도(0, 0.5, 1, 2.5, 5 ng/㎖)의 LPS로 48시간 동안 자극하였다.
48 시간의 LPS 자극후, 80 ㎕의 상층액을 수집하고 내용물 분석에 앞서 -80℃에서 냉동시켰다:
- CBA 생쥐 염증 키트(BD Biosciences 552364) SDF-1을 통하여 분석된 사이토킨 방출(TNF-α와 IL-6)
- 사내에 설정되고 아래에 기술된 샌드위치 ELISA를 이용한 SDF-1α.
- MTS 검사법(Promega G5421; 세포 밀도(cell density)와 상관하는 것으로 밝혀진 불용성 포르마잔(formazan) 염의 형성을 통하여 미토콘드리아 활성을 측정하는 비-방사성 세포 증식 검사)을 이용하여 평가된 세포 생존능(cell viability).
SDF-1α ELISA
혼합된 외피 배양액 내에서 SDF-1α 수준의 정량을 위한 샌드위치 ELISA를 사내 설정하였다. 100 ㎕/웰의 단클론 항-생쥐 SDF-1(1:500 R&D Systems Inc, Minneapolis, USA)을 코팅하기 위하여, 100 ㎕/웰의 비오틴화된 다클론 항-생쥐 IgG(1:400 R&D Systems Inc, Minneapolis, USA)를 이차 항체로서 이용하고, 100 ㎕/웰의 엑스트라비딘(extravidin)-공액된 양고추냉이 과산화효소(horseradish peroxidase)(1:5000 Sigma, St. Louis, MO, USA)를 이용하였다. 재조합 생쥐 SDF-1(2000 내지 10 ng/㎖ R&D Systems Inc, Minneapolis, USA)을 이용하여 표준 곡선(standard curve)을 작성하였다. 시각화를 위하여, 100 ㎕/웰의 기질 반응물 팩은 안정화된 과산화수소(hydrogen peroxide)와 테트라메틸벤지딘(tetramethylbenzidine)(R&D Systems Inc, Minneapolis, USA)의 혼합물을 이용하였다. 흡광도(optical density)는 450 nm에서 형광평판 판독기(fluoroplate reader)(Labsystems Multiskan EX)를 이용하여 측정하였다.
LPS 자극된 배양액 내에서 사이토킨 발현에 대한 SDF-1α와 SDF-1α 변이체 효과
LPS 자극된 배양액에 대한 SDF-1α와 SDF-1α 변이체(SEQ ID NO: 4에 정의됨)의 효과를 검사하기 위하여, 세포는 2주 동안 성장시켰다. 14일에, 세포는 37℃와 10% CO2에서 3시간 동안 25 ㎕의 배지 내로 증가하는 농도(0.001, 0.1, 10 ng/㎖)의 해당 단백질과 함께 미리-배양하였다. 이후, 25 ㎕의 배지 내로 5 ng/㎖의 농도에서 이들 세포에 LPS를 보충하여 100 ㎕의 최종 부피를 획득하고 48시간 동안 배양하였다. 상층액은 16일에 수집하고, R&D systems로부터 구입된 특이적인 ELISA(DuoSet 생쥐 TNF-α ELISA DY410, 생쥐 IL-6 ELISA DY406)를 통하여 TNF-α와 IL-6(활성화된 소교세포에 의해 방출된 주요 사이토킨)의 수준을 측정하였다.
활성화된 소교세포로부터 사이토킨 방출을 저해하는 것으로 밝혀진 2개의 대조 분자, 덱사메타손(dexamethasone)과 생쥐 IL-10을 이용하였다.
데이터 분석
데이터의 전체적인 분석은 일원 ANOVA를 이용하여 수행하였다. Dunnett 검증을 더욱 이용하고, 데이터를 "처리되지 않은 세포"와 비교하였다. 유의성(significance) 수준은 a: p < 0.001; b 또는 **: p < 0.01; c 또는 *: p < 0.05; d: p < 0.1로 설정되었다. 결과는 평균ㅁ평균의 표준오차(s.e.m.)로 표시되었다.
결과
검사 설정
TNF-α, IL-6 분비는 2.5와 5 ng/㎖에서 LPS로 유도하였는데, 이들 용량은 복합 배양액에서 비-독성이었다. 이에 더하여, 다양한 농도(0, 0.5, 1, 2.5, 5 ng/㎖)의 LPS가 내생적 SDF-1α 수준에 영향을 주지 않았다(결과 제시하지 않음).
SDF-1α와 SDF-1α 변이체
이들 결과는 10ng/㎖에서 IL-10과 덱사메타손(25pM)이 처리되지 않은 세포와 비교하여 TNF-α와 IL-6을 하향 조절한다는 것을 입증하였다. SDF-1α와 SDF-1α 변이체는 처리되지 않은 세포와 비교하여 LPS로 자극이후 혼합된 외피 배양액 내에서 TNF-α와 IL-6 분비의 수준을 유의하게 감소시켰는데, 최적 농도는 10 ng/㎖이 었다(도 1A와 1B).
결론
이들 혼합된 외피 배양액은 별아교세포(astrocyte), 소교세포, 뉴런, 희소돌기아교세포를 비롯한 여러 신경-상피 세포형을 포함하는 복합적인 체계를 구성한다. SDF-1α의 비-GAG 결합 돌연변이체, SDF-1-α 변이체는 SDF-1α와 유사한 방식으로 TNF-α와 IL-6을 감소시키는데, 이는 GAG 돌연변이가 수용체 CXCR4에 SDF-1α 결합에 영향을 주지 않는다는 것을 암시한다.
LPS 처리된 혼합된 외피 배양액 내에서 SDF-1α와 SDF-1α 변이체로 관찰되는 사이토킨의 저해는 소교세포에 대한 SDF-1의 직접적인 작용, 또는 CXCR4 수용체 발현 별아교세포 또는 뉴런에 대한 간접적인 효과에 기인하는 것으로 생각된다.
임상 과정에 따라, MS는 여러 종류로 분류될 수 있고, MS 환자는 질병 활성(disease activity)의 상이한 패턴으로 계층화될 수 있다. 극히 드물긴 하지만 재발 이후에 질병으로부터 완전히 회복하는 환자는 양성 MS 환자로 간주된다. MS의 가장 일반적인 형태인 재발-완화성 MS(relapsing-remitting MS, RRMS)는 MS 환자의 85 - 90%에서 관찰되고, 순환성 재발(recurrent relapse) 및 이후의 결함-잔류성 회복 단계(recovery phase)로 특성화된다. 이들 공격은 CNS 내로 미엘린-반응성 T 세포의 왕래에 의해 유발될 가능성이 높고, 급성 염증을 유발한다. 시간의 흐름에서, 재발로부터 회복의 정도가 감소하고, 기선 신경학적 불능(baseline neurological disability)이 증가한다. 궁극적으로, 대략 40%의 RRMS 환자는 더 이상 공격을 받지 않지만 이차 진행성 MS(SPMS)로 알려져 있는 만성 CNS 염증에 관련 된 진행성 신경-변성 이차 질환(progressive neuro-degenerative secondary disorder)이 발병한다(Confavreux et al., 2000). 상기 질환의 이러한 이차 진행성 형태로의 진전은 현저하게 적은 활성 병소 및 뇌 실질 용적(brain parenchymal volume)에서 감소와 연관된다. 초기 RRMS는 면역억제(immunosuppression)에 민감한 반면, SPMS에서는 면역요법(immunotherapy)에 대한 반응이 감소하고 후기 형태에서는 심지어 소멸된다. 이런 이유로, RRMS와 SPMS는 2가지 별개의 질병이 아닌 연속체(continuum)인 것으로 가정될 수 있는데, 여기서 초기에 급성 염증 현상(acute inflammatory event)은 신경변성 과정의 이차적인 유도를 결과한다.
MS의 일차 진행성 형태(PPMS)는 발병으로부터 급성 공격의 부재로 특성화되고, 그 대신에 점진적인 임상적 쇠약을 수반한다. 임상적으로, 상기 질환의 이러한 형태는 임의의 면역요법 형태에 대한 반응의 부재와 연관된다. 하지만, 일차 진행성 다발성 경화증의 병리생태(pathobiology)에 관하여 알려진 바는 거의 없고, 검시(postmortem) 연구에서는 이들 환자에서 신경-변성이 염증보다 우세하다는 것을 암시한다. 흥미롭게도, 회백질(grey matter) 손상은 불능(disabilty)의 후속적인 악화의 가장 강한 증세원적 예언자(paraclinical predictor)로서, 일차 진행성 MS의 진전을 전조한다(Rovaris 2006). 회백질 내에서 소교세포 활성화는 가속화된 신경 손실과 뇌 위축(brain atrophy) 발생의 원인이 될 수도 있다. 이런 이유로, SDF-1알파와 SDF-1 변이체는 소교세포 활성화와 신경 생존을 조절하는 잠재력으로 인하여, 일차 진행성 MS을 치료할 수 있는 잠재력을 갖는다. 신경 손실을 유발하는 병태생리학적 기전(pathophysiological mechanism) 중의 일부는 일차와 이차 MS 형 태에서 중복될 수도 있다.
