JP2009513689A - 神経学的疾患の治療、及び/又は予防のためのsdf−1の使用 - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、概して、神経炎症に関連する神経学的疾患の分野にある。より詳しく述べると、本発明は、神経学的疾患の治療、及び/又は予防用の医薬品の製造のためのSDF-1の使用に関する。
神経炎症に関連している神経学的疾患
神経炎症は、ほとんどの神経学的疾患に対する共通点である。多くの刺激が、ニューロン若しくは乏突起膠細胞の被害によって誘発され得るか、あるいは外傷、中枢若しくは末梢神経損傷の、又はウイルス若しくは細菌感染の影響であり得るかのいずれかである神経炎症を引き起こす。神経炎症の主な影響は、(i)星状細胞、小膠細胞による様々な炎症性ケモカインの分泌;及び(ii)星状細胞若しくは小膠細胞をさらに刺激する追加的な白血球の動員である。多発性硬化症(MS)、アルツハイマー病(AD)、又は筋萎縮性側索硬化症(ALS)などの慢性神経変性疾患では、継続的な神経炎症の存在が、それらの疾患の悪化にかかわると考えられている。神経炎症に関連している神経学的疾患は、また、神経学的炎症性疾患とも呼ばれる。
慢性神経変性疾患において、病態は炎症反応に関連する。最近の証拠は、全身性炎症が、順々に挙動に影響を及ぼすかもしれない脳内の炎症性サイトカイン及び他の伝達物質の過度の合成につながる病的な脳における局所炎症に対して影響を与えるかもしれないことを示している(Perry, 2004)。慢性神経変性疾患には、とりわけ、多発性硬化症(MS)、アルツハイマー病(AD)、パーキンソン病(PD)、ハンチントン病(HD)、筋萎縮性側索硬化症(ALS)、多系統萎縮症(MSA)、プリオン病、及びダウン症が含まれる。
例えば、急性播種性脳脊髄炎などのいくつかの神経障害は、通常、その疾患の免疫性原因を示すウイルス感染又はウイルス予防接種(又は、極稀に細菌予防接種)に続いて起こる。ウイルス予防接種又はギラン・バレー症候群に続いて起こる急性炎症性末梢神経障害は、同じ推定上の免疫病因を有する同様の脱髄性障害であるが、それらは末梢構造物だけに影響を及ぼす。
外傷、低酸素症、及び虚血を含めた急性傷害によって引き起こされたCNSに対する傷害は、灰白質と白質の両方に影響を及ぼす。CNSへの傷害は、神経炎症を伴う。例えば、外傷又は炎症の後のCNSへの白血球浸潤は、星状細胞におけるMCP-1ケモカインの上方制御によって部分的に誘発される(Panenka et al., 2001)。
末梢神経障害は、感覚喪失、筋脱力及び萎縮、減少した深部腱反射、及び血管運動症状の単独又はいずれかの組み合わせによる症候群である。末梢神経障害は、ウォーラー変性とも呼ばれる過程である軸索変性を伴う。神経炎症は、ウォーラーの変性の一因となっている(Stoll et al., 2002)。
ケモカイン(走化性サイトカイン)は、主として白血球化学遊走物質と活性化因子として基礎輸送と炎症反応作用の両方にかかわる7回膜貫通型のGタンパク質結合受容体を活性化する小さな(8〜10kDa)サイトカインのスーパーファミリーを構成する。
本発明の目的は、神経学的疾患の治療、及び/又は予防の新規な手段を提供することである。
本発明の枠組みの中で、SDF-1の投与が、末梢神経学的疾患の生体内動物モデルにおいて有益な効果があることがわかった。坐骨神経挫滅で誘発した神経障害のマウス・モデルにおいて、神経の再生、完全性、及び活力に関連するすべての生理的パラメーターが、SDF-1α、Met-SDF-1α、又はSDF-1α変異体の投与によってプラスに影響を受けた。
(a)配列番号1のアミノ酸を含むポリペプチド;
(b)配列番号4のアミノ酸を含むポリペプチド;
(c)配列番号7のアミノ酸を含むポリペプチド;
(d)シグナル配列、好ましくは、配列番号5のアミノ酸をさらに含む(a)〜(c)のポリペプチド;
(e)アミノ酸配列が、(a)〜(d)の配列の少なくとも1つに対して少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、若しくは90%の同一性を有する、(a)〜(d)のいずれかの突然変異タンパク質;
(f)高ストリンジェント条件下、(a)〜(d)のいずれかをコードする天然のDNA配列の相補鎖にハイブリダイズするDNA配列によってコードされる、(a)〜(d)のいずれかの突然変異タンパク質;
(g)アミノ酸配列のあらゆる変化が(a)〜(d)のアミノ酸配列に対して保存的なアミノ酸置換である、(a)〜(d)のいずれかの突然変異タンパク質;
(h)(a)〜(d)のいずれかの塩、あるいは、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、又は活性画分、
から成る群から選択されるペプチド、ポリペプチド、又はタンパク質から選択される。
(a)配列番号1のアミノ酸を含むポリペプチド;
(b)配列番号4のアミノ酸を含むポリペプチド;
(c)配列番号7のアミノ酸を含むポリペプチド;
(d)シグナル配列、好ましくは、配列番号5のアミノ酸をさらに含む(a)〜(c)のポリペプチド;
(e)アミノ酸配列が、(a)〜(d)の配列の少なくとも1つに対して少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、若しくは90%の同一性を有する、(a)〜(d)のいずれかの突然変異タンパク質;
(f)高ストリンジェント条件下、(a)〜(d)のいずれかをコードする天然のDNA配列の相補鎖にハイブリダイズするDNA配列によってコードされる、(a)〜(d)のいずれかの突然変異タンパク質;
(g)アミノ酸配列のあらゆる変化が(a)〜(d)のアミノ酸配列に対して保存的なアミノ酸置換である、(a)〜(d)のいずれかの突然変異タンパク質;
(h)(a)〜(d)のいずれかの塩、あるいは、アイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、又は活性画分、
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列を含む前記使用に関する。
本発明の好ましい態様において、発現ベクターは、筋肉内注射によって投与されるかもしれない。
序論
免疫学的に特権を有する部位であると見られているが、CNSは、多くの神経学的疾患に影響を与えるかもしれない顕著な炎症反応を示す可能性がある。小膠細胞は、CNS炎症の開始及び持続に特に重要であるようである。これらの細胞は、正常なCNSにおいて休止形態で存在しているが、感染又はT細胞による刺激後に(活性な食作用、抗原提示と炎症性サイトカインの産生に必要なタンパク質の上方制御を含めた)マクロファージのような特性を獲得する。
初代混合皮質培養の調製
初代細胞の培養を、***後16日目にNMRIマウスから単離した胎児からの脳組織を使用して記載されたとおり(Lubetzki et al., 1993)実施した。大脳半球を胎児脳から解剖し、トリプシン消化により分離し、そして、単細胞浮遊液をBioCoat(登録商標)ポリ-L-リジン・コート96ウェル・プレート(356516、Becton Dickinson)上に1ウェルあたり50μlの髄鞘形成培地中、5×104細胞にて播種した。前記髄鞘形成培地は、1%のFCS、1%のペニシリン-ストレプトマイシン溶液(Seromed)、及び10ng/mlの組み換え血小板由来成長因子AA(PDGH-AA、R&D Systems)を補ったBottenstein-Sato培地(Bottenstein and Sato, 1979; Sadir et al., 2001)から成る。
LPSで刺激された初代混合皮質培養からのサイトカイン放出の準備のために、培養物を、37℃、10%のCO2にて14日間培養し、その後、逓増的な濃度のLPS(0、0.5、1、2.5、5ng/ml)にて48時間刺激した。
− CBAマウス炎症キット(BD Biosciences 552364)SDF-1により分析されるサイトカイン放出(TNF-αとIL-6)、
− インハウスで準備し、そして、本明細書中で以下に記載したサンドイッチELISA法を使用したSDF-1α、
− MTSアッセイ(Promega G5421;細胞密度と相関があることが示された不溶性ホルマザン塩の形成を通じてミトコンドリア活性を計測する非放射性細胞増殖アッセイ)を使用して評価される細胞生存率、
の内容分析の前に−80℃にて冷凍した。
混合皮質培養におけるSDF-1αレベルの定量のためのサンドイッチELISAを、インハウスで準備した。コーティングのために、100μl/ウェルのモノクローナル抗マウスSDF-1(1:500 R&D Systems Inc、Minneapolis, USA)を使用し、100μl/ウェルのビオチン化ポリクローナル抗マウスIgG(1:400 R&D Systems Inc、Minneapolis, USA)を二次抗体として使用し、そして、100μl/ウェルのエクストラビジン(extravidin)結合西洋ワサビ・ペルオキシダーゼ(1:5000 Sigma、St. Louis, MO, USA)を使用した。組み換えマウスSDF-1(2000〜10ng/ml R&D Systems Inc.、Minneapolis, USA)を、検量線を得るために使用した。視覚化のために、100μl/ウェルの基質試薬パックである安定化過酸化水素とテトラメチルベンジジン(R&D Systems Inc.、Minneapolis, USA)混合物を使用した。吸光度を、450nmにてフルオロプレート・リーダー(Labsystems Multiskan EX)を使用して計測した。
LPS刺激した培養物に対する(配列番号4で規定される)SDF-1α及びSDF-1α変異体の効果を試験するために、細胞を2週間増殖させた。14日目に、細胞を、25μlの培地中、逓増的な濃度(0.001、0.1、及び10ng/ml)の対応するタンパク質と共に37℃、10%のCO2にて3時間プレインキューベートした。次に、LPSを、25μlの培地中に5ng/mlの濃度にて細胞に補って、100μlの終量を得、そして、48時間インキューベートする。上清を、16日目に回収し、そして、TNF-αとIL-6(活性化された小膠細胞によって放出される主要なサイトカイン)のレベルをR&D systemsから購入した特異的ELISA(DuoSetマウスTNF-α ELISA DY410、マウスIL-6 ELISA DY406)により計測した。