실시예 2: 복막 세포 동원의 생체내 모형에서 백혈구 동원에 대한 SDF-1α 변이체 효과
케모킨의 주요한 역할은 염증 반응(inflammatory response)과 면역 감시(immune surveillance) 동안 특정 백혈구 집단의 이동을 통제하는 것이다. 케모킨은 7개의 막통과 G 단백질-결합된 수용체에 결합으로 생물학적 효과를 나타낸다. 이들은 또한, 양쪽 가용성 글리코사미노글리칸(GAG) 및 세포 표면상에 GAG에 결합할 수 있는데, 이는 케모킨의 국소 농도를 강화시키고, 이들의 소중합체화(oligomerization)를 촉진하고, 수용체에 대한 이들의 전시를 조장한다. 최근에, GAG와 케모킨의 상호작용이 생체내에서 케모킨의 주화성 기능에 요구되는 것으로 밝혀졌다.
재료와 방법
8-12 주령 암컷 Balb/C 생쥐(Janvier, France)는 200 ㎕ NaCl(0.9%, LPS 없음), 또는 200 ㎕ NaCl(0.9%, LPS 없음)에 희석된 케모킨 4 ㎍(SEQ ID NO:4에 따른 WT SDF-1α 또는 SDF-1α 변이체)를 복막내(i.p.) 주입하였다. WT 또는 돌연변이 SDF-1α의 주입후, 생쥐는 CO2 질식(asphyxiation)으로 희생시키고, 복강(peritoneal cavity)은 3 x 5㎖ 차가운 PBS로 세척하고, 개별 생쥐에 대한 전체 세척액(lavage)은 모았다. 수집된 전체 세포는 혈구계산기(haemocytometer)(Neubauer, Germany)로 계산하였다.
결과
복막내 주입된 SDF-1α는 백혈구를 동원한다. SDF-1α 변이체는 백혈구를 동원하지 않았는데, 이는 생체내 GAG 결합 활성이 SDF-1α 변이체에서 돌연변이에 의해 상실됨을 증명한다(도 2).
결론
SDF-1α 변이체(SDF-1의 GAG 결합 결함성 돌연변이체)는 생체내에서 백혈구 동원 활성을 보이지 않는다.
실시예 3: EAE 척수(만기) 내에서 SDF-1α 정량
도입
SDF-1α 발현은 만성 단계에서 MOG 펩티드로 유도된 EAE를 앓는 생쥐로부터 절개된 척수 내에서 정량하였다. 이러한 실험적 자가면역 뇌척수염(experimental autoimmune encephalomyelitis, EAE) 모형은 뮤린 만성 탈수초성 모형이고, 다발성 경화증(MS)의 확립된 동물 모형이다. 생쥐에서 EAE의 유도에 이용되는 방법은 Sahrbacher 등(Sahrbacher et al., 1998)에 의해 공개된 프로토콜로부터 개조된다.
재료와 방법
척수 샘플링(spinal cord sampling)
척수는 발병, 다시 말하면, 임상 징후(clinical sign)로서 꼬리 마비의 존재후 4주 시점에, EAE를 앓는 생쥐로부터 절개하였다. 생쥐는 차가운 PBS로 관류하고, 척수는 프로테아제 저해물질 칵테일(protease inhibitor cocktail)(Roche Molecular Biochemicals, 1836170, 10 ㎖ 완충액마다 1개의 정제)을 포함하는 삼중 세정제 완충액(50 mM Tris, pH 8.0, 150 mM NaCl, 0.02% NaN3, 0.1% SDS, 1% Nonidet P-40, 0.5% 데옥시콜린산나트륨(sodium deoxycholate)) 내로 절개하였다. 획득된 조직 ㎎당 100 ㎕의 완충액이 이용되었다. 조직 샘플은 균질화(homogenization)에 의한 제조와 차후 분석(subsequent analysis)에 앞서 -20℃에서 플라스틱 에펜도르프 튜브(eppendorf tube) 내에 보관하였다.
척수의 SDF-1α 함량의 분석
척수는 녹이고, 폴리트론(polytron)을 이용하여 삼중 세정제 완충액 내에서 균질화시켰다. 샘플 내에서 단백질 수준은 상기 실시예 1의 "재료와 방법" 섹션에 기술된 ELISA를 이용한 SDF-1α 함량 분석에 앞서, BCA 단백질 함량 측정검사(Pierce Biotechnology, Rockford IL61105, USA)를 통하여 정량하였다.
결과
도 3에서는 EAE의 만성 단계에서 EAE 동물의 척수 조직 내에서 SDF-1α의 상향조절을 도시한다.
결론
만성 MOG EAE 단계로부터 EAE 척수 추출물 내에서 SDF-1α 단백질의 상향 조절은 염증성 세포 동원 이외에 신경-염증에서 SDF-1α에 대한 역할을 암시한다.
실시예 4: 좌골 신경(sciatic nerve) 분쇄에 의해 유도된 신경병증에 대한 SDF-1α의 보호 효과
도입
본 연구는 상이한 용량에서 SDF-1α로 처리된 생쥐 내에서 신경 재생(nerve regeneration)과 재수초화(remyelination)를 평가하기 위하여 수행하였다. 뉴런과 축색돌기(axonal)(감각과 운동 뉴런) 생존과 재생, 또는 탈수초화(myelination) 또는 대식세포(macrophage) 염증에 대한 SDF-1α의 긍정적인 효과는 운동 기능(motor function)의 회복을 유도한다. 이러한 재생은 전기생리학적 기록(electrophysiological recording)에 의해 평가될 수 있는 감각운동(sensorimotor) 기능의 회복에 따라 측정할 수 있다.
재료와 방법
동물
30 마리의 8주령 암컷 C57bl/6 RJ 생쥐(Elevage Janvier, Le Genest-St-Isle, France)를 이용하였다. 이들은 6개 군(n = 6)으로 분류하였다:
(a) 신경 분쇄/운반제(식염수/0.02% BSA);
(b) 신경 분쇄/SDF-1α(3 ㎍/㎏);
(c) 신경 분쇄/SDF-1α(10 ㎍/㎏);
(d) 신경 분쇄/SDF-1α(30 ㎍/㎏);
(e) 신경 분쇄/SDF-1α(100 ㎍/㎏);
(f) 신경 분쇄/IL-6 (30 ㎍/㎏).
이들 동물은 군별로 사육되고(우리당 6마리 동물), 온도(21-22℃)가 통제되고 밝음-어둠 주기(12h/12h)가 반복되는 장소에 유지되며, 사료와 물을 자유롭게 먹을 수 있도록 하였다. 모든 실험은 연구 가인드라인(institutional guideline)에 따라 수행되었다.
좌골 신경의 병소
이들 동물은 3% Isofluranㄾ(Baxter)의 흡입으로 마취시켰다. 우측 좌골 신경은 중간 넓적다리 수준에서 외과적으로 노출시키고, 좌골 신경의 삼분기(trifurcation)에서 5 ㎜ 근위 부위에서 분쇄하였다. 신경은 각 분쇄 간에 90-도 회전하여 지혈 포셉(haemostatic forcep)(너비 1.5 ㎜; Koenig; Strasbourg; France)으로 30초 동안 2회 분쇄하였다.
실험과 약리학적 처리의 계획
근전도(electromyographical, EMG) 검사는 수술일 이전에 1회 수행하고, 수술후 3주 동안 주1회 수행하였다.
신경 분쇄 수술 당일은 dpl 0(dpl = 병소후 일자)으로 간주되었다. 분쇄후 4일 동안 어떤 검사도 수행하지 않았다.
신경 손상 일부터 연구 종결 시점까지, SDF-1α, IL-6 또는 운반제는 피하 주사(s.c.) 경로로 주5일 투여하였다.
전기생리학적 기록
전기생리학적 기록은 Neuromatic 2000M 근전계(electromyograph)(EMG)(Dantec, Les Ulis, France)를 이용하여 수행하였다. 생쥐는 3% Isofluranㄾ(Baxter)의 흡입으로 마취시켰다. 가열된 작업대 (Minerve, Esternay, France)를 이용하여 정상적인 체온을 유지시켰다.
합근 활동 전위(compound muscle action potential, CMAP)는 최대 상(supramaximal intensity)(12.8 mA)에서 좌골 신경의 단일 0.2 ms 자극이후 비복근(gastrocnemius muscle)에서 측정하였다. 활동 전위(action potential)의 진폭(amplitude)(mV)과 잠복(latency)(ms)은 수술된 다리에서 측정하였다. 이들 치수는 운반제 처리된 동물(기선)의 반대쪽(분쇄되지 않은) 다리에서도 기록하였다. 진폭은 활성 운동신경 단위(active motor unit)의 총수를 지시하는 반면, 원위 잠복(distal latency)은 수초화(myelination)의 정도에 부분적으로 의존하는 운동 신경 전도(motor nerve conduction)와 신경근 전달 속도(neuromuscular transmission velocity)를 간접적으로 반영한다.