データの網羅的解析は、一元配置ANOVAを使用して実施した。ダネット検定をさらに使用し、そして、データを「無処理の細胞」と比較した。有意水準を、a:p<0.001;b又は**:p<0.01;c又は*:p<0.05;d:p<0.1に設定した。結果を、平均値±平均値の標準誤差(s.e.m.)と表した。
アッセイの準備
TNF-α、IL-6分泌は、2.5及び5ng/mlにてLPSによって誘発され、そして、両用量は、複合培養物において毒性でない。加えて、様々な濃度のLPS(0、0.5、1、2.5、5ng/ml)が、内因性のSDF-1αレベルに影響を及ぼさなかった(結果未掲載)。
結果は、無処理の細胞と比べて、10ng/mlのIL-10とデキサメサゾン(25pM)がTNF-αとIL-6を下方調節することを示した。SDF-1αとSDF-1α変異体は共に、無処理の細胞と比べて、そして、10ng/mlの最良の濃度と比べて、LPSでの刺激後の混合皮質培養におけるTNF-αとIL-6分泌のレベルを有意に減少させた(図1A及び1B)。
混合皮質培養は、星状細胞、小膠細胞、ニューロン、及び希突起膠細胞を含めたいくつかの神経上皮細胞型を含む複合系を構成する。SDF-1αの非GAG結合突然変異体であるSDF-1-α変異体は、GAG突然変異体がその受容体であるCXCR4へのSDF-1α結合に影響しないことを示すSDF-1αと同じような様式でTNF-αとIL-6を減少させた。
ケモカインの主要な役割は、炎症反応及び免疫学的監視中の特定の白血球集団の遊走を制御することである。ケモカインは、7回膜貫通Gタンパク質結合受容体に結合することによってそれらの生物学的効果を発揮する。それらは、また、ケモカインの局所濃度を高め、それらのオリゴマー化を促進し、そして、受容体へのそれらの提示を容易にする可溶性グリコサミノグリカン(GAG)、並びに細胞表面上のGAGの両方にも結合する。最近、GAGとのケモカイン相互作用が生体内におけるそれらの走化性機能に必要であることが実証された。
8〜12週齢の、雌Balb/Cマウス(Janvier, France)に、200μlのNaCl(0.9%、LPS不含)、又はケモカイン4μg(200μlのNaCl(0.9%、LPS不含)中に希釈したWT SDF-1α、若しくは配列番号4によるSDF-1α変異体)を腹腔内(i.p.)に注射した。wt又は突然変異体SDF-1αの注射後4に、マウスをCO2窒息によって屠殺し、腹腔を3×5mlの氷冷PBSで洗浄し、そして、全洗浄液を個々のマウスについてプールした。回収された全細胞を、血球計算器(Neubauer, Germany)によってカウントした。
腹腔内にSDF-1αを注射したものは白血球を動員する。SDF-1α変異体は白血球を動員せず、生体内のGAG結合活性がSDF-1α変異体における突然変異によって失われていることを示した(図2を参照のこと)。
SDF-1α変異体(SDF-1のGAG結合不全変異体)は、生体内における白血球動員活性を示さない。
序論
SDF-1α発現を、慢性相にてMOGペプチドによって誘発したEAEに冒されたマウスから解剖した脊髄において定量した。実験的自己免疫性脳脊髄炎(EAE)モデルは、マウス慢性の脱髄性モデルであり、そして、多発性硬化症(MS)の確立された動物モデルである。マウスにおけるEAEの誘発のために使用した方法は、Sahrbacherら(Sahrbacher et al., 1998)によって刊行されたプロトコールから適合させた。
脊髄のサンプリング
発病、すなわち、臨床的兆候としての尾部麻痺症の存在から4週間後にEAEに冒されたマウスから脊髄を解剖した。マウスに冷PBSを潅流し、そして、脊髄をプロテアーゼ・インヒビター・カクテル(Roche Molecular Biochemicals、1836170、10mlのバッファーあたり1錠)を含む三重界面活性剤バッファー(50mMのTris、pH8.0、150mMのNaCl、0.02%のNaN3、0.1%のSDS、1%のNonidet P-40、0.5%のデオキシコール酸ナトリウム)中に切り出した。100μlのバッファーを、得られた組織1mgあたりに使用した。組織サンプルを、均質化処理による調製とそれに続く分析の前まで−20℃にてプラスチック製のエッペンドルフ・チューブ内に保存した。
脊髄を、解剖し、そして、ポリトロン(polytron)を使用して三重界面活性剤バッファー中で均質化した。サンプル中のタンパク質レベルをBCA Protein Content Assay(Pierce Biotechnology, Rockford IL61105, USA)により定量し、その後、先の実施例1の材料と方法の項に記載のELISAを使用したSDF-1含量分析により定量した。
図3は、EAEの慢性相におけるEAE動物の脊髄組織においてSDF-1αの上方制御を示している。
慢性のMOG EAE相から抽出したEAE脊髄におけるSDF-1αタンパク質の上方制御は、炎症性細胞動員以外の神経炎症におけるSDF-1αの役割を示唆している。
序論
当該研究を、異なる用量のSDF-1αで処理したマウスにおける神経再生と再ミエリン化を評価するために実施した。ニューロンと軸索(知覚ニューロンと運動ニューロン)の生存と再生、又は髄鞘形成若しくはマクロファージ炎症に対するSDF-1αの正の効果は、運動機能の回復につながるかもしれない。再生は、電気生理学的記録によって評価され得る感覚運動機能の回復により計測される。
動物
38週齢の雌C57bl/6 RJマウス(Elevage Janvier、Le Genest-St-Isle, France)を使用した。それらを、以下の6群(n=6):
(a)神経挫滅/ビヒクル(生理的食塩水/0.02%のBSA);
(b)神経挫滅/SDF-1α(3μg/kg);
(c)神経挫滅/SDF-1α(10μg/kg);
(d)神経挫滅/SDF-1α(30μg/kg);
(e)神経挫滅/SDF-1α(100μg/kg);
(f)神経挫滅/IL-6(30μg/kg)、
に分けた。
動物を、3%のIsofluran(登録商標)(Baxter)の吸入によって麻酔した。右坐骨神経を、大腿中央部くらいの所で外科的に晒し、そして、坐骨神経の3分岐の近位5mmにて挫滅した。神経を、各挫滅の間に90度回転する止血用鉗子(1.5mm幅;Koenig;Strasbourg;France)を用いて30秒間で2回、挫滅した。
筋電図(EMG)試験を、外科手術日の前に1回、そして、手術後3週間に毎週実施した。
電気生理学的記録を、Neuromatic 2000M筋電計(EMG)(Dantec、Les Ulis, France)を使用して実施した。マウスを、3%のIsofluran(登録商標)(Baxter)の吸入によって麻酔した。加温した手術台(Minerve、Esternay, France)を使用して、標準体温を維持した。
データの網羅的解析を、一元配置ANOVAを使用して実施した。ダネット検定を、さらに使用し、そして、データを「ビヒクル」対照に比較した。有意水準を、a:p<0.001;b又は**:p<0.01;c又は*:p<0.05;d:p<0.1に設定した。結果を、平均値±平均値の標準誤差(s.e.m.)として表した。
複合筋活動電位の振幅(図4.A):
研究を通じてCMAP振幅の著しい変化は、ビヒクル処理動物(ベースライン)の反対側の(挫滅されていない)脚について観察されなかった。対照的に、坐骨神経の挫滅は、それぞれのベースライン濃度と比べたときに、dpl7とdpl15にて約80%のビヒクル投与群における減少を有するCMAP振幅の劇的な減少を引き起こした。マウスを30μg/kg若しくはμ/kgにてSDF-1αで、又は30μ/kgにてIL-6で処理したとき、無処理マウスのレベルと比較して、それらはCMAP振幅の増大(約1.5倍)を実証し、そして、この効果は15dplと22dplにて有意であった。
研究を通して、ビヒクル処理動物の反対側の(挫滅されていない)脚のCMAP潜時の悪化は全くなかった。対照的に、挫滅側の筋肉はベースラインに比べてより長いCMAP潜時を示した。SDF-1αで処理したマウスでは、CMAP潜時値は、ビヒクル処理マウスのものと比較した場合に有意に短縮された。7日目において、この効果は、30μg/kg及び100μg/kgのSDF-1αでの処理後には観察できたが、30μg/kgのIL-6では観察できなかった。dpl15及び22において、有意な効果は、(3又は10μg/kgでは得られなかったが)30μg/kg及び100μg/kgのSDF-1αではまだ得られた。SDF-1α(30μg/kg)は、IL-6(30μg/kg)に比べてより強力である。
神経挫滅モデルは、外傷性神経傷害、及び末梢神経障害の非常に目覚しいモデルである。神経挫滅直後、大きい直径を持った繊維の大部分は、機械的傷害のため失われ、CMAP振幅の激しい減少を招いている。CMAP潜時は、すぐには影響を受けなかったが、二次的な免疫媒介性変性(マクロファージ、顆粒球)による細径繊維の追加的な変性に15日間に増大を示している。CMAP持続時間は、dpl7に高まり、そして、dpl15にピークとなった。
配列番号4で規定されるSDF-1α変異体を試験するために、先の実施例4に記載の坐骨神経挫滅モデルを実施し、そして、そのマウスを、以下の2群(n=6):
(a)神経挫滅手術/ビヒクル(生理的食塩水/0.02%のBSA);
(b)神経挫滅/30μg/kgのSDF-1α変異体のs.c、
に分けた。
電気生理学的測定
複合筋活動電位の振幅(図5.A):
マウスをSDF-1α変異体で処理したとき、CMAP振幅の有意な増大は、22dplにて実証された。