데이터 분석
데이터의 전체적인 분석은 일원 ANOVA를 이용하여 수행하였다. Dunnett 검증을 더욱 이용하고, 데이터를 "운반제" 대조와 비교하였다. 유의성(significance) 수준은 a: p < 0.001; b 또는 **: p < 0.01; c 또는 *: p < 0.05; d: p < 0.1로 설정되었다. 결과는 평균ㅁ평균의 표준오차(s.e.m.)로 표시되었다.
전기생리학적 측정
합근 활동 전위(compound muscular action potential)의 진폭(도 4A):
전체 연구 기간 동안 CMAP 진폭에서 유의한 차이는 운반제 처리된 동물(기선)의 반대쪽(분쇄되지 않은) 다리에서 관찰되었다. 대조적으로, 좌골 신경의 분쇄는 각각의 기선 수준과 비교하여, dpl 7과 dpl 15에서 대략 80%의 운반제 처리된 군에서 감소로 CMAP의 진폭에서 급격한 감소를 유도하였다. 생쥐를 30 ㎍/㎏ 또는 μ/kg에서 SDF-1α, 또는 30 μ/kg에서 IL-6으로 처리하는 경우에, 이들 생쥐는 처 리되지 않은 생쥐에서 수준과 비교하여 CMAP 진폭에서 증가(대략 1.5 배)를 보였는데, 이러한 효과는 dpl 15와 dpl 22에서 유의하였다.
합근 활동 전위의 잠복(도 4.B):
전체 연구 기간 동안 운반제 처리된 동물의 반대쪽(분쇄되지 않은) 다리에서 CMAP 잠복의 악화는 관찰되지 않았다. 대조적으로, 분쇄된 쪽에서 근육은 기선보다 높은 CMAP 잠복을 보였다. SDF-1α로 처리된 생쥐에서 CMAP 잠복 수치는 운반제 처리된 생쥐에서 대응하는 수치와 비교하여 유의하게 감소하였다. 7일에, 이러한 효과는 30 ㎍/㎏과 100 ㎍/㎏의 SDF-1α로 처리이후에 관찰되지만 30 ㎍/㎏의 IL-6으로 처리에서는 관찰되지 않았다. dpl 15와 22에서, 유의한 효과는 30 ㎍/㎏과 100 ㎍/㎏의 SDF-1α로 여전히 달성되지만 3 또는 10 ㎍/㎏에서는 관찰되지 않았다. SDF-1α(30 ㎍/㎏)는 IL-6(30 ㎍/㎏)보다 강력하다.
결론
이러한 신경-분쇄 모형은 외상성 신경 손상과 말초 신경병증의 매우 인상적인 모형이다. 신경 분쇄 직후에, 큰 직경을 갖는 대부분의 섬유는 물리적 손상으로 인하여 상실되고, CMAP 진폭에서 강한 감소를 유도한다. CMAP 잠복은 즉각적인 영향을 받지 않지만, 이차적인 면역 매개된 변성(대식세포, 과립구)에 의한 작은 직경 섬유의 추가적인 변성으로 인하여 15일 시점에 증가를 보인다. CMAP 존속 기간은 dpl 7에서 증가하고 dpl 15에서 최고점에 도달한다.
SDF-1α는 말초 신경 분쇄후 기능(CMAP 잠복)을 복구한다. 이는 또한, 신경 분쇄 생쥐 모형에서 측정된 모든 파라미터에서 보호 효과를 보였다. 요약하면, SDF-1α는 본 연구에 이용된 참고 분자, IL-6만큼 유효하였다.
실시예 5: 좌골 신경 분쇄에 의해 유도된 신경병증에 대한 SDF-1α 변이체의 보호 효과
SEQ ID NO: 4에 정의된 SDF-1α 변이체를 조사하기 위하여 상기 실시예 4에 기술된 좌골 신경 분쇄 모형을 수행하고, 생쥐를 아래의 2개 군(n = 6)으로 분류하였다:
(a) 신경 분쇄 작업/운반제(식염수/0.02% BSA);
(b) 신경 분쇄/30 ㎍/㎏ s.c에서 SDF-1α 변이체.
운반제 처리된 동물의 반대쪽 다리에서 기록된 치수는 기선 수치로서 간주되었다.
본 실시예에 이용되고 SEQ ID NO: 4에 의해 인코딩되는 SDF-1α 변이체는 부가적인 N 말단 메티오닌을 보유하도록 발현되었다. CMAP 존속 기간(탈분극(depolarization)과 재분극(repolarization) 세션에 필요한 시간) 역시 기록하였다.
결과
전기생리학적 측정
합근 활동 전위의 진폭(도 5.A):
CMAP 진폭에서 유의한 증가는 생쥐를 SDF-1α 변이체로 처리하는 경우에 dpl 22에서 관찰되었다.
합근 활동 전위의 잠복(도 5.B):
SDF-1α 변이체로 처리된 생쥐에서 CMAP 잠복 수치는 특히, dpl 7에서 운반제 처리된 생쥐에서 대응하는 수치와 비교하여 유의하게 감소하였다. 긍정적인 효과는 dpl 22에서 여전히 달성되었다.
합근 활동 전위의 존속 기간(도 5.C):
SDF-1α 변이체로 처리된 생쥐에서 CMAP 존속 기간 수치는 dpl 7과 dpl 22에서, 운반제 처리된 생쥐에서 대응하는 수치와 비교하여 감소하였다.
결론
SDF-1α 변이체는 말초 신경 분쇄후 기능(CMAP 잠복)을 복구하는 것으로 밝혀졌다. 이는 또한, 신경 분쇄 생쥐 모형에서 측정된 모든 파라미터에서 보호 효과를 보였다.
실시예 6: 좌골 신경 분쇄에 의해 유도된 신경병증에 대한 Met-SDF-1α의 보호 효과
Met-SDF-1α(SEQ ID NO: 7에 정의됨)를 조사하기 위하여 상기 실시예 4에 기술된 좌골 신경 분쇄 모형을 수행하고, 생쥐를 아래의 2개 군(n = 6)으로 분류하였다:
(a) 신경 분쇄 작업/운반제(식염수/0.02% BSA);
(b) 신경 분쇄/100, 30, 10 ㎍/㎏ s.c에서 Met-SDF-1α 변이체.
운반제 처리된 동물의 반대쪽 다리에서 기록된 치수는 기선 수치로서 간주되었다.
CMAP 존속 기간(탈분극(depolarization)과 재분극(repolarization) 세션에 필요한 시간) 역시 기록하였다.
결과
전기생리학적 측정
합근 활동 전위의 잠복(도 6):
Met-SDF-1α로 처리된 생쥐에서 CMAP 잠복 수치는 운반제 처리된 생쥐에서 대응하는 수치와 비교하여, 분쇄후 7일과 14일 시점에 유의하게 감소하였다.
결론
SDF-1α 뿐만 아니라 Met-SDF-1α 역시 말초 신경 분쇄후 기능(CMAP 잠복)을 복구하는 것으로 밝혀졌다.
실시예 7: 당뇨성 신경병증에서 SDF-1α의 보호 효과
도입
당뇨성 신경병증은 당뇨의 가장 일반적인 만성 합병증이다. 기초 기전은 복합적이고, 고혈당증(hyperglycemia) 및 인슐린과 C-펩티드 결핍에 기인한 여러 상관된 대사 비정상(metabolic abnormality)을 수반하는 것으로 보인다. 당뇨성 신경병증을 지시하는 가장 일반적인 초기 비정상은 감소된 신경 전도 속도(nerve conduction velocity)에 의해 반영되는 무증후성 신경 기능장애(asymptomatic nerve dysfunction)이다(Dyck and Dyck, 1999). 이들 변화는 통상적으로, 발에서 진동 감각(vibration sensation)의 상실 및 발목 반사(ankle reflex)의 상실을 동반한다. 전기생리학적 치수는 빈번하게, 기초 병리(underlying pathology)를 상당히 정확하게 반영하고, 신경 전도 속도에서 변화는 신경 섬유의 수초화와 상관한 다(참조: Sima, 1994).
스트렙토조토신(streptozotocin, STZ) 당뇨성 쥐는 당뇨성 신경병증의 가장 폭넓게 연구된 동물 모형이다. 상기 모형은 신경 혈류(nerve blood flow)에서 급격한 감소(40%) 및 신경 전도 속도의 둔화(20%)(Cameron et al., 1991)가 발생하고, 신경 섬유의 축색돌기 위축(axonal atrophy)이 동반된다(Jakobsen, 1976). 장기간 지속되는 당뇨병에서, 탈수초성 섬유와 변성 수초화 섬유 및 이형-신경교 분리(axo-glial dysjunction)가 관찰된다(Sima et al., 1988).
본 연구의 일차적인 목적은 STZ-쥐에서 당뇨성 신경병증의 발병에 대한 SDF-1α의 잠재적인 신경보호(neuro-protective)와 신경교보호(glia-protective) 효과를 탐구하는 것이었다.