SDF-1α変異体で処理したマウスでは、CMAP潜時値は、特に7dplにおいて、ビヒクル処理マウスの値に比べて、有意に減少していた。正の効果は、22dplでもまだ得られた。
SDF-1α変異体で処理したマウスでは、7dplと22dplにおいて、CMAP持続時間の値がビヒクル処理マウスと比較して減少した。
SDF-1α変異体が、末梢神経挫滅後に機能(CMAP潜時)を回復させることが示された。それは、また、計測したすべてのパラメーターにおいてもマウスの神経挫滅モデルにおける保護効果を示した。
先の実施例4に記載の坐骨神経挫滅モデルを、(配列番号7で規定される)Met-SDF-1αを試験するために実施し、そして、そのマウスを、以下の2つの群(n=6):
(a)神経挫滅手術/ビヒクル(生理的食塩水/0.02%のBSA);
(b)神経挫滅/100、30、及び10μg/kgのMet-SDF-1α変異体のs.c、
に分けた。
電気生理学的測定
複合筋活動電位の潜時(図6):
Met-SDF-1αで処理したマウスでは、CMAP潜時値は、ビヒクル処理マウスの値と比較した場合に、挫滅後7日目と14日目に有意に減少した。
Met-SDF-1αは、SDF-1αと同様に、末梢神経挫滅後に機能(CMAP潜時)を回復させることが示された。
序論
糖尿病性神経障害は、糖尿病の最も一般的な慢性合併症である。基礎をなす機構は、複合的であり、且つ、高血糖、及びインスリンとC-ペプチド欠乏の結果として生じるいくつかの相関的な代謝異常にかかわるように見える。糖尿病性神経障害の指標となる最も一般的な初期異常は、低下した神経伝導速度によって反映される無症候性神経機能不全である(Dyck and Dyck, 1999)。通常、これらの変化の後に、足の振動感覚の喪失、及び足首反射の喪失が続く。電気生理学的測定は、多くの場合、基礎をなす病態、及び神経線維の髄鞘形成に相関する神経伝導速度の変化を極めて正確に反映する(総説のために、Sima, 1994を参照のこと)。
動物
8週齢の雄スプラーグ-ドーリー・ラット(Janvier、Le Genest Saint Isle, France)を、以下に示す6つの実験群(n=10)に無作為に割り付けた。
糖尿病を、55mg/kgの用量でのストレプトゾトシン(Sigmar、L’Isle d’Abeau Chesnes, France)の緩衝化溶液の静脈内注射によって誘発した。STZを、0.1mol/lのクエン酸バッファー pH4.5中に調製した。対照群には、等量のクエン酸バッファーを与えた。STZ注射の日を、D0とみなした。
− −7日目:ベースライン(EMG)
− 0日目:ストレプトゾトシンによる誘発
− 7日目:血糖の観察
− 11日目:処理開始
− 20日目:フォン・フライ試験
− 25日目:EMGの観察
− 40日目:EMGの観察とHP52℃の試験
− 41日目:坐骨神経と皮質生検サンプルを組織形態計測的分析のために取り出す。
電気生理学的記録を、筋電計(Keypoint、Medtronic、Boulogne-Billancourt, France)を使用して実施した。ラットを、60mg/kgのケタミン・クロルハイドレート(ketamine chlorhydrate)(Imalgene 500(登録商標)、 Rhone Merieux、Lyon. France)及び4mg/kgのキシラジン(xylazin)(Rompum 2%、Bayer Pharma、Kiel, Germany)の腹腔内注射(IP)によって麻酔した。標準体温を、加熱灯で30℃に維持し、そして、尾部表面に設置した接点温度計(Quick、Bioblock Scientific、Illkirch, France)によって制御した。
形態計測的分析を、研究の終了時に実施した。動物を、60mg/kgのImalgene 500(登録商標)のIP注射によって麻酔した。坐骨神経の5mm片を、組織学的検査のために摘出した。その組織を、リン酸緩衝溶液(pH7.4)中、4%のグルタルアルデヒド(Sigma、L’Isle d’Abeau-Chesnes, France)溶液で一晩固定し、そして、使用するまで30%のショ糖中、+4℃にて維持した。神経サンプルを、リン酸緩衝溶液中、2%の四酸化オスミウム(Sigma)溶液の中で2時間、固定し、そして、一連のアルコール水溶液中で脱水し、そして、Epon内に包埋した。次に、包埋した組織を3日間の重合の間、+70℃にさらした。1.5μmの厚さの横断切片をミクロトームを使用して得た。それらを、1%のトルイジンブルー溶液(Sigma)で2分間染色し、脱水し、そして、Eukitt中に封入した。
データの網羅的解析を、一因子又は頻回測定分散分析(ANOVA)及び一元配置ANOVAを使用して実施した。ANOVAが有意差を示したとき、フィッシャーの保護最小有意差法を、ビヒクルで処理した糖尿病ラット群と、実験群を比べるために事後検定として使用した。有意水準を、p≦0.05に設定した。結果を、平均値±平均値の標準誤差(s.e.m.)として表した。
体重
累進的な成長を示す非糖尿病ラットとは対照的に、糖尿病ラットは、有意な成長停止を明らかにした(図7A)。
STZ後7日目に、STZを受けたすべてのラットが、対照ラットのものより5倍高い血糖を示した(図7B)。
1.複合筋活動電位の潜時
CMAP潜時は、非糖尿病ラットのものと比較して、糖尿病ラットにおいてD25で有意に延長された(図7C)。SDF-1α又はIL-6での処理は、ビヒクルで処理した糖尿病ラットのものと比較して、糖尿病ラットのCMAP潜時における有意な短縮を引き起こした。
D25において、ビヒクルで処理した糖尿病ラットは、非糖尿病ラットと比較して、有意に低下したSNCVを明らかにした(図7D)。SDF-1α又はIL-6での処理は、糖尿病ラットのSNCV能力の有意に改善した。最良の効果は、10及び30μg/kgの処理用量で観察され、そして、それはIL-6処理を伴ったものに匹敵した。
1.g比(相対的ミエリン厚)
ビヒクルを与えた糖尿病ラットのg比は、非糖尿病ラットのものと比較して、有意に高まっており(図7E)、糖尿病ラットにおける髄鞘の肉薄化を示唆した。SDF-1αでの糖尿病ラットの処理は、特に10又は30μg/kgの用量について、STZ/ビヒクル群と比較して、g比を有意に低下させた。100μg/kgの用量において、g比の値の低下は、有意水準に達しなかった。
ビヒクルを与えた糖尿病ラットは、非糖尿病ラットに比べて、有意に高い変性線維の割合を示した(図7F)。逆に、糖尿病ラットにおける非変性線維の割合は、非糖尿病ラットのものと比較して、有意に低下した(図7F)。SDF-1αでの糖尿病ラットの処理は、変性線維集団の低減を示した。最良の効果は、実施した最も低い用量(10μg/kg)に関連し、有意水準に達した。
図7Gに示されているように、ビヒクルを与えた糖尿病ラットは、非糖尿病ラットと比較して、有意に低下した表皮内の神経線維の密度を示した。SDF-1αでの糖尿病ラットの処理は、ビヒクルでの処理に比べて、皮膚の神経線維の有意に高い密度に関連していた。観察された効果は、IL-6処理によって引き起こされたものに匹敵していた。
当該研究において、我々は糖尿病関連の神経障害の進行に対するSDF-1αの神経及び神経膠の保護効果を評価したかった。調査を、ラットにおけるSTZ誘発糖尿病に関連する神経障害で行った。糖尿病性神経障害の臨床条件と同様に、早ければSTZ後7日目に検出される欠陥のある感覚神経伝導が、後の時点で観察される髄鞘脱落、及び/又は軸索変性の証拠に一致するこのモデルの進行中の神経障害を示す最初の兆候である(Andriambeloson et al., 2006)。先の研究は、低用量のIL-6でのSTZラットの処理が、血糖症の進行を妨げずに、このモデルにおける神経障害の進行を阻止することを実証した(Andriambeloson et al., 2006)。
序論
神経障害性疼痛の最も一般的な増悪原因は、糖尿病、特に血糖制御が乏しい糖尿病である。糖尿病患者の約2〜24%が、神経障害性疼痛を経験する。糖尿病の神経障害性疼痛は、通常は軽い痛みを伴う刺激への暴露(すなわち、痛覚過敏)、又は通常は痛みがあると知覚されない刺激への暴露(すなわち、異痛)のいずれかの結果として自然に発生する。疼痛知覚の多くの例外が、糖尿病の初期段階にてストレプトゾトシン・モデル(Hounsom and Tomlinson, 1997)において明らかにされた。例えば、ホルマリンで誘発されたフリンチングは、対照動物と比較して、STZ-ラットにおいて拡大される。加えて、接触性アロディニアの進行が、糖尿病のこの動物モデルにおいて報告された(Calcutt et al., 1995, 1996)。高血糖が持続する後期において(Bianchi et al., 2004)、ホットプレート閾値の拡張が、糖尿病ラットの行動異常として報告された。
動物
8週齢の雄スプラーグ・ドーリー・ラット(Janvier、Le Genest Saint Isle, France)を、以下に示す6つの実験群(n=10)に無作為に割り付けた。
糖尿病を、55mg/kgの用量におけるストレプトゾトシン(Sigma、L’Isle d’Abeau Chesnes, France)の緩衝化溶液の静脈内注射によって誘発した。STZを、0.1mol/lのクエン酸バッファー pH4.5中に調製した。対照群には、等量のクエン酸バッファーを与えた。STZ注射の日を、D0とみなした。
− 0日目:ストレプトゾトシンによる誘発
− 7日目:血糖の観察
− 11日目:処理開始
− 20日目:フォン・フライ試験
− 40日目:EMGモニタリングとHP 52℃試験
ラットを、金属グリッド床の上に乗せた。侵害試験を、グリッド床を貫いてフォン・フライ式フィラメント(Bioseb、France)を挿入し、そして、それを後肢の足底面に当てることによっておこなった。試験は、異なるフォン・フライ式フィラメントの(1〜1.5sの振動数の)数回の適用から成った。フォン・フライ式フィラメントは、10g〜180gのフィラメントを適用した。後肢の勢いの良い引っ込めを生じる圧力を、閾値とみなした。カットオフ値を180gに設定した。