재료와 방법
동물
8주령 수컷 Sprague Dawley 쥐(Janvier, Le Genest Saint Isle, France)를 아래에 제시된 바와 같이, 6개 실험 군(n = 10)으로 무작위 지정하였다.
군(n = 10) 치료물질 투여 경로 치료 기간 (STZ-이후 일자)
대조/운반제 매일 운반제 s.c. 11 내지 40
STZ/운반제 매일 운반제 s.c. 11 내지 40
STZ/SDF-1α(10 ㎍/㎏) 매일 SDF-1α s.c. 11 내지 40
STZ/SDF-1α(30 ㎍/㎏) 매일 SDF-1α s.c. 11 내지 40
STZ/SDF-1α(100 ㎍/㎏) 매일 SDF-1α s.c. 11 내지 40
STZ/IL-6(10 ㎍/㎏) 매일 IL-6 s.c. 11 내지 40
이들 동물은 군별로 사육되고(우리당 3마리 동물), 온도(21-22℃)가 통제되고 밝음-어둠 주기(12h/12h)가 반복되는 장소에 유지되며, 사료와 물을 자유롭게 먹을 수 있도록 하였다. 모든 실험은 연구 가인드라인(institutional guideline)에 따라 수행되었다.
당뇨병 유도 및 약리학적 치료
당뇨병은 55 ㎎/㎏에서 스트렙토조토신(streptozotocin)(Sigma, L'Isle d'Abeau Chesnes, France)의 완충액의 정맥내 주입으로 유도하였다. STZ는 0.1 mol/ℓ 구연산염 완충액 pH 4.5에서 제조하였다. 대조군은 동등량의 구연산염 완충액이 투여되었다. STZ 주입 당일은 D0으로 간주되었다.
STZ-이후 D10에, 각 개별 동물에서 혈당증(glycemia)을 모니터하였다. 260 ㎎/㎗ 미만의 수치를 보이는 동물은 본 연구로부터 배제하였다.
SDF-1α, IL-6, 또는 이들의 상응하는 운반제로 치료는 D11에서부터 D40까지 매일 수행하였다.
SDF-1α와 IL-6은 0.02% BSA를 포함하는 식염수(0.9% NaCl)에서 제조하였다.
실험 계획
- Day -7: 기선(EMG)
- Day 0: 스트렙토조토신에 의한 유도
- Day 7: 혈당증 모니터링
- Day 11: 치료의 시작
- Day 20: Von Frey 검사
- Day 25 : EMG 모니터링
- Day 40: EMG 모니터링 및 HP 52℃ 검사
- Day 41: 조직형태계측학적 분석(histomorphometric analysis)을 위하여, 좌골 신경과 피부 생검 샘플을 채취하였다.
근전도검사(electromyography)
전기생리학적 기록은 근전계(electromyograph)(Keypoint, Medtronic, Boulogne-Billancourt, France)를 이용하여 수행하였다. 쥐는 60 ㎎/㎏ 케타민 클로르하이드레이트(ketamine chlorhydrate)(Imalgene 500ㄾ, Rhㆄne Mㅹrieux, Lyon. France)와 4 ㎎/㎏ 실라진(xylazin)(Rompum 2%, Bayer Pharma, Kiel, Germany)의 복막내 주입(IP)으로 마취시켰다. 정상 체온은 가열 램프로 30℃에 유지시키고, 꼬리 표면에 배치된 접촉식 온도계(contact thermometer)(Quick, Bioblock Scientific, Illkirch, France)로 통제하였다.
합근 활동 전위(CMAP)는 좌골 신경의 자극후 비복근근(gastrocnemius muscle)에서 기록하였다. 참고 전극(reference electrode)과 활동 바늘(active needle)을 뒷발에 배치하였다. 그라운드 바늘(ground needle)을 쥐의 하배부(lower back)에 삽입하였다. 좌골 신경은 최대상(supramaximal intensity)에서 단일 0.2 ms 펄스로 자극하였다. 운동파(motor wave) 속도를 기록하였다.
감각 신경 전도 속도(sensitive nerve conduction velocity, SNCV) 역시 기록하였다. 꼬리 피부 전극(tail skin electrode)을 아래와 같이 배치하였다: 참고 바늘(reference needle)은 꼬리 기부에 삽입하고, 애노드 바늘(anode needle)은 꼬리 말단을 향하여 참고 바늘로부터 30 ㎜ 이격된 위치에 배치하였다. 그라운드 바늘 전극(ground needle electrode)은 애노드와 참고 바늘 사이에 삽입하였다. 꼬리 신경(caudal nerve)은 12.8 mA의 강도에서 일련의 20회 펄스(0.2 ms 동안)로 자극하였다. 속도는 m/s로 표시하였다.
형태계측학적 분석(morphometric analysis)
형태계측학적 분석은 연구의 종결 시점에서 수행하였다. 이들 동물은 60 ㎎/㎏ Imalgㅸne 500ㄾ의 IP 주입으로 마취시켰다. 조직연구(histology)를 위하여 좌골 신경의 5 ㎜-조각을 절제하였다. 상기 조직은 인산염 완충액(pH 7.4)에 담긴 4% 글루타르알데히드(Sigma, L'Isle d'Abeau-Chesnes, France) 용액으로 하룻밤동안 고정시키고, 이용 때까지 4℃에서 30% 수크로오스 내에 유지시켰다. 상기 신경 샘플은 인산염 완충액에 담긴 2% 사산화오스뮴(osmium tetroxide)(Sigma) 용액에서 2시간동안 고정시키고, 일련의 알코올 용액에서 탈수시키고, Epon 내에 끼워 넣었다. 끼워 넣어진 조직은 이후, 3일간의 중합화(polymerization) 동안 +70℃에 위치시켰다. 마이크로톰(microtome)을 이용하여 1.5 ㎛ 두께의 횡단 절편(transverse section)을 획득하였다. 이들은 1% 톨루이딘 블루(toluidine blue) 용액(Sigma)으로 2분간 염색하고, 탈수하고, eukitt에 올려놓았다.
분석은 반-자동 디지털 이미지 분석 소프트웨어(Biocom, France)를 이용하여 신경 절편의 전체 표면에서 수행하였다. 이질적 대상이 제거되면, 상기 소프트웨어는 수초화 섬유의 총수를 보고하였다. 이후, 변성된 섬유의 숫자를 연산자(operator)로 수동 계산하였다. 축색돌기 없는 수초화 섬유, 풍부한 미엘린 및 축색돌기 직경에 비하여 너무 두꺼운 수초(sheath)를 보이는 섬유는 변성이 진행 중인 섬유로서 간주되었다. 비-변성된 섬유의 숫자는 변성된 섬유의 숫자를 뺄셈함으로써 획득하였다.
형태학적 분석(morphological analysis)은 비-변성된 섬유로 간주되는 섬유에서만 수행하였다. 각 섬유에서, 축색돌기와 미엘린 크기는 표면적(surface area)(㎛2)으로 보고되었다. 이들 2가지 파라미터는 상대적인 미엘린 수초 두께를 지시하는 각 섬유의 g-비율(축색돌기 직경/섬유 직경)의 등면적(equivalent area)(즉, [A/(A+M)]0.5, A = 축색돌기 면적, M = 미엘린 면적)을 산정하는데 이용되었다.
이에 더하여, 뒷발로부터 5-10 ㎜ 직경면적(diameter area)의 피부를 펀치-생검하였다. 피부 샘플은 4℃에서 파라포름알데히드(paraformaldehyde)에서 하룻밤동안 즉시 고정시키고, 동결방지(cryoprotection)를 위하여 0.1 M PBS에 담긴 30% 수크로오스에서 배양하고(하룻밤), OCT에 끼워 넣고, 동결절편제조(cryocut) 때까지 -80℃에서 냉동시켰다.
이후, 냉동미세절단기(cryostat)로 피부 표면에 수직으로 50 ㎛-두께 동결절편(cryosection)을 절단하였다. 자유-유동 절편은 4℃에서 토끼 항-단백질 유전자 산물 9.5(1:10000; Ultraclone, Isle of Man, UK)의 용액조 내에서 7일 동안 배양하였다. 이들 절편은 이후, ABC 과산화효소(peroxidase) 방법에 따라 면역반응성(immunoreactivity)이 나타나도록 처리하였다. 간단히 말하면, 이들 절편은 비오틴화된 항-염소 항체(1:200)와 함께 1시간 동안 배양하고, 이후 실온에서 아비딘 비오틴화된 복합체 내에서 30분간 배양하였다. 과산화효소 활성은 DAB 시스템을 이용하여 가시화시켰다. 절편은 이후, 에오신(eosin) 또는 헤마톡실린(hematoxylin)으로 대비염색(counterstain)하였다. 절편은 탈수시키고, bioclear로 투명하게 하고, eukitt에 올려놓았다. 현미경 시야(microscope field)의 사진은 12.9 ㎜의 초점 거리(focal distance)에서 Nikon 디지털 카메라를 이용하여 20x 배율(power magnification view)에서 촬영하였다. 각각 0.22 ㎛2(544 x 408 ㎛)의 3개의 현미경 시야에서 표피내(intra-epidermal) 신경의 숫자는 컴퓨터 스크린 상에서 실험자가 계산하였다.