動物を、52℃に調整したホットプレート上のガラス製円柱内に入れた。最初の反応の潜時を、30sのカットオフ時間で記録した(熱から逃れるための舐め、肢の勢いの良い運動、小さい飛躍、又はジャンプ)。
フォン・フライ式フィラメント
STZ後20日目において、ビヒクルで処理した糖尿病ラットは、非糖尿病ラットと比べて、フォン・フライ試験において有意に低い閾値を示した(図8A)。
STZ後D40において、ビヒクル処理を受けた糖尿病ラットは、非糖尿病ラットと比較して、ホットプレート試験において有意に大きい潜時の閾値が明らかになった(図8B)。
フォン・フライ式フィラメント(機械刺激)及び熱(52℃)に対応したラットの挙動を、それぞれ、D20とD40にて評価した。これらの2つの試験において、SDF-1αで処理した糖尿病ラットは、ビヒクルで処理したものと比較して、挙動の違いを明らかに示し、そして、それらのスコアは非糖尿病ラットのそれに匹敵するようになった。
材料と方法
患者及び対照のサンプリング
研究には、一次進行型MS(MSPP)と関係のない患者の一群を含んだ。研究におけるすべての対象がイタリア出身の白人であった。サルジニア出身の患者と対照を除外した。
全ゲノム分析の方法:アフィメトリックス法
各サンプルからの250ng(5μl)のDNAを、10単位のNsp I及びSty I制限酵素(New England Biolabs、Beverly, MA)で平行して37℃にて2時間、消化した。次に、酵素特異的アダプター・オリゴヌクレオチドを、T4 DNAリガーゼで16℃にて3時間、消化された末端に連結した。水での希釈後に、5μlの希釈した連結反応物を、PCRにかけた。PCRを、25μMのPCRプライマー002(Affymetrix)、350μMの各dNTP、1Mのベタイン(USB、Cleveland, OH)、及び1×チタニウムTaq PCRバッファー(BD Biosciences)の存在下、25μMのチタニウムTaq DNAポリメラーゼ(BD Biosciences、San Jose, CA)を用いて実施した。サイクル・パラメーターは、以下の:94℃にて3分間の最初の変性、合計30回繰り返される94℃にて30秒間の増幅、60℃にて30秒間、及び68℃にて15秒間の伸長、68℃にて7分間の最後の伸長、であった。3つの反応からのPCR産物を、合わせ、そして、製造業者の指示に従ってMinElute 96ウェルUF PCR精製プレート(Qiagen、Valencia, CA)を用いて精製した。サンプルを、マイクロチューブ内に回収し、そして、16,000×gにて10分間、遠心分離機にかけた。
SNPを、以下の評価基準:
− 欠損遺伝子型率が、<5%でなければならない、
− 最小対立遺伝子頻度(MAF)が、対照において>1%でなければならない、
− ハーディー-ヴァインベルク平衡にはない確率が、対照において<2%でなければならない、
− SNPが、症例において多形性でなければならない、
を用いて選別した。
方法:
FDR(誤発見率(false discovery rate))を、各集団について以下の(ピアソンの統計値を用いた正確検定を使用した)一変量試験:
− 対立遺伝子の試験、
− 遺伝子型の試験、
− 対立遺伝子と遺伝子型の試験の最小(「min」と短縮した)、
− 対立遺伝子と遺伝子型の試験の最大(「max」と短縮した)、
で10,000個の順列を用いて推定した。
SNPフィルタリングとゲノム・カバー率
先に規定したフィルターを適用することで、表VIに示されているように残存SNPの数を減少させた:
FDRの結果を、図9に示している。
10%のFDR閾値にて、表VIIに示されているように、SNPと遺伝子を選択した。
− SDF-1遺伝子は期待されたものより長い:8kbではなく87kb、
− 着目のSNP(SNP_A-2185631)は、SDF-1遺伝子の中にあり、SDF-1イプシロン及びSDF-1ファイの最後のイントロンの中に位置している(図12を参照のこと)、
を示した。
Claims (28)
- 神経学的疾患の治療用、及び/又は予防用医薬品の製造のためのSDF-1又はSDF-1活性の作動物質の使用。
- 前記SDF-1が、SDF-1αである、請求項1に記載の使用。
- 前記SDF-1が、SDF-1α変異体である、請求項1に記載の使用。
- 前記神経学的疾患が、炎症と関連する、請求項1に記載の使用。
- 前記炎症が、神経炎症である、請求項4に記載の使用。
- 前記神経学的疾患が、外傷性神経傷害、脳卒中、CNS又はPNSの脱髄性疾患、神経障害から成る群から選択される、請求項1〜5のいずれか1項に記載の使用。
- 前記神経学的疾患が、末梢神経障害である、請求項1〜6のいずれか1項に記載の使用。
- 前記末梢神経障害が、糖尿病性神経障害又は神経障害性疼痛である、請求項7に記載の使用。
- 前記外傷性神経傷害が、末梢神経の外傷を含む、請求項6に記載の使用。
- 前記外傷性神経傷害が、脊髄の外傷を含む、請求項6に記載の使用。
- 前記脱髄性疾患が、多発性硬化症(MS)である、請求項6に記載の使用。
- 前記脱髄性疾患が、一次進行型多発性硬化症(MS)又は二次進行型多発性硬化症(MS)である、請求項11に記載の使用。
- 前記脱髄性疾患が、慢性炎症性多発性硬化症、脱髄性多発神経症(CIDP)、及びギラン・バレー症候群(GBS)から選択される、請求項6に記載の使用。
- 前記SDF-1が、以下の:
(a)配列番号1のアミノ酸を含むポリペプチド;
(b)配列番号4のアミノ酸を含むポリペプチド;
(c)配列番号7のアミノ酸を含むポリペプチド;
(d)シグナル配列、好ましくは、配列番号5のアミノ酸をさらに含む(a)〜(c)のポリペプチド;
(e)アミノ酸配列が、(a)〜(c)の配列の少なくとも1つに対して少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、若しくは90%の同一性を有する、(a)〜(d)のいずれかの突然変異タンパク質;
(f)高ストリンジェント条件下、(a)〜(c)のいずれかをコードする天然のDNA配列の相補鎖にハイブリダイズするDNA配列によってコードされる、(a)〜(d)のいずれかの突然変異タンパク質;
(g)アミノ酸配列のあらゆる変化が(a)〜(c)のアミノ酸配列に対して保存的なアミノ酸置換である、(a)〜(d)のいずれかの突然変異タンパク質;
(h)(a)〜(d)のいずれかの塩、又はアイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、若しくは活性画分、
から成る群から選択される、請求項1〜13のいずれか1項に記載の使用。 - 前記SDF-1に、血液脳関門の通過を促進する担体分子、ペプチド、又はタンパク質を融合させる、請求項1〜14のいずれか1項に記載の使用。
- 前記SDF-1をPEG化する、請求項1〜15のいずれか1項に記載の使用。
- 前記融合タンパク質に、免疫グロブリン(Ig)融合が含まれる、請求項15に記載の使用。
- 前記医薬品に、同時の、連続した、又は別々の使用のためにインターフェロン、及び/又はオステオポンチン、及び/又はクラステリンがさらに含まれる、請求項1〜17のいずれか1項に記載の使用。
- 前記インターフェロンがインターフェロンβである、請求項18に記載の使用。
- 前記SDF-1が、約0.001〜1mg/kg体重、約0.01〜10mg/kg体重、約9、8、7、6、5、4、3、2、若しくは1mg/kg体重、又は約0.1〜1mg/kg体重の量で使用される、請求項1〜19のいずれか1項に記載の使用。
- 神経学的疾患の治療用、及び/又は予防用の医薬品の製造のための核酸分子の使用であって、上記核酸分子に、配列番号6の核酸配列、又は以下の:
(a)配列番号1のアミノ酸を含むポリペプチド;
(b)配列番号4のアミノ酸を含むポリペプチド;
(c)配列番号7のアミノ酸を含むポリペプチド;
(d)シグナル配列、好ましくは、配列番号5のアミノ酸をさらに含む(a)〜(c)のポリペプチド;
(e)アミノ酸配列が、(a)〜(c)の配列の少なくとも1つに対して少なくとも40%、50%、60%、70%、80%、若しくは90%の同一性を有する、(a)〜(d)のいずれかの突然変異タンパク質;
(f)高ストリンジェント条件下、(a)〜(c)のいずれかをコードする天然のDNA配列の相補鎖にハイブリダイズするDNA配列によってコードされる、(a)〜(d)のいずれかの突然変異タンパク質;
(g)アミノ酸配列のあらゆる変化が(a)〜(c)のアミノ酸配列に対して保存的なアミノ酸置換である、(a)〜(d)のいずれかの突然変異タンパク質;
(h)(a)〜(d)のいずれかの塩、又はアイソフォーム、融合タンパク質、機能性誘導体、若しくは活性画分、
から成る群から選択されるアミノ酸配列を含むポリペプチドをコードする核酸配列が含まれる前記方法。 - 前記核酸分子に、発現ベクター配列がさらに含まれる、請求項21に記載の使用。
- 神経学的疾患の治療用、及び/又は予防用の医薬品の製造における、細胞内のSDF-1、又はSDF-1活性の作動物質の内因性産生を誘発する、及び/又は高めるためのベクターの使用。
- 遺伝子治療のための請求項21〜23のいずれか1項に記載の使用。
- 神経学的疾患の治療用、及び/又は予防用の医薬品の製造におけるSDF-1、又はSDF-1活性の作動物質を産生するように遺伝子操作をした細胞の使用。
- 必要に応じて、1種類以上の医薬として許容される賦形剤と一緒に、SDF-1、又はSDF-1活性の作動物質、及びインターフェロンを含む、神経学的疾患の治療用、及び/又は予防用の医薬組成物。
- 必要に応じて、1種類以上の医薬として許容される賦形剤と一緒に、SDF-1、又はSDF-1活性の作動物質、及びオステオポンチンを含む、末梢神経学的疾患の治療用、及び/又は予防用の医薬組成物。
- 必要に応じて、1種類以上の医薬として許容される賦形剤と一緒に、SDF-1、又はSDF-1活性の作動物質、及びクラステリンを含む、末梢神経学的疾患の治療用、及び/又は予防用の医薬組成物。
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