데이터 분석
데이터의 전체적인 분석은 일인자(one factor) 또는 반복 측정(repeated measure) 분산분석(analysis of variance, ANOVA) 및 일원 ANOVA를 이용하여 수행하였다. ANOVA가 유의한 차이를 지시하면, 피셔 보호된 최소 유의성 차이(Fisher Protected Least Significant Difference)를 사후 검증법(post-hoc test)으로 이용하여 실험 군과 운반제로 치료된 당뇨성 쥐 군을 비교하였다. 유의성 수준은 p ≤ 0.05로 설정되었다. 결과는 평균ㅁ평균의 표준오차(s.e.m.)로 표시된다.
결과
체중
점진적인 성장을 보이는 비-당뇨성 쥐와 대조적으로, 당뇨성 쥐는 유의한 성장 정지(growth arrest)를 보였다(도 7A).
SDF-1α 또는 IL-6으로 치료는 운반제-치료된 당뇨성 쥐의 체중에서 작지만 유의한 증가와 연관하였다.
혈당증
STZ-이후 7일 시점에, STZ가 투여된 모든 쥐는 대조 쥐보다 5배 높은 혈당증을 보였다(도 7B).
전기생리학적 측정
1. 합근 활동 전위의 잠복
CMAP 잠복은 D25에서, 비-당뇨성 쥐와 비교하여 당뇨성 쥐에서 유의하게 연장되었다(도 7C). SDF-1α 또는 IL-6으로 치료는 운반제-처리된 당뇨성 쥐와 비교하여 당뇨성 쥐의 CMAP 잠복에서 유의한 감소를 유도하였다.
STZ-이후 D40에서 유사한 결과가 관찰되었다.
2. 감각 신경 전도 속도
D25에서, 운반제-처리된 당뇨성 쥐는 비-당뇨성 쥐와 비교하여 유의하게 감소된 SNCV를 보였다(도 7D). SDF-1α 또는 IL-6으로 치료는 당뇨성 쥐의 SNCV 능력을 유의하게 향상시켰다. 최고 효과는 10과 30 ㎍/㎏의 치료 용량에서 관찰되었고, IL-6 치료와 연관된 효과에 필적하였다.
STZ-이후 D40에서 유사한 결과가 관찰되었다.
형태계측학적 분석
1. g-비율(상대적인 미엘린 두께)
운반제가 투여된 당뇨성 쥐의 g-비율은 비-당뇨성 쥐의 대응하는 비율과 비교하여 유의하게 증가하였는데(도 7E), 이는 당뇨성 쥐에서 미엘린 수초(myelin sheath)의 얇아짐을 암시하였다. SDF-1α로 당뇨성 쥐의 치료는 특히, 10 또는 30 ㎍/㎏의 용량에서, STZ/운반제 군과 비교하여 g-비율을 유의하게 감소시켰다. 100 ㎍/㎏의 용량에서, g-비율 수치의 감소는 유의성 수준에 도달하지 못하였다.
IL-6 치료 역시 g-비율 수치에서 유의한 감소를 유도하였다.
2. 변성된 섬유의 숫자
운반제가 투여된 당뇨성 쥐는 비-당뇨성 쥐보다 훨씬 높은 비율의 변성된 섬유를 보였다(도 7F). 반대로, 당뇨성 쥐에서 비-변성된 섬유의 비율은 비-당뇨성 쥐에서 대응하는 비율과 비교하여 유의하게 감소하였다(도 7F). SDF-1α로 당뇨성 쥐의 치료는 변성된 섬유 집단의 감소를 유도하였다. 최고 효과는 최저 용량(10 ㎍/㎏)과 연관하고, 유의성 수준에 도달하였다.
IL-6으로 치료된 당뇨성 쥐에서도 변성된 섬유 집단의 유의한 감소가 관찰되었다.
도 7G에 도시된 바와 같이, 운반제가 투여된 당뇨성 쥐는 비-당뇨성 쥐와 비교하여, 표피내 신경 섬유의 유의하게 감소된 밀도를 보였다. SDF-1α로 당뇨성 쥐의 치료는 운반제로 치료보다 훨씬 높은 밀도의 피부 신경 섬유(dermal nerve fiber)와 연관하였다. 관찰된 이런 효과는 IL-6 치료에 의해 유도된 효과에 필적하였다.
결론
본 연구에서는 당뇨병-관련된 신경병증의 발병에 대한 SDF-1α의 신경보호와 신경교보호 효과를 평가하였다. 연구는 쥐에서 STZ-유도된 당뇨병 관련된 신경병증에서 수행되었다. 당뇨성 신경병증의 임상적 설정(clinical setting)과 유사하게, 빠르면 STZ-이후 7일 정도에 탐지되는 손상된 감각 신경전도는 이러한 모형에서 진행성 신경병증을 지시하는 첫 번째 증후인데, 이는 후기 시점(Andriambeloson et al., 2006)에서 관찰된 탈수초 및/또는 축색돌기 변성의 증가와 일치한다. 기존의 한 연구에서, 적은 용량의 IL-6으로 STZ-쥐의 치료는 혈당증의 발병을 간섭하지 않으면서 이러한 모형에서 신경병증의 진행을 방해하는 것으로 밝혀졌다(Andriambeloson et al., 2006).
본 연구에서는 SDF-1α(10, 30, 100 ㎍/㎏)의 장기적인 투여가 대략 2주간의 치료 이내에 당뇨성 쥐의 감각운동 능력(sensorimotor performance)(SNCV와 CMAP 잠복 스코어)을 향상시킨다는 것을 확인하였다. 최고 결과는 10 또는 30 ㎍/㎏의 치료 용량에서 달성되고, 10 ㎍/㎏ IL-6에 필적하는 효능을 보였다. 이에 더하여, 이들 용량에서 SDF-1α 치료는 상기 모형과 연관된 미엘린 손실을 현저하게 예방하는 것으로 밝혀졌다. 미엘린 수초의 품질이 최적 신경 전도에서 중요한 구성요소이기 때문에, 미엘린 수초의 크기 보존은 SDF-1α 치료를 받는 당뇨성 쥐의 신경 기능에서 향상을 부분적으로 설명한다. 또한, SDF-1α는 좌골 신경 내에서 축색돌기 변성이 진행되는 섬유 집단을 감소시키는 것으로 밝혀졌다.
신경병증의 존재와 심각도 및 피부 생검으로부터 표피내 신경 섬유의 변성 사이에 상관관계(Herrmann et al., 1999; Smith et al., 2001)를 증명하는 당뇨성 신경병증의 임상적 설정과 유사하게, 쥐에서 STZ-유도된 당뇨성 신경병증 역시 이러한 동물 모형에서 신경병증의 임상적 징후가 표피내 신경 섬유의 밀도에서 감소와 강하게 상관한다는 것을 증명한다. 상기 결과와 일관되게, 본 연구에서는 운반제-처리된 당뇨성 쥐가 표피내 신경 섬유 밀도에서 유의한 감소를 나타낸다는 것을 확인하였다. 이러한 현상은 SDF-1α 또는 IL-6으로 치료에 의해 현저하게 예방되었고, 따라서 당뇨병-유도된 신경 손상과 관련하여 SDF-1α의 신경보호 효과를 더욱 뒷받침한다.
종합하면, 이들 결과는 당뇨성 신경병증의 쥐 모형에서 SDF-1α 치료의 신경보호 효과를 지시한다. SDF-1α는 임상적 당뇨성 신경병증에 대한 치료 요법의 개발에서 흥미로운 후보이다.
실시예 8: 신경병증성 통증에서 SDF-1α의 보호 효과
도입
신경병증성 통증의 가장 일반적인 원인은 특히, 혈당 조절이 불량한 경우에 당뇨병이다. 당뇨병 환자의 대략 2―24%가 신경병증성 통증을 경험한다. 당뇨성 신경병증성 통증은 자발적으로, 또는 정상 상태에서 경미한 통증 자극(즉, 통각과민(hyperalgesia)) 또는 정상 상태에서 통증으로 인식되지 않는 자극(즉, 무해자극통증(allodynia))에 대한 노출의 결과로서 발생할 수 있다. 통증 인식에서 다수의 이형은 초기 단계의 당뇨병에서 스트렙토조토신 모형에서 확인되었다(Hounsom and Tomlinson, 1997). 가령, 포르말린-유발된 주춤(flinching)이 대조 동물에 비하여 STZ-쥐에서 과장된다. 이에 더하여, 당뇨병의 이러한 동물 모형에서 촉각 무해자극통증(tactile allodynia)의 발병이 보고되었다(Calcutt et al., 1995, 1996). 후기 단계에서 고혈당증이 지속되면(Bianchi et al., 2004), 당뇨성 쥐에서 행동 기형(behavioral abnormality)으로서 열판 역치(hot plate threshold)의 확대(extension)가 보고되었다.
재료와 방법
동물
8주령 수컷 Sprague Dawley 쥐(Janvier, Le Genest Saint Isle, France)를 아래에 제시된 바와 같이, 6개 실험 군(n = 10)으로 무작위 지정하였다.
군(n = 10) 치료물질 투여 경로 치료 기간 (STZ-이후 일자)
대조/운반제 매일 운반제 s.c. 11 내지 40
STZ/운반제 매일 운반제 s.c. 11 내지 40
STZ/SDF-1α(10 ㎍/㎏) 매일 SDF-1α s.c. 11 내지 40
STZ/SDF-1α(30 ㎍/㎏) 매일 SDF-1α s.c. 11 내지 40
STZ/SDF-1α(100 ㎍/㎏) 매일 SDF-1α s.c. 11 내지 40
STZ/IL-6(10 ㎍/㎏) 매일 IL-6 s.c. 11 내지 40
이들 동물은 군별로 사육되고(우리당 3마리 동물), 온도(21-22℃)가 통제되고 밝음-어둠 주기(12h/12h)가 반복되는 장소에 유지되며, 사료와 물을 자유롭게 먹을 수 있도록 하였다. 모든 실험은 연구 가인드라인(institutional guideline)에 따라 수행되었다.
당뇨병 유도 및 약리학적 치료
당뇨병은 55 ㎎/㎏에서 스트렙토조토신(Sigma, L'Isle d'Abeau Chesnes, France)의 완충액의 정맥내 주입으로 유도하였다. STZ는 0.1 mol/ℓ 구연산염 완충액 pH 4.5에서 제조하였다. 대조군은 동등량의 구연산염 완충액이 투여되었다. STZ 주입 당일은 D0으로 간주되었다.
STZ-이후 D10에, 각 개별 동물에서 혈당증(glycemia)을 모니터하였다. 260 ㎎/㎗ 미만의 수치를 보이는 동물은 본 연구로부터 배제하였다.
SDF-1α, IL-6, 또는 이들의 상응하는 운반제로 치료는 D11에서부터 D40까지 매일 수행하였다.
SDF-1α와 IL-6은 0.02% BSA를 포함하는 식염수(0.9% NaCl)에서 제조하였다.
실험 계획
- Day 0: 스트렙토조토신에 의한 유도
- Day 7: 혈당증 모니터링
- Day 11: 치료의 시작
- Day 20: Von Frey 검사
- Day 40: EMG 모니터링 및 HP 52℃ 검사
Von Frey 필라멘트 검사
쥐는 금속성 격자 바닥에 위치시켰다. 침해수용 검사(nociceptive testing)는 격자 바닥을 통하여 Von Frey 필라멘트(Bioseb, France)를 삽입하고 이를 뒷발의 발바닥 표면(plantar surface)에 접촉시킴으로써 수행하였다. 시험은 상이한 von Frey 필라멘트의 수회 적용(1-1.5 s의 빈도)으로 구성되었다. Von Frey 필라멘트는 필라멘트 10 g 내지 180 g로 적용되었다. 뒷발의 활동적인 움츠림을 유도하는 압력은 역치(threshold value)로서 간주되었다. 컷오프 수치(cuttoff value)는 180 g로 설정되었다.
열판 52℃ 검사
이들 동물은 52℃로 조정된 열판 상에서 유리 실린더(glass cylinder) 내에 위치시켰다. 30 s의 컷오프 시간(cutoff time)에서, 첫 번째 반응의 잠복을 기록하였다(핥음(licking), 발의 활동적인 움직임, 열을 피하기 위한 도약 없음).
결과
Von Frey 필라멘트
STZ-이후 D20에, 운반제-처리된 당뇨성 쥐는 Von Frey 검사에서 비-당뇨성 쥐보다 훨씬 낮은 역치를 보였다(도 8A).
SDF-1α 또는 IL-6으로 치료는 운반제-처리된 당뇨성 쥐의 스코어에 비하여, 당뇨성 쥐의 역치에서 유의한 증가를 유도하였다. SDF-1α 또는 IL-6-처리된 쥐의 역치는 비-당뇨성 쥐의 역치와 통계학적으로 차이가 없었다.
열판 52℃ 검사
STZ-이후 D40에서, 운반제가 투여된 당뇨성 쥐는 비-당뇨성 쥐에 비하여, 열판 검사에서 훨씬 높은 잠복 역치(threshold latency)를 보였다(도 8B).
SDF-1α 또는 IL-6으로 당뇨성 쥐의 치료는 당뇨성 쥐의 잠복 역치를 비-당뇨성 쥐의 수준에 통계학적으로 필적하는 수준으로 유의하게 낮추었다.
결론
각각, D20과 D40에서, Von Frey 필라멘트(물리적 자극)와 열(52℃)에 반응하는 쥐의 행동을 평가하였다. 이들 두 검사에서, SDF-1α로 치료된 당뇨성 쥐는 운반제로 치료된 쥐와 비교하여 명백한 행동 차이(behavior difference)를 보였고, 이들의 스코어는 비-당뇨성 쥐의 스코어에 필적하였다.
이들 결과는 앞서 언급된 전기생리학적 조사 결과 및 조직학적 조사 결과와 일치하고, SDF-1α가 신경병증성 통증에서도 보호효과를 나타낼 수 있음을 암시한다.
실시예 9: SDF-1 유전자와 일차 진행성 MS 사이에 유전적 연관
재료와 방법
환자와 대조 모집
본 연구는 일차 진행성 MS(MSPP)를 앓는 관계없는 환자의 집합으로 구성되었다. 본 연구에서 모든 피험자는 이탈리아계 백인이었다. 사르디니아(Sardinia)계 환자와 대조는 제외되었다.
진행성 과정을 나타내는 197명의 환자가 포함되었다. 141명은 재발없이 발병 시점부터 신경학적 증상의 진행을 보였다(일차 진행성); 39명은 중첩된 재발(superimposed relapse)과 함께 진행성 과정을 보였다(진행성 재발성); 17명은 독립된 공격후 수년이 경과한 시점에 진행성 과정이 시작되었다(단일-공격 진행성). 대조 집단은 사례 집단과 동일한 인종 배경으로부터 234명의 관계없는 건강한 대조로 구성되었다.
사례 군은 성비가 1.05(101명의 여성과 96명의 남성)이고, 평균 발병 연령이 39.2[19-65]세이었다. 대조군은 234명의 피험자로 구성되고, 성비가 1.03(119명의 여성과 115명의 남성)이고, 평균 연령이 40.4[19-70]세 이었다.
유전자형확인(genotyping)
전체 게놈 분석을 위한 방법: Affymetrix 방법
각 샘플로부터 250 ng(5 ㎕)의 DNA는 37℃에서 2시간 동안 10 unit의 Nsp I과 Sty I 제한 효소(New England Biolabs, Beverly, MA)로 동시 절단하였다. 이후, 16℃에서 3시간 동안 T4 DNA 리가아제로 효소 특이적 어댑터 올리고뉴클레오티드를 이들 절단된 말단에 결찰하였다. 물로 희석후, 5 ㎕의 희석된 결찰 반응물에 PCR을 수행하였다. PCR은 25 μM PCR 프라이머 002(Affymetrix), 350 μM 각 dNTP, 1M 베타인(Betaine)(USB, Cleveland, OH), 1X 티타늄(Titanium) Taq PCR 완충액(BD Biosciences)의 존재에서 티타늄 Taq DNA 중합효소(BD Biosciences, San Jose, CA)로 수행되었다. 서열증폭 파라미터(cycling parameter)는 아래와 같았다: 94℃에서 3분간 최초 변성; 94℃에서 30초간, 60℃에서 30초간 증폭 및 68℃에서 15초간 신장의 총 30회 반복; 68℃에서 7분간 최종 신장. 3가지 반응물로부터 PCR 산물은 합치고, 제조업체의 사용설명서에 따라 MinElute 96-웰 UF PCR 정제 플레이트(Qiagen, Valencia, CA)로 정제하였다. 샘플은 미세원침관(microfuge tube) 내로 수집하고, 16,000 x g에서 10분간 회전시켰다.
정제된 산물은 인산마그네슘(magnesium phosphate)의 백색 겔-유사 펠릿이 파괴되지 않도록 주의하면서 튜브로부터 회수하였다. 이후, PCR 산물은 2% TAE 겔 전기영동(gel electrophoresis)을 이용하여, 200-800 bp 사이의 평균 크기로 이동하는 지를 확인하였다. 그 다음, 37℃에서 35분간 0.25 단위(unit)의 DNAse I을 이용하여 60 ㎍의 정제된 PCR 산물을 단편화(fragmentation)시켰다. 180 bp 이하의 평균 크기로 이들 산물의 완전한 단편화는 2% TAE 겔 전기영동을 이용하여 확인하였다. 단편화이후, DNA는 37℃에서 2시간 동안 105 단위(unit)의 말단 데옥시뉴클레오티딜 전이효소(terminal deoxynucleotidyl transferase)로 말단 표지하였다. 표지된 DNA는 이후, 49℃에서 18시간 동안 60 rpm으로, 개별 Mendel 어레이 상에 혼성화시켰다. 혼성화된 어레이는 세척하고, 염색하고, 제조업체(Affymetrix)의 사용설명서에 따라 정밀하게 검사하였다.
유전자형 콜(genotype call)은 .33의 pValue에서 DM 알고리즘 및 Affymetrix 사용설명서에 따라 BRLMM 알고리즘을 이용한 일괄 분석(batch analysis)을 순차적으로 이용하여 획득하였다.
SNP 필터링(filtering)
SNP는 아래의 기준으로 필터링하였다:
분실 유전자형 비율(missing genotype rate)이 < 5%이어야 한다.
최소 대립형질 빈도(Minimum Allele Frequency, MAF)가 대조에서 > 1%이어야 한다.
하디-와인버그 평형(Hardy-Weinberg equilibrium)이 아닐 가능성(probability)이 대조에서 < 2%이어야 한다.
SNP가 사례에서 다형성(polymorphic)이어야 한다.
상동 염색체(autosomal chromosome)로부터 SNP만 분석을 위하여 보관되었다.
통계학적 분석
방법:
FDR(false discovery rate, 오류 발견율)은 각 집단에 대한 아래의 일도량 검사(univariate test)(피어슨 통계량(Pearson's statistic)으로 정확한 검사 이용)에 의해 10,000개의 순열(permutation)로 추정되었다:
- 대립형질 검사
- 유전자형 검사
- 대립형질과 유전자형 검사의 최소점(약어, 'min')
- 대립형질과 유전자형 검사의 최대점(약어, 'max')
결과
SNP 필터링과 게놈 적용범위(genomic coverage)
앞서 정의된 필터를 적용하면, 표 6에 제시된 바와 같이, 잔류하는 SNP의 숫자가 감소하였다:
정밀 조사 전체 #SNP 필터링이후 #SNP 잔류 %
MSPP 사례 vs. MS 대조 497,641 323,664 65 %
FDR
이들 FDR 결과는 도 9에 도시된다.
10%의 FDR 역치에서, SNP와 유전자는 표 7에 제시된 바와 같이 선택되었다.
정밀 조사 #SNP #BIN #유전자 #desert
MSPP vs 대조 78 72 62 10
SDF-1(CXCL2) 유전자에서 하나의 SNP(SNP_A-2185631)가 선별되었다(도 10 참조).
이들 분할표(contingency table)를 살펴봄으로써, 이러한 연관이 사례와 대조 집단에서 대립유전자 C의 차별적 분포(differential distribution)로부터 기인한다는 것을 확인할 수 있다.
MSPP vs 대조
유전형 사례 대조
CC 2.2% 0.0%
CG 22.8% 7.4%
GG 75.0% 92.6%
이러한 SNP 인근에서 상기 영역의 상세한 생체시료분석 결과는 상기 SNP가 아래에 기술된 바와 같이, SDF-1의 최근에 발견된 신규한 동소체의 인트론(intron) 내에 존재한다는 것을 증명한다:
2개의 동소체 SDF-1 알파와 SDF-1 베타를 확인한 Ensembl에 따르면, SNP_A-2185631은 SDF-1(일명, CXCL12) 유전자의 25kb 하류에 위치한다. SNP_A-2185631에 더욱 근접하여 위치하는 유전자는 존재하지 않는다.
SDF-1은 염색체 10 상에 위치하고(44,192,517-44,200,551, NCBI build 35) 8kb에 이른다.
SNP_A-2185631이 SDF-1 유전자 또는 다른 이웃하는 유전자에 관련될 수 있는 지를 확인하기 위하여 이러한 게놈 서열의 주석달기(annotation)를 수행하였다.
서열 데이터베이스에서, Ensembl에서 기술되지 않은 절단접합 변이체가 발견되었다: SDF-1 감마, SDF-1 델타, SDF-1 엡실론, SDF-1 파이. 모든 절단접합 변이체는 동일한 첫 번째 3개의 엑손을 보유한다. SDF-1 엡실론과 SDF-1 파이의 최종 엑손은 72 kb 하류에 위치한다(도 11 참조). 이들 새로운 서열은 "Lilly Research Laboratories, Cardiovascular Division, Cancer Division and Integrative Biology, Eli Lilly and Company, Indianapolis, IN 46285, USA"에 의해 2006년 6월에 NCBI에 제출되었다. 이들 2개의 동소체를 인코딩하는 cDNA(DQ345520과 DQ345519)는 정규의 절단접합 부위(canonical splice site), 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal), polyA 꼬리(게놈 서열에서 관찰되지 않음)를 보유한다.
모든 절단접합 변이체가 동일한 첫 번째 3개의 엑손을 보유하기 때문에, 이들 6개의 동소체는 동일한 N-ter 부분(88개 아미노산)을 보유한다.
따라서, SNP_A-2185631 인근에 상기 영역의 상세한 생체시료분석 결과는 아래의 사실을 증명하였다:
- SDF-1 유전자가 예상보다 길다: 8kb 대신에 87 kb
- 목적하는 SNP(SNP_A-2185631)가 SDF-1 유전자에서, SDF-1 엡실론과 SDF-1 파이의 최종 인트론 내에 위치한다(도 12 참조).
따라서, SDF-1 유전자는 일차 진행성 MS와 연관되는 것으로 결론된다.
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65 70 <210> 3 <211> 98 <212> PRT <213> Human <400> 3 Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser 1 5 10 15 His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro 20 25 30 Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln 35 40 45 Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys 50 55 60 Ala Leu Asn Lys Gly Arg Arg Glu Glu Lys Val Gly Lys Lys Glu Lys 65 70 75 80 Ile Gly Lys Lys Lys Arg Gln Lys Lys Arg Lys Ala Ala Gln Lys Arg 85 90 95 Lys Asn <210> 4 <211> 68 <212> PRT <213> Human <400> 4 Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser 1 5 10 15 His Val Ala Arg Ala Asn Val Ala Ala Leu Ala Ile Leu Asn Thr Pro 20 25 30 Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln 35 40 45 Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys 50 55 60 Ala Leu Asn Lys 65 <210> 5 <211> 21 <212> PRT <213> Human <400> 5 Met Asn Ala Lys Val Val Val Val Leu Val Leu Val Leu Thr Ala Leu 1 5 10 15 Cys Leu Ser Asp Gly 20 <210> 6 <211> 267 <212> DNA <213> Human <400> 6 atgaacgcca aggtcgtggt cgtgctggtc ctcgtgctga ccgcgctctg cctcagcgac 60 gggaagcccg tcagcctgag ctacagatgc ccatgccgat tcttcgaaag ccatgttgcc 120 agagccaacg tcaagcatct caaaattctc aacactccaa actgtgccct tcagattgta 180 gcccggctga agaacaacaa cagacaagtg tgcattgacc cgaagctaaa gtggattcag 240 gagtacctgg agaaagcttt aaacaag 267 <210> 7 <211> 69 <212> PRT <213> Human <400> 7 Met Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu 1 5 10 15 Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr 20 25 30 Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg 35 40 45 Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu 50 55 60 Lys Ala Leu Asn Lys 65 <210> 8 <211> 65 <212> PRT <213> Human <400> 8 Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser His Val Ala 1 5 10 15 Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro Asn Cys Ala 20 25 30 Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln Val Cys Ile 35 40 45 Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Leu Asn 50 55 60 Lys 65 <210> 9 <211> 66 <212> PRT <213> Human <400> 9 Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser His Val 1 5 10 15 Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro Asn Cys 20 25 30 Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln Val Cys 35 40 45 Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Leu 50 55 60 Asn Lys 65 <210> 10 <211> 67 <212> PRT <213> Human <400> 10 Met Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser His 1 5 10 15 Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro Asn 20 25 30 Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln Val 35 40 45 Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys Ala 50 55 60 Leu Asn Lys 65 <210> 11 <211> 69 <212> PRT <213> Human <400> 11 Met Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu 1 5 10 15 Ser His Val Ala Arg Ala Asn Val Ala Ala Leu Ala Ile Leu Asn Thr 20 25 30 Pro Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg 35 40 45 Gln Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu 50 55 60 Lys Ala Leu Asn Lys 65 <210> 12 <211> 68 <212> PRT <213> Human <400> 12 Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser 1 5 10 15 His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Cys Ile Leu Asn Thr Pro 20 25 30 Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln 35 40 45 Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys 50 55 60 Ala Leu Asn Lys 65 <210> 13 <211> 300 <212> PRT <213> Human <400> 13 Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser 1 5 10 15 His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro 20 25 30 Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln 35 40 45 Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys 50 55 60 Ala Leu Asn Lys Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro 65 70 75 80 Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Glu Gly Ala Pro Ser Val Phe Leu Phe 85 90 95 Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val 100 105 110 Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe 115 120 125 Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro 130 135 140 Arg Glu Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr 145 150 155 160 Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val 165 170 175 Ser Asn Lys Ala Leu Pro Ser Ser Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala 180 185 190 Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg 195 200 205 Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly 210 215 220 Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro 225 230 235 240 Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser 245 250 255 Phe Phe Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln 260 265 270 Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His 275 280 285 Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys 290 295 300 <210> 14 <211> 119 <212> PRT <213> Human <400> 14 Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser 1 5 10 15 His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro 20 25 30 Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln 35 40 45 Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys 50 55 60 Ala Leu Asn Asn Leu Ile Ser Ala Ala Pro Ala Gly Lys Arg Val Ile 65 70 75 80 Ala Gly Ala Arg Ala Leu His Pro Ser Pro Pro Arg Ala Cys Pro Thr 85 90 95 Ala Arg Ala Leu Cys Glu Ile Arg Leu Trp Pro Pro Pro Glu Trp Ser 100 105 110 Trp Pro Ser Pro Gly Asp Val 115 <210> 15 <211> 69 <212> PRT <213> Human <400> 15 Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser 1 5 10 15 His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro 20 25 30 Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln 35 40 45 Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys 50 55 60 Ala Leu Asn Asn Cys 65 <210> 16 <211> 79 <212> PRT <213> Human <400> 16 Lys Pro Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser 1 5 10 15 His Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro 20 25 30 Asn Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln 35 40 45 Val Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys 50 55 60 Ala Leu Asn Lys Ile Trp Leu Tyr Gly Asn Ala Glu Thr Ser Arg 65 70 75 <210> 17 <211> 65 <212> PRT <213> Human <400> 17 Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser His Val 1 5 10 15 Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro Asn Cys 20 25 30 Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln Val Cys 35 40 45 Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys Ala Leu 50 55 60 Asn 65 <210> 18 <211> 66 <212> PRT <213> Human <400> 18 Met Val Ser Leu Ser Tyr Arg Cys Pro Cys Arg Phe Phe Glu Ser His 1 5 10 15 Val Ala Arg Ala Asn Val Lys His Leu Lys Ile Leu Asn Thr Pro Asn 20 25 30 Cys Ala Leu Gln Ile Val Ala Arg Leu Lys Asn Asn Asn Arg Gln Val 35 40 45 Cys Ile Asp Pro Lys Leu Lys Trp Ile Gln Glu Tyr Leu Glu Lys Ala 50 55 60 Leu Asn 65

Claims (28)

  1. 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 SDF-1 또는 SDF-1 활성 작용제의 용도.
  2. 청구항 1에 있어서, SDF-1은 SDF-1α인 것을 특징으로 하는 용도.
  3. 청구항 1에 있어서, SDF-1은 SDF-1α 변이체인 것을 특징으로 하는 용도.
  4. 청구항 1에 있어서, 신경 질환은 염증과 연관되는 것을 특징으로 하는 용도.
  5. 청구항 4에 있어서, 염증은 신경-염증인 것을 특징으로 하는 용도.
  6. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 신경 질환은 외상성 신경 손상, 발작, CNS 또는 PNS의 탈수초 질환, 신경병증에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  7. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 신경 질환은 말초 신경병증인 것을 특징으로 하는 용도.
  8. 청구항 7에 있어서, 말초 신경병증은 당뇨성 신경병증 또는 신경병증성 통증 인 것을 특징으로 하는 용도.
  9. 청구항 6에 있어서, 외상성 신경 손상은 말초 신경의 외상을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  10. 청구항 6에 있어서, 외상성 신경 손상은 척수의 외상을 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  11. 청구항 6에 있어서, 탈수초 질환은 다발성 경화증(MS)인 것을 특징으로 하는 용도.
  12. 청구항 11에 있어서, 탈수초 질환은 일차 진행성 다발성 경화증(MS) 또는 이차 진행성 다발성 경화증(MS)인 것을 특징으로 하는 용도.
  13. 청구항 6에 있어서, 탈수초 질환은 만성 염증성 다발성 경화증, 탈수초성 다발신경병증(CIDP), 귈레인-바레 증후군(GBS)에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도.
  14. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, SDF-1은 아래에서 선택되는 것을 특징으로 하는 용도:
    (a) SEQ ID NO: 1의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
    (b) SEQ ID NO: 4의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
    (c) SEQ ID NO: 7의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
    (d) 신호 서열, 바람직하게는, SEQ ID NO: 5의 아미노산을 더욱 포함하는 (a) 내지 (c) 중에서 하나의 폴리펩티드;
    (e) (a) 내지 (d) 중에서 하나의 뮤테인, 여기서 아미노산 서열은 (a) 내지 (c)에서 서열 중에서 적어도 하나에 적어도 40% 또는 50% 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 동일성을 보유하고;
    (f) 높은 엄밀도 조건 하에 (a) 내지 (c) 중에서 하나를 인코딩하는 고유 DNA 서열의 보체에 혼성화되는 DNA 서열에 의해 인코딩되는 (a) 내지 (d) 중에서 하나의 뮤테인;
    (g) 아미노산 서열에서 변화가 (a) 내지 (c)에서 아미노산 서열에 보존성 아미노산 치환인 (a) 내지 (d) 중에서 하나의 뮤테인; 또는
    (h) (a) 내지 (d) 중에서 하나의 염 또는 동소체, 융합 단백질, 기능 유도체, 또는 활성 분획물.
  15. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, SDF-1은 뇌-혈관 장벽(blood brain barrier)의 통과를 촉진하는 담체 분자, 펩티드 또는 단백질에 융합되는 것을 특징으로 하는 용도.
  16. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, SDF-1은 PEG화되는 것을 특징으로 하는 용도.
  17. 청구항 15에 있어서, 융합 단백질은 면역글로불린(Ig) 융합을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  18. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, 약제는 동시, 순차적, 또는 독립된 이용을 위한 인터페론 및/또는 오스테오폰틴 및/또는 클루스테린을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  19. 청구항 18에 있어서, 인터페론은 인터페론-β인 것을 특징으로 하는 용도.
  20. 전술한 항중 어느 한 항에 있어서, SDF-1은 대략 0.001 내지 1 ㎎/체중 ㎏, 또는 대략 0.01 내지 10 ㎎/체중 ㎏ 또는 대략 9, 8, 7, 6, 5, 4, 3, 2 또는 1 ㎎/체중 ㎏ 또는 대략 0.1 내지 1 ㎎/체중 ㎏의 양으로 이용되는 것을 특징으로 하는 용도.
  21. 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 핵산 분자의 용도에 있어서, 핵산 분자는 SEQ ID NO: 6의 핵산 서열 또는 아래에서 선택되는 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 것을 특징으로 하 는 용도:
    (a) SEQ ID NO: 1의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
    (b) SEQ ID NO: 4의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
    (c) SEQ ID NO: 7의 아미노산을 포함하는 폴리펩티드;
    (d) 신호 서열, 바람직하게는, SEQ ID NO: 5의 아미노산을 더욱 포함하는 (a) 내지 (c) 중에서 하나의 폴리펩티드;
    (e) (a) 내지 (d) 중에서 하나의 뮤테인, 여기서 아미노산 서열은 (a) 내지 (c)에서 서열 중에서 적어도 하나에 적어도 40% 또는 50% 또는 60% 또는 70% 또는 80% 또는 90% 동일성을 보유하고;
    (f) 높은 엄밀도 조건 하에 (a) 내지 (c) 중에서 하나를 인코딩하는 고유 DNA 서열의 보체에 혼성화되는 DNA 서열에 의해 인코딩되는 (a) 내지 (d) 중에서 하나의 뮤테인;
    (g) 아미노산 서열에서 변화가 (a) 내지 (c)에서 아미노산 서열에 보존성 아미노산 치환인 (a) 내지 (d) 중에서 하나의 뮤테인; 또는
    (h) (a) 내지 (d) 중에서 하나의 염 또는 동소체, 융합 단백질, 기능 유도체, 또는 활성 분획물.
  22. 청구항 21에 있어서, 핵산 분자는 발현 벡터 서열을 더욱 포함하는 것을 특징으로 하는 용도.
  23. 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 세포 내에서 SDF-1, 또는 SDF-1 활성 작용제의 내인성 생산을 유도 및/또는 강화하기 위한 벡터의 용도.
  24. 청구항 21 내지 23 중 어느 한 항에 있어서, 유전자 요법을 위한 용도.
  25. 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 약제의 제조에서 SDF-1, 또는 SDF-1 활성 작용제를 생산하도록 유전자 조작된 세포의 용도.
  26. 선택적으로 하나이상의 제약학적으로 수용가능한 부형제와 함께 SDF-1, 또는 SDF-1 활성 작용제 및 인터페론을 함유하고 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 제약학적 조성물.
  27. 선택적으로 하나이상의 제약학적으로 수용가능한 부형제와 함께 SDF-1, 또는 SDF-1 활성 작용제 및 오스테오폰틴을 함유하고 말초 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 제약학적 조성물.
  28. 선택적으로 하나이상의 제약학적으로 수용가능한 부형제와 함께 SDF-1, 또는 SDF-1 활성 작용제 및 클루스테린을 함유하고 말초 신경 질환의 치료 및/또는 예방을 위한 제약학적 조성물.
